KR20220163389A - 안히드로이카리틴의 의약적 용도 - Google Patents

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구이민 장
징춘 야오
쳉홍 선
빈 리
시나 판
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Abstract

출혈성 질환의 예방 및 치료용 약물의 제조에서 안히드로이카리틴의 용도로서, 이는 의약 분야에 속한다. 안히드로이카리틴은 혈소판 기능 장애를 개선하고, 트롬보플라스틴 시간을 단축하며, 혈액 응고를 촉진할 수 있으므로, 출혈성 질환의 예방 및 치료, 특히 뇌경색 출혈성 변형, 뇌경색 혈전용해제 또는 항혈전제로 인한 위장관 출혈 또는 심근경색증 혈전용해제 또는 항혈전제 출혈 합병증의 치료에 사용될 수 있다.

Description

안히드로이카리틴의 의약적 용도
본 발명은 의약 분야에 속하며, 안히드로이카리틴의 의약적 용도에 관한 것으로, 특히 출혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물의 제조에서 안히드로이카리틴의 용도에 관한 것이다.
사람의 혈관이 손상되면 혈액이 혈관 밖으로 흘러나오거나 스며 나올 수 있다. 이때, 신체는 지혈이라는 일련의 생리적 반응을 통해 출혈을 멈춘다. 지혈 과정에는 많은 요인이 관련되어 있고, 일련의 복잡한 생리적 및 생화학적 반응이 포함된다. 따라서, 지혈 기능의 결함으로 인한, 자발적이거나 혈관 손상 후 출혈이 멈추지 않는 것을 특징으로 하는 질환을 출혈성 질환이라고 한다.
출혈성 질환은 병인 및 발병 기전에 따라 다음과 같은 몇 가지 주요 유형으로 나눌 수 있다. (1) 혈소판 기능 이상으로 인한 출혈성 질환: 뇌경색 출혈성 변형, 뇌경색 혈전용해제 또는 항혈전제로 인한 위장관 출혈 또는 심근경색증 혈전용해제 또는 항혈전제 출혈 합병증을 포함한다. 여기서, 뇌경색 출혈성 변형은 허혈성 뇌경색 이차성 출혈성 변형, 원발성 출혈성 변형 또는 무증상 출혈성 변형이다. 혈전용해제 또는 항응고제 치료는 현재 급성 허혈성 경색을 치료하는 효과적인 방법이지만, 혈전을 용해시킴과 동시에 출혈성 변형과 같은 다양한 심각한 합병증을 유발할 수 있어 임상 적용에 심각한 제한이 있다. 현재 서양의학에서 혈전용해제 또는 항응고제 치료 후의 다양한 합병증에 대한 예방 및 치료는 각각의 단일 단계 또는 단일 요소에만 기초하고 있으며, 아직 만족스러운 치료 효과를 얻지 못하고 있으므로, 전반적인 조절과 다중 단계 종합 치료에 중점을 둔 한의학의 장점을 충분히 발휘할 수 있다면 혈전을 용해시키는 동시에 다양한 출혈성 변형의 위험을 줄이거나 제거할 수 있는 효과적인 치료법과 처방을 찾아, 경색류 질환에 대한 혈전용해 치료의 단기 및 장기 치료를 향상시키는 것은 매우 중요하다. (2) 비정상적인 혈관벽으로 인한 출혈성 질환: 선천성 또는 유전성 및 후천성을 포함한다. 여기서, 선천성에는 유전성 출혈성 모세혈관 확장증, 가족성 단순성 자반병, 선천성 결합조직 질환이 포함된다. (3) 비정상적인 혈액 응고로 인한 출혈성 질환: 선천성 또는 유전성 및 후천성을 포함한다. 여기서, 선천성 비정상적인 혈액 응고는 A형 혈우병, B형 혈우병, 및 유전성
Figure pct00001
결핍증; 유전성 프로트롬빈, FⅤ, FⅦ, FⅩ 결핍증, 유전성 피부리노겐 결핍 및 감소증, 유전성
Figure pct00002
결핍 및 감소증을 의미한다. 유전성 비정상적인 혈액 응고는 간 질환 비정상적인 혈액 응고; 비타민 K 결핍증; 항인자 VIII 및 IX 항체 형성; 요독증 비정상적인 혈액 응고 등을 의미한다. (4) 비정상적인 항응고 및 섬유소 용해로 인한 출혈성 질환: 주로 후천성 질환으로, 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 과다 복용, 쿠마린 과다 복용, 면역 관련 항응고제 증가 또는 혈전용해제 과다 복용으로 인한 출혈성 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
음양곽은 심엽음양곽(Epimedium brevicornum Maxim.), 전엽음양곽(Epimedium sagiatumMaxim.), 유모음양곽(Epimedium pubescens Maxim.) 또는 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai)의 말린 줄기와 잎이다. 임상적으로는 신장양결핍, 발기부전, 빈뇨, 불임, 류마티스 관절통, 사지의 저림 및 수축, 근육과 뼈의 약화, 보행 곤란, 신장양결핍, 천식 및 호흡곤란에 주로 사용된다.
안히드로이카리틴(IT)은 심엽음양곽 중 폴리히드록시플라보노이드 단량체 성분이다. 약리학적 연구에 따르면, IT는 음양곽의 다른 플라보노이드 배당체보다 더 강력한 항골다공증 작용을 가지고 있으며 시험관 내에서 조골세포 활성을 촉진하고 파골세포 활성을 억제하는 작용을 가지고 있다. 최근 음양곽의 중요한 활성 성분인 이카리틴 및 안히드로이카리틴이 의약계 종사자들의 주목을 받고 있다. 예를 들어, 특허 출원 CN101637467A는 골다공증 치료용 약물의 제조에서 안히드로이카리틴의 응용을 개시하였다. 특허 US6399579는 성기능 장애의 치료에서 안히드로이카리틴의 용도를 개시하였다.
출원인은 연구 과정에서 안히드로이카리틴이 혈소판 기능 장애를 개선하고, 트롬보플라스틴 시간을 단축하며, 혈액 응고를 촉진할 수 있으므로, 혈소판 기능 이상 및 이로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈액 응고로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈관벽으로 인한 출혈성 질환 또는 비정상적인 항응고 및 섬유소 용해로 인한 출혈성 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있음을 발견하였다.
일 양태에서, 본 발명은 질환의 예방 또는 치료용 약물의 제조에서 안히드로이카리틴의 용도를 제공하고, 상기 질환은 혈소판 기능 이상 및 이로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈액 응고로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈관벽으로 인한 출혈성 질환 또는 비정상적인 항응고 및 섬유소 용해로 인한 출혈성 질환이다.
일 실시형태에서, 상기 혈소판 기능 이상으로 인한 출혈성 질환은, 뇌경색 출혈성 변형, 뇌경색 혈전용해제 또는 항혈전제로 인한 위장관 출혈 또는 심근경색증 혈전용해제 또는 항혈전제 출혈 합병증으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 뇌경색 출혈성 변형은 허혈성 뇌경색 이차성 출혈성 변형, 원발성 출혈성 변형 또는 무증상 출혈성 변형이다.
일 실시형태에서, 상기 이차성 출혈성 변형은 혈전용해제, 항혈전제 및 혈관내 치료 중 하나 이상의 치료 방법의 사용으로 인한 출혈성 변형이다.
일 실시형태에서, 상기 혈전용해제는 우로키나제, 스트렙토키나제, 레테플라제, 알테플라제, 테넥테플라제 또는 라노테플라제로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 상기 항혈전제는 항응고제 및 항혈소판제 중 하나 이상이다. 일 실시형태에서, 상기 항응고제는 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 저분자량 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 재조합 히루딘으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 상기 항혈소판제는 아스피린, 클로피도그렐 또는 티클로피딘으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 원발성 출혈성 변형은 급성 뇌경색 후 자연출혈 변형이다.
일 실시형태에서, 상기 심근경색증 혈전용해제 또는 항혈전제 출혈 합병증에서 혈전용해제는 우로키나제, 스트렙토키나제, 레테플라제, 알테플라제, 테넥테플라제 또는 라노테플라제로부터 선택되고; 항혈전제는 심근경색증 발병기 및 1차, 2차 예방기의 항혈전 치료제이며; 상기 항혈전제는 항응고제 또는 항혈소판제 중 하나 이상이고;
일 실시형태에서, 상기 항혈소판제는 아스피린, 클로피도그렐 또는 티클로피딘으로부터 선택되며, 항응고제는 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 저분자량 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 재조합 히루딘으로부터 선택되고;
일 실시형태에서, 상기 출혈 합병증은 피하 출혈, 두개내 출혈, 상부 위장관 출혈 또는 잇몸 출혈 중 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 상기 뇌경색 혈전용해제 또는 항혈전제로 인한 위장관 출혈에서 혈전용해제는 우로키나제, 스트렙토키나제, 레테플라제, 알테플라제, 테넥테플라제 또는 라노테플라제 중 하나 이상이고; 상기 항혈전제는 항응고제 또는 항혈소판제 중 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 상기 혈소판 기능 이상은 비정상적인 혈소판 활성화 기능 또는 응집 기능이고; 상기 혈소판 기능 이상은 선천성 혈소판 결손 또는 후천성 혈소판 결손이며;
일 실시형태에서, 상기 선천성 혈소판 결손은 유전성 거대 혈소판 증후군, 유전성 혈소판 감소증 또는 선천성 결합조직 질환이고; 상기 후천성 혈소판 결손은 약물 또는 질환에 의해 유발되며;
일 실시형태에서, 상기 약물은 항균제, 항종양제 또는 헤파린 중 하나 이상이고, 상기 질환은 요독증, 당뇨병, 신증후군, 관상동맥질환 또는 백혈병 중 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 상기 비정상적인 혈액 응고로 인한 출혈성 질환은 혈우병이다.
일 실시형태에서, 상기 혈우병은 유전적 요인으로 인한 혈우병 또는 이차성 혈우병이고; 상기 이차성 혈우병은 약물 또는 자가 면역 질환에 의해 유발된다.
일 실시형태에서, 상기 자가 면역 질환은 간병, 용혈, 후천성 면역 결핍증, 에반스 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 각종 급성 백혈병, 림프종, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 또는 갑상선 기능 항진증을 포함하지만 이에 한정되지 않고; 상기 간병은 만성 지속성 간염, 간경화증에 의해 유발되는 임의의 하나의 간병이며; 상기 약물은 알킬화제, 항대사 물질, 세포독성제인 클로로티아지드계 약물 및 이의 상승제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 혈우병은 A형 혈우병, B형 혈우병 또는 C형 혈우병 중 임의의 하나이다.
일 실시형태에서, 상기 비정상적인 항응고 및 섬유소 용해로 인한 출혈성 질환은 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 과다 복용, 쿠마린 과다 복용, 면역 관련 항응고제 증가 또는 혈전용해제 과다 복용으로 인한 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 후천성 질환이다.
약효 실시예 1의 혈소판 활성화 기능에 대한 안히드로이카리틴의 영향 연구 결과에 따르면, 안히드로이카리틴 투여 3일 후, 동물의 말초 항응혈제는 동일한 조건에서 아데노신 이인산에 의해 활성화된 후, CD61이 표지된 모든 혈소판에서, CD62p의 발현이 유의하게 증가하였는데, 즉 아데노신 이인산에 의해 활성화된 혈소판의 활성화율은 증가하였고, 투여 전 기준치와 비교하여 유의한 차이가 있다. 본 실험 조건에서, 안히드로이카리틴을 위내 투여하면 래트의 말초 항응혈제에서 아데노신 이인산(ADP)에 의해 유도된 혈소판 활성화를 유의하게 촉진할 수 있음을 제시한다.
시험관 내 혈소판 응집 기능에 대한 안히드로이카리틴의 영향 연구 결과에 따르면, 안히드로이카리틴의 각 농도는 모두 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 응집 활성을 촉진하는 작용을 가지고 있고, 농도가 증가함에 따라 촉진 작용이 증가되는데, 이는 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 응집 활성에 대한 안히드로이카리틴의 촉진 작용이 용량 의존적 관계를 나타냄을 설명한다.
약효 실시예 2의 아스피린 또는 클로피도그렐으로 인한 뇌허혈 재관류 후 출혈성 변형에 대한 안히드로이카리틴의 영향 실험은, 안히드로이카리틴이 아스피린 또는 클로피도그렐으로 인한 뇌허혈 재관류 후 출혈성 변형을 유의하게 억제할 수 있음을 보여준다.
약효 실시예 3의 헤파린 나트륨으로 인한 마우스 출혈 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향 작용 결과에 따르면, 안히드로이카리틴은 헤파린 나트륨으로 인한 마우스 출혈 시간을 유의하게 단축시킬 수 있고, 응고 촉진 작용을 발휘하는 동시에 혈액 루틴 및 혈액 응고 4가지 항목을 변경하지 않는다.
약효 실시예 4의 아스피린으로 인한 마우스 출혈 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향 작용 결과에 따르면, 안히드로이카리틴은 아스피린으로 인한 마우스 출혈 시간을 유의하게 단축시킬 수 있다.
약효 실시예 5의 혈전용해제의 혈전용해 효과에 대한 안히드로이카리틴의 영향 및 실시예 6의 혈전용해제로 인한 출혈성 변형에 대한 안히드로이카리틴의 영향 결과에 따르면, 안히드로이카리틴은 혈전용해제로 인한 출혈성 변형을 유의하게 개선할 수 있고, 출혈성 변형을 방지하고 출혈량을 감소시키는 동시에 혈전에 대한 혈전용해제의 용해 작용에 영향을 미치지 않으며, 혈액 루틴 수치에 영향을 미치지 않는다. 안히드로이카리틴은 상기 실시예에 열거된 것 이외의 혈전용해제, 항응고제 및 항혈소판제로 인한 출혈성 변형에 대해서도 유의한 예방 및 치료 작용을 가지고 있고, 자연출혈 변형 및 무증상 출혈성 변형의 위험에 대해서도 마찬가지로 유의하게 감소시키는 작용을 가지고 있다. 상기 뇌경색 발생 후 출혈성 변형에 대해 유의한 예방 및 치료 작용을 갖는 이외에, 안히드로이카리틴은 또한 최초 머리 CT／MRI에 따라 결정할 수 있는 출혈성 경색의 발생에 대해 유의한 예방 및 치료 작용을 가지고 있다.
약효 실시예 7의 아스피린으로 인한 위장관 출혈에 대한 안히드로이카리틴의 예방 작용, 약효 실시예 8의 혈전용해제로 인한 위출혈에 대한 안히드로이카리틴의 예방 작용, 실험 결과에 따르면, 안히드로이카리틴은 혈전용해제로 인한 위장관 출혈의 발생률을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 고용량의 안히드로이카리틴은 혈전류 질환 자체로 인한 위장관 출혈에 대해서도 유의한 예방 작용을 가지고 있고, 상기 작용은 모두 용량 의존적 관계를 나타낸다.
약효 실시예 9의 혈전용해제로 인한 출혈 합병증에 대한 안히드로이카리틴의 영향 실험 결과에 따르면, 안히드로이카리틴은 혈전용해제로 인한 심근경색증 출혈 합병증의 발생률을 유의하게 감소시킬 수 있고, 혈전용해제와 동시에 사용하여도 혈전용해제의 혈전용해 효과에 영향을 미치지 않는다.
약효 실시예 10의 혈액 응고 인자 IX 유전자 녹아웃 혈우병 마우스 출혈 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향 결과에 따르면, 안히드로이카리틴이 IX 유전자 녹아웃 혈우병 마우스 출혈 시간을 효과적으로 단축시킬 수 있고, 각 군의 마우스의 혈액 루틴에는 유의한 차이가 없음을 설명한다.
약효 실시예 11의 후천성 A형 혈우병의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향 결과에 따르면, 안히드로이카리틴은 혈우병 환자의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간을 유의하게 단축시키고, 혈우병 환자의 혈액 응고를 촉진할 수 있다.
안히드로이카리틴은 유전적 요인으로 인한 혈우병에 대해 유의한 치료 작용을 가지고 있을 뿐만 아니라, 이차성 혈우병에 대해서도 유의한 치료 효과를 가지고 있다.
안히드로이카리틴이 출혈성 질환의 예방 및 치료에 사용될 경우, 투여 경로는 경장 투여 경로 및 비경구 투여 경로를 포함하고, 비경구 투여 경로는 피하, 피내, 동맥, 정맥, 근육, 관절, 척수강 내, 두개 내, 흉강 내, 복강 내 주사 또는 점적, 비강, 협측, 설하, 기관, 요도, 직장 또는 병소 국소 투여 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다른 약물과 동시에 복용할 수 있거나 예방을 위해 미리 복용할 수 있다.
본 발명은 출혈성 질환의 예방 및 치료하는 약물의 제조에서 안히드로이카리틴의 용도를 제공하는 이외에, 상기 질환의 치료 시 사용되는, 안히드로이카리틴 및 약학적으로 허용 가능한 약학적 부형제를 포함하는 약제학적 제제를 더 제공한다.
본 발명 제제에 사용되는 약학적 부형제는 당업자에게 공지된 통상적인 부형제이다.
적합한 약학적 부형제는 "약학적 부형제 대전"(제123 페이지, Sichuan Science and Technology Press, 1993년 출판, Luo Mingsheng 및 Gao Tianhui 편집)에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 마이크로에멀젼 제제의 제조에 일반적으로 사용되는 약학적 부형제는 대두유, 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르, 1,2-프로판디올, 히드로제네이티드 코코-글리세리드, 라우로일 마크로골-32-글리세리드, 마크로골 3350, 홍화유, 면실유, 데카글리세롤 모노스테아레이트를 포함하지만 이에 한정되지 않고; 점적 환제 제제의 제조에 일반적으로 사용되는 약학적 부형제는 마크로골 6000, 마크로골 1000을 포함하지만 이에 한정되지 않으며; 캡슐 제제의 제조에 일반적으로 사용되는 약학적 부형제는 락토오스 및 옥수수 전분을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 연질 캡슐 제제의 제조에 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 중쇄 지방산 글리세리드, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 1,2-프로판디올 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
당업자는 실제 필요에 따라 적합한 약학적 부형제를 선택하고, 당업계에 공지된 방법을 통해 본 발명의 제제를 조제할 수 있다. 상기 제제는 고체, 액체, 오일, 에멀젼, 젤, 에어로졸, 흡입제, 스프레이, 캡슐, 환제, 패치 및 좌제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 안히드로이카리틴은 혈소판 기능 장애를 개선하고, 트롬보플라스틴 시간을 단축하며, 혈액 응고를 촉진할 수 있으므로, 혈소판 기능 이상 및 이로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈액 응고로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈관벽으로 인한 출혈성 질환 또는 비정상적인 항응고 및 섬유소 용해로 인한 출혈성 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
이하, 구체적인 실시형태를 통해 본 발명을 더 설명하며, 본 발명은 아래의 실시예에 한정되지 않는다.
제제 실시예 1: 안히드로이카리틴 마이크로에멀젼 제제
안히드로이카리틴: 10 g
대두유: 35 g
폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르: 60 g
1,2-프로판디올: 30 g
제조 공정: 조제량의 대두유, 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르, 1,2-프로판디올을 칭량하여 혼합한 후 균일하게 교반한 다음, 안히드로이카리틴을 첨가하여 용해시키거나 초음파 처리하여 용해를 가속화하여 투명한 용액, 즉 안히드로이카리틴 마이크로에멀젼 제제를 얻었다. 레이저 입도 측정기로 입도를 측정한 결과, 평균 입경은 15 nm이였다.
제제 실시예 2: 안히드로이카리틴 마이크로에멀젼 제제
안히드로이카리틴: 0.1 g
히드로제네이티드 코코-글리세리드: 5 g
라우로일 마크로골-32-글리세리드: 20 g
1,2-프로판디올: 5 g
마크로골 3350: 20 g
제조 공정: 조제량의 히드로제네이티드 코코-글리세리드, 라우로일 마크로골-32-글리세리드, 1,2-프로판디올, 마크로골 3350을 칭량하여 혼합한 후 균일하게 교반한 다음, 안히드로이카리틴을 첨가하여 용해시키거나 초음파 처리하여 용해를 가속화하여 투명한 용액, 즉 안히드로이카리틴 마이크로에멀젼 제제를 얻었다. 레이저 입도 측정기로 입도를 측정한 결과, 평균 입경은 40 nm이였다.
제제 실시예 3: 안히드로이카리틴 주사액
안히드로이카리틴: 500 g
PEG-400: 2 L
에탄올: 0.5 L
0.9 % 염화나트륨 용액: 10 L까지 첨가
제조 공정: 조제량의 PEG-400에 안히드로이카리틴을 첨가하고, 교반하여 용해시키며, 0.9 % 염화나트륨 용액을 10 L까지 첨가하여 균일하게 교반하고, 0.5 % 주사용 활성탄을 첨가하여 교반하며, 탈탄하여 안히드로이카리틴 주사액을 얻었다.
제제 실시예 4: 안히드로이카리틴 주사액
안히드로이카리틴: 10 g
에탄올: 2 L
트윈-80: 1500 g
주사용수: 10 L까지 첨가
제조 공정: 조제량의 에탄올 및 트윈-80을 균일하게 혼합하고, 안히드로이카리틴을 첨가하며, 교반하여 용해시키고, 주사용수를 10 L까지 첨가하여 균일하게 교반하며, 0.5 % 주사용 활성탄을 첨가하여 교반하고, 탈탄하여 안히드로이카리틴 주사액을 얻었다.
제제 실시예 5: 안히드로이카리틴 주사액
안히드로이카리틴: 1 g
에탄올: 3.3 L
주사용수: 10 L까지 첨가
제조 공정: 조제량의 에탄올을 안히드로이카리틴에 첨가하고, 교반하여 용해시키며, 주사용수를 10 L까지 첨가하여 균일하게 교반하며, 0.5 % 주사용 활성탄을 첨가하여 교반하고, 탈탄하여 안히드로이카리틴 주사액을 얻었다.
제제 실시예 6: 안히드로이카리틴 점적 환제 제제
안히드로이카리틴: 5.0 g
마크로골-6000: 14.5 g
마크로골-1000: 5.0 g
1000알로 제조
제조 공정: 100메쉬의 체를 통과하는 조제량의 안히드로이카리틴을 칭량하여, 워터 배스에서 가열하여 용융시킨 조제량의 마크로골 6000, 마크로골 1000을 함유한 혼합액에 첨가하며, 충분히 교반하여 균일해지도록 하여 점적병에 넣고, 95±2℃의 조건에서 4 ~ 6 mL의 메틸 실리콘 오일이 들어 있는 유리 응축 칼럼 내에 떨어뜨리고, 성형 후 꺼내어 흡수지로 부착된 메틸 실리콘 오일을 흡수하여 안히드로이카리틴 점적 환제 제제를 얻었다.
제제 실시예 7: 안히드로이카리틴 장용 연질 캡슐 제제
내용물의 조성:
안히드로이카리틴: 10 g
무수 에탄올: 10 g
1,2-프로판디올: 10 g
폴리옥시에틸렌 피마자유: 50 g
중쇄 지방산 글리세리드: 20 g
캡슐 외피의 조성:
젤라틴: 10 g
글리세린: 5 g
정제수: 10 g
장용 코팅액의 조성:
Eudragit L30D-55: 100 g
트리에틸 시트레이트: 3 g
탈크: 7.5 g
정제수: 200 g
제조 공정: 조제량의 중쇄 지방산 글리세리드, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 1,2-프로판디올, 무수 에탄올을 칭량하여 혼합한 후 균일하게 교반한 다음, 안히드로이카리틴을 첨가하여 용해시키거나 초음파 처리하여 용해를 가속화하여 연질 캡슐 마이크로에멀젼 내용물을 얻었다. 조제량의 젤라틴, 글리세린, 정제수를 칭량하여 균일하게 혼합한 후 압착하여 캡슐 외피로 제조한 다음, 조제량의 Eudragit L30D-55, 트리에틸 시트레이트, 탈크, 정제수를 칭량하여 균일하게 혼합하여 장용 코팅액을 제조하였다. 안히드로이카리틴을 함유한 연질 캡슐 마이크로에멀젼 내용물을 캡슐 외피로 패키징하여 연질 캡슐로 제조하고, 연질 캡슐에 장용 피막을 코팅하여 장용 연질 캡슐을 제조하였다.
제제 실시예 8: 안히드로이카리틴 캡슐 제제
안히드로이카리틴: 50 g
락토오스: 120 g
옥수수 전분: 130 g
스테아린산 마그네슘: 5 g
제조 공정: 100 g의 안히드로이카리틴, 120 g의 락토오스 및 130 g의 옥수수 전분을 혼합기에서 10 ~ 15분 동안 혼합하고, 5 g의 스테아린산 마그네슘을 첨가하여 1 ~ 3분 동안 혼합하여 1000개의 캡슐 쉘에 넣어 안히드로이카리틴 캡슐 제제를 얻었다.
제제 실시예 9: 안히드로이카리틴 정제
안히드로이카리틴: 50 g
미결정 셀룰로오스: 200 g
소듐 카복시메틸 스타치: 8g
스테아린산 마그네슘: 1.5 g
8 % 전분 슬러리: 적당량
제조 공정: 안히드로이카리틴 및 부형제인 미결정 셀룰로오스, 소듐 카복시메틸 스타치를 균일하게 혼합하고, 적당량의 전분 슬러리를 첨가하여 연질 재료를 제조한 다음, 16메쉬의 체를 통과시켜 펠레타이징하였다. 젖은 입자를 60℃에서 건조시키고, 건조한 입자를 20메쉬의 체를 통과시켜 입자를 균일하게 하여 건조한 입자로부터 미분체를 스크리닝하고, 스테아린산 마그네슘과 균일하게 혼합한 다음 건조한 입자와 균일하게 혼합하며, 1정당 약 260 mg로 타정하여 안히드로이카리틴 정제를 얻었다.
제제 실시예 10: 안히드로이카리틴 분말 주사제
안히드로이카리틴: 10 g
글루코오스: 500 g
주사용수: 10 L까지 첨가
동결 건조 제품: 총 2000개 제조
제조 공정: 조제량의 주사용 안히드로이카리틴 원료를 칭량하고, 적당량의 주사용수를 첨가하여 용해시킨다. 다음, 사전에 멸균 및 발열원 제거 처리된 포도당을 소정량을 첨가하여 균일하게 혼합한 다음, 주사용수를 규정된 10 L까지 첨가하였다. 상기 약액에 주사제를 첨가하고 50 g의 활성탄으로 60 ~ 80℃에서 30분 동안 가열하며, 여과막으로 여과하여 여과액을 수집하였다. 상기 여과액을 무균 조작법에 따라 멸균 필터로 양압 멸균 여과를 수행하고, 0.22 μM 밀리포어 필터로 여과하며, 여과액에 대해 발열원 검사 및 반제품 함량 검사를 수행한 다음 바이알에 나누어 넣었다. 전용 동결 건조 상자에서, -40℃이하에서 1.5 ~ 3.5 시간 동안 예비 동결하고, 진공 승화하여 유리 수분의 90 %를 제거한 후 가열 건조시키며(최고 온도는 35℃를 초과해서는 아니됨), 동결 건조 후 안히드로이카리틴 분말 주사제를 제조하여 얻었다.
약효 실시예 1: 혈소판 활성화 기능 및 시험관 내 혈소판 응집 기능에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 혈소판 활성화 기능에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1.1 실험 동물
SD 래트, SPF 등급, 체중 250 ~ 300 g, 암컷 절반 수컷 절반, 암컷 래트는 임신하지 않음.
1.2 혈소판 활성화의 유세포 분석
래트의 안와에서 0.5 mL의 혈액을 채취하고, 3.8 % 구연산나트륨 항응고제(혈액과 항응고제의 비율은 9:1임)로 항응혈제를 제조하였다. 50 μL의 항응혈제를 취하여 각 동물의 혈소판 자발적 활성화율을 측정하고, 50 μL의 항응혈제를 별도로 취하여 여기에 최종 농도가 10 μmol인 50 μL의 아데노신 이인산을 첨가하여 활성화하였다. 상기 2가지 항응혈제에 각각 1.0 ~ 1.5 μL의 CD62pPE/Cy7 및 CD61PE를 첨가하여 이중 표지하되, CD61로 모든 혈소판을 표지하고, CD62p로 활성화된 혈소판을 표지하였다. 50 μL의 항응혈제를 취하여 여기에 최종 농도가 10 μmol인 50 μL의 아데노신 이인산을 첨가하여 활성화하였다. G2a-PE/Cy7의 위내 투여 및 G-PE의 위내 투여에 의해 이중 표지된 것을 이소형 대조군으로 사용하였다. 이상의 각 튜브를 4℃의 어두운 조건에서 20분 동안 배양하였다. 다음, 0.5 mL의 4 % 파라포름알데히드를 첨가하여 10분 동안 고정시켰다. 50 μL의 고정된 혈액 샘플을 취하여 1 mL의 희석액으로 희석한 후 유세포 분석기로 분석하였다. CD61PE/사이드 스캐터(Side Scatter, SSC) 2-매개변수 산점도에서 혈소판 세포군을 확정하고, 5000개의 혈소판을 계수하며, CD61/CD62p 산점도에서 CD61 및 CD62p 양성 발현의 세포 수를 추가적으로 계수하고, CD62p 양성 발현율이 CD61 발현율에서 차지하는 백분율로 혈소판의 활성화율(%)을 반영하였다.
1.3 래트 체내에서 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 활성화에 대한 안히드로이카리틴의 영향
24마리의 래트를 취하여 군당 8마리씩 3개의 군으로 나누고, 각각 3 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg의 안히드로이카리틴을 3일 연속 1일 1회 위내 투여하며, 투여 전 및 마지막 투여 후 20분에 각각 안와에서 1.0 mL의 혈액을 채취하여 그 중 0.5 mL를 혈액 루틴 검사에 사용하고, 0.5 mL를 항응혈제의 제조에 사용하며, 상기 혈소판 활성화의 유세포 분석법에 따라 처리한 후 유세포 분석기로 분석하여, 투여 전 아데노신 이인산에 의해 활성화된 혈소판 활성화율(기준치) 및 투여 후 아데노신 이인산에 의해 활성화된 혈소판 활성화율을 검출하고, 양자를 비교하였다. 동시에 투여 전에 50 μL의 래트 항응혈제를 취하여 아데노신 이인산을 첨가하지 않고 동일 방법으로 동물 항응혈제의 자발적 활성화율을 측정하였다. 매 번 채혈 전에 동물을 16 ~ 24 시간 동안 금식시켰다.
1.4 검출 항목 및 실험 결과
(1) 래트 체내에서 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 활성화에 대한 영향
투여 전 동물의 말초 항응혈제를 아데노신 이인산에 의해 활성화시킨 후, CD61이 표지된 모든 혈소판에서, 활성화된 혈소판의 비율은 자발적 활성화율에 비해 유의하게 증가하였는데, 즉 CD62p의 발현이 유의하게 증가하였으므로, 이는 아데노신 이인산이 혈소판 활성화율의 증가를 유도할 수 있음을 보여준다. 안히드로이카리틴 투여 3일 후, 동물의 말초 항응혈제는 동일한 조건에서 아데노신 이인산에 의해 활성화된 후, CD61이 표지된 모든 혈소판에서, CD62p의 발현이 유의하게 증가하였는데, 즉 아데노신 이인산에 의해 활성화된 혈소판의 활성화율은 증가하였고, 투여 전 기준치와 비교하여 유의한 차이가 있다. 본 실험 조건에서, 안히드로이카리틴을 위내 투여하면 래트의 말초 항응혈제에서 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 활성화를 유의하게 촉진할 수 있음을 제시한다. 구체적으로 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1] 체내 투여 전과 후 아데노신 이인산에 의해 활성화된 혈소판 활성화율의 비교
Figure pct00003
(2) 혈액 루틴안히드로이카리틴의 용량군의 혈액 루틴 수치는 투여 전과 비교하여 유의한 차이가 없고, 특히 혈소판 수는 유의한 차이가 없는데, 이 결과는 안히드로이카리틴이 혈소판 활성을 증가시키는 동시에 혈소판 수에 영향을 미치지 않음을 설명하며, 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2] 아데노신 이인산에 의해 유도된 래트 혈액 루틴에 대한 안히드로이카리틴의 영향
Figure pct00004
2. 시험관 내 혈소판 응집 기능에 대한 안히드로이카리틴의 영향
2.1 시험관 내 혈소판 응집 촉진 활성 실험 방법
집토끼를 프로카인으로 국소 마취한 후, 총경동맥을 외과적으로 분리하여 채혈하고, 질량 분율이 3.8 %인 구연산나트륨 항응고제를 사용하며, 800 r/min으로 10분 동안 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 제조하고, 나머지 부분을 다시 300 r/min으로 10분 동안 원심분리하여 혈소판 결핍 혈장(PPP)을 제조하여 혈소판 응집 실험을 수행하였다. 측정 튜브에 265 μL의 PRP, 30 μL의 안히드로이카리틴(최종 농도가 각각 0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L 및 5 mmol/L이도록 함)을 넣고 5분 동안 배양하며, 5 μL의 아데노신 이인산(최종 농도 25 μmol/L)을 유도제로 사용하여 5분 이내 최대 응집률을 관찰하고 기록하였다. 질량 분율이 1 %인 디메틸 설폭사이드를 대조군으로 사용하여 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 응집에 대한 각 농도의 안히드로이카리틴의 촉진 작용을 관차랗였다.
2.2 실험 결과
시험관 내에서 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 응집 작용에 대한 상이한 농도의 안히드로이카리틴의 촉진 작용은 표 3에 나타낸 바와 같고, 표로부터 알 수 있는 바, 안히드로이카리틴의 각 농도는 모두 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 응집 활성을 촉진하는 작용을 가지고 있고, 농도가 증가함에 따라 촉진 작용이 증가되는데, 이는 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 응집 활성에 대한 안히드로이카리틴의 촉진 작용이 용량 의존적 관계를 나타냄을 설명한다.
[표 3] 시험관 내에서 아데노신 이인산에 의해 유도된 혈소판 응집 활성에 대한 안히드로이카리틴의 촉진 작용
Figure pct00005
약효 실시예 2: 아스피린 또는 클로피도그렐으로 인한 뇌허혈 재관류 후 출혈성 변형에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 실험 과정
1.1 모델 제작 및 실험 방법
수컷 ICR 마우스, 150마리, Jinan Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd., SPF 등급, 체중 27 ~ 30 g. 동물 등록 번호: No.1107262011001201, No.1107262011001347.
마우스를 입실시킨 후 3 ~ 7일 동안 검역하여 건강한(출산 경험이 없는 암컷) 마우스를 피험 동물로 선택하였다. 검역 기간 동안의 주요 검사 내용은 신청에 필요한 동물 수 및 품질 지표와 일치한지 여부, 일반 상태, 체중을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 위에서 언급한 검역에 통과하지 못한 동물은 본 실험에서 취급하지 않는다. 구체적으로 표 4에 나타낸 바와 같다.
[표 4] 마우스 그룹화 및 투여 상황
Figure pct00006
비고: 투여 시작일을 Day1로 정의한다.
5 주령의 ICR 수컷 마우스를 6 주령까지 사육하고, 체중에 따라 대조군, 모델군, 안히드로이카리틴-3 mg/kg군, 안히드로이카리틴-6 mg/kg군, 안히드로이카리틴-12 mg/kg군, 이카리틴-12 mg/kg군으로 나누었다. 그룹화 후 1일째부터 3일째에 안히드로이카리틴의 각 군에 3 mg/kg, 6 mg/kg, 12 mg/kg의 안히드로이카리틴을 각각 위내 투여하고, 이카리틴군에 12 mg/kg의 이카리틴을 위내 투여하되, 1일 1회 투여하며, 나머지 각 군에 상응한 용매를 위내 투여하였다. 대조군을 제외하고 나머지 각 군에 아스피린(100 mg/kg) 또는 클로피도그렐(15 mg/kg)을 1일 1회 위내 투여하되, 위내 투여 부피는 모두 10 mL/kg이다.
3일째에 투여 10분 후, 마우스에 70 mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 마취한 후, 뇌허혈 재관류(MCAO) 수술을 수행하되, 허혈 1시간, 재관류 23시간 수행하였다.
수술 후 24시간이 실험 종말점이다.
1.2 검출 지표
출혈률: 마우스에 70 mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 마취한 후, 뇌조직을 취하여 뇌출혈 상황을 기록하고, 각 군의 마우스 뇌출혈률을 계산하였다. 뇌출혈률 %=뇌출혈 동물 수/각 군의 생존 동물 수×100.
2. 데이터 처리
모든 데이터를 Excel 파일에 입력하고, SPSS17.0으로 통계적 분석을 수행하며, 평균±표준편차(mean±SD)의 방식으로 나타내었다. 실험 데이터에 대해 일원분산분석(one-wayANOVA) 및 ttest를 사용하여 각 군의 데이터를 통계적으로 분석하고 비교하였다.
3. 실험 결과
출혈률에 대한 영향
실험 결과에 따르면, 아스피린과 뇌허혈 재관류의 병용에 의해 유도된 출혈성 변형 모델에서, 모델군의 출혈률은 85.7 %이고, 안히드로이카리틴을 사전에 투여하여 예방한 후의 출혈률은 유의하게 감소되었으며, 안히드로이카리틴-3 mg/kg군, 안히드로이카리틴-6 mg/kg군, 안히드로이카리틴-12 mg/kg군의 출혈률은 각각 37.5 %, 25.0 %, 22.2 %이고, 이카리틴을 사전에 투여하여 예방한 후의 출혈률은 유의하게 개선되지 않았으며, 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.
클로피도그렐과 뇌허혈 재관류의 병용에 의해 유도된 출혈성 변형 모델에서, 모델군의 출혈률은 80 %이고, 안히드로이카리틴을 사전에 투여하여 예방한 후의 출혈률은 유의하게 감소되었으며, 안히드로이카리틴-3 mg/kg군, 안히드로이카리틴-6 mg/kg군, 안히드로이카리틴-12 mg/kg군의 출혈률은 각각 42.9 %, 25.0 %, 25.0 %이고, 이카리틴을 사전에 투여하여 예방한 후의 출혈률은 유의하게 개선되지 않았으며, 결과는 표 6에 나타낸 바와 같다.
[표 5] 아스피린으로 인한 뇌허혈 후 출혈성 변형의 출혈률에 대한 안히드로이카리틴의 영향
Figure pct00007
[표 6] 클로피도그렐으로 인한 뇌허혈 후 출혈성 변형의 출혈률에 대한 안히드로이카리틴의 영향
Figure pct00008
본 연구에서는 문헌을 참조하여 항혈소판응집제(아스피린 또는 클로피도그렐)를 선택하고 뇌허혈 재관류와 병용하여 출혈성 변형 모델을 성공적으로 구축하였고, 출혈 상황을 통해 출혈성 변형 동물 모델에 대한 안히드로이카리틴의 예방 작용을 조사하였다.
본 연구에서는 출혈성 변형 마우스 동물 모델을 성공적으로 복제하여 출혈률을 유의하게 증가시켰고, 안히드로이카리틴을 투여하여 예방한 후, 상기 각 지표는 모두 유의하게 감소되었는데, 이는 안히드로이카리틴이 아스피린 또는 클로피도그렐으로 인한 뇌허혈 재관류 후 출혈성 변형을 유의하게 억제할 수 있음을 제시한다.
약효 실시예 3: 헤파린 나트륨으로 인한 마우스 출혈 시간 연장에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 약품 및 출처
헤파린 나트륨 주사액(출처: Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd.; 배치 번호: 51701106)
에탐실레이트 주사액(출처: Shandong Fangming Pharmaceutical Group Co., Ltd.; 배치 번호: 18060672)
2. 실험 동물 및 그룹화
5 ~ 6 주령의 ICR 마우스 72마리, 체중 19 ~ 21 g, 암컷 절반 수컷 절반. 마우스를 입실시킨 후 7일 동안 검역하여 건강한 마우스를 피험 동물로 선택하였다. 검역 첫날과 마지막 날에 제충을 측정하였다. 검역 마지막 날의 체중에 따라 간단한 무작위법으로 암컷과 수컷 동물을 각각 6군으로 나누되, 각각 정상군(C), 모델군(V), 안히드로이카리틴 저용량군, 중용량군, 고용량군(2 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg, L, M, H) 및 양성 약물군(200 mg/kg 에탐실레이트, P)이다.
3. 사전 투여 및 모델링
그룹화가 완료된 후, 정상군, 모델군에 10 ml/kg의 안히드로이카리틴 용매를 투여하되, 용매는 12 g의 하이프로멜로스 E5, 0.1 g의 황산 도데실 나트륨을 1 L의 물에 첨가하여 조제된다. 안히드로이카리틴의 용량군에 각각 2 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg의 안히드로이카리틴을 5일 연속 1일 1회 위내 투여하였다. 양성 약물군에 200 mg/kg의 에탐실레이트 주사액을 5일 연속 1일 1회 복강 내 주사하였다. 마지막 사전 투여 1시간 후, 모델군 및 각 투여군에 150 U/kg의 헤파린 나트륨 주사액을 꼬리 정맥을 통해 주사하여 모델링하고, 정상군에 10 ml/kg의 염화나트륨 주사액을 꼬리 정맥을 통해 주사하였다.
4. 검출 지표
4.1 출혈 시간
모델링 15분 후, 꼬리를 잘라 각 마우스의 출혈 시간을 측정하였다.
4.2 혈액 루틴 및 혈액 응고 4가지 항목
출혈 시간을 측정한 후, 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 마취하고, 복부 주정맥에서 채혈하여 혈액 루틴 및 혈액 응고 4가지 항목(프로트롬빈 시간, 트롬보플라스틴 시간, 트롬빈 시간, 피부리노겐)을 검출하였다.
5． 실험 결과
5.1 출혈 시간
각 군의 마우스의 출혈 시간은 표 7에 나타낸 바와 같다.
[표 7] 헤파린 나트륨으로 인한 마우스 출혈 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향
Figure pct00009
표로부터 알 수 있는 바, 정상군에 비해, 모델군의 마우스 출혈 시간이 유의하게 연장되었는데, 이는 모델링에 성공하였음을 설명한다. 모델군에 비해, 각 투여군의 마우스 출혈 시간이 유의하게 단축되었는데, 이는 안히드로이카리틴이 출혈하는 마우스의 출혈 시간을 단축시킬 수 있음을 설명하고, 용량이 증가함에 따라 출혈 시간이 더욱 유의하게 단축되었는데, 이는 안히드로이카리틴의 응고 촉진 작용이 용량 의존적임을 설명하며, 고용량군은 양성 대조 약물군과 비교하여 유의한 차이가 있는데, 이는 안히드로이카리틴의 응고 촉진 작용이 양성 대조 약물군의 응고 촉진 작용보다 우수함을 설명한다.
5.2 혈액 루틴 및 혈액 응고 4가지 항목
각 군의 마우스의 혈액 루틴 및 혈액 응고 4가지 항목 결과는 각각 표 8 및 표 9에 나타낸 바와 같다.
[표 8] 각 군의 마우스의 혈액 루틴 검사 결과
Figure pct00010
[표 9] 각 군의 마우스의 혈액 응고 4가지 항목 검사 결과
Figure pct00011
상기 표로부터 알 수 있는 바, 각 군의 마우스의 혈액 루틴 및 혈액 응고 4가지 항목에서 모두 유의한 차이가 없는데, 이는 안히드로이카리틴이 헤파린 나트륨으로 인한 출혈 시간 연장을 단축시킬 때 혈액 루틴 및 혈액 응고 4가지 항목에 유의한 영향을 미치지 않음을 보여준다.
약효 실시예 4: 아스피린으로 인한 마우스 출혈 시간 연장에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 약품 및 출처
아스피린(출처: Shantou Jinshi Pharmaceutical Factory Co., Ltd.; 배치 번호: 1903012)
에탐실레이트 주사액(출처: Shandong Fangming Pharmaceutical Group Co., Ltd.; 배치 번호: 1905032)
2. 실험 동물 및 그룹화
5 ~ 6 주령의 ICR 마우스 96마리, 체중 19 ~ 21 g, 암컷 절반 수컷 절반. 마우스를 입실시킨 후 7일 동안 검역하여 건강한 마우스를 피험 동물로 선택하였다. 검역 첫날과 마지막 날에 제충을 측정하였다.
검역 마지막 날의 체중에 따라 간단한 무작위법으로 암컷과 수컷 동물을 각각 6군으로 나누되, 각각 정상군(C), 모델군(V), 안히드로이카리틴 저용량군, 중용량군, 고용량군(2 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg, L, M, H) 및 양성 약물군(200 mg/kg 에탐실레이트, P)이다.
3. 사전 투여 및 모델링
그룹화가 완료된 후, 정상군, 모델군에 10 ml/kg의 안히드로이카리틴 용매를 투여하고, 안히드로이카리틴의 용량군에 각각 2 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg의 안히드로이카리틴을 5일 연속 1일 1회 위내 투여하였다. 양성 약물군에 200 mg/kg의 에탐실레이트 주사액을 5일 연속 1일 1회 복강 내 주사하였다. 마지막 사전 투여 1시간 후, 모델군 및 각 투여군에 20 mg/kg의 아스피린을 위내 투여하여 모델링하고, 정상군에 동일한 부피의 생리식염수를 위내 투여하였다.
4. 출혈 시간 측정
모델링 15분 후, 꼬리를 잘라 각 마우스의 출혈 시간을 측정하였다.
5. 실험 결과
각 군의 마우스 출혈 시간은 표 10에 나타낸 바와 같다. 정상군에 비해, 모델군의 마우스 출혈 시간이 유의하게 연장되었는데, 이는 모델링에 성공하였음을 설명한다. 모델군에 비해, 각 투여군의 마우스 출혈 시간이 유의하게 단축되었는데, 이는 안히드로이카리틴이 출혈하는 마우스의 출혈 시간을 단축시킬 수 있음을 설명하고, 용량이 증가함에 따라 출혈 시간이 더욱 유의하게 단축되었는데, 이는 안히드로이카리틴의 응고 촉진 작용이 용량 의존적임을 설명하며, 고용량군은 양성 대조 약물군과 비교하여 유의한 차이가 있는데, 이는 안히드로이카리틴의 응고 촉진 작용이 양성 대조 약물군의 응고 촉진 작용보다 우수함을 설명한다.
[표 10] 아스피린으로 인한 마우스 출혈 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향
Figure pct00012
약효 실시예 5: 혈전용해제의 혈전용해 효과에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 래트 복부 대동맥 혈전 모델의 구축
다음과 같은 방법에 따라 래트 복부 대동맥 혈전 모델을 제조하였다. 40 mg/kg 의 1.5 % 펜토바르비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 래트를 마취하였다. 래트의 복부를 제모하여 피부준비하고, 앙와위 자세로 래트 플레이트에 고정하였다. 래트의 복부 피부를 절개하고, 현관과 주변 조직을 분리하며, 복부 대동맥을 노출시킨 후, 유리 박리용 바늘로 복부 대동맥을 조심스럽게 분리하였다. 복부 대동맥 아래에 0.7cmХ1.5cm의 주석 호일 스트립을 받친 다음, 35 % FeCl3 용액이 함침된 여과지 스트립(0.5cmХ1.0cm)으로 복부 대동맥을 감싸고, 30분 후 여과지 스트립을 제거하였는데, 이때 혈관벽의 색은 분명히 어두워졌고, 현미경으로 혈관 내에 색전이 형성된 것을 볼수 있었으며, 병리학 섹션은 혈관이 혈전에 의해 막힌 것으로 나타났다.
2. 그룹화 및 투여
SD 래트를 체중에 따라 군당 10마리씩 혈전 모델군, 룸브로키나제 캡슐군 및 룸브로키나제 캡슐+안히드로이카리틴군인 3개의 군으로 무작위로 나누었다. 모델링 5분 후 30Х104 U/kg의 룸브로키나제 캡슐을 십이지장에서 직접 주사하여 투여하고, 18 mg/kg의 안히드로이카리틴을 위내 투여하며, 혈전 모델군은 동일한 부피의 증류수로 대체하였다.
3. 재료 채취
복부 대동맥의 양쪽 끝을 지혈 겸자로 고정하고, 모델링 부위의 혈관 분절을 완전히 제거하며, 여과지로 감싼 0.5 cm의 혈관 분절을 정확하게 절단하여 무게를 측정하고, 나머지 혈관 분절은 10 % 포름알데히드에 보관하였다.
4. 래트 혈전 무게의 측정
전자저울로 제거된 혈관 분절의 무게를 측정하고, 혈전을 제거한 후 혈관의 무게를 측정하였으며, 혈전 습중량 = 혈전과 혈관의 총 무게 - 혈관의 무게이다.
제거된 혈전을 80℃의 오븐에서 건조시키고 밤새 방치한 후 혈전의 건중량을 측정하였다.
5. 실험 결과
각 군의 래트의 혈전 무게는 아래 표에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 모델군에 비해, 룸브로키나제군의 혈전 무게는 유의하게 감소되었는데, 이는 룸브로키나제가 유의한 혈전용해 작용을 갖고 있음을 설명한다. 룸브로키나제군에 비해, 룸브로키나제+안히드로이카리틴군의 혈전은 유의한 차이가 없는데, 이는 안히드로이카리틴이 래트의 혈전에 대한 룸브로키나제의 용해 작용에 영향을 미치지 않음을 설명한다.
[표 11] 각 군의 래트의 혈전 무게에 대한 안히드로이카리틴의 영향
Figure pct00013
약효 실시예 6: 혈전용해제로 인한 출혈성 변형에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 동물 모델의 제조
다음과 같은 방법에 따라 래트 중대뇌동맥 자가혈전색전증 모델을 제조하였다. 래트에 350 mg/kg 체중의 10 % 염소산 수화물을 복강 내 주사하여 마취하고, 앙와위 자세로 수술대에 고정하며, 무균 조작 규정에 따라 일상적인 피부 수독하고 드레이핑하였다. 목의 정중 피부에서 약 3.0 cm 길이로 절개하고, 근육과 피하 조직을 무딘 박리(blunt dissection)하며, 오른쪽 양측 총경동맥, 외경동맥 및 내경동맥을 분리하고, 미주신경의 손상을 피하며, 내경동맥을 두개골 기저부로부터 분리하고, 양측 총경동맥 분기점에서 외경동맥을 결찰하였다. 1 ml의 주사기를 사용하여 래트의 대퇴동맥에서 0.1 ml의 동맥혈을 채취하고, 4U의 트롬빈을 흡입하며, 균일하게 혼합하여 8 ~ 10분 동안 방치한 후, 혈액이 응고된 후 24G 정맥 유치침에 주입하여 약 1 cm 길이의 색전을 제조한 후 1 ~ 2 ml의 생리식염수 주사기에 연결하였다. 다음, 유치침을 외경동맥과 내경동맥의 분기점 앞에서 양측 총경동맥에 천자하여 내경동맥을 전방 및 내측으로 약 8 ~ 10 mm 들어가 바늘심을 빼내고, 주사기의 색전과 생리식염수를 내경동맥으로 빠르게 플러시(flush)한 다음 결찰하고 봉합하였다. 모의 수술군과 대조군은 색전 대신 생리식염수를 주입하는 것을 제외하고는 나머지 수술 단계는 모두 위의 혈전용해 모델의 각 군과 동일하다.
2. 동물 취급 기준
모델링 2시간 후 래트의 증상 및 징후를 관찰하였으며, 걸을 때 허혈 반대측으로 회전하는 허혈 동측 Horner 증후군; 반대측으로 기울림; 래트의 꼬리를 공중에 매달았을 때 뇌허혈 반대측 앞다리 굽힘, 들어올림, 어깨 내전, 팔꿈치 신전 등 증상 및 징후는 모델이 성공적으로 제작되었음을 나타낸다.
3. 실험 그룹화 및 투여
102마리의 래트를 모의 수술군, rt－PA 혈전용해군(혈전용해군), rt－PA 혈전용해+안히드로이카리틴 저용량군, 중용량군, 고용량군으로 무작위로 나누고, 그 중 모의 수술군에는 18마리 있고, 나머지 각 군에는 각각 21마리가 있다. 그 중 각 군은 상이한 희생 시점(혈전용해 후 3, 6, 24시간)에 따라 평균적으로 그룹화하되, 모의 수술군은 각 시점에 6마리씩, 나머지 각 군은 3시간 시점에 각각 9마리씩, 다른 시점에 각각 6마리씩 그룹화되었다. 20마리의 래트를 별도로 취해 예비로 사용하였는데, 예를 들어 모델링이 실패하면(사망 또는 0점으로 평점됨) 무작위로 보충하였다.
모의 수술군을 제외한 나머지 각 군은 모두 모델링 3시간 후 대퇴정맥을 통해 알테플라제(rt－PA)(5 mg/kg, rt－PA 조제용 멸균수를 1 ml까지 첨가함)를 투여하였다. 모의 수술군에 동일한 부피의 생리식염수를 투여하였다.
치료군은 두 번 나누어 투여하되, 각각 모델링 후 및 혈전용해 치료 후 약물을 즉시 위내 투여하였다. 투여량은 각각 2 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg이다. 모의 수술군에 동일한 부피의 생리식염수를 투여하였다.
4. 지표 관찰 및 측정 방법
4.1 전체 상태 비교 및 혈액 루틴 검사
4.1.1 모의 수술군, 혈전용해군 및 혈전용해군+안히드로이카리틴군각 군의 래트의 전체 상태를 비교하였다.
4.1.2 모의 수술군, 혈전용해군 및 혈전용해군+안히드로이카리틴군각 군의 래트의 혈액 루틴을 검출하였다.
4.2 뇌경색 부피(율)의 측정
모의 수술군을 제외하고, 혈전용해 3시간 때 각 군에서 3마리의 래트를 희생시키고, 뇌조직을 -20 ℃의 냉장고에 20분 동안 급속 냉동한 후, 2 mm 두께의 관상 뇌 절편을 제조하여 2 % 트롬빈 용액에 침지하고, 37 ℃에서, 어두운 조건의 워터 배스에서 30분, ４ % 파라포름알데히드 용액에 방치하여 24시간 동안 고정하며, 촬형 후 이미지 분석 소프트웨어(Image-ProPlus6.0)로 경색 부피를 측정하였다. 경색 부피 = 비허혈측 반구 부피 - 허혈측 반구 비경색 영역 부피이고, 경색 부피 비율의 계산은 경색 부피와 비허혈측 반구 부피의 백분율(%)로 표시된다.
4.3 뇌출혈량의 측정:
(１) 표준 곡선 그리기
4마리의 건강한 래트를 별도로 취하여 과도한 마취로 희생시킨 후 심장 관류를 통해 혈액을 채취하였다. 8개의 대뇌 반구 조직을 취하여 각 반구 조직에 0 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL, 50 μL의 수컷 SD 래트의 동맥혈을 순차적으로 첨가한 다음, PH=7.4의 PBS를 총 부피가 3 ml 되도록 첨가하고, 30초 동안 균질화한 후 초음파로 용해시키며, ４ ℃에서 13000 r/min으로 30분 동안 원심분리하였다. 0.8 ml의 drabkin 시약을 취하여 0.2 ml의 각 샘플의 상청액과 혼합하고, 실온의 어두운 조건에서 10분 동안 방치한 후 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다(혈액을 첨가하지 않은 샘플의 흡광도를 0으로 설정함). 흡광도를 종좌표로 하고, 각 샘플 중의 혈액량을 횡좌표로 하여 표준 곡선을 그렸다.
(２) 경색측 반구 출혈량의 측정
뇌경색 래트의 경색측 반구 조직에 PH=7.4의 PBS를 총 부피가 3 ml 되도록 첨가하고, 30초 동안 균질화한 후 초음파로 용해시키며, 13000 r/min으로 30분 동안 원심분리하였다. 0.8 ml의 drabkin 시약을 취하여 0.2 ml의 각 샘플의 상청액과 혼합하고, 실온의 어두운 조건에서 10분 동안 방치한 후 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다(혈액이 함유되지 않은 뇌조직 샘플의 흡광도를 0으로 설정하고, 동일한 배치를 측정함). 표준 곡선에서 얻은 흡광도에 대응되는 혈액량이 출혈량이다.
5. 통계 처리
모든 실험 데이터는 평균±표준편차로 나타내고, PASWStatistics17.0 통계 소프트웨어 패키지로 데이터를 처리하였다. 군 간 및 군 내 비교는 일원분산분석을 사용하되, 등분산성이면 LSD 검정을 사용하고, 이분산성이면 Dunne 트롬빈 시간 T3 비모수 검정을 사용하였다. 관련 분석은 선형 상관 양측 Pearson 곱-차 상관계수 검정을 사용하고, 양측 Ｐ값＜0.05이면 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
6. 실험 결과
6.1 전체 상태 비교 및 혈액 루틴 검사
6.1.1 전체 상태 비교
모의 수술군의 래트는 정신 상태가 양호했으며 모피 색상과 광택은 정상이었다. 혈전용해군, 혈전용해군+안히드로이카리틴의 용량군은 수술 전보다 수술 후 정신 상태가 모두 유의하게 악화되어 털색이 칙칙하고 자발적인 활동이 감소되었으며 외부 세계에 대한 반응이 상대적으로 둔하였는데, 그 중 혈전용해군이 가장 나빴고, 혈전용해군+안히드로이카리틴 고용량군의 정신 상태가 가장 좋았다.
6.1.2 혈액 루틴 검사
혈액 루틴 검사 결과에 따르면, 혈전용해군과 혈전용해군+안히드로이카리틴군의 래트의 혈액 루틴 수치에는 유의한 차이가 없었고, 혈전용해군, 혈전용해군+안히드로이카리틴군과 모의 수술군 간에도 모두 유의한 차이가 없었다.
6.2 뇌경색 부피(율)의 측정
트롬빈 시간 C 염색을 통해 뇌허혈의 범위를 관찰할 수 있다. 염색 결과에 따르면, 모의 수술군 및 나머지 각 군의 비경색측 뇌조직은 균일하게 붉은 색을 띠는 반면 경색측 뇌조직은 분명히 부종이 있고, 창백하며, 윤기가 없었고, 트롬빈 시간 C 염색 후 경색 부위는 창백했다. 연구 결과에 따르면, 예비로 사용하는 래트를 취하여 모델링 3시간 후 뇌경색 부피율은 (38.84±3.67) %이고, 모의 수술군의 래트의 뇌조직 트롬빈 시간 C 염색은 변화가 없었다. 모델군에 비해, 혈전용해군 및 혈전용해제+안히드로이카리틴의 용량군의 래트의 트롬빈 시간 C 염색은 모두 경색 부위의 창백한 면적이 유의하게 감소되었다. 뇌경색 부피의 측정을 통해, 혈전용해제+안히드로이카리틴의 용량군의 뇌경색 부피 감소율이 혈전용해군과 유사한 것을 발견하였는데, 이 결과는 안히드로이카리틴이 혈전용해제의 혈전용해 작용에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
6.3 상이한 시점의 각 군의 래트 뇌출혈량의 비교
상이한 시점의 각 군의 래트 뇌출혈량은 하기 표에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 혈전용해군의 출혈량은 모의 수술군보다 유의하게 많은데, 이는 혈전용해제가 뇌경색 래트의 출혈성 변형을 유발하고, 시간의 경과에 따라 출혈량이 유의하게 증가되었음을 설명한다. 혈전용해군에 비해, 혈전용해제+안히드로이카리틴의 용량군의 출혈량은 모두 유의하게 감소되었고, 출혈량은 시간의 경과에 따라 증가되지 않았다. 이는 안히드로이카리틴이 혈전용해제로 인한 출혈성 변형을 효과적으로 방지할 수 있음을 설명한다.
[표 12] 상이한 시점의 각 군의 래트의 뇌출혈량의 비교
Figure pct00014
약효 실시예 7: 아스피린으로 인한 위장관 출혈에 대한 안히드로이카리틴의 예방 작용
1. 모델링 및 그룹화
24마리의 SD 래트에 500 mg/kg의 아스피린을 위내 투여하여 위장관 출혈 모델을 제작하고, 12마리의 SD 래트를 별도로 취하여 동일한 부피의 생리식염수를 위내 투여하여 정상 대조군으로 사용하며, 출혈 모델 래트를 모델군 및 안히드로이카리틴군으로 무작위로 나누고, 안히드로이카리틴군은 모델 제작과 동시에 18 mg/kg의 안히드로이카리틴을 위내 투여하며, 모델군에 동일한 부피의 생리식염수를 위내 투여하였다.
2. 해부 및 위점막 궤양 출혈 상황의 관찰
위내 투여 24시간 후, 래트를 마취하여 희생시키고, 해부하여 래트의 위점막 표면 출혈, 미란, 궤양 상황을 관찰하였다.
3. 실험 결과 및 토론
각 군의 래트의 위점막 출혈 발생 상황은 표 13에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 정상 대조군에서는 출혈이 발생하지 않았고, 모델군의 출혈 발생률은 66.7 %이며, 모델군에 비해, 안히드로이카리틴군의 래트의 위점막 출혈 상황은 유의하게 감소되었고, 출혈 발생률은 모델군에 비해 유의하게 감소되었으므로, 통계적으로 유의한데(P<0.01), 이는 안히드로이카리틴이 아스피린으로 인한 위장관 출혈의 발생률을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여준다.
[표 13] 각 군의 래트의 위점막 출혈 발생 상황의 비교
Figure pct00015
약효 실시예 8: 혈전용해제로 인한 위출혈에 대한 안히드로이카리틴의 예방 작용
1. 모델링 및 그룹화
120마리의 SD 래트를 난수 테이블 방법으로 군당 20마리씩 모의 수술군, 모델군, 우로키나제군, 안히드로이카리틴고용량+우로키나제군, 안히드로이카리틴 중용량+우로키나제군, 안히드로이카리틴 저용량+우로키나제군으로 나누었다. 그 중 안히드로이카리틴의 용량군은 수술 4일 전에 위내 투여하되, 투여량은 각각 2 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg이고, 모의 수술군, 모델군 및 우로키나제군에 동일한 부피의 생리식염수를 위내 투여하였다. 모의 수술군을 제외하고, 나머지 각 군은 카테터에 의해 국소 동맥을 통해 투여하며, 우로키나제의 사용량은 5000 u/kg, 농도200 u/μL이고, 약물 사용 부피는 20 μL이며, 모델군 및 안히드로이카리틴군의 국소 동맥에 동일한 부피의 우로키나제를 사용하였다. 봉합된 자가 혈전으로 중대뇌동맥을 막고 유치 카테터를 삽입하여 혈전색전성 뇌허혈 동물 모델을 제조하였다.
2. 관찰 지표 및 측정 방법
2.1 출혈률 계산
동맥 내 투여 24시간 각 군의 래트를 마취 및 해부하고, 육안 및 광학현미경으로 출혈한 동물을 관찰하고 건수를 통계하며, 출혈 건수와 총 동물 수의 비율을 계산하였다.
2.2 위조직의 병리학적 관찰:
좌폐와 위 전정부를 적출하여 100 g/L의 중성 포름알데히드 용액으로 고정하고, 탈수, 투명, 왁스 침지, 포매, 절편, 염색하여 광학현미경으로 병리학적 변화를 관찰하였다. 손상 정도는 조직 충혈, 부종 및 세포 변성의 정도에 따라 경증에서 중증으로 등급 I: 0 % ~ 25 %, 등급 II: 26 % ~ 50 %, 등급 III: 51 % ~ 75 %, 등급 IV: >75 %(현미경하 출혈 참조)와 같이 등급을 나누었다.
3. 실험 결과 및 토론
3.1 출혈률의 비교
각 군의 래트의 위출혈률은 표 14에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 모델군은 모의 수술군과 비교하여 위출혈이 발생하였는데, 이는 뇌허혈이 어느 정도 위출혈 합병증을 유발할 수 있음을 보여준다. 우로키나제군은 모델군에 비해 출혈률이 유의하게 증가되었으므로, 유의한 차이가 있는데(P<0.01), 이는 혈전용해제가 혈전성 질환에 대한 혈전용해 치료에서 위장관 출혈 합병증을 유발할 수 있음을 보여준다. 우로키나제+안히드로이카리틴의 용량군은 우로키나제군에 비해 출혈률이 모두 유의하게 감소되었으므로, 유의한 차이가 있는데(P<0.01), 이는 안히드로이카리틴이 혈전용해제로 인한 위장관 출혈률을 감소시키는 작용을 가지고 있고, 이 작용이 용량 의존적 관계를 나타냄을 보여준다.
안히드로이카리틴 고용량군은 모델군과 비교하여 유의한 차이가 있는데(P<0.01), 이는 안히드로이카리틴이 혈전류 질환 자체로 인한 위장관 출혈에 대해서도 일정한 예방 작용을 가지고 있음을 보여준다.
[표 14] 각 군의 래트의 위출혈률의 비교
Figure pct00016
3.2 위조직의 병리학적 관찰
각 군의 래트의 위조직의 병리학적 관찰 결과는 표 15에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 우로키나제군은 모델군에 비해 위 손상률이 유의하게 증가되었으므로, 유의한 차이가 있는데(P<0.01), 이는 혈전용해제가 혈전성 질환에 대한 혈전용해 치료에서 위조직 충혈, 부종, 세포 변성 및 출혈 등 합병증을 유발할 수 있음을 보여준다. 우로키나제+안히드로이카리틴의 용량군은 우로키나제군에 비해 상기 합병증의 발생률이 모두 유의하게 감소되었으므로, 유의한 차이가 있는데(P<0.01 또는 P<0.05), 이는 안히드로이카리틴이 혈전용해제로 인한 소화관 조직 충혈, 부종, 세포 변성 및 출혈 등 합병증을 감소시키는 작용을 가지고 있고, 모델군에 비해, 우로키나제+안히드로이카리틴 고용량군의 상기 합병증의 발생률이 유의하게 감소되었음을 보여주는 바, 이상의 결과에 따르면, 안히드로이카리틴은 혈전용해제로 인한 위장관 출혈의 발생률을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 소화관 조직 충혈, 부종 및 세포 변성 등 증상을 감소시킬 수 있으며, 소화관 손상에 대해 좋은 회복 작용을 가지고 있다.
이 밖에, 모델군과 비교한 결과는 안히드로이카리틴이 허혈류 질환 자체로 인한 소화관 손상에 대해서도 일정한 예방 및 치료 작용을 가지고 있음을 보여준다.
[표 15] 각 군의 래트의 위조직의 병리학적 등급 결과 비교
Figure pct00017
약효 실시예 9: 혈전용해제로 인한 출혈 합병증에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 모델의 제조
체중이 220 ~ 260 g 인 60마리의 wistar 수컷 래트(SPF 등급)를 난수 테이블 방법으로 심근경색증 모델링군(Myocardial Infarction) 및 대조군으로 무작위로 나누되, 대조군은 12마리, 모델링군은 48마리였다. 케이지당 4마리씩 별도의 케이지에서 일상적으로 사육하였다. 정상 심전도를 기록한 후, 심근경색증 모델링군의 래트에 150
Figure pct00018
의 이소프레날린(ISO)을 0.2 mL/100 g의 부피로 24시간 간격으로 연속 2일 피하 주사하였다. 대조군에 동일한 방법으로 동일한 양(0.2 mL/100 g)의 생리식염수를 연속 2일 피하 주사하였다. 두 번째로 이소프레날린을 피하 주사한 24시간 후 심전도를 모니터링하였고, 래트를 에틸에테르로 마취한 후 래트의 약물 주입 전과 후의 6-리드(사지유도 리드) 심전도를 각각 기록하며, 심박수를 측정하고, Q파 및 ST 분절 편차 정도를 관찰하여 모델이 성공적으로 제조되었는지의 여부를 평가하되, 리드 II에서 ST 분절의 상승이 0.2 mV보다 크거나 Q 파형의 형성을 심근경색증의 기준으로 하였다.
2. 그룹화 및 투여
36마리의 모델링군 모델 형성 래트를 선택하여 난수 테이블 방법으로 모델군, 혈전용해군 및 혈전용해제+안히드로이카리틴군으로 무작위로 나누고, 혈전용해군에 5 mg/kg의 rt－PA를 대퇴정맥을 통해 투여하고, 혈전용해제+안히드로이카리틴군에 동일한 용량의 혈전용해제를 투여하는 이외에 동시에 안히드로이카리틴(18 mg/kg)을 위내 투여하며, 모델군에 대퇴정맥을 통해 동일한 부피의 생리식염수를 투여하였다.
3. 검출 지표
3.1 각 군의 래트의 심전도 모니터링
래트를 에틸에테르 흡입으로 마취하고, 래트가 마취 상태에 들어간 후 호흡이 안정되었고, 정향 반사가 사라졌으며, 통증 감각이 사라졌다. 앙와위 자세를 취하고, 실험대에 래트를 고정하며, 바늘 전극을 래트의 사지에 피하로 삽입하고(근육에 삽입하지 않도록 주의), 사지유도 리드를 사용하여 래트의 심전도를 모니터링하되, 오른쪽 상지-빨간색, 왼쪽 상지-노란색, 왼쪽 하지-녹색, 오른쪽 하지-검정을 누르며, 심전도계를 켜고, 50 mm/s의 용지 속도, 1 mv의 전압으로 심전도 모니터링을 완료 후 동물을 케이지로 복귀시켰다.
3.2 각 군의 래트의 심장 조직의 형태학적 관찰
마지막 투여 후 동물을 희생시키고, 앙와위 자세로 래트 플레이트에 고정하며, 피부를 75 % 알코올로 소독하고, 가슴을 빠르게 열어 조직 가위로 흉골의 정중선을 따라 피부 및 피하 조직을 절단하며, 흉골의 왼쪽 갈비뼈를 절단하고, 큰 혈관을 절단하여 심장을 꺼낸 후, 심장강에 남아있는 혈액을 4℃에서 0.9 % 염화나트륨 용액으로 씻어내고, 좌심방과 우심방 부속기 및 나머지 대혈관을 절단한 후 여과지로 여과하고 건조시킨 후, 전자저울로 무게를 측정하여 래트의 체중 값과 심장 질량 값을 계산하고, 심장의 실제 무게(습중량)를 측정하며, 체중에 대한 비율(HWI=심장 무게/체중)을 계산하였다.
3.3 각 군의 래트 출혈 합병증의 관찰
피하 출혈점을 포함한 각 군의 래트의 출혈 상황을 관찰하였고, 해부 후 내장 출혈 상황과 두개내 출혈 상황을 관찰하였다.
4. 실험 결과 및 토론
4.1 각 군의 심전도 상황
대조군과 비교하여 모델군의 래트는 병리학적 Q파를 보여 모델링이 성공했음을 설명한다. 모델군과 비교하여 혈전용해군 및 혈전용해+안히드로이카리틴군에서 병리학적 Q파가 없어져 혈전용해제가 심근경색증 래트의 심근경색증 상태를 유의하게 개선할 수 있고, 안히드로이카리틴이 혈전용해제의 혈전용해 효과에 영향을 미치지 않음을 설명한다.
4.2 각 군의 래트의 심장의 대체적인 형태의 비교
각 군의 래트의 심장의 대체적인 형태를 육안으로 관찰한 결과, 대조군과 비교하여 모델군의 심장 부피가 유의하게 증가하였고, 좌심실강이 유의하게 확대되었으며, 경색 부위에서 심근 경벽성 괴사가 발생하였고, 창백하고 얇았다. 모델군과 비교하여 혈전용해군 및 혈전용해제+안히드로이카리틴군의 심장 부피 증가 정도 및 심근 경벽성 괴사 정도가 유의하게 감소되었다. 각 군의 래트의 심장 무게 및 심장 무게와 체중의 비율은 하기 표에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 대조군과 비교하여 모델군의 심장 무게와 체중의 비율은 유의한 차이가 있는데(P<0.01), 이는 모델링이 성공적임을 설명한다. 혈전용해군 및 혈전용해제+안히드로이카리틴군은 모델군과 비교하여 유의한 차이가 있고(P<0.01), 혈전용해군은 혈전용해제+안히드로이카리틴군과 비교하여 유의한 차이가 없는데, 이는 혈전용해제가 심근경색증 래트의 심근경색증 상태를 유의하게 개선할 수 있고, 안히드로이카리틴이 혈전용해제의 효과에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
[표 16] 각 군의 래트의 심장의 대체적인 형태의 비교
Figure pct00019
대조군에 비해, ＃＃P<0.01; 모델군에 비해, ????P<0.01.
4.3 투여군의 래트의 출혈 합병증의 비교
[표 17] 투여군의 래트의 출혈 합병증의 비교
Figure pct00020
상기 표로부터 알 수 있는 바, 혈전용해군의 출혈 백분율은 혈전용해제+안히드로이카리틴군의 출혈 백분율보다 유의하게 높으므로, 통계적으로 유의한데(P<0.01), 이 결과는 안히드로이카리틴이 혈전용해제로 인한 출혈 합병증의 발생률을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여준다.
약효 실시예 10: 혈액 응고 인자 IX 유전자 녹아웃 혈우병 마우스 출혈 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 실험 동물
IX 유전자 녹아웃 혈우병 마우스는 Beijing Biositu Gene Biotechnology Co., Ltd.에서 제공하였다.
2. 동물 그룹화 및 투여
40마리의 IX 유전자 결실 혈우병 마우스를 군당 10마리씩 무작위로 4개의 군으로 나누고, 안히드로이카리틴 저용량군, 중용량군, 고용량군(B, C, D)에 각각 3 mg/kg, 6 mg/kg, 18 mg/kg의 안히드로이카리틴을 11일 연속 1일 1회 위내 투여하였다. 대조군(A)에 동일한 부피의 생리식염수를 위내 투여하였다.
3. 검출 지표
3.1 출혈 시간의 측정
마지막 투여 1시간 후, 꼬리를 잘라 각 마우스의 출혈 시간을 측정하였다.
3.2 혈액 루틴 검사
마지막으로 출혈 시간을 측정한 후, 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 마취하고, 복부 주정맥에서 채혈하여 혈액 루틴을 검출하였다.
4. 실험 결과
4.1 출혈 시간의 측정
각 군의 마우스 출혈 시간은 하기 표에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 대조군에 비해, 안히드로이카리틴의 용량군의 마우스 출혈 시간이 유의하게 단축되었으므로, 통계적으로 유의한데(＃P<0.05 또는 ＃＃P<0.01), 이는 안히드로이카리틴이 IX 유전자 녹아웃 혈우병 마우스 출혈 시간을 효과적으로 단축시킬 수 있음을 설명한다.
[표 18] IX 유전자 녹아웃 혈우병 마우스 출혈 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향
Figure pct00021
4.2 혈액 루틴
안히드로이카리틴의 용량군의 마우스의 혈액 루틴은 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없는데, 이는 안히드로이카리틴이 혈우병 마우스 출혈 시간을 단축시키는 동시에 혈액 루틴 수치에 영향을 미치지 않음을 설명한다.
약효 실시예 11: 후천성 A형 혈우병의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간에 대한 안히드로이카리틴의 영향
1. 실험 재료 및 동물
활성화 부분 트롬보플라스틴 시간의 측정: 키트는 Shanghai Sun Biotechnology Co., Ltd.에서 구입하였고, 후천성 A형 혈우병 환자의 혈장은 Linyi People's Hospital에서 제공하였으며, 실험용 건강한 뉴질랜드 토끼는 중국 Bingfeng 축산 및 양 사육 연구 기지에서 제공하였다.
2. 후천성 A형 혈우병 동물 모델의 제조 및 투여
24마리의 건강한 뉴질랜드 토끼를 선택하고 무작위로 군당 8마리씩 대조군, 모델군 및 처리군으로 나누고, 각 토끼의 체중은 약 1.5 kg이다. 18 ~ 25 ℃의 실온에서, 스테인레스 스틸 케이지에 별도의 케이지에서 사육하고, 각 군에 모두 특별한 처리 없이 정상적인 식이를 제공하였다. 1주 후, 2 % 펜토바르비탈(1.5 ml/kg)로 귀 정맥을 마취한 후 토끼의 왼쪽 대퇴정맥을 분리하여 주사를 위해 노출시켰다. 후천성 A형 혈우병 환자(Linyi People's Hospital의 혈액과에서 진단)의 혈장을 2 ml/kg 토끼 체중으로 모델군 및 치료군의 토끼에 정맥 주사하고, 주사 완료 후 치료군에 즉시 18 mg/kg의 안히드로이카리틴을 위내 투여하며, 모델군에 동일한 양의 생리식염수를 투여하였다. 대조군의 토끼에 동일한 양의 정상 사람의 혈장을 정맥 주사하고, 각각 혈장을 주사하기 전 30분과 혈장 주사 후 30분, 60분, 90분, 120분 시점에 귀 정맥에서 채혈하며, 3.8 % 1:9 구연산나트륨으로 항응고 처리하고, 항응혈제로 3000 r/m으로 원심분리하여 혈장을 분리하였다.
3. 트롬보플라스틴 시간의 측정 및 통계적 방법
키트 설명서를 참조하여 0.1 ml의 토끼 혈장을 취한 다음, 0.1 ml의 트롬보플라스틴 시간 시약을 첨가하여 혼합한 후, 37 ℃에서 2분 동안 온욕한 다음, 37 ℃로 예열한 0.1 ml의 0.025 M 염화칼슘을 첨가하여 균일하게 혼합한 후 즉시 스톱워치를 시작하여 각 시점에서 트롬보플라스틴 시간 값을 측정하고, 각 시점에서 트롬보플라스틴 시간을 두 번 반복하며, 결과의 평균을 취하였다.
SPSS11.0 소프트웨어를 적용하여 통계적 분석을 수행하였다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내고, 정규성 검정 및 등분산 검정을 수행하였다. 군 간의 비교는 t-검정를 사용하여 수행하였다.
4. 실험 결과
각 군의 각 시점의 트롬보플라스틴 시간의 비교는 표 19에 나타낸 바와 같으며, 표로부터 알 수 있는 바, 대조군의 토끼의 트롬보플라스틴 시간 값은 혈장 주사 전과 후에 유의한 변화가 없었고, 모델군의 주사 전 트롬보플라스틴 시간 값과 비교하여 주사 후 30분, 60분, 90분, 120분 시점에서 토끼 혈장의 트롬보플라스틴 시간이 유의하게 연장되었고 트롬보플라스틴 시간 연장은 시간 의존적 경향을 보였으며, 치료군은 각 시점의 트롬보플라스틴 시간을 유의하게 단축시킬 수 있다. 이는 안히드로이카리틴이 혈우병 환자의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간을 유의하게 단축시키고, 혈우병 환자의 혈액 응고를 촉진할 수 있음을 설명한다.
[표 19] 각 군의 각 시점의 트롬보플라스틴 시간의 비교
Figure pct00022

Claims (11)

  1. 출혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물의 제조에서 안히드로이카리틴의 용도로서,
    상기 출혈성 질환은 혈소판 기능 이상 및 이로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈액 응고로 인한 출혈성 질환, 비정상적인 혈관벽으로 인한 출혈성 질환 또는 비정상적인 항응고 및 섬유소 용해로 인한 출혈성 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈소판 기능 이상으로 인한 출혈성 질환은 뇌경색 출혈성 변형, 뇌경색 혈전용해제 또는 항혈전제로 인한 위장관 출혈 또는 심근경색증 혈전용해제 또는 항혈전제 출혈 합병증인 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 뇌경색 출혈성 변형은 허혈성 뇌경색 이차성 출혈성 변형, 원발성 출혈성 변형 또는 무증상 출혈성 변형이고;
    바람직하게는, 이차성 출혈성 변형은 혈전용해제, 항혈전제 및 혈관내 치료 중 하나 이상의 치료 방법의 사용으로 인한 출혈성 변형이며;
    더 바람직하게는, 상기 혈전용해제는 우로키나제, 스트렙토키나제, 레테플라제, 알테플라제, 테넥테플라제 또는 라노테플라제로부터 선택되고;
    더 바람직하게는, 상기 항혈전제는 항응고제 및 항혈소판제 중 하나 이상이며;
    더 바람직하게는, 상기 항혈전제는 항응고제 및 항혈소판제 중 하나 이상이며;
    더 바람직하게는, 상기 항응고제는 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 저분자량 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 재조합 히루딘으로부터 선택되고;
    더 바람직하게는, 상기 항혈소판제는 아스피린, 클로피도그렐 또는 티클로피딘으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 상기 원발성 출혈성 변형은 급성 뇌경색 후 자연출혈 변형인 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 심근경색증 혈전용해제 또는 항혈전제 출혈 합병증에서 혈전용해제는 우로키나제, 스트렙토키나제, 레테플라제, 알테플라제, 테넥테플라제 또는 라노테플라제로부터 선택되고; 항혈전제는 심근경색증 발병기 및 1차, 2차 예방기의 항혈전 치료제이거나; 또는 상기 항혈전제는 항응고제 또는 항혈소판제 중 하나 이상이며;
    상기 심근경색증 혈전용해제 또는 항혈전제 출혈 합병증에서 혈전용해제는 우로키나제, 스트렙토키나제, 레테플라제, 알테플라제, 테넥테플라제 또는 라노테플라제로부터 선택되고; 항혈전제는 심근경색증 발병기 및 1차, 2차 예방기의 항혈전 치료제이거나; 또는 상기 항혈전제는 항응고제 또는 항혈소판제 중 하나 이상이며;
    바람직하게는, 상기 항혈소판제는 아스피린, 클로피도그렐 또는 티클로피딘으로부터 선택되고, 항응고제는 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 저분자량 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 재조합 히루딘으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 상기 출혈 합병증은 피하 출혈, 두개내 출혈, 상부 위장관 출혈 또는 잇몸 출혈 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 뇌경색 혈전용해제 또는 항혈전제로 인한 위장관 출혈에서 혈전용해제는 우로키나제, 스트렙토키나제, 레테플라제, 알테플라제, 테넥테플라제 또는 라노테플라제 중 하나 이상이고; 상기 항혈전제는 항응고제 또는 항혈소판제 중 하나 이상이며;
    바람직하게는, 상기 항혈소판제는 아스피린, 클로피도그렐 또는 티클로피딘으로부터 선택되고, 항응고제는 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 저분자량 헤파린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 재조합 히루딘으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 혈소판 기능 이상은 비정상적인 혈소판 활성화 기능 또는 응집 기능이고;
    바람직하게는, 상기 혈소판 기능 이상은 선천성 혈소판 결손 또는 후천성 혈소판 결손이며,
    제2항에 있어서,
    상기 혈소판 기능 이상은 비정상적인 혈소판 활성화 기능 또는 응집 기능이고;
    바람직하게는, 상기 혈소판 기능 이상은 선천성 혈소판 결손 또는 후천성 혈소판 결손이며,
    바람직하게는, 상기 선천성 혈소판 결손은 유전성 거대 혈소판 증후군, 유전성 혈소판 감소증 또는 선천성 결합조직 질환이고; 상기 후천성 혈소판 결손은 약물 또는 질환에 의해 유발되며;
    더 바람직하게는, 상기 약물은 항균제, 항종양제 또는 헤파린 중 하나 이상이고, 상기 질환은 요독증, 당뇨병, 신증후군, 관상동맥질환 또는 백혈병 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 비정상적인 혈액 응고로 인한 출혈성 질환은 혈우병이고, 상기 혈우병은 A형 혈우병, B형 혈우병 또는 C형 혈우병 중 임의의 하나이며;
    바람직하게는, 상기 혈우병은 유전적 요인으로 인한 혈우병 또는 이차성 혈우병이고,
    더 바람직하게는, 상기 이차성 혈우병은 약물 또는 자가 면역 질환에 의해 유발되며;
    더 바람직하게는, 상기 자가 면역 질환은 간병, 용혈, 후천성 면역 결핍증, 에반스 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 각종 급성 백혈병, 림프종, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 또는 갑상선 기능 항진증을 포함하지만 이에 한정되지 않고;
    더 바람직하게는, 상기 간병은 만성 지속성 간염, 간경화증에 의해 유발되며;
    더 바람직하게는, 상기 약물은 알킬화제, 항대사 물질, 세포독성제인 클로로티아지드계 약물 및 이의 상승제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 비정상적인 항응고 및 섬유소 용해로 인한 출혈성 질환은 헤파린 과다 복용, 쿠마린 과다 복용, 면역 관련 항응고제 증가 또는 혈전용해제 과다 복용으로 인한 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 후천성 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    안히드로이카리틴을 포함하는 약제학적 제제는 주사제, 분말 주사제, 캡슐제, 정제, 마이크로에멀젼, 점적 환제 또는 장용 연질 캡슐인 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약물의 투여량은 0.01 mg/kg ~ 100 mg/kg인 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 약물의 투여량은 0.1 mg/kg ~ 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는 용도.
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