KR20220161737A - 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법 및 이를 이용한 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물 - Google Patents
대나무 잎 주정 추출물의 제조방법 및 이를 이용한 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (a) 대나무 잎을 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출한 후, 농축시키는 단계; 및 (b) 상기 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 동결 건조시키는 단계를 포함하는 항산화 및 항염증 효과를 가지는 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법 및 이를 이용한 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 대나무(특히, 오죽(Phyllaostachys nigra)) 잎 주정 추출물은 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출됨에 따라, 물 추출물 또는 에탄올의 농도가 100(v/v)%인 주정 추출물에 비해, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높을 뿐만 아니라, 항산화 효과가 우수한 것으로 확인된다. 또한, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응 역시 효과적으로 억제하는 것으로 확인된다. 따라서, 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 대나무(특히, 오죽(Phyllaostachys nigra)) 잎 주정 추출물은 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출됨에 따라, 물 추출물 또는 에탄올의 농도가 100(v/v)%인 주정 추출물에 비해, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높을 뿐만 아니라, 항산화 효과가 우수한 것으로 확인된다. 또한, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응 역시 효과적으로 억제하는 것으로 확인된다. 따라서, 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법 및 이를 이용한 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
대나무는 벼과의 아과인 대나무아과(Bambusoideae)에 속하는 식물로 열대지역이나 산악지방 등 넓은 지역에 걸쳐 분포되어있다. 한국에서 자생 및 재배되고 있는 대나무는 5속에 11종, 4변종이 있는 것으로 알려져 있으며, 자생하고 있는 대표적인 종류로는 오죽, 왕대, 조릿대, 솜대, 맹종죽, 신의대 등이 있다. 대나무는 여러해살이 식물로 매년 재생산이 가능하고, 성장 속도가 빠른 특징 때문에 자원으로 활용이 우수한 장점을 가지고 있다. 대나무의 싹은 죽순이라고 하며 식품으로 사용되고 있으며, 잎은 죽엽이라고 불리며 대잎차로 제조하여 차로 마시기도 하며 대줄기 및 대가지는 목재에 비해 탄력성이 우수하여 가공이 쉽다는 특징이 있으며 대나무 부위별로도 다양하게 활용하고 있다. 특히, 한의학에서 대나무 죽엽은 열 내림, 출혈방지, 이뇨, 소갈 방지 등에 사용하고, 죽순은 소담, 상위, 이격, 하기, 화열, 지갈, 해독에 사용하고, 열매는 원기를 북돋는 데 사용하였다.
대나무의 생리활성에 관한 연구로는 대나무의 지방 대사에 미치는 효과, 대나무(이대)의 생리활성 및 항균성 효과, 항산화 효과 및 아질산염 소거작용 등이 보고되었으며 특히 대나무의 항균 및 항산화 효과가 우수하다고 보고되었다. 대나무 잎이 혈중 콜레스테롤과 중성지질을 감소시키며 여러 항산화지표를 개선시켜 시중에 제품이 판매 및 개별인정을 받았으며, 대나무 잎이 혼합된 추출물에서 혈행개선 및 혈관확장의 기능과 대나무 잎 추출물에서 항염증 효능 및 지방생성 억제에 대한 분석이 보고되었으나, 대나무 잎의 추출방법에 따른 항염증 활성이나 항염증 활성의 지표성분에 대한 비교 연구는 아직 부족한 실정이다.
본 발명에서 사용된 3종의 대나무(오죽, 왕대, 조릿대) 중 오죽(Phyllostachys nigra)은 검정대, 흑죽 등으로 불리며 오죽 잎으로부터 분리된 성분으로는 오리엔틴(orientin), 비텍신(vitexin), 이소오리엔틴(isoorientin), 트리신(tricin), 루테올린-6-C-(6"-O-트랜스-카페오일글루코사이드)(luteolin-6-C-(6"-O-trans-caffeoylglucoside)), 바타리플라본(vattariflavone), 트랜스-코니페릴 알코올(trans-coniferyl alcohol), p-쿠마르산(p-coumaric acid), n-페룰로일 세로토닌(n-feruloyl serotonin), 카페익산 에틸 에테르(caffeic acid ethyl ether), 쿠마릴 알코올(coumaryl alcohol), 쿠마릭산 에틸 에테르(coumaric acid ethyl ether) 및 페루릭산 에틸 에테르(ferulic acid ethyl ether) 등이 있다. 왕대(Phyllostachys bambusoides)는 강죽, 참대, 고죽 등으로 불리며 왕대 잎으로부터 분리된 성분으로는 호모오리엔틴(homoorientin), 페루릭산(ferulic acid), 바닐린(vanillin), 코니페르알데하이드(coniferaldehyde), 코리페릴 알코올(coniferyl alcohol), 2,6-디메톡시-p-벤조퀴논(2,6-dimethoxy-p-benzoquinone), p-메톡시신나믹산(p-methoxycinnamic acid), (±)-발라노포닌((±)-balanophonin), 6-메톡시크로마논(6-methoxychromanone) 등이 있다. 조릿대(Sasa borealis)는 산죽, 지죽, 조죽, 입죽 등으로 불리며 조릿대 줄기 또는 잎에는 아세트산(acetic acid), 시트르산(cirtic acid), 숙신산(succinic acid), 옥살산(oxalic acid), 타르타르산(tartaric acid), 포름산(formic acid), 말산(malic acid), 푸마르산(fumaric acid) 등을 함유하고 있는데, 조릿대 잎에는 조릿대 줄기 보다 유기산이 풍부하다. 조릿대 잎에는 시링가레시놀(syringaresinol), 트리신(tricin), 트리신 7-o-β-D-글로코피라노사이드(tricin 7-o-β-D-glucopyranoside), 루테올린 6-C-α-L-아라비노피라노사이드(luteolin 6-C-α-L-arabinopyranoside; isoorientin), 이소오리엔틴 2-O-α-L-람노사이드(isoorientin 2-O-α-L-rhamnoside), 아피제닌 6-C-β-D-자일로피라노실-8-C-D-글루코피라노사이드(apigenin 6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-D-glucopyranoside) 등이 있다.
이에, 본 발명에서는 대나무의 종류와 추출방법에 따라 항산화 및 항염증(특히, 신경염증)의 효과를 비교하여 시료의 최적 추출 조건을 확인하고자 하였으며, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, 항산화 효과 그리고 LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응 억제 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 (a) 대나무 잎을 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출한 후, 농축시키는 단계; 및 (b) 상기 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 동결 건조시키는 단계를 포함하는 항산화 및 항염증 효과를 가지는 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 대나무 잎 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (a) 대나무 잎을 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출한 후, 농축시키는 단계; 및 (b) 상기 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 동결 건조시키는 단계를 포함하는 항산화 및 항염증 효과를 가지는 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 대나무는 오죽(Phyllaostachys nigra), 왕대(Phyllaostachys bambusoides) 및 조릿대(Sasa borealis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 추출은 40℃내지 80℃의 온도에서 3시간 내지 10시간 동안 환류 추출을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 동결 건조는 -50℃내지 -100℃의 온도에서 수행될 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 상기 방법으로 제조된 대나무 잎 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물에 대하여, 상기 대나무 잎 주정 추출물의 농도는 10 ㎍/mL 내지 5,000 ㎍/mL일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 있어서, 상기 대나무 잎 주정 추출물에서 총 폴리페놀 함량은 30 mg GAE/g extract 내지 100 mg GAE/g extract일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 대나무 잎 주정 추출물에서 총 플라보노이드 함량은 3 mg GAE/g extract 내지 50 mg GAE/g extract일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 대나무(특히, 오죽(Phyllaostachys nigra)) 잎 주정 추출물은 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출됨에 따라, 물 추출물 또는 에탄올의 농도가 100(v/v)%인 주정 추출물에 비해, 추출 수율이 높고, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높을 뿐만 아니라, 항산화 효과가 우수한 것으로 확인된다. 또한, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응 역시 효과적으로 억제하는 것으로 확인된다. 따라서, 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1(a) 내지 (c)는 3종의 대나무 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포에서, 3종의 대나무 잎 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포에서, 3종의 대나무 잎 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
항산화 및 항염증 효과를 가지는 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법
본 발명은 (a) 대나무 잎을 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출한 후, 농축시키는 단계; 및 (b) 상기 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 동결 건조시키는 단계를 포함하는 을 제공한다.
먼저, 본 발명에 따른 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법은 대나무 잎을 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출한 후, 농축시키는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
본 명세서 내 "대나무"라 함은 벼과의 아과인 대나무아과(Bambusoideae)에 속하는 식물로서, 상기 대나무는 국내에 자생하는 대나무로서, 오죽(Phyllaostachys nigra), 왕대(Phyllaostachys bambusoides) 및 조릿대(Sasa borealis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 그중에서도, 오죽(Phyllaostachys nigra)을 사용하는 경우, 왕대(Phyllaostachys bambusoides) 또는 조릿대(Sasa borealis)를 사용하는 경우에 비해, 그 잎의 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 우수하고, 항산화 활성 역시 우수한 것을 특징으로 한다.
상기 추출은 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정을 용매로 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하고, 에탄올의 농도가 50(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정을 용매로 사용하여 수행되는 것이 보다 바람직하고, 에탄올의 농도가 70(v/v)%인 주정을 용매로 사용하여 수행되는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기와 같이 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정을 용매로 사용하여 추출하는 대신, 열수 또는 에탄올의 농도가 100(v/v)%인 주정을 용매로 사용하여 추출하는 경우에는, 추출 수율이 저하되고, 총 폴리페놀 함량이 상대적으로 저하되며, 항산화 활성이 상대적으로 저하된다.
또한, 상기 추출은 40℃내지 80℃의 온도로 3시간 내지 20시간 동안 환류 추출을 통해 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 추출은 대나무 잎에 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정을 대나무 잎의 중량당 5배 내지 50배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 10배 내지 50배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 온도는 40℃내지 80℃인 것이 바람직하며, 50℃내지 70℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 시간은 3시간 내지 20시간인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출방법은 환류, 냉침 또는 초음파 추출방법이 모두 이용가능하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 회수는 1회 내지 5회인 것이 바람직하며, 2회 내지 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적으로, 상기 주정 추출된 대나무 잎을 농축시킬 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법은 상기 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 동결 건조시키는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
본 명세서 내 "동결 건조"라 함은 다른말로 냉동 건조라고도 하는데, 용기 온도를 급격하게 낮추어 건조하고자 하는 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 얼린 다음, 용기 내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 주정 추출 및 농축된 대나무 잎에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법을 말한다.
상기 동결 건조는 -50℃ 내지 -100℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 동결 건조의 경우, 통상적인 분무 건조에 비해, 항산화 활성을 더욱 향상시킬 수 있는 이점을 가진다.
상기 방법을 통해 제조된 대나무 잎 주정 추출물은 추출 수율이 높고, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높은 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 대나무 잎 주정 추출물에서 총 폴리페놀 함량은 30 mg GAE/g extract 내지 100 mg GAE/g extract일 수 있고, 50 mg GAE/g extract 내지 100 mg GAE/g extract인 것이 바람직하고, 65 mg GAE/g extract 내지 100 mg GAE/g extract인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 대나무 잎 주정 추출물에서 총 플라보노이드 함량은 3 mg GAE/g extract 내지 50 mg GAE/g extract일 수 있고, 20 mg GAE/g extract 내지 50 mg GAE/g extract인 것이 바람직하고, 35 mg GAE/g extract 내지 50 mg GAE/g extract인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이로써, 항산화 및 항염증(특히, 신경염증) 효과가 우수한 것을 특징으로 하는바, 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
상기 검토한 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 대나무(특히, 오죽(Phyllaostachys nigra)) 잎 주정 추출물은 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출됨에 따라, 물 추출물 또는 에탄올의 농도가 100(v/v)%인 주정 추출물에 비해, 추출 수율이 높고, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높을 뿐만 아니라, 항산화 효과가 우수한 것으로 확인된다. 또한, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증 반응 역시 효과적으로 억제하는 것으로 확인된다.
항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물
본 발명의 일 구현예로, (a) 대나무 잎을 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출한 후, 농축시키는 단계; 및 (b) 상기 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 동결 건조시키는 단계를 포함하여 제조된 대나무 잎 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 대나무 잎 주정 추출물 및 이를 제조하기 위한 추출 공정 및 건조 공정에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물에 대하여, 상기 대나무 잎 주정 추출물의 농도는 10 ㎍/mL 내지 5,000 ㎍/mL일 수 있고, 항산화 및 항염증 활성을 최적으로 높이기 위해서는, 200 ㎍/mL 내지 5,000 ㎍/mL인 것이 바람직하고, 500 ㎍/mL 내지 5,000 ㎍/mL인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 항산화는 체내에서 일어나는 여러 산화작용을 방지하는 것을 말한다. 이때, 산화작용은 체내에 존재하는 여러 종류의 불포화 지방산이 산소에 의해 산화되면 과산화 지질이라고 하는 물질이 생성되고 이것이 증가하면 노화 현상이 촉진되는 현상을 말한다.
한편, 상기 항염증은 신경염, 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염증성 질환 억제를 말한다. 특히, 상기 항염증은 신경염증 반응 억제를 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다. 본 발명의 대나무 잎 30-70% 주정 추출물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 상기 건강기능식품 조성물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있다. 구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 대나무 잎 30-70% 주정 추출물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 대나무 잎 30-70% 주정 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 10중량%, 바람직하 게는 0.01~0.1중량%로 포함된다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 건강기능식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
시약
본 실험에 사용한 3종의 대나무 잎은 2020년 8월 백옥산업(경북 경산)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), gallic acid, Folin-Ciocalteu's reagent, lipopolysaccharide(LPS), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), catechin, ferric chloride (FeCl3), 4,6-tripyridyl-S-triazine(TPTZ), caffeic acid, p-coumaric acid 및 tricin 시약은 Sigma-Aldrich Ltd. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 그 외에 사용된 시약은 모두 특급을 사용하였다.
시료의 추출
본 실험에 사용된 3종의 대나무(왕대, 오죽, 조릿대) 잎 3종의 시료는 물 추출과 30%, 70%, 100% 주정 추출 네 가지 방법으로 추출하였다. 물 추출은 왕대(106.5g), 오죽(52g), 조릿대(90g)에 정제수 각 2.0L를 추가하여 60℃에서 16시간 동안 환류 추출하여 여과한 후 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 -80℃에 얼린 후 동결건조하였다. 주정 추출은 물 추출과 같은 양의 시료에 각각 30% 에탄올, 70% 에탄올 및 100% 에탄올 2.0L를 넣은 후 60℃에서 16시간 동안 환류 추출하여 여과한 후 감압 농축하고 동결건조 하여 30% 주정 추출물, 50% 주정 추출물, 100% 주정 추출물을 제조하였다. 이와 같이 제조한 12개의 시료는 냉동보관 하면서 실험에 사용하였다.
총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Gutfinger, 1981)을 약간 변형하여 측정하였으며, 시료 200 μL에 1.0 N Folin-Ciocalteau 시약 및 20% Na2CO3 용액을 각 1.0 mL씩 차례로 넣은 다음 실온에서 30분 반응시킨 후 분광광도계 (Thermo Scientific Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 대나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였고 gallic acid equivalents (mg GAE/g extract)로 나타내었다.
총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 Jia 등(1999)의 방법을 약간 변형하여 측정하였으며, 시료 0.25 mL에 증류수 1.25 mL를 혼합하고 5% sodium nitrite 75 μL 추가한 후 실온에서 5분간 반응시켰다. 10% aluminum chloride 0.15 mL를 추가한 후 실온에서 6분간 반응시킨 다음 1.0 M sodium hydroxide 0.5 mL와 증류수 275 μL를 차례로 추가하여 혼합한 후 510nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin을 표준물질로 사용하여 표준검량선을 작성하였으며, 표준검량선으로부터 대나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였고 결과는 catechin equivalents (mg CE/g extract)로 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거활성 측정
DPPH 라디칼 소거능 측정은 Blois의 방법(1958)을 조금 변형하여 다음과 같은 방법으로 수행하였다. Blank는 에탄올 100 μL, control은 에탄올 50 μL와 2mM DPPH 용액 50 μL, DPPH와 시료 반응군은 에탄올 40 μL, DPPH 용액 50 μL와 시료 10 μL를 넣고, 시료 자체의 흡광도군은 에탄올 90 μL와 시료 10 μL를 넣은 후 상온에서 30분간 반응시킨 다음 515nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였으며 활성은 아래와 같이 계산하였다.
DPPH 라디칼 소거활성 (%)=(1－(C－D/B－A))×100
A: Blank 흡광도
B: Control 흡광도
C: DPPH와 시료 반응액의 흡광도
D: 시료 자체의 흡광도
Ferric reducing antioxidant power (FRAP)을 이용한 총 항산화력 측정
FRAP 측정은 Benzie와 Strain(1999)의 방법에 따라 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 녹인 10 mM TPTZ 및 20 mM FeCl36H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다. 시료 0.15 mL과 3.0 mL의 FRAP 시약을 혼합하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며 총 항산화력은 FeSO4를 표준물질로 사용하여 mM FeSO4 equivalent/mg extract로 나타내었다.
ABTS 라디칼을 이용한 총 항산화력 측정
ABTS 라디칼을 이용한 총 항산화력의 측정은 Re 등(1999)의 방법을 조금 변형하여 사용하였다. 7.4 mM ABTS 용액과 2.4 mM potassium persulfate를 혼합하여 어두운 곳에서 12~16시간 동안 반응시켜 ABTS 라디칼을 생성하였다. 생성된 ABTS 라디칼의 흡광도가 734 nm에서 1.5가 되도록 증류수로 희석한 후 3.0 mL를 취하고 시료 1.0 mL를 넣은 후 실온에서 10분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 trolox를 표준물질로 사용하여 mM Trolox equivalent/mg extract로 나타내었다.
Nitric oxide (NO) 및 세포 생존율 측정
Mouse microglia 세포인 BV2 세포를 5% fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 5% CO2와 37°C 조건에서 배양하였다. BV2 세포는 1×105/well의 농도로 24-well plate에 분주하고 다음날 시료를 1시간 전처리한 후, LPS (200ng/mL)를 처리하여 20시간 동안 신경염증 반응을 유도하였다. 세포 배양액의 상등액 100μL를 취하여 Griess 시약과 반응시킨 후 550nm에서 흡광도를 측정하여 NO의 생성량을 측정하였다. 결과는 표준물질인 sodium nitrate (NaNO2) 용액을 사용하여 NO의 생성량을 표시하였다. 세포의 생존율은 MTT 방법을 이용하여 측정하였다. NO 측정할 때와 같은 조건으로 BV2 세포에 시료 및 LPS 처리 후 24시간 후 MTT용액을 넣고 2시간 더 배양하였다. 배지를 버리고 DMSO을 넣어 MTT로 형성된 formazan을 녹인 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 무처리군인 control을 100% 기준으로 세포의 생존율을 계산하였다.
통계분석
실험 결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차(SD)를 구하였으며, 각 군간 유의성의 검증은 GraphPad Prism 5.0 version(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA 로 검증하여 P 값이 0.05 미만을 유의한 것으로 판단하였다.
실험예 1: 3종의 대나무 잎 추출물의 추출 수율, 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량
3종의 대나무(왕대, 오죽, 조릿대) 잎의 추출 용매별 수율을 비교한 결과를 [표 1]에 나타내었다.
왕대 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물의 수율은 각각 5.91%, 6.24%, 6.21%, 4.96%이었고, 오죽 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물의 수율은 각각 6.69%, 7.23%, 7.39%, 6.21%이었으며, 조릿대 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물의 수율은 각각 6.92%, 7.28%, 7.47%, 6.44%이었다. 즉, 3종의 대나무 중 오죽 및 조릿대 잎의 추출 수율이 다소 높게 나타났으며, 3종의 대나무 잎 모두 30-70% 주정 추출물이 물 추출물 이나 100% 주정 추출물에 비해 추출 수율이 높았다.
한편, 페놀성 물질인 폴리페놀과 플라보노이드는 다양한 식물들에서 발견되고 있으며, 항산화, 항염, 항균 등 다양한 생리활성을 나타낸다는 많은 연구 결과들이 알려져 있다. 3종의 대나무 잎을 용매별로 추출하여 얻은 12종의 시료의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과를 [표 1]에 나타내었다.
왕대 잎의 물 추출물의 총 폴리페놀 함량은 31.969±0.206mg GAE/g extract이고, 30% 주정 추출물은 34.546±1.148mg GAE/g extract, 70% 주정 추출물은 31.419±1.194mg GAE/g extract, 100% 주정 추출물은 30.491±0.297mg GAE/g extract를 나타내었다. 오죽 잎의 물 추출물의 총폴리페놀 함량은 64.993±0.833mg GAE/g extract이고, 30% 주정 추출물은 69.736±2.282mg GAE/g extract, 70% 주정 추출물은 68.911±1.491mg GAE/g extract, 100% 주정 추출물은 60.113±0.676mg GAE/g extract를 나타내었다. 조릿대 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물이 각각 25.852±0.297, 31.213±0.586, 31.797±1.129, 24.718±0.487mg GAE/g extract을 나타내었다. 즉, 3종의 대나무 중 오죽 잎의 총 폴리페놀 함량이 크게 높았으며, 3종의 대나무 잎 모두 30-70% 주정 추출물이 물 추출물 이나 100% 주정 추출물에 비해 총 폴리페놀 함량이 높았다.
왕대 잎의 총 플라보노이드 함량은 물 추출물이 3.593±1.697mg CE/g extract이고, 30% 주정 추출물은 8.037±0.641mg CE/g extract, 70% 주정 추출물은 8.407±1.697mg CE/g extract, 100% 주정 추출물은 13.963±0.641mg CE/g extract을 나타내었다. 오죽 잎의 총 플라보노이드 함량은 물 추출물이 27.296±0.641mg CE/g extract이고, 30% 주정 추출물은 37.296±3.394mg CE/g extract, 70% 주정 추출물은 37.296±1.283mg CE/g extract, 100% 주정 추출물은 37.667±1.111 mg CE/g extract을 나타내었다. 조릿대 잎의 총 플라보노이드 함량은 물 추출물이 2.852±0.641mg CE/g extract이고, 30% 주정 추출물은 3.593±0.641mg CE/g extract, 70% 주정 추출물은 6.185±1.283mg CE/g extract, 100% 주정 추출물은 6.926±1.697mg CE/g extract을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량과 마찬가지로, 3종의 대나무 중 오죽 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량이 크게 높았다.
| 시료 | 추출 용매 | 추출 수율 (% w/w) |
총 폴리페놀 함량 (mg GAE/g extract) |
총 플라보노이드 함량 (mg CE/g extract) |
FRAP (mM FeSO4 eq./mg extract) |
TEAC (mM Trolox eq./mg extract) |
|
왕대
(P.bambusoides) |
물 | 5.91 | 31.969±0.206 | 3.593±1.697 | 0.337±0.010 | 0.379±0.037 |
| 30% 주정 | 6.24 | 34.546±1.148 | 8.037±0.641 | 0.399±0.005 | 0.476±0.030 | |
| 70% 주정 | 6.21 | 31.419±1.194 | 8.407±1.697 | 0.402±0.007 | 0.426±0.025 | |
| 100% 주정 | 4.96 | 30.491±0.297 | 13.963±0.641 | 0.394±0.008 | 0.386±0.009 | |
|
오죽
(P.nigra) |
물 | 6.69 | 64.993±0.833 | 27.296±0.641 | 0.978±0.024 | 0.655±0.021 |
| 30% 주정 | 7.23 | 69.736±2.282 | 37.296±3.394 | 1.110±0.020 | 0.692±0.021 | |
| 70% 주정 | 7.39 | 68.911±1.491 | 37.296±1.283 | 1.152±0.020 | 0.688±0.013 | |
| 100% 주정 | 6.21 | 60.113±0.676 | 37.667±1.111 | 1.042±0.011 | 0.609±0.007 | |
|
조릿대
(S.borealis) |
물 | 6.92 | 25.852±0.297 | 2.852±0.641 | 0.266±0.004 | 0.347±0.014 |
| 30% 주정 | 7.28 | 31.213±0.586 | 3.593±0.641 | 0.367±0.014 | 0.408±0.025 | |
| 70% 주정 | 7.47 | 31.797±1.229 | 6.185±1.283 | 0.378±0.009 | 0.403±0.027 | |
| 100% 주정 | 6.44 | 24.718±0.487 | 6.926±1.697 | 0.266±0.005 | 0.301±0.021 | |
| BHT | - | - | - | 0.456±0.011 | 0.791±0.013 | |
실험예 2: 3종의 대나무 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성
3종의 대나무 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 도 1에 나타내었다. 각각 농도별 시료가 DPPH 라디칼 소거 효과가 있는지 확인하기 위하여, 100-1000μg/mL의 농도 범위에서 측정하였으며 시료의 농도와 용매별 활성 차이를 비교하였다. 왕대 잎의 추출 용매별 시료를 농도별로 처리하였을 때 DPPH 라디칼 소거 활성은 모두 농도 의존적으로 증가하였다. 그러나, 왕대 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물은 1000 μg/mL의 농도에서 각각 15.05±1.55%, 20.54±2.63%, 20.89±2.41%, 24.10±1.54%로 DPPH 라디칼 소거 활성이 낮았다. 또한, 조릿대 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물 1000 μg/mL의 농도에서 각각 11.10±1.95%, 18.09±2.26%, 22.10±1.00%, 16.26±1.94%의 DPPH 라디칼을 소거하여, 왕대 잎 추출물과 비슷한 결과를 나타내었다. 그러나, 오죽 잎의 추출 용매별 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 오죽 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물은 1000 μg/mL의 농도에서 각각 50.71±1.24%, 53.47±1.22%, 58.25±1.56%, 53.00±3.25%로 3종의 대나무 잎 추출물 중 오죽 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 높았으며 이는 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량의 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 3종의 대나무 중 오죽 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 높았으며, 특히 30-70% 주정 추출물이 물 추출물 이나 100% 주정 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성이 높았다.
실험예 3: 3종의 대나무 잎 추출물의 FRAP(Ferric reducing antioxidant power)법을 이용한 총 항산화력
FRAP법을 이용하여 3종의 대나무 잎 추출물의 항산화력을 측정한 결과를 [표 1]에 나타내었다.
왕대 잎의 물 추출물은 0.337±0.010 mM FeSO4 eq./mg extract, 30% 주정 추출물은 0.399±0.005 mM FeSO4 eq./mg extract, 70% 주정 추출물은 0.402±0.007 mM FeSO4 eq./mg extract, 100% 주정 추출물은 0.394±0.008 mM FeSO4 eq./mg extract를 나타내었다. 오죽 잎의 물 추출물은 0.978±0.024 mM FeSO4 eq./mg extract, 30% 주정 추출물은 1.110±0.020 mM FeSO4 eq./mg extract, 70% 주정 추출물은 1.152±0.020 mM FeSO4 eq./mg extract, 100% 주정 추출물은 1.042±0.011 mM FeSO4 eq./mg extract를 나타내었다. 조릿대 잎의 물추출물은 0.266±0.004 mM FeSO4 eq./mg extract, 30% 주정 추출물은 0.367±0.014 mM FeSO4 eq./mg extract, 70% 주정 추출물은 0.378±0.009 mM FeSO4 eq./mg extract, 100% 주정 추출물은 0.266±0.005 mM FeSO4 eq./mg extract를 나타내었다. DPPH 라디칼 소거활성 결과와 마찬가지로, 오죽 잎 추출물이 왕대 잎 추출물 또는 조릿대 잎 추출물 보다 훨씬 강한 FRAP법을 이용한 항산화력을 나타내었다. 즉, 3종의 대나무 중 오죽 잎 추출물의 FRAP법을 이용한 항산화력이 가장 높았으며, 특히 30-70% 주정 추출물이 물 추출물 이나 100% 주정 추출물에 비해 FRAP법을 이용한 항산화력이 높았다. 또한, 양성 대조군인 BHT의 경우 0.456±0.011 mM FeSO4 eq./mg extract값을 나타내었고, 이는 오죽 잎 추출물이 항산화제인 BHT보다 더 우수한 전자공여 능력을 통한 항산화력이 있음을 나타냄을 의미한다.
실험예 4: 3종의 대나무 잎 추출물의 ABTS 라디칼을 이용한 총 항산화력
ABTS 라디칼을 이용하여 3종의 대나무 잎 추출물의 항산화력을 측정한 결과를 [표 1]에 나타내었으며, trolox를 표준물질로 사용하여 항산화력을 TEAC(mM Trolox eq./mg extract) 값으로 나타내었다.
왕대 잎의 물 추출물의 항산화력은 0.379±0.037mM Trolox eq./mg extract, 30% 주정 추출물은 0.476±0.037mM Trolox eq./mg extract, 70% 주정 추출물은 0.426±0.025mM Trolox eq./mg extract, 100% 주정 추출물은 0.386±0.009mM Trolox eq./mg extract를 나타내었다. 오죽 잎의 물 추출물의 항산화력은 0.655±0.021mM Trolox eq./mg extract, 30% 주정 추출물은 0.692±0.021mM Trolox eq./mg extract, 70% 주정 추출물은 0.688±0.013 mM Trolox eq./mg extract를 나타내었으며 양성대조군으로 사용한 BHT의 TEAC 값은 0.791±0.013 mM Trolox eq./mg extract로 오죽 잎 추출물과 비슷한 활성을 나타내었다, 조릿대 잎의 물 추출물, 30% 주정 추출물, 70% 주정 추출물 및 100% 주정 추출물은 각각 0.347±0.014, 0.408±0.025, 0.403±0.027, 0.301±0.021mM Trolox eq./mg extract을 나타내었다. FRAP법을 이용한 항산화력 결과와 마찬가지로, 오죽 잎 추출물이 왕대 잎 추출물 또는 조릿대 잎 추출물 보다 훨씬 높은 TEAC 값을 나타내었다. 즉, 3종의 대나무 중 오죽 잎 추출물의 TEAC 값이 가장 높았으며, 특히 30-70% 주정 추출물이 물 추출물 이나 100% 주정 추출물에 비해 TEAC 값이 높았다.
실험예 5: 3종의 대나무 잎 추출물의 NO 생성 억제 효과 및 세포 생존율 확인
과도한 NO의 생성은 산화적 손상이나 뇌혈관장벽(blood-brain-barrier) 붕괴와 같은 다양한 과정을 통해 뇌신경 질환에 연관되어있기 때문에 NO의 생성을 효과적으로 조절하는 것이 신경염증의 치료와 예방을 위한 일반적인 접근방법으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 항산화 활성이 가장 우수하였던 3종의 대나무 잎 70% 주정 추출물을 이용하여, LPS에 의해 활성화된 BV2 세포의 NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, LPS 처리에 의해 증가된 NO의 생성량이 3종의 대나무 잎 70% 주정 추출물이 모두 농도 의존적으로 감소시키고 있음을 확인할 수 있었으며, 50μg/mL-200μg/mL의 농도에서 3종의 대나무 잎 70% 주정 추출물 모두 유의적인 NO 생성억제를 나타내었다(도 2). 이러한 NO의 감소가 세포독성에 의한 것인지 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하여 세포의 생존율을 측정한 결과 3종의 추출물 모두 최고 농도인 200μg/mL에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다, 따라서, 3종의 대나무 잎 70% 주정 추출물은 LPS로 과도하게 유도된 신경염증 반응을 억제하였으며 이는 항신경염증 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
본 연구에서는 국내에 자생하는 3종의 대나무(왕대, 오죽 조릿대) 잎을 4종의 추출 용매(물, 30% 주정, 70% 주정, 100% 주정)를 이용하여 추출 후 추출물별 항산화 활성 및 신경염증 반응 억제 효과를 측정하였다. 3종의 대나무 중에서는 오죽 잎 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 가장 높았고, 3종의 대나무 잎 모두 30-70% 주정 추출물이 물 추출물 이나 100% 주정 추출물에 비해 총 폴리페놀 함량이 높았다. DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP법을 이용한 항산화력, 및 ABTS 라디칼을 이용한 항산화력을 측정한 결과, 오죽 잎 추출물의 항산화 활성이 가장 우수하였고, 특히 30-70% 주정 추출물이 물 추출물 이나 100% 주정 추출물에 비해 항산화 활성이 우수하였다. 또한, LPS를 사용하여 미세아교세포의 활성화를 유도하여 신경염증 반응의 지표인 NO의 생성량을 측정한 결과 3종의 대나무 잎 70% 주정 추출물 모두 농도 의존적으로 NO의 생성량을 억제하였다. 따라서, 본 발명의 결과는 대나무 잎 70% 주정 추출물이 미세아교세포의 과도한 신경염증 활성화로 인해 발생되는 뇌 신경질환의 치료 소재로서 활용 가능성을 제시하였다.
Claims (8)
- (a) 대나무 잎을 에탄올의 농도가 30(v/v)% 내지 70(v/v)%인 주정으로 추출한 후, 농축시키는 단계; 및
(b) 상기 주정 추출 및 농축된 대나무 잎을 동결 건조시키는 단계를 포함하는
항산화 및 항염증 효과를 가지는 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 대나무는 오죽(Phyllaostachys nigra), 왕대(Phyllaostachys bambusoides) 및 조릿대(Sasa borealis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 추출은 40℃내지 80℃의 온도에서 3시간 내지 20시간 동안 환류 추출을 통해 수행되는, 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b)에서 동결 건조는 -50℃ 내지 -100℃의 온도에서 수행되는, 대나무 잎 주정 추출물의 제조방법.
- 제1항에 따른 방법으로 제조된 대나무 잎 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물에 대하여, 상기 대나무 잎 주정 추출물의 농도는 10 ㎍/mL 내지 5,000 ㎍/mL인, 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 대나무 잎 주정 추출물에서 총 폴리페놀 함량은 30 mg GAE/g extract 내지 100 mg GAE/g extract인 것을 특징으로 하는, 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 대나무 잎 주정 추출물에서 총 플라보노이드 함량은 3 mg GAE/g extract 내지 50 mg GAE/g extract인 것을 특징으로 하는, 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물.
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