KR102290225B1 - 항산화 효과가 우수한 블루베리 발효 식초 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
항산화 효과가 우수한 블루베리 발효 식초 및 이를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 효과가 우수한 블루베리 발효 식초 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 천연 아카시아 꿀, 연근 추출물에 의한 항산화 활성이 높은 천연 발효 식초에 관한 것으로, 본 발명에 따른 블루베리 발효 식초는 활성산소종 (DPPH, ABTS radical)을 직접 제거하고 환원력 (Reducing power) 효과를 가지고 활성산소를 제거하고, 항산화 효과가 뛰어나 화장료, 식품 조성물, 의약품 등에 용이하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 항산화 효과가 우수한 블루베리 발효 식초 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 천연 아카시아 꿀, 연근 추출물에 의한 항산화 활성이 높은 블루베리 발효 식초에 관한 것이다.
블루베리(Blueberry)는 진달래목(Ericales) 진달래과(Ericaceae) 산앵나무속(Vaccinium) 식물로써 북아메리카 원산지로 하이부시 블루베리(V. corymbosum), 로우부시 블루베리(V. angustifolium) 및 래빗아이 블루베리(V. ashei) 등 세가지 종류가 주로 재배되고 있다. 국내에서는 북부 하이부시, 반수고 하이부시, 남부 하이부시, 래빗아이의 4가지 종류의 블루베리가 약 100여 품종 이상 도입되었고, 이 중 북부 하이부시의 재배가 가장 많이 이루어지고 있다.
블루베리에는 비타민, 식이섬유, 칼슘, 칼륨 등 각종 미네랄성분이 풍부할 뿐만 아니라 항산화, 항염증, 함암 등과 같은 생리활성을 가지고 있는 플라보노이드(flavonoid), 페놀산(phenolic acid) 등의 파이토케이컬(phytochemical) 화합물을 다량 함유하고 있다. 특히, 블루베리에 포함된 안토시아닌 색소는 플라보노이드계 물질로 항산화능이 뛰어난 성분이다. 이러한 항산화물질은 세포내 에너지 생산과정에서 발생하는 활성산소종의 활성을 억제하는 물질로서 생체 내 방어시스템에서 아주 중요한 역할을 한다.
벌꿀에 함유된 각종 유기산, 항균물질, 페놀계 물질들은 항산화 및 항균효과와 같은 생리적 기능과 관련이 있으며, 각종 비타민과 무기질 외 여러 가지 미확인된 물질들 및 기타 성분들에 의해 다양한 약리작용이 있는 것으로 알려져 있는 기능성 식품이다. 벌꿀은 당, 단백질, 수분, 비타민, 미네랄 등을 포함하여 약 181가지 물질을 함유하고 있다. 그 중 수분(17~18%)과 당분(70~80%)이 대부분을 차지하고 있는데, 특히 단당류인 과당과 포도당이 각각 36~38%, 34~36%를 차지하고 있다. 벌꿀은 전 세계적으로 감미료로써 뿐만 아니라 식품의 저장, 발효 등의 용도로 널리 이용되어 왔으며, 최근 건강에 관한 관심이 높아지면서 기능성 식품으로써도 크게 주목받고 있다.
활성산소종(Reactive Oxygen Species: ROS)은 정상적인 세포 및 조직에 손상을 일으켜 각종 질병과 노화를 유발하는 원인으로 알려져 있으며 superoxide, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, hydroxyl ion, nitric oxide같은 다양한 형태로 존재한다. 활성산소종(ROS)은 화학구조상 최외각 전자궤도에 쌍을 이루지 못한 전자를 갖고 있는 자유라디칼(free radical)과 여기에 파생된 여러 가지 산소화합물의 집합이라고 할 수 있다. 활성산소종의 일종인 자유라디칼(free radical)은 UV light, 방사능, 흡연, metabolism, 염증, 각종 환경오염 등과 같은 다양한 요인으로 발생하며 대부분은 산소를 사용하는 미토콘드리아의 ATP 에너지 생성에 의해 발생한다. 미토콘드리아 내의 약 2-3%의 산소가 전자 전달 사이에서의 부산물로서 superoxide radical을 생성하여 이것이 차례로 과산화수소, 수산화 라디칼 등의 다양한 radical을 생성한다. 생체 내에는 활성산소종(ROS)의 활성을 억제하는 SOD(superoxide dismutase), catalase 등의 항산화 효소 및 vitamin C, vitamin E, glutathione 등과 같은 비효소 항산화 물질이 존재하고 있으나, 활성산소종(ROS)의 생성과 항산화효소 및 비효소 항산화제와 같은 방어시스템 사이에서 발생하는 불균형으로 인해 산화적 스트레스가 발생하게 되면 생체 내 지질과산화 및 단백질, 세포막, DNA, 효소와 면역계 세포 등과 같은 생체 분자에 손상을 초래하여 각종 성인병, 노화 등을 유발하게 된다.
활성산소종의 해독은 모든 호기성 생명체의 생존에 가장 중요하다. 세포 내 산화적 스트레스에 대한 방어메커니즘은 ROS의 제거와 생성사이의 균형에서 제공되고 ROS의 생성과 제거의 불균형은 산화적 스트레스를 야기한다. 세포는 ROS 유해한 영향을 개선하기 위한 다양한 방어메커니즘을 가지고 있다. Superoxide dismutase(SOD)는 과산화수소(H2O2)와 산소(O2) 분자에 삽입된 두 슈퍼 옥사이드 음이온의 변환을 촉매하며, 카탈라아제 효소는 H2O2를 물과 산소로 변환시켜 SOD로부터 시작된 활성산소의 해독을 완료한다. 이러한 해독에 중요한 역할을 하는 비효소 소분자 항산화제들이 많이 있다. Glutathione은 활성산소종의 유해 효과에 대해 가장 중요한 세포 내 방어 역할을 수행한다. ROS 분자와의 반응은 Glutathione을 산화하지만, 환원된 형태는 NADPH 의존성 환원 효소에 의해 산화 환원에서 재생된다. glutathione (GSSG)의 산화 형의 비율로 환원 형태인 (GSH)은 생물의 산화 스트레스의 동적 지표이다.
식초는 동서양을 막론하고 예로부터 이용되어 온 발효 식품으로 소량의 휘발성 및 비휘발성의 유기산, 당류, 아미노산, ester 등의 다양한 영양성분이 함유된 독특한 향과 신맛을 가진 대표적인 발효 식품이다. 또한 식초는 동맥경화, 고혈압 등의 성인병 예방효과, 식중독균의 살균효과, 콜레스테롤 저하 효과, 체지방 감소 및 피로회복 등과 같은 효과가 밝혀지면서 식초에 대한 그 기능성이 주목을 받고 있다.
최근 건강에 대한 관심이 증대됨에 따라 영양분 섭취와 질병 예방차원에서 각종 과실을 이용한 다양한 건강기능식품개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 생리활성 물질이 풍부한 블루베리와 같은 과실을 이용한 식초 제조는 과실에 함유되어 있는 기존의 생리활성 물질뿐만 아니라 식초의 생리활성 물질이 더해져 풍부한 영양성분들을 섭취할 수 있어 과실식초의 기능성에 대한 관심이 더욱 증대되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 블루베리 발효 식초의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 블루베리 발효 식초를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 세척된 블루베리를 분쇄하여 블루베리 주스를 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 블루베리 주스에 당도가 10 내지 20˚ brix가 되도록 천연 아카시아 꿀을 첨가하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 천연 아카시아 꿀이 첨가된 블루베리 주스 100 중량부 기준 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 5 내지 15 중량부를 접종하여 20 내지 40℃에서 100-200rpm으로 알코올 발효하는 단계(단계 3);
상기 단계 3의 알코올 발효액을 여과한 뒤, 알코올발효액 100 중량부 기준 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)를 5 내지 15 중량부를 접종하여 20 내지 50℃에서 200-300rpm으로 초산발효하는 단계(단계 4); 및
상기 단계 4의 초산발효액과 연근 추출물을 혼합하는 단계(단계 5);를 포함하는 블루베리 발효 식초의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 블루베리 발효 식초를 제공하는 것이다.
나아가 본 발명은 상기 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은 상기 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 블루베리 발효 식초는 활성산소종 (DPPH, ABTS radical)을 직접 제거하고 환원력 (Reducing power) 효과를 가지고 활성산소를 제거하고, 항산화 효과가 뛰어나 화장료, 식품 조성물, 의약품 등에 용이하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 블루베리 도 1은 본 발명의 블루베리 식초 제조과정 중 알코올 발효 단계에서 측정 한 당도와 알코올 함량을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 블루베리 식초 제조과정 중 초산 발효 단계에서 측정한 알코올 함량과 총 산도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 블루베리 발효 식초의 DPPH 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 블루베리 발효 식초의 ABTS 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 블루베리 발효 식초의 DNA protection activity를 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 블루베리 발효 식초의 환원력 (Reducing power) 측정결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 블루베리 발효 식초의 세포독성 측정결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 블루베리 식초 제조과정 중 초산 발효 단계에서 측정한 알코올 함량과 총 산도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 블루베리 발효 식초의 DPPH 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 블루베리 발효 식초의 ABTS 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 블루베리 발효 식초의 DNA protection activity를 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 블루베리 발효 식초의 환원력 (Reducing power) 측정결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 블루베리 발효 식초의 세포독성 측정결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
블루베리 발효 식초 제조방법
본 발명은 세척된 블루베리를 분쇄하여 블루베리 주스를 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 블루베리 주스에 당도가 10 내지 20˚ brix가 되도록 천연 아카시아 꿀을 첨가하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 천연 아카시아 꿀이 첨가된 블루베리 주스 100 중량부 기준 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 5 내지 15 중량부를 접종하여 20 내지 40℃에서 100-200rpm으로 알코올 발효하는 단계(단계 3);
상기 단계 3의 알코올 발효액을 여과한 뒤, 알코올발효액 100 중량부 기준 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)를 5 내지 15 중량부를 접종하여 20 내지 50℃에서 200-300rpm으로 초산발효하는 단계(단계 4); 및
상기 단계 4의 초산발효액과 연근 추출물을 혼합하는 단계(단계 5);를 포함하는 블루베리 발효 식초의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 블루베리 주스 100 중량부 기준 천연 아카시아 꿀을 10 내지 30 중량부 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 알코올 함량 6 내지 10 %가 되도록 알코올 발효하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 4는 알코올 함량이 0% 및 총 산도 4 내지 6 %가 되도록 초산발효하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 5는 초산발효액 100 중량부 기준 연근 추출물을 10 내지 40 중량부 혼합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 상기 단계 5의 연근 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 열수추출한 것일 수 있다.
블루베리 발효 식초
본 발명은 상기 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 블루베리 발효 식초를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 블루베리 발효 식초는 활성산소종을 제거하거나, 환원력을 가지는 것을 특징으로 한다.
피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물
본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 활성산소종 (DPPH, ABTS radical)을 직접 제거하고 환원력 (Reducing power) 효과를 가지고 활성산소를 제거할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만 피부 외용제의 제형인 것이 바람직하며, 상기 피부 외용제 제형의 하나의 바람직한 형태는 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 마사지크림, 영양크림, 팩, 클렌저, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물을 들 수 있고, 다른 바람직한 형태로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 들 수 있다. 또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 바람직하게는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 바이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있으며, 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
상기와 같이 화장료 조성물을 의약품 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약품으로의 제형화시에는 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 [International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
피부 노화 예방 또는 개선용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물
본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 블루베리 발효 식초를 건강기능식품 및 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 블루베리 발효 식초를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품 및 건강식품 조성물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 블루베리 발효 식초를 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 블루베리 발효 식초의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 및 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 블루베리 발효 식초는 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 블루베리 발효 식초를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 블루베리 발효 식초를 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 블루베리 발효 식초를 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 블루베리 발효 식초 제조
<1-1> 블루베리 알코올 발효
물 100중량부에 파쇄된 블루베리 40% (w/v), 꿀 15~30% (w/v)를 배합하여 최종당도가 13~15°Brix가 되도록 한다. 배합된 원료에 효모균주 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 10%(v/v) 접종하여 25~30℃ 온도에서 100~200 rpm으로 알코올 발효시킨다. 상기의 알코올 발효를 통해 당도 3~6°Brix, 알코올 함량 7~9%의 최종 알코올 발효액을 제조한다(도 1참조).
<1-2> 블루베리 초산발효
상기 실시예 1-1에서 제조한 알코올 발효액을 여과한 뒤, 초산균주 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)를 10~15%(v/v) 접종하여 25~30℃ 온도에서 200~250 rpm으로 초산 발효시킨다. 상기의 초산 발효는 알코올 함량이 0%가 될 때 종료되며, 알콜올 함량 0%, 총산도 4~6%의 초산 발효액을 제조한다. 상기의 초산 발효액을 6000rpm, 2min 원심분리하여 상층액을 여과하여 블루베리 발효식초를 제조한다(도 2참조).
<1-3> 연근 추출물 준비
연근의 몸통부분을 햇볕이 들지 않는 서늘한 곳에서 48시간 건조하고, 적당한 크기로 파쇄한 후, 건조된 연근 100g 당 물을 800ml씩 첨가한 뒤, 90℃에서 3시간 동안 3회 환류추출하였다. 추출물을 여과하고 40℃에서 감압 농축하였다. 농축 후 -80 내지 -110℃로 7일 동안 동결건조하여 최종 연근 추출물을 제조하였다.
<1-4> 블루베리 발효 식초 제조
상기 실시예 1-2의 초산발효된 블루베리 발효 식초 100 중량부에 상기 실시예 1-3의 연근 추출물을 25중량부를 혼합하여 최종 블루베리 발효 식초를 제조하였다.
실험예 1. 알코올 함량 측정 및 당도 측정
알코올 함량은 시료 100ml 를 취하여 증류한 다음 증류액이 약70ml 정도 되면 증류를 중지하고, 증류수를 30ml를 추가로 넣어 100ml를 맞춰준 뒤 Gay-Lussac 주정 환산표를 이용하여 15℃로 보정하여 주정계로 알코올 함량을 측정하였다. 알코올 함량은 온도에 따라 다르므로 증류액의 온도를 측정하여 주정환산표에 의해 보정을 해주어야 정확한 알코올 도수를 측정할 수 있다. 당도는 굴절당도계를 이용하여 측정하였다(도 1참조).
실험예 2. 총산도 측정
식초의 총산도(w/v%)란 식초 100ml에 함유되어 있는 초산, 유기산 과 같은 총산의 함량 (g)을 %로 나타낸 값이다. 측정 방법은 다음과 같다. flask에 증류수 19ml, 시료 1ml를 넣고 섞어준 뒤 1% phenolphthalein solution 2 drops 넣어준다. 뷰렛을 이용하여 0.1N NaOH 용액을 상기 혼합된 용액에 첨가함으로써 혼합 시료가 분홍색으로 변화할 때까지의 소요된 0.1N NaOH를 측정하였다(도 2참조). 총산도 계산식은 다음과 같다.
[식 1]
실험예 3. Total Phenolic, Flavonoid content 측정
Folin-Ciocalteu's의 방법(Wang et al., 1994)을 이용하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. galic acid를 이용하여 standard 표준곡선을 획득하였고, 상기 실시예 1-4의 블루베리식초 40㎕와 1N Folin-Ciocalteu phenol reagent 20㎕, 20% Na₂CO₃60㎕ 혼합한다. 암실에서 30분간 반응시킨 후 흡광도 700nm에서 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 Nieva 방법(Nieva et al., 2000)의 방법으로 측정하였다. catechin reagent을 이용하여 standard 표준곡선을 획득하였고, 상기 방법으로 제조된 블루베리 식초(실시예 1-4) 25㎕씩 분주한 후 125㎕ 증류수로 희석한 다음 5% sodium nitric 8㎕를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시켰다. 그 후 10% aluminum chloride 15㎕를 첨가하여 6분간 반응시킨 후 1M Sodium hydroxide 50㎕와 증류수 27㎕의 증류수를 첨가하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 총 폴리페놀 함량은 285.21±2.44 (mg GAE/1ml), 총 플라보노이드 함량은 3441.27±26 (mg CE/1ml) 로 나타났다.
| sample | Total Phenolic (mg GAE†/1ml) |
Total flavonoid (mg CE††/1ml) |
| 블루베리 식초 | 285.21±2.44 | 3041.27±26 |
실험예 4. DPPH radical scavenging activity 측정
상기 연근 추출물이 첨가되지 않은 블루베리 발효 식초(실시예 1-2), 연근 추출물(실시예 1-3) 및 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초(실시예 1-4)의 DPPH radical scavenging activity (Electron donating abilities, EDA)는 다음과 같이 측정하였다. 각 시료용액 100 μl에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 50 μl를 넣고 교반한 후 차광하여 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 항산화력은 라디칼 소거능의 중간 활성을 나타내는 농도를 표시하는 IC50(half maximal inhibitory concentration)으로 표시하였다. 즉, DPPH 라디칼의 흡광도를 50% 줄여주는 값의 농도를 말한다.
DPPH radical scavenging activity 측정은 항산화효과를 측정하는 가장 보편적인 방법이다. 연근 추출물이 첨가되지 않은 블루베리 발효 식초(실시예 1-2), 연근 추출물(실시예 1-3) 및 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초(실시예 1-4)의 DPPH 라디칼 IC50을 측정한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 연근 추출물이 첨가되지 않은 블루베리 발효 식초는 0.68%, 연근 추출물은 1.01%이며, 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초는 0.36%로 각각 단독의 경우보다 혼합사용의 경우 항산화 활성이 더 우수한 것을 확인하였다.
실험예 5. ABTS
+
radical cation scavenging activity 측정
ABTS+ radical cation scavenging activity 실험은 ABTS+ radical cation은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate (K2S2O8)을 1:1로 혼합하여 암실에서 실온으로 24시간 동안 반응하였다. 사용 전에 ABTS+ 용액을 에탄올에 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.706±0.001이 되게 하여 사용하였다. 추출물의 항산화력은 라디칼 소거능의 중간 활성을 나타내는 농도를 표시하는 IC50(half maximal inhibitory concentration)으로 표시하였다. 즉, ABTS 라디칼의 흡광도를 50% 줄여주는 값의 농도를 말한다.
ABTS+ radical scavenging activity 측정은 DPPH 라디칼 소거능 측정방법과 유사한 방법으로 연근 추출물이 첨가되지 않은 블루베리 발효 식초(실시예 1-2), 연근 추출물(실시예 1-3) 및 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초(실시예 1-4)의 ABTS+ IC50을 측정한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 연근 추출물이 첨가되지 않은 블루베리 발효 식초는 0.88%, 연근 추출물은 1.22%이며, 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초는 0.43%로 각각 단독의 경우보다 혼합사용의 경우 항산화 활성이 더 우수한 것을 확인하였다.
실험예 6. DNA protection activity
H2O2에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 예방은 Tian &Hua (2005)의 실험방법을 변형하여 실시하였다. 플라스미드 PBR 322 DNA (0.5 μg/㎕) 1 ㎕, 0.8mM FeSO4 2 ㎕, 30 % H2O2 3 ㎕ (v / v), 3 ㎕ 증류수와 서로 다른 농도의 블루베리 식초(실시예 1-4) 2 ㎕의 혼합물을 1시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 그 후 6X DNA loading dye 2 ㎕가 첨가되었다. 실온에서 100V의 0.8% agarose gel electrophoresis에 반응시켰다. DNA 밴드 (supercoiled, linear and open circular)는 ethidium bromide로 염색시켰고, DNA 산화를 억제하는 효과는 control 값을 기준으로 한 supercoiled monomer의 증가와 감소로 평가하였다.
연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초(실시예 1-4)의 DNA 산화 억제 효과를 측정한 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, DNA 손상에 대하여 블루베리식초의 보호 효과에 대한 결과로서 Control 군에 비해 Negative control(NC) 군은 Supercoiled form의 DNA가 산화적 손상에 의해 Open circular form으로 변화되었다. 블루베리 식초는 DNA 손상에 대하여 Negative control(NC)에 비해 산화적 손상을 입은 형태인 Open circular form 이 감소되었으며, Supercoiled form의 DNA는 보호되었다. 따라서 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초는 산화적 손상에 대하여 DNA 보호효과를 가진 것을 확인 할 수 있다.
실험예 7. 환원력 측정
환원력 측정은 Chung등에(Chung et al. 2005)의해 기술된 방법에 따라 약간 변형하여 실행하였다. 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 및 1%의 다양한 농도의 블루베리 발효 식초 또는 standard인 BHT, Ascorbic acid 0.5ml와 0.5ml의 Sodium Phosphate buffer(PBS)와 1% 페리시안화 칼륨(Potassium Ferricyanide)을 0.5ml를 각각 혼합시킨 후 50℃에서 20분 동안 정치한 다음 반응이 끝난 혼합물을 각각 1ml씩 따서 새 tube로 옮긴 뒤 Trichloroacetic acid(TCA) 0.5ml를 첨가하여 centrifuge에서 3,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리 하였다.
원심분리한 상층액 0.5ml에 DW 0.5ml와 염화제2철(Ferric chloride) 0.1ml를 첨가한 후 96 well plate에 0.15ml씩 분주 해준 뒤 ELISA reader를 이용해 700nm로 흡광도를 측정하였다. 측정한 값을 그래프로 나타내었다.
연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초(실시예 1-4)의 환원력을 측정한 결과, 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초는 standard인 Ascorbic acid와 BHT에 비교하여 우수한 효과를 가짐을 알 수 있었다(도 6참조).
실험예 8. 세포 독성 측정
안전한 화장품소재로 활용 가능함을 알아보기 위해 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초(실시예 1-4)의 세포 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위해 마우스 대식 세포인 Raw 264.7 cell을 사용하여 세포독성을 확인하였다.
세포생존율 측정은 다음과 같이 측정하였다. Raw 264.7 세포는 96 well plate에 well당 1×105 세포로 180 μl 분주하고, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 배양하였다. 배양 후 연근 추출물이 첨가된 블루베리 발효 식초의 최종농도가 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 및 2.5%가 되도록 첨가한 후 24 hr 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 후 각 well에 5 mg/ml 농도로 제조한 MTT (Sigma-Aldrich) 용액 20 μl를 첨가하여 4 hr 배양한 후 배양액을 제거하고 dimethyl sulfoxide와 에탄올을 1:1로 섞은 용액을 각 well당 200 μl를 가하여 실온에서 30 min 동안 반응시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. 그 결과 도 7에서와 같이, 실험한 모든 농도에서 세포생존율이 85% 이상으로 나타났다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (14)
- 세척된 블루베리를 분쇄하여 블루베리 주스를 제조하는 단계(단계 1);
당도가 10 내지 20˚brix가 되도록 상기 단계 1의 블루베리 주스 100 중량부 기준 천연 아카시아 꿀을 10 내지 30 중량부 첨가하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 천연 아카시아 꿀이 첨가된 블루베리 주스 100 중량부 기준 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 5 내지 15 중량부를 접종하여 20 내지 40℃에서 100-200rpm으로 알코올 함량 6 내지 10 %가 되도록 알코올 발효하는 단계(단계 3);
상기 단계 3의 알코올 발효액을 여과한 뒤, 알코올발효액 100 중량부 기준 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)를 5 내지 15 중량부를 접종하여 20 내지 50℃에서 200-300rpm으로 알코올 함량이 0% 및 총 산도 4 내지 6 %가 되도록 초산발효하는 단계(단계 4); 및
상기 단계 4의 초산발효액 100 중량부 기준 연근 추출물 24 내지 26 중량부 혼합하는 단계(단계 5);를 포함하는 블루베리 발효 식초의 제조방법. - 삭제
- 삭제
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- 제1항에 있어서,
상기 단계 5의 연근 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제1항의 방법에 따라 제조된 블루베리 발효 식초.
- 제7항에 있어서,
상기 블루베리 발효 식초는 활성산소종을 제거하거나, 환원력을 가지는 것을 특징으로 하는 블루베리 발효 식초. - 제7항의 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제7항의 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
- 삭제
- 제7항의 블루베리 발효 식초를 포함하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
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-
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|---|
| 김희진 외 6명. 연근 추출물에서 주름개선 소재의 개발. 한국화학공학회지. 48(4): 413~416(2010.08.)* |
| 오현화 외 5명. 블루베리 농축식초 제조 및 이들의 항산화 및 항균 활성. 한국식품영양과학회지. 46(6): 695~702(2017.)* |
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