KR20240078599A

KR20240078599A - 락토바실러스 플라타럼, 락토바실러스 람노서스로 발효한 포도껍질 발효 추출물을 유효성분으로 하는 항산화, 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR20240078599A
Application number: KR1020230165015A
Authority: KR
Inventors: 임병우; 정수아; 정영환
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2023-11-24
Publication date: 2024-06-04

Abstract

본 발명은 포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 조성물에 관한 것으로, 항산화 및 항염증에 현저한 효과가 있다.

Description

락토바실러스 플라타럼, 락토바실러스 람노서스로 발효한 포도껍질 발효 추출물을 유효성분으로 하는 항산화, 항염증용 조성물{Antioxidant and anti-inflammatory composition containing fermented grape skin extract fermented with Lactobacillus platarum and Lactobacillus rhamnosus as an active ingredient}

본 발명은 포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 충주시청으로부터 지원받은 사업을 통한 결과물이다.

[부처명] 충주시청

[과제관리 기관명] 충주시청

[연구사업명] 충주시 바이오산업 성장기반구축 지원사업

[연구과제명] 충북특화 작목 포도 껍질과 이를 함유한 유산균 발효물의 혈당개선 기능성 소재 개발

[과제수행기관명] (주)휴먼바이오사이언스

[연구기간] 2022.06~2022.11

인체의 대사과정 중 생성되는 활성 산소종은 체내의 세포막, 단백질 및 DNA 등의 손상을 일으켜 노화와 질병의 원인이 되기도 한다. 자유라디칼 및 다른 반응성 산소종 (ROS)은 살아있는 유기체의 산화 진행 중에 부산물로써 생성될 수 있다(Halliwell & Gutteridge, 1999). 반응 산소종(ROS)은 정상적인 신진대사에 많은 중요한 기능을 하지만, 과도한 ROS는 단백질의 기능을 손상, 세포 거대 분자에 산화 손상을 가져오고, trigger cell의 사망을 일으킬 수 있다 (Kremer et al. 2012). 산화 스트레스의 장기간 상태는 심혈과 질환과 암 등 여러 질병의 발병에 관여한다 (Sun et al. 2004). DNA, 단백질 및 기타 거대 분자에 대한 산화 손상은 나아가 노화로 이어지는 내적 손상의 주요 유형을 구성한다고 가정되어지고 있다(Fraga et al. 1990). 따라서 항산화 물질을 섭취하여 건강한 삶을 누리고자 하는데에 관심이 높아지면서 인체에 무해 한 천연 항산화제에 대한 관심과 수요가 증가하고 있어 천연물 유래의 다양한 항산화제의 탐색이 진행되고 있다(Choi et al., 2005).

염증은 인체의 대식세포(macrophage)가 외부의 자극이나 침입한 병원체에 반응하여 염증유발인자인 TNF-α, interleukin1-ββ및 IL-6와 같은 cytokine을 생성하고 또한 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2(COX-2)를 합성하여 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2(PGE2)를 생성한다. 이러한 과정을 거쳐 생성된 NO는 종양과 세균을 제거하는 등의 역할을 수행하지만, NO가 체내에 과도하게 생성되면 조직의 손상, 유전자의 변이 및 혈관의 투과성을 증가시켜 부종 등의 염증반응을 일으켜 인체에 피해를 주게 된다(Moncada et al., 1991; Choi et. al., 1993). 이로 인해 항염증 물질에 대한 관심이 높아지고 있다.

한국공개특허공보 제10-2004-0092952호

본 발명의 목적 1은 항산화 및 항염증 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적 2는 항산화 및 항염증 기능성 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적 3은 항산화 및 항염증 기능성 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus) 등의 유산균을 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

바람직하게, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 혼합하여 사용할 수 있다.

더욱 바람직하게, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.5-3.5 중량비로 혼합 사용할 수 있다.

더욱 더 바람직하게, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.8-3.2 중량비로 혼합 사용할 수 있다.

특히 바람직하게, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.9-3.1 중량비로 혼합 사용할 수 있다.

만약, 상기한 혼합 중량비 범위를 벗어나는 경우에는 항산화 및 항염증 활성이 감소하는 문제가 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 유산균은 상술한 바와 같다.

나아가, 본 발명은 포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 건강식품 조성물을 제공한다.

상기 유산균은 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 포도 껍질 추출물의 유산균 발효물은 항산화 및 항염증에 현저한 효과가 있다.

도 1은 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 DPPH radical scabengin activity 측정 결과이다.
도 2는 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정 결과이다.
도 3은 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 DNA 산화 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 4는 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효 추출물의 세포내 ROS 발생률 측정 결과이다.
도 5는 포도껍질 추출물에 L. Plantarum 및 L. Rhamnosus 혼합 비율을 달리처리하여 얻은 발효물의 세포내 ROS 발생률 측정 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

화장료 조성물

본 발명은 유효물질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태일 수 있다. 더욱 구체적인 형태로는 화장수, 유액, 크림, 스킨, 로션, 세럼, 에센스, 에멀젼, 파우더, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 클렌저, 비누, 샴푸, 린스, 입욕제, 세정제 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 유효물질에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 유효물질을 함유하는 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 유효물질이 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 유효물질을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

건강식품 및 건강기능성식품 조성물

식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 및 건강기능성식품을 모두 포함한다.

건강식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 등을 들 수 있다.

건강기능식품의 예로는 정제, 캡슐제, 환제, 액제 형태 등의 건강기능성식품을 들 수 있다.

본 발명에 따른 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효물질의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 및 건강기능성식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 유효물질을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능성 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예1> 포도껍질(Grape Skin) 추출물 및 L.Plantarum, L.Rhamnosus 발효물의 제조

<1-1> 포도껍질(Grape Skin) 추출물(GS)의 제조방법

포도(campbell)는 충북 영동에서 구매하여 사용하였다. 포도는 껍질과 알맹이를 분리하여 40℃에서 3일 건조 및 분쇄한 다음 포도껍질의 10배(w/v)에 해당하는 70% 에탄올을 사용하여 60℃ 에서 1시간 30분씩 3회 추출하였다. 추출물을 Whatman No.1 여과지 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 통해 여과하고 Rotary Evaporator(RV10D, Ika)를 사용하여 40℃에서 감압농축하여 농축액을 얻었다. 이어서 농축 추출물을 동결 건조기에서 동결 건조하여 포도껍질 추출물을 수득하였다. 추출물은 사용전까지 -20℃에서 보관하였다.

<1-2>포도껍질(Grape Skin) L. Plantarum 발효물(GSP)의 제조

포도(campbell)는 충북 영동에서 구매하여 사용하였다. 포도는 껍질과 알맹이를 분리하여 40℃에서 3일 건조 및 분쇄한 다음 포도껍질의 10배(w/v)에 해당하는 70% 에탄올을 사용하여 60℃ 에서 1시간 30분씩 3회 추출하였다. 추출물을 Whatman No.1 여과지 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 통해 여과하고 Rotary Evaporator(RV10D, Ika)를 사용하여 40℃에서 감압농축하여 농축액을 얻었다. 농축액의 4%(v/v)에 해당하는 L. Plantarum을 접종하여 incubator(37℃, 180rpm)에서 48시간 발효시켰다. 이 발효액을 동결건조기에서 동결 건조하여 포도껍질 L. Plantarum 발효물을 수득하였다. 발효물은 사용하기까지 -20℃에서 보관하였다.

<1-3>포도껍질(Grape Skin) L. Rhamnosus 발효물(GSR)의 제조

포도(campbell)는 충북 영동에서 구매하여 사용하였다. 포도는 껍질과 알맹이를 분리하여 40℃에서 3일 건조 및 분쇄한 다음 포도껍질의 10배(w/v)에 해당하는 70% 에탄올을 사용하여 60℃ 에서 1시간 30분씩 3회 추출하였다. 추출물을 Whatman No.1 여과지 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 통해 여과하고 Rotary Evaporator(RV10D, Ika)를 사용하여 40℃에서 감압농축하여 농축액을 얻었다. 농축액의 4%(v/v)에 해당하는 L. Rhamnosus를 접종하여 incubator(37℃, 180rpm)에서 48시간 발효시켰다. 이 발효액을 동결건조기에서 동결 건조하여 포도껍질 L. Rhamnosus 발효물을 수득하였다. 발효물은 사용하기까지 -20℃에서 보관하였다.

<1-4>포도껍질(Grape Skin) L. Plantarum 및 L. Rhamnosus 발효물(GSPR)의 제조

포도(campbell)는 충북 영동에서 구매하여 사용하였다. 포도는 껍질과 알맹이를 분리하여 40℃에서 3일 건조 및 분쇄한 다음 포도껍질의 10배(w/v)에 해당하는 70% 에탄올을 사용하여 60℃ 에서 1시간 30분씩 3회 추출하였다. 추출물을 Whatman No.1 여과지 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 통해 여과하고 Rotary Evaporator(RV10D, Ika)를 사용하여 40℃에서 감압농축하여 농축액을 얻었다. 농축액의 4%(v/v)에 해당하는 L. Plantarum 및 L. Rhamnosus를 1:3 중량비로 접종하여 incubator(37℃, 180rpm)에서 48시간 발효시켰다. 이 발효액을 동결건조기에서 동결 건조하여 포도껍질 L. Plantarum 및 L. Rhamnosus 발효물을 수득하였다. 발효물은 사용하기까지 -20℃에서 보관하였다.

<실험예 1> DPPH radical scavenging activity 측정

실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 항산화 효과를 측정하기 위하여 DPPH radical scavenging activity (Electron donating abilities, EDA)을 수행하였다. 각 시료용액 80μl에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 80 μl을 넣고 교반항 후 차광하여 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 항산화력은 천연 항산화제인 아스코르브산(ascorbic acid, A.A)와 비교하였다.

도 1은 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 DPPH radical scavenging activity 측정 결과이다.

도 1에 나타난 바와 같이, GS, GSP 및 GSR 샘플 대비 GSPR 샘플의 DPPH 라디칼 소거 활성이 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> ABTS ⁺ radical cation scavenging activity 측정

실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 ABTS 라디칼 소거능을 확인하기 위해 ABTS⁺radical cation scavenging activity 실험을 수행하였다.

ABTS⁺ radical cation은 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate (K₂S₂O₈)을 1: 1로 혼합하여 암실에서 실온으로 24 시간 동안 반응하였다. 사용 전에 ABTS⁺용액을 0.01 M PBS(pH 7.4)에 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.7 ± 0.02이 되게 하여 사용하였다. 추출물의 항산화력은 천연 항산화제인 아스코르브산(ascorbic acid, A.A)와 비교하였다.

도 2는 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정 결과이다.

도 2에 나타난 바와 같이, GS, GSP 및 GSR 샘플 대비 GSPR 샘플의 ABTS 라디칼 소거 활성이현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> Total Phenolic, Flavonoid content 측정

Folin-Ciocalteu's의 방법을 이용하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. gallic acid를 이용하여 standard 표준곡선을 획득하였고, 상기 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 포도껍질 발효 추출물 10mg/ml을 200μl, 1 N Folin-Ciocalteu phenol reagent 100 μl 및 20 % Na₂CO₃ 60μl를 혼합하고, 암실에서 30분간 반응시킨 후 120μl를 3회 분주 후 흡광도를 700 nm에서 측정하였다.

총 플라보노이드 함량 측정은 Nieva 방법(Nieva et al., 2000)의 방법으로 측정하였다. catechin reagent을 이용하여 standard 표준곡선을 획득하였고, 상기 실시예 1의 포도껍질 추출물 및 포도껍질 발효 추출물 10mg/ml을 25μl씩 분주한 후 125μl 증류수로 희석한 다음 5% sodium nitrite 8μl를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시켰다. 그 후 10% aluminum chloride 15μl를 첨가하여 6분간 반응시킨 후 1 M Sodium hydroxide 50μl와 증류수 27μl를 첨가하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

하기의 표 1에 측정된 총 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량 값을 나타내었다.

시료	총 페놀류 (mg GAE per g of extract)	총 플라보노이드 (mg CE per g of extract)
GS	230.74 ± 5.14	100.48 ± 1.03
GSP	210.27 ± 0.30	80.52 ± 1.40
GSR	203.00 ± 0.50	58.41 ± 1.14
GSPR	284.36 ± 2.41	148.25 ± 1.33

표 1에 나타난 바와 같이, GSPR 샘플의 총 페놀류 및 총 플라보노이드 함량이 현저히 높은 수준으로 나타남을 확인할 수 있다.

<실험예 4> DNA protection activity

H₂O₂에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 DNA의 보호 효과를 평가하였다.

0.08 mM FeSO₄ 2μL, 30% H₂O₂ 3μL (v/v), 플라스미드 PBR 322 DNA(0.5 μg/μL) 1μL, 증류수 5μL 및 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물 2μL(0.25, 0.5, 1 mg/mL의 다양한 농도)를 혼합한 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 6X Loading dye 2μL를 첨가한 후 0.8 % agarose gel에 분주해 전기영동하였다. DNA 밴드(supercoiled, linear and open circular)는 ethidium bromide로 염색시켰고, DNA 산화를 억제하는 효과는 control 값을 기준으로 한 supercoiled monomer의 증가와 감소로 평가하였다.

도 3은 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 DNA 산화 억제 효과를 측정한 결과이다.

도 3에 나타난 바와 같이, Control 군에 비해 Negative control(NC) 군은 Supercoiled form(**S.C)의 DNA가 산화적 손상에 의해 Open circular form(*O.C)으로 변화되었으나, 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 포도껍질 발효 추출물은 DNA손상에 대한 Open circular form이 감소 되었으며 Supercoiled form의 DNA는 보호되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물은 산화적 손상에 대하여 DNA 보호효과를 가진 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 세포 독성 측정

실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 세포 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위하여 간 암세포인 Hep G2 cell을 사용하여 세포독성(MTT assay)을 확인하였다.

구체적으로, Hep G2 세포는 96웰-플레이트에 5×10⁴ cell/well로 100μL 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 배양 후 실시예 1의 포도껍질 추출물(GS) 및 발효물(GSP, GSR 또는 GSPR)을 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/mL이 되도록 첨가한 후 24시간 배양하고, 배양액 제거 후 각 well에 0.2 mg/mL 농도로 제조한 MTT (Sigma-Aldrich) 용액 100μL를 첨가하여 2시간 배양한 후 배양액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100μL 분주하여 실온에서 10 분 동안 반응시킨 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포독성(MTT assay) 측정결과, GS, GSP, GSR 및 GSPR 샘플 모두 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/mL 처리농도에서 90% 이상의 세포생존율을 나타내는 것을 확인하여, 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

<실험예 6> 세포내 ROS 발생률 측정

비형광물질인 DCF-DA(Dichlorofluorescin diacetate, Sigma-Aldrich)는 세포 내 과산화수소(hydrogen peroxide)와 관련된 과산화물(peroxides) 존재시 ROS에 의해 산화되어 녹색의 현광을 띄므로 DCF-DA를 통해 ROS를 측정하였다. 먼저, 간암 세포를 96-웰 블랙 플레이트에 5 × 10⁴cell/well이 되도록 세포를 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 포도껍질 추출물 및 발효물을 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 시료가 처리된 플레이트에 PBS(Phosphate buffer, Sigma-Aldrich)에 용해시킨 10 μmol/mL DCF-DA(Dichlorofluorescin diacetate, Sigma-Aldrich)를 100μL 처리하여 30분간 반응시킨 후 600 μM의 H₂O₂10μL 처리하여 1시간 반응시켰다. 반응시킨 플레이트를 Ex: 485nm, Em: 530nm에서 형광을 측정하였다.

도 4는 실시예 1에서 수득한 포도껍질 추출물 및 발효물의 세포내 ROS 발생률 측정 결과이다.

도 4에 나타난 바와 같이, GS, GSP, GSR, GSPR 시료는 모두 농도의존적으로 세포내 ROS 발생률을 억제하는 것으로 나타났다. 특히 GSPR 시료의 ROS 발생률 억제 효과가 현저하게 나타났다.

실시예 1의 4종 시료 중에서 GSPR 시료의 항산화 및 항염증 효능이 현저히 우수함을 확인하여, L. Plantarum 및 L. Rhamnosus의 처리 비율을 달리하여 얻은 발효물의 ROS 발생률을 추가로 측정하였다. 실시예 1에서는 L. Plantarum 및 L. Rhamnosus를 1:3 중량비로 혼합 처리하였다. 비교 시료로 L. Plantarum 및 L. Rhamnosus를 1:1, 1:2 및 1:4 중량비로 혼합 처리한 발효물을 제조하여, 세포내 ROS 발생률을 측정하였다.

도 5는 포도껍질 추출물에 L. Plantarum 및 L. Rhamnosus 혼합 비율을 달리처리하여 얻은 발효물의 세포내 ROS 발생률 측정 결과이다.

도 5에 나타난 바와 같이, L. Plantarum 및 L. Rhamnosus를 1: 1-4 중량비로 혼합 처리한 발효물 시료들 중에서 1:3 중량비로 혼합 처리한 발효물 시료에서 세포내 ROS 발생률 억제 효능이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.

화장료의 제조예

본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 화장료로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 화장료의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<화장료 제조예 1> 유연 화장수의 제조

유효물질 10.0 중량부

1,3-부틸렌글리콜 1.00 중량부

디소듐이디티에이 0.05 중량부

알란토인 0.10 중량부

디포타슘글리시리제이트 0.05 중량부

시트르산 0.01 중량부

소듐시트레이트 0.02 중량부

글리세레스-26 1.00 중량부

알부틴 2.00 중량부

하이드로제네이티드캐스터오일 1.00 중량부

에탄올 30.0 중량부

보존제 미량

착색제 미량

착향제 미량

정제수 잔량

<화장료 제조예 2> 영양 크림의 제조

유효물질 10.0 중량부

1,3-부틸렌글리콜 7.00 중량부

글리세린 1.00 중량부

D-판테놀 0.10 중량부

식물 추출물 3.20 중량부

마그네슘알루미늄실리케이트 0.30 중량부

PEG-40 스테아레이트 1.20 중량부

스테아르산 2.00 중량부

폴리소르베이트 60 1.50 중량부

친유형글리세릴스테아레이트 2.00 중량부

소르비탄세스퀴올리에이트 1.50 중량부

세테아릴알코올 3.00 중량부

미네랄오일 4.00 중량부

스쿠알란 3.80 중량부

카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.80 중량부

식물성오일 1.80 중량부

디메치콘 0.40 중량부

디포슘글리시리제이트 미량

알란토인 미량

소듐 히아루로네이트 미량

토코페릴아세테이트 적량

트리에탄올아민 적량

보존제 적량

착향제 적량

정제수 잔량

건강식품의 제조예

본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<건강식품 제조예 1> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 유효물질 0.01-1 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<건강식품 제조예 2> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 유효물질을 진공 농축기에서 감압농축하고 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 유효물질의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 34 중량부, 율무 19 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

유효물질 (2 중량부),

영지(1.5 중량부), 및

지황(1.5 중량부).

건강기능식품의 제조예

본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강기능식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강기능식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<건강기능식품 제조예 1> 건강기능식품의 제조

유효물질 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<건강기능식품 제조예 2> 건강 기능 음료의 제조

유효물질 100 mg

구연산 100 mg

올리고당 100 mg

매실농축액 2 mg

타우린 100 mg

정제수를 가하여 전체 500 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus) 중 1종 이상인 것인, 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스인 것인, 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.5-3.5 중량비로 혼합한 것인, 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.8-3.2 중량비로 혼합한 것인, 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.9-3.1 중량비로 혼합한 것인, 화장료 조성물.
포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.8-3.2 중량비로 혼합한 것인, 건강기능식품 조성물.
포도 껍질 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 기능성 건강식품 조성물.
제9항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스를 1:2.8-3.2 중량비로 혼합한 것인, 건강식품 조성물.