KR20040092952A - 항산화 활성 및 ｄｎａ 손상 억제 활성 물질로서의 홍경천및 포도씨 추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 열수 및 75% 에탄올로 추출한 홍경천 및 포도씨 추출물의 항산화 활성 및 DNA 손상 억제 활성을 확인함으로써 상기 추출물의 항산화제 및 DNA 손상 억제제로써의 유용성을 제공한다.
Description
본 발명은 새로운 효과를 가진 홍경천（Rhodiola rosea） 및 포도씨（grapeseed）추출물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 항산화 활성 및 DNA 손상 보호 효과를 가진 홍경천 및 포도씨 추출물에 관한 것이다.
노화, 흡연, 환경오염 등의 요인으로 인해 신체 내에서 광범위한 해로운 활성을 가진 활성산화물질 (reactive oxygen species, ROS)의 생산이 증가하여 우리 몸 안의 산화 방지 체계의 한계를 넘어서게 되고 산화 스트레스 현상이 일어나며 그 결과, 암 발생 초기단계인 DNA 손상을 유발하게 되며 이는 세포 돌연변이를 유발해서 암으로까지 발전하게 된다. 따라서, 암을 예방하기 위해서는 체내에 축적된 산화 스트레스를 중화시켜야 하는 데, 체내 산화 스트레스를 중화시키는 신체 항산화 체계는 두 가지가 있다. 그 중 하나는 항산화 효소의 활성도를 증가시키는 방법이고, 또 한 가지는 항산화 식품이나 항산화 비타민을 많이 섭취하여 산화 스트레스를 중화시키는 방법이다. 최근 연구에 따르면 항산화 효소 활성도를 선택적으로 증가시키는 방법보다, 항산화 식품이나 항산화 비타민을 많이 섭취하게 하는 방법이 체내에서 훨씬 효율적인 것으로 알려지고 있다.
홍경천 추출물의 라디칼 소거 활성 및 이를 이용한 노화방지용 화장료 조성물은 대한민국 특허공개공보 제10-1996-0033438호에 개시되어 있다. 대한민국 특허 제265385호에는 홍경천 추출물의 순환기 질환 예방 및 치료 효능 및 그 추출물의 활성 성분 및 추출 방법이 개시되어 있으며, 이는 본 발명의 일부로써 포함된다. 그러나, 상기 선행 문헌들에는 본 발명에서와 같은 홍경천 추출물의 DNA 손상 억제 효과에 대해서는 언급하고 있지 않다.
한편, 대한민국 특허공개공보 제10-2003-0017300호에는 포도씨의 추출물을포함하는 각질 제거용 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 포도씨 추출물의 항산화 작용에 대하여 개시하고 있으나, 본원 발명의 목적과 관련있는 DNA 손상 억제 활성에 대해서는 언급되어 있지 않다. 상기 문헌에 개시된 포도씨 추출물에 관한 기재 내용은 참조로써 본 발명의 일부를 구성한다.
본 발명의 목적은 홍경천 및 포도씨 추출물의 항산화 활성 및 DNA 손상 보호 효과를 확인하고, 홍경천 및 포도씨 추출물의 새로운 용도를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 확인한 홍경천 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 확인한 홍경천 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 확인한 홍경천 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에서 확인한 홍경천 추출물의 하이드록실 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에서 확인한 홍경천 추출물의 과산화수소 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 6에서 확인한 홍경천 추출물의 DNA 손상 억제 효과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예 7에서 확인한 홍경천 추출물의 DNA 손상 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 8에서 확인한 포도씨 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 9에서 확인한 포도씨 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 10에서 확인한 포도씨 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 11에서 확인한 포도씨 추출물의 하이드록실 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 12에서 확인한 포도씨 추출물의 과산화수소 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실시예 13에서 확인한 포도씨 추출물의 리놀레산의 산화 작용 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실시예 14에서 확인한 포도씨 추출물의 DNA 손상 억제 효과를 보여주는 사진이다.
도 15는 본 발명의 실시예 15에서 확인한 포도씨 추출물의 DNA 손상 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
본 발명의 상기 과제는 홍경천(Rhodiola rosea) 및 포도씨 각각을 열수 및 75% 에탄올로 추출하고, 그 추출물의 항산화 활성 및 DNA 손상 보호 효과를 확인함으로써 달성된다.
홍경천 및 포도씨 각각을 열수 및 75% 에탄올 추출은 다음과 같이 수행한다.
몰타르(Mortar)로 잘게 부순 일정량의 홍경천 및 포도씨 각각을 물 및 75% 에탄올 용매에 넣고 85℃에서 환류(reflux)시키면서 2회 추출한다. 이중 75% 에탄올 추출물은 회전 증발기(rotary evaporator)를 사용하여 45℃에서 에탄올을 제거하고 소량의 물로 용해시킨 후 동결 건조하고, 물 추출물은 그대로 동결건조하여 제조하였으며 홍경천의 물과 75% 에탄올 추출물의 수율은 각각 추출에 사용한 홍경천의 중량에 대해 17.4%와 22.6%였으며, 포도씨의 물과 75% 에탄올 추출물의 수율은 각각 추출에 사용한 포도씨의 중량에 대해 8.3 %와 9.3 %였다.
홍경천 및 포도씨 추출물의 총 페놀 화합물의 함량은 폴린-시오칼투 (Folin-Ciocalteu) 방법에 따라 정량하였다. 즉, 3㎎/㎖의 상기 추출물 1 ㎖에 95% 에탄올 1㎖, 증류수 5㎖ 그리고 50% 폴린-시오칼투 페놀 시약 0.5 ㎖을 가하고 5분간 반응시킨 다음 5% Na2CO3 1㎖를 섞고 빛을 차단시킨 어두운 장소에서 1시간 정치시킨 후 잘 섞은 상태에서 725nm에서 흡광도를 측정하였으며 갈릭산(gallic acid)의 스탠더드 커브를 작성하여 총 페놀 화합물의 함량을 계산하였다. 그 결과, 홍경천의 물 추출물은 16.0%, 75%에탄올 추출물은 21.7%, 포도씨의 물 추출물은 12.4%, 75% 에탄올 추출물은 24.0%의 총 페놀 화합물 함량을 나타내었다.
상기와 같은 방법으로 얻은 홍경천 및 포도씨의 열수 및 75% 에탄올 추출물의 항산화 활성 및 DNA 손상 보호 효과는 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 상기 추출물의 항산화 활성은 ⅰ）DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydryzyl） 라디칼 소거 활성 시험, ⅱ）ABTS（2,2'-Azino-bis-（3-ethylbenthiazoline-6-sulfonic acid） 라디칼 소거 활성 시험, ⅲ）슈퍼옥사이드 음이온（superoxide anion） 소거 활성 시험, ⅳ）데옥시리보스 에세이에 의한 하이드록시 라디칼 소거 활성 시험, ⅴ）과산화수소 소거 활성 시험, 및 ⅵ）리놀레산의 산화에 대한 억제 활성 시험을 통해 확인하였으며, 추출물의 DNA 손상 억제 효과는 ⅰ）DNA 닉킹 에세이법（nicking assay） 및 ⅱ）코멧 에세이법에 의해 확인하였다.
이들의 활성 시험 과정 및 결과를 이하의 실시예를 통하여 설명한다.
실시예
실시예 1
홍경천 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 시험
대표적인 프리 라디칼 소거활성 측정방법인Journal of agricultural food and chemistry 46(1998) 49-53에 보고된 Chen 등의 방법에 따라 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹여 농도별로 희석한 추출물 시료 10㎕에 200μM DPPH/EtOH 190㎕를 가한 후, 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 대신 DMSO를 가한 대조구에 대해 시료를 넣었을 때의 흡광도의 감소 정도를 조사하여 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도를 IC50으로 표시하였다. 도 1에 나타난 바와 같이 홍경천의 열수 및 75% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼에 대한 소거활성을 IC50으로 나타내었을 때 각각 2.13㎍/㎖과 2.61㎍/㎖로서 갈릭산의 3.20㎍/㎖와 아스코르브산 4.00㎍/㎖ 보다 높은 DPPH 소거활성을 보여주였다.
실시예 2
홍경천 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성 시험
Food Chemistry 73(2001) 239-244에 보고된 Arnao 등의 방법에 따라 2mM ABTS, 15μM H2O2그리고 0.25 ㎛ HRP를 함유한 50 mM Na-포스페이트 버퍼(pH 7.5) 1 ㎖를 25℃에서 5분간 정치시킨 다음 730 nm에서 흡광도가 일정하게 유지되면 탈이온수에 용해시킨 시료 10㎕를 가하고 5분 후에 730 nm에서 흡광도 감소를 측정하였다. 도 2에 표시된 소거활성을 보면 홍경천의 열수 및 75% 에탄올 추출물의 IC50이 각각 0.67 ㎍/㎖와 0.69 ㎍/㎖로서 75% 에탄올 추출물은 양성 대조군으로서 가장 높은 갈릭산의 소거활성(0.53 ㎍/㎖)보다 약간 낮은 수준의 소거활성을 갖고 있는 것으로 나타났다.
실시예 3
홍경천 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 소거 활성 시험
잔틴(Xanthine)과 잔틴 옥시다아제의 효소 반응계로 슈퍼옥사이드 음이온을 발생시킨 후 시토크롬 C의 환원 정도를 측정하는CRC handbook of free fadicals and antioxidants in biomedicine, Mquel J.(Ed.), CRC Press. Florida, vol. Ⅲ: 287-293 (1989)에 보고된 레오폴드(Leopold) 등의 방법에 따라 측정하였다. 0.019g의 잔틴/0.001N NaOH 5㎖와 0.1mM EDTA를 함유한 50mM 포스페이트 버퍼(pH 7.8) 50㎖를 혼합한 후 시토크롬 C 0.0124g을 넣은 기질액 200㎕에 DMSO에 용해시킨 추출물 시료 10㎕를 가하고 10분간 안정화시킨 후 잔틴 옥시다아제(0.2 유닛/㎖, 0.1mM EDTA) 10㎕를 가하고 잘 혼합한 후 550nm에서 2분간 흡광도를 측정하여 ΔAbs/min을 계산하였으며, 시토크롬 C의 환원 속도를 50% 저하시키는 농도를 IC50으로 표시하였다. 도 3의 결과와 같이 열수 추출물은 1.23㎍/㎖ 그리고 75% 에탄올 추출물은 1.12㎍/㎖의 소거활성을 나타내어 양성 대조군으로서 가장 높은 활성을 나타낸 갈릭산(1.36㎍/㎖)보다 약간 높은 수준의 활성을 갖고 있었다.
실시예 4
홍경천 추출물의 하이드록실 라디칼 소거 활성 시험
Method in enzymology 233(1998) 57-66에 보고된 Aruoma의 방법에 따라 펜톤 반응에 의해 -OH 라디칼을 발생시켜 이에 대한 소거활성을 데옥시리보스 에세이법에 의해 측정하였다. 2.8 mM 데옥시리보스, 25 μM FeCl3, 100 μM EDTA, 2.8 mM H2O2를 포함한 10 mM KH2PO4/KOH 버퍼(pH7.4)에 일정농도의 추출물 시험 시료 100 ㎕를 가하고 잘 혼합하여 반응 부피가 1.2㎖가 되게 하였다. 이 때 데옥시리보스를 넣기 전에 EDTA와 FeCl3는 미리 잘 섞은 후에 첨가하였다. 반응 혼합물의 아스코르브산 염의 농도가 100 μM이 되도록 아스코르브산 염을 첨가한 후 37℃에서 한 시간동안 200rpm의 속도로 회전하는 진탕 배양기(shaking incubator)에서 반응시킨 다음 1% TBA 1㎖와 2.8% TCA 1㎖를 가하여 OH 라디칼과의 반응에 의해 생성된 데옥시리보스의 MDA(malondialdehyde)유사물질과의 반응을 위하여 80℃에서 20분간 가열시키고 상온으로 냉각시켰다. n-부탄올 3.2㎖를 가하여 30초간 강하게 흔들어서 잘 혼합한 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리시켜 반응에 의해 생성된 색소물질을 분리하였으며 색소물질을 함유한 위층 200㎕를 취하여 532 ㎚에서 ELISA 판독기(reader)로 흡광도를 측정하였다. 도 4에 나타난 OH 라디칼에 대한 소거활성을 보면 열수 추출물의 IC50이 0.17㎍/㎖ 그리고 75% 에탄올 추출물의 IC50이 0.38㎍/㎖의 활성을 나타내 열수 추출물은 양성대조군인 트롤록스(Trolox)(0.13㎍/㎖)과 같은 수준의 소거활성을 갖고 있는 것으로 나타났다.
실시예 5
홍경천 추출물의 과산화수소 소거 활성 시험
2mM의 H2O2를 함유한 포스페이트로 버퍼링된 살린 용액(phosphate buffered saline)(pH 7.4) 600㎕에 일정농도의 추출물 시료 300㎕를 가하고 5분 후에 230nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조군으로서 탈이온수를 사용하였을 때의 흡광도를 50% 감소시키는 시료의 농도를 IC50으로 표시하였다. H2O2의 농도는 H2O2의 흡광계수를 81 M-1Cm-1로 하여 230 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 도 5에 나타난 열수 추출물과 75% 에탄올 추출물의 H2O2소거활성은 각각 43.24㎍/㎖와 63.00㎍/㎖로서 갈릭산(217.97㎍/㎖)이나 아스코르브산(377.39㎍/㎖)보다 매우 높은 활성을 갖고 있는 것으로 확인되었다.
실시예 6
홍경천 추출물의 DNA 손상 억제 효과 시험(DNA 닉킹 에세이법)
Food and Chemical Toxicology. 39(2001) 229-237에 보고된 Kim 등의 방법을 약간 수정하여 pBR 322 DNA (2㎍/㎖)를 포스페이트로 버퍼링된 살린 용액(PBS, pH 7.4)에 용해시킨 일정 농도의 추출물 시료와 잘 혼합한 다음 30mM의 AAPH(2,2'-azobis(α-amidinopropane) dihydrochloride) 2㎕를 첨가하고 37℃에서 2시간동안 반응시켜 DNA에 퍼옥실 라디칼에 의한 손상을 유도하였다.
추출물 시료로 처리된 pBR 322 DNA 를 0.9% 아가로즈 겔상에서 전기 영동을 실시하였다. 전기영동 버퍼로는 40mM 트리스(Tris) 와 2mM EDTA를 함유한 트리스-아세테이트-EDTA 버퍼(pH 8.5)를 사용하였으며 호리전탈 서브마린 일렉트로포레시스(horizontal submarine electrophoresis) 장치를 이용하여 100V에서 1시간 10분동안 전개하였으며 0.5㎍/㎖ 농도의 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 60분간 착색(staining)한 후 탈이온수로 30분간 탈색시키고 UV를 조사하면서 DNA 밴드의 사진을 촬영하고(도 6 참조) 덴시토미터(densitometer)를 사용하여 DNA 밴드를 스캔(scan)하여 각 시료의 처리에 따른 슈퍼코일(supercoil) 형태의 DNA를 비교하여 DNA 손상에 대한 억제효과를 다음식에 의하여 계산하였다.
Retention(%)=(추출물 처리 시료 농도/대조군 시료 농도) X 100
Fig. 6에 보여준 결과와 같이 홍경천의 열수 및 75% 에탄올 추출물의 DNA손상에 대한 억제효과는 각각 51%와 19%로서 열수 추출물이 AAPH 라디칼에 의한 DNA의 손상에 대해 높은 보호작용을 갖고 있는 것으로 나타났다.
실시예 7
홍경천 추출물의 DNA 손상 억제 효과 시험(코멧 에세이법)
채혈 전 최소 8시간 이상은 음식물을 먹지 않은 건강한 실험 대상자(비흡연자)로부터 약 5㎖의 혈액을 채취하여 헤파린처리된 멸균 시험관(heparinated sterile tube)에 담아 2시간이내에 임파구 분리를 실시하였다. 인체 임파구는 신선한 전혈 30㎕을 1㎖의 10％ FBS(fetal bovine serum)를 함유한 RPMI 1640에 섞은 후 히스토페이크(Histopaque) 1077을 이용해 임파구만을 분리하였다.
임파구에 여러 가지 농도의 홍경천 열수 추출물 시료를 배양기에서 반응시키고 반응이 끝난 임파구 세포는 5분간 H2O2와 반응시켜 산화 스트레스에 의한 DNA 손상을 유발시킨다.
위와 같은 처리 과정을 마친 임파구 현탁액 20㎕을 채취하여 75㎕의 0.7％ LMA(low melting agarose gel)과 섞은 후, 0.5％ NMA(normal melting agarose)가 예비코팅된 완전 프로스트된 슬라이드(fully frosted slide) 위로 임파구와 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버 글라스로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. 겔이 굳으면 커버 글라스를 벗기고 그 위에 다시 0.7％ LMA 용액 75㎕로 한 겹 더 덮어 주었다. 슬라이드가 완성되면, 미리 준비해 둔 차가운 알칼리 라이시스(alkali lysis) 버퍼 (2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM tris)에 1％ 트리톤(Triton) X-100을 섞은 후 슬라이드를 담가 임파구세포의 DNA 이중 가닥을 풀어주었다. 1시간의 라이시스가 끝난 슬라이드를 전기영동 탱크에 배열하고 4℃의 차가운 버퍼(300mM NaOH, 10mM Na2EDTA)를 채워 언와인딘(unwinding)시키고 20분이 지나면 25V/300±3mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다.
전기영동이 끝난 후 0.4M Tris 완충용액 (pH 7.4)으로 충분히 세척하고 20 ㎍/㎖ 농도의 에티디움 브로마이드로 핵을 염색하여 형광현미경상에서 관찰하고 CCD 카메라를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 코멧 이미지 분석 시스템(comet image analyzing system)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 임파구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 추출물에 의한 손상억제정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리 (TL:tail length) 또는 TL에 테일(tail)내에 포함된 DNA(％)를 곱해준 TM(tail moment)를 구하였으며 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다. 분석결과는 DNA 손상도를 나타내는 TM으로부터 나온 값을 각 실험의 음성 대조군 값으로 보정하여 DNA손상도(relative score)로 표시하였다. 각 농도별로 one-way 분산 분석을 한 후, 각 농도별 차이는 던칸 테스트(Duncan test)로 사후 검증하여 통계적 유의성을 표시하였다(유의수준 a=0.05). 도 7의 홍경천 열수 추출물을 처리한 결과에서 알 수 있듯이 홍경천 열수 추출물의 처리는 인체 임파구 DNA에 H2O2에 의해 야기된 산화적 손상에 대해 DNA 손상 보호효과를 보여주었다. 그림에서 확인할 수 있듯이 홍경천 추출물의 처리농도가 50㎍/㎖인 저농도에서 DNA 손상정도는 양성 대조군에 비해 약 50％정도로 감소한 것을 볼 수 있었다. 또한 홍경천 추출물의 처리농도가 100㎍/㎖로 증가함에 따라 DNA 손상정도는 약 절반으로 감소하였다. 이로 부터 홍경천 추출물의 DNA 손상 보호작용을 확인할 수 있었다.
실시예 8
포도씨 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 시험
실시예 1과 동일한 방법에 의하여 포도씨 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을시험하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보면, 포도씨의 열수 및 75% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼에 대한 소거활성을 IC50으로 나타내었을 때 각각 2.51㎍/㎖과 2.35㎍/㎖로서 갈릭산의 3.20㎍/㎖와 아스코르브산 4.00㎍/㎖ 보다 높은 DPPH 소거활성을 보여주였다.
실시예 9
포도씨 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성 시험
실시예 2와 동일한 방법에 의하여 포도씨 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 시험하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보면, 포도씨의 열수 및 75% 에탄올 추출물의 IC50이 각각 0.58㎍/㎖와 0.50㎍/㎖로서 양성 대조군으로서 가장 높은 갈릭산의 소거활성(0.53 ㎍/㎖)과 같은 수준의 소거활성을 갖고 있는 것으로 나타났다.
실시예 10
포도씨 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 소거 활성 시험
실시예 3과 동일한 방법에 의하여 포도씨 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 소거 활성을 시험하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 보면, 열수 추출물은 3.07㎍/㎖, 그리고 75% 에탄올 추출물은 3.26㎍/㎖의 소거활성을 나타내어 갈릭산의 1.36㎍/㎖ 이나 아스코르브산의 2.37㎍/㎖보다 낮은 수준의 활성을 갖고 있었다.
실시예 11
포도씨 추출물의 데옥시리보스 에세이에 의한 하이드록시 라디칼 소거 활성 시험
실시예 4와 동일한 방법에 의하여 포도씨 추출물의 하이드록시 라디칼 소거 활성을 시험하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 보면, 열수 추출물의 IC50이 0.13㎍/㎖ 그리고 75% 에탄올 추출물의 IC50이 0.30㎍/㎖의 활성을 나타내 열수 추출물은 양성대조군인 트롤록스(0.13㎍/㎖)과 같은 수준의 소거활성을 갖고 있는 것으로 나타났다.
실시예 12
포도씨 추출물의 과산화수소 소거 활성 시험
실시예 5와 동일한 방법에 의하여 포도씨 추출물의 하이드록시 라디칼 소거 활성을 시험하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보면, 열수 추출물과 75% 에탄올 추출물의 H2O2소거활성은 각각 53.65㎍/㎖와 51.72㎍/㎖로서 갈릭산(217.97㎍/㎖)이나 아스코르브산(377.39㎍/㎖)보다 매우 높은 활성을 갖고 있는 것으로 확인되었다.
실시예 13
포도씨 추출물의 리놀레산의 산화에 대한 억제 활성 시험
0.5㎖의 리놀레산과 0.25㎖의 트윈(tween) 60(40% w/v)을 함유하는 증류수 50㎖를 유화시키고 1N KOH 를 사용하여 pH 7.0으로 중화시킨 다음 0.05M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 110㎖와 혼합하여 최종 부피가 160㎖가 되게 하여 리놀레산 용액을 제조하였다. 10㎖의 상기 리놀레산 용액에 DMSO에 녹여 농도별로 희석한 포도씨 추출물 시료 20㎕를 첨가한 후 37℃의 진탕 배양기에서 1시간 동안 진탕시킨 다음, 리놀레산을 과산화시키기 위해 촉매로서 0.05M FeSO4를 20㎕ 첨가하고 다시 37℃에서 2시간 동안 진탕시켰다. 과산화 처리된 리놀레산 용액 400㎕를 취하여 4℃에서 10분간 열처리(tempering)시키고 TBA(thiobarbituric acid) 43㎎을 탈이온수 10㎖에 용해시켜 만든 TBA 용액과 6M 포스포릭산을 부피비 5:1로 사용하기 직전에 혼합하여 제조한 TBA 시약 200㎕를 첨가한 다음 잘 혼합한 후 비등수조에서 15분간 열처리하고 수돗물로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 n-부탄올 560㎕를 가하고 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 잘 섞은 다음 3,000rpm에서 20분간 원심분리시켜 얻은 부탄올 상(butanol phase)으로 이행된 TBA와 TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)반응물의 흡광도를 530nm에서 측정하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이 열수 및 75% 에탄올 추출물의 억제활성이 각각 6.48 ㎍/㎖와 2.53 ㎍/㎖로서 75% 에탄올 추출물은 합성 항산화제로서 널리 쓰이는 BHA보다 높은 억제활성을 보여주었다.
실시예 14
포도씨 추출물의 DNA 손상 억제 효과 시험(DNA 닉킹 에세이법)
실시예 6과 동일한 방법에 의하여 포도씨 추출물의 DNA 손상 억제 효과를 DNA 닉킹 에세이법으로 시험하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 보면, 포도씨의 열수 및 75% 에탄올 추출물의 DNA손상에 대한 억제효과는 각각 53%와 66%로서 두가지 추출물 모두 AAPH 라디칼에 의한 DNA의 손상에 대해 높은 보호작용을 갖고 있는 것으로 나타났다.
실시예 15
포도씨 추출물의 DNA 손상 억제 효과 시험(코멧 에세이법)
실시예 7과 동일한 방법에 의하여 포도씨 추출물의 DNA 손상 억제 효과를 코멧 에세이법으로 시험하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보면,포도씨의 열수 추출물을 처리한 경우 인체 임파구 DNA에 H2O2에 의해 야기된 산화적 손상에 대해 DNA 손상 보호효과를 보여주었다. 그림에서 확인할 수 있듯이 포도씨 추출물의 처리농도가 50, 100, 250㎍/㎖로 증가할 수록, 포도씨 추출물 처리구의 DNA 손상정도는 양성 대조군에 비해 농도 의존적인 감소 경향으로 감소하여 포도씨 추출물의 DNA 손상 보호작용을 확인할 수 있었다.
본 발명에 의하여 홍경천 및 포도씨의 열수 및 75% 에탄올 추출물이 뛰어난 항산화 활성 및 DNA 손상 억제 작용을 가지고 있음이 밝혀졌다.
Claims (4)
- 홍경천(Rhodiola rosea) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항산화 작용 및 DNA 손상 보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 홍경천 추출물은 물 또는 75% 에탄올을 사용하여 추출한 것인 조성물.
- 포도씨 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항산화 작용 및 DNA 손상 보호용 조성물.
- 제3항에 있어서, 포도씨 추출물은 물 또는 75% 에탄올을 사용하여 추출한 것인 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020030027528A KR20040092952A (ko) | 2003-04-30 | 2003-04-30 | 항산화 활성 및 ｄｎａ 손상 억제 활성 물질로서의 홍경천및 포도씨 추출물 |
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|---|---|
| KR20040092952A true KR20040092952A (ko) | 2004-11-04 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100543809B1 (ko) * | 2004-02-27 | 2006-01-20 | 중모포도영농조합법인 | 항산화성 안토시아닌 색소 및 카테킨을 함유한 고품질의포도 과립차 및 그것의 제조방법 |
| US10352580B2 (en) | 2015-09-30 | 2019-07-16 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Air conditioner and method of controlling the same |
| CN110368468A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-10-25 | 无限极（中国）有限公司 | 一种具有抗污染损伤作用的组合物及制备方法、应用 |
| KR20240078599A (ko) | 2022-11-25 | 2024-06-04 | 건국대학교 글로컬산학협력단 | 락토바실러스 플라타럼, 락토바실러스 람노서스로 발효한 포도껍질 발효 추출물을 유효성분으로 하는 항산화, 항염증용 조성물 |
-
2003
- 2003-04-30 KR KR1020030027528A patent/KR20040092952A/ko not_active Application Discontinuation
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