KR102298173B1 - 곤충유래 글라이코스아미노글리칸을 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곤충유래 글라이코스아미노글리칸을 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 벌에서 추출된 뮤코다당류, 특히 서양뒤영벌 수벌 및 봉군으로부터 추출된 글라이코스아미노글리칸을 함유함으로써, 피부의 탄력과 보습의 개선, 피부주름개선, 피부장벽 기능 개선 및 항염에 도움을 주는 피부미용증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 곤충유래 글라이코스아미노글리칸은 Elastase 활성 억제능, Collagenase 활성 억제능 및 Hyaluronic acid 생성능이 모두 우수하고 인체피부에 안전성이 확인되어, 특히 피부보습이나 피부주름 개선 등에 탁월한 효과가 있다.

Description

곤충유래 글라이코스아미노글리칸을 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 조성물{A composition for improving skin beauty containing glycosaminoglycan extracted from insect}

본 발명은 곤충유래 글라이코스아미노글리칸을 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 벌에서 추출된 뮤코다당류인 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 유래 글라이코스아미노글리칸을 함유함으로써, 엘라스틴 분해 및 콜라겐 분해를 억제하며 히알루론산 농도를 크게 증가시켜서 피부의 탄력과 보습의 개선 및 피부주름개선에 도움을 주며, 피부 장벽 기능을 강화시키며 염증매개제의 활성을 억제하여 항염 효과를 갖는 피부미용증진용 조성물에 관한 것이다.

피부는 몸의 근육과 기관을 덮어 보호하는 상피조직으로 표피, 진피, 피하지방으로 구성되어 있으며 외부환경으로부터 신체를 보호하고 체온을 조절하며 감각을 느낄 수 있게 하는데 주로 외부의 물리적 손상 및 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하며, 수분 손실을 막는 보호 장벽 역할을 한다. 그 중 표피는 3개 층 중 가장 얇은 층으로 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 하며 특히 표피의 각질층에 존재하는 수분에 의하여 피부가 탄력 있고 부드럽게 된다.

또한, 최근에는 소비자의 고기능 화장품에 대한 욕구를 충족시키기 위한 미백, 피부주름 개선 및 억제, 그리고 자외선 차단 기능을 갖는 화장품들이 계속해서 개발되고 있는데, 그 중에서도 특히 주름 개선 및 억제 제품은 피부를 젊게 유지하려는 소비자의 많은 관심을 받는 대상이다.

나이가 들면서 콜라겐이 부족하거나 질이 저하되어 피부는 탄력을 잃고 주름이 생기게 되는데, 피부의 주름은 피부의 수분 함유량과 콜라겐의 함유량 그리고 면역 기능 등의 여러 요인에 영향을 받으며, 피부의 탄력은 이 콜라겐과 엘라스틴(elastin, 탄력섬유)에 의해서 유지되는 것으로 알려져 있다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해효소(MMP, matrix metalloproteinase)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

또한, 대식세포는 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 산화질소(NO, nitric oxide)와 사이클로옥시게네이스-2(COX-2, cyclooxygenase-2)에 의해서 과량 만들어지는 프로스타글란딘 E2(PGE2, prostaglandin E2) 등과 같은 염증 촉진 인자들을 생성한다. 따라서 PGE2 염증매개체의 활성을 직접적으로 억제하는 물질들은 여드름, 아토피성 피부염, 류마티스 관절염, 악성 신생물 등과 같은 각종 염증 관련 질환을 억제하는 항염증제로서 개발 가능성이 높으며, 최근에는 부작용을 나타내는 합성 항염증 치료제를 대체하는 보다 안전하고 효과 있는 천연 유래의 여러 식품 및 한약재로부터 항염증 치료제를 찾기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 글라이코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)는 우론산과 글루코사민이 반복되고 부분적으로 설페이트화된 구조를 가지며, 이러한 복잡한 화학구조에 의해 여러 종류의 생물활성을 나타낼 수 있게 된다. 현재까지 알려진 바에 의하면, 이러한 다양한 생물활성은 고유의 특정 서열이 존재함에 기인한 것으로 보인다. GAG류는 생체 내에서 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 형태로 존재하며 이러한 프로테오글리칸은 프로테아제와 글리코시다제에 의해 분해되어 당부분이 유리된다. GAG류의 생리적 역할에 대해서 아직까지 많이 밝혀져 있지 않으나, 생체내의 단백질들과 결합하여 생리활성을 나타내는 것으로 보인다.

이러한 GAG는 여러 곤충에서 추출할 수 있으나 곤충의 종류에 따라 추출량과 GAG 구성이 다른 것으로 알려져 있으며, GAG를 곤충으로부터 제조하는 방법은 한국등록특허 제10-1522604호에도 제안되어 있다.

종래기술에 의하면, 서양뒤영벌에서도 추출할 수 있는데, 서양뒤영벌(Bombus terrestris)은 벌목 꿀벌과의 곤충으로 유럽이 원산지이며 한국에는 자원곤충(화분매개용)으로 도입되었다. 여왕벌의 몸길이는 20～22㎜이고, 수벌의 몸길이는 14～16㎜이며 일벌의 몸길이는 11～17㎜이다.

또한, 곤충으로부터 GAG의 제조방법과 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제 용도, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방의 의약품 용도가 한국특허공개 제10-2011-0013074호(신규한 곤충글라이코자미노글라이칸의 제조방법)에 개시되어 있으며, 그 이후에 간 보호 식품 조성물(한국특허등록 제10-1869792호) 및 소염 및 관절염 등의 염증개선용 건강기능식품으로의 적용(한국특허등록 제10-1680644호), 등이 개시되었다.

그러나 이러한 기존의 GAG에 대한 활용기술은 아직까지 확실한 치료 효과를 나타내는 제품으로 상업화되지 못하고 있어서 실용화를 위한 연구가 지속되고 있으며, 이에 대한 실제 효능효과를 발휘할 수 있도록 활용성을 충분하게 발휘하도록 제안하지 못하고 있는 문제가 있다.

특히, 종래기술에서는 GAG를 활용함에 있어서 그 자체로서 유효성분으로서의 기능을 활용하는 기술이 부족하여 이를 다른 담체나 유효성분에 혼합하여 다양한 용도로 사용하고자 하는 시도가 있는 정도에 불과하였다.

그러므로 종래기술에서는 GAG의 유효성분으로서의 활용성을 제대로 밝혀내지 못한 문제가 있었다.

한국등록특허 제10-1522604호 공개특허공보 제10-2011-0013074호 등록특허공보 제10-1869792호 등록특허공보 제10-1680644호

이와 같은 종래기술의 문제점과 활용성 개선의 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 GAG 자체를 유효성분으로 하는 실효성 있는 새로운 용도의 개발을 해결과제로 한다.

본 발명자들은 이러한 문제 해결을 위해, GAG의 새로운 용도를 개발하기 위한 연구를 지속적으로 수행하던 중에, GAG 특히 곤충유래 GAG가 엘라스틴 분해 및 콜라겐 분해를 억제하며 히알루론산 농도를 증가시키어 피부의 탄력과 보습 및 주름의 개선에 도움을 주고 피부 장벽 기능을 강화시킬 뿐만 아니라 염증매개제의 활성을 억제하여 항염 효과를 가짐으로써, 피부미용 개선 효과가 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 곤충유래 GAG의 새로운 용도로서의 피부미용증진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 곤충유래 GAG를 함유하는 피부미용증진용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 곤충유래 GAG를 함유하는 피부미용증진용 건강식품을 제공하는데 있다.

상기와 같은 본 발명의 과제해결을 위하여, 본 발명은 곤충유래 글라이코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)을 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충유래 글라이코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충유래 글라이코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)을 유효성분으로 함유하는 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충유래 글라이코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)을 유효성분으로 함유하는 항염 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충유래 글라이코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)을 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 곤충유래 GAG가 전체 피부미용증진용 조성물 중에 유효성분으로서 0.01-5중량%로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 곤충유래 GAG을 함유한 피부미용개선용 조성물은 피부에 안전하고, 엘라스틴 분해 및 콜라겐 분해를 억제하여 피부의 탄력과 보습에 효과가 있으며 염증매개제의 활성을 억제하여 항염 효과도 가지므로 피부 보습력 유지, 주름개선 및 항염 등 피부미용개선에 우수한 효과를 발휘한다.

또한, 이러한 본 발명에 따른 GAG는 기존과는 달리 그 자체로서 피부미용개선에 유효한 활성을 나타내는 것이므로 다른 유효활성 성분을 혼합하여 사용하지 않더라도 그 자체로서 피부미용개선을 위한 조성물로 화장품이나 건강식품으로서 활용이 가능한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 사용한 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 유래된 GAG의 면역세포 세포독성을 보여주는 그래프이다.
도 2A는 본 발명의 실시예에서 사용한 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 유래된 GAG의 HAS-2 mRNA 발현효과를 보여주는 그래프이다.
도 2B는 본 발명의 실시예에서 사용한 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 유래된 GAG의 HAS-3 mRNA 발현효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 사용한 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 유래된 GAG의 필라그린 mRNA 발현효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 사용한 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 유래된 GAG의 Elastase 억제능을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 사용한 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 유래된 GAG의 LPS유도 염증 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 기존에 항암 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있는 글라이코스아미노글리칸; GAG)의 새로운 용도에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 곤충유래 GAG를 단순하게 다른 유효성분과 혼합하여 사용하는 것이 아니라 본질적으로 GAG 단독으로도 유효성분으로서 기능하도록 하는 것으로서, GAG에 대한 유효성분으로서 용도를 새롭게 제시하고자 한다.

일반적으로 GAG는 의약 용도로서 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제 용도, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방의 의약품이나 지방 축적 억제용 식품 등으로 알려져 있으나, 피부미용증진을 위한 유효성분으로서의 실질적인 용도에 관해서는 전혀 제안된 바 없다.

많은 의약품이나 건강식품이 개발되고 있지만 이러한 의약이나 식품용 성분들이 피부미용증진이나 피부미용개선에 효과가 있는 것을 발명하는 것은 어려운 작업 중의 하나이다.

본 발명에서는 기존에 피부미용증진용 효과가 밝혀지지 않은 GAG 성분을 피부미용증진에 대한 새로운 효과를 밝혀낸 것으로서, 특히 피부의 보습과 주름개선, 피부장벽 기능 강화 및 항염에 효과가 뚜렷함을 새롭게 밝혀냈다.

피부는 매우 민감한 부분이며, 특히 안면피부의 경우 다른 부위에 비해 매우 민감하여 이러한 피부에 미용개선효과를 발현하는 물질을 찾아내는 것은 어려운 작업이 수반된다. 피부의 주름은 피부의 수분 함유량과 콜라겐의 함유량 그리고 면역 기능 등의 여러 요인에 영향을 받으므로, 엘라스틴 분해 및 콜라겐 분해를 억제하며 히알루론산 농도를 현저하게 증가시켜서 피부의 탄력과 보습의 개선에 도움을 줌으로써, 피부 주름이 개선될 수 있다. 피부의 염증은 프로스타글란딘 E2(PGE2, prostaglandin E2) 등과 같은 염증 촉진 인자가 과량 생성되어 나타나는데, PGE2 염증매개체의 활성을 억제하여 피부의 염증이 개선될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 제조된 곤충유래 GAG가 엘라스틴 분해 및 콜라겐 분해를 억제하며 히알루론산 농도를 크게 증가시키고 피부장벽 기능을 강화시키며 PGE2 염증매개체의 활성을 감소시킨다는 사실을 최초로 밝혀냈다.

따라서 본 발명은 곤충유래 GAG를 엘라스틴 분해 억제, 콜라겐 분해 억제, 히알루론산 농도 증가, 피부장벽 기능을 강화 및 PGE2 염증매개체 활성 감소를 위한 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 조성물을 제공한다. 특히, 곤충유래 GAG를 엘라스틴 분해 및 콜라겐 분해 억제와 히알루론산 농도 증가를 위한 유효성분으로 하여 피부 주름개선용 화장료 조성물로 적용하는 경우에 탁월한 효능을 보인다. 그 이외에도 피부 보습용으로도 우수한 효과가 있고, 이너뷰티로 먹는 화장품이나 피부미용증진을 위한 건강식품으로도 적용이 가능하다.

GAG는 다양한 천연자원에서 추출하여 얻을 수 있는데, 예컨대 바람직하게는 곤충에서 추출하여 얻을 수 있다. 본 발명은 특히 벌에서 유래된 것을 바람직하게 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직하게는 본 발명의 목적에 가장 부합되는 곤충유래 GAG 추출물은 벌이 바람직하고, 그 중에서도 특히, 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 얻은 GAG가 특히, 엘라스틴 분해, 콜라겐 분해 및 항염 효과가 우수함을 확인하였다.

서양뒤영벌은 농촌에서 화분매개용으로 많이 사용되고 있으므로 이를 공급하는 양봉업체도 발달되어 있어 수집하기가 용이한 장점이 있으며, 특히 수벌 및 봉군은 여왕벌에 비해 수집이 용이하고 공급량이 많아 사용하기가 용이한 장점이 있다.

또한, 일반적으로 폐기되는 수벌과 봉군을 사용할 수 있어 구입비용이 저렴하고 폐기되는 곤충 부산물을 재활용하는 것이므로 환경적으로도 매우 바람직하다.

따라서 본 발명의 바람직한 예로서, GAG를 벌, 특히 서양뒤영벌 수벌 및 봉군에서 추출한 것을 피부미용증진용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 GAG 추출을 위해, 바람직하게는 예컨대 서양뒤영벌 수벌 및 봉군을 유기용매로 세척하여 꿀 성분과 지방류를 제거하고 잔유물을 건조하는 단계, 건조된 잔유물을 150~500㎛로 분쇄하는 단계, 위 단계의 분쇄물을 단백분해제로 단백질을 분해하고 이를 제거하는 단계, 단백질이 제거된 잔유물을 에탄올에 침전시키고 세척하는 단계를 포함하는 방법으로 서양뒤영벌 수벌 및 봉군으로부터 GAG을 제조할 수 있다. 그러므로 본 발명은 이러한 GAG 추출물의 제조방법을 포함한다.

본 발명에 따른 피부미용증진용 조성물에 함유되는 서양뒤영벌여왕벌로부터 제조될 수 있는 글라이코스아미노글리칸(GAG)은 예컨대 한국등록특허 제10-1522604호(곤충 글라이코자미노글라이칸 유래 헤파린 단편 및 이의 제조방법)에 의하여 제조할 수도 있으나, 구체적으로 다음 방법으로 제조하여 사용하는 것이 바람직하다.

(1) 서양뒤영벌 수벌 및 봉군을 에탄올로 세척하고 건조한 후 1차 분쇄하는 단계;

(2) 위 분쇄물을 에탄올로 추출하여 지방류를 제거하고 잔사물을 회수하여 건열 건조하고 평균직경 150～500㎛ 로 분쇄하는 단계;

(3) 위 잔사물에 5-15배 부피의 탄산나트륨, 좋기로는 pH 8-10, 더욱 좋기로는 pH 8.5-9.5인 탄산나트륨 을 넣어 교반한 후 단백질 분해효소로 단백질을 분해하는 단계;

(4) 위 분해액에 Trichloroacetic acid 를 첨가하고 침전을 유도한 후 분해단백질을 제거하는 단계;

(5) 위 상등액에 에탄올과 초산나트륨을 첨가하여 침전시키고 냉장보관한 후 침전물을 회수하는 단계;

(6) 위 침전물을 에탄올로 세척하고 건조시키어 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG을 얻는 단계.

위 1단계는 단순하게 이물질을 제거하는 것만이 아니라, 1차 분쇄하여 지방류 제거가 용이하도록 하는 것이다. 일반적으로 수벌 및 봉군에는 화분, 꽃가루 및 꿀 성분 등도 많이 존재하여 잔사의 회수가 용이하지 않으므로 유기용매를 구배를 두어 세척하여 점성을 줄여나가는 방법으로 세척함이 바람직하다. 또한, 곤충에는 지방류 함량이 높고 이에 따라 필요로 하는 성분의 추출이 어려운 점이 있어 산업적으로는 지방류 제거가 매우 중요한 문제가 된다. 기존에는 이에 대한 특별한 해결책이 제시되지 아니하고 바로 다음 단계인 분쇄를 시행하였다. 그러나 본 발명은 바람직하게고 이러한 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 곤충의 수집단계에서 많이 혼입되어 있는 이물질들을 제거하고 또한 1차 간헐분쇄를 통하여 크기를 작게 하여 용매와 닿는 면적을 넓히고 내부로의 흡수를 용이하게 하여 지방류가 매우 효율적으로 제거되도록 한 것이다.

위 2단계에서 잔사물의 평균직경은 150㎛ (통상 100mesh)보다 작으면 분쇄하기가 매우 어렵고 손실율도 높아지며, 500㎛ (통상 35mesh)보다 크면 효소분해가 늦어질 수 있는데, 더욱 좋기로는 350~500㎛ (통상 35~45mesh)이 더 바람직하다.

본 발명에 따르면, 이러한 분쇄과정에서 본 발명에 비해 더 작은 크기로 분쇄하는 경우, 예컨대 100mesh 크기 보다 더 작은 입경을 분쇄하는 경우 그 제조과정에서 곤충 특성상 건조가 어려운데다가 분쇄공정이 매우 어려운 문제가 있을 뿐만 아니라 분쇄에 필요한 공정시간도 오래 소요되며, 입자가 너무 작아서 오히려 효소분해가 늦어질 염려가 있다. 또한, 원심분리시 상등액에 유입될 염려가 크기 때문에 분리도 어려워서 전제적으로 오히려 공정상 불리하고 비경제적이며, 수율도 저하되는 요인으로 작용한다. 그러므로 본 발명에서는 이러한 문제 해결을 위해 잔사물의 평균입경, 바람직하게는 입경을 100mesh 보다 크게 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 위 3단계에서 단백질분해효소는 예컨대 Alcalase (Alkaline Protease)를 사용하며 실온이상의 온도에서 1～7일 반응시킬 수 있으나 2~3일이 능률적이어서 바람직하다.

본 발명의 피부미용증진용 조성물은, GAG을 유효성분으로 함유하기 위해서 전체 조성물 총중량 대비 0.01~5.0 중량%로 사용할 수 있다. 만일, 본 발명의 피부미용증진용 조성물을 화장품으로 구성하는 경우 경제적인 면을 고려하면 바람직하게는 0.01-1.0중량%, 더욱 바람직하게는 0.03~0.3 중량% 포함할 수 있다. 또한, 화장품 중에서 경구 투여되는 이너뷰티용 화장품이나 건강식품 등으로 적용하여 유효성분으로 함유하도록 하기 위해서는 상기 보다 과량, 예컨대 0.3-5.0중량%로 함유하도록 할 수 있다. 바람직한 예로서 GAG가 5-1000㎍/ml, 좋기로는 100-700㎍/ml, 더욱 좋기로는 200-700㎍/ml로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, GAG가 피부미용증진용 조성물의 유효성분으로 사용되기 위해서 총 중량대비 0.01 중량% 미만 포함되는 경우 엘라스틴 분해 및 콜라겐 분해 억제가 나타나지 않는 문제가 있으며, 전체 용량 중에5.0 중량% 초과인 경우 건조 피부를 가진 사람에게 피부 가려움 등 부작용이 발생될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 모든 제형, 예를 들면, 용액, 현탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 팩, 폼 등으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장품은 통상의 화장료 조성물에 사용되는 점증제, 산화방지제, 보존제, 피부 보습제, 피부 유연화제, 계면활성제, L-멘톨, 모발 컨디셔닝제, 기포방지제, 향료 등을 더 포함할 수 있다.

또한, 피부미용증진용 건강식품으로서는 액제, 엑기스, 고형제, 정제, 분말제, 그래뉼, 캡슐 등으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 피부미용증진용 조성물을 화장품으로 사용하는 경우 그 화장품 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 피부미용증진용 조성물을 이용한 화장품의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

본 발명에 따른 피부미용증진용 조성물을 이용한 화장품의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 및 폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부미용증진용 건강식품은 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 추가적으로 다른 성분들을 복합하여 사용할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 이는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 : 글라이코스아미노글리칸(GAG)의 제조

서양뒤영벌 수벌 및 봉군 1㎏을 체를 이용하고 에탄올을 구배를 두어 100%, 90%, 70% 에탄올로 세척 후 Dry-Oven 에서 건조시킨 후에 간헐분쇄 하고, 위 분쇄물을 3배 부피의 에탄올로 추출하였으며, 추출 잔사를 Dry-Oven에서 건조시키고 분쇄기로 35mesh (500㎛)가 될 때까지 분쇄하였다.

분쇄된 잔사 100g 에 10배 부피의 탄산나트륨(pH 9.0)을 넣어 교반한 후, 잔사 중량의 1/10 부피의 알칼레이스(Alcalase) 분말을 첨가하고 2일간 정치 배양하였다.

배양물을 부흐너판넬로 여과하고, 용액에 존재하는 단백질 및 효소의 불활성화를 위해서 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid)을 최종농도 5%가 되도록 처리하고 부흐너판넬로 여과하였다.

용액에 2배 부피의 에탄올을 첨가하고 최종농도 1% 되도록 초산나트륨(Sodium acetate)을 첨가하여 침전시켰으며, 1일간 냉장 보관한 후 부흐너판넬로 여과하여 침전물만 회수하였다.

회수된 침전물을 100 → 70% 에탄올로 세척한 후 열풍 건조하여 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG을 얻었으며 최종 수득률은 원물대비 1.6%이었다.

비교제조예 : 글라이코스아미노글리칸(GAG)의 제조

제조예의 방법 중 서양뒤영벌 수벌 및 봉군의 세척 및 간헐분쇄를 하지 않았고, 건조 후 분쇄기로 200mesh가 될 때까지 분쇄한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제조하였으며 최종 수득율은 원물대비 0.3% 이었다.

실험예 : 글라이코스아미노글리칸(GAG)의 피부미용증진 효과 평가

(1) 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG의 세포독성평가

대식세포(macrophage) 유래의 인 RAW264.7 세포를 96-well plate에 2×10⁴ cells/well 농도로 분주하여 세포가 완전히 부착하도록 12 h 동안 배양한 후 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG를 다양한 농도(25, 50, 100, 200, 400 μg/mL)로 24 h 동안 처리하였다. 배양 후 MTT reagent를 처리하여 살아있는 세포에 형성된 formazan을 디메틸설폭사이드(DMSO, dimethyl sulfoxide)를 well당 100 μL씩 첨가하여 용해한 후 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

MTT assay를 이용하여 세포생존율을 확인한 결과를 도 1에 나타내었는데, 모든 농도에서 대조구 대비 세포 독성이 나타나지 않았다.

(2) 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG의 보습효과 평가

인간각질형성세포인 HaCaT세포를 1×10⁶ cells/well 농도를 6-well plate에 분주하여 24h 배양한 후에 serum-free 배지로 교환하여 24 h 동안 starvation 하였다. 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG (0.1, 1, 10 ug/mL)을 처리한 뒤 세포 TRIzol을 이용하여 전체 RNA를 추출하고 정량하여 1 ug의 RNA를 oligo(dT) primer를 사용하여 cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA는 HAS-2, HAS-3, Filaggrin 및 GAPDH 프라이머를 이용하여 Real-time PCR을 수행하였다. Real time PCR을 통해 얻은 실험 결과는 housekeeping 유전자인 GAPDH를 기준으로 방법으로

Ct계산하여 그 결과를 도 2A 및 도 2B에 나타내었다.

그 결과 대조군에 비하여 HAS-2는 1 ug/mL, 10 ug/mL에서 각각 1.3, 1.6 배만큼, HAS-3는 1 ug/mL, 10 ug/mL에서 각각 1.4, 2.7 배 만큼 발현량이 증가한다는 것을 알 수 있었다.

(3) 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG의 피부 장벽 기능 평가

서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG의 피부장벽 기능 개선에 대한 효과를 알아보기 위하여, (2)에서와 같이 HaCaT 세포에 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG를 처리하여 24 h 배양 후 RT-PCR을 통해 filaggrin mRNA의 발현변화를 확인하여 도 3에 나타내었으며, 그 결과, 1 ug/mL 에서 2.1 배 증가하였으며 10 ug/mL에서는 3.0 배 증가 하였다.

따라서 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG가 각질형성세포에 처리 시 피부장벽 구성 펩타이드인 필라그린(filaggrin)의 발현을 증가시킴으로써 피부장벽의 기능을 강화시킴을 확인하였다.

(4) Elastase 활성 억제능 평가

GAG의 피부미용증진(주름개선) 효과를 평가하기 위해 아데노신을 비교물질로 하여 Elastase 활성 억제능을 측정하였으며 제조예에서 얻은 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG를 50㎎/㎖로 희석하여 효과평가의 시료로 사용하였다.

0.1M Tris-HCl buffer (pH 8.0)에 농도별(125㎍/㎖, 250㎍/㎖, 500㎍/㎖)로 희석한 시료 220 ㎕와 2 ㎎/㎖ N-succinyl-Ala-Ala-Ala-ρ-nitroanilide 20 ㎕를 첨가하여 25℃ 조건에서 10분간 반응시켰다. 1 ㎍/㎖의 porcine pancreatic elastase (PPE) 20 ㎕를 첨가하여 25℃ 조건에서 20분간 반응시킨 다음 얼음위에서 반응을 종결시킨 후 microplate reader를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, Elastase 억제능은 시료 처리구와 무처리구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

[수학식]

억제능(%) = 1 - (시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) ×100

Elastase 억제능 평가 결과, 도 4에서와 같이 GAG는 비교물질인 아데노신에 비하여 500㎍/㎖에서 약2배 가까운 Elastase 억제 활성을 나타내었다.

(5) 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG의 항염 효능 평가

항염 효능 평가를 위하여 다음과 같이 프로스타글란딘 E2((PGE2, Prostaglandin E2)억제능을 측정하였다.

RAW 264.7세포를 2*10⁴ cells/well의 농도로 48 well plate에 분주한 후 세포가 완전히 부착하도록 12 h 동안 배양하고, 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG를 25, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 12시간 동안 처리하고 1 ㎍/㎖의 지질다당체(LPS, lipopolysaccharide)를 처리하여 24 시간 배양 후 배양 상등액을 취하여 상등액 내 PGE2의 함량을 측정하였다. PGE2의 함량은 ELISA kits(abcam Inc.)의 매뉴얼에 제시되어있는 방법으로 측정하였고 그 결과는 도 5와 같았다.

측정 결과, LPS 단독구(1664.8±127.5 pg/mL)와 비교하였을 때 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG 100 μg/mL 병용처리구에서 1447.9±69.6 pg/mL로 13%감소되는 것으로 나타났으며, 200 μg/mL 처리구에서 1227.9±83.2 pg/mL로 26%감소되는 것으로 나타났으며, 400 μg/mL 처리구에서 808.69±128.1 pg/mL로 51%감소되는 것으로 나타났다. 따라서 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG는 LPS로 유도되는 염증반응을 억제하는 활성이 매우 높은 것으로 판단된다.

위와 같이 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG는 세포독성이 거의 없으며 보습, 주름, 피부장벽 기능 개선 및 항염 효능을 가짐으로써 피부미용에 탁월한 효과가 있는 것으로 확인되었다.

실시예 1 : GAG를 포함하는 피부미용증진용 화장품(겔제) 제조

다음과 같은 조성의 겔제를 일반적인 겔제의 제조방법과 동일한 방법으로 제조하였다. GAG로서는 상기 제조예에서 제조된 것을 사용하였다.

원 료	함량(중량%)
알코올 글리세린 유동파라핀 디에톡시에틸 석시네이트 클로르페네신 트리에탄올아민 페닐 트리메치콘 코폴리머 Disodium EDTA 부틸렌 글라이콜 정제수 감초뿌리추출물 GAG	1.0 2.0 8.0 0.5 0.3 0.5 0.5 0.2 0.1 3.0 83.5 0.1 0.3
합 계	100

실시예 2 : GAG를 포함하는 피부미용증진용 화장품(크림제) 제조

다음과 같은 조성의 크림제를 일반적인 크림제의 제조방법과 동일한 방법으로 제조하였다.

원 료	함량(중량%)
로즈 프리미엄워터 호호바 골덴 아르간 오일 로즈힙 오일 마카데미어 넛 오일 올리브 유화 왁스 몬타 왁스 68 씨벅톤 오일 세라마이드 어성초추출물 감초뿌리추출물 나프리 GAG	56.5 10.0 6.0 6.0 6.0 5.0 2.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 0.5
합 계	100

실험예 2 : GAG의 안전성 평가

안전성 시험에는 상기 제조예에서 제조된 GAG의 농도가 600㎍/㎖인 시료를 사용하였다.

(1) 민감성피부 안전성 시험

국제접촉피부염학회 및 미국화장품협회 기준을 응용한 기준에 의거 Lactic acid stinging test에서 민감성으로 판정된 피험자를 선정하여 실시하였으며, 피험자의 등에 24시간 첩포(폐쇄첩포) 후에 첩포 제거 30분, 24시간, 48시간 후에 관찰하였다. 시험 결과 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG는 민감성 피부 대상으로 한 일차 자극시험 측면에서 무자극 물질로 판단되었다.

(2) 인체피부 광독성 시험

미국화장품협회 가이드라인에 따라 단회 첩포 시험 방법(24hours Single Patch Test)에 따라 시험하였으며, 광(UVA) 조사 후 20분, 24시간, 48시간 경과 시에 Personal Care Products Council guidelines(2014)에 따라 피부반응을 비교하여 평가하였다. 시험 결과 20%에서 미세한 홍반이 있었으나 48시간 또는 72시간이내에 모두 소실되었다. 따라서 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG는 인체피부의 광독성 측면에서 안전한 물질로 판단되었다.

(3) 안자극 평가 시험

유럽동물대체시험법검증센터의 유럽유해물질관리지침에 따라 시험 및 판정을 하였으며, 시험 결과 판정기준에 따른 평균 반응도는 0.1(0.3~0.4)로 나타났다. 따라서 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG는 안점막 자극의 수준이 무자극 범주의 물질로 판단되었다.

위와 같이 본 발명에 따르면, 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 GAG는 인체 피부 및 안점막에 대한 안전성이 확인되었으므로 화장품의 유효성분 원료로 사용될 수 있는 것이 확인되었다.

본 발명에 따른 곤충유래 GAG를 유효성분으로 함유하는 피부미용증진용 조성물은 세포독성이 거의 없으며 보습, 주름, 피부장벽 기능 개선 및 항염 효능이 확인되었으며, 인체피부에 안전한 물질임이 확인되어 피부미용증진용 화장품이나 피부미용증진용 건강식품으로 사용이 가능하다.

Claims (8)

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2. 삭제
3. 삭제
4. 서양뒤영벌 수벌 및 봉군을 에탄올로 세척하여 건조한 후 1차 분쇄하는 단계;
   위 1차 분쇄물을 에탄올로 추출하여 지방류를 제거하고 잔사물은 건조하여 직경 150～500㎛ 로 분쇄하는 단계;
   위 잔사물에 10배 부피의 탄산나트륨을 넣어 교반한 후 단백질분해효소로 단백질을 분해하는 단계;
   위 분해액에 Trichloroacetic acid 를 첨가하고 침전을 유도한 후 분해단백질을 제거하는 단계;
   위 상등액에 에탄올과 초산나트륨을 첨가하여 침전시키고 냉장 보관한 후 침전물을 회수하는 단계;
   위 침전물을 에탄올로 세척하고 건조시키어 서양뒤영벌 수벌 및 봉군 유래 글라이코스아미노글리칸을 얻는 단계;
   를 포함하는 글라이코스아미노글리칸 함유 피부미용증진용 조성물의 제조방법.
   
5. 청구항 4에 있어서, 서양뒤영벌 수벌 및 봉군을 에탄올로 세척하는 것은 서양뒤영벌 수벌 및 봉군을 에탄올을 구배를 두어 100%, 90%, 70% 에탄올로 세척하는 것임을 특징으로 하는 피부미용증진용 조성물의 제조방법.
   
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