KR100578626B1

KR100578626B1 - 기능성 항산화 음료 조성물

Info

Publication number: KR100578626B1
Application number: KR1020030092770A
Authority: KR
Inventors: 김태석; 심재석; 김승덕; 최인; 김경남; 박유경; 강명희
Original assignee: 주식회사풀무원; 강명희
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2003-12-17
Publication date: 2006-05-11
Also published as: KR20050061018A

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 갖는 천연 식물 소재 추출물들을 탐색하고, 최종 6종의 높은 항산화 활성을 나타내는 식물 추출물을 선발하여 이를 이용한 최적의 배합비를 조사하고 이러한 배합비를 이용하여 제조된 기능성 항산화 음료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 항산화 활성 물질을 함유하고 있는 식물 추출물을 이용하여 기존에 단순한 항산화 실험법을 통한 효능 검증 방법을 개선하여 산화 작용에 의해 생성되는 자유라디칼(free radicals)을 제거하는 기본적인 항산화 활성 측정법과 더불어 실제 인체 내 항산화 활성을 측정할 수 있는 지표로서 흡연자에 의한 DNA 손상을 조사하여 조직 내 항산화 활성을 측정하는 방법을 이용하였고, 동물 실험과 인체 시식실험을 통해서 그 효능이 입증된 기능성 항산화 음료 조성물로 제공할 수 있다.

식물소재, 항산화, 다중활성, 음료

Description

기능성 항산화 음료 조성물{Composition for functional antioxidant beverage}

도 1은 항산화 시제품의 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical) 소거활성 그래프.

도 2는 항산화 시제품의 하이드로겐 퍼옥사이드(hydrogen peroxide) 소거활성 그래프.

도 3은 항산화 시제품의 DNA nicking assay 사진.

도 4는 항산화 시제품의 DNA comet assay 그래프.

도 5는 항산화 시제품의 동물실험에 의한 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase, SOD) 효소 활성 그래프.

도 6은 항산화 시제품의 동물실험에 의한 카탈레이즈(catalase) 효소 활성 그래프.

도 7은 항산화 시제품의 인체섭취 실험에 의한 DNA tail length(TL) 그래프.

도 8은 항산화 시제품의 인체섭취 실험에 의한 % DNA in tail 그래프.

도 9는 항산화 시제품의 인체섭취 실험에 의한 tail moment(TM) 그래프.

본 발명은 항산화 활성 물질을 포함하는 수종의 식물 추출물을 탐색하여 최종 6종의 우수한 항산화 활성을 나타내는 식물 추출물을 이용하여 제조한 기능성 항산화 음료 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 항산화 활성이 있는 수종의 식물 추출물 중에서 신선초 추출물, 케일 추출물, 루이보스 추출물, 녹차 추출물, 노니 추출물 및 적와인 추출물을 최적의 배합비로 혼합하여 제조한 우수한 항산화 활성을 갖는 기능성 항산화 음료 조성물에 관한 것이다.

사람 몸의 정상적인 대사 과정에서는 활성산소라는 화학적인 입자가 부수적으로 생산된다. 이러한 활성산소 들은 끊임없이 몸의 구성 세포들을 공격해 손상을 입히는데 이것을 산화라고 한다. 활성산소에 의한 손상들은 인체의 자연 치유력에 의해 회복되지만, 회복능력 이상의 손상들이 지속적으로 가해지게 될 경우 일생을 통하여 만성적으로 유해작용이 일어나게 된다. 이러한 유해 작용은 세포나 조직의 기능을 저하시키며 질병 및 노화의 원인이 된다.

자유 라디칼(free radical)은 하나 이상의 짝을 이루지 못한 전자를 가지고 있는 분자로서 다른 분자로부터 전자를 빼앗아 안정화하려는 특성을 지니고 있다. 또한 자유 라디칼은 수명이 수천 분의 일초 정도로 짧아 매우 불안정하고 공격적이며 강한 산화력을 가지고 있다. 자유 라디칼의 대부분은 활성 산소종(reactive oxygen species)으로, 그 종류로는 하이드록실 라디칼(hydroxy radical), 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 일중항 산소(singlet oxygen) 및 과산화수소(H₂O₂)와 지질과 산화에 따라 발생하는 알콕실 라디칼(alkoxyl radical) 등이 있는데 이들은 생체에 치명적인 산소독성을 일으키는 양면성을 지니고 있다. 즉, 이들 활성 산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로서 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파킨슨병 등의 뇌질환과 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기 질환, 염증, 류마티스 및 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다.

이러한 자유 라디칼에 의한 손상으로부터 스스로를 보호하기 위해 체내에는 일련의 산화 보호 시스템을 갖추고 있다. 이러한 보호 시스템으로 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase, SOD), 카탈레이즈제(catalase) 등의 효소와 알파-토코페롤(α-tocopherol, vitamin E), 베타-카로틴(β-carotene), 아스코르빈산(ascorbic acid, vitamie C) 및 클루타치온(glutathione)과 같은 지용성 및 수용성 항산화제 또는 라디칼 소거제들이 포함된다.

최근 항산화제와 관련된 연구는 식품공업, 발효공업 및 의약산업 분야, 농업 분야 등 다방면의 분야에서 이용될 수 있기 때문에 국가 경제 산업적 측면에서 매우 큰 파급효과를 기대할 수 있다. 특히 지금까지 알려진 항산화제가 약한 활성, 독성 및 사용상의 한계로 인하여 의약활성물질로 사용하는 데에 있어서 많은 문제점을 내포하고 있기 때문에 천연으로부터 보다 안전하고 강한 활성을 지닌 신규 천연 항산화제의 개발이 요구된다.

최근 프랑스 보르도지방 남부에 생육하고 있는 프랑스 적송의 수피에서 추출 한 수용성 식물성분인 피크노제놀(pyconogenol)은 vitamin E의 50배, vitamin C의 20배 이상의 강력한 항산화 활성을 나타내는 물질로서 식품첨가물, 화장품원료 등의 목적으로 판매되고 있다. 이러한 상품들은 미국의 건강식품 시장에서 수년간 3억불의 매우 큰 시장을 형성하고 있으며, 최근 일본에서도 판매를 시작했는데 음료와 화장품 원료로 kg당 40만 円을 호가하고 있는 등 커다란 시장을 형성하고 있다. 펄프 제지 산업의 부산물인 적송의 수피로부터 피크노제놀(pyconogenol)이라는 항산화제를 개발함으로써 고부가가치 상품을 창출한 성공적인 예가 되고 있다.

항산화제 시장규모를 보면 식품분야에서만도 년간 10억불 이상의 세계시장을 확보하고 있는데, 이들은 대부분이 천연 항산화제가 주류를 이루고 있다. 국내에서의 항산화제 개발 연구는 대부분 미생물 대사산물을 비롯하여 버섯류, 조류 등의 해양생물, 식물, 동물, 식품 가수분해산물 등 매우 다양하며 발견되는 항산화물질의 종류 또한 대상이 되는 천연물의 종류에 따라 다양하다. 그러나 이러한 식품소재를 재료로 하여 단순한 항산화활성의 유무 및 활성의 강도를 측정하고 식품의 보호제로서의 항산화제의 이용에 국한되어 뚜렷한 효능을 입증하지 못하고 있으며, 의약품 또는 기능성 음료로 적용하는 예가 극히 드문 실정이다.

이에 본 발명자들은 4가지의 기본적인 항산화 활성 측정법 및 DNA 손상 측정법을 동시에 수행하는 다중 활성 검증에 의해서 효능을 확인하고, 동물 실험 및 인체 시식실험을 통해서 분자 레벨에서 인체 내 실질적인 항산화 효능을 입증할 수 있는 최적 배합비의 조성물을 제공하여 기존 항산화 음료 시장을 형성하고 있는 루이보스 티와 녹차 보다 우수한 기능성 항산화 음료 조성물을 제공함으로서 대기환 경 오염, 불건전한 식생활, 자외선 노출, 스트레스, 각종 질병 등의 유해 환경에 노출되어 있는 현대인들이 생체 내 산화적 스트레스(oxidative stress)를 충분히 소거할 수 있도록 하는 항산화 영양 성분을 제공하기 위한 목적으로 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 항산화 활성이 우수한 식물 추출물의 최적 배합비로 이루어져 있고, DNA 손상 회복 측정법 등의 다중 활성 검증과 동물 실험 및 인체 시식 실험을 통해서 분자레벨에서 입증된 체내 항산화 효능을 갖는 기능성 항산화 음료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 항산화 활성이 보고 된 식물 추출물들을 탐색하고 항산화 활성을 조사하여 유효성 있는 식물 추출물들을 선발하여 기능성 항산화 음료 조성물을 제조하였다. 또한 기존의 연구들이 DPPH법 등의 기본적인 항산화 활성 측정법에만 국한되어 효능을 보고하였던 것과는 달리 본 발명에서는 DPPH법 이외에 ABTS법과 인체 내 실질적인 항산화 효능을 증명하기 위한 지표로서 인체임파구 세포배양 실험을 이용한 DNA 손상 회복능(ex vivo) 측정법과 동물 실험을 통한 효능검증(in vivo) 및 흡연자를 대상으로 한 인체 섭취실험을 이용한 DNA 손상 회복능(in vivo)을 측정하였으며, 그와 직접적인 관련이 있는 hydroxyl radical과 hydrogen peroxide 소거활성에 대한 연구를 주요 활성 측정법으로 수행하였다.

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 인체 내 항산화 영양소를 충분히 공급할 수 있는 기능성 항산화 음료 조성물을 제조하기 위해 항산화 활성이 보고된 식물들을 중심으로 하여 DPPH법, ABTS법, 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical) 소거법 및 하이드로겐 퍼옥사이드(hydrogen peroxide) 소거법에 의해 항산화 활성을 탐색하였으며 동시에 조직 내 DNA 손상 억제 효과를 측정함으로서 신선초 추출물, 케일 추출물, 노니 추출물, 루이보스 추출물, 녹차 추출물 및 적와인 추출물의 유효성 있는 식물 추출물을 선발하여 기능성 항산화 음료 조성물을 제조하였다.

기능성 항산화 음료 조성물은 최적의 배합을 통한 우수한 항산화 활성을 위해 신선초 추출물 20 내지 50 중량%, 케일 추출물 20 내지 50 중량%, 노니 추출물 10 내지 30 중량%, 루이보스 추출물 2 내지 5 중량%, 녹차추출물 1 내지 4 중량%, 적와인 추출물 1 내지 4 중량% 및 관능을 고려한 단풍나무 수액을 5 내지 20 중량%로 함유하는 것이 바람직하여 상기와 같이 제조된 기능성 항산화 음료 조성물의 동물 실험과 인체 시식 실험을 통한 조직 내 항산화 활성을 측정한 결과 항산화 활성 효소와 인체 내 DNA 손상을 회복시키는 효능을 나타냈다.

이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예 및 실험예 들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 하기 실시예 및 실험예 들에서 특별히 부피%임을 명시하지 않은 %는 중량%를 나타낸다.

(실시예 1)

항산화 식물 추출물의 제조

본 실험에 사용한 식물 소재의 유효성분을 분석하기 위해서 20종의 식물인 신선초, 케일, 루이보스, 녹차, 홍차, 맥류약엽, 홍경천, 포도씨, 노니, 적와인, 로즈마리, 세이지, 솔잎, 인삼, 황금, 오미자, 구기자, 목단피, 감초 및 갈근을 열수 추출하였다. 즉, 총 20종의 식물 원료 10 g을 100 ml의 증류수에 침지하여 80℃에서 4시간 동안 역류(reflux) 하에서 추출한 다음 여과하여 추출액을 동결건조 하였고, 모든 시료는 항산화 실험 테스트를 위해 농도별로 10 mM KH₂PO₄/KOH 완충용액(pH 7.4)에 녹인 후 희석하여 사용하였다.

(실시예 2)

DPPH 라디칼 소거법에 의한 항산화 활성 측정

DPPH radical 소거활성은 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹여 농도별로 희석한 식물소재 또는 시제품 10 ㎕에 200 μM DPPH/EtOH 190 ㎕를 가한 후, 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정한다. 식물소재 또는 시제품 대신 DMSO를 가한 대조구에 대해 식물소재 또는 시제품을 넣었을 때의 흡광도의 감소 정도를 조사하여 DPPH radical을 50% 소거하는 시료의 농도를 IC₅₀으로 표시한다.

(실시예 3)

ABTS 라디칼 소거법에 의한 항산화 활성 측정

ABTS radical 소거활성은 2 mM ABTS (2,2'-Azino-bis-(3-ethy; benthiazoline-6-sulfonic acid), 15 μM H₂O₂ 그리고 0.25 ㎛ HRP를 함유한 50 mM Na-phosphate buffer(pH 7.5) 1 ㎖를 25℃에서 5분간 정치시킨 다음 730 nm에서 흡광도가 일정하게 유지되면 탈이온수에 용해시킨 식물소재 또는 시제품 10 ㎕를 가하고 5분 후에 730 nm에서 흡광도 감소를 측정한다.

(실시예 4)

Hydroxyl radical 소거법에 의한 항산화능 측정

Hydroxyl radical 측정법은 Fenton reaction에 의해 OH radical를 발생시켜 이에 대한 소거활성을 측정하였다. 2.8 mM deoxyribose, 25 μM FeCl₃, 100 μM EDTA, 2.8 mM H₂O₂를 포함한 10 mM KH₂PO₄/KOH buffer(pH7.4)에 일정농도의 식물소재 또는 시제품 100 ㎕를 가하고 잘 혼합하여 reaction volume이 1.2 ㎖가 되게 하였다. 이 때 deoxyribose를 넣기 전에 EDTA와 FeCl₃는 미리 잘 섞은 후에 첨가하였다. Reaction mixture의 ascorbate의 농도가 100 μM이 되도록 ascorbate를 첨가한 후 37℃에서 한 시간동안 200 rpm의 속도로 회전하는 shaking incubator에서 반응시킨 다음 1% TBA 1 ㎖와 2.8% TCA 1 ㎖를 가하여 OH 과의 반응에 의해 생성된 deoxyribose의 malondialdehyde(MDA)유사물질과의 반응을 위하여 80℃에서 20분간 가열시키고 상온으로 냉각시켰다. n-Butanol 3.2 ㎖를 가하여 30초간 강하게 흔들어서 잘 혼합한 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리시켜 반응에 의해 생성된 색소물질을 분리하였으며 색소물질을 함유한 위층 200 ㎕를 취하여 532 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

(실시예 5)

Hydrogen peroxide 소거법에 의한 항산화능 측정

2 mM의 H₂O₂를 함유한 phosphate buffered saline(pH 7.4) 600 ㎕에 일정농도의 식물소재 또는 시제품 300 ㎕를 가하고 5분 후에 230 nm에서 흡광도를 측정하였으며 control로 탈이온수를 사용하였을 때의 흡광도를 50% 감소시키는 식물소재 또는 시제품의 농도를 IC₅₀으로 표시하였다. H₂O₂의 농도는 H₂O ₂의 extinction coefficient를 81 M^-1Cm^-1로 하여 230 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.

(실시예 6)

기능성 항산화 음료 포뮬라(formular) 제조

항산화 활성이 입증된 식물 소재 추출물들을 이용하여 최적의 음료 formular를 설계하여 기능성 항산화 음료를 제조하였다.

(실시예 7)

DNA nicking assay에 의한 DNA손상 억제효과의 측정

pBR 322 DNA (2 ㎍/ml)를 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에 용해시킨 일정농도의 식물소재 또는 시제품과 잘 혼합한 다음 peroxyl radical과 hydroxyl radical을 발생시켜 DNA손상을 유도하였다. Peroxyl radical에 의한 손상을 유도하기 위하여 30 mM AAPH (2,2'-azobis(α-amidinopropane) dihydrochloride)를 첨가하여 5 mM의 AAPH농도에서 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. Hydroxyl radical에 의한 DNA손상을 유도하기 위하여 UV photolysis와 Fenton reaction 두 가지 방법을 사용하였다. UV photolysis에서는 5 mM의 농도로 H₂O₂를 첨가하고 10 W UV lamp를 사용하여 20 cm의 거리에서 10분간 UV를 조사하여 hydroxyl radical을 발생시켰다. Fenton reaction을 이용한 방법에서는 DNA와 식물소재 또는 시제품의 혼합물에 100 um EDTA과 10 uM FeCl₃이 되도록 EDTA + FeCl3 용액을 먼저 첨가한 다음 100 uM이 되도록 H₂O₂을 첨가하고 마지막에 ascorbicc acid를 10 um이 되게 첨가한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다.

식물소재 또는 시제품으로 처리된 pBR 322 DNA를 0.9% agarose gel상에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동 buffer로는 40 mM Tris와 2 mM EDTA를 함유한 Tris-acetate-EDTA buffer(pH 8.5)를 사용하였으며 horizontal submarine electrophoresis장치를 이용하여 100 V에서 1시간 10분 동안 전개하였으며 0.5 ㎍/ml 농도의 ethidium bromide로 60분간 염색시킨 다음 탈이온수로 30분간 탈색시키고 UV를 조사하면서 DNA band의 사진을 찍고 densitometer를 사용하여 DNA band를 scan하여 각 식물소재 또는 시제품의 처리에 따른 supercoil 형태의 DNA를 비교하여 DNA 손상에 대한 억제정도를 다음과 같이 계산하였다.

(실시예 8)

인체 임파구 세포배양 실험을 이용한 ex vivo DNA 손상 감소 효과 측정

인체 임파구 세포는 채혈 전 최소 8시간 이상은 음식물을 먹지 않은 건강한 대상자(비흡연자)로부터 약 5 ml의 혈액을 heparinated sterile tube에 받아 전혈 100㎕을 1 ml의 10% fetal bovine serum을 함유한 RPMI 1640에 섞은 후 Histopaque 1077을 이용해 임파구만을 분리하였다. 인체 임파구 세포에 식물소재 또는 시제품을 동결건조한 후 PBS에 용해하여 10-1000 ㎍/㎕ 사이의 농도로 cell에 처리하여 냉장고(30분, 4℃)에서 반응시키고 반응이 끝난 임파구 세포에 oxidative stress(100 μM H₂O₂)를 4℃에서 5분 동안 가한 뒤 oxidative stress에 의한 DNA 손상을 유발시킨 후 comet assay를 실시하였다.

처리 과정을 마친 lymphocytes 20 ㎕을 채취하여 75 ㎕의 0.7% low melting agarose gel(LMA)과 섞은 후, 0.5% normal melting agarose (NMA)가 precoating된 fully frosted slide 위로 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 cover glass로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. Gel이 굳으면 Cover glass를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75 ㎕로 한 겹 더 덮어 주었다. 미리 준비해 둔 차가운 alkali lysis buffer (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM tris)에 사용직전에 1% Triton X-100을 섞은 후 slide를 담가 저온으로 유지되는 암실에서 1시간 동안 침지 시켜 DNA의 double strand를 풀어주었다. Lysis가 끝난 slide를 electrophoresis tank에 배열하고 4℃의 차가운 buffer (300 mM NaOH, 1 mM Na₂EDTA)를 채워 unwinding시키고 40분이 지나면 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.4 M Tris 완충용액(pH 7.4)으로 충분히 세척하고 20 ㎍/㎖ 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 형광현미경상에서 관찰하고 CCD camera 를 통해 보내진 각각의 세포핵 image는 comet image analyzing system이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 임파구 세포의 H₂O₂에 의한 DNA 손상 및 식물소재 또는 시제품에 의한 손상억제정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리 (tail length) 또는 tail length에 tail 내 함유된 DNA%를 곱해준 tail moment를 구하였으며 각각의 처리구에서 2개의 slide를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.

(실시예 9)

In vivo 동물 실험에 의한 항산화 음료 시제품(그린포셀^®)의 효능 검증

실험동물은 6주령의 ICR계열의 mouse를 (주)대한바이오링크로부터 분양받아 사용하였고, 1주간의 실험실에서 적응기간을 가지도록 하였다. 사료는 삼양사의 고형사료를 공급하였고 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험시행 전날로부터 24시간 동안 절식시켰다.

실험 동물은 난괴법(randomized complete block design)으로 분류하여 스트레스를 받지 않고 시제품을 섭취하지 않은 일반군(normal group), 스트레스를 받고 시제품을 섭취하지 않은 대조군(control group)과 스트레스를 받고 시제품을 섭취한 실험군(시제품 group)의 3군으로 나누었다.

스트레스 원으로는 고정화 스트레스(immobilization stress)를 사용하였다. 고정화 스트레스는 심리적 스트레스를 유발하는 것으로 원통안에 고정된 직립상태로 서있게 하는 방법이다. 본 실험에 들어가기 전에 스트레스군이 스트레스에 적응 할 수 있도록 1주일 동안 스트레스 적응기를 두었는데 일주일동안 5분부터 시작하여 매일 10분씩 늘려가는 방법을 택하였다. 실험 기간 동안 매일 오후 3시부터 4시까지 한시간씩 4주 동안 스트레스군에게 스트레스를 가하였다.

모든 실험군의 물과 시제품은 오후 12시에 공급하였는데 실험식이를 섭취하는 군에게는 물에 시제품을 150 mg/kg mouse으로 녹여서 함께 공급하였다. 실험동물이 섭취하는 물의 양은 실험실 적응기간동안 그 섭취량을 조사하여 물이 약 10 ml 남을 정도로 공급하였고 실험동물이 성장하는 것을 맞추어주기 위해 매주 섭취하는 물의 양을 조절하였다.

실험동물은 실험 전 24시간동안 절식시켰고 ether로 마취 후 개복하여 심장으로부터 전혈을 채취하였고 여기에 1 unit/mL blood 농도의 heparin을 첨가하여 분석시까지 혈액의 응고를 방지하였다. 혈액의 분석은 채혈 후 24시간 내에 실시하였다. 전혈 중 일부를 취하여 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 적혈구를 분리한 뒤, 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 3회 washing한 후 증류수를 가하여 세포를 파쇄하여 적혈구 시료로 사용하였으며 이를 이용하여 항산화 활성에 직접적으로 관여하는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase, SOD) 활성 및 카탈레이즈(catalase)활성을 측정하였다.

(실시예 10)

흡연자 대상 인체 섭취실험을 통한 항산화 음료 시제품(그린포셀^®)의 in vivo DNA 손상 감소 효과(Comet assay) 측정

본 연구의 대상자는 유해환경이나 유전질환에 노출된 적이 없으며 비타민 영양제를 복용하고 있지 않고 다른 질환이 없는 23-60세 사이의 건강한 성인 남자로 선정하였다. 연구대상자를 흡연상태에 따라 흡연력 3년 이상인 흡연군 19명, 담배를 피우지 않는 비흡연군 20명의 두 군으로 나누었다. 설문지를 통하여 연구대상자의 일반 인구 특성과 건강상태 및 생활습관(흡연, 음주, 운동 등)을 조사하였으며, 연구대상자들에게 항산화 시제품 음료를 매회 120 ml 씩 하루 두 번에 걸쳐 240 ml씩 8주 동안 매일 섭취하도록 지도하였다. 항산화 시제품 음료 섭취 실험에 앞서 2주동안 과일과 채소가 많이 함유된 식품을 제한하는 고갈식이를 섭취하도록 하였으며 항산화 시제품 음료를 섭취하는 기간 동안 동일한 식사습관을 유지하도록 지도하였다. 항산화 시제품 음료 섭취실험 전에 24시간 회상법에 의한 식이섭취 조사, 신체계측조사(신장, 체중, BMI, WHR 및 체지방량 등) 및 1차 채혈(0주)을 실시하였고, 8주간 투여 후에 같은 방법으로 식이섭취 조사, 신체계측조사 및 2차 채혈(8주)을 실시하였다.

총 39명의 대상자로부터 본인의 동의를 얻어 채혈을 하였다. 대상자들은 채혈하기 전 8시간 이상 음식물을 먹지 않도록 지도하였으며 대상자들의 혈액은 아침식사 전에 채혈하였다. 200∼300 ㎕의 전혈을 heparinated sterile tube에 받아 2시간 이내에 lymphocytes를 분리한 뒤 위에 서술한 방법으로 Comet assay를 실행하였다. 1차와 2차에 걸쳐 채혈한 혈액 임파구의 DNA 손상 정도를 분석하여 섭취 전후를 비교함으로써 최종 시제품의 인체 섭취실험을 통한 in vivo DNA 손상 감소유무를 확인하였다.

(실험예 1)

식물 추출물의 항산화 활성

항산화 소재 검색에 이용된 총 20종의 식물 소재들의 항산화 활성을 다중 활성 검증법에 의해 탐색하였다. 즉 식물 소재 추출물들에 대한 항산화 활성을 DPPH법, ABTS법, OH radical 소거법, hydrogen peroxide 소거법, DNA nicking assay 및 DNA Comet assay 등의 방법으로 측정하여 식물 소재 추출물들에 대한 항산화 활성을 검증 하였다. 그 결과 하기 표 1에 나타난 바와 같이 총 20종의 식물 추출물 중에서 6가지 활성 측정법에 대해서 높은 항산화 활성을 보인 신선초 추출물, 케일 추출물, 루이보스 추출물, 녹차 추출물, 노니 추출물, 맥류약엽 추출물, 홍경천 추출물, 솔잎 추출물, 포도씨 추출물, 적와인 추출물의 10종을 일차로 선발하였으나 원료의 사용에 있어서 경제적인 문제와 식품 공전에 등재 되어 있지 않는 등의 사용이 부적합한 식물 원료를 제외하고 최종 신선초 추출물, 케일 추출물, 루이보스 추출물, 녹차 추출물, 노니 추출물 및 적와인 추출물의 6종을 선발함으로서 기능성 항산화 음료 조성물을 제조하기 위한 식물 추출물로 최종 선발하였다.

[표 1]

(실험예 2)

최종 항산화 식물 추출물의 확보 및 항산화 음료 포뮬라(formular) 제조

기능성 항산화 음료 제조를 위한 소재를 탐색한 결과 DNA 손상과 밀접한 관련이 있는 하이드록실 라디칼 소거법과 하이드로겐 퍼옥사이드 소거법에서 우수한 활성을 보였던 소재를 중심으로 신선초 추출물, 케일 추출물, 노니 추출물, 루이보 스 추출물, 적와인 추출물, 녹차 추출물 및 관능을 고려한 단풍나무 수액을 최적의 배합비로 혼합하여 항산화 활성이 높은 하기 표 2와 같은 기능성 항산화 음료 조성물(그린포셀^®, Green for Cell)을 제조하였다.

[표 2]

상기 표 2과 같이 제조된 기능성 항산화 음료 조성물은 노화에 관심도가 높은 40-60대 성인을 위해 항산화 효과를 높인 기능성 추출음료라는 컨셉을 가지고 현재 항산화 소재 식품의 세계 규모가 약 2조원에 달하며 국내 시장도 1,000억원을 형성하고 있는 시점에서 경쟁력 있는 기능성 항산화 음료로 자리 잡을 수 있을 것으로 생각되며 항산화 음료에 국한되지 않고 노화, 간기능 개선 및 스트레스 해소 음료로의 확대가 가능할 것이다.

(실험예 3)

시제품(그린포셀)의 항산화 활성

시제품에 대한 항산화 활성을 OH radical 소거법 및 hydrogen peroxide 소거법의 방법으로 검증하였으며 비교군으로 폴리페놀 화합물과 활성을 비교하였다.

OH radical 소거법은 도 1에서 보는 바와 같이 폴리페놀 화합물과 활성 차이가 뚜렷이 나타나는 경향을 보였고, 0.1%의 농도에서 50% 이상의 라디칼 소거활성을 나타낸 반면 폴리페놀 화합물은 50% 이하의 낮은 소거활성을 보였다. Hydrogen peroxide radical 소거 활성은 도 2에서 보는 바와 같이 OH radical 소거법에 비해 활성을 나타내는 농도가 전반적으로 다소 낮았으나 폴리페놀 화합물과의 활성 차이는 OH radical 소거법에서와 마찬가지로 폴리페놀 화합물보다 높은 활성을 보였다.
비교군으로 사용한 폴리페놀 화합물(Sunphenon 100S)은 일본의 태양화학주식회사 제품으로 폴리페놀 화합물을 80% 이상 함유하고 있고, 다양한 생리활성에 관한 선행 연구들이 있으며, 음료 제품 및 건강기능성 식품으로 상용화 되고 있는 대표적인 항산화 활성 지표물질이다.

(실험예 4)

시제품의 in vitro 및 세포 배양 실험(ex vivo test)을 이용한 DNA 손상 감소 효과

Peroxyl radical에 의한 DNA 손상을 유도하여 이에 대한 시제품의 보호효과를 측정한 결과 도 3에 나타난 바와 같이 AAPH로서 산화를 유도하면 대부분의 supercoiled DNA는 nicking이 일어나 supercoiling이 풀려 circular한 형태로 변화하였으며 AAPH처리 전에 시제품을 농도별로 첨가하였을 때 DNA손상에 대한 높은 억제효과를 보여주었다. 도 3에서 [가]는 DNA 손상 억제 효과를 나타내는 젤(gel) 사 진이고, [나]는 DNA 손상 억제 %를 나타낸다.

또한 DNA Comet assay법에 의한 항산화 음료 시제품의 DNA 손상 억제 효과를 조사한 결과 도 4에서 보는 바와 같이 H₂O₂만 처리한 positive control에 비해 human lymphocyte cell에 대한 산화적 DNA 손상 정도는 시제품의 처리 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 감소하여, 산화적 DNA 손상의 감소 효과를 관찰할 수 있었다. 또 100 ㎍/㎖의 저농도에서 시제품의 DNA 손상 감소효과를 비교해 본 결과 약 78%의 손상 감소 효과를 보였다.

(실험예 5)

동물 실험에 의한 시제품의 in vivo 항산화 효소 활성

항산화 효소 활성의 측정은 superoxide dismutase(SOD) 활성과 catalase 활성으로 측정하였다. Superoxide dismutase(SOD)의 효소 활성 정도를 측정한 결과 도 5에서 보는 바와 같이 시제품 섭취군은 일반 대조군 보다 높거나 비슷한 활성을 나타내었다. 이는 과산화물의 축적에 따른 산화적 손상이 SOD 활성 증가 한계 범위를 넘어서 계속적인 활성산소 발생에 따른 효소 유도능의 저하 또는 효소 단백질의 파괴를 일으켰기 때문으로 생각된다. 스트레스군 내에서 비교해 봤을 때 대조군보다 시료 섭취 군이 활성이 높은 것을 볼 수 있는데 이는 항산화 제품의 섭취가 SOD 활성을 높일 수 있다는 결과로 판단된다.

또한 Catalase의 효소 활성 정도를 측정한 결과 도 6에서 보는 바와 같이 시제품 섭취군은 대조군보다 유의적으로 활성이 높게 나타났으며 이는 시제품이 catalase 활성을 유지하는데 영향을 주기 때문인 것으로 생각된다.

(실험예 6)

인체 섭취실험을 통한 시제품의 in vivo DNA 손상 감소효과 (Comet assay)

시제품에 대한 인체 섭취실험 전과 후의 신체계측 결과와 식이섭취조사 결과는 표 4, 5, 6과 같다. 흡연군과 비흡연군 모두 시제품 섭취 전과 후의 신체계측치, 항산화 영양소 섭취량 및 플라보노이드 섭취량에 유의적인 차이가 없었다. 식품섭취 빈도조사표(FFQ)를 이용하여 계산한 플라보노이드 섭취량을 보면, 흡연군의 플라보노이드 섭취량이 비흡연군에 비해 대체로 낮은 경향을 보였으나 통계적으로 유의적인 차이는 아니었으며, 두 군 모두 시제품 섭취 전후의 차이는 보이지 않았다.

[표 4]

[표 5]

[표 6]

시제품 섭취 후 체내 임파구 DNA 손상 정도는 DNA 파편이 핵으로부터 이동한 거리인 tail length(TL), % DNA in tail, 그리고 TL과 % DNA in tail을 곱한 값인 tail moment(TM) 등 3 가지 분석 지표로 살펴보았으며 그 결과를 도 7, 8 및 9에 각각 나타내었다.

도 7, 8 및 9의 결과에서 보는 바와 같이 시제품 섭취 전의 baseline에서 선행연구 결과와 마찬가지로 흡연자의 TL값은 비흡연자보다 유의적으로 손상된 것으로 나타났으며, 8주간의 시제품 섭취를 통해 대상자들의 DNA 손상이 통계적으로 유의하게 감소되는 것을 볼 수 있었다. 먼저 비흡연자의 TL 값은 섭취 전 63.1±1.1에서 섭취 후 37.9±0.8로 40% 감소하였고, percent DNA in tail은 섭취전 19.7±0.4에서 섭취 후 16.6±0.4로 16% 감소하였으며, TM 값은 섭취 전 14.6±0.6에서 섭취 후 6.6±0.3으로 55% 감소하였다. 이에 비해 흡연자의 DNA 손상 감소효과는 비흡연자에 비해 비슷하거나 혹은 더욱 큰 것으로 나타났다. 흡연자의 TL 값은 섭취 전 66.7±1.2에서 섭취 후 36.5±1.1로 55%감소하였고, percent DNA in tail은 섭취 전 20.6±0.3에서 섭취 후 17.1±0.5로 17% 감소하였으며, TM 값은 섭취 전 15.4±0.5에서 섭취 후 6.7±0.4로 56% 감소하였다. 위 결과들을 종합해 보면, 시제품의 장기간(8주) 섭취는 임파구 DNA 손상정도를 감소시키는데 매우 효과적이었으며, 그 효과는 흡연자와 비흡연자 모두에서 나타났다. 따라서 본 연구결과 개발된 시제품은 흡연으로 인해 증가된 산화성 DNA 손상에 의한 암의 발생을 지연시킬 수 있는 체내 항산화 체계의 보호효과가 탁월한 것으로 검증되었다.

상기와 같이 본 발명의 기능성 항산화 음료 조성물은 기존에 DPPH와 같은 단순한 항산화 실험법에만 국한되어 효능을 검증하던 방법을 개선하여 인체 내 항산화 활성을 측정할 수 있는 지표로서 흡연자에 의한 DNA 손상을 조사하여 분자 레벨 에서 조직 내 항산화 활성을 측정하는 방법을 이용하였고, 기본적인 항산화 활성 측정 방법으로서 DNA 손상과 밀접한 관련이 있는 하이드록실 라디칼 소거법과 하이드로겐 퍼옥사이드 라디칼 소거법을 집중적으로 활용하였다. 또한 기능성 항산화 음료 조성물에 대한 동물 실험과 인체 시식실험을 실시하고 유사 제품과의 활성을 비교함으로서 고기능성 항산화 음료 조성물을 제공할 수 있다.

따라서 본 발명의 기능성 항산화 음료 조성물은 각종 스트레스와 공해, 흡연 등의 외부 요인에 의해 산화적 스트레스에 노출되어 있는 현대인들에게 효과적인 항산화 영양소를 공급할 수 있는 기능성 음료로 제공될 수 있다.

Claims

삭제
폴리페놀화합물(Sunphenon 100S, 폴리페놀 80%이상 함유) 대비 항산화 활성 능력이 30% 이상 초과 향상된 것을 특징으로 하는 신선초 추출물 32중량%, 케일 추출물 32중량%, 노니 추출물 20중량%, 루이보스 추출물 3중량%, 적와인 추출물 1.5중량%, 녹차 추출물 1.5중량% 및 단풍나무수액 10중량%를 함유한 항산화 활성 음료 조성물
삭제