KR20220094233A - 마리골드 추출물에 모유 유산균으로 생물전환 시킨 성분을 함유하는 항균, 항산화 및 항염증 활성을 갖는 조성물 - Google Patents

마리골드 추출물에 모유 유산균으로 생물전환 시킨 성분을 함유하는 항균, 항산화 및 항염증 활성을 갖는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마리골드 추출물에 모유 유산균으로 생물전환 시킨 성분을 함유하는 항균, 항산화 및 항염증 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물은 항산화, 항염증 및 항균 효능이 현저히 우수한 효과가 있다.

Description

마리골드 추출물에 모유 유산균으로 생물전환 시킨 성분을 함유하는 항균, 항산화 및 항염증 활성을 갖는 조성물{Composition with antibacterial, antioxidant, and anti-inflammatory activity containing ingredients converted to kimchi lactic acid bacteria and breast lactic acid bacteria in marigold extract}
본 발명은 마리골드(Tagetes erscta) 추출물에 모유 유산균으로 생물전환 시킨 성분을 함유하는 항균, 항산화 및 항염증 활성을 갖는 조성물에 관한 것이다.
인체의 대사과정 중 생성되는 활성 산소종은 체내의 세포막, 단백질 및 DNA 등의 손상을 일으켜 노화와 질병의 원인이 되기도 한다. 자유라디칼 및 다른 반응성 산소종 (ROS)은 살아있는 유기체의 산화 진행 중에 부산물로써 생성 될 수 있다 (Halliwell & Gutteridge, 1999). 반응 산소종(ROS)은 정상적인 신진대사에 많은 중요한 기능을 하지만, 과도한 ROS는 단백질의 기능을 손상, 세포 거대 분자에 산화 손상을 가져오고, trigger cell의 사망을 일으킬 수 있다 (Kremer et al. 2012). 산화 스트레스의 장기간 상태는 심혈과 질환과 암 등 여러 질병의 발병에 관여한다 (Sun et al. 2004). DNA, 단백질 및 기타 거대 분자에 대한 산화 손상은 나아가 노화로 이어지는 내적 손상의 주요 유형을 구성한다고 가정되어지고 있다 (Fraga et al. 1990). 따라서 항산화 물질을 섭취하여 건강 한 삶을 누리고자 하는 데에 관심이 높아지면서 인체에 무해 한 천연 항산화제에 대한 관심과 수요가 증가하고 있어 천연 물 유래의 다양한 항산화제의 탐색이 진행되고 있다(Choi et al., 2005).
염증은 인체의 대식세포(macrophage)가 외부의 자극이나 침입한 병원체에 반응하여 염증유발인자인 TNF-α, interleukin1-β(IL-1β) 및 IL-6와 같은 cytokine을 생성하고 또한 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)를 합성하여 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2(PGE2)를 생성한다. 이러한 과정을 거쳐 생성된 NO는 종양과 세균을 제거하는 등 의 역할을 수행하지만, NO가 체내에 과도하게 생성되면 조직의 손상, 유전자의 변이 및 혈관의 투과성을 증가시켜 부종 등 의 염증반응을 일으켜 인체에 피해를 주게 된다(Moncada et al., 1991; Choi et. al., 1993). 이로 인해 항염증 물질에 대한 관심이 높아지고 있다.
유산균이란 유기산 (organic acid)의 한 종류인 젖산 (lactaticacid)을 생산하는 미생물로 사람의 체내뿐만 아니라 동물과 식물에 널리 분포하고 있다. 고대 식생활에서 유산균은 발효식품의 발효종으로써 식품의 맛과 향기를 증진시키는 목적으로 많이 이용되어 왔다. 미생물의 리보솜 (ribosome)에서 생합성되는 박테리오신은 주로 단백질(peptide 또는 protein)로 이루어져 있으며, 식중독 세균으로 알려진 Bacillus cereus 균을 포함한 병원성 세균의 세포 표면에 부착하여 세포벽 합성을 저해하거나 단백질 합성을 억제하여 결국 세균 세포를 사멸시키는 역할을 한다 (Jack, R. W.(1995) Bacteriocins of grampositive bacteria. Microbiol). 이러한 특성을 지닌 박테리오신은 천연물질이며 단백질로 이루어져있기 때문에 인체에 무해하다는 가장 큰 장점을 가지고 있다. 그리고 유전자 조작 및 배양조건의 최적화 등의 산업화 과정을 거쳐 원활한 균주 배양과 대량 생산으로 더 많은 항균물질을 생산할 수 있다.
연구의 재료인 마리골드(Tagetes erscta)는 국내에서 금잔화로 명명되는 국화과의 한해살이풀로 남유럽이 원산지이다. 금잔화는 주성분인 사포닌(saponins)에 의한 부종에 의해 원인이 되는 염증성 질환에 효과가 있으며 항균효과가 있다고 알려져 있다. 최근 들어 곰팡이, 효모, 유산균 및 버섯류와 같은 유익한 미생물을 활용한 발효기술로 원료의 생리활성을 높이는 연구가 이루어지고 있다.
과학기술의 발달과 함께 미생물 또한 많은 연구와 발전이 이뤄졌으며, 그 중 유산균은 저분자 항균물질로 알려진 박테리오신 (Bacteriocin)을 생산하는 것으로 알려져 있다. 유산균에 의한 발효는 식품에 다양한 풍미와 조직감을 부여하고, 영양 및 기능성 성분의 생성으로 식품의 가치를 증가시킬 뿐 아니라, 항균성 물질의 생합성으로 저장성을 향상시키는 오래된 식품 가공법이다.
김치 유산균(Lactobacillus plantarum) 균주는 plantaricin이라는 이름의 박테리오신을 생산하는 유산균으로 잘 알려져 있다. 모유 유산균(Lactobacillus gasseri)은 인간의 위 장관에 매우 풍부하게 존재한다고 알려져 있다. 일부 선행연구들에 따르면 L. gasseri의 발효 생성물은 면역 조절, 항균 및 항 고혈압제에 효능이 있다고 알려져 있으나, 우유 내에서는 L. gasseri의 생육 활성이 좋지 않은 것으로 보고되어진다.
이와 같이 다방면의 생리, 화학적 기능이 보고를 바탕으로 모유 유산균과 김치 유산균을 활용하여 각각의 마리골드 추출물 생물전환물을 제조하였고 페놀 및 플라보노이드 함량을 평가하였으며, 다양한 항산화, 및 항균 효능을 비교 분석하여 검토하였다.
등록특허공보 10-2035261호
본 발명의 목적은 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는 항상화 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.
상기 모유 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 항산화 조성물은 건강식품, 화장료 또는 약학적 원료로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.
상기 모유 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 항염증 조성물은 건강식품, 화장료 또는 약학적 원료로서 사용할 수 있다.
나아가, 본 발명은 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
상기 모유 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 항균 조성물은 건강식품, 화장료 또는 약학적 원료로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물은 항산화, 항염증 및 항균 효능이 현저히 우수한 효과가 있다.
도 1은 마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1), 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 및 아스코르브산(AA, 양성대조군) 각각의 환원력을 평가한 그래프이다.
도 2는 마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1) 및 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 처리에 따른, 초나선형 DNA의 산화적 손상에 의해 선형 DNA로의 전환 정도를 정량평가한 결과이다.(C: Control, NC:과산화수소 처리군, 0.25 ~ 1 mg/mL: 과산화수소와 시료 동시 처리군)
도 3은 마리골드 추출물(제조예 1)과 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 처리 농도에 따른 S. aureus 및 E. coli에 대한 항균활성을 디스크 확산법으로 확인한 이미지이다.
건강식품 및 건강기능성식품 조성물
식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 유효물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 및 건강기능성식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효물질의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 및 건강기능성식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 유효물질을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능성 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
화장료 조성물
본 발명은 유효물질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 유효물질에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 유효물질을 함유하는 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 유효물질이 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 유효물질을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 유효물질은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 유효물질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 유효물질의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 마리골드( Tagetes erscta ) 추출물의 제조
씨케이㈜에서 구입한 마리골드(Tagetes erscta) 원물 100g을 70% EtoH에 추출한 후 추출물을 필터링하였다. 이후 마리골드 추출물을 감압 농축기를 사용하여 50℃에서 감압 농축한 마리골드 농축액을 제조하였다.
<제조예 2> 모유 유산균 추출물의 제조
생물자원센터 KCTC에서 모유 유산균 KCTC 3144 (Lactobacillus gasseri)를 분양받아 MRS Agar배지에 도말하여 37℃에서 24시간을 키운 후 콜로니를 따 생장곡선을 확인하고 MRS배지에서 균을 키웠다. 충분히 자란 모유 유산균을 원심분리기에 1400rpm, 4℃에서 20분간 돌려 상층액만을 취하여 0.45 μL 필터로 필터링 한 것을 동결건조 함으로서 Lactobacillus gasseri 균주 추출물을 제조하였다.
<실시예 1> 모유 유산균으로 생물 전환한 마리골드 추출물의 제조
씨케이㈜에서 구입한 마리골드 원물 100g을 70% EtOH 12L로 3번 나누어 추출한 후 추출물을 필터링하였다. 이후 마리골드 추출물을 감압 농축기를 사용하여 50℃에서 감압 농축한 마리골드 농축액에, Difco Lactobacillus MRS Broth 250mL, Agr 배지에서 37℃의 인큐베이터에 24시간 동안 배양한 모유 유산균으로서 KCTC 3144 (Lactobacillus gasseri) 균주를 마리골드 농축물 500mL의 2％(v/v) 만큼 접종하고 24시간 동안 인큐베이터에 배양하여 마리골드 모유 유산균 생물전환 결과물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
<비교예 1> 김치 유산균으로 생물 전환한 마리골드 추출물의 제조
씨케이㈜에서 구입한 마리골드 원물 100g을 70% EtOH 12L로 3번 나누어 추출한 후 추출물을 필터링하였다. 이후 마리골드 추출물을 감압 농축기를 사용하여 50℃에서 감압 농축한 마리골드 농축액에, Difco Lactobacillus MRS Broth 250mL, Agr 배지에서 37℃의 인큐베이터에 24시간 동안 배양한 김치 유산균으로서 KCCM 12116 (Lactobacillus plantarum) 균주를 마리골드 농축물 500mL의 2％(v/v) 만큼 접종하고 24시간 동안 인큐베이터에 배양하여 마리골드 김치 유산균 생물전환 결과물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
<실험예 1> 항산화 평가
<실험예 1-1> 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 평가
마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1), 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1), Lactobacillus gasseri 추출물(제조예 2) 각각의 플라보노이드 및 폴리페놀 함량을 평가하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시료 플라보노이드 함량
(μg/ CE mg)		 폴리페놀 함량
(μg/ GAE mg)
마리골드 추출물(제조예 1) 175.21 ± 6.14 173.46 ± 1.83
김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1) 186.43 ± 5.11 175.29 ± 0.80
모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 210.54 ± 5.28 234.87 ± 3.25
모유 유산균 추출물(제조예 2) 12.84 ± 0.06 128.21 ± 3.54
표 1에 나타난 바와 같이, 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1)의 플라보노이드 및 폴리페놀 함량이 마리골드 단독 추출물(제조예 1), 모유 유산균 단독 추출물(제조예 2) 및 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1) 대비 현저히 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
<실험예 1-2> 환원력(Reducing power) 평가
마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1), 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 및 아스코르브산(AA, 양성대조군) 각각의 환원력을 평가하였다.
구체적으로, 0.25-4 mg/mL 농도의 시료 또는 표준 시약 1 ㎖와 1 ㎖의 Sodium Phosphate buffer(PBS)와 1% Potassium Ferricyanide를 2.5 ㎖를 각각 혼합 시킨 후 50℃에서 20분 동안 정치한 다음 반응이 끝난 혼합물을 각각 5 ㎖L씩 따서 새 tube로 옮긴 뒤 Trichloroacetic acid(TCA) 2.5 ㎖를 첨가하여 centrifuge에서 3,000rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 상층액 5 ㎖에 DW 5 ㎖와 Ferric chloride 1 ㎖를 첨가한 후 96well plate에 0.15 ㎖씩 분주 해준 뒤 ELISA reader를 이용해 700nm로 흡광도를 측정한다. 흡광도 값이 0.5(EC50)되는 각 샘플의 효과적인 농도를 평가하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1), 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 및 아스코르브산(AA, 양성대조군) 각각의 환원력을 평가한 그래프이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1)의 환원력이 마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1) 대비 현저히 향상됨을 확인할 수 있었다.
<실험예 1-3> 산화적 DNA 손상 예방 효능 평가
과산화수소(H2O2)에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 예방은 Tian &Hua (2005)의 실험방법을 약간 수정하여 실시하였다. 플라스미드 PBR 322 DNA (0.5 μg/μL) 1 μL은 FeSO4의 3 μL (0.08 ㎜), 30 % H2O2 4 μL (v / v)의 3 μL 증류수와 0.25, 0.5 및 1 mg/mL 농도의 추출물 2 μL의 혼합물을 1시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 그 후 6X DNA loading dye 2 μL가 첨가되었다. 실온에서 70V의 0.8% agarose gel electrophoresis에 반응시켰다. DNA 밴드 (supercoiled, linear and open circular)는 ethidium bromide로 염색시켰고, Gel documentation system (Nextep, Korea)을 통해 gels scanned을 실시하였으며, 밴드의 정량은 NEXTEP analysis software을 사용하였다. DNA 산화를 억제하는 효과는 control 값을 기준으로 한 supercoiled monomer의 증가와 감소로 평가하였다.
도 2는 마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1) 및 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 처리에 따른, 초나선형 DNA의 산화적 손상에 의해 선형 DNA로의 전환 정도를 정량평가한 결과이다.(C: Control, NC:과산화수소 처리군, 0.25 ~ 1 mg/mL: 과산화수소와 시료 동시 처리군)
도 2에 나타난 바와 같이, 마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1) 및 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1)은 모두 초나선형 DNA가 산화적 손상에 의해 선형 DNA로 전환되는 것을 억제하는 효능이 있는 것으로 확인되었다. 특히, 실시예 1이 제조예 1 및 비교예 1 대비 산화적 DNA 손상을 보호하는 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> NO(Nitric oxide) 생성 억제능을 통한 항염증 평가
NO(Nitric oxide)는 cytokine의 자극 또는 미생물 침입으로 인해 세포가 활성되는 것으로서 NO 합성효소에 의하여 L-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체이다. RAW264.7 대식세포에 LPS 자극에 의해 많은 양의 NO를 형성하며 이에 의한 세포 독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
항염증 효능을 평가하기 위해, 마리골드 추출물(제조예 1), 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1), 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 및 모유 유산균 추출물(제조예 2)의 NO 생성 억제능을 각각 처리농도별로 평가하였다.
구체적으로, RAW264.7 대식세포를 1×106 cells/well로 6 well plate에 seeding하고, 18시간 후에 각각의 시료를 0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/mL 처리한 다음, LPS(100 ng/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후에 세포배양액 150 μL와 Griess시약 150 μL를 혼합하여 37℃에서 10분 동안 incubator에서 반응시킨 후 ELISA reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrate로 표준곡선을 작성하여 NO의 함량을 산출하였다.
NO 생성량 (μM)
시료 처리농도(mg/mL)
0.25 0.5 1 2 4
Control 18.2 - - - - -
LPS 100 - - - - -
실시예 1 - 87 80 70 58 43
비교예 1 - 92 89 83 74 62
제조예 1 - 96 92 88 81 71
제조예 2 - 97 95 90 83 74
표 2에 나타난 바와 같이,모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1)의 NO 생성량이 마리골드 단독 추출물(제조예 1), 모유 유산균 단독 추출물(제조예 2) 및 김치 유산균 생물전환 마리골드 추출물(비교예 1) 대비 현저히 낮게 나타나, 항염증 효능이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 항균 효능 평가
마리골드 추출물(제조예 1) 및 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1)의 향균 효과를 알아보기 위하여, 디스크 확산법을 실시하였다.
구체적으로, S. aureus 및 E. coli를 각각 평판 배지에 미리 접종한 다음, 동그라미 모양 여과지를 제조예 1 및 실시예 1의 농도별 추출물(10, 25, 50, 100, 200 mg/mL)에 각각 담군 후 꺼내서 평판 배지에 올려놓는다. 배양 후 항균 물질이 들어있는 디스크 주변에는 미생물이 자라지 않는 생장저해 지대가 원형으로 나타나는데 이원이 얼마나 큰가를 항균물질의 효과 정도로 평가한다.
도 3은 마리골드 추출물(제조예 1)과 모유 유산균 생물전환 마리골드 추출물(실시예 1) 처리 농도에 따른 S. aureus 및 E. coli에 대한 항균활성을 디스크 확산법으로 확인한 이미지이다.
도 3에 나타난 바와 같이, E.coli의 경우 제조예 1 및 실시예 1에서 유사한 항균 효과가 관찰되었고, S. aureus의 경우 제조예 1 대비 실시예 1의 항균 효능이 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다.
건강식품의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<건강식품 제조예 1> 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 유효물질 0.01-1 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<건강식품 제조예 2> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 유효물질을 진공 농축기에서 감압농축하고 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 유효물질의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 34 중량부, 율무 19 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
유효물질 (2 중량부),
영지(1.5 중량부), 및
지황(1.5 중량부).
건강기능식품의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강기능식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강기능식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<건강기능식품 제조예 1> 건강기능식품의 제조
유효물질 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<건강기능식품 제조예 2> 건강 기능 음료의 제조
유효물질 100 mg
구연산 100 mg
올리고당 100 mg
매실농축액 2 mg
타우린 100 mg
정제수를 가하여 전체 500 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
화장료의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 화장료로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 화장료의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<화장료 제조예 1> 유연 화장수의 제조
유효물질 10.0 중량부
1,3-부틸렌글리콜 1.00 중량부
디소듐이디티에이 0.05 중량부
알란토인 0.10 중량부
디포타슘글리시리제이트 0.05 중량부
시트르산 0.01 중량부
소듐시트레이트 0.02 중량부
글리세레스-26 1.00 중량부
알부틴 2.00 중량부
하이드로제네이티드캐스터오일 1.00 중량부
에탄올 30.0 중량부
보존제 미량
착색제 미량
착향제 미량
정제수 잔량
<화장료 제조예 2> 영양 크림의 제조
유효물질 10.0 중량부
1,3-부틸렌글리콜 7.00 중량부
글리세린 1.00 중량부
D-판테놀 0.10 중량부
식물 추출물 3.20 중량부
마그네슘알루미늄실리케이트 0.30 중량부
PEG-40 스테아레이트 1.20 중량부
스테아르산 2.00 중량부
폴리소르베이트 60 1.50 중량부
친유형글리세릴스테아레이트 2.00 중량부
소르비탄세스퀴올리에이트 1.50 중량부
세테아릴알코올 3.00 중량부
미네랄오일 4.00 중량부
스쿠알란 3.80 중량부
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.80 중량부
식물성오일 1.80 중량부
디메치콘 0.40 중량부
디포슘글리시리제이트 미량
알란토인 미량
소듐 히아루로네이트 미량
토코페릴아세테이트 적량
트리에탄올아민 적량
보존제 적량
착향제 적량
정제수 잔량
약제의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<약제 제조예 1> 산제의 제조
유효물질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<약제 제조예 2> 정제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<약제 제조예 3> 캡슐제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<약제 제조예 4> 주사제의 제조
유효물질 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 유효물질을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<약제 제조예 5> 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조
유효물질 1.0 g
아세트산나트륨 0.3 g
메틸파라벤 0.1 g
프로필파라벤 0.02 g
염화나트륨 적량
HCl 또는 NaOH pH 조정 적량
정제수 적량
통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 mL당 유효물질 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.
<약제 제조예 6> 액제의 제조
유효물질 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는, 항산화 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 모유 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)인 것을 특징으로 하는, 항산화 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항산화 조성물은 건강식품, 화장료 또는 약학적 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는, 항산화 조성물.
  4. 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는, 항염증 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 모유 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)인 것을 특징으로 하는, 항염증 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 항염증 조성물은 건강식품, 화장료 또는 약학적 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는, 항염증 조성물.
  7. 마리골드(Tagetes erscta) 추출물의 모유 유산균 배양 추출물을 포함하는, 항균 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 모유 유산균은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)인 것을 특징으로 하는, 항균 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 항균 조성물은 건강식품, 화장료 또는 약학적 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는, 항균 조성물.
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