KR20220138153A - 표고버섯 균사 배양 여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표고버섯 균사 배양 여액을 준비하는 단계; 상기 여액을 감압농축하는 단계; 상기 감압농축하여 얻어진 농축물을 에탄올에 침전시키는 단계; 상기 침전물을 수거하여 건조하는 단계를 포함하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법 및 동 방법에 의해 얻어진 세포외 다당류를 제공한다.
Description
본 발명은 기존에는 활용가치가 매우 낮아서 전량이 폐기되고 있는 버섯 균사 배양여액에 존재하는 수용성 고분자를 면역증진 식의약품 소재로 개발하기 위한 것으로, 보다 상세하게는 표고버섯 균사 배양 여액으로부터 식의약품 소재로서 활용가치가 다양하고, 생체 이용률이 매우 높은 세포 외 다당류인 만난을 생산하는 방법에 관한 것이다.
버섯류는 오랫동안 각종 성인병, 항암, 면역조절, 항산화효과, 혈당강하, 항바이러스, 항종양, 콜레스테롤 저하 등이 있는 것으로 알려져 있어 현재까지 건강기능식품 소재로 애용되고 있다. 버섯류의 주요 성분으로는 단백질, 당류, 유기산, 핵산 및 다양한 다당류가 있는 것으로 알려져 있는데, 고분자 다당류 및 단백다당체가 주요한 생리활성 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
버섯 유래 고분자 다당류의 면역활성 증대 및 항암 효능에 대한 많은 연구가 꾸준히 진행되어 다양한 기능성 식품 및 의약품이 개발되었다. 그 예로, 표고버섯 유래 다당체인 렌티난(Lentinan), 치마버섯 다당류인 스키조필란(Schizophyllan), 운지버섯 유래 다당류인 PSK 등이 항암치료에 약물 보조제로 이용되고 있으며, 상황버섯 균사체 추출물인 단백다당체도 항암 보조제로 활용가능성이 우수한 것으로 보고되었다.
버섯 유래 다당류는 암세포의 직접적인 사멸보다는 체내 면역계의 반응과 관련이 있는 것으로 보고되며, 손상된 면역기능의 회복 또는 면역세포의 활성화를 통해 보체계 (complement system)와 대식세포의 활성화를 유도하여 암세포의 성장 및 전이를 억제하는 것으로 보고된다. 또한 기존의 항암제와 병행투여 시 항암제의 투여량 및 빈도를 획기적으로 낮출 수 있다고 보고되고, 장기간 복용에도 부작용이 크지 않아 새로운 신약 신소재로 관심을 받고 있다.
하지만, 버섯 자실체 유래 다당체는 자실체의 재배시간이 길어 생산성이 떨어지며, 수율 또한 좋지 않아 대량생산이 용이하지 않은 단점이 있다. 이에 반해 균사의 액체배양을 통한 균사체 유래 다당류는 배지 및 배양 조건 등 배양 공정이 최적화됨에 따라 다당류 생산량이 극대화 될 수 있어 버섯 유래 다당체 수득에 적용하기 위해 활발한 연구가 진행되고 있다. 그 예로 자실체 유래 다당체와 액체배양을 통한 균사체 유래 다당체가 유사한 수준으로 마우스 대식세포의 IL-6 및 TNF-a 등 사이토카인의 생성을 증가시키며, T & B 세포의 항원 특이적 면역반응 활성화를 유도하여 종양세포의 활성을 억제시킨다고 보고되었다. 항암 활성뿐만 아니라, 버섯 자실체 및 균사체 유래 다당체는 혈당강하효과가 있다고 보고된다.
대부분의 버섯유래 성분의 생리활성 검증은 고체 배양 중에 버섯, 버섯 균사체 또는 자실체에 유래하는 성분을 검증하는데 국한되어 있다. 그러나 보고된 자료(대한민국 출원번호 10-2001-0004116: 출원번호 10-2000-0077487; 출원번호 10-1999-0007997)에 의하면, 균사체의 주요성분은 버섯, 자실체의 성분과 비슷하며, 액체 배양 중에 버섯 균사는 세포 외 다당류라는 고분자 물질을 생산하는 것으로 알려져 있으나, 배양액에 생성되는 세포 외 다당류를 활용하기 위한 연구는 미진한 상태이다.
균사 배양액은 식의약품 및 화장품 소재로 활용가능성이 매우 높은 장점이 있는데, 그 예로, 균사 배양중 생성되는 세포외 다당류는 면역증진, 항산화, 혈당강하, 프리바이오틱스, 스켄케어(보습, 탄력 등) 등의 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 세포 외 다당류는 수용성이기 때문에 가공적성이 우수하고 생체 흡수율이 높은 특성이 있다.
또한, 버섯 균사를 활용하기 위한 연구는 한정되어 있는 자원을 최대한 활용이 가능한 기술로서, 기능성 고분자 물질을 생산하는데 에너지 투입이 매우 낮으며, 육상/해상유래 동식물에 비하여 탄소 발생이 낮고, 설비에 투자되는 비용이 매우 낮은 장점이 있고, GRAS (generally recognized as safe)물질 이기 때문에 미래 식의약품 소재를 개발하기 위한 주목받는 생물공학 기술로 인지되고 있다.
본 발명에서는 식의약품 및 화장품 소재로서 활용가치가 매우 높은 균사 배양 여액 유래 세포 외 다당류를 유용자원으로 활용이 가능한 방법을 제시하고자 한다. 배양여액으로부터 확보한 세포 외 다당류의 화학적 구조 특성을 분석하였으며, 식의약품 소재로서 활용가능성을 검증하기 위하여 RAW 264.7 cell 대식세포에 처리하여 면역증진 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명에서는 균사 배양여액으로부터 기능성 고분자 세포 외 다당류를 대량으로 확보하는 방법, 화학 구조적 특징 구명 및 면역활성 증진을 검증함으로써 식의약품 소재로서 개발가능성을 제시하고자 한다.
본 발명은 표고버섯 균사 배양여액에서 기능성 원료로 사용될 수 있는 재료임에도 불구하고, 액체배양 후 버려지는 여액으로부터 식의약품 소재로서 활용가치가 다양하고, 생체 이용률이 매우 높은 세포 외 다당류의 생산방법을 제공함에 그 목적이 있다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 해결하고자 하는 과제는 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.
(1) 표고버섯 균사 배양액의 여액을 준비하는 단계; 상기 여액을 감압농축하는 단계; 상기 감압농축하여 얻어진 농축물을 에탄올에 침전시키는 단계; 상기 침전물을 수거하여 건조하는 단계를 포함하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법.
(2) 상기 (1)에 있어서,
여액은 감압회전농축기를 이용해 농축하되, 농축 시 RPM은 85~100, 감압 MPa는 -0.08~0.1, 수조 온도 35~45℃에서 진행하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법.
(3) 상기 (2)에 있어서,
농축은 부피비로 1/9~1/10로 하고, 응집이 보이기 전까지 진행하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법.
(4) 상기 (3)에 있어서,
농축물을 한 번 더 감압필터로 여과하고, 여과된 농축물은 250~350mL의 99.0~99.9% 에탄올에 침전되어 2~4시간동안 교반하여 수분을 제거하고, 수분이 제거되어 얻어진 침전물을 다시 99.0~99.9%의 에탄올을 이용하여 추가적으로 수분을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법.
(5) 상기 (4)에 있어서,
감압필터를 이용해 농축물로부터 다당류를 수득하고, 40~60℃의 드라이 오븐에서 건조하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 선택된 어느 하나의 방법에 의해 생산된 만난을 포함하는 세포외 다당류.
(7) 상기 (6)의 세포외 다당류를 활성성분으로 함유하는 면역증진용 약제학적 조성물.
(8) 상기 (6)의 세포외 다당류를 활성성분으로 함유하는 면역증진용 식품조성물.
상술한 바와 같이 본 발명에 따라 표고버섯 균사 배양여액으로부터 얻어진 만난을 포함하는 세포외 다당류는 다당류에 의한 면역 증진 효과를 갖는 기능성 물질로 식의약품 소재로서 활용가치가 다양하고, 생체 이용률이 매우 높은 효과를 제공한다.
도 1은 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양여액의 고분자 조성물의 평균 절대 분자량의 분석결과.
도 2는 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양여액의 고분자 조성물의 대식세포에서의 NO 생성능(좌), 세포증식능(우) 분석결과.
도 3은 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양 여액의 고분자 조성물의 IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, iNOS 사이토카인 발현을 보여주는 Real-time PCR 분석결과.
도 4는 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양여액의 고분자 조성물의 웨스턴 블롯 분석결과.
도 5는 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양 여액의 고분자 조성물의 표고버섯 균사체 배양액 고분자 조성물의 대식세포에서의 CD 40, CD11b 발현 조사결과.
도 2는 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양여액의 고분자 조성물의 대식세포에서의 NO 생성능(좌), 세포증식능(우) 분석결과.
도 3은 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양 여액의 고분자 조성물의 IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, iNOS 사이토카인 발현을 보여주는 Real-time PCR 분석결과.
도 4는 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양여액의 고분자 조성물의 웨스턴 블롯 분석결과.
도 5는 본 발명에 따라 얻어진 표고버섯 균사체 배양 여액의 고분자 조성물의 표고버섯 균사체 배양액 고분자 조성물의 대식세포에서의 CD 40, CD11b 발현 조사결과.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 실시예들을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명의 실시예에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 살펴보기로 한다.
본 발명의 구성을 (A) 표고버섯 균사체 배양여액에서 고분자 조성물을 생산하는 과정; (B) 획득된 고분자 조성물의 성분분석; 및 (C) 제조된 고분자 조성물의 면역증진 효과 실험에 관하여 순차 설명하고자 한다.
상기 단계 (A)는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법에 관한 것으로, 표고버섯 균사 배양여액을 준비하는 단계; 상기 여액을 감압농축하는 단계; 상기 감압농축하여 얻어진 농축물을 에탄올에 침전시키는 단계; 상기 침전물을 수거하여 건조하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 상기 표고버섯 균사 배양여액은 감압회전농축기를 이용해 농축하되, 농축 시 RPM은 85~100, 감압 MPa는 -0.08~0.1, 수조 온도 35~45℃에서 진행한다.
또한, 바람직하게는 상기 감압농축과정에서 농축은 부피비로 1/9~1/10, 보다 바람직하게는 1/10로 하고, 응집(aggregation)이 보이기 전까지 진행한다.
본 발명에서 바람직하게는 상기 감압농축에 의해 얻어진 농축물을 한 번 더 감압필터로 여과하고, 여과된 농축물은 250~350mL의 99.0~99.9% 에탄올에 침전되어 2~4시간동안 교반하여 수분을 제거하고, 수분이 제거되어 얻어진 침전물을 다시 99.0~99.9%의 에탄올을 이용하여 추가적으로 수분을 제거한다.
본 발명에서 바람직하게는 상기 수분이 제거된 침전물을 대상으로 감압필터를 이용해 만난을 포함하는 다당류를 수득하고, 40~60℃의 드라이 오븐에서 건조한다.
상기 과정에 의해 얻어지는 다당류는 만노스로 이루어지는 만난을 다량 함유하며, 이는 자실체나 균사체의 직접 배양액에서는 얻어지기 어렵다.
상기 (B) 단계에서는 표고버섯 균사체 배양여액 고분자 조성물의 탄수화물, 단백질 함량을 페놀 황산법, 로우리[Lowery, O.H., Rosebrough, N. J., Farr, L., and Rindall, R. J., J. Biol. Chem., 193, 256(1951)]법으로 분석하며 표준물질로는 소혈청알부민(BSA)을 사용한다. 우론산은 D-글루쿠론산을 표준물질로 사용하며, m-하이드록시다이페닐 용액, 소듐테트라보레이트 용액, 포타슘설페이트 용액을 이용하여 측정한다.
가스크로마토그래피를 이용하여 고분자 조성물의 단당류 조성 및 결합(Linkage)을 분석하였으며, HPSEC-RI-UV-MALLS 시스템을 이용하여 절대 분자량을 확인한다.
상기 (C) 단계에서는 표고버섯 균사체 배양여액 고분자 조성물의 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행에서 분양 받아 사용하며, NO, 세포증식능, 실시간 PCR, 웨스턴 블롯, FACS를 실시하여 평가한다.
상기와 같이 얻어진 본 발명에 따른 만난을 포함하는 다당류는 약제학적 조성물이며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포외 다당류의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 경우 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 만난을 포함하는 세포외 다당류를 유효성분으로 함유하는 식품조성물을 포함한다. 상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료 조성물에는 100 ㎖를 기준으로 1 내지 25 g, 바람직하게는 2 내지 15 g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물들을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드, 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0 내지 약 30 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것으로 해석되어져서는 아니될 것이다.
[실시예 1] 표고버섯 균사체 배양 여액에서 고분자 조성물의 분리
표고버섯 균사체의 배양 여액으로부터 고분자 다당류를 분리하기 위해 화봉 바이오텍에서 배양한 표고버섯 균사 및 배양여액을 제공받았다. 균사체와 배양여액은 감압필터를 이용해 균사와 배양여액을 분리하였으며, 분리된 배양여액은 감압회전농축기를 이용해 약 1L를 100mL까지 농축시켰다. 농축 시 RPM은 85~100, 감압 MPa는 -0.08~0.1, 수조 온도 40℃에서 진행하였고, 농축되는 조성물의 응집(aggregation)이 보이기전까지 농축을 진행하였다. 상기 단계에서 10배의 농축 비율은 응집이 생기기 전까지의 비율이다.
농축물은 한 번 더 감압필터로 여과되었고, 여과된 농축물은 300mL의 99.9% 에탄올에 침전되어 3시간동안 교반하여 조성물과 결합하고 있는 수분을 제거해 주었고, 수분이 제거되어 침전된 조성물은 다시 99.9%의 에탄올에 의해 한 번 더 수분을 제거하였다.
그 후 감압필터를 이용해 고분자 조성물을 수득하였으며, 50℃의 드라이 오븐에서 하루간 건조하였다[표 1 참고].
| 수율 | 균사 배양여액 (%) |
| 0.03 |
건조된 고분자 조성물의 수율은 [조성물 무게(g)/배양액 무게(g) x 100]으로 계산하였으며 계산된 고분자 조성물의 수율은 상기 표 1과 같이 0.03%로 측정되었다.
[실시예 2] 표고버섯 균사체 배양여액 고분자 조성물의 성분 및 단당류, 결합(Linkage) 분석
탄수화물 함량 측정은 페놀 황산법법으로 시행하였고, 표준물질로 글루코오즈 0.1mg/ml 용액을 사용하였다. 페놀과 황산을 처리한 샘플과 표준물질은 450nm의 파장에서 흡광도 값을 측정하였다.
단백질 함량은 로우리[Lowery, O.H., Rosebrough, N. J., Farr, L., and Rindall, R. J., J. Biol. Chem., 193, 256(1951)]법으로 분석하였으며 표준물질로는 소혈청알부민(BSA)을 사용하였다.
우론산 함량은 D-글루큐론산을 표준물질로 사용하였고, m-하이드록시다이페닐 용액, 소듐테트라보레이트 용액, 포타슘설페이트 용액을 이용하여 측정하였다.
| 화학조성 | 균사 배양여액 (%) |
| 탄수화물 | 70.1 ± 0.9 |
| 단백질 | 28.7 ± 0.0 |
| 우론산 | 1.7 ± 0.1 |
상기 표 2의 결과에서와 같이, 탄수화물 함량은 71.0%, 단백질 함량은 28.7%, 우론산은 1.7%로 분석되어 고분자 조성물의 주 성분은 탄수화물인 것을 알 수 있었다.
가수분해 및 아세틸화된 균사 배양액은 HP-5MS 모세관 컬럼(30m×0.25mm×0.25μm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), 가스크로마토그래피-질량분광분석기(GC-MS, 6890 N/MSD 5973, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 단당류 조성을 분석하고 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
| 단당류 | 함량 (%, db) |
| 아라비노스 | 1.8±0.1 |
| 만노스 | 75.2±0.4 |
| 글루코스 | 14.6±0.3 |
| 갈락토스 | 8.5±0.2 |
상기 표와 같이 단당류 조성을 분석하였을 때 고분자 조성물의 주요 단당류는 총 단당류 중 만노스(mannose)가 75.2%로 대부분이었으며, 글루코스(glucose)가 14.6%로 나타났다.
고분자 조성물의 평균 절대 분자량(weight average molecular weight, Mw)을 분석하기 위해 2mg/mL로 이동상에 녹여주고, 오토클레이브하였다. 준비된 샘플은 주사기 필터를 이용해 여과하고, 인젝터를 통해 TSK G5000 PW 컬럼(7.5×600mm; Toso Biosep, Montgomeryville, PA, USA)에서 분리하고, multi-angle laser light scattering (HELEOS; Wyatt Technology Corp, Santa Barbara, CA, USA), refractive index detection (Waters, 2414) system (HPSEC-UV-MALLS-RI)로 절대분자량을 분석하였다.
SEC 컬럼으로부터 용리 타임(elution time) 11분에서 18분에 용리되어 분석된 평균 절대 분자량(Mw)은 6.54×104±39로 측정되었다(도 1, 표 4).
균사 배양액 고분자 조성물의 글루코시드 결합 분석은 I. Ciucanu, F. Kerek, Carbohydrate Research 13 (1984) 209-217.에 기재된 방법을 조금 변형하여 수행하였다. 다당류 2 내지 3 mg을 질소 하에 DMSO 0.5 mL에 용해시킨 뒤, CH3I 0.3mL 및 건조된 NaOH 분말(dried NaOH powder) 20 mg으로 메틸화시켰다. 완전히 메틸화된 시료들을 100℃에서 4M-TFA로 6시간 동안 산분해한 뒤, 가수분해 생성물을 물에서 NaBD4를 이용하여 환원하고, 무수아세트산(aceticanhydride)으로 아세틸화하여 부분적으로 메틸화된 알디톨아세테이트(alditol acetates)를 제조하였다. 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트를 GC-MS(6890??N/MSD 5973, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 HP-5MS 모세관 컬럼(30m×0.25mm×0.25μm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 균사 배양여액 고분자 조성물의 글루코시드 결합의 타입 및 비율을 상기의 표 4에 기재하였다. 메틸화되고 아세틸화된 균사 배양여액 고분자 조성물은 주로 1,2-글루코시드와 1,3-글루코시드 결합으로 이루어져 있으며, O-4와 O-6에 가지가 있는 것으로 추정된다.
[실시예 3] 표고버섯 균사체 배양여액 고분자 조성물의 대식세포에서의 NO 생성능, 세포증식능 분석
실험에 사용한 대식세포인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양 받았다. 배지의 조성은 RPMI-1640에 소태아혈청(FBS) 10%, 페니실린/스트렙토마이신 100U으로 구성되었으며, 37℃, CO2 5% 농도의 인큐베이터에서 5회 계대 배양한 후 세포의 모폴로지를 확인한 후 96 웰 플레이트에 분주하였다.
96 웰플레이트에서 하루 간 배양한 후, 샘플을 농도별로 처리하고, 지질다당류(LPS)를 RAW 264.7 세포 활성화제로써 처리하였다. 24시간 후에 96 웰플레이트의 상층액 100uL에 그리스 시약(Green et al., 1982) 100uL를 처리하여 30분간 반응시켰다. 마이크로 플레이트 리더(EL-800; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
세포증식능을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 웰플레이트에 하루 간 배양한 후, 샘플을 처리하고, 하루 뒤에 상층액을 제거한 후, WST-1 용액 100uL를 처리하고 암실에서 1시간동안 반응시켰다. 마이크로 플레이트 리더(EL-800; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하고 다음과 같이 계산하였다.
도 2는 상기 방법으로 측정한 NO 생성 및 세포증식 결과이다. 샘플을 처리함에 따라 농도가 증가할수록 NO 생성 또한 유의적으로 증가하였으며, LPS는 45.03uM의 NO를 생성하였고, 각 샘플은 농도별로 17.23uM, 27.1uM, 28.58uM의 NO 생성능을 보여주었다. 세포증식능은 대조군인 RPMI와 비교하였을 때 RAW 264.7 세포의 성장을 저해하지 않으며, 배지 대비 최대 121%까지 생장하는 모습을 보였다. 이와 같은 결과로 볼 때, 균사 배양액 고분자 조성물을 처리하였을 때, 대식세포의 증식을 더 유도하여 면역 활성을 증진시킬 수 있는 것으로 보인다.
[실시예 4] 표고버섯 균사체 배양여액 고분자 조성물의 대식세포에서의 사이토카인 발현 및 기작 분석
IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, iNOS 사이토카인 발현은 실시간 PCR(QuantStudioTM 3 Flex Real-Time PCR System, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 분석되었다.
RAW 264.7 세포를 96 웰 마이크로플레이트에 1×106세포/mL로 배양하였고, 균사 배양여액 고분자 조성물을 처리하고, 37℃에서 18시간동안 배양하였다. 총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 추출하였고, 스펙트로포토미터를 이용하여 농도를 측정하였다. cDNA는 올리고-(dT) 20 프라이머와 Superscript Ⅲ RT(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 합성하였다. Fast Start DNA Master TB Green II kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 실시간 PCR 시스템에 의해 DNA를 증폭시켜 주었다.
웨스턴블롯은 RAW 264.7 세포를 1×106세포/mL의 농도로 균사 배양여액 및 LPS, RPMI 배지와 37℃에서 18시간 동안 배양하였고, 총 단백질은 RIPA 라이시스 버퍼에 의해 분리되었다. 그 후 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 단백질을 옮기고 항-포스포-NF-κB p65, 항-포스포-JNK, 항-포스포-ERK1/2, 항-포스포 p38 (Abcam, Cambridge, United Kingdom)와 같은 항체를 붙여준 후, 2차 항체 (HRP-conjugated anti-rabbit antibody)를 붙여주었다. 타겟 단백질은 enhanced chemiluminescence (ECL) 키트로 발광시켜준 후, Bio-Rad 이미지 분석 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 밴드를 확인하고, 데이터를 분석하였다.
인산화된 각 단백질은 RPMI에서는 발현되지 않았고, LPS에 의해 크게 발현되었으며, 샘플을 처리하였을 때, 유의하게 인산화가 진행되었음을 확인할 수 있었다.
따라서 표고버섯 균사체 배양 여액으로부터 분리된 고분자 조성물이 ERK, JNK, MAPK 경로의 인산화를 통한 면역반응을 활성화시킨다는 것을 말해준다[도 3][도 4].
[실시예 5] 표고버섯 균사체 배양여액 고분자 조성물의 대식세포에서의 CD 40, CD11b 발현 조사
균사 배양여액 조성물을 처리하였을 때 RAW 264.7 세포에서 표면 CD11b와 CD40의 발현을 유세포분석(flow cytometry analysis)을 통해 분석하였다.
CD11b는 단세포, 과립구, 대식세포, NK 세포의 표면에 발현되는 대식세포 활성화 마커이고, CD40은 T 세포의 활성화를 통해 IL-2와 TNF-α의 생성을 자극하는 공동자극분자(Costimulatory molecule)이다.
본 실시예에서는 RAW 264.7 세포를 LPS로 처리하였을 때 CD11b, CD40의 발현이 각각 91.41%와 71.94%인 것으로 나타났다.
균사 배양여액을 처리하였을 때, 유사한 발현이 확인되었으며, RAW 264.7 세포에서 CD40(83.82%)와 CD11b(52.06%) 발현을 유의하게 유도하였다.
그러나 CD11의 발현은 CD40보다 낮았고, CD40의 발현의 증가는 mRNA 발현과 유사하게 나타남을 확인할 수 있었다.
전반적으로 균사 배양여액으로부터 분리된 고분자 조성물은 NF-kB와 MAPK 경로를 통한 사이토카인 생성에 의한 RAW 264.7 세포 활성화와 CD40 발현을 통한 NO 생성을 유도한다고 할 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- 표고버섯 균사 배양 여액을 준비하는 단계; 상기 여액을 감압농축하는 단계; 상기 감압농축하여 얻어진 농축물을 에탄올에 침전시키는 단계; 상기 침전물을 수거하여 건조하는 단계를 포함하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법.
- 제 1항에 있어서,
여액은 감압회전농축기를 이용해 농축하되, 농축 시 RPM은 85~100, 감압 MPa는 -0.08~0.1, 수조 온도 35~45℃에서 진행하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법. - 제 2항에 있어서,
농축은 부피비로 1/9~1/10로 하고, 응집이 보이기 전까지 진행하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법. - 제 3항에 있어서,
농축물을 한 번 더 감압필터로 여과하고, 여과된 농축물은 250~350mL의 99.0~99.9% 에탄올에 침전되어 2~4시간동안 교반하여 수분을 제거하고, 수분이 제거되어 얻어진 침전물을 다시 99.0~99.9%의 에탄올을 이용하여 추가적으로 수분을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법. - 제 4항에 있어서,
감압필터를 이용해 농축물로부터 다당류를 수득하고, 40~60℃의 드라이 오븐에서 건조하는 것을 특징으로 하는 표고버섯 균사 배양여액 유래 만난을 포함하는 세포외 다당류의 생산방법. - 제 1항 내지 제 5항 중 선택된 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 만난을 포함하는 세포외 다당류.
- 제 6항의 세포외 다당류를 활성성분으로 함유하는 면역증진용 약제학적 조성물.
- 제 6항의 세포외 다당류를 활성성분으로 함유하는 면역증진용 식품조성물.
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| KR920010762B1 (ko) * | 1990-11-28 | 1992-12-17 | 오화석 | 항종양 면역증강 효과가 있는 단백질다당체 |
| KR20120078327A (ko) * | 2010-12-31 | 2012-07-10 | 주식회사한국신약 | 표고버섯 균사체 배양물에서 추출된 다당체를 유효성분으로 함유하는 보습 및/또는 미백용 화장료 조성물 |
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Non-Patent Citations (1)
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| 김택. 구름버섯 균사체 배양액 추출물의 생리활성 및 약용버섯 균사체의 배양특성, 제주대학교 대학원, [online], 2009년 2월, [2023년 10월 4일 검색], 인터넷: <URL: https://lib.jejunu.ac.kr/#/search/detail/827891>(2009.02.28.) 1부.* * |
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Legal Events
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