KR920010762B1 - 항종양 면역증강 효과가 있는 단백질다당체 - Google Patents

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Abstract

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Description

항종양 면역증강 효과가 있는 단백질다당체
제1도는 DEAE 셀루로즈 이온교환수지 칼럼크로마토그라피에 의한 분획 A의 용출형태를 나타낸 그래프.
제2도는 세파로즈 CL-4B 젤여과에 의한 분획 B의 용출형태를 나타낸 그라프.
제3도는 세파로즈 CL-4B 젤여과에 의한 표준덱스트란의 용출형태를 나타낸 그라프.
제4도는 표준텍스트란을 이용한 세파로즈 CL-4B에 의한 분획 E의 분자량 결정 그라프.
제5a도는 분획 A의 메틸화된 단당류의 가스-액체 크로마토그래피.
제5b도는 분획 B의 메틸화된 단당류의 가스-액체 크로마토그래피.
제5c도는 분획 C의 메틸화된 단당류의 가스-액체 크로마토그래피.
제5d도는 분획 D의 메틸화된 단당류의 가스-액체 크로마토그래피.
제5e도는 분획 E의 메틸화된 단당류의 가스-액체 크로마토그래피.
제6a도는 분획 A의 산가수분해된 아미노산의 크로마토그람.
제6b도는 분획 B의 산가수분해된 아미노산의 크로마토그람.
제6c도는 분획 C의 산가수분해된 아미노산의 크로마토그람.
제6d도는 분획 D의 산가수분해된 아미노산의 크로마토그람.
제6e도는 분획 E의 산가수분해된 아미노산의 크로마토그람.
제7a도는 분획 A의 적외선 분광 스펙트림.
제7b도는 분획 B의 적외선 분광 스펙트림.
제7c도는 분획 C의 적외선 분광 스펙트림.
제7d도는 분획 D의 적외선 분광 스펙트림.
제7e도는 분획 E의 적외선 분광 스펙트림.
본 발명은 식용버섯인 표고버섯으로부터 추출한 강력한 항종양 면역작용이 있는 단백다당체(이하, “에도단”이라 한다.) 및 그 추출공정에 관한 것이다.
버섯류인 담자균류에서 발견된 렌티난, 쉬조필란, 효모의 세포벽 지모산과 효모의 글루칸, 세균제제인 BCG 및 코리네 박테리움 팔붐, 방선균류의 하나인 노카르디아 루브라의 세포벽 성분등이 항암작용을 가진다고 보고되어 있다. 그러나, 이들중에서도 세균제제인 BCG나 프로인트 전 보조액(Freund’s complete adjuvant)과 같은 면역 보조제가 생체내에서 종종 복잡한 부작용을 나타내기 때문에 종양면역을 증가시키기 위한 보조제로 사용할때에는 지장이 있다고 밝히고 있다. [Schuarenberg. L., Simmier, M. C. and Pico, J. L. :Cancer Immunol. Immunotherapy 1, 69(1976)]. 반면에 담자균류에서 분리한 다당체 성분은 숙주에 대하여 독작용을 수반하지 않으면서 종양억제작용을 나타내는 것으로 발표되었다. [Sugiura, M. and Ito, H. :Tokyo Yakka Daigaku Kenkyu Mempo 27, 722(1977)].
본 발명자는 표고버섯의 항종양 면역증강 효과에 관하여 오랜동안 연구를 행하여 왔으며, 표고버섯의 균사체를 영양소가 들어있는 배양액에서 배양한 후 그 성분을 열시추출하여 분리하고 약효실험을 행한 결과, 이 항종양 성분은 고분자물질이며, 종양에 대하여 직접 억제작용이 있는 것이 아니라, 생체내에 원래부터 존재하는 방어 세포인 T세포, B세포 및 마이크로파지의 수를 증가시키고 아룰러 그 공격력을 활성화시킴으로 종양을 억제하는 사실을 밝혀내고 이 성분을 “에도단”이라 명명하였다.
따라서 본 발명의 목적은 식용버섯인 표고버섯의 균사체를 배양하고 열시추출하여 항종양 면역효과가 있는 단백다당체 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
[실시예 1]
[표고버섯의 균사배양]
표고버섯(Lentinus edodes)의 균사를 액내배양하였다.
[배양균사의 배양]
1. 배지의 조성
(1) 종균용 배지
박토 포테이토 덱스트로스 아가(Bacto potato dextrose agar) 39g에 증류수를 가하여 1ℓ로 한다음 121℃, 1.1kg/㎠에서 15분간 멸균하여 사용하였다.
(2) 액내배양용 배지
글루코스 50g, 펩톤 9g, 이스트 추출물 9g, K2HOP40.87g, MgSO47Hz 0 0.5g, CaCl20.3g, FeSO47H20.10mg, MnCl24H20.7mg, ZnSO47Hz 0.4mg, CuSO45Hz 9.1mg에 증류수를 가하여 1ℓ로 하고 0.1M HCl pH를 5.5로 맞춘후 121℃, 1.1kg/㎠에서 15분간 멸균하여 사용하였다.
2. 배양방법
(1) 종균배양
저상균주의 균사체를 무균적으로 분리하고 새로운 종균용 평판배지에 이식하여 27±1℃에서 10일반 배양하였다.
(2) 1차 액내배양
평판배지의 균사를 무균적으로 분리하여 액내배양을 배지 소량을 가하여 10초간 균질화한 후 100ml이 액내배양용 배지를 가한 500ml 삼각플라스크에 이식하고, 27±1℃에서 180rpm와 속도로 orbital incubator에서 10일간 배양하였다.
(3) 2차 액내배양
균사체를 포함한 배양액 전체를 10초간 무균적으로 균질화한 후 무균피렛으로 20ml씩 취하여 액내배양용 배지 500ml를 가한 2ℓ 삼각 플라스크에 이식하고, 27±1℃에서 180rpm의 속도로 오비탈 인큐베이터에서 15일간 배양하였다.
[실시예 2]
배양균사체로 부터의 단댁다당체의 추출 및 분리:
65ℓ의 액체배지에서 배양된 균사체를 열수추출, 농축, 75% 에탄올 침전, 투석 및 동결 건조하여 7.83g의 갈색분말을 얻었다. (도식 1). 이 분말을 분획 A라 명하였다.
도식 1. 표고버섯 배양균사체의 항암분획의 추출 및 분리
[실시예 3]
도식 II. DEAE 셀룰로즈 이온교환 크로마토그래피에 의한 분획 A로부터 중성 및 산성분획의 분리
분획 B는 다시 세파로즈 CL-4B 젤에서 0.01 소디움 포스페이트 완충액에 의해 용출하여 분획 E를 얻었다. (도식 III). 그 용출형태는 제2도에 나타내었다. 또한 분자량을 결정하기 위해 젤 여과방법을 이용했는데, T-2000(분자량 2백만), T-480(분자량 48만) 및 T-480(분자량 6만)을 이용하여 표준곡선을 작성하였으며 용출형태는 제3도와 같다. 이 결과 분획 E의 분자량은 1.05×105이었다. (제4도).
[실시예 4]
[항암실험]
생후 5주의 수컷 ICR마우스의 윈쪽 서혜부에 1ml당 106개의 육종 180세포를 근육주사한 후 72시간 후에 음성대조군으로 0.9% 생리식염수와 20mg/kg의 양으로 각 분획과 양성대조군인 크레스틴을 10일동안 복강주사후 2주후에 실시하여 서혜부의 고형종양의 무게를 측정(도식 IV)하여 억제정도를 백분율로 나타내었다.
(표 1). 분획 B와 E가 강한 억제작용을 보였는데 88-90%였다. 종양 억제율(%)는 다음식으로 계산하였다.
도식 IV. 생체상에서 항암실험 과정
도식 IV. 생체상에서 항암실험 과정
[표 1]
[실시예 5]
[화학적 분석]
각 분획의 총 다당류 함량은 안쓰론법으로 총 단백질 함량은 브레드포드 및 로리-폴린분석법으로 측정하였다. (표 2). 단백질양의 경우에, 표 3에 나타나는 것과 같이 브레드포드분석법이 더 효과적이었다. 분획 E는 87%의 다당류와 1.39%의 단백질로 구성되어 있었다.
헥소자민을 검출하고 양을 측정하기 위한 방법으로 엘손-몰간법이 이용되었으며 표 4에 결과를 나타내었다. 각 분획은 0.1-80%의 헥소자민을 함유하였다.
각 분획의 구성다당류는 가스-액체 크로마토그래피에 의해 검색하였던바 글루코즈(0-58%), 갈락토즈(0-45%), 멘조즈(19-48%), 자일로즈(0-55%) 및 푸코즈(0.5-10%)로 구성되어 있었다. (표 5, 제5도). 그리고 단백다당체의 단백질 부분은 표 6과 제6도에서 보는 바와 같이 분획 A,B,C,D 및 E는 각각 17종, 12종, 16종, 16종 및 13종의 아미노산으로 구성되어 있었다.
[표 2]
[표 3-가]
[표 3-나]
[표 4]
[표 5]
[표 6]
[실시예 6]
[기기분석]
각 분획의 구성원소는 탄소, 산소, 수소 및 질소가 각각 6:10.3:7.6:0.4의 비율로 구성되어 있었고(표 7), 각 분획의 적외분광 스펙트럼 분석결과는 제7도에 나타내었다.
[표 7]
[실시예 7]
[면역 반응]
단백다당체에 의한 증강된 면역의 정도는 복강내에서 활성화된 대식세포에 의해 생성되는 과산화산수 음이온(superoxide anion)의 측정(도식 V)과 비장내의 B세포, T세포 및 면역세포에 의한 용혈반수의 측정으로 평가하였다(도식 VI). 그 결과는 각각 표 8과 표 9에 나타내었는데 대조군에 비해 과산화수소 음이온은 1.42-1.75배, 용혈반수는 3.4배정도 증가되었다.
도식 V. 활성화된 세포에서 과산화산소 음이온의 분석과정
[표 8]
[표 9]
이상의 실시예들로 부터 표고버섯 배양 균사체의 열수추출물은 단백다당체이며, 이들의 항암작용을 복강투여후 대식세포에 의해 부분 소화되어서 면역증강 자극물질로 대식세포 및 면역세포를 활성화시켜 암세포에 억제적 작용을 하는 것으로 사료된다.

Claims (8)

  1. 표고버섯의 균사체를 배양하고 여과하여 얻어진 균사체를 열시추출하고 여과하여, 얻어진 여액을 농축하고 에탄올로 침전시켜서 얻어진 침전물을 투석하여 얻어진 수용성 물질을 동결 건조시켜서 얻어진 항암성 단백다당체.
  2. 표고버섯의 균사체를 배양하고 여과하여 얻어진 균사체를 열시추출하고 여과하여, 얻어진 여액을 농축하고 에탄올로 침전시켜서 얻어진 침전물을 투석하여 얻어진 수용성 물질을 동결 건조시켜서 항암성 단백다당체를 제조하는 방법.
  3. 제1항에서 얻어진 단백다당체를 트리스-HCl 완충액에 용해하여 원심분리하고 DEAE 셀룰로즈상에서 칼럼 크로마토그라피하고, 트리스-CHl 완충액으로 용출시키고, 미흡착 분획을 원심분리하고, 투석한 후 동결 건조시켜서 얻어진 항암 단백다당체.
  4. 제1항에서 얻어진 단백다당체를 트리스-HCl 완충액에 용해하여 원심분리하고 DEAE 셀룰로즈상에서 칼럼 크로마토그라피하고, 트리스-HCl 완충액으로 용출시키고, 미흡착 분획을 원심분리하고 투석한 후 동결 건조시켜서 항암성 단백다당체를 제조하는 방법.
  5. 제1항에서 얻어진 단백다당체를 트리스-HCl 완충액에 용해하여 원심분리하고 DEAE 셀룰로즈상에서 칼럼 크로마토그라피한, 0.5N NaOH로 용출시키켜서 흡착된 강산성의 단백다당체 분획을 원심분리하고 투석 및 동결 건조시켜서 얻어진 항암성 단백다당체.
  6. 제1항에서 얻어진 단백다당체를 트리스-HCl 완충액에 용해하여 원심분리하고 DEAE 셀룰로즈상에서 칼럼 크로마토그라피하고 0.5N NaOH로 용출시키서 흡착된 강산성의 단백다당체 분획을 원심분리하고 투석 및 동결 건조시켜서 항암성 단백다당체를 제조하는 방법.
  7. 제3항에서 얻어진 단백다당체를 소디움포스페이트 완충액에 용해하고 원심분리하여 얻어진 상등액을 세파로즈 CL-4B로 여과하고 소디움포스페이트 완충액으로 용출시키고 원심분리한 후 투석하고 동결 건조시켜서 얻어진 항암성 단백다당체.
  8. 제3항에서 얻어진 단백다당체를 소디움포스페이트 완충액에 용해하고 원심분리하여 얻어진 상등액을 세파로즈 CL-4B로 여과하고 소디움포스페이트 완충액으로 용출시키고 원심분리한 후 투석하고 동결 건조시켜서 항암성 단백다당체를 제조하는 방법.
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