KR20220116514A - 마이코프로테인 제조 방법 - Google Patents

마이코프로테인 제조 방법 Download PDF

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KR20220116514A
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데이비드 스파크스
로버트 제임스 테일러 레어드
폴 앤드류 허드만
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쓰리에프 바이오 엘티디
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Abstract

마이코프로테인의 제조 및 단리를 위한 연속 방법을 기술한다. 본 방법은 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계; 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계; 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계; 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계; 및 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한 본 방법으로부터 수득된 마이코프로테인도 기술한다.

Description

마이코프로테인 제조 방법
본 발명은 마이코프로테인의 제조 및 단리 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 효율적이고, 저에너지이며, 비용면에서 효과적인 마이코프로테인 제조 및 단리 방법에 관한 것이다.
마이코프로테인은 전형적으로 식품 또는 성분으로 사용되는 단일 세포 단백질의 한 형태이다. 이는 통상적으로 사상성 진균, 예컨대, 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum)을 사용하여 탄수화물 공급원의 호기성 발효에 의해 제조된다.
GB2137226A는 필요한 모든 성장 촉진 영양 물질을 포함하는 배양 배지 중에서 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)을 사용하여 연속 호기성 발효에 의해 마이코프로테인을 제조하는 방법을 기술한다. 호기성 발효에 의한 마이코프로테인 성장 후, 마이코프로테인 생성물에 존재하는 RNA와 같은 핵산의 함량을 감소시키기 위해서는 열 처리 단계가 요구된다.
GB1440642A는 마이코프로테인 생성물 중의 RNA의 함량을 감소시키는 데 사용되는 방법을 기술한다. 열 처리 단계는 여과에 의해 수확되고, 세척된 후, 이어서, 물 중에 재현탁된 물질에 대해 수행된다.
마이코프로테인은 대중적인 육류 대용품이지만, 마이코프로테인 생산 비용은 높다. 높은 비용은 정제된 공급원료 (전형적으로 글루코스 시럽)의 사용, 높은 물 사용량, 호기성 발효와 연관된 높은 에너지 비용 및 높은 공장 운영 비용과 연관이 있다.
WO 2016/063053은 마이코프로테인 및 에탄올의 공동생산 방법을 기술한다. 특히, 마이코프로테인은 푸사리움 종의 호기성 발효에 의해 생산된다. 발효 브로쓰에 대해 열 처리 단계를 수행하여 RNA 함량을 감소시키고, 이어서, 분리하여 마이코프로테인 페이스트 및 소모된 마이코프로테인 발효액을 제공한다. 이어서, 소모된 마이코프로테인 발효액을 혐기성 발효 공정에 공급하여 에탄올을 생산한다.
그러나, WO 2016/063053에 기술된 방법은 요구되는 마이코프로테인 대 에탄올 비를 달성하기 위해서는 마이코프로테인 또는 에탄올을 수득하는 데 사용되는 성장 조건 및 기질 제어를 필요로 한다. 추가로, WO 2016/063053의 열 처리 단계는 혐기성 발효 공정에 추가되는 발효액의 품질 및 일관성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 예컨대, 마이야르(Maillard) 반응과 같은 영양 성분 상호작용을 초래할 수 있다.
추가로, 전형적인 마이코프로테인 제조 방법에서 열 처리 단계는 에너지 비용이 높고, 처리 시간이 길다.
따라서, 본 발명의 목적은 효율적이고, 저에너지이며, 비용면에서 효과적인 마이코프로테인 수득 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 선행 기술의 단점 중 적어도 일부를 완화시키는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 하기 내용을 읽음으로써 자명해질 것이다.
본 발명의 제1 측면에 따라,
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계; 및
(v) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계를 포함하는, 마이코프로테인의 제조 및 단리를 위한 연속 방법을 제공한다.
용어 "배지"는 미생물의 성장을 지원하도록 디자인 고체, 액체 또는 반고체를 의미한다.
용어 "발효 배지"는 발효에 적합한 배지를 의미한다. 예를 들어, 발효에 사용되는 미생물의 성장을 지원하는 데 필요한 성분을 포함하는 배지.
발효 배지는 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 탄수화물을 포함할 수 있으며, 임의적으로, 여기서 탄수화물은 당이고, 임의적으로, 여기서 탄수화물은 글루코스, 수크로스 또는 그의 공급원이다. 탄수화물은 글루코스일 수 있다.
발효 배지는 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 수성 발효성 브로쓰일 수 있다.
발효 배지는 물, 탄수화물, 질소 공급원 및 영양소를 포함할 수 있다. 영양소는 마이코프로테인을 제조하는 데 적합할 수 있다. 영양소는 염, 비타민 및 미량 금속으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택될 수 있다.
염은 황산칼륨, 인산칼륨, 황산마그네슘, 염화망가니즈, 아세트산칼슘, 염화칼슘, 황산철, 염화철, 황산아연, 염화아연, 황산구리, 염화구리, 염화코발트, 염화암모늄, 몰리브덴산나트륨, 수산화암모늄, 인산암모늄 및 콜린 염으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택될 수 있다.
용어 "부분적으로 소모된 발효 배지"는 발효를 거친 배지를 의미한다. 부분적으로 소모된 배지는 원래 발효 배지로부터의 탄수화물 및/또는 영양소의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 탄수화물은 당일 수 있고, 임의적으로, 탄수화물은 글루코스, 수크로스 또는 그의 공급원일 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부를 제1 발효 베쓸로 재도입시킨 후, 발효 단계는 발효 배지 및 단리된 부분적으로 소모된 배지의 일부를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 것을 포함할 수 있다. 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부를 제1 발효 베쓸로 재도입시킨 후, 발효 단계는 발효 배지 및 단리된 부분적으로 소모된 배지의 일부, 둘 모두로부터 탄수화물을 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 것을 포함할 수 있다.
발효 배지는 원래 발효 배지일 수 있다. 발효 배지는 제1 발효 배지일 수 있다. 제1, 또는 원래 발효 배지는 이전에 발효 공정을 거치지 않은 (즉, 부분적으로 소모된 발효 배지가 아닌) 신선하거나, 새로운 배지 성분을 포함할 수 있다.
부분적으로 소모된 발효 배지가 원래 발효 배지와 조합될 때, 이렇게 형성된부분적으로 소모된 발효 배지 및 원래 발효 배지의 혼합물은 연속 발효 배지로 지칭될 수 있다.
연속 방법은
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 원래 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 원래 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 원래 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계; 및
(v) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계를 포함할 수 있고,
여기서 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부를 제1 발효 베쓸로 재도입시킨 후, 발효 단계는 원래 발효 배지 및 단리된 부분적으로 소모된 배지의 일부를 발효시키는 것을 포함할 수 있다.
발효 전 발효 배지 중 탄수화물은 과량으로 존재할 수 있다.
(a) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부를 재도입시킨 후 발효 배지를 제공하는 것; 및 (b) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 재도입시키는 것 중 적어도 하나는 발효 전에 과량의 탄수화물을 유지하도록 구성될 수 있다.
발효 전에 과량의 탄수화물을 유지하는 것은 (a) 부분적으로 소모된 발효 배지 중 탄수화물의 농도를 결정하고; (b) 제1 발효 베쓸에 도입된 발효 배지를 조정하여 발효 전에 과량의 탄수화물을 유지하는 것을 포함할 수 있고, 임의적으로, 여기서 발효 배지를 조정하는 것은 제공된 발효 배지의 양; 및 그 안의 탄수화물 농도 중 적어도 하나를 감소시키는 것을 포함한다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부 중 탄수화물의 농도는 발효 전 발효 배지 중 탄수화물의 농도보다 낮을 수 있다. 발효 전 발효 배지 중 탄수화물의 농도는 대략 15 g/L 내지 대략 90 g/L, 임의적으로 대략 15 g/L 내지 대략 44 g/L, 임의적으로 대략 15 g/L 내지 대략 33 g/L, 임의적으로 대략 33 g/L 내지 대략 44 g/L, 임의적으로 대략 16.5 g/L 내지 대략 49.5 g/L, 임의적으로 대략 33 g/L일 수 있다. 발효 전 발효 배지 중 탄수화물의 농도는 적어도 15 g/L일 수 있다. 제1 발효 베쓸 내로 재도입되는 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부 중의 탄수화물의 농도는 대략 90 g/L 미만, 임의적으로, 대략 0.1 g/L 내지 대략 89.9 g/L, 임의적으로, 대략 33 g/L 미만, 임의적으로, 대략 0.1 g/L 내지 대략 32.9 g/L일 수 있다.
발효 전 발효 배지 중 탄수화물의 농도는 33 g/L일 수 있다. 제1 발효 베쓸 내로 재도입되는 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부 중의 탄수화물의 농도는 33 g/L 미만일 수 있다.
(a) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부를 재도입시킨 후 원래 또는 제1 발효 배지를 제공하는 것; 및 (b) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 재도입시키는 것 중 적어도 하나는 발효 전에 발효 배지 중 적어도 15 g/L, 임의적으로, 33 g/L의 탄수화물 농도를 유지하도록 구성될 수 있다.
발효 전 발효 배지 중의 영양소는 과량으로 및/또는 미리 결정된 농도로 존재할 수 있다.
(a) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부의 일부를 재도입시킨 후 발효 배지를 제공하는 것; 및 (b) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 재도입시키는 것 중 적어도 하나는 발효 전 영양소의 과량 및/또는 미리 결정된 농도를 유지하도록 구성될 수 있다.
발효 전 영양소의 과량 및/또는 미리 결정된 농도를 유지하는 것은 (a) 부분적으로 소모된 발효 배지 중 하나 이상의 영양소의 농도를 측정하고; (b) 제1 발효 베쓸에 도입된 발효 배지를 조정하여 발효 전 영양소의 과량 및/또는 미리 결정된 농도를 유지하는 것을 포함할 수 있고, 임의적으로, 여기서 발효 배지를 조정하는 것은 제공된 발효 배지의 양; 및 그 안의 영양소의 농도 중 적어도 하나를 감소시키는 것을 포함한다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부 중 영양소의 농도는 발효 전 발효 배지 중 영양소의 농도보다 낮을 수 있다.
영양소가 칼륨, 임의적으로 황산칼륨일 때, 농도는 대략 1 g/L 내지 대략 3 g/L, 전형적으로, 대략 1.5 g/L 내지 대략 2.5 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 2 g/L일 수 있다.
영양소가 마그네슘, 임의적으로 황산마그네슘일 때, 농도는 대략 0.45 g/L 내지 대략 1.35 g/L, 전형적으로, 대략 0.68 g/L 내지 대략 1.13 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.9 g/L일 수 있다.
영양소가 칼슘, 임의적으로 아세트산칼슘일 때, 농도는 대략 0.1 g/L 내지 대략 0.3 g/L, 전형적으로, 대략 0.15 g/L 내지 대략 0.25 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.2 g/L일 수 있다.
영양소가 인산, 임의적으로 85% 인산일 때, 농도는 대략 0.575 g/L 내지 대략 1.725 g/L, 전형적으로, 대략 0.86 g/L 내지 대략 1.44 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 1.15 g/L일 수 있다.
영양소가 철, 임의적으로 황산철일 때, 농도는 대략 0.0025 g/L 내지 대략 0.0075 g/L, 전형적으로, 대략 0.004 g/L 내지 대략 0.006 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.005 g/L일 수 있다.
영양소가 아연, 임의적으로 황산아연일 때, 농도는 대략 0.0125 g/L 내지 대략 0.0375 g/L, 전형적으로, 대략 0.019 g/L 내지 대략 0.031 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.025 g/L일 수 있다.
영양소가 망가니즈, 임의적으로 황산망가니즈일 때, 농도는 대략 0.01 g/L 내지 대략 0.03 g/L, 전형적으로, 대략 0.015 g/L 내지 대략 0.025 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.02 g/L일 수 있다.
영양소가 구리, 임의적으로 황산구리일 때, 농도는 대략 0.00125 g/L 내지 대략 0.00375 g/L, 전형적으로, 대략 0.0019 g/L 내지 대략 0.0031 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.0025 g/L일 수 있다.
영양소가 비오틴일 때, 농도는 대략 0.0000125 g/L 내지 대략 0.0000375 g/L, 전형적으로, 대략 0.0019 g/L 내지 대략 0.000031 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.000025 g/L일 수 있다.
영양소가 콜린, 임의적으로 콜린 히드로클로라이드일 때, 농도는 대략 0.0435 g/L 내지 대략 0.1305 g/L, 전형적으로, 대략 0.065 g/L 내지 대략 0.109 g/L, 더욱 전형적으로, 대략 0.087 g/L일 수 있다.
본원에 제공된 범위 및 양에서, 주어진 상이한 값이 조합되어 상이한 범위 및 양을 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 범위 및 양이 1 g/L 내지 3 g/L, 전형적으로, 1.5 g/L 내지 2.5 g/L, 더욱 전형적으로, 2 g/L로 주어지는 경우, 이는 또한 1 g/L 내지 2.5 g/L, 1 g/L 내지 2 g/L, 1 g/L 내지 1.5 g/L, 1.5 g/L 내지 3 g/L, 1.5 g/L 내지 2 g/L, 2 g/L 내지 3 g/L, 2 g/L 내지 2.5 g/L, 2.5 g/L 내지 3 g/L 및/또는 값의 임의의 다른 조합, 및/또는 1 g/L, 1.5 g/L, 2 g/L, 2.5 g/L 및 3 g/L의 개별 값도 포함한다.
마이코프로테인의 비 성장률은 대략 0.17 h-1 내지 대략 0.2 h-1일 수 있다.
제1 발효 베쓸은 호기성 발효 베쓸일 수 있다.
제1 발효 베쓸은 제1 호기성 발효 베쓸일 수 있다. 본 방법은 발효 배지를 하나 이상의 호기성 발효 베쓸에 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 발효 배지를 제1 호기성 발효 베쓸 및 제2 호기성 발효 베쓸에 도입시키는 단계를 포함할 수 있다.
발효 배지를 미생물과 함께 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득할 수 있으며, 임의적으로, 여기서 미생물은 사상성 진균이고, 임의적으로, 여기서 사상성 진균은 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 리조푸스(Rhizopus) 종 및 푸사리움 종으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다. 미생물은 푸사리움 베네나툼일 수 있다.
마이코프로테인은 사상성 진균을 이용한 호기성 발효에 의해 생성될 수 있다. 사상성 진균은 아스페르길루스 종, 리조푸스 종 및 푸사리움 종으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택될 수 있다. 사상성 진균은 푸사리움 베네나툼일 수 있다. 마이코프로테인은 푸사리움 베네나툼을 이용한 호기성 발효에 의해 생성될 수 있다.
본 방법은 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계 후, 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 제1 발효 베쓸로부터 제거하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 방법은 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계 이후일 수 있다.
마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계는 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계 이후일 수 있다.
마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계 이전일 수 있다.
혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계는 제1 단리 단계 및 제2 단리 단계를 포함할 수 있다.
제1 단리 단계는 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계 이전일 수 있고, 제2 단리 단계는 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계 이후일 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계는 제1 재도입 단계 및 제2 재도입 단계를 포함할 수 있다.
제1 재도입 단계는 제1 단리 단계 이후 및 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계 이전일 수 있다.
제2 재도입 단계는 제2 단리 단계 이후일 수 있다.
혼합물 중의 마이코프로테인은 실질적으로 고체상일 수 있고, 혼합물 중의 부분적으로 소모된 발효 배지는 영양소 및 탄수화물을 포함하는 실질적으로 액체상일 수 있다. 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계는 실질적으로 고체상 및 실질적으로 액체상을 분리하는 것을 포함할 수 있다.
마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계는 원심분리에 의해 실질적으로 고체상 및 실질적으로 액체상을 분리하는 것을 포함할 수 있고, 임의적으로, 여기서 분리는 여과에 의해 이루어진다.
용어 "실질적으로 고체상"이란, 고체가 풍부한 상을 의미한다. 용어 "실질적으로 액체상"은 액체가 풍부한 상을 의미한다.
원심분리는 디스크 스택 원심분리일 수 있다. 그러나, 임의의 적합한 원심분리 수단 및/또는 장치가 사용될 수 있다.
여과는 십자류 여과일 수 있다. 그러나, 임의의 적합한 여과 수단 및/또는 장치가 사용될 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 배지는 센트레이트(centrate), 여액 등일 수 있다. 액체가 풍부한 상은 센트레이트일 수 있다. 액체가 풍부한 상은 여액일 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 배지는 물, 영양소 및 탄수화물을 포함하는 수용액일 수 있다.
부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부의 제1 발효 베쓸로의 재도입은 재순환 단계일 수 있다. 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부의 제1 발효 베쓸로의 재도입은 본 방법에 필요한 발효 배지의 양을 감소시킬 수 있다. 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부의 제1 발효 베쓸로의 재도입은 본 방법에 필요한 탄수화물 및/또는 물의 양을 감소시킬 수 있다.
본 방법은 단리 단계 이후 및 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계 이전에 멸균 단계를 포함할 수 있다. 멸균 단계는 제2 단리 단계 이후 및 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계 이전일 수 있다.
멸균 단계는 가열-멸균 단계 또는 여과-멸균 단계일 수 있다.
본 방법은 에탄올을 제조하고, 단리시키는 추가 단계를 포함할 수 있다.
발효 배지는 공급원료로부터 수득될 수 있다. 공급원료는 전분 기반 공급원료 및 당 기반 공급원료 중 적어도 하나일 수 있다. 전분 기반 공급원료는 곡물, 카사바 및 감자로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택될 수 있다. 공급원료는 곡물일 수 있다. 곡물은 밀, 옥수수, 메밀, 호밀, 보리, 기장 및 쌀 중 적어도 하나일 수 있다. 당 기반 공급원료는 사탕수수, 사탕무 및 단수수로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택될 수 있다. 공급원료는 사탕수수일 수 있다. 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계 이전에 공급원료에 대해 밀링, 그라인딩, 젤라틴화, 액화 및 당화 중 하나 이상의 것을 수행할 수 있다. 발효 배지는 가수분해된 전분을 포함하는 수성 발효성 브로쓰일 수 있다.
본 방법은 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제2 발효 베쓸로 도입시키는 추가 단계를 포함할 수 있다. 제2 발효 베쓸은 혐기성 발효 베쓸일 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제2 발효 베쓸로 도입시키는 단계는 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계 이후일 수 있다.
본 방법은 제2 발효 베쓸 중에서 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 발효시켜 에탄올을 수득하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부는 제1 발효 베쓸로 재도입될 수 있고, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 중 잔류물은 제2 발효 베쓸로 도입될 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부는 제1 발효 베쓸로 재도입될 수 있고, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 중 잔류물은 제2 발효 베쓸로 도입될 수 있다. 임의적으로, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 중 잔류물은 배출물로서 배출될 수 있다.
본 방법은 과량의 발효 배지 성분을 이용하여 작동될 수 있다. 본 방법은 발효 배지 중 과량의 탄수화물을 이용하여 작동될 수 있으며, 임의적으로, 여기서 탄수화물은 글루코스이다.
본 발명의 제2 측면에 따라, 제1 측면에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인을 제공한다.
본 발명의 제3 측면에 따라,
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함하는 제1 단리 단계;
(v) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계;
(vi) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계; 및
(vii) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함하는 제2 단리 단계를 포함하는, 마이코프로테인의 제조 및 단리를 위한 연속 방법을 제공한다.
제2 단리 단계는 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 가열 처리된 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따라, 제3 측면에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인을 제공한다.
본 발명의 제5 측면에 따라,
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계;
(v) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계; 및
(vi) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계를 포함하는, 마이코프로테인의 제조 및 단리를 위한 연속 방법을 제공한다.
본 방법은 단리 단계 이후 및 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계 이전에 멸균 단계를 포함할 수 있다.
멸균 단계는 가열-멸균 단계 또는 여과-멸균 단계일 수 있다.
본 발명의 제6 측면에 따라, 제5 측면에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인을 제공한다.
본 발명의 제7 측면에 따라,
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함하는 제1 단리 단계;
(v) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 것을 포함하는 제1 재도입 단계;
(vi) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계;
(vii) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함하는 제2 단리 단계; 및
(viii) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 것을 포함하는 제2 재도입 단계를 포함하는, 마이코프로테인의 제조 및 단리를 위한 연속 방법을 제공한다.
제2 단리 단계는 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 가열 처리된 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함할 수 있다.
제2 재도입 단계는 제2 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따라, 제7 측면에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인을 제공한다.
본 발명의 제9 측면에 따라,
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계; 및
(v) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재순환시키는 단계를 포함하는, 재순환 방법을 제공한다.
재순환 방법은 발효 배지를 재순환시키는 방법일 수 있다.
본 발명의 제10 측면에 따라, 제9 측면에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인을 제공한다.
본 발명의 제11 측면에 따라,
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계;
(v) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계;
(vi) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계; 및
(vii) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 잔류물을 제2 발효 베쓸 내로 도입시키는 단계를 포함하는, 마이코프로테인 및 에탄올의 제조 및 단리를 위한 통합된 연속 방법을 제공한다.
본 방법은 제2 발효 베쓸 중에서 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 잔류물을 발효시켜 에탄올을 수득하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 배지의 잔류물을 미생물과 함께 발효시켜 에탄올을 수득할 수 있다. 미생물은 알콜 생산 미생물일 수 있다. 미생물은 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
단리된 부분적으로 소모된 배지의 잔류물을 비발효 수성 발효성 브로쓰의 일부 및 미생물과 함께 발효시켜 에탄올을 수득할 수 있다.
제2 발효 베쓸은 혐기성 발효 베쓸일 수 있다.
본 발명의 제12 측면에 따라, 제11 측면에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인을 제공한다.
본 발명의 제13 측면에 따라,
(i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
(ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
(iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함하는 제1 단리 단계;
(v) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 것을 포함하는 제1 재도입 단계;
(vi) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계;
(vii) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 것을 포함하는 제2 단리 단계; 및
(viii) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제2 발효 베쓸로 도입시키는 단계를 포함하는, 마이코프로테인 및 에탄올의 제조 및 단리를 위한 통합된 연속 방법을 제공한다.
본 발명의 제14 측면에 따라, 제13 측면에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인을 제공한다.
설명된 바와 같은 대안적인 특징 및 상이한 실시양태는 필요한 수정을 가하여 각각의 모든 측면 및 그의 각각의 모든 실시양태에 적용된다.
이제, 예로서, 도면을 참조하여 본 발명의 실시양태를 설명할 것이며, 여기서:
도 1은 본 발명의 한 실시양태에 따른 방법을 도시한 흐름도이고;
도 2는 본 발명의 제2 실시양태에 따른 방법을 도시한 흐름도이고;
도 3은 본 발명의 제3 실시양태에 따른 방법을 도시한 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 제4 실시양태에 따른 방법을 도시한 흐름도이다.
도 5는 (a) 디스크 스택 원심분리에 의한 분리 이전, (b) 디스크 스택 원심분리에 의한 제1 분리 이후, 및 (c) 디스크 스택 원심분리에 의한 제1 분리의 제2 예 이후에 수득된 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 배지를 포함하는 혼합물 중 필라멘트의 균사 길이의 이미지를 보여주는 것이다 (실험 1A).
도 6은 이전 호기성 발효 반응으로부터 (열 처리 후 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 단리된) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 발효 배지 중 순수한 글루코스 상에서의 마이코프로테인 (F. 베네나툼(F. venenatum))의 성장을 보여주는 것이다 (실험 2).
도 7은 발효 배지로서 글루코스 피드의 농도 및 유속이 고정된 연속 발효 반응에서 바이오매스 농도 대 글루코스 농도의 상관관계 그래프를 보여주는 것이다 (실험 3).
도 8은 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 연속 재순환이 배지 영양소 (다량영양소)에 미치는 효과를 보여주는 것이다 (실험 4).
도 9는 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 연속 재순환이 배지 영양소 (미량영양소)에 미치는 효과를 보여주는 것이다 (실험 4).
도 1을 참조하면, 마이코프로테인을 제조 및 단리시키는 방법이 제시되어 있다. 글루코스가 풍부한 발효 배지 (10)를 제1 발효 베쓸 (20)에 첨가한다. 발효 배지 (10)는 물, 탄수화물, 질소 공급원 및 영양소를 포함한다. 탄수화물은 전형적으로 글루코스이다. 영양소는 전형적으로 염, 비타민 및 미량 금속으로부터 선택된다. 염은 전형적으로 황산칼륨, 인산칼륨, 황산마그네슘, 염화망가니즈, 아세트산칼슘, 염화칼슘, 황산철, 염화철, 황산아연, 염화아연, 황산구리, 염화구리, 염화코발트, 염화암모늄, 몰리브덴산나트륨, 수산화암모늄 및 인산암모늄으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다. 임의적으로 발효 배지에 첨가되는 다른 성분으로는 비오틴, 콜린 및 인산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
발효 배지 (10)를 30℃로 냉각시키고, 마이코프로테인-생산 미생물을 접종한다. 마이코프로테인 생산 미생물은 임의적으로 푸사리움 종으로부터 유래된 사상성 진균이며, 이는 전형적으로, 푸사리움 베네나툼이다.
호기성 조건은 배지를 통기시키고, 교반함으로써 유지된다.
호기성 발효의 생성물은 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 혼합물이다. 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)는 발효 배지로부터의 영양소 및 글루코스를 포함한다.
한 실시양태에서, 도 1에 제시된 바와 같이, 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 적어도 일부는 호기성 발효 후, 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 혼합물로부터 단리된다 (30). 단리 단계 (30)는 관련 기술분야에 공지된 임의의 고체-액체 분리 수단 및/또는 장치에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과 등. 호기성 발효로부터 수득된 혼합물은 고체가 풍부한 상 및 액체가 풍부한 상을 포함한다. 고체가 풍부한 상은 실질적으로 마이코프로테인 (60)을 포함하고, 액체가 풍부한 상은 실질적으로 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함한다. 단리 단계는 효율면에서 100%는 아니다. 그러므로, 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 적어도 일부는 혼합물로부터 단리되고 (30), 잔류 혼합물은 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함한다. 이어서, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 (20) 내로 재도입시킨다. 단리 단계 (30) 후, 이어서, 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 혼합물은 계속해서 마이코프로테인 제조 방법의 남은 단계를 거치게 될 것이다.
단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 제1 발효 베쓸 (20)로의 재순환은 발효 배지 (10) 중 물, 글루코스 및/또는 영양소 내용물을 복위시킨다. 그러므로, 제1 발효 베쓸 (20)로 도입된 발효 배지 (10)의 부피는 감소될 수 있다. 발효 배지 (10)에 필요한 물 부피의 감소는, 호기성 발효 공정에서 사용되는 물이 발효 배지 (10)에서 사용되기 전, 사전 처리를 필요로 하기 때문에 작동 비용을 절감시킬 것이다. 이는 또한 상기 방법에 의해 생성된 폐 배출물의 부피도 감소시킬 것이다. 발효 배지 (10) 및 폐 배출물, 둘 모두에서 상기와 같은 물 감소는 마이코프로테인 제조 방법을 운영하는 대용량 공장 (전형적으로, 10,000 L 내지 700,000 L)에 기인하여 마이코프로테인 제조 방법의 탄소 족적을 유의적으로 감소시킨다.
호기성 발효 직후 제1 발효 베쓸 (20) 내로 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 재도입시킴으로써, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)는 마이코프로테인 발효에 필요한 영양소 및 글루코스를 여전히 포함할 것이다.
도 1에 제시된 바와 같이, 이어서, 단리 단계 (30) 후, 존재할 수도 있는 핵산, 예컨대, RNA를 분해시키기 위해, 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 배지 (50)를 포함하는 혼합물에 대해 열 처리 단계 (40)를 수행한다. 열 처리 (40) 이전에 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 적어도 일부를 단리시키는 것 (30)의 이점은 열 처리 (40)를 수행하는 데 필요한 혼합물의 부피가 유의적으로 감소된다는 점이다. 그 결과 처리 시간이 단축되고, 증기, 전기, 폐기물 처리 및 처리에 대한 요구 사항이 감소하여 공정 운영 비용이 감소된다.
열 처리 (40) 후, 제2 단리 단계 (30)를 수행하여 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 배지 (50)의 적어도 일부를 단리시킨다. 이어서, 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)을 포함하는 혼합물에 대해 추가의 처리 단계를 수행하여 단리된 마이코프로테인 (60)을 제공한다. 도 2 내지 4에서 설명된 바와 같이, 제2 단리 단계 (30)로부터의 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 폐 배출물로서 공정으로부터 처리 또는 배출시킬 수 있거나, 공정에서 재순환될 수 있다.
도 2를 참조하면, 열 처리 (40) 후에 수득된 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 (20)로 재순환 또는 재도입시키는 것인, 본 발명의 제2 실시양태가 제시되어 있다.
상기 단계에서, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 제1 발효 베쓸 (20)로 재도입시키기 전, 추가의 멸균 단계가 요구된다. 이는 전형적인 마이코프로테인 생산 공장의 디자인에서, 제2 단리 단계 (30)는 전형적으로 비멸균 조건하에서 원심분리에 의해 수행되기 때문이다. 그러므로, 제1 발효 베쓸 (20)로 재도입시키기 전에, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)에 대해 가열-멸균 또는 여과-멸균을 수행할 수 있다. 가열-멸균은 열 교환기를 사용하여 수행될 수 있다.
도 3을 참조하면, 열 처리 (40) 전 및 열 처리 (40) 후에 수득된 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 (20)로 재순환 또는 재도입시키는 것인, 본 발명의 제3 실시양태가 제시되어 있다.
제1 단리 단계 (30) 후 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 재도입은 공정이 상기 단계에서 멸균성이기 때문에, 추가 멸균 단계를 필요로 하지 않는다.
도 4를 참조하면, 마이코프로테인 제조 방법이 기존 에탄올 바이오리파이너리와 통합된 것인, 본 발명의 제4 실시양태가 제시되어 있다. 도 4에서, 마이코프로테인 제조 방법을 위한 발효 배지 (10)는 에탄올 공정으로부터 수득된다.
전형적인 에탄올 바이오리파이너리에서 바이오매스 공급원료, 예컨대, 밀, 옥수수 또는 사탕수수는 혐기성 발효를 거쳐 에탄올을 생성한다.
공급원료, 예컨대, 전분이 풍부한 곡물, 예컨대, 밀 또는 옥수수를 공급원료 처리 탱크에서 밀링하거나, 또는 그라인딩하여 곡분을 생성한다. 곡분을 매시 탱크에 첨가하고, 물 및 효소, 예컨대, 아밀라아제와 혼합하여 매시를 생성한 후, 이어서, 가열하여 공급원료로부터의 전분을 발효성 당으로 가수분해시킨다. 매시 탱크는 2 단계로 가열한다: 매시를 2시간 동안 85℃로 가열한 후, 이어서, 온도를 60℃로 낮추고, 60℃에서 4시간 동안 유지시킨다. 이어서, 글루코스가 풍부한 생성된 가수분해된 매시를 호기성 발효 반응을 위한 발효 배지 (10)의 일부로서 사용한다.
가수분해된 매시 (10)의 일부를 매시 탱크로부터 제거하고, 제1 발효 반응 베쓸 (20)에 제공한다. 제1 발효 반응 베쓸 (20)에 첨가하기 전에 가수분해된 매시를 임의적으로 여과 멸균하고, 당화 단계를 수행한다. 여과 멸균 공정은 가수분해된 매시를 원심분리한 후, 이어서, 임의적으로, 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과하는 것을 포함한다. 이어서, 액체상을 제1 발효 반응 베쓸 (20)에 첨가한다.
이어서, 가수분해된 매시를 질소, 물 및 영양소 중 적어도 하나의 공급원과 혼합하여 상기 기술된 바와 같은 발효 배지 (10)를 생성한다.
도 4에서, 열 처리 (40) 전 및 열 처리 (40) 후에 수득된 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 (20)로 재순환 또는 재도입시킨다.
추가로, 열 처리 (40) 후에 수득된 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 제2의 적어도 일부를 제2 발효 반응 베쓸 (100)로 재도입시킨다. 온도를 30℃로 낮추고, 발효 배지에 알콜 생산 미생물, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시아에를 접종함으로써 혐기성 발효 반응 조건을 제2 베쓸 (100)에 도입시킨다.
혐기성 발효 반응을 거쳐 에탄올 (110) 및 잔류물을 포함하는 발효된 매시를 생성하고, 이는 증류 베쓸로 옮긴다. 증류 베쓸을 진공하에 63℃에서 작동시켜 발효 잔류물로부터 바이오에탄올 (110)을 분리시킨다. 이산화탄소가 발효 반응의 부산물로서 생성된다.
본 발명을 뒷받침하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
실험 1A: 열 처리 단계 전 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 배지 분리 (12 L)
표 1에 요약된 영양소를 12 L의 탈이온수에 첨가하여 발효 배지 (10)를 제조한다.
Figure pct00001
표 1: 발효 배지의 영양소 조성
배지 (10)를 제1 발효 베쓸 (20)에 첨가하고, 가열된 물 재킷을 이용하여 발효 베쓸 (20)을 가열함으로써 멸균시킨다. 온도를 121℃에서 30분 동안 유지시킨다. 멸균 전 제1 발효 베쓸 (20) 중의 모든 연결부를 조심히 주의를 기울여 고정시키고; 예를 들어, 고무 격막 및 각각의 칼라 피팅을 사용하여 모든 첨가 포트를 고정시킨다.
멸균 후, 제1 발효 베쓸 (20)을 주변 온도로 냉각시킨 후에 여과 멸균된 글루코스 (44 g/L), 비오틴 (0.000025 g/L) 및 콜린 히드로클로라이드 (0.087 g/L)를 연동 펌프를 사용하여 무균 조건하에서 제1 발효 베쓸 (20)로 옮긴다.
용존 산소 (DO) 프로브를 멸균 전에 발효 베쓸 (20) 내로 삽입한다. 이어서, 프로브를 멸균 후에 보정한다. 압축 공기 및 질소 가스를 사용하여 교반 속도 300 rpm 및 기류 10 L/min (1 VVM (분당 액체 부피당 공기 부피))하에 DO 프로브를 30℃의 발효 온도에서 보정한다. DO 프로브 보정 0%를 달성하기 위해 10 L/min의 속도로 질소 가스를 스파저를 통해 플러싱한다. 이어서, 유사하게, 100% 보정이 가능하도록 포화가 달성될 때까지 (즉, 일정한 판독값이 관찰될 때까지), 압축 공기를 발효 배지 (10)에 살포한다. 공기는 멸균 입구 필터 및 스파저를 통해 제1 발효 베쓸 (20)로 진입한다. 공기는 먼저 응축기를 통해 빠져나가 배지 (10)의 손실이 없도록 한 후, 이어서, 출구 필터를 통과한다. 이후, 적합한 염기를 사용하여 (본 실시예에서는 염기로서 35% 수산화암모늄이 사용) 발효 배지 (10)의 pH를 pH 6.0으로 조정한다.
발효 베쓸 (20)에 1% w/v 접종물 (탈이온수 중 푸사리움 베네나툼) 1 L를 첨가하여 발효를 개시한다. 이를 통해 최종 발효 배지 (10) 부피 13 L 및 접종물 농도 7.7% v/v를 얻는다. 가변 교반 (300 내지 1200 rpm) 및 통기 (1 내지 3 VVM)를 사용하여 용존 산소 수준 (DO-30%)을 유지하면서, 제어된 호기성 환경하에 30℃에서 발효를 수행한다. 발효 동안, 수산화암모늄 (35%)은 pH 제어 및 질소 공급원으로서, 이 둘 모두를 위해 사용된다.
대략 18 g/L 건조 중량의 바이오매스 (마이코프로테인) 농도를 달성할 때까지 계속해서 발효를 수행한다. 이어서, 제1 발효 베쓸 (20)에 (표 1에 요약되어 있는) 추가의 신선한 발효 배지를 미생물의 성장률 (대략 0.2 h- 1)와 동일한 속도로 첨가하여 발효를 유지시킨다. 신선한 발효 배지를 대략 3.5시간 동안 첨가하여 대략 20 g/L의 최종 바이오매스 (마이코프로테인) 농도를 수득한다.
마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 생성된 혼합물을 단리, 또는 분리 (30)를 위해 발효 베쓸 (20)로부터 제거한다.
본 실험에서, 디스크 스택 원심분리기를 이용하여 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 배지 (50)를 분리한다. 그러나, 다른 분리 기술이 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 여과 또는 십자류 여과.
혼합물을 대략 10 L/h의 유속으로 디스크 스택 원심분리기에 공급한다. 디스크 스택 원심분리기를 1시간 동안 대략 10,000 g의 원심력으로 작동시켰다. 본 실시예에서 사용된 디스크 스택 원심분리기는 GEA, 웨스트팔리아 패스파인더(Westfalia Pathfinder) PSC 1이었고, 디스크 간격을 0.77 mm로 세팅하였다.
본 단계 동안, 고체는 보울 내에 포획되는 동안, 액체상은 연속하여 원심분리기로부터 수집된다. 일단 보울 내의 고체 부피가 최대 용량 (1L)에 도달하고 나면, 고체상을 배출시키고, 이는 슬러리/페이스트로서 수집된다. 슬러리는 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함한다.
디스크 스택 분리로부터 수집된 총 건조 바이오매스는 127.8 g/L이다. 디스크 스택 분리로부터 예상되는 건조 바이오매스는 169.4 g/L이다 (혼합물 중 바이오매스의 건조 중량 (18 g/L)에 발효된 발효 배지의 부피 (9.41 L)를 곱하여 산출). 따라서, 디스크 스택 분리로부터의 고체 회수율은 75%이다.
본 실시예의 조건하에서, 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물의 부피는 기술된 단리, 또는 탈수 단계를 사용하여 고체 농도에 의해 92%만큼 감소되었다. 수집된 슬러리/페이스트의 바이오매스 농도는 대략 18% (w/w) 고체이다. 그러나, 이는 하류 마이코프로테인 공정 단계를 통해 진행되는 물질의 고체/액체 함량에 관한 하류 공정 요건에 따라 고체 배출 간격 또는 공급 유속을 변경함으로써 조정될 수 있다.
제2 디스크 스택 분리는 임의적으로 제1 디스크 스택 분리 이후에 수행될 수 있다. 잔류 물질 (즉, 제1 분리 후 원심분리기에 남아있는 물질)을 유속으로 20, 30 및 40 L/h로 증가시켜 가면서 원심분리한다. 제2 원심분리의 목적은 강제로 고체가 원심분리기로부터 완전히 돌파하게 하는 것이다.
혼합물 중 마이코프로테인 필라멘트의 균사 길이를 측정하여 디스크 스택 원심분리기가 균사 길이에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다.
마이코프로테인과 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물은 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 분석하였고, 생성된 이미지는 도 5에 제시되어 있다. 파지 대비 모드로 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TE2000-S 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고, 이미지 J(Image J) 추적 소프트웨어를 사용하여 개별 균사 길이를 측정하였다. 샘플당 대략 10개의 사진을 캡처하고, 분석하여 각 샘플의 평균/중앙값 균사 길이를 산출하였다.
도 5 (a)는 마이코프로테인 발효로부터 수득된 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 혼합물의 두 이미지를 보여주는 것이다. 별개의 배치 7개를 분석하였고, 평균 균사 길이는 하기 표 2에 요약되어 있다. 도 5 (b)는 제1 디스크 스택 분리 이후에 회수된 고체상 (마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물)의 두 이미지를 보여주는 것이다. 한 배치를 분석하였고, 평균 균사 길이는 하기 표 2에 요약되어 있다. 도 5 (c)는 제1 디스크 스택 분리의 두 번째 예 후에 회수된 고체상 (마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물)의 두 이미지를 보여주는 것이다. 한 배치를 분석하였고, 평균 균사 길이는 하기 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00002
표 2: (i) 단리 전 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물 ( 마이코프로테인 브로쓰 ); 및 (ii) 디스크 스택 원심분리로부터 회수된 고체상에 대한 균사 길이 측정.
마이코프로테인 브로쓰 - 7 및 2개의 원심분리된 샘플 비교 결과, 제1 및 제2 분리에 대한 균사 길이 감소는 각각 39% 및 30%인 것으로 산출되었다. 그러나, 다른 마이코프로테인 브로쓰 배치에 적용하였을 때, 39% 감소는 평균 균사 길이가 여전히 > 200 ㎛인 결과를 초래할 것이다.
혼합물은 열 처리 전에 중력 침전이 아니기 때문에, 전통적인 분리 기술을 사용하여 열 처리 전에 혼합물을 분리하는 것은 어렵다. 그러나, 이 실험은 열 처리 전에 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물의 분리가 가능하고, 디스크 스택 원심분리기를 사용하면 마이코프로테인 필라멘트에서 합리적인 균사 길이를 유지한다는 것을 보여준다.
이어서, 고체상은 최종 생성물을 분리하기 위해 마이코프로테인 제조 방법의 남은 단계를 거치게 된다.
액체상 (단리된 부분적으로 소모된 발효 배지)은 발효 배지 (10) 중 신선한 물에 대한 요건을 대체함으로써 마이코프로테인 발효 공정으로 다시 재순환될 수 있다. 이 단계는 액체상이 영양이 풍부하고, 열 처리에 의해 분해되지 않기 때문에 원료 비용을 절감시키고, 액체상을 폐 배출물로 처리하는 비용과 환경 부하를 감소시킨다.
실험 1B: 열 처리 단계 전 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 배지 분리 (18 L)
실험 1A에 따른 추가 실시예를 하기와 같이 수행한다.
작업 부피 18 L를 위해 표 1에 따라 발효 배지 (10)를 제조한다. 발효 배지 (10)를 30 L 발효 베쓸 (20)에 첨가하고, 121℃에서 30분 동안 계내에서 멸균시킨다. 멸균 사이클 종료시, 발효 베쓸 (20)을 30℃로 냉각시키고, 교반은 200 rpm으로, 및 기류는 1 VVM로 세팅한다.
비오틴 용액 (0.000025 g/L) 및 콜린 히드로클로라이드 용액 (0.087 g/L)을 여과 멸균하고, (121℃에서 20분 동안 오토클레이브된) 가열 멸균된 글루코스 용액 에 무균적으로 첨가한다. 이어서, 글루코스/비오틴/콜린 용액을 무균적으로 발효 베쓸 (20)로 옮긴다.
이어서, 25% 수산화암모늄 용액을 사용하여 발효 배지 (10)의 pH를 pH 6.0으로 조정하고, DO 프로브를 100% 산소로 보정되고, 교반기, 이어서, 기류에 의한 캐스케이드를 통해 DO를 30%로 제어하도록 세팅한다.
대략 5 g/L 바이오매스 농도로 시드 배양물 중에서 성장한 10% 작업 부피의 푸사리움 베네나툼을 발효 베쓸 (20)에 접종한다.
발효는 바이오매스가 후기 지수기에 도달하고, 바이오매스 (마이코프로테인) 농도가 12 g/L 건조 중량으로 일정할 때까지, 발효를 배치 모드로 작동시킨다.
마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 생성된 혼합물을 수확하였고 (마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 배지 (50) 제거), 여기서 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)는 탈수 단계를 거쳐 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)의 일부를 분리하고, 이는 공정으로 다시 재순환하는 데 이용가능하다.
(마이코프로테인을 포함하는) 탈수 단계로부터의 고체 분획을 RNA 감소 단계, 및 최종 고체 액체 분리를 통해 추가로 처리하여 식품 성분으로서 사용하기 위한 25% 고체 마이코프로테인 페이스트를 생성할 수 있다.
본 실시예에서 탈수 단계를 위해 디스크 스택 연속 원심분리기가 사용될 수 있다. 디스크 스택 원심분리기는 보울 속도 10,000 g 및 유속 12 L/h로 작동하였다. 디스크 스택 보울의 액체 수용 부피는 1 L였고, 이는 물을 펌핑하여 보울을 충전시키고, 유동이 센트레이트 라인에 출현하였을 때 첨가된 부피를 기록함으로써 확인하였다. 배출 간격은 보울에 로딩된 고체의 양에 의해 결정되었고, 예컨대, 2 L의 피드 중 총 24 g의 고체가 첨가되고, 2 L의 피드 첨가 후 배출되면, 24 g이 1 L 부피로 배출되어 고체/농축물 비는 2.4%가 되고, 이로써, 50% 탈수가 이루어진다.
본 실험 1B에서 5개의 예를 수행하였으며, 각 예는 탈수 비율을 변경하여 제어 정도 및 실행가능한 탈수 정도를 입증하는 것을 목표로 하고 있다.
본 실험 1B의 목적은 실험 1B, 실시예 2에 예시된 바와 같이, 부분적으로 소모된 발효 배지의 50%만큼의 탈수를 입증하는 것이었다. 실시예 2에서 보출 용량의 2배 (2 L)를 디스크 스택에 공급하고, 2 L 브로쓰를 첨가한 후, 보울 중 고체를 배출하였다. 배출 지점에서 보울은 이론상 24 g의 고체 및 1 L의 센트레이트를 포함하며, 남은 1 L는 연속해서 센트레이트 (소량의 고체 분획)로서 보울에서 배출된다. 보울에서 배출된 물질 (농후 물질)을 고체 (건조 고체) 비율에 대해 측정하여 탈수율 및 농축 계수를 계산하였다.
50% 탈수의 경우 (실험 1B, 실시예 2), 농후 물질 분획의 고체 함량은 2.34%였고 (이론값 = 2.4%), 따라서, 부분적으로 소모된 발효 배지를 49%만큼 탈수시켰다. 작동상의 관점에서, 제거된 센트레이트는 추가 가열 멸균 없이 연속 발효 동안 발효 베쓸로 복귀될 수 있다.
실시예 1, 3, 4 및 5를 수행하여 방법 요건에 의존하여 제조 동안 적용될 수 있는 표적 탈수율(%) 감소 또는 증가하에 탈수 단계를 입증하였다 (표 3 참조).
Figure pct00003
표 3: 실험 1B로부터의 디스크 스택 탈수 실시예 1 - 5
실험 1C: 열 처리 단계 전 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 배지 분리 (100 L)
실험 1A에 따른 추가 실시예를 하기와 같이 수행한다.
작업 부피 100 L를 위해 표 1에 따라 추가의 발효 배지 (10)를 제조하였다. 발효 배지 (10) (글루코스, 비오틴 및 콜린 포함)를 베쓸로 여과하기 전에, 300 L 발효 베쓸 (20)에 대해 증기 멸균 (SIP)을 수행하였다.
작동 파라미터 (온도, 기류, 압력, DO)는 실험 1A 및 1B에 따라 세팅하였다. 발효 베쓸 (20)에 14 g/L의 바이오매스 (마이코프로테인) 농도로 10 L의 시드 배양물 (푸사리움 베네나툼)을 접종하였다.
바이오매스가 5 g/L 농도에 도달할 때까지, 발효 베쓸 (20)을 배치 모드로 작동시켰다. 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 생성된 혼합물을 40 L/h 유속으로 발효 베쓸 (20)로부터 수확하고, 열 처리 없이 디캔터 연속 원심분리기에 공급하였다.
혼합물을 고체 함량 ≤10% 건조 고체로 탈수시키는 것으로 목표로 하여 디캔터 보울 속도 및 분별 속도 세팅을 5개의 실시예 간에 걸쳐 변경시켰다 (표 4 참조).
Figure pct00004
표 4: 실험 1C를 위한 디캔터 탈수 실시예 1 내지 5.
실시예 1 내지 5에 또한 수조에서 가열 쇼크 (73℃, 20분)를 가하였다. 이는 총 RNA 함량을 신선한 바이오매스 중 11%의 근사치 값으로부터 인간 섭취를 위해 및 본 출원인의 명세서 준수를 위해 요구되는 <2%로 감소시키는 데 있어 열 처리의 효과를 입증한다. (현행 마이코프로테인 제조에서 처리될 때의 1.6% 고체와 비교하여) 고체 로드 증가는 물질로의 열 전달에 영향을 미칠 것이다. 그러나, 표 5의 데이터는 12%의 총 고체 (120 g/L 바이오매스 농도와 등가)만큼 밀도가 높은 바이오매스 용액에서 충분한 RNA 감소를 입증한다.
열 처리 전 상기 수준의 탈수는 최종 식품 성분으로 25% 고체 페이스트를 생성하기 위해 RNA 감소 단계 동안 73℃로 가열하는 데 필요한 물질의 부피를 극적으로 감소시키는 이점이 있을 것이다.
Figure pct00005
표 5: 실험 1C로부터의 샘플의 열 처리 후 RNA 분석.
실험 2: 열 처리 후 분리된 부분적으로 소모된 배지의 적어도 일부를 마이코 프로테인 발효로 재도입
호기성 발효을 수행하여 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 혼합물을 제공하였다.
혼합물에 대해 열 처리 (40)를 수행하여 미생물을 불활성화시키고, RNA 함량을 감소시키며, 존재할 수 있고, 후속 공정 단계를 방해할 수 있는 임의의 박테리아를 사멸시켰다.
혼합물을 여과에 의해 분리하여 고체상 (마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)를 포함하는 혼합물) 및 액체상 (단리된 부분적으로 소모된 배지 (50))을 제공하였다. 임의의 적합한 여과 기술에 의해 열 처리 후의 여과를 수행할 수 있다. 본 실험에서, 와트만(Whatman) 정성적 여과지 (등급 4, 240 mm)를 사용하여 진공 펌프 여과에 의해 분리하였다.
이어서, 단리된 부분적으로 소모된 배지 (50)를 후속 마이코프로테인 발효에서의 물로서 사용하였다.
후속 마이코프로테인 발효는 하기와 같이 제조하였다. 발효 배지 (10)는 표 6의 공급원료 성분을 이용하여 제조하였다.
Figure pct00006
표 6: 발효 배지 성분
표 6의 성분을 플라스크에 첨가하고, 제1 발효로부터의 단리된 부분적으로 소모된 배지 (50)를 사용하여 부피가 1 L가 되도록 만들었다.
재순환된 단리된 부분적으로 소모된 배지 (50)를 포함하는 배지 (10)를 30℃하에 150 rpm 궤도형 진탕기에서 배양된 푸사리움 베네나툼을 이용하여 플라스크에서 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 제공하였다.
발효 반응 개시 후 0, 4, 8, 20 및 24시간인 시간 간격으로 호기성 발효 반응을 HPLC에 의해 분석하였다. 완충제 (pH 7 및 pH 4)를 이용하여 보정된 pH 프로브 (메틀러-톨레도(Mettler-Toledo: 영국))를 이용하여 반응 pH를 모니터링하였다. 레젝스(Rezex)™ ROA-유기산 H+ (8%), LC 칼럼 (150 x 7.8 mm)이 장착된 애질런트 1290 인피너티 LC 시스템(Agilent 1290 Infinity LC System)을 이용하여 HPLC를 수행하였다. HPLC 조건은 하기와 같았다: 칼럼은 온도는 40℃로 유지되었고, 이동상은 0.005 N 황산이고, 유속은 0.5 mL/min이었다.
실험은 이중으로 수행하였고, 결과는 도 6에 제공되어 있다. 처음 24시간 동안 대략 11 g/L의 바이오매스 (마이코프로테인)가 생성되었고, 글루코스 농도는 대략 13 g/L에서 0 g/L로 감소하였다. pH는 처음 8시간 동안 대략 pH 6으로 유지된 후, 이어서, 24시간까지 pH 4로 감소하였다.
바이오매스 수율은 24시간 동안의 바이오매스 농도 변화를 24시간 동안의 글루코스 농도 변화로 나누어 계산하였다. 이 계산을 사용하였을 때, 바이오매스 수율은 0.75 Yx/s였다.
증류수를 사용한 마이코프로테인 발효의 바이오매스 수율 (즉, 재순환된 단리된 부분적으로 소모된 배지를 사용하지 않은 경우)은 대략 0.5 Yx/s였다 (데이터는 제시되지 않음).
따라서, 본 실험은 마이코프로테인 발효의 바이오매스 수율은 발효 배지 (10) 중 재순환된 단리된 부분적으로 소모된 배지 (50)를 증류수로 대체하는 것에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 단리된 부분적으로 소모된 배지를 사용하여 약간 더 높은 바이오매스 수율을 얻었다. 이론에 얽매이지 않고, 이는 미생물이 부분적으로 소모된 배지 (50)에 존재하는 아미노산과 같은 다른 생성물을 대사할 수 있기 때문일 수 있다.
실험 3: 부분적으로 소모된 배지 재순환 스트림 제어
실험 1A에 요약된 발효 배지 (10) 및 조건을 사용하여 연속 호기성 발효를 수행하였다.
도 7은 연속 발효 반응에서의 바이오매스 농도 대 글루코스 농도의 상관관계 그래프를 보여주는 것이다. 이러한 상관관계를 이용하여 발효 반응 동안 바이오매스 판독값으로부터 글루코스 농도를 외삽할 수 있다.
이어서, 발효 반응에 필요한 재순환된 단리된 부분적으로 소모된 배지 및 발효 배지의 부피를 결정할 수 있다. 이러한 이론상의 실험은 글루코스 농도 제어를 기반으로 하지만, 발효 배지 중의 임의의 다른 성분 제어에도 기반하여 동일하게 계산을 수행할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
표 7의 데이터를 이용하여 공정에서 단리된 부분적으로 소모된 배지의 50% 재순환을 이용하여 마이코프로테인 발효를 수행하는 데 필요한 단리된 부분적으로 소모된 배지의 부피 및 발효 배지의 부피를 계산하였다.
Figure pct00007
표 7: 단리된 부분적으로 소모된 배지의 50% 재순환을 이용하여 마이코프로 테인 발효를 수행하는 데 필요한 부분적으로 소모된 배지의 부피 및 발효 배지의 부피를 계산하는 데 사용된 데이터.
표 7의 데이터를 사용하여, 필요한 발효 배지 및 부분적으로 소모된 배지 부피, 및 발효 베쓸로의 33 g/L 글루코스의 연속 피드를 유지시키는 데 필요한 농도를 계산할 수 있다.
결과를 하기 표 8에 제공되어 있다.
Figure pct00008
표 8: 부분적으로 소모된 배지의 50% 재순환을 이용하여 마이코프로테인 발효를 수행하는 데 필요한 부분적으로 소모된 배지의 부피 및 발효 배지의 부피.
이는 재순환 단계를 도입함으로써 발효 배지 중 물의 부피가 약 15,000 L까지 감소될 수 있다는 것을 보여준다. 이를 통해 마이코프로테인 제조 방법의 비용 및 에너지는 상당부 절감된다.
마이코프로테인 제조 방법을 에탄올 바이오리파이너리와 통합하면, 공장 규모가 더 커짐에 따라 비용 절감은 더욱 크게 나타난다. 예를 들어, 전형적인 통합 방법에서, 48,000 kg/hr의 물이 호기성 발효 베쓸 (20)에서 발효 배지 (10)를 위해 바이오리파이너리로부터 제공된다. 마이코프로테인 제조 방법 후에, 에탄올 바이오리파이너리로 복귀하여 혐기성 발효를 거치는 물의 부피는 46770 kg/hr이다. 그러나, 마이코프로테인 발효 공정으로부터 부분적으로 소모된 배지를 재순환시킴으로써, 발효 배지 (10)로서 바이오리파이너리로부터 요구되는 물은 24000 kg/hr로 감소된다. 추가로, 에탄올 바이오리파이너리로 복귀하여 혐기성 발효를 거치는 물의 부피는 23,150 kg/hr로 감소된다. 이는 혐기성 발효 단계에서 증가된 물 투입으로 인한 바이오에탄올 공정에 미치는 영향을 감소시키고, 공정으로부터 배출되는 폐 배출물도 또한 감소시킨다.
실험 4: 부분적으로 소모된 배지의 연속 재순환이 배지 영양소에 미치는 영향 측정
표 9에 요약된 영양소를 탈이온수에 첨가하여 발효 배지 (10)를 제조한다.
Figure pct00009
표 9: 발효 배지의 영양소 조성
배지 (10)를 제1 발효 베쓸 (20)에 첨가하고, 발효 베쓸 (20) 둘레의 열 재킷으로의 증기 도입을 사용하여 가열-멸균함으로써 멸균시킨다. 온도를 30분 동안 121℃로 유지시킨다. 멸균 전, 제1 발효 베쓸 (20) 중의 모든 연결부를 조심히 주의를 기울여 고정시키고; 예를 들어, 고무 격막 및 각각의 칼라 피팅을 사용하여 모든 첨가 포트를 고정시킨다.
멸균 후, 제1 발효 베쓸 (20)을 주변 온도로 냉각시킨 후에 여과 멸균된 글루코스 (44 g/L), 비오틴 (0.00005 g/L), 미량 염 (Fe, Cu, Mn, Zn) 및 콜린 히드로클로라이드 (0.087 g/L)를 연동 펌프를 사용하여 무균 조건하에서 제1 발효 베쓸 (20)로 옮긴다.
용존 산소 (DO) 프로브를 멸균 전에 발효 베쓸 (20) 내로 삽입한다. 이어서, 프로브를 멸균 후에 보정한다. 압축 공기 및 질소 가스를 사용하여 교반 속도 300 rpm 및 기류 10 L/min (1 VVM)하에 DO 프로브를 30℃의 발효 온도에서 보정한다. DO 프로브 보정 0%를 달성하기 위해 10 L/min의 속도로 질소 가스를 스파저를 통해 플러싱한다. 이어서, 유사하게, 100% 보정이 가능하도록 포화가 달성될 때까지 (즉, 일정한 판독값이 관찰될 때까지), 압축 공기를 발효 배지 (10)에 살포한다. 공기는 멸균 입구 필터 및 스파저를 통해 제1 발효 베쓸 (20)로 진입한다. 공기는 먼저 응축기를 통해 빠져나가 배지 (10)의 손실이 없도록 한 후, 이어서, 출구 필터를 통과한다. 이후, 적합한 염기를 사용하여 (본 실시예에서는 염기로서 35% 수산화암모늄이 사용) 발효 배지 (10)의 pH를 pH 6.0으로 조정한다.
발효 베쓸 (20)에 1% w/v 접종물 (탈이온수 중 푸사리움 베네나툼) 1 L를 첨가하여 발효를 개시한다. 이를 통해 발효 베쓸 중 최종 농도 10% v/v의 접종물을 제공한다. 가변 교반 (300 내지 1200 rpm) 및 통기 (1 내지 3 VVM)를 사용하여 용존 산소 수준 (DO-30%)을 유지하면서, 제어된 호기성 환경하에 30℃에서 발효를 수행한다. 발효 동안, 수산화암모늄 (35%)은 pH 제어 및 질소 공급원으로서, 이 둘 모두를 위해 사용된다.
발효 완료 후, 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물에 대해 열 처리를 수행하여 미생물을 불활성화시키고, RNA 함량을 감소시킨다.
혼합물을 여과에 의해 분리하여 고체상 (마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 발효 배지 (50)) 및 액체상 (단리된 부분적으로 소모된 배지 (50))을 제공한다. 임의의 적합한 여과 기술에 의해 열 처리 후의 여과를 수행할 수 있다. 본 실험에서, 와트만 정성적 여과지 (등급 4, 240 mm)를 사용하여 진공 펌프 여과에 의해 분리하였다.
이어서, 단리된 부분적으로 소모된 배지 (50)를 여과 멸균시키고, 후속 마이코프로테인 발효의 배지 중 물로서 사용한다.
본 실험은 배지 재순환이 발효 배지 중 영양소에 미치는 영향을 결정하기 위해 6회 반복하였다.
구체적으로, 제1 배치를 상기 요약된 바와 같이 제조하였고, 열 처리 단계 후 발효 종료시 마이코프로테인 (60) 및 부분적으로 소모된 배지 (50)를 포함하는 혼합물 중 칼륨, 술페이트, 포스페이트, 칼슘, 마그네슘 및 글루코스의 농도를 측정하였다.
발효 배지 중 5 L의 물을 제1 배치로부터의 5 L의 단리된 부분적으로 소모된 배지 (50)로 대체시킴으로써 제2 배치를 제조하였다. 제2 배치로 도입시키지 전에 단리된 부분적으로 소모된 배지를 여과 멸균시킨다. 제2 배치에서 발효 배지에 대한 모든 다른 배지 성분은 제1 배치에 대한 것과 동일하였다.
다음 4개의 배치는 유사한 방식으로 제조되었으며, 여기서 이전 배치로부터의 5 L의 단리된 부분적으로 소모된 배지 (50)를 각각의 후속 배치에 첨가하였다.
본 결과는 도 8 및 9에 제시되어 있다. 특히, 데이터는 배지 영양소가 대략 4회의 후속 발효 후에 평형에 도달한다는 것을 보여준다. 마그네슘은 발효 중 가장 많이 소비되는 배지 성분이며, 실험 3에서 요약된 바와 같이 재순환 전략법을 결정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 재순환된 단리된 부분 발효된 배지 중 영양소 축적은 미생물 또는 마이코프로테인 생성물에 해로운 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
실험 5: 탈수된 부분 발효된 배지 재순환
표 10에 제시된 바와 같은 발효 배지 조성을 이용하고, 실험 1A에 요약된 조건 및 절차를 사용하여 10 L, 150 L 및 200 L 교반 탱크 반응기 (발효 베쓸)에서 다회에 걸친 연속 발효를 수행하였다. 사용시, 및 부분적으로 소모된 발효 배지가 원래의 발효 배지와 조합될 때, 그렇게 형성된 연속 발효 배지는 표 10에 요약된 바와 같은 성분을 포함한다. 성분은 글루코스 및 영양소를 포함한다. 질소 공급원도 필요하며, 별도의 독립적인 제어하에 첨가된다.
Figure pct00010
표 10: 발효 배지 및/또는 연속 발효 배지 (부분적으로 소모된 발효 배지 및 원래 발효 배지) 중 성분의 양
본원에 요약된 실험에서, 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시킨 후, 이어서, 발효 베쓸로 재도입시켜 원래 발효 배지와 혼합하고, 연속 발효 배지를 형성한다. 이를 수행할 때, 탄수화물 (예를 들어, 글루코스)의 양은 발효 전, 발효 배지 중 적어도 15g/L, 임의적으로 33 g/L인 농도로 유지된다. 다른 영양소는 발효 전, 발효 배지 중 표 10에서 언급된 농도 범위 이내로 유지된다. 질소 공급원 (예컨대, 수산화암모늄, 요소, 기체 암모니아)을 첨가하고, 탄수화물 및 다른 영양소 피드와 별개로 제어한다.
발효 조건 뿐만 아니라, 발효 배지는 본원에 요약된 실험에 대해 것과 유사하였다. 연속 단계 동안의 희석률은 0.17 h-1 내지 0.2 h-1에서 변하는 마이코프로테인 유기체의 비 성장률과 매칭되도록 조정되었다. 발효 베쓸로의 연속 배지의 유동 및 발효 브로쓰의 수확은 유기체의 성장률 (즉, 0.17 h-1 내지 0.2 h- 1)와 매칭되도록 조정된다. 베쓸 부피 X 성장률 = 희석률 (L/h)이다.
이러한 정상 상태 연속 발효 전 기간 동안 다양한 시점에서 농축물 샘플을 채취하고, 각 시점에서 발효 베쓸 내의 바이오매스 농도를 (발효 배지의 건조 세포 중량 측정을 통해) 기록하였다. 원심분리 후 (예컨대, 디캔터 원심분리기에 의한 원심분리 후), 액체 스트림으로부터 센트레이트 샘플을 채취하였다.
이어서, 상관관계를 추정하고, 글루코스 및 각 영양소 요소 또는 이온에 대한 수율 계수 (Yx/s = 기질의 단위 질량당 바이오매스 수율)를 계산하였다. 이는 표 11에 예시되어 있다.
Figure pct00011
표 11: 바이오매스에 대한 수율 계수
상기 표 11의 값을 임의의 주어진 시점에서의 발효 베쓸 중의 공지된 바이오매스 농도와 조합하여 사용함으로써 연속 발효 배지 중 글루코스 (또는 다른 영양소)를 정확한 양으로 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 사용자가 주어진 바이오매스 농도를 포함하는 발효 베쓸에서 배출되는 센트레이트의 예상 배지 조성을 계산할 수 있게 하는 글루코스 활용 데이터를 사용하여 연속 발효로 공급되는 원래의 비발효 발효 배지의 양 또는 성분은, 적어도 부분적으로 소모된 발효 배지와 함께 조합되었을 때, 표 10에서 언급된 모든 배지 성분의 작업 농도가 일정하게 유지되는 정확한 조성으로 조정된다.
더욱 상세하게, 표 10 및 11의 값을 사용하고, 변수 (예컨대, 바이오매스 농도, 유기체의 비 성장률 및/또는 발효 베쓸의 작업 부피) 중 적어도 일부를 알고 있는 경우, 부분적으로 소모된 발효 배지의 특정 성분의 예상 농도를 계산할 수 있다. 차례로, 이는 연속 발효 배지 (즉, 부분적으로 소모된 발효 배지 및 원래 발효 배지, 둘 모두를 포함 및/또는 함유하는 것)의 성분이 예를 들어, 표 10에 제시된 범위 내에서 유지되도록 원래 (즉, 이전에 발효되지 않은) 발효 배지에 대해 이루어질 수 있는 균형화 또는 수정을 계산하는 데 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 각 이온 종의 예상 소비량을 계산할 수 있으며, 발효 베쓸로 들어가는 원래 발효 배지 ("신선한" 피드)는 원래 발효 배지의 양 또는 성분을 감량시키거나, 또는 다르게는 수정함으로써 발효 베쓸로 또한 들어가는 재순환된 부분적으로 소모된 발효 배지와 균형화될 수 있다.
이를 나타낸 방정식은 하기와 같다:
Figure pct00012
여기서:
A = (상기에서 언급된 바와 같은) 수율 계수 (g/g)
B = "신선한" 피드의 작업 농도 (g/L)
C = "재순환" 피드 스트림의 작업 농도 (g/L)
X = 발효기 내 바이오매스의 건조 세포 중량 (g/L)
μ = 유기체의 성장률 (h-1)
V = 발효기의 작업 부피
Qf = 재순환의 부피 유속 (L/h).
우측에 있는 항은 재순환 시작시 'B'의 농도를 조정하는 데 사용될 수 있다.
발효 베쓸로 복귀되는 적어도 부분적으로 소모된 발효 배지의 비율은 (부분적으로 소모된 발효 배지의 총량 대비) 1부피% 내지 최대 95부피%로 달라질 수 있지만, 전형적으로는, 40부피% 내지 60부피%이고, 가장 전형적으로는, 50부피%이다.
이러한 방식으로, 신선한 물 사용 중 상당부가 공정에서 제거되고, "폐" 수 및 사용되지 않은 글루코스, 질소 및 영양소의 공급원 (적어도 부분적으로 소모된 발효 배지 중에 있는 것)은 제2 발효 (예컨대, 알콜 생산을 위한 효모 발효)로 진행되거나, 또는 대안적으로, 폐수 처리 공정으로 진행되기보다는 재순환될 수 있다.
본원에 기술된 개선된 방법은 마이코프로테인을 수득하는 데 있어 효율적이고, 비용면에서 효과적인 방법을 제공한다. 본 방법은 기존 에탄올 바이오리파이너리에 도입될 수 있으며, 기존 방법에 대한 추가 화학물질 또는 변형도 요구되지 않는다. 또한, 방법으로부터 배출되는 폐 배출물을 현저히 감소시키고, 공급원료의 부피를 줄이며, 처리 시간을 단축시킨다. 이를 통해 마이코프로테인을 제조하는 데 있어 더욱 효율적이고, 비용면에서 효과적이며, 환경 친화적인 방법을 얻을 수 있다.
본 발명은 그의 샘플 실시양태를 참조하여 설명되었지만, 전체적으로 본 발명의 정신 및 범주를 벗어남 없이, 본 발명의 구조 및 요소에 대한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다.

Claims (25)

  1. (i) 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 발효 배지를 제공하는 단계;
    (ii) 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계;
    (iii) 발효 배지를 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
    (iv) 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계; 및
    (v) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계를 포함하는, 마이코프로테인의 제조 및 단리를 위한 연속 방법.
  2. 제1항에 있어서, 발효 배지가 마이코프로테인을 제조하는 데 적합한 탄수화물을 포함하고, 임의적으로, 여기서 탄수화물이 당이고, 임의적으로, 여기서 탄수화물이 글루코스, 수크로스 또는 그의 공급원인 방법.
  3. 제2항에 있어서, (a) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 일부를 재도입시킨 후 발효 배지를 제공하는 것; 및 (b) 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 재도입시키는 것 중 적어도 하나가 발효 전에 과량의 탄수화물을 유지하도록 구성되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 발효 전에 과량의 탄수화물을 유지하는 것이 (a) 부분적으로 소모된 발효 배지 중 탄수화물의 농도를 결정하고; (b) 제1 발효 베쓸에 도입된 발효 배지를 조정하여 발효 전에 과량의 탄수화물을 유지하는 것을 포함하고, 임의적으로, 여기서 발효 배지를 조정하는 것은 제공된 발효 배지의 양; 및 그 안의 탄수화물 농도 중 적어도 하나를 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발효 베쓸이 호기성 발효 베쓸인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지를 미생물과 함께 발효시켜 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 수득하고, 임의적으로, 여기서 미생물은 사상성 진균이고, 임의적으로, 여기서 사상성 진균은 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 리조푸스(Rhizopus) 종 및 푸사리움(Fusarium) 종으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택되고, 임의적으로, 여기서 미생물은 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum)인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 추가 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계가 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계 이후인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계가 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계 이후인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계가 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계 이전인 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계가 제1 단리 단계 및 제2 단리 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제1 단리 단계가 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계 이전이고, 제2 단리 단계가 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계 이후인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계가 제1 재도입 단계 및 제2 재도입 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제1 재도입 단계가 제1 단리 단계 이후 및 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계 이전인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 제2 재도입 단계가 제2 단리 단계 이후인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중 마이코프로테인이 실질적으로 고체상이고, 혼합물 중 부분적으로 소모된 발효 배지가 영양소 및 탄수화물을 포함하는, 실질적으로 액체상이고, 여기서 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계가 실질적으로 고체상 및 실질적으로 액체상을 분리시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 마이코프로테인 및 부분적으로 소모된 발효 배지를 포함하는 혼합물로부터 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 단리시키는 단계가 원심분리에 의해 실질적으로 고체상 및 실질적으로 액체상을 분리시키는 것을 포함하고, 임의적으로, 여기서 분리가 여과에 의한 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부의 제1 발효 베쓸로의 재도입이 재순환 단계이고, 임의적으로, 여기서 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부의 제1 발효 베쓸로의 재도입이 방법에 필요한 발효 배지의 양을 감소시키는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 에탄올을 제조하고, 단리시키는 추가 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지가 공급원료로부터 수득되고, 임의적으로, 여기서 공급원료가 전분 기반 공급원료 및 당 기반 공급원료 중 적어도 하나이고, 임의적으로, 여기서 발효 배지를 제1 발효 베쓸에 도입시키는 단계 이전에 공급원료에 대해 밀링, 그라인딩, 젤라틴화, 액화 및 당화 중 하나 이상의 것을 수행하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제2 발효 베쓸로 도입시키는 추가 단계를 포함하고, 임의적으로, 여기서 제2 발효 베쓸이 혐기성 발효 베쓸인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제2 발효 베쓸로 도입시키는 단계가 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸 내로 재도입시키는 단계 이후인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 방법이 제2 발효 베쓸 중에서 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 발효시켜 에탄올을 수득하는 추가 단계를 포함하는 것인 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 적어도 일부를 제1 발효 베쓸로 재도입시키고, 단리된 부분적으로 소모된 발효 배지의 잔류물은 제2 발효 베쓸로 도입시키는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 또는 직접 수득된 마이코프로테인.
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