CN117683694A - 枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117683694A
CN117683694A CN202410023471.8A CN202410023471A CN117683694A CN 117683694 A CN117683694 A CN 117683694A CN 202410023471 A CN202410023471 A CN 202410023471A CN 117683694 A CN117683694 A CN 117683694A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
bacillus subtilis
acetoin
glucose
tryptone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410023471.8A
Other languages
English (en)
Inventor
童文华
郑佳
李红
乔宗伟
赵东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuliangye Yibin Co Ltd
Original Assignee
Wuliangye Yibin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuliangye Yibin Co Ltd filed Critical Wuliangye Yibin Co Ltd
Priority to CN202410023471.8A priority Critical patent/CN117683694A/zh
Publication of CN117683694A publication Critical patent/CN117683694A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G3/00—Preparation of other alcoholic beverages
    • C12G3/02—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation
    • C12G3/021—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation of botanical family Poaceae, e.g. wheat, millet, sorghum, barley, rye, or corn
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用。为了开发出新的耐乙醇且同时产乙偶姻的芽孢杆菌，本发明从浓香型大曲中分离、筛选出一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)E03，其保藏编号为CGMCC No.29247。本发明菌株E03耐乙醇度高、能产乙偶姻，且以小麦为原料发酵时，还能产阿魏酸，产2,3,5,6‑四甲基吡嗪、2,3‑丁二酮、2‑甲基丁酸丁酯、异丁酸丁酯等风味物质，对于白酒口感和品质的提高具有重要意义。

Description

枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用。
背景技术
白酒是以酒曲为糖化发酵剂，发酵粮谷为主要原料，经蒸煮糖化、发酵、蒸馏、贮存、勾调成的蒸馏酒。白酒的风味特征和保健功能一直是人们关注的热点，筛选功能菌进行强化发酵是一种有效提升白酒品质的方法。
乙偶姻，又称3-羟基丁酮，是一种具有奶油香气的重要风味物质和平台化合物。目前，乙偶姻的生产方法有化学合成法、酶学转化法及微生物发酵法，其中微生物发酵法以微生物为工具、原料来源丰富、工艺条件温和、其产物具有绿色安全等优点，并且满足可持续发展理念而日益受到瞩目。因此，开发有较好性能的高产乙偶姻的新菌株具有较高的理论研究价值和应用意义。在已发现的产乙偶姻的微生物中，主要有多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产酸克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、有孢汉逊酵母等。其中研究最多的就是芽孢杆菌，芽孢杆菌有强大的水解酶系统，可显著提高大曲产淀粉酶和蛋白酶的能力，从而使酒醅中淀粉、蛋白质的利用率增加，生成更多糖酸和氨基酸等小分子类物质，为微生物发酵提供必要的营养元素以及为一些风味物质提供必要的前体，同时芽孢杆菌因其能产生对环境具有一定抗力的孢子使得它即使在高乙醇和厌氧的窖池环境下仍有一定耐受性。
在白酒酿造过程中，大部分微生物对乙醇浓度耐受有限，乙醇浓度过高会导致菌株生长延滞、发酵时间过长，从而影响目的产物产量。目前专利CN113999800A公开了一种产乙偶姻的芽孢杆菌菌株，但其最大乙醇耐受度为8％，因此，开发新的耐乙醇且同时产乙偶姻的芽孢杆菌对于白酒酿造具有重要意义。
发明内容
为了开发出新的耐乙醇且同时产乙偶姻的芽孢杆菌，本发明从浓香型大曲中分离、筛选出一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)E03，已于2023年12月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.29247，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：Bacillus subtilis。
第一方面，本发明提供耐乙醇且同时产乙偶姻的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCC No.29247。
第二方面，本发明提供上述枯草芽孢杆菌的分离、筛选方法，其包括以下步骤：
将浓香型大曲粉悬浮液，先富集培养后再分离培养，通过肌酸显色试验初筛出产乙偶姻的菌株，再进行发酵培养，复筛出产乙偶姻最高的菌株，结合形态学及生理生化特征、分子生物学鉴定出所述枯草芽孢杆菌。
其中，上述分离、筛选方法中，富集培养基成分包括：酵母浸粉0.3～0.7％、葡萄糖(一水)2.0～5.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％。
优选地，上述分离、筛选方法中，富集培养基成分包括：酵母浸粉0.5％、葡萄糖(一水)3.3％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％。
其中，分离培养基成分包括：酵母浸粉0.3～0.7％、葡萄糖(一水)2.0～5.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、琼脂粉1.5～2.5％。
优选地，分离培养基成分包括：酵母浸粉0.5％、葡萄糖(一水)3.3％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％、琼脂粉2.0％。
其中，发酵培养基成分包括：酵母浸粉0.8～1.2％、葡萄糖(一水)8.0～10.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、七水硫酸镁0.02～0.04％、无水氯化钙0.06～0.1％、磷酸二氢钾0.02～0.04％、硫酸铵0.02～0.04％。
优选地，发酵培养基成分包括：酵母浸粉1.0％、葡萄糖(一水)8.8％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、无水氯化钙0.09％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％。
其中，上述分离、筛选方法中，发酵培养条件为接种量3～8％、发酵温度30～40℃、转速120～250r/min、发酵时间32～72h。
优选地，上述分离、筛选方法中，发酵培养条件为接种量5％、发酵温度37℃、转速180r/min、发酵时间36h。
第三方面，本发明提供上述枯草芽孢杆菌在发酵生产乙偶姻中的应用。
其中，所述枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻的发酵条件为：pH 5.0～7.0，温度31～43℃，接种量3～11％，转速120～240r/min，装液量30～70/250mL。
优选地，所述枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻的发酵条件为：发酵pH 5.5、发酵温度40℃、接种量5％、转速210r/min、装液量50/250mL。
第四方面，本发明提供上述枯草芽孢杆菌在小麦液态或固态发酵中的应用。
优选地，所述液态或固态发酵中产阿魏酸。
优选地，所述固态发酵产2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-丁二酮、2-甲基丁酸丁酯或异丁酸丁酯中至少一种。
第五方面，本发明提供上述枯草芽孢杆菌在大曲制备、白酒酿造领域的应用。
第六方面，本发明提供一种微生物菌剂，其含有上述枯草芽孢杆菌的活细胞或干菌体。
有益效果：本发明从浓香型大曲中分离、筛选出一株枯草芽孢杆菌E03，其保藏编号为：CGMCC No.29247。本发明菌株有以下优势：
1、本发明枯草芽孢杆菌E03能够产乙偶姻，且由于生长环境长期驯化，具有耐乙醇的特性，相比于其他产乙偶姻的芽孢杆菌菌株，其酒精最大耐受度达到12％，非常有利于后期进行酒类酿造时，乙偶姻的产生。
2、本发明菌株属于芽孢杆菌，其在发酵温度为50℃时仍能生长，能用于白酒酿造、大曲制作中，以提高白酒中乙偶姻含量，增加白酒健康性。
3、本发明枯草芽孢杆菌E03用于小麦发酵时能产阿魏酸，从而提高以小麦为原料的白酒中阿魏酸的含量，提高白酒质量。
4、本发明枯草芽孢杆菌E03在小麦固态发酵时，产2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-丁二酮、2-甲基丁酸丁酯、异丁酸丁酯等风味物质，从而能提高白酒风味物质含量，改善其口感和风味。
5、本发明枯草芽孢杆菌E03由于具有耐乙醇、产乙偶姻的特点，能用于大曲的制备，有利于提升白酒品质。
6、通过对本发明枯草芽孢杆菌E03发酵条件进行优化，结果表明，最佳发酵条件为：发酵pH 5.5、发酵温度40℃、接种量5％、转速210r/min、装液量50/250mL，发酵培养基为：酵母浸粉1％、葡萄糖(一水)8.8％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、无水氯化钙0.09％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％，在此条件下菌株摇瓶发酵乙偶姻产量高达18.135g/L，与优化前菌株乙偶姻产量15.703g/L相比提高了20％。
7、由于化学合成法制备成本高，环保性差，植物富集法提取工艺复杂，产率低，本发明采用微生物发酵法来获得高产乙偶姻，具有安全、绿色、高效，可持续等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1中的产乙偶姻菌株的初筛结果；
图2是本发明实施例1中产乙偶姻的复筛结果；
图3是本发明实施例1中的枯草芽孢杆菌E03的系统发育树图；
图4是本发明实施例1中的枯草芽孢杆菌E03的生长曲线；
图5是本发明实施例1中的枯草芽孢杆菌E03的形态学特征实物图：a为菌株透明圈，b为革兰氏染色结果，c为扫描电镜图；
图6是本发明实施例2中的枯草芽孢杆菌E03的酸度耐受性效果图；
图7是本发明实施例2中的枯草芽孢杆菌E03的酒精耐受性效果图；
图8是本发明实施例3中的乙偶姻标准曲线；
图9是本发明实施例4中的枯草芽孢杆菌E03的发酵产乙偶姻的单因素实验结果效果图，a是pH，b是温度，c是接种量，d是转速，e是装液量；
图10是本发明实施例5中枯草芽孢杆菌E03产阿魏酸酯酶效果图：a是菌株产阿魏酸酯酶透明圈，b是阿魏酸标准曲线；
图11是本发明实施例5中(a)接种枯草芽孢杆菌E03的阿魏酸液相图和(b)未接种枯草芽孢杆菌E03的阿魏酸液相图。
本发明枯草芽孢杆菌E03的菌种保藏说明：
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)E03，已于2023年12月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.29247，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：Bacillus subtilis。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施方式，对本申请进行进一步详细说明。除非另有定义，本申请使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
本发明第一方面是从浓香型大曲里面分离纯化，通过肌酸显色反应、微生物生理、形态学，分子生物学鉴定，筛选出一株耐乙醇产乙偶姻的枯草芽孢杆菌菌株，其保藏编号为CGMCC No.29247。
本发明枯草芽孢杆菌菌株形态学及生理生化特征为：菌落呈白色，表面湿润隆起、边缘不整齐，形状较规则，粘稠度较低，容易被挑起，菌落不透明；革兰氏染色后呈现蓝紫色，为革兰氏阳性菌；菌体为短杆状。
本发明的枯草芽孢杆菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：
GGTCGGAGTCTATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCCCTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACCCCGCCCGTCACCCCCCGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACACAGCTCCTCA。
本发明的枯草芽孢杆菌菌株乙醇耐受性为1～12％，在1～8％生长良好，在5％生长繁殖最快。
本发明第二方面提供所述枯草芽孢杆菌菌株E03分离、筛选方法包括以下步骤：
将浓香型大曲粉末在生理盐水中短暂高温(15min、80℃)水浴后进行富集培养11～21h，再在分离培养基中，通过稀释涂布平板法分离培养11～21h成单个菌落；
对菌株进行肌酸显色实验初筛出产乙偶姻的菌株，再通过发酵培养，对发酵液进行肌酸显色实验复筛出产乙偶姻最高的菌株，并将其保藏于甘油管中，结合形态学及生理生化特征、分子生物学鉴定出所述枯草芽孢杆菌。
在本发明的一些实施例中，培养基成分含量以百分质量(％)表示(除葡萄糖在115℃，灭菌20min，其余成分均在121℃下灭菌20min)：
富集(种子)培养基成分包括：酵母浸粉0.3～0.7％、葡萄糖(一水)2.0～5.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％。在一些具体实施例中，富集培养基成分包括：酵母浸粉0.5％、葡萄糖(一水)3.3％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％，pH 6.0。
在一些实施例中，分离培养基成分包括：酵母浸粉0.3～0.7％、葡萄糖(一水)2.0～5.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、琼脂粉1.5～2.5％。在一些具体实施例中，分离培养基成分包括：酵母浸粉0.5％、葡萄糖(一水)3.3％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％、琼脂粉2.0％，pH 6.0。
在一些实施例中，发酵培养基成分包括：酵母浸粉0.8～1.2％、葡萄糖(一水)8.0～10.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、七水硫酸镁0.02～0.04％、无水氯化钙0.06～0.1％、磷酸二氢钾0.02～0.04％、硫酸铵0.02～0.04％。在一些具体实施例中，发酵培养基成分包括：酵母浸粉1.0％、葡萄糖(一水)8.8％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、无水氯化钙0.09％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％，pH6.0。
在一些实施例中，发酵培养条件为接种量3～8％、发酵温度30～40℃、转速120～250r/min、发酵时间32～72h。在一些具体实施例中，发酵培养条件为接种量5％、发酵温度37℃、转速180r/min、发酵时间36h。
本发明第三方面还对筛选的枯草芽孢杆菌菌株的发酵条件进行优化，在最佳优化条件下：发酵pH 5.5、发酵温度40℃、接种量5％、转速210r/min、装液量50/250mL，发酵培养基为：酵母浸粉1％、葡萄糖(一水)8.8％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、无水氯化钙0.09％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％，发现菌株摇瓶发酵乙偶姻平均产量为18.135g/L。
本发明第四方面还发现本发明菌株还具有耐乙醇的特点，能应用于白酒酿造生产中，尤其是大曲制作工艺的应用方面，有助于提高白酒中乙偶姻的含量，增加白酒的功能性作用。
本发明菌株在小麦固态发酵中，能够产阿魏酸，且还能产2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-丁二酮、2-甲基丁酸丁酯、异丁酸丁酯等风味物质，能用于白酒酿造中，提供白酒风味及品质。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例所用培养基成分如下：
其中培养基成分含量以百分质量(％)表示(除葡萄糖在115℃，灭菌20min，其余成分均在121℃下灭菌20min)：
富集(种子)培养基：酵母浸粉0.5、葡萄糖(一水)3.3、胰蛋白胨1.0、氯化钠0.05、pH6.0；
分离培养基：酵母浸粉0.5、葡萄糖(一水)3.3、胰蛋白胨1.0、氯化钠0.05、琼脂粉2.0、pH 6.0；
发酵培养基：酵母浸粉1.0、葡萄糖(一水)8.8、胰蛋白胨1.0、氯化钠0.05、七水硫酸镁0.03、无水氯化钙0.09、磷酸二氢钾0.03、硫酸铵0.03、pH 6.0；
阿魏酸乙酯分离培养基：氯化钠0.03g，硫酸铵0.13g，七水硫酸镁0.03g，磷酸氢二钾0.03g，琼脂2g，1.5mL阿魏酸乙酯(10％的二甲基甲酰胺，V/V)，去离子水100mL，pH7.0，121℃灭菌20min。
小麦培养基：小麦麸皮10g，葡萄糖0.1g，磷酸二氢钾0.03g，去离子水10mL。121℃灭菌20min。
实施例1菌株E03分离、筛选与鉴定
1、芽孢杆菌E03的分离、筛选
取5g宜宾五粮液浓香型大曲粉末放入装有100mL无菌生理盐水且含有无菌磁子的烧杯中，80℃水浴15min，水浴时每1～2min在磁力搅拌器上搅拌10s，水浴结束后在超净台中吸取悬浮液5mL加入到富集培养基中培养11h(37℃、180r/min)。吸取1mL富集液于无菌的10mL离心管中，加入9mL无菌生理盐水进行梯度稀释，可得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍的稀释菌液。取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个梯度的稀释菌液各200μL涂布于分离培养基上，在37℃培养箱中培养21h。选取和芽孢杆菌菌落形态特征相同的大小不一的菌落，在分离培养基上进行画线分离，重复该操作直至出现单菌落。将分离培养基中的单菌落接种于1mL现配的肌酸溶液(1g 1-萘酚，0.1g肌酸与4g NaOH定容100mL)的试管中，通过溶液变红筛选出产乙偶姻的菌株(如图1所示)。将使溶液变红的菌株制成种子液接种至发酵培养基中(接种量5％、发酵温度37℃、转速180r/min、发酵时间36h)培养，再取1mL发酵液在12000r/min的条件下离心2min，取0.1mL上清液离心管中，再加入4.5mL上述现配的肌酸溶液，振荡混匀后，30℃水浴30min，测定OD522 nm值，每组3次平行，选取OD522 nm最高的菌株，从而获得乙偶姻(ACT)产量较高的菌株，结果如图2所示，并将其用甘油保藏法保藏。
2、枯草芽孢杆菌E03分子生物学鉴定
一)鉴定：经过形态学观察与鉴定初步判断为短杆状菌体，利用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R对细菌基因组16S rDNA进行扩增测序，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQID NO:2)，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:3)。由16S rDNA分子生物学鉴定测序结果与NCBI数据库进行BLAST对比，并利用MEGA-X软件基于Neighbor-Joining算法最终构建系统发育树，如图3。
3、枯草芽孢杆菌E03的生长曲线
在摇瓶培养的过程中，每隔2h取种子液测定OD600 nm值。测定结果显示，在培养6h前生长缓慢，6h后进入对数生长期，18～24h处于稳定生长期，24h后进入衰亡期，见图4。
4、芽孢杆菌E03的形态学及生理生化鉴定
经过菌落形态观察，菌落呈白色，表面湿润隆起、边缘不整齐，形状较规则，粘稠度较低，容易被挑起，菌落不透明，见图5a。革兰氏染色后用光学显微镜观察呈现蓝紫色，为革兰氏阳性菌，见图5b。通过电镜照片可知此菌体为短杆状，见图5c。
菌株生理生化结果见表1。
表1枯草芽孢杆菌E03生理生化特征
检测项目 结果
甲基红试验 -
酪蛋白试验 +
淀粉水解试验 +
葡萄糖利用 +
注：“+”，表示反应结果为阳性；“-”表示反应结果为阴性。
实施例2菌株E03耐酸、耐乙醇度
1、酸度耐受性
如图6所示，该菌株在pH 3.5时菌株数量急剧下降，而该菌株在pH 5～6之间数量最多，pH＞7后该菌株数量无过多变化，可说明该菌株具有较广的pH耐受性。
2、酒精耐受性
如图7所示，乙醇含量1％～6％之间在OD600 nm变化不大，说明菌株生长情况较好，当乙醇达到14～16％时OD600 nm趋于0，可知该菌株的酒精度最大耐受性为12％。极大部分产乙偶姻菌株乙醇耐受性≤8％，说明该菌株乙醇耐受性较好。
实施例3菌株E03在发酵液中产乙偶姻的测定
一)乙偶姻标准曲线绘制
分别称取0.005g、0.01g、0.02g、0.04g、0.08g乙偶姻溶于100mL水中配成不同含量的乙偶姻标准溶液。向5个装有4.5mL上述现配肌酸混合溶液的试管中依次滴入0.1mL上述不同含量的乙偶姻标准溶液。混匀后在30℃的恒温水浴锅中保温30min。分别测定上述混合液在OD522 nm处的吸光度，以未加乙偶姻的肌酸混合液为对照。吸光度在波长OD522 nm处的值为纵坐标，乙偶姻浓度为横坐标绘制标准曲线。并制作线性回归方程。如图8所示，其回归方程y＝2.0561x-0.013，相关系数R2＝0.9992，表明两者之间线性关系良好。
二)乙偶姻含量的测定
挑取一环分离培养基中E03的单菌落接入装有50mL种子培养基中放置于37℃，180r/min恒温摇床中培养11h得种子液，以5％接种量接种于50mL发酵培养基于37℃，180r/min恒温摇床中培养48h后，结束发酵，得到发酵液，取1mL发酵液于2mL离心管中12000r/min离心2min，再取0.1mL上清液于离心管中，再加入4.5mL刚配置好的肌酸混合液，振荡混匀后，30℃水浴30min，测定OD522 nm值，以未加乙偶姻的肌酸混合液为空白对照，测得接种E03发酵培养基中乙偶姻产量为15.703g/L。
实施例4菌株E03产乙偶姻发酵条件优化
一)单因素实验
选取pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，发酵温度分别为31、34、37、40、43℃，接种量分别为3、5、7、9、11％，转速分别为120、150、180、210、240r/min，装液量分别为30、40、50、60、70/250mL等5个因素做单因素试验，其他试验操作步骤流程同实施3(二)，获得种子液后，发酵培养后，处理测定OD522 nm值，每组做3个平行。
由图9a可知，发酵培养基的pH为5.5～6.0时乙偶姻产量达到最大值，随着pH的增加产量下降，这可能与大曲酸性环境的驯化及菌株适应性有关，所以E03在pH值为5.5时具有较强的生长繁殖与乙偶姻的积累能力。
由图9b可知，当发酵温度从31℃升至34℃时乙偶姻产量随之增加，40℃时产量达到最大值，可能是由于E03在40℃时最适合其生长繁殖且其关键酶活性亦随之提高。随后酶活性又随温度升高而降低，推测高温下E03代谢酶活性受到抑制。
由图9c可知，乙偶姻产量随接种量的增加呈现先增后减的趋势，在接种量为5％时，乙偶姻产量达到最大，这是因为接种量过大引起发酵初期比较高的细胞浓度，进而底物大量消耗，造成产物合成阶段营养物质供应不足。
由图9d可知，随着转速的增加，乙偶姻的产量也增加，其产量在转速210r/min时到达最大值，随后开始下降。菌体的积累需要大量氧气，低转速条件下溶氧较低不利于菌体生长繁殖，但转速过高会加速菌体衰亡。
由图9e可知，随着装液量的增大，乙偶姻的产量先增加后减少，乙偶姻产量最大值为装液量50/250mL。这是因为随着装液量的增加，发酵液体培养基的营养物质的量增多，但是同时发酵体系中的氧气溶解量也逐渐变少，装液量超过50/250mL时，溶氧量对菌株本身的影响就要大于发酵液体培养基中营养物质的量的影响。
二)正交试验
设计L9(43)正交试验，考察不同因素对乙偶姻产量影响的大小。选取pH、温度、转速、装液量4个因素进行3个水平的考察试验，每组试验设有3个平行。
在单因素试验的基础上，通过正交试验考察各因素对芽孢杆菌的乙偶姻产量影响的大小。正交试验设计方案及结果见表2，由极差分析可知，各因素对乙偶姻产量是影响大小依次为装液量>温度>pH>转速。
表2正交实验设计方案及结果
通过以上结果表明，本发明菌株最佳发酵条件为：发酵pH 5.5、发酵温度40℃、接种量5％、转速210r/min、装液量50/250mL，发酵培养基为：酵母浸粉1％、葡萄糖(一水)8.8％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、无水氯化钙0.09％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％，在此条件下菌株摇瓶发酵乙偶姻产量高达18.135g/L，与优化前菌株乙偶姻产量15.703g/L相比提高了20％。
实施例5菌株E03产阿魏酸酯酶测定试验
一)菌株E03产阿魏酸酯酶试验
挑取一环分离培养基中E03的单菌落接入阿魏酸乙酯分离培养基中，放置于37℃恒温培养箱中，培养36h，由图10a可知，产生透明圈，证明其产阿魏酸酯酶。
二)阿魏酸标准曲线绘制
称取0.01g阿魏酸溶于1000mL水中配成不同含量的阿魏酸标准溶液。用0.22um的无菌滤膜过滤标准液，通过HPLC测定得到标准曲线方程。以标准溶液浓度(g/L)为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并作线性回归方程，如图10b所示，阿魏酸标准品回归方程y＝38279.59x-4.22，相关系数R2＝0.99915，这表明两者线性关系良好。
三)发酵产阿魏酸含量的测定
挑取一环分离培养基中E03的单菌落接入装有50mL种子培养基中放置于37℃，180r/min恒温摇床中培养11h得种子液，以5％接种量接种于小麦培养基中固态发酵试产阿魏酸，将不加菌的小麦液态发酵作为对照组。通过对发酵产物进行液相分析，由图11a和图11b可知，E03在发酵中对比对照组还产生了阿魏酸，阿魏酸含量为1.31mg/L。阿魏酸是一种强抗氧化剂，该特性使其在治疗癌症、糖尿病、阿尔兹海默症、心脑血管疾病中有良好效果，可提高白酒质量的应用价值。
实施例6菌株E03发酵对比试验
将E03进行小麦固态发酵，将不加菌的小麦固态发酵作为对照组。由表3可知，E03在固态发酵中对比对照组还产生了2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-丁二酮、2-甲基丁酸丁酯、异丁酸丁酯等风味物质，2,3,5,6-四甲基吡嗪具有坚果、烤面包、熟花生、榛子和可可豆的香味；2,3-丁二酮有强烈的奶油香味、发酵香味、乳脂香味等；2-甲基丁酸丁酯有苹果样的果香香气；异丁酸丁酯具有强烈的新鲜苹果和菠萝似水果香味等。表明该菌株在发酵中有利于改善白酒口感和风味方面的应用价值。
表3菌株EO3固态发酵风味物质比较
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)新菌株，其特征在于：保藏编号为CGMCCNo.29247。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的分离、筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
将浓香型大曲粉悬浮液，先富集培养后再分离培养，通过肌酸显色试验初筛出产乙偶姻的菌株，再进行发酵培养，复筛出产乙偶姻最高的菌株，结合形态学及生理生化特征、分子生物学鉴定出所述枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的分离、筛选方法，其特征在于：
富集培养基成分包括：酵母浸粉0.3～0.7％、葡萄糖(一水)2.0～5.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％；优选地，富集培养基成分包括：酵母浸粉0.5％、葡萄糖(一水)3.3％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％；和/或
分离培养基成分包括：酵母浸粉0.3～0.7％、葡萄糖(一水)2.0～5.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、琼脂粉1.5～2.5％；优选地，分离培养基成分包括：酵母浸粉0.5％、葡萄糖(一水)3.3％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％、琼脂粉2.0％；和/或
发酵培养基成分包括：酵母浸粉0.8～1.2％、葡萄糖(一水)8.0～10.0％、胰蛋白胨0.8～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、七水硫酸镁0.02～0.04％、无水氯化钙0.06～0.1％、磷酸二氢钾0.02～0.04％、硫酸铵0.02～0.04％；优选地，发酵培养基成分包括：酵母浸粉1.0％、葡萄糖(一水)8.8％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.05％、七水硫酸镁0.03％、无水氯化钙0.09％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.03％。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌的分离、筛选方法，其特征在于：
发酵培养条件为接种量3～8％、发酵温度30～40℃、转速120～250r/min、发酵时间32～72h；优选地，发酵培养条件为接种量5％、发酵温度37℃、转速180r/min、发酵时间36h。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在发酵生产乙偶姻中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻的发酵条件为：pH 5.0～7.0，温度31～43℃，接种量3～11％，转速120～240r/min，装液量30～70/250mL；优选地，所述枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻的发酵条件为：发酵pH 5.5、发酵温度40℃、接种量5％、转速210r/min、装液量50/250mL。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在小麦液态或固态发酵中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述液态或固态发酵中产阿魏酸；和/或
所述固态发酵产2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-丁二酮、2-甲基丁酸丁酯或异丁酸丁酯中至少一种。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在大曲制备、白酒酿造领域的应用。
10.一种微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的活细胞或干菌体。
CN202410023471.8A 2024-01-08 2024-01-08 枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用 Pending CN117683694A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410023471.8A CN117683694A (zh) 2024-01-08 2024-01-08 枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410023471.8A CN117683694A (zh) 2024-01-08 2024-01-08 枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117683694A true CN117683694A (zh) 2024-03-12

Family

ID=90139158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410023471.8A Pending CN117683694A (zh) 2024-01-08 2024-01-08 枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117683694A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112251379B (zh) 一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌dqa21及应用
CN110093285B (zh) 一株耐酸发酵乳杆菌及其应用
CN114591850B (zh) 酿酒酵母cmrc 5s及其应用
CN111248409A (zh) 一种低盐豆瓣酱发酵方法
CN111979146A (zh) 糖多孢菌及其在食品中的应用
CN114134055A (zh) 一株高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母及其应用
CN109971657B (zh) 一种高产糖化酶的米根霉及其应用
CN111411061A (zh) 一株地衣芽孢杆菌的筛选及其在食品生产中的应用
CN114574375A (zh) 酿酒酵母、发酵剂及它们在制备发酵食品中的应用
CN117343871B (zh) 一种鲍氏不动杆菌、酯化液及在黄水处理中的应用
CN110408571A (zh) 一株凝结芽孢杆菌及其应用
EP3845658B1 (en) Method for preparing vanillin by fermentation with eugenol as substrate
CN110628653B (zh) 一种马克斯克鲁维酵母菌的增殖培养基及其制备方法
CN110760549B (zh) 一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法
CN117286064A (zh) 一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌、方法及在白酒生产中的应用
CN110150457B (zh) 一种抑菌型酵母培养物及其应用
CN117229929A (zh) 一株高产酯异常威克汉姆酵母菌及其应用
CN114456990B (zh) 一种ddgs的制备方法及其发酵菌种和培养基
CN117683694A (zh) 枯草芽孢杆菌新菌株、筛选方法及应用
CN106434435A (zh) 一株醋酸杆菌及在加速绿豆淀粉分离沉降中的应用
CN116103171B (zh) 一种耐环境胁迫及快速发酵产乙醇的酿酒酵母及其应用
CN118308433B (zh) 枯草芽孢杆菌bs-22株在发酵菜粕中的应用
CN115873743B (zh) 一株高产尿囊素的发酵粘液乳杆菌及其应用
CN116083307B (zh) 一种生产酯酶和酯类化合物的格氏乳球菌及其应用
CN116948847B (zh) 一株拜耳接合酵母及其在白酒生产中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination