CN114846150A - 用于产生真菌蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了产生和分离真菌蛋白的连续方法。该方法可以包括以下的步骤：提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；将发酵培养基引入第一发酵容器；使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；以及将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中。还描述了从该方法获得的真菌蛋白。

Description

用于产生真菌蛋白的方法
发明领域
本发明涉及产生和分离真菌蛋白的方法。具体地，本发明涉及用于产生和分离真菌蛋白的高效、低能耗和具有成本效益的方法。
背景
真菌蛋白是通常用作食物产品或成分的单细胞蛋白。它常规通过使用丝状真菌诸如镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)对碳水化合物源进行有氧发酵产生。
GB2137226A描述了使用禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)在含有所有必需的促进生长的营养物质的培养基中通过连续有氧发酵产生真菌蛋白的方法。在通过有氧发酵产生真菌蛋白之后，需要热处理步骤以减少存在于真菌蛋白产品中的核酸(诸如RNA)的含量。
GB1440642A描述了用于减少真菌蛋白产品中的RNA的含量的方法。对通过过滤收集、洗涤和然后在水中重悬的物质进行热处理步骤。
虽然真菌蛋白是受欢迎的肉类替代品，但真菌蛋白的产生是昂贵的。高成本与使用精制原料(feedstock)(通常是葡萄糖糖浆)、高水用量、与有氧发酵相关的高能源成本以及高工厂运营成本相关。
WO 2016/063053描述了共产生真菌蛋白和乙醇的方法。具体地，真菌蛋白由镰孢菌属(Fusarium)的种的有氧发酵产生。发酵肉汤(fermentation broth)经历热处理步骤以减少RNA含量，并且然后被分离以提供真菌蛋白糊状物和消耗的真菌蛋白发酵液(spentmycoprotein fermentation liquor)。然后消耗的真菌蛋白发酵液被送入厌氧发酵过程以提供乙醇。
然而，WO 2016/063053中描述的方法需要控制用于获得真菌蛋白或乙醇的生长条件和底物，以实现所需的真菌蛋白与乙醇的比率。此外，WO2016/063053中的热处理步骤可能导致营养组分相互作用，诸如美拉德反应，这可能对添加到厌氧发酵过程中的发酵液的质量和一致性产生负面影响。
另外，在典型的真菌蛋白产生过程中，热处理步骤具有高能源成本和高处理时间。
因此，本发明的目的是提供用于获得真菌蛋白的高效、低能耗和具有成本效益的方法。
本发明的另外的目的是消除或减轻现有技术中的至少一些缺点。通过阅读以下内容，本发明的另外的目的将变得明显。
发明的公开内容
根据本发明的第一方面，提供了一种用于产生和分离真菌蛋白的连续方法，该方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；和
(v)将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中。
术语“培养基”意指被设计为支持微生物生长的固体、液体或半固体。
术语“发酵培养基”意指适于发酵的培养基。例如，包含支持用于发酵的微生物的生长所需的组分的培养基。
发酵培养基可以包括适于产生真菌蛋白的碳水化合物，任选地其中碳水化合物是糖，任选地其中碳水化合物是葡萄糖、蔗糖或其来源。碳水化合物可以是葡萄糖。
发酵培养基可以是适于产生真菌蛋白的水性可发酵的肉汤。
发酵培养基可以包含水、碳水化合物、氮源和营养物。营养物可以适于产生真菌蛋白。营养物可以选自由盐、维生素和微量金属组成的组中的一种或更多种。
盐可选自由以下组成的组中的一种或更多种：硫酸钾、磷酸钾、硫酸镁、氯化锰、乙酸钙、氯化钙、铁硫酸盐(iron sulphate)、铁氯化物(iron chloride)、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化铜、氯化钴、氯化铵、钼酸钠、氢氧化铵、铵磷酸盐(ammonium phosphate)和胆碱盐。
术语“部分消耗的发酵培养基”意指已经历发酵的培养基。部分消耗的培养基可以包含来自原始发酵培养基的至少一部分的碳水化合物和/或营养物。碳水化合物可以是糖，任选地碳水化合物可以是葡萄糖、蔗糖或其源。
在分离的部分消耗的发酵培养基的一部分被重新引入第一发酵容器中之后，发酵步骤可以包括使发酵培养基和分离的部分消耗的培养基的一部分发酵，以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物。在分离的部分消耗的发酵培养基的一部分被重新引入第一发酵容器中之后，发酵步骤可以包括使来自发酵培养基和分离的部分消耗的培养基的一部分二者的碳水化合物发酵，以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物。
发酵培养基可以是原始发酵培养基。发酵培养基可以是第一发酵培养基。第一发酵培养基或原始发酵培养基可以包含先前未经历发酵过程的新鲜的或新的培养基组分(即，它不是部分消耗的发酵培养基)。
当部分消耗的发酵培养基与原始发酵培养基合并时，这样形成的部分消耗的发酵培养基和原始发酵培养基的混合物可称为连续发酵培养基。
连续方法可以包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的原始发酵培养基；
(ii)将原始发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使原始发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；和
(v)将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中；
其中在分离的部分消耗的发酵培养基的一部分被重新引入第一发酵容器中之后，发酵步骤可以包括使原始发酵培养基和分离的部分消耗的培养基的一部分发酵。
发酵前发酵培养基中的碳水化合物可以过量。
可以配置以下中的至少一种以在发酵前维持过量的碳水化合物：(a)在重新引入分离的部分消耗的发酵培养基的一部分之后提供发酵培养基；和(b)重新引入分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分。
在发酵前维持过量的碳水化合物可以包括：(a)确定部分消耗的发酵培养基中的碳水化合物的浓度；和(b)调节被引入第一发酵容器的发酵培养基以在发酵前维持过量的碳水化合物，任选地其中调节发酵培养基包括减少以下中的至少一种：所提供的发酵培养基的量；和其中碳水化合物的浓度。
分离的部分消耗的发酵培养基中的一部分中的碳水化合物的浓度可以低于发酵前发酵培养基中的碳水化合物的浓度。发酵前发酵培养基中的碳水化合物的浓度可为约15g/L至约90g/L，任选地约15g/L至约44g/L，任选地约15g/L至约33g/L，任选地约33g/L至约44g/L，任选地约16.5g/L至约49.5g/L，任选地约33g/L。发酵前发酵培养基中的碳水化合物的浓度可为至少15g/L。被重新引入第一发酵容器中的分离的部分消耗的发酵培养基的一部分中的碳水化合物的浓度可少于约90g/L，任选地约0.1g/L至约89.9g/L，任选地少于约33g/L，任选地约0.1g/L至约32.9g/L。
发酵前发酵培养基中的碳水化合物的浓度可为33g/L。被重新引入第一发酵容器中的分离的部分消耗的发酵培养基的一部分中的碳水化合物的浓度可少于33g/L。可以配置以下中的至少一种以在发酵前在发酵培养基中维持至少15g/L、任选地33g/L的碳水化合物浓度：(a)在重新引入分离的部分消耗的发酵培养基的一部分之后提供原始或第一发酵培养基；和(b)重新引入分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分。
发酵前发酵培养基中的营养物可以过量和/或处于预先确定的浓度。
可以配置以下中的至少一种以在发酵前维持过量和/或预先确定的浓度的营养物：(a)在重新引入分离的部分消耗的发酵培养基的一部分之后提供发酵培养基；和(b)重新引入分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分。
在发酵前维持过量和/或预先确定的浓度的营养物可以包括：(a)确定部分消耗的发酵培养基中一种或更多种营养物的浓度；和(b)调节被引入第一发酵容器的发酵培养基以在发酵前维持过量和/或预先确定的浓度的营养物，任选地其中调节发酵培养基包括减少以下中的至少一种：所提供的发酵培养基的量；和其中营养物的浓度。
分离的部分消耗的发酵培养基的一部分中的营养物的浓度可低于发酵前发酵培养基中的营养物的浓度。
当营养物是钾，任选地硫酸钾时，该浓度可为约1g/L至约3g/L，通常约1.5g/L至约2.5g/L，更通常约2g/L。
当营养物是镁，任选地硫酸镁时，该浓度可为约0.45g/L至约1.35g/L，通常约0.68g/L至约1.13g/L，更通常约0.9g/L。
当营养物是钙，任选地乙酸钙时，该浓度可为约0.1g/L至约0.3g/L，通常约0.15g/L至约0.25g/L，更通常约0.2g/L。
当营养物是磷酸，任选地85％磷酸时，该浓度可为约0.575g/L至约1.725g/L，通常为约0.86g/L至约1.44g/L，更通常为约1.15g/L。
当营养物是铁，任选地铁硫酸盐时，该浓度可为约0.0025g/L至约0.0075g/L，通常约0.004g/L至约0.006g/L，更通常约0.005g/L。
当营养物是锌，任选地硫酸锌时，该浓度可为约0.0125g/L至约0.0375g/L，通常约0.019g/L至约0.031g/L，更通常约0.025g/L。
当营养物是锰，任选地硫酸锰时，该浓度可为约0.01g/L至约0.03g/L，通常约0.015g/L至约0.025g/L，更通常约0.02g/L。
当营养物是铜，任选地硫酸铜时，该浓度可为约0.00125g/L至约0.00375g/L，通常约0.0019g/L至约0.0031g/L，更通常约0.0025g/L。
当营养物是生物素时，该浓度可为约0.0000125g/L至约0.0000375g/L，通常约0.0019g/L至约0.000031g/L，更通常约0.000025g/L。
当营养物是胆碱，任选地盐酸胆碱时，该浓度可为约0.0435g/L至约0.1305g/L，通常约0.065g/L至约0.109g/L，更通常约0.087g/L。
关于本文给出的范围和量，将理解，可以将给出的不同值组合以提供不同的范围和量。例如，在将范围和量给出为1g/L至3g/L，通常1.5g/L至2.5g/L，更通常2g/L时，这还包括了1g/L至2.5g/L、1g/L至2g/L、1g/L至1.5g/L、1.5g/L至3g/L、1.5g/L至2g/L、2g/L至3g/L、2g/L至2.5g/L、2.5g/L至3g/L和/或值的任何其他组合，和/或1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L和3g/L的单个值。
真菌蛋白的比生长率(specific growth rate)可以在约0.17h-1与约0.2h-1之间。
第一发酵容器可以是有氧发酵容器。
第一发酵容器可以是第一有氧发酵容器。该方法可以包括将发酵培养基引入一个或更多个有氧发酵容器的步骤。该方法可以包括将发酵培养基引入第一有氧发酵容器和第二有氧发酵容器的步骤。
发酵培养基可以用微生物发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物，任选地其中微生物是丝状真菌，任选地其中丝状真菌选自由曲霉属(Aspergillus)的种、根霉属(Rhizopus)的种和镰孢菌属(Fusarium)的种组成的组中的一种或更多种。微生物可以是镶片镰孢菌。
真菌蛋白可使用丝状真菌通过有氧发酵产生。丝状真菌可选自由曲霉属的种、根霉属的种和镰孢菌属的种组成的组中的一种或更多种。丝状真菌可以是镶片镰孢菌。真菌蛋白可以使用镶片镰孢菌通过有氧发酵产生。
该方法可以包括，在使发酵培养基发酵的步骤之后，从第一发酵容器中取出包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的另外的步骤，以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物。
该方法可以包括加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的另外的步骤。
加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的步骤可以在从混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤之后。
加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的步骤可以在将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中的步骤之后。
加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的步骤可以在从混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤之前。
从混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤可以包括第一分离步骤和第二分离步骤。
第一分离步骤可以在加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的步骤之前，并且第二分离步骤可以在加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的步骤之后。
将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中的步骤可以包括第一重新引入步骤和第二重新引入步骤。
第一重新引入步骤可以在第一分离步骤之后和在加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的步骤之前。
第二重新引入步骤可以在第二分离步骤之后。
混合物中的真菌蛋白可以是基本上固体的相，并且混合物中的部分消耗的发酵培养基可以是包含营养物和碳水化合物的基本上液体的相。从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤可以包括分离基本上固体的相和基本上液体的相。
从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤可以包括通过离心分离基本上固体的相和基本上液体的相，任选地其中分离通过过滤进行。
术语“基本上固体的相”意指富含固体的相。术语“基本上液体的相”意指富含液体的相。
离心可以是碟式离心(disc stack centrifugation)。然而，可以使用任何合适的离心手段和/或设备。
过滤可以是错流过滤。然而，可以使用任何合适的过滤手段和/或设备。
分离的部分消耗的培养基可以是离心液(centrate)、滤液等。富含液体的相可以是离心液。富含液体的相可以是滤液。
分离的部分消耗的培养基可以是包含水、营养物和碳水化合物的水性溶液。
将部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中可以是循环步骤。将部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中可以降低方法所需的发酵培养基的量。将部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中可以降低方法所需的碳水化合物和/或水的量。
该方法可以包括在分离步骤之后并在将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中的步骤之前的灭菌步骤。灭菌步骤可以在第二分离步骤之后并在将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中的步骤之前。
灭菌步骤可以是热灭菌步骤或过滤灭菌步骤。
该方法可以包括产生和分离乙醇的另外的步骤。
发酵培养基可以从原料中获得。原料可以是基于淀粉的原料和基于糖的原料中的至少一种。基于淀粉的原料可以选自由谷物、木薯和马铃薯组成的组中的一种或更多种。原料可以是谷物。谷物可以是小麦、玉米、荞麦、黑麦、大麦、粟和稻中的至少一种。基于糖的原料可以选自由甘蔗、甜菜和甜高粱组成的组中的一种或更多种。原料可以是甘蔗。在将发酵培养基引入第一发酵容器的步骤之前，原料可以经历碾磨(milling)、研磨(grinding)、凝胶化、液化和糖化中的一种或更多种。发酵培养基可以是包含水解淀粉的水性可发酵的肉汤。
该方法可以包括将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分引入第二发酵容器中的另外的步骤。第二发酵容器可以是厌氧发酵容器。
将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分引入第二发酵容器中的步骤可以在将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中的步骤之后。
该方法可以包括使第二发酵容器中的分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分发酵以获得乙醇的另外的步骤。
分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分可以被重新引入第一发酵容器中，并且分离的部分消耗的发酵培养基的其余部分可以被引入第二发酵容器中。
分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分可以被重新引入第一发酵容器中，并且分离的部分消耗的发酵培养基的其余部分可以被引入第二发酵容器中。任选地，分离的部分消耗的发酵培养基的其余部分可以作为流出物排出。
方法可以在有过量发酵培养基组分的情况下操作。方法可以在发酵培养基中有过量的碳水化合物时操作，任选地其中碳水化合物是葡萄糖。
根据本发明的第二方面，提供了通过第一方面描述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
根据本发明的第三方面，提供了用于产生和分离真菌蛋白的连续方法，该方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)第一分离步骤，包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；
(v)将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中；
(vi)加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；和
(vii)第二分离步骤，包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分。
第二分离步骤可以包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的经热处理的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分。
根据本发明的第四方面，提供了通过第三方面描述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
根据本发明的第五方面，提供了用于产生和分离真菌蛋白的连续方法，该方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(v)从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；和
(vi)将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中。
该方法可以包括在分离步骤之后并在将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中的步骤之前的灭菌步骤。
灭菌步骤可以是热灭菌步骤或过滤灭菌步骤。
根据本发明的第六方面，提供了通过第五方面描述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
根据本发明的第七方面，提供了用于产生和分离真菌蛋白的连续方法，该方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)第一分离步骤，包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；
(v)第一重新引入步骤，包括将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中；
(vi)加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(vii)第二分离步骤，包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；和
(viii)第二重新引入步骤，包括将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中。
第二分离步骤可以包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的经热处理的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分。
第二重新引入步骤可以包括将第二分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中。
根据本发明的第八方面，提供了通过第七方面描述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
根据本发明的第九方面，提供了循环方法，所述循环方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；和
(v)将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分循环到第一发酵容器中。
循环方法可以是循环发酵培养基的方法。
根据本发明的第十方面，提供了通过第九方面描述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
根据本发明的第十一方面，提供了用于产生和分离真菌蛋白和乙醇的集成的连续方法，该方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(v)从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；
(vi)将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中；和
(vii)将分离的部分消耗的发酵培养基的其余部分引入第二发酵容器中。
该方法可以包括使第二发酵容器中的分离的部分消耗的发酵培养基的其余部分发酵以获得乙醇的另外的步骤。
分离的部分消耗的培养基的其余部分可以用微生物发酵以获得乙醇。微生物可以是产醇的微生物。微生物可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
分离的部分消耗的培养基的其余部分可以用未发酵的水性可发酵肉汤的一部分和微生物发酵以获得乙醇。
第二发酵容器可以是厌氧发酵容器。
根据本发明的第十二方面，提供了通过第十一方面描述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
根据本发明的第十三方面，提供了用于产生和分离真菌蛋白和乙醇的集成的连续方法，该方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)第一分离步骤，包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；
(v)第一重新引入步骤，包括将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入第一发酵容器中；
(vi)加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(vii)第二分离步骤，包括从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分；和
(viii)将分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分引入第二发酵容器中。
根据本发明的第十四方面，提供了通过第十三方面描述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
如所描述的可选的特征和不同的实施方案加以必要的变更适用于每一个和每个方面及其每一种和每种实施方案。
附图简述
现将参照附图，以实例的方式描述本发明的实施方案，在附图中：
图1是图示根据本发明的一种实施方案的方法的流程图；
图2是图示根据本发明第二实施方案的方法的流程图；和
图3是图示根据本发明第三实施方案的方法的流程图。
图4是图示根据本发明第四实施方案的方法的流程图。
图5示出以下获得的包含真菌蛋白和部分消耗的培养基的混合物中的菌丝的菌丝长度的图像：(a)在通过碟式离心分离前，(b)在通过碟式离心的第一分离后，以及(c)在通过碟式离心的第一分离的第二实例后。(实验1A)
图6示出真菌蛋白(镶片镰孢菌(F.venenatum))在发酵培养基中的纯葡萄糖上的生长，所述发酵培养基包含来自先前有氧发酵反应的分离的部分消耗的发酵培养基(从热处理后的包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物中分离)。(实验2)
图7示出用固定浓度和流速的葡萄糖进料作为发酵培养基的连续发酵反应中的生物质浓度对葡萄糖浓度的相关性图。(实验3)
图8示出分离的部分消耗的发酵培养基的连续循环对培养基营养物(常量营养物)的影响。(实验4)
图9示出分离的部分消耗的发酵培养基的连续循环对培养基营养物(微量营养物)的影响。(实验4)
详述
参考图1，示出了用于产生和分离真菌蛋白的方法。向第一发酵容器20添加富含葡萄糖的发酵培养基10。发酵培养基10包含水、碳水化合物、氮源和营养物。碳水化合物通常是葡萄糖。营养物通常选自盐、维生素和微量金属。盐通常选自由以下组成的组中的一种或更多种：硫酸钾、磷酸钾、硫酸镁、氯化锰、乙酸钙、氯化钙、铁硫酸盐、铁氯化物、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化铜、氯化钴、氯化铵、钼酸钠、氢氧化铵和铵磷酸盐。任选地添加到发酵培养基中的其他组分包括但不限于生物素、胆碱和磷酸。将发酵培养基10冷却至30℃，并接种产真菌蛋白的微生物。产真菌蛋白的微生物是丝状真菌，任选地来自镰孢菌属，并且通常是镶片镰孢菌。
有氧条件通过通气和搅拌培养基来维持。
有氧发酵的产物是包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物。部分消耗的发酵培养基50包含来自发酵培养基的营养物和葡萄糖。
在一种实施方案中，如图1中示出的，在有氧发酵后，从包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物中分离30部分消耗的发酵培养基50的至少一部分。分离步骤30可以通过本领域中已知的任何固液分离手段和/或设备来执行。例如，离心、过滤等。从有氧发酵获得的混合物包含富含固体的相和富含液体的相。富含固体的相实质上包含真菌蛋白60，并且富含液体的相实质上包含部分消耗的发酵培养基50。分离步骤不是100％有效的。因此，将部分消耗的发酵培养基50的至少一部分从混合物中分离30，并且剩余的混合物包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50。然后，将分离的部分消耗的发酵培养基50的至少一部分重新引入第一发酵容器20中。在分离步骤30之后，包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物然后将继续进行其余的真菌蛋白产生方法。
将分离的部分消耗的发酵培养基50循环到第一发酵容器20中，替换了发酵培养基10中的水、葡萄糖和/或营养内容物。因此，可以减少引入第一发酵容器20的发酵培养基10的体积。发酵培养基10所需水体积的减少将减少操作成本，因为在有氧发酵方法中使用的水在被用在发酵培养基10中之前需要预处理。这也将减少该方法产生的废流出物的体积。由于操作真菌蛋白产生方法的大容量设备(通常在10,000L至700,000L之间)，发酵培养基10和废流出物二者中的水的这种减少显著减少了真菌蛋白产生过程的碳足迹。
通过在有氧发酵后将分离的部分消耗的发酵培养基50直接重新引入第一发酵容器20中，分离的部分消耗的发酵培养基50将仍然包含真菌蛋白发酵所必需的营养物和葡萄糖。
如图1中示出的，在分离步骤30之后，包含真菌蛋白60和部分消耗的培养基50的混合物然后经历热处理步骤40，以便使可能存在的核酸诸如RNA降解。在热处理40之前从混合物中分离30部分消耗的发酵培养基50的至少一部分的优点是需要经历热处理40的混合物的体积显著减少。由于缩短的处理时间和降低的对蒸汽、电和废物处理和处置的要求，这导致降低的方法操作成本。
在热处理40后，进行第二分离步骤30以从包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物中分离部分消耗的培养基50的至少一部分。
然后，使包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物经历另外的处理步骤以提供分离的真菌蛋白60。来自第二分离步骤30的分离的部分消耗的发酵培养基50可以作为废流出物从该过程中处置或排出，或在如图2至4描述的方法中循环。
参考图2，示出了本发明的第二实施方案，其中热处理40后获得的分离的部分消耗的发酵培养基50的至少一部分被循环到或重新引入第一发酵容器20中。
在该阶段，在分离的部分消耗的发酵培养基50被重新引入第一发酵容器20之前，需要另外的灭菌步骤。这是因为，在典型的真菌蛋白产生设备的设计中，第二分离步骤30通常在非无菌条件下通过离心进行。因此，分离的部分消耗的发酵培养基50在被重新引入第一发酵容器20前可以经历热灭菌或过滤灭菌。可以使用热交换器进行热灭菌。
参考图3，示出了本发明的第三实施方案，其中在热处理40前和热处理40后获得的分离的部分消耗的发酵培养基50的至少一部分被循环到或重新引入第一发酵容器20中。
在第一分离步骤30后重新引入分离的部分消耗的发酵培养基50不需要另外的灭菌步骤，因为该方法在此阶段是无菌的。
参考图4，示出了本发明的第四实施方案，其中真菌蛋白产生过程与现有的乙醇生物炼制集成在一起。在图4中，用于真菌蛋白产生过程的发酵培养基10是从乙醇产生过程中获得的。
在典型的乙醇生物炼制中，生物质原料诸如小麦、玉米或甘蔗经历厌氧发酵以产生乙醇。
原料，例如富含淀粉的谷物，诸如小麦或玉米，在原料处理罐中被碾磨或研磨以产生粉(flour)。将粉添加到醪液(mash)罐中，并与水和酶例如淀粉酶混合，以产生醪液，然后将醪液加热以将来自原料的淀粉水解成可发酵的糖。醪液罐以两阶段加热；将醪液加热到85℃持续两小时，然后将温度降低到60℃并维持在60℃持续四小时。然后将得到的富含葡萄糖的水解的醪液用作发酵培养基10的一部分，用于有氧发酵反应。
将水解的醪液10的一部分从醪液罐中取出并提供到第一发酵反应容器20。在水解的醪液被添加到第一发酵反应容器20之前，水解的醪液任选地被过滤灭菌并经历糖化步骤。过滤灭菌方法包括离心水解的醪液，然后过滤，任选地使用0.2μm过滤器。然后将液相添加到第一发酵反应容器20中。
然后将水解的醪液与至少一种氮源、水和营养物混合以产生如以上描述的发酵培养基10。
在图4中，热处理40前和热处理40后获得的分离的部分消耗的发酵培养基50的至少一部分被循环到或重新引入第一发酵容器20中。
另外，将经热处理40后获得的分离的部分消耗的发酵培养基50的第二部分引入第二发酵反应容器100。通过将温度降低至30℃并用产醇的微生物诸如酿酒酵母接种发酵培养基，将厌氧发酵反应条件引入第二容器100。
厌氧发酵反应产生包含乙醇110和残留物的发酵醪液，将发酵醪液转移到蒸馏容器。蒸馏容器在63℃在真空操作，以使生物乙醇110与发酵残留物分离。二氧化碳作为发酵反应的副产物产生。
为支持本发明进行了以下实验。
实验1A：在热处理步骤前分离真菌蛋白和部分消耗的培养基(12L)
通过将表1中列出的营养物添加至12L的去离子水来制备发酵培养基10。
发酵培养基组分 浓度(g/L)
硫酸钾(K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>) 2
七水合硫酸镁(MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O) 0.9
乙酸钙(Ca(C<sub>2</sub>H<sub>3</sub>O<sub>2</sub>)<sub>2</sub>) 0.2
磷酸(85％) 1.15(mL/L)
七水合硫酸铁(II)(FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O) 0.005
七水合硫酸锌 0.025
四水合硫酸锰(MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O) 0.02
七水合硫酸铜(CuSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O) 0.0025
表1：发酵培养基的营养物组成
将培养基10添加到第一发酵容器20中，并通过使用加热的水套加热发酵容器20来灭菌。温度维持在121℃持续30分钟。在灭菌前，注意小心地固定第一发酵容器20中的所有连接件；例如，所有添加端口都使用橡胶隔膜和相应的套环配件固定。
在灭菌后，在将第一发酵容器20冷却到环境温度后，在无菌条件下使用蠕动泵将过滤灭菌的葡萄糖(44g/L)、生物素(0.000025g/L)和盐酸胆碱(0.087g/L)转移到第一发酵容器20中。
在灭菌前，将溶解氧(DO)探头插入发酵容器20中。然后在灭菌后校准探头。在30℃的发酵温度，使用压缩空气和氮气以10L/min(1VVM(空气体积/液体体积/分钟))的气流和300rpm的搅拌速度校准DO探头。氮气以10L/min的速率冲洗通过吹扫器(sparger)，以实现DO探头的0％校准。类似地，然后将压缩空气吹扫到发酵培养基10中，直至达到饱和(即，观察到恒定读数)以允许100％校准。空气通过无菌入口过滤器和吹扫器进入第一发酵容器20。空气首先通过冷凝器逸出，以确保没有培养基10的损失，并且然后通过出口过滤器。此后，使用合适的碱(在本实施例中，使用35％氢氧化铵作为碱)将发酵培养基10的pH调节至pH 6.0。
通过将1L的1％w/v接种物(去离子水中的镶片镰孢菌)添加到发酵容器20中来启动发酵。这提供了13L的最终的发酵培养基10的体积和7.7％v/v的接种物浓度。发酵在30℃在受控有氧环境下进行，使用可变搅拌(300rpm至1200rpm)和通气(1VVM至3VVM)维持的溶解氧水平(DO-30％)。在发酵过程中，氢氧化铵(35％)用于pH控制和作为氮源二者。
继续发酵直至达到约18g/L干重的生物质(真菌蛋白)浓度。然后，通过以等于微生物生长速率(约0.2h-1)的速率向第一发酵容器20添加另外的新鲜发酵培养基(在表1中列出)来维持发酵。添加新鲜发酵培养基约3.5小时，以提供约20g/L的最终生物质(真菌蛋白)浓度。
从发酵容器20中取出包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的所得混合物，用于分离(isolation)或分离(separation)30。
在本实验中，使用碟式离心机分离真菌蛋白60和部分消耗的培养基50。然而，应理解，可以使用其他分离技术。例如，过滤或错流过滤。
混合物以约10L/h的流量进料到碟式离心机中。碟式离心机以约10,000g的离心力运行1小时。本实施例中使用的碟式离心机是GEA,Westfalia Pathfinder PSC 1，碟间距被设置为0.77mm。
在该步骤期间，从离心机连续收集液相，而固体被捕获在碗内。一旦碗内的固体的体积达到最大容量(1L)，固相被射出并作为浆料/糊状物收集。浆料包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50。
从碟式分离收集的总干生物质为127.8g/L。来自碟式分离的预期干生物质为169.4g/L(通过将混合物中的生物质的干重(18g/L)与发酵的发酵培养基的体积(9.41L)相乘来计算)。因此，来自碟式分离的固体回收率为75％。
在本实施例的条件下，通过使用所描述的分离或脱水步骤的固体浓缩的手段，包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物的体积减少了92％。所收集的浆料/糊状物的生物质浓度为约18％(w/w)固体。然而，取决于关于前行通过下游真菌蛋白工艺步骤的物质的固体/液体含量的下游工艺要求，这可以通过改变固体排出间隔或补料流速来调节。
第二碟式分离可以任选地在第一碟式分离后进行。剩余的物质(即，在第一分离后剩余在离心机中的物质)以20L/h、30L/h和40L/h的增加的流量离心。第二离心的目的是迫使固体从离心机完全突破(breakthrough)。
测量混合物中的真菌蛋白菌丝的菌丝长度以确定碟式离心机是否对菌丝长度有影响。
使用扫描电子显微镜(SEM)分析包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物，并且在图5中示出所产生的图像。使用Nikon Eclipse TE2000-S显微镜在噬菌体对比度模式捕获图像，并使用Image J追踪软件测量单个菌丝长度。捕获并分析约10幅图片/样品，以计算每个样品的平均菌丝长度/中位菌丝长度。
图5(a)示出从真菌蛋白发酵获得的包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物的两幅图像。分析了七个独立批次，并在下表2中列出平均菌丝长度。图5(b)示出在第一碟式分离后回收的固相(包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基的混合物)的两幅图像。分析了一个批次，并在下表2中列出平均菌丝长度。图5(c)示出了在第一碟式分离的第二实例后回收的固相(包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基的混合物)的两幅图像。分析了一个批次，并在下表2中列出平均菌丝长度。
Figure BDA0003703079560000201
表2：对以下的菌丝长度测量：(i)在分离前包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养 基的混合物(真菌蛋白肉汤)；和(ii)从碟式离心回收的固相。
将真菌蛋白肉汤-7和两个经离心的样品进行比较，计算出第一分离和第二分离分别存在39％和30％的菌丝长度减少。然而，当应用于其他批次的真菌蛋白肉汤时，39％的减少仍会导致>200μm的平均菌丝长度。
使用传统分离技术很难在热处理前分离混合物，因为混合物在热处理前不能重力沉降。然而，本实验显示，在热处理前分离包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物是可行的，并且使用碟式离心机维持了真菌蛋白菌丝的合理菌丝长度。
然后使固相经受真菌蛋白产生方法的其余部分以分离最终产品。
通过替换对发酵培养基10中的新鲜水的要求，可以将液相(分离的部分消耗的发酵培养基)循环回到真菌蛋白发酵过程中。由于液相富含营养物且没有被热处理降解，该步骤减少了原料成本，并且也减少了将液相作为废流出物处理的成本和环境负荷。
实验1B：在热处理步骤之前分离真菌蛋白和部分消耗的培养基(18L)
如下进行根据实验1A的另一个实施例。
按表1制备工作体积为18L的发酵培养基10。将发酵培养基10添加到30L发酵容器20中并在121℃原位灭菌30分钟。在灭菌周期结束时，发酵容器20被冷却到30℃，将搅拌设置为200rpm并将气流设置为1VVM。
将生物素溶液(0.000025g/L)和盐酸胆碱溶液(0.087g/L)过滤灭菌，并无菌地添加到经热灭菌的葡萄糖溶液(在121℃高压灭菌20分钟)。然后将葡萄糖/生物素/胆碱溶液无菌地转移到发酵容器20中。
然后使用25％氢氧化铵溶液将发酵培养基10的pH调节至pH 6.0，将DO探头校准到100％氧气，并将其被设置为通过搅拌器然后气流的级联将DO控制在30％。
用10％工作体积的在种子培养中生长至约5g/L生物质浓度的镶片镰孢菌接种发酵容器20。
发酵采用分批模式操作，直至生物质达到指数后期(late exponential phase)并且生物质(真菌蛋白)浓度恒定在12g/L干重。
收获所得的包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物(取出真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50)，其中部分消耗的发酵培养基50经历脱水步骤以分离可用于循环回该方法中的部分消耗的发酵培养基50的一部分。
来自脱水步骤的固体级分(包含真菌蛋白)可以用RNA减少步骤和最终固液分离进一步处理，以产生用作食品成分的25％固体真菌蛋白糊状物。
将碟式连续离心机用于本实施例中的脱水步骤。碟式离心机以10,000g的碗速和12L/h的流量运行。碟式碗具有1L的液体容纳体积，该体积是通过泵入水来填充碗并记录当离心液线出现流体时所添加的体积验证的。排出间隔通过装载到碗中的固体的量确定，例如，在2L的进料中，总共添加24g的固体，通过在添加2L的进料后排出，24g将以1L体积排出，提供了2.4％的固体/离心液比率，导致脱水50％。
在本实验1B中进行了五个实施例，每个实施例的目的在于改变脱水的百分率，以展示控制程度和脱水程度是可行的。
本实验1B的目的是展示部分消耗的发酵培养基脱水50％，其在实验1B实施例2中展示。在实施例2中，将碗容量的两倍(2L)进料到碟堆(disc stack)中，并在添加2L的肉汤后，将碗中的固体排出。在排出时，理论上碗含有24g固体和1L离心液，剩余的1L已经作为离心液(低固体级分)连续地离开碗。测量从碗排出的物质(浓稠物(thick))的固体(干固体)百分率，以计算脱水百分率和浓缩系数。
对于50％脱水(实验1B，实施例2)，浓稠物级分具有2.34％的固体含量(理论值＝2.4％)，并且因此使部分消耗的发酵培养基脱水49％。从操作的角度来看，在连续发酵过程中，取出的离心液可以返回到发酵容器中而无需另外的热灭菌。
进行实施例1、3、4和5以展示脱水步骤，其中根据方法要求可在制造过程中应用减少的或增加的目标脱水百分比(参见表3)。
Figure BDA0003703079560000221
表3：来自实验1B的碟式脱水实施例1-5
实验1C：在热处理步骤之前分离真菌蛋白和部分消耗的培养基(100L)
如下进行根据实验1A的另一个实施例。
按表1制备工作体积为100L的另一发酵培养基10。对300L发酵容器20进行蒸汽灭菌(SIP)，然后将发酵培养基10(包含葡萄糖、生物素和胆碱)过滤到容器中。
操作参数(温度、气流、压力、DO)按实验1A和1B设置。用10L的生物质(真菌蛋白)浓度为14g/L的种子培养物(镶片镰孢菌)接种发酵容器20。
发酵容器20以批次模式运行，直至生物质达到5g/L的浓度。以40L/h的流量从发酵容器20中收获包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的所得的混合物，并将其进料到沉降式连续离心机中而不进行热处理。
在五个实施例中改变沉降碗速和差速设置(参见表4)，目的是将混合物脱水到≤10％的干固体的固体含量。
Figure BDA0003703079560000231
表4：实验1C的沉降脱水实施例1至5
实施例1-5也在水浴中经历热激(73℃，20分钟)。这展示热处理在将总RNA含量从新鲜生物质的约11％的值降低到人类消耗所需并符合申请人的说明的<2％方面的有效性。增加的固体载量(相对于目前的真菌蛋白制造中被处理的1.6％固体)将影响热传递到物质中。然而，表5中的数据展示，致密如12％总固体的生物质溶液(相当于120g/L生物质浓度)中的足够的RNA减少。
热处理前的这种脱水水平将具有以下益处：大幅减少在RNA减少步骤期间需要被加热至73℃的物质的体积，以产生25％固体糊状物作为最终食品成分。
Figure BDA0003703079560000232
Figure BDA0003703079560000241
表5：来自实验1C的样品热处理后的RNA分析
实验2：将热处理后将分离的部分消耗的培养基的至少一部分重新引入真菌蛋白 发酵中
进行有氧发酵以提供包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物。
使混合物经历热处理40，以灭活微生物，减少RNA含量，并杀死可能存在的和可能干扰后续方法步骤的任何细菌。
通过过滤分离混合物以提供固相(包含真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50的混合物)和液相(分离的部分消耗的培养基50)。热处理后的过滤可以通过任何合适的过滤技术进行。在本实验中，分离通过真空泵过滤使用Whatman定性滤纸(等级4，240mm)进行。
然后将分离的部分消耗的培养基50用作随后的真菌蛋白发酵中的水。
如下地准备随后的真菌蛋白发酵。用表6中的原料组分制备发酵培养基10。
组分 浓度(g/L)
磷酸二氢钾(KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>) 20
硫酸钾(K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>) 0.3
氯化铵(NH<sub>4</sub>Cl) 4.4
七水合硫酸镁(MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O) 0.25
二水合氯化钙(CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O) 0.01
六水合氯化铁(III)(FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O) 0.01
柠檬酸(HOC(COOH)(CH<sub>2</sub>COOH)<sub>2</sub>·H<sub>2</sub>O) 0.0075
氯化锌(ZnCl<sub>2</sub>) 0.005
二水合氯化锰(MnCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O) 0.0041
二水合氯化铜(CuCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O) 0.001
六水合氯化钴(CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O) 0.00145
钼酸钠(Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>) 0.001
生物素 0.00005
葡萄糖(纯) 10
表6：发酵培养基组分
将表6中的组分添加到烧瓶中，并使用来自第一发酵的分离的部分消耗的培养基50制成1L体积。
使用镶片镰孢菌使包含循环的分离的部分消耗的培养基50的培养基10在30℃和150rpm的轨道振荡器中孵育的烧瓶中发酵，以提供包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物。
在发酵反应启动后的0小时、4小时、8小时、20小时和24小时通过HPLC对有氧发酵反应进行分析。使用用缓冲液(pH 7和pH 4)校准的pH探头(Mettler-Toledo,U.K.)监测反应的pH。HPLC使用Agilent 1290Infinity LC系统和RezexTMROA-有机酸H+(8％)、LC柱(150x7.8mm)进行。HPLC条件如下：柱温维持在40℃，流动相为0.005N硫酸，流量为0.5mL/min。
实验一式两份进行，并且结果在图6中提供。在最初的24小时内产生了约11g/L的生物质(真菌蛋白)，并且葡萄糖浓度从约13g/L降低至0g/L。pH在最初的8小时内保持在约pH 6，并且然后在24小时之前降低至pH 4。
生物质产量通过将24小时内生物质浓度的变化除以24小时内葡萄糖浓度的变化来计算。使用该计算，生物质产量为0.75Yx/s。
使用蒸馏水(即不使用循环的分离的部分消耗的培养基)的真菌蛋白发酵的生物质产量为约0.5Yx/s(数据未示出)。
因此，本实验显示，用循环分离的部分消耗的培养基50替换发酵培养基10中的蒸馏水不影响真菌蛋白发酵的生物质产量。使用分离的部分消耗的培养基获得略高的生物质产量。不希望受理论束缚，这可能是由于微生物能够代谢存在于部分消耗的培养基50中的其他产物，诸如氨基酸。
实验3：部分消耗的培养基循环流的控制
使用实验1A中列出的发酵培养基10和条件进行连续有氧发酵。
图7示出了连续发酵反应中生物质浓度对葡萄糖浓度的相关性图。这种相关性可以用来从发酵反应期间的生物质读数推断葡萄糖浓度。
然后这可以用来确定发酵反应所需的循环的分离的部分消耗的培养基和发酵培养基的体积。这个理论实验是基于葡萄糖浓度的控制，但应理解，同样的计算可以基于控制发酵培养基的任何其他组分来进行。
表7中的数据用于计算在该方法中使用50％循环的分离的部分消耗的培养基的真菌蛋白发酵所需的分离的部分消耗的培养基的体积和发酵培养基的体积。
葡萄糖营养进料中的葡萄糖浓度(g/L) 700
部分消耗的培养基中的葡萄糖浓度(g/L) 5
发酵容器中所需的葡萄糖的连续进料(g/L) 33
发酵体积(L) 150000
稀释率(h<sup>-1</sup>) 0.2
进料流量(L/h) 30000
表7：用于计算使用50％循环的分离的部分消耗培养基的真菌蛋白发酵所需的部 分消耗培养基的体积和发酵培养基的体积的数据。
使用表7中的数据，可以计算维持33g/L葡萄糖连续进料到发酵容器中所需的发酵培养基和部分消耗的培养基的体积和浓度。
结果在下表8中提供。
发酵培养基中来自营养进料的葡萄糖浓度(g/L) 30.5
发酵培养基中的营养进料的体积(L) 1307
发酵培养基中的水的体积(L) 13693
来自部分消耗的培养基的葡萄糖浓度(g/L) 2.5
部分消耗的培养基的体积(L) 15000
表8：使用50％循环的部分消耗的培养基的真菌蛋白发酵所需的部分消耗的培养 基的体积和发酵培养基的体积。
这显示，通过引入循环步骤，发酵培养基中的水的体积可减少约15,000L。这为真菌蛋白产生方法节省了大量的成本和能源。
当真菌蛋白产生方法与乙醇生物炼制集成在一起时，由于设备规模较大，成本节约更为显著。例如，在典型的集成方法中，从生物炼制为有氧发酵容器20中的发酵培养基10提供48,000kg/hr的水。真菌蛋白产生方法之后，返回乙醇生物炼制以经历厌氧发酵的水的体积为46770kg/hr。然而，通过循环来自真菌蛋白发酵方法的部分消耗的培养基，作为发酵培养基10所需的来自生物炼制的水减少至24000kg/hr。此外，返回乙醇生物炼制以经历厌氧发酵的水的体积减少至23,150kg/hr。这减少了厌氧发酵阶段增加的水输入引起的对生物乙醇产生方法的影响，并且也减少了该方法排出的废流出物。
实验4：连续循环部分消耗的培养基对培养基营养物的影响的确定
通过向去离子水中添加表9中列出的营养物来制备发酵培养基10。
Figure BDA0003703079560000271
表9：发酵培养基的营养物组成
将培养基10添加到第一发酵容器20，并通过使用将蒸汽引入包围发酵容器20的加热套的热灭菌来灭菌。温度维持在121℃持续30分钟。在灭菌前，注意小心地固定第一发酵容器20中的所有连接；例如，所有添加端口都使用橡胶隔膜和相应的套环配件固定。
在灭菌后，在将第一发酵容器20冷却到环境温度后，在无菌条件下使用蠕动泵将过滤灭菌的葡萄糖(44g/L)、生物素(0.00005g/L)、微量盐(Fe、Cu、Mn、Zn)和盐酸胆碱(0.087g/L)转移到第一发酵容器20中。
在灭菌前，将溶解氧(DO)探头插入发酵容器20中。然后在灭菌后校准探头。在30℃的发酵温度，使用压缩空气和氮气以10L/min(1VVM)的气流和300rpm的搅拌速度校准DO探头。氮气以10L/min的速率冲洗通过吹扫器，以实现DO探头的0％校准。类似地，然后将压缩空气吹扫到发酵培养基10中，直至达到饱和(即，观察到恒定读数)以允许100％校准。空气通过无菌入口过滤器和吹扫器进入第一发酵容器20。空气首先通过冷凝器逸出，以确保没有培养基10的损失，并且然后通过出口过滤器。此后，使用合适的碱(在本实施例中，使用35％氢氧化铵作为碱)将发酵培养基10的pH调节至pH 6.0。
通过将1L的1％w/v接种物(去离子水中的镶片镰孢菌)添加到发酵容器20中来启动发酵。这提供了发酵容器中的10％v/v接种物的最终浓度。发酵在30℃在受控有氧环境下进行，使用可变搅拌(300rpm至1200rpm)和通气(1VVM至3VVM)维持的溶解氧水平(DO-30％)。在发酵过程中，氢氧化铵(35％)用于pH控制和作为氮源二者。
发酵完成后，使包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物经历热处理，以灭活微生物并减少RNA含量。
通过过滤分离混合物以提供固相(真菌蛋白60和部分消耗的发酵培养基50)和液相(分离的部分消耗的培养基50)。热处理后的过滤可以通过任何合适的过滤技术进行。在本实验中，分离通过真空泵过滤使用Whatman定性滤纸(等级4，240mm)进行。
然后将分离的部分消耗的培养基50过滤灭菌并用作随后真菌蛋白发酵的培养基中的水。
本实验重复六次，以确定培养基循环对发酵培养基中的营养物的影响。
具体地，如以上列出地制备第一批次，并在发酵结束时在热处理步骤之后，测量包含真菌蛋白60和部分消耗的培养基50的混合物中钾、硫酸根、磷酸根、钙、镁和葡萄糖的浓度。
通过用5L的来自第一批次的分离的部分消耗的培养基50代替5L的发酵培养基中的水来制备第二批次。分离的部分消耗的培养基在被引入第二批次前被过滤灭菌。第二批次中的发酵培养基的所有其他培养基组分与第一批次的相同。
接下来的四个批次以类似的方式制备，其中5L的来自先前批次的分离的部分消耗的培养基50被添加到每一随后批次中。
结果在图8和图9中示出。特别是，数据显示培养基营养物在约四次随后发酵后达到平衡。镁是发酵期间消耗最多的培养基组分，并可以用于确定实验3中列出的循环策略。此外，发现循环分离的部分发酵培养基中的营养物的积累对微生物或真菌蛋白产物没有有害影响。
实验5：循环脱水的部分发酵培养基
在10L、150L和200L搅拌罐反应器(发酵容器)中进行了多次连续发酵，其中发酵培养基组成如表10中示出的，并使用实验1A中列出的条件和程序。在使用中，并且当部分消耗的发酵培养基与原始发酵培养基合并时，这样形成的连续发酵培养基包含如表10中列出的组分。组分包括葡萄糖和营养物。氮源也是所需的，并且在单独的独立控制下添加。
Figure BDA0003703079560000291
表10：发酵培养基和/或连续发酵培养基(部分消耗的发酵培养基和原始发酵培养 基)中组分的量
在本文列出的实验中，分离部分消耗的发酵培养基的至少一部分，并且然后将其重新引入发酵容器，从而使其与原始发酵培养基混合并形成连续发酵培养基。当进行这种操作时，在发酵前发酵培养基中的碳水化合物(例如葡萄糖)的量被维持在至少15g/L，任选地33g/L的浓度。在发酵前发酵培养基中的其他营养物被维持在表10中陈述的浓度范围内。添加氮源(例如氢氧化铵、尿素、气态氨)并且氮源与碳水化合物和其他营养进料分开控制。
发酵条件和发酵培养基与本文列出的实验类似。调节连续阶段期间的稀释速率，以匹配真菌蛋白生物体的比生长速率，该速率在0.17h-1和0.2h-1之间变化。控制进入发酵容器的连续培养基的流和发酵肉汤的收获以匹配生物的生长速率(即在0.17h-1和0.2h-1之间)。容器体积乘以生长速率＝稀释速率(L/h)。
在这些稳态连续发酵过程中在不同时间点取得离心液样品，并在每个时间点(经由发酵培养基的干细胞重量测量)记录发酵容器内的生物质浓度。离心后(例如，沉降后离心)从液体流中取得离心液样品。
然后进行相关性评估，并计算葡萄糖和每种营养元素或离子的产量系数(Yx/s＝生物质产量/单位质量底物)。这在表11中图示。
Figure BDA0003703079560000301
表11：生物质的产量系数
来自表11的这些值与任何给定时间点的发酵容器中的已知生物质浓度组合，可用于维持连续发酵培养基中的正确量的葡萄糖(或其他营养物)。例如，使用葡萄糖利用的数据(该数据允许使用者计算离开发酵容器的含有给定生物质浓度的离心液的预期培养基组成)，可以将被进料到连续发酵的原始未发酵发酵培养基的量或组分调节到正确的组成，从而当与至少部分消耗的发酵培养基合并时，表10中提及的所有培养基组分的工作浓度保持恒定。
更详细地，使用来自表10和表11的值并知道至少一些变量(例如，生物质浓度、生物体的比生长速率和/或发酵容器的工作体积)，可以计算部分消耗的发酵培养基的特定组分的预期浓度。继而，这可用于计算应该对原始(即，先前未发酵的)发酵培养基进行的平衡或修改，以确保连续发酵培养基(即，包含和/或含有部分消耗的发酵培养基和原始发酵培养基二者)的组分保持在例如表10给出的范围内。
如所述的，可以计算每个离子物类的预期消耗，并且然后通过减少或以其他方式修改原始发酵培养基的量或组分，使进入发酵容器中的原始发酵培养基(“新鲜”进料)与也进入发酵容器中的循环的部分消耗的发酵培养基平衡。
说明这一点的等式是：
Figure BDA0003703079560000311
其中：
A＝产量系数(如以上陈述的)(g/g)
B＝“新鲜”进料的工作浓度(g/L)
C＝“循环”进料流的工作浓度(g/L)
X＝发酵罐中生物质的干细胞重量(g/L)
μ＝生物体的生长速率(h-1)
V＝发酵罐的工作体积
Qf＝循环的体积流量(L/h)
右侧的项可以用于调节循环开始时的‘B’的浓度。
返回到发酵容器的至少部分消耗的发酵培养基的比例可以从按(部分消耗的发酵培养基的总量的)体积计的1％至最大按体积计95％变化，但通常是按体积计40％至60％，并且最通常是按体积计50％。
以这种方式，显著比例的新鲜的水的使用从该方法中被移出，并且“废”水和(在至少部分消耗的发酵培养基中的)未使用的葡萄糖、氮源和营养物可以被循环，而不是被传递到第二发酵(诸如用于产生醇的酵母发酵)或可选地被传递到废水处理过程。
本文描述的改进的方法提供了用于获得真菌蛋白的高效、具有成本效益的方法。该方法可以并入现有的乙醇生物炼制，并且不需要另外的化学品或对现有方法进行修改。此外，从该方法排出的废流出物显著减少，原料体积减少，并且处理时间缩短。这导致用于产生真菌蛋白的更高效、具有成本效益和环境友好的方法。
虽然此发明已参照其示例实施方案被描述，但本领域普通技术人员将理解的是，在不脱离本发明作为整体的精神和范围的情况下，可以对本发明中的结构和要素做出改变。

Claims (25)

1.一种用于产生和分离真菌蛋白的连续方法，所述方法包括：
(i)提供适于产生真菌蛋白的发酵培养基；
(ii)将所述发酵培养基引入第一发酵容器；
(iii)使所述发酵培养基发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物；
(iv)从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物中分离所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分；和
(v)将所分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入所述第一发酵容器中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基包含适于产生真菌蛋白的碳水化合物，任选地其中所述碳水化合物是糖，任选地其中所述碳水化合物是葡萄糖、蔗糖或其来源。
3.根据权利要求2所述的方法，其中配置以下中的至少一种以在发酵前维持过量的碳水化合物：(a)在重新引入所述分离的部分消耗的发酵培养基的一部分之后提供发酵培养基；和(b)重新引入所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在发酵前维持过量的碳水化合物包括：(a)确定所述部分消耗的发酵培养基中的碳水化合物的浓度；和(b)调节被引入所述第一发酵容器的发酵培养基以在发酵前维持过量的碳水化合物，任选地其中调节所述发酵培养基包括减少以下中的至少一种：所提供的发酵培养基的量；和其中碳水化合物的浓度。
5.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述第一发酵容器是有氧发酵容器。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述发酵培养基用微生物发酵以获得包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的混合物，任选地其中所述微生物是丝状真菌，任选地其中所述丝状真菌选自由曲霉属(Aspergillus)的种、根霉属(Rhizopus)的种和镰孢菌属(Fusarium)的种组成的组中的一种或更多种，任选地其中所述微生物是镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物的另外的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物的所述步骤在从所述混合物中分离所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤之后。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物的所述步骤在将所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入所述第一发酵容器中的步骤之后。
10.根据权利要求7所述的方法，其中加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物的所述步骤在从所述混合物中分离所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤之前。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中从所述混合物中分离所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤包括第一分离步骤和第二分离步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一分离步骤在加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物的步骤之前，并且所述第二分离步骤在加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物的步骤之后。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中将所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入所述第一发酵容器中的步骤包括第一重新引入步骤和第二重新引入步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一重新引入步骤在所述第一分离步骤之后并且在加热包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物的步骤之前。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述第二重新引入步骤在所述第二分离步骤之后。
16.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述混合物中的所述真菌蛋白是基本上固体的相，并且所述混合物中的所述部分消耗的发酵培养基是包含营养物和碳水化合物的基本上液体的相，并且其中从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物中分离所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤包括分离所述基本上固体的相和所述基本上液体的相。
17.根据权利要求16所述的方法，其中从包含真菌蛋白和部分消耗的发酵培养基的所述混合物中分离所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分的步骤包括通过离心分离所述基本上固体的相和所述基本上液体的相，任选地其中所述分离通过过滤进行。
18.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中将所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入所述第一发酵容器中是循环步骤，任选地其中将所述部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入所述第一发酵容器中降低了所述方法需要的发酵培养基的量。
19.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括产生和分离乙醇的另外的步骤。
20.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述发酵培养基从原料获得，任选地其中所述原料是基于淀粉的原料和基于糖的原料中的至少一种，任选地其中所述原料在将所述发酵培养基引入所述第一发酵容器的步骤之前经历碾磨、研磨、凝胶化、液化和糖化中的一种或更多种。
21.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括将所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分引入第二发酵容器中的另外的步骤，任选地其中所述第二发酵容器是厌氧发酵容器。
22.根据权利要求21所述的方法，其中将所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分引入所述第二发酵容器中的步骤在将所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分重新引入所述第一发酵容器中的步骤之后。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述方法包括使所述第二发酵容器中的所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分发酵以获得乙醇的另外的步骤。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述分离的部分消耗的发酵培养基的至少一部分被重新引入第一发酵容器中，并且所述分离的部分消耗的发酵培养基的其余部分被引入第二发酵容器中。
25.通过权利要求1至24中任一项所述的方法可获得、获得或直接获得的真菌蛋白。
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