CN117343975A - 酵母菌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种酵母菌及其制备方法。所述酵母菌的制备方法，包括以下步骤：混合发酵底水和营养剂，制备发酵培养基；于所述发酵培养基中接种种子酵母，发酵培养8h~12h，并于发酵培养过程中加入碳源和磷源，制备所述酵母菌；其中，每225g的所述种子酵母中所含的活菌数为1.61×1013cfu/mL~1.64×1013cfu/mL；接种每225g的所述种子酵母对应加入950g~1200g的所述碳源以及对应加入33g~40g的所述磷源。本发明的制备方法有利于提高酵母菌中的核糖核酸含量。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种酵母菌及其制备方法。
背景技术
核糖核酸（RNA）承担着生命遗传信息载体和传输物质的功能，它在生命的延续、遗传特性的维持、成长、发育和细胞分化等方面发挥着重要的作用。RNA在食品加工过程中更是扮演着重要的角色，RNA可以用于肉制品加工，提高食品的储存期和口感质量，例如：酵母RNA被广泛应用于啤酒酿造和面包制作。
发酵法是通过利用微生物发酵来生产RNA，相比化学合成法等其他方法，发酵法生产RNA所需投入的成本较低，且操作流程相对简单，不需要特别的技术和设备支持，在实际应用中更适合大规模生产，利用富含RNA的酵母发酵提取RNA，是生产RNA的有效途径。
目前，工业上还存在发酵法所获得酵母菌中核糖核酸含量较少的问题。
发明内容
基于此，本发明提供一种酵母菌及其制备方法。
本发明第一方面提供一种酵母菌的制备方法，其技术方案如下：
一种酵母菌的制备方法，包括以下步骤：
混合发酵底水和营养剂，制备发酵培养基；
于所述发酵培养基中接种种子酵母，发酵培养8h~12h，并于发酵培养过程中加入碳源和磷源，制备所述酵母菌；
其中，每225g的所述种子酵母中所含的活菌数为1.61×1013cfu/mL~1.64×1013cfu/mL；
接种每225g的所述种子酵母对应加入950g~1200g的所述碳源以及对应加入33g~40g的所述磷源。
在其中一些实施例中，满足以下条件中的一个或多个：
（1）所述碳源为糖，所述糖由糖蜜处理液提供；
（2）所述磷源为磷酸。
在其中一些实施例中，还包括于发酵培养过程中加入氮源的步骤，接种每225g的所述种子酵母对应加入130g~260g的所述氮源。
在其中一些实施例中，所述氮源为硫酸铵。
在一些实施例中，所述碳源、磷源和氮源各自独立地以流加的方式加入。
在其中一些实施例中，所述流加的工艺参数满足以下条件中的一个或多个：
（1）流加所述碳源时，达到最大流速的时间为9h~12h；
（2）流加所述磷源时，达到最大流速的时间为6h~10h；
（3）流加所述氮源时，达到最大流速的时间为6h~10h。
在其中一些实施例中，所述发酵培养的工艺参数还满足以下条件中的一个或多个：
（1）发酵培养时，达到最大通风量的时间为5h~7h；
（2）发酵培养过程中，控制pH值由3.8~4.6上升至5.5~6.5；
（3）发酵培养的温度为28℃~34℃。
在其中一些实施例中，满足以下条件中的一个或多个：
（1）接种每225g的所述种子酵母对应加入3L~5L的所述发酵底水；
（2）接种每225g的所述种子酵母对应加入8g~14g的所述营养剂。
在其中一些实施例中满足以下条件中的一个或多个：
（1）所述营养剂包括维生素B1、生物素和无机盐中的一种或多种；
（2）所述种子酵母中的酵母菌为酿酒酵母。
在其中一些实施例中，所述维生素B1、生物素和无机盐的重量比为（0.09~0.15）：（0.0007~0.002）：（7~14）。
在其中一些实施例中，所述无机盐选自硫酸镁和/或硫酸锌。
本发明第二方面提供一种酵母菌，其由上述酵母菌制备方法制备而成。
与传统方案相比，本发明具有以下有益效果：
本发明经过一系列研究发现，酵母菌中RNA的含量受发酵培养过程中加入的碳源、磷源的量以及发酵培养的时间影响，且影响较大，其中，加入的碳源的量与酵母细胞总量密切相关，磷源的量与酵母核酸含量密切相关，在上述发现下，本发明优化了种子酵母在发酵培养基的发酵培养过程中所加的碳源和磷源的含量，并优化了发酵培养的时间，相对于优化前，可以保留更多的RNA，获得高RNA含量的酵母菌。相对于采用诱变育种和基因工程选育高RNA的方法，本发明的方法相对更简单快捷，且能适用于工业化大规模生产，提高大规模工业化生产所获得的酵母菌中的RNA含量，实际应用性能高，同时，本发明优化后的制备方法还可以保证产物的湿重，原料转化率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案、更完整地理解本发明及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为一实施方式的制备方法的流程示意图；
图2为实施例1的核酸含量与发酵时间的关系曲线；
图3为实施例2的核酸含量与发酵时间的关系曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本发明中，涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本发明中，涉及“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，涉及“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，涉及到百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中，涉及到百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中，%(w/w)与wt%均表示重量百分比，%(v/v)指体积百分比，%(w/v)指质量体积百分数。
本发明第一方面提供一种酵母菌的制备方法，请参见图1，在一个实施方式中，酵母菌的制备方法包括以下步骤：
混合发酵底水和营养剂，制备发酵培养基；
于所述发酵培养基中接种种子酵母，发酵培养8h~12h，并于发酵培养过程中加入碳源和磷源，制备所述酵母菌；
其中，每225g的所述种子酵母中所含的活菌数为1.61×1013cfu/mL~1.64×1013cfu/mL；
接种每225g的所述种子酵母对应加入950g~1200g的所述碳源以及对应加入33g~40g的所述磷源。
据报道，提高酵母生产核糖核酸的方法有：通过诱变育种或者分子生物学手段获得高核酸酵母生产菌株或利用基因工程技术对酵母菌进行改良，增强其核酸合成能力。但是诱变育种具有非定向性且工作量较大，在一些食品添加物料的生产限制使用基因工程菌。因而上述两种方法在高核酸酵母生产中受到一定限制。
本发明经过一系列研究发现，酵母菌中RNA的含量受发酵培养过程中加入的碳源、磷源的量以及发酵培养的时间影响，且影响较大，其中，加入的碳源的量与酵母细胞总量密切相关，磷源的量与酵母核酸含量密切相关，在上述发现下，本实施方式优化了种子酵母在发酵培养基的发酵培养过程中所加的碳源和磷源的含量，并优化了发酵培养的时间，相对于优化前，可以保留更多的RNA，获得高RNA含量的酵母菌。相对于采用诱变育种和基因工程选育高RNA的方法，本实施方式的方法相对更简单快捷，且能适用于工业化大规模生产，提高大规模工业化生产所获得的酵母菌中的RNA含量，实际应用性能高，同时，本实施方式优化后的制备方法还可以保证产物的湿重，原料转化率高。
可选地，所述碳源为糖，所述糖由糖蜜处理液提供。
进一步可选地，所述糖蜜处理液中的总糖浓度为30wt%~35wt%。通过上述方法制备酵母菌可以提高酵母菌中的RNA含量的同时，不影响糖蜜转化率。
进一步可选地，所述糖蜜处理液中的糖蜜为甘蔗糖蜜。
可选地，所述磷源为磷酸。
进一步可选地，磷酸由磷酸水溶液提供。
更进一步可选地，所述磷酸水溶液中磷酸的浓度为80wt%~90wt%。
可选地，还包括于发酵培养过程中加入氮源的步骤，接种每225g的所述种子酵母对应加入130g~260g的所述氮源。
可选地，所述氮源为硫酸铵。
进一步可选地，硫酸铵由硫酸铵水溶液提供。
更进一步可选地，所述硫酸铵水溶液中硫酸铵的浓度为45wt%~55wt%。
可选地，所述碳源、磷源和氮源各自独立地以流加的方式加入。
可选地，流加所述碳源时，达到最大流速的时间为9h~12h。
可选地，流加所述磷源时，达到最大流速的时间为6h~10h。
可选地，流加所述氮源时，达到最大流速的时间为6h~10h。
可选地，发酵培养时，达到最大通风量的时间为5h~7h。
可选地，发酵培养过程中，控制pH值由3.8~4.6上升至5.5~6.5。
可选地，发酵培养的温度为28℃~34℃。
发酵培养时，温度、达到最大通风量的时间、pH值的调整可提高酵母菌的生长速度和细胞活性，通过对上述参数进行调整，有利于保留更多的RNA，提高酵母菌中的RNA含量。
可选地，接种每225g的所述种子酵母对应加入3L~5L的所述发酵底水。
可选地，接种每225g的所述种子酵母对应加入8g~14g的所述营养剂。
可选地，所述营养剂包括维生素B1、生物素和无机盐中的一种或多种。
可选地，所述维生素B1、生物素和无机盐的重量比为（0.09~0.15）：（0.0007~0.002）：（7~14）。
可选地，所述无机盐选自硫酸镁和/或硫酸锌。
可选地，所述营养剂包括维生素B1、生物素、硫酸镁和硫酸锌，维生素B1、生物素、硫酸镁和硫酸锌的重量比为（0.09~0.15）：（0.0007~0.002）：（6~11）：（1~3）。
可选地，所述种子酵母中的酵母菌为酿酒酵母。酿酒酵母具备以下的优点，其在工业用途中成为生产RNA最主要的微生物菌体：①酿酒酵母细胞内RNA含量高。②适应性强：酵母菌类具有良好的代谢适应性，可以在不同的培养条件下生长和繁殖，适合大规模生产。③生长快速：酿酒酵母的生长周期短，可以快速地进行培养和扩增。④安全可靠：酿酒酵母属于真核生物，安全性较高，不会产生毒素或致病性物质。
可以理解地，种子酵母可按照常规工艺培养方法将常规的酿酒酵母菌种经过斜面菌种培养，一级种子液体培养、二级种子液体培养和发酵罐种子培养，得到发酵罐种子培养液，经过离心和重悬得到种子酵母乳，种子酵母乳湿重在600g/kg~680g/kg左右。
可以理解地，发酵培养后，可采用适当的分离纯化方法，获得酵母菌。例如，将发酵培养的发酵液通过普通立式离心机进行分离，倒掉酵母上清液后得到酵母乳，得到的鲜酵母用工艺软水进行洗涤后离心分离得到酵母菌。
本实施方式的方法可使核酸含量比优化前提高20%以上，且具有发酵周期短，产量高，产品质量稳定等优点，有利于工业化生产。
本发明第二方面提供一种酵母菌，在一个实施方式中，其由上述酵母菌制备方法制备而成。
以下结合具体实施例和对比例进行进一步说明，以下具体实施例和对比例中所涉及的原料，若无特殊说明，均可来源于市售，所使用的仪器，若无特殊说明，均可来源于市售，所涉及到的工艺，如无特殊说明，均为本领域技术人员常规选择。
1、材料和方法
1.1菌种
①酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，其已于2021年5月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61681，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。②酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB434已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61362，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
1.2甘蔗糖蜜处理液
取甘蔗糖蜜（总糖浓度在42wt%~48wt%左右），用工艺软水稀释糖蜜到总糖浓度范围在32wt%，其密度约为1.23g/mL，经加热处理、冷却沉淀、分离和高温灭菌处理，备用。
1.3 磷酸水溶液和硫酸铵溶液
获取85wt%的磷酸水溶液，其密度约为1.684g/mL，备用；
获取50wt%硫酸铵水溶液，其密度约为1.21g/mL，备用。
1.4 核酸检测方法（高氯酸法）
1.5 商品罐发酵液处理
发酵液经离心机离心分离（4000rpm，10min）后，加水4L~10L重悬沉淀后离心（4000rpm，10min），第二次加水4L~10L重悬沉淀后离心后得到的沉淀再用水重悬即为酵母乳。
2、酵母发酵处理
2.1 摇瓶扩培
取一环斜面1.1项下菌种接种到含5mL YPD培养基（酵母浸出粉胨葡萄糖培养基）的试管中，30℃、150r/min活化培养24h。按照2%的接种量转接到装液有50mL种子摇瓶培养基1的摇瓶培养基中，30℃、150r/min培养17h，将50mL种子培养液1全部转接至含有450 mL种子摇瓶培养基2的摇瓶中，30℃、150r/min培养22h，将培养好的种子液2放入4℃冰箱中备用。种子摇瓶培养基为常规的种子培养基，包括蔗糖、酵母粉、硫酸镁和磷酸二氢钾。
2.2 种子发酵
按常规工艺进行种子发酵，15L发酵罐中加入4L工艺软水、硫酸镁和硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入维生素B1和生物素，接种2.1项下培养的种子液2，流加总糖浓度为32wt%的甘蔗糖蜜、氨水和磷酸二氢铵溶液（灭菌处理），发酵28h后结束发酵，发酵液经离心分离，沉淀用工艺纯净水重悬得到种子酵母乳，种子酵母乳的湿重在650g/kg左右。
2.3 商品发酵
2.3.1对照例1（15L商品罐，菌株ZB434）
15L发酵罐中加入4L工艺软水作为发酵底水，再加入10g七水硫酸镁、2g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入110mg维生素B1、1.4mg生物素，接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳300mL（约346g），即将约含225g种子酵母（按湿重计，活菌数为1.62×1013cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加的方式加入发酵罐中，其中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为3800mL，到最大流速的时间为12h，最大流速为428.6mL/h；85wt%磷酸水溶液的总的流加量为30mL，到最大流速的时间为8h，最大流速为0.9mL/h，50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为264mL，到最大流速的时间为10h，最大流速为37.7mL/h。发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为1.6m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，15h后结束发酵，得发酵液。
取发酵过程中发酵11h的发酵液及发酵15h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
2.3.2对照例2（15L商品罐，菌株ZB421）
15L发酵罐中加入4L工艺软水作为发酵底水，再加入10g七水硫酸镁、2g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入110mg维生素B1、1.4mg生物素，接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳300mL（约346g），即将约含225g种子酵母（按湿重计，活菌数为1.62×1013cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加的方式加入发酵罐中，其中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为3800mL，到最大流速的时间为12h，最大流速为428.6mL/h；85wt%磷酸水溶液的总的流加量为30mL，到最大流速的时间为8h，最大流速为0.9mL/h，50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为264mL，到最大流速的时间为10h，最大流速为37.7mL/h。发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为1.6m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，15h后结束发酵，得发酵液。
取发酵过程中发酵11h的发酵液及发酵15h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
2.3.3对照例3（200L商品罐，菌株ZB434）
在200L商品发酵罐中加入44L工艺软水作为发酵底水，再加入130g七水硫酸镁、26g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入1.43g维生素B1、18.2mg生物素，然后接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳3.9L，将约含2925g种子酵母（活菌数为2.1×1014cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加方式加入发酵罐中，其中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为40000mL，到最大流速的时间为11h，最大流速为3000mL/h；85wt%磷酸水的总的流加量为425mL，到最大流速时间为6h，最大流速为57.89mL/h；50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为7000mL，到最大流速时间为6h，最大流速为905.88mL/h；发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为21m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，15h后结束发酵，得发酵液。
取发酵过程中发酵11h的发酵液及发酵15h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
2.3.4对照例4（200L商品罐，菌株ZB421）
在200L商品发酵罐中加入44L工艺软水作为发酵底水，再加入130g七水硫酸镁、26g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入1.43g维生素B1、18.2mg生物素，然后接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳3.9L，将约含2925g种子酵母（活菌数为2.1×1014cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加方式加入发酵罐中，其中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为40000mL，到最大流速的时间为11h，最大流速为3000mL/h；85wt%磷酸水的总的流加量为425mL，到最大流速时间为6h，最大流速为57.89mL/h；50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为7000mL，到最大流速时间为6h，最大流速为905.88mL/h；发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为21m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，15h后结束发酵，得发酵液。
取发酵过程中发酵11h的发酵液及发酵15h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
2.3.5实施例1（15L商品罐，菌株ZB434）
15L发酵罐中加入4L工艺软水作为发酵底水，再加入7.8g七水硫酸镁、1.56g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入85.8mg维生素B1、1.09mg生物素，接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳300mL（约346g），即将约含225g种子酵母（活菌数为1.62×1013cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加的方式加入发酵罐中，其中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为3000mL，到最大流速的时间为10h，最大流速为333.3mL/h；85wt%磷酸水的总的流加量为26mL，到最大流速时间为8h，最大流速为5.2mL/h；50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为235mL，到最大流速时间为10h，最大流速为38mL/h；发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为1.6m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，11h后结束发酵，得发酵液。
在发酵过程中每隔2h检测一下发酵液的核酸含量，结果如图2所示。取发酵过程中发酵9h的发酵液及发酵11h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
2.3.6实施例2（15L商品罐，菌株ZB421）
15L发酵罐中加入4L工艺软水作为发酵底水，再加入7.8g七水硫酸镁、1.56g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入85.8mg维生素B1、1.09mg生物素，接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳300mL（约346g），即将约含225g种子酵母（活菌数为1.62×1013cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加的方式加入发酵罐中，其中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为3000mL，到最大流速的时间为10h，最大流速为333.3mL/h；85wt%磷酸水的总的流加量为26mL，到最大流速时间为8h，最大流速为5.2mL/h；50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为235mL，到最大流速时间为10h，最大流速为38mL/h；发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为1.6m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，11h后结束发酵，得发酵液。
在发酵过程中每隔2h检测一下发酵液的核酸含量，结果如图3所示。取发酵过程中发酵9h的发酵液及发酵11h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
2.3.7实施例3（200L商品罐，菌株ZB434）
在200L商品发酵罐中加入44L工艺软水作为发酵底水，再加入102g七水硫酸镁、26g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入1.12g维生素B1、14.2mg生物素，然后接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳3.9L，将约含2925g种子酵母（活菌数为2.1×1014cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加方式加入发酵罐中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为32000mL，到最大流速的时间为10h，最大流速为3809.52mL/h；85wt%磷酸水溶液总的流加量为310mL，到最大流速时间为6h，最大流速为50.17mL/h；50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为5400mL，到最大流速时间为6h，最大流速为698.75ml/h；发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为21m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，11h后结束发酵，得发酵液。
取发酵过程中发酵9h的发酵液及发酵11h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
2.3.8实施例4（200L商品罐，菌株ZB421）
在200L商品发酵罐中加入44L工艺软水作为发酵底水，再加入102g七水硫酸镁、26g七水硫酸锌，用硫酸调pH至4.0，121℃，0.1Mpa下灭菌30min，冷却至30℃后加入1.12g维生素B1、14.2mg生物素，然后接种2.2项下15L发酵罐培养的种子酵母乳3.9L，将约含2925g种子酵母（活菌数为2.1×1014cfu/mL）接种到发酵罐中，此时发酵液的起始湿重在50g/L左右，随后进行发酵，将1.2项下的甘蔗糖蜜处理液、85wt%磷酸水溶液和50wt%硫酸铵水溶液通过流加方式加入发酵罐中，甘蔗糖蜜处理液的总的流加量为32000mL，到最大流速的时间为10h，最大流速为3809.52mL/h；85wt%磷酸水溶液总的流加量为310mL，到最大流速时间为6h，最大流速为50.17mL/h；50wt%硫酸铵水溶液的总的流加量为5400mL，到最大流速时间为6h，最大流速为698.75ml/h；发酵过程中，经过6h达到最大通风量，最大通风量为21m3/h。发酵过程中控制pH值由4.2逐渐上升至6.4，温度为30℃，11h后结束发酵，得发酵液。
取发酵过程中发酵9h的发酵液及发酵11h得到的发酵液，分别经分离、清洗处理后，得到酵母产品，检测酵母产品的品质，结果见表1。
表1
酵母菌株RNA含量在发酵过程中会受到来自发酵培养基、补料以及发酵培养条件的影响，在发酵过程中会随着生长、代谢等因素的变化，核酸含量也会发生变化。本申请发明人发现，酿酒酵母在生长期，酵母会迅速增殖，细胞数量急剧增加，当酿酒酵母细胞数量达到最高峰时，进入高度代谢期，此时，酵母开始进行大量的代谢活动，包括糖的分解、乙醇的合成等，同时也会合成相应的蛋白质和核酸，此时酵母核酸含量开始稳步上升。随后，细胞开始逐渐老化死亡，细胞数量开始下降，此时，酵母核酸含量开始下降。在此发现基础上，通过实施例1和实施例2对发酵培养的工艺进行调整，结合图2和图3可知，酵母核酸的含量在9h达到最高值，11h时，酵母核酸相较于9h核酸有略微的下降，但是依然可以维持较高的含量，结合表1数据可知，11h时的湿重相较于9h有明显增长，为了实现较高的核酸和湿重含量，因此，优选发酵时间为11h。
进一步地，由表1可知，本申请经过发酵培养工艺的调整，使得酵母湿重以及物料利用率不受工艺调整的影响的前提条件下，明显提高酵母菌种核酸的含量，且缩短了发酵周期。菌株ZB434在15L发酵罐的中发酵11h后核酸含量增加了20.6%；在200L发酵罐中发酵11h后的核酸含量增加了26.9%，菌株ZB421在15L发酵罐中发酵11h后的核酸含量增加了21.7%；在200L发酵罐中发酵11h后的核酸含量增加了26.5%。结果表明优化后的工艺可以有效提高酵母的发酵物料的核酸含量，且具有一定的通用性，对于发酵工艺生产有很好的实用价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种酵母菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
混合发酵底水和营养剂，制备发酵培养基；
于所述发酵培养基中接种种子酵母，发酵培养8h~12h，并于发酵培养过程中加入碳源和磷源，制备所述酵母菌；
其中，每225g的所述种子酵母中所含的活菌数为1.61×1013cfu/mL~1.64×1013cfu/mL；
接种每225g的所述种子酵母对应加入950g~1200g的所述碳源以及对应加入33g~40g的所述磷源。
2.根据权利要求1所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，满足以下条件中的一个或多个：
（1）所述碳源为糖，所述糖由糖蜜处理液提供；
（2）所述磷源为磷酸。
3.根据权利要求1所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，还包括于发酵培养过程中加入氮源的步骤，接种每225g的所述种子酵母对应加入130g~260g的所述氮源。
4.根据权利要求3所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，所述氮源为硫酸铵。
5.根据权利要求3所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，所述碳源、磷源和氮源各自独立地以流加的方式加入。
6.根据权利要求5所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，所述流加的工艺参数满足以下条件中的一个或多个：
（1）流加所述碳源时，达到最大流速的时间为9h~12h；
（2）流加所述磷源时，达到最大流速的时间为6h~10h；
（3）流加所述氮源时，达到最大流速的时间为6h~10h。
7.根据权利要求1至6任一项所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的工艺参数还满足以下条件中的一个或多个：
（1）发酵培养时，达到最大通风量的时间为5h~7h；
（2）发酵培养过程中，控制pH值由3.8~4.6上升至5.5~6.5；
（3）发酵培养的温度为28℃~34℃。
8.根据权利要求1至6任一项所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，满足以下条件中的一个或多个：
（1）接种每225g的所述种子酵母对应加入3L~5L的所述发酵底水；
（2）接种每225g的所述种子酵母对应加入8g~14g的所述营养剂。
9.根据权利要求1至6任一项所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，满足以下条件中的一个或多个：
（1）所述营养剂包括维生素B1、生物素和无机盐中的一种或多种；
（2）所述种子酵母中的酵母菌为酿酒酵母。
10.一种酵母菌，其特征在于，由权利要求1至9任一项所述的制备方法制备而成。
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