KR20220113918A - 인터류킨-2-유도체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IL-2 유도체를 제공한다. 이는 야생형 IL-2를 기반으로 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입함으로써, IL-2 유도체와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면을 부분적으로 또는 완전히 폐쇄하고, 동시에 β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물에 대한 친화력을 기본적으로 유지한다. 본 발명은 복합물을 더 제공한다. 여기에는 야생형 IL-2를 기반으로 제3 시스테인 잔기를 도입한 IL-2 유도체; 및 제4 시스테인 잔기를 구비하거나 도입한 폐쇄 모듈이 포함된다. 상기 IL-2 유도체 상의 제3 시스테인 잔기와 상기 폐쇄 모듈 상의 제4 시스테인 잔기는 분자 간 이황화 결합을 형성함으로써, IL-2와 폐쇄 모듈의 복합물을 형성하고, IL-2 유도체와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면을 부분적으로 또는 완전히 폐쇄하는 동시에, β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물에 대한 친화력을 기본적으로 유지한다.
Description
본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인터류킨-2 유도체 및 그 복합물에 관한 것이다.
1976년에 발견되어 T 세포 성장 인자(TCGF)로 알려진 인터류킨-2(IL-2)는 T 림프구와 NK 세포의 정상적인 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 구형 당단백질이다. 천연 IL-2는 133개 아미노산 잔기로 구성된 하나의 폴리펩티드이며, 분자량은 약 15kD이고, 58번째, 105번째, 125번째 위치에 각각 3개의 시스테인 잔기를 갖는다. 번역 후 변형은 3번째 위치의 Thr 글리코실화를 포함하고, 58번째와 105번째 위치의 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성하며, 기능에 필수적인 주로 4개의 α-나선 및 일부 연결 서열(loop)로 구성된 고차 구조(Bazan 등, Science 257, 410-413(1992))를 형성한다.
IL-2는 주로 활성화된 T 세포에 의해 생성된다. 이는 T 세포의 증식 및 분화를 촉진하며, T 세포 활성을 유지한다. 자연 살해(NK) 세포의 생성, 증식 및 활성화를 자극하고, 세포독성 T 림프구(CTL)의 생성을 유도하고 림포카인 활성 살해 세포(LAK) 및 종양 침윤 림프구를 유도 및 활성화하며, T 세포에 의한 사이토카인 및 세포 용해 분자의 발현을 촉진하고, B 세포의 증식을 촉진한다(Waldmann 등, Nat Rev Immunol 6, 595-601(2009)). 이러한 세포는 외인성 미생물 감염 세포 및 암세포를 사멸시키는 효과를 갖거나 간접적으로 갖기 때문에, IL-2는 우수한 항바이러스, 항암 작용 및 광범위한 임상 적용 가능성을 갖는다.
IL-2는 IL-2 수용체(IL-2R)를 결합하여 그 작용을 매개하며, IL-2 수용체(IL-2R)는 3개의 서브 유닛으로 구성되고 이는 각각 α(CD25), β(CD122) 및 γ(CD132) 수용체 서브 유닛이다. 여기에서 α 수용체는 주로 T 억제 세포(Treg) 및 일부 내피 세포(endothelial cells) 표면에서 발현되는 반면, β와 γ 수용체 서브 유닛은 이펙터 T 세포(Teff) 및 NK 세포에서 고도로 발현된다. IL-2는 서로 다른 수용체 서브 유닛의 복합물 형태에 대한 친화력이 다르다. IL-2는 α, β 및 γ 수용체 서브 유닛으로 구성된 복합체에 대한 친화력이 가장 높고, β와 γ 수용체 서브 유닛으로 구성된 복합체에 대한 친화력은 중간 정도(약 100배 더 낮음)이며, IL-2와 두 가지 형태의 수용체 서브 유닛 조합과 결합한 후에는 모두 신호를 전달할 수 있다(Minami 등, Annu Rev Immunol 11, 245-268(1993)). 그러나 임상적으로 저용량의 IL-2 조건에서는 Treg 세포 표면의 고친화성 수용체에 우선적으로 결합하여 면역억제작용을 일으켜 치료효과를 얻지 못한다. 고용량의 IL-2는 대량의 이펙터 T 세포를 활성화하여 Treg 활성화로 인한 면역 억제를 중화할 수 있으며, 동시에 더 많은 독성 부작용과 세포 사멸(activation induced cell apoptosis)이 나타날 수 있다.
IL-2의 항종양 작용을 기반으로, 고용량 IL-2(aldesleukin)는 흑색종 및 신장세포암의 임상 치료를 위해 1992년 FDA에 의해 승인되었다. 그러나 고용량의 IL-2를 투여 받는 환자는 종종 심혈관, 폐부종, 간, 위장, 신경 및 혈액학적 등의 사건을 포함한 심각한 부작용을 경험하며, 대부분의 이러한 부작용은 혈관(또는 모세혈관) 누출 증후군(VLS)으로 설명될 수 있으며, 이는 임상 및 동물 실험에서 IL-2 치료 부작용을 나타내는 지표이기도 하다. VLS를 유발하는 것은 내피 세포에서 IL-2의 고친화성 수용체(α, β 및 γ 서브 유닛)가 발현되기 때문이다(Krieg 등, Proc Nat Acad Sci USA107, 11906-11 (2010)). 따라서 α 수용체와의 결합을 약화 또는 제거하는 것은 IL-2가 T 세포 증식 활성 억제를 촉진시키는 기능에 도움이 된다. 동시에 내피 세포 α 수용체에 대한 결합을 감소시켜 IL-2 치료로 인한 독성 부작용을 감소 또는 제거할 수도 있다. IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 부위는 주로 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 65, 68 및 72번째 아미노산 부위에 있다(Rickert.M 등(2005) Science 308:1477-1480). Merck 및 Roche사 또는 기타 과학연구기관은 이러한 α 수용체 서브 유닛과 결합하는 IL-2 표면 아미노산을 중심으로 일부 돌연변이를 만들었다. 예를 들어 Merck사의 돌연변이체(R38W, F42K, WO2008003473A2)는 α 수용체 서브 유닛과의 상호 작용을 저하시켜 이펙터 T 세포 활성화를 구현하여 효능을 강화한다. Roche사의 IL-2 돌연변이체(F42A, Y45A 및 L72G, US 2016/0208017A1)는 α 수용체와 결합하지 않지만, β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물을 정상적으로 결합할 수 있고 효능을 발휘할 수 있으며 현재 임상에서 사용되고 있다.
따라서 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 상호 작용을 감소 또는 제거하는 것은 암 환자에서 치료 효능을 높이고 부작용을 줄이는 중요한 측면이 될 수 있다.
종래 기술의 결함을 감안하여, 본 발명은 IL-2 유도체 및 복합물을 제공한다.
본 발명의 일 양상은 IL-2 유도체를 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 유도체는 야생형 IL-2를 기반으로 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입함으로써, IL-2 유도체와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면을 부분적으로 또는 완전히 폐쇄하고, 동시에 β와 및 γ 수용체 서브 유닛 복합물에 대한 친화력을 기본적으로 유지한다. 야생형 IL-2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1로 표시된다.
또한 야생형 IL-2를 기반으로 도입하는 적어도 하나의 시스테인 잔기는,
a) IL-2 유도체의 분자 내 이황화 결합을 형성하거나, 또는
b) IL-2 유도체가 분자 간 이황화 결합을 통해 폐쇄 모듈과 결합할 수 있도록 만들 수 있는 것이다.
선택적으로, 상기 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입하는 것은 점 돌연변이 방식을 통해 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입하는 것이다.
선택적으로, 일 방식에 있어서, 야생형 IL-2를 기반으로 점 돌연변이 방식을 통해 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기를 도입하고, 상기 제1 시스테인 잔기와 상기 제2 시스테인 잔기 중 하나 또는 둘은 야생형 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면과 관련된 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이다. 여기에서 야생형 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면 관련 아미노산 부위는 37번째, 38번째, 41번째, 42번째, 43번째, 44번째, 45번째, 61번째, 62번째, 65번째, 68번째 및 72번째이다.
또한 제1 시스테인 잔기는 야생형 IL-2의 37번째, 38번째, 41번째, 42번째, 43번째, 44번째, 45번째, 61번째, 62번째 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이다. 제2 시스테인 잔기는 야생형 IL-2의 61번째, 62번째, 65번째, 68번째, 72번째 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이다. 선택적으로, "근처"는 1) 1차 구조 상에서 인접한 1 내지 4개 아미노산; 및/또는 3차 구조 상에서 인접한 아미노산이다.
또한 제1 시스테인 잔기는 K35C, L36C, R38C, M39C, L40C, T41C, F42C, K43C, F44C 및 E61C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이이다.
또한 제2 시스테인 잔기는 V69C, E62C, P65C, T111C, Y107C, A112C, T113C, I114C, L72C 및 A73C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이이다.
선택적으로, 분자 내 이황화 결합의 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기의 조합은 M39C와 V69C, F44C와 E62C, F44C와 P65C, F42C와 V69C, E61C와 Y107C, F42C와 P65C, F42C와 T111C, F42C와 A112C, F42C와 T113C, T41C와 A112C, L40C와 A112C, L40C와 T113C, L40C와 I114C, M39C와 L72C, M39C와 A73C, R38C와 V69C, R38C와 L72C, L36C와 V69C, L36C와 L72C, L36C와 A73C, K35C와 V69C 및 K43C와 A112C로 이루어진 군의 아미노산 점 돌연변이 조합에서 선택된다.
선택적으로, 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기의 잔기 센트로이드 벡터 거리는 6Å보다 작다.
선택적으로, 제2 방식에 있어서, 야생형 IL-2를 기반으로 점 돌연변이 방식을 통해 제3 시스테인 잔기를 도입하고, 상기 제3 시스테인 잔기는 야생형 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면과 관련된 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이다.
또한 제3 시스테인 잔기는 야생형 IL-2의 37번째, 38번째, 41번째, 42번째, 43번째, 44번째, 45번째, 61번째, 62번째, 65번째, 68번째, 72번째 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이다. 선택적으로, "근처"는 1) 1차 구조 상에서 인접한 1 내지 4개 아미노산; 및/또는 3차 구조 상에서 인접한 아미노산이다.
또한 상기 제3 시스테인 잔기는 P34C, K35C, T37C, R38C, T41C, K43C, F44C, Y45C, E61C, E62C, K64C, P65C, E68C 및 L72C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이이다.
또한 폐쇄 모듈 상에 제4 시스테인 잔기가 구비 또는 도입되고, IL-2 유도체 상의 제3 시스테인 잔기와 상기 폐쇄 모듈 상의 제4 시스테인 잔기는 분자 간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
선택적으로, 제3 시스테인 잔기와 상기 제4 시스테인 잔기의 잔기 센트로이드 벡터 거리는 6Å보다 작다.
선택적으로, 폐쇄 모듈은 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인이다.
또한 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 24로 표시된다.
또한 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인 상의 상기 제4 시스테인 잔기 위치는 D4C, D5C, M25C, N27C, R35C, R36C, K38C, S39C, G40C, S41C, L42C, I118C, Y119C 및 H120C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이로부터 선택된다.
선택적으로, 분자 간 이황화 결합을 형성하는 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기의 조합은 T41C와 N27C, P34C와 D4C, E68C와 L42C, Y45C와 R35C, R38C와 H120C, L72C와 M25C, E61C와 S39C, T41C와 I118C, K35C와 D4C, T37C와 D4C, R38C와 D4C, R38C와 D5C, T41C와 L42C, T41C와 Y119C, K43C와 R35C, K43C와 R36C, F44C와 L42C, K43C와 L42C, E61C와 K38C, E62C와 K38C, K64C와 S39C, K64C와 G40C, K64C와 S41C, P65C와 K38C로 이루어진 군의 아미노산 점 돌연변이 조합에서 선택된다.
제1 방식과 제2 방식을 불문하고, 선택적으로 점 돌연변이 방식을 통해 야생형 IL-2 125번째 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 전환한다.
또한 선택적으로, 야생형 IL-2 125번째 점 돌연변이는 C125A이다.
선택적으로, IL-2 유도체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 3 내지 SEQ ID NO. 24로 표시되거나, 또는 SEQ ID NO. 26 내지 40으로 표시된다.
본 발명의 제2 양상은 복합물을 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서 상기 복합물은,
1) 야생형 IL-2를 기반으로 제3 시스테인 잔기를 도입한 IL-2 유도체; 및
2) 제4 시스테인 잔기를 구비하거나 도입한 폐쇄 모듈을 포함한다.
상기 IL-2 유도체 상의 제3 시스테인 잔기와 상기 폐쇄 모듈 상의 제4 시스테인 잔기는 분자 간 이황화 결합을 형성함으로써, IL-2와 폐쇄 모듈의 복합물을 형성하고, IL-2 유도체와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면을 부분적으로 또는 완전히 폐쇄하는 동시에, β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물에 대한 친화력을 기본적으로 유지한다.
선택적으로, 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입하는 것은 점 돌연변이 방식을 통해 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입하는 것이다.
또한 상기 제3 시스테인 잔기는 야생형 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면 관련 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이다.
또한 상기 제3 시스테인 잔기는 야생형 IL-2의 37번째, 38번째, 41번째, 42번째, 43번째, 44번째, 45번째, 61번째, 62번째, 65번째, 68번째, 72번째 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이다. 선택적으로, "근처"는 1) 1차 구조 상에서 인접한 1 내지 4개 아미노산; 및/또는 3차 구조 상에서 인접한 아미노산이다.
선택적으로, 상기 제3 시스테인 잔기와 상기 제4 시스테인 잔기의 잔기 센트로이드 벡터 거리는 6Å보다 작다.
또한 제3 시스테인 잔기는 P34C, K35C, T37C, R38C, T41C, K43C, F44C, Y45C, E61C, E62C, K64C, P65C, E68C 및 L72C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이이다.
선택적으로, 상기 폐쇄 모듈은 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인이며, 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 25로 표시된다.
또한 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인 상의 상기 제4 시스테인 잔기 위치는 D4C, D5C, M25C, N27C, R35C, R36C, K38C, S39C, G40C, S41C, L42C, I118C, Y119C 및 H120C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이로부터 선택된다.
선택적으로, 분자 간 이황화 결합을 형성하는 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기의 조합은 T41C와 N27C, P34C와 D4C, E68C와 L42C, Y45C와 R35C, R38C와 H120C, L72C와 M25C, E61C와 S39C, T41C와 I118C, K35C와 D4C, T37C와 D4C, R38C와 D4C, R38C와 D5C, T41C와 L42C, T41C와 Y119C, K43C와 R35C, K43C와 R36C, F44C와 L42C, K43C와 L42C, E61C와 K38C, E62C와 K38C, K64C와 S39C, K64C와 G40C, K64C와 S41C, P65C와 K38C로 이루어진 군의 아미노산 점 돌연변이 조합에서 선택된다.
선택적으로, 야생형 IL-2 125번째 점 돌연변이는 C125A이다.
선택적으로, IL-2 유도체의 아미노산 서열과 상기 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인의 서열 조합은, SEQ ID NO. 26과 SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 27과 SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 28과 SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 29와 SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 30과 SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 31과 SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 32와 SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 33과 SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 34와 SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 35와 SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 36과 SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 37과 SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 38과 SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 39와 SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 40과 SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 41과 SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 42와 SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 43과 SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 44와 SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 45와 SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 46과 SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 47과 SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO. 48과 SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 49와 SEQ ID NO. 73으로 이루어진 군의 조합에서 선택된다.
본 발명의 제3 양상은 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 이는 상술한 IL-2 유도체를 인코딩하거나 상술한 복합물을 인코딩한다.
본 발명의 제4 양상은 발현 벡터를 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 여기에는 상술한 분리된 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 제5 양상은 숙주 세포를 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 여기에는 상술한 분리된 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 제6 양상은 조성물을 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 조성물은 상술한 IL-2 유도체 또는 상술한 복합물, 및 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다.
본 발명의 제7 양상은 상술한 IL-2 유도체 또는 상술한 복합물을 질병 치료용 약물 또는 제제의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 제8 양상은 상술한 IL-2 유도체 또는 상술한 복합물을 질병 개체의 면역계 자극용 조성물의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 제9 양상은 IL-2 유도체의 생성 방법을 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 방법은 상기 IL-2 유도체 발현에 적합한 조건에서 상술한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제10 양상은 복합물의 생성 방법을 제공한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 방법은 상기 복합물 발현에 적합한 조건에서 제37항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시방식에서 IL-2 유도체 또는 복합물은, 분자 내 또는 분자 간 이황화 결합을 형성하는 방식을 통해, IL-2 유도체와 α 수용체 결합의 부위를 폐쇄함으로써 α 수용체와의 결합 구조를 방지한다. 본 발명에서 IL-2 유도체 또는 복합물은 VLS를 감소시키거나 IL-2 치료로 인한 독성 부작용을 감소 또는 제거하는 새로운 방향이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 정제된 IL-2 유도체 SDS-PAGE 전기영동이다. 여기에서 환원은 환원제 β-ME를 로딩 완충액에 첨가하는 것이고, 비환원은 환원제를 첨가하지 않는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 IL-2 유도체와 IL2Rα 결합능을 시험한 Fortebio의 측정신호도이다. 농도는 100nM이고, 사용된 비관련 단백질 대조군은 HER2이다. 여기에서 도 2A는 IL-2 wt C125A에 대한 것이고, 도 2B는 IL-2 돌연변이체 1에 대한 것이고, 도 2C는 IL-2 돌연변이체 2에 대한 것이고, 도 2D는 IL-2 돌연변이체 3에 대한 것이고, 도 2E는 IL-2 돌연변이체 4에 대한 것이다. 도 2F는 IL-2 복합물 1에 대한 것이고, 도 2G는 IL-2 복합물 2에 대한 것이고, 도 2H는 IL-2 복합물 3에 대한 것이고, 도 2I는 IL-2 복합물 4에 대한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 Fortebio에 의해 테스트된 IL-2 유도체와 IL2Rβγ의 결합 친화력 테스트 신호도 및 Ka, kd, KD 및 R2이며, 농도 범위는 1.25nM 내지 40nM이다. 여기에서 도 3A는 IL-2 wt C125A에 대한 것이고, 도 3B는 IL-2 돌연변이체 1에 대한 것이고, 도 3C는 IL-2 돌연변이체 2에 대한 것이고, 도 3D는 IL-2 돌연변이체 3에 대한 것이고, 도 3E는 IL-2 돌연변이체 4에 대한 것이고, 3F는 IL-2 복합물 1에 대한 것이고, 도 3G는 IL-2 복합물 2에 대한 것이고, 도 3H는 IL-2 복합물 3에 대한 것이고, 도 3I는 IL-2 복합물 4에 대한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 CTLL-2(T 세포)의 증식 실험이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 IL-2 유도체와 IL2Rα 결합능을 시험한 Fortebio의 측정신호도이다. 농도는 100nM이고, 사용된 비관련 단백질 대조군은 HER2이다. 여기에서 도 2A는 IL-2 wt C125A에 대한 것이고, 도 2B는 IL-2 돌연변이체 1에 대한 것이고, 도 2C는 IL-2 돌연변이체 2에 대한 것이고, 도 2D는 IL-2 돌연변이체 3에 대한 것이고, 도 2E는 IL-2 돌연변이체 4에 대한 것이다. 도 2F는 IL-2 복합물 1에 대한 것이고, 도 2G는 IL-2 복합물 2에 대한 것이고, 도 2H는 IL-2 복합물 3에 대한 것이고, 도 2I는 IL-2 복합물 4에 대한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 Fortebio에 의해 테스트된 IL-2 유도체와 IL2Rβγ의 결합 친화력 테스트 신호도 및 Ka, kd, KD 및 R2이며, 농도 범위는 1.25nM 내지 40nM이다. 여기에서 도 3A는 IL-2 wt C125A에 대한 것이고, 도 3B는 IL-2 돌연변이체 1에 대한 것이고, 도 3C는 IL-2 돌연변이체 2에 대한 것이고, 도 3D는 IL-2 돌연변이체 3에 대한 것이고, 도 3E는 IL-2 돌연변이체 4에 대한 것이고, 3F는 IL-2 복합물 1에 대한 것이고, 도 3G는 IL-2 복합물 2에 대한 것이고, 도 3H는 IL-2 복합물 3에 대한 것이고, 도 3I는 IL-2 복합물 4에 대한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 CTLL-2(T 세포)의 증식 실험이다.
본 발명은 실시예를 참조하여 하기에 추가로 설명될 것이며, 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 보호 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
하기 실시예에서 구체적인 조건이 언급되지 않은 실험 방법은 통상적으로 일반적인 조건을 따른다. 예를 들어 Sambrook 등 분자 클론: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기술된 조건, 또는 제조업체의 지침에 따른 조건이 있다. 사용된 시약은 달리 명시되지 않는 한 시판되거나 공개적으로 획득 가능한 시약이다.
본원에서 IL-2 유도체와 야생형 IL-2의 관련 아미노산 위치는 야생형 IL-2의 아미노산 서열(예를 들어 SEQ ID NO. 1)을 기준으로 계산한다.
야생형 IL-2(IL-2 wt, SEQ ID NO. 1):
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT.
야생형 IL-2의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 146으로 표시된다.
본원에서 CD25-ECD의 관련 아미노산 위치는 SEQ ID NO. 25로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 계산한다.
본원에서 "제1", "제2", "제3" 등은 구분하기 위한 것으로 순서를 한정하는 것이 아니다. 예를 들어 하나의 유도체에는 "제3" 시스테인 잔기만 있을 수 있지만, 반드시 "제1" 및 "제2" 시스테인 잔기가 있는 것은 아니다.
본원에서 "IL-2 유도체"는 IL-2 돌연변이체, IL-2 돌연변이체와 기타 분자가 형성하는 복합물을 포함한다. IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2를 기반으로 돌연변이(예를 들어 점 돌연변이 또는 삽입 돌연변이)에 의해 형성되는 분자를 의미한다.
본원에서 "IL2Rα"는 인터류킨-2 수용체 α를 의미하며, "α 수용체 서브 유닛"으로도 불린다. "IL2Rβ"는 인터류킨-2 수용체 β를 의미하며, "β 수용체 서브 유닛"으로도 불린다. "IL2Rγ"는 인터류킨-2 수용체 γ를 의미하며, "γ 수용체 서브 유닛"으로도 불린다. "IL2Rβγ"는 인터류킨-2 수용체 β 및 수용체 γ에 의해 형성된 복합물을 의미하며, "β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물"로도 불린다.
종래 기술에서는 IL-2와 α 수용체의 결합을 감소 또는 제거하기 위해, 모두 IL-2와 α 수용체의 결합 표면 내의 아미노산에 대해 단순 돌연변이를 수행하였다.
본 발명의 구체적인 실시방식에 있어서, 채택된 전략은 추가적인 시스테인 잔기를 도입함으로써, IL-2 분자 내부에 새로운 이황화 결합을 형성하거나, IL-2가 분자 간 이황화 결합과 다른 폐쇄 모듈이 복합물을 형성하도록 함으로써 IL-2와 α 수용체의 결합 부위를 부분적으로 또는 완전히 폐쇄하는 것이다. 그러나 이는 β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물의 결합에는 영향을 미치지 않는다.
제1 구체적인 실시방식에 있어서, 제1 시스테인 잔기 및 제2 시스테인 잔기를 도입하여 IL-2 분자 내 이황화 결합을 형성함으로써, IL-2 유도체가 구조적으로 보다 안정적이고 장벽을 형성할 수 있도록 하여 α 수용체와의 결합 평면을 파괴한다.
제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기를 도입하는 방식은 야생형 IL-2를 기반으로 적절한 점 돌연변이를 수행하는 것이다. 도입해야 하는 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기의 위치는 주로 하기와 같은 방식으로 결정된다.
1) 제1 및 제2 시스테인 잔기의 위치는 IL-2와 α 수용체의 결합면 상의 아미노산 잔기 또는 그 근처의 아미노산 잔기이다. IL-2와 α 수용체의 결합면 상의 아미노산 잔기는 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 65, 68 및 72번째 아미노산 부위이다.
2) IL-2의 구조와 원자 간의 거리를 충분히 고려한다.
3) 생물정보학 및 단백질 공학 설계를 통해 상술한 아미노산 잔기 주위에서 잔기 센트로이드의 벡터 거리 기준에 따라 2개의 적합한 부위를 찾는다. 이는 분자 내 이황화 결합을 형성할 수 있으나, IL-2 분자 간 이황화 결합을 형성하기 쉽지 않거나 형성할 수 없다.
적합한 부위를 결정한 후, 돌연변이를 통해 원래의 아미노산 잔기를 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기로 돌연변이시킨다. 돌연변이된 IL-2 유도체(및 IL-2 돌연변이체)는 정상적인 전사 및 번역 후 분자 내 이황화 결합을 형성한다.
일부 실시예에 있어서, IL-2의 125번째 위치에 있는 원래의 유리 시스테인이 돌연변이되어 이것이 분자 간 이황화 결합 형성을 간섭하는 것을 방지한다.
일부 실시예에 있어서, 획득한 IL-2 돌연변이체의 아미노산 서열은 표 1과 같이 설계한다.
발현 숙주는 E.Coli 또는 포유동물 세포일 수 있다.
제2 구체적인 실시방식에 있어서, IL-2는 분자 간 이황화 결합과 폐쇄 모듈을 통해 복합물을 형성한다. 따라서 IL-2와 α 수용체의 결합 평면을 완전히 또는 부분적으로 폐쇄하여, IL-2와 내인성 α 수용체의 결합을 차단한다. IL-2와 폐쇄 모듈 사이의 이황화 결합은 야생형 IL-2 상에서 제3 시스테인 잔기를 도입하고, 폐쇄 모듈 상에서 제4 시스테인 잔기를 구비하거나 도입함으로써, 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기 사이에 형성된 것이다.
일 실시예에 있어서, 폐쇄 모듈은 α 수용체의 세포외 도메인이다. 야생형 α 수용체의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 25로 표시된다. 천연 상태에서, α 수용체와 IL-2의 결합은 안정적이지 않으므로(높은 해리 계수 Kd), 안정한 이종이합체를 형성할 수 없으며, 반드시 β와 γ 수용체 서브 유닛과 함께 IL-2의 고친화성 수용체를 구성해야 한다. 따라서 두 가지의 야생형 분자를 공동 발현하여 안정적인 복합물을 형성할 수 없다. 그러나 야생형 IL-2 상에 제3 시스테인 잔기를 도입하고, α 수용체의 세포외 도메인(CD25-ECD) 상에 제4 시스테인 잔기를 도입하며, 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합을 통해, IL-2 유도체와 α 수용체의 세포외 도메인(CD25-ECD)이 복합물을 형성하도록 하여 IL-2와 내인성 α 수용체의 결합을 차단한다.
야생형 α 수용체의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 25로 표시된다.
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG;
야생형 α 수용체의 세포외 도메인의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 145로 표시된다.
도입해야 하는 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기의 위치는 주로 하기와 같은 방식으로 결정된다.
1) 제3 시스테인 잔기의 위치는 IL-2와 α 수용체의 결합면 상의 아미노산 잔기 또는 그 근처의 아미노산 잔기이다. IL-2와 α 수용체의 결합면 상의 아미노산 잔기는 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 65, 68 및 72번째 아미노산 부위이다.
2) 생물정보학 및 단백질 공학 설계를 통해 각각 IL-2와 α 수용체 세포외 도메인(CD25-ECD)에서 잔기 센트로이드의 벡터 거리 기준에 따라 적절한 결합면 부위를 찾는다. 상기 돌연변이는 단백질 구조에 영향을 미치지 않는다.
적합한 부위를 결정한 후, 돌연변이를 통해 IL-2 상의 원래 아미노산 잔기는 제3 시스테인 잔기로 돌연변이되고, α 수용체 세포외 도메인(CD25-ECD) 상의 원래 아미노산 잔기는 제4 시스테인 잔기로 돌연변이된다. IL-2와 α 수용체 세포외 도메인의 돌연변이체는 공동발현을 수행하고 전사와 번역을 거친 후 IL-2와 α 수용체 세포외 도메인 사이에 이황화 결합을 형성함으로써, 하나의 완전한 분자 IL-2/CD25-ECD 이종이합체(heterodimer)를 형성한다. 상기 복합물은 체내의 내인성 α 수용체와 결합할 수 없으나, β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물과 결합할 수 있으므로 Treg 비활성화 목적을 달성할 수 있다.
일 실시예에 있어서, IL-2의 125번째에 있는 원래의 유리 시스테인을 돌연변이시켜, 이것이 시스테인 돌연변이체가 있는 α 수용체의 세포외 도메인 및 IL-2와 추가적인 이황화 결합을 형성하여 α 수용체와 IL-2 이합체의 형성에 영향을 미치는 것을 방지한다.
일부 실시예에 있어서, 획득한 IL-2 돌연변이체와 CD25-ECD 돌연변이체의 아미노산 서열 설계는 표 2와 같다.
발현 숙주는 포유동물 세포(HEK293 또는 CHO)이다.
실시예 1 IL-2(C125A), IL-2 돌연변이체와 IL-2 복합물의 제조
본 실시예에서 IL-2wt(C125A), IL-2 돌연변이체 1 내지 4 및 IL-2 복합물 1 내지 4를 선택하여 각각 발현시키며, 분자 C 말단에 있는 HPC4 태그를 기반으로 정제하여 제조한다.
1.1 발현 플라스미드 구축
Suzhou Jinweizhi Biotechnology에 위탁하여 IL-2 wt C125A(SEQ ID NO. 74), IL-2 돌연변이체 1 내지 4, IL-2 복합물 1 내지 4(IL-2 2 복합물 중 IL-2 Pair 1 내지 4 및 CD25 Pair 1 내지 4)가 있는 유전자를 합성한 후, <분자 클론>에서 언급된 조작 방법에 따라 중복 PCR을 수행하여 표적 단편을 획득한다. 그 후 단편과 pTT5 범용 벡터를 재조합 연결하고, DH10B로 형질전환하고, 시퀀싱 및 보존하여 필요한 IL-2 wt(C125A), IL-2 돌연변이체 1 내지 4 및 IL-2 복합물 1 내지 4의 플라스미드(IL-2 복합물 중 IL-2 Pair 1 내지 4의 플라스미드와 CD25-ECD Pair 1 내지 4의 플라스미드)를 획득한다. 또는 <Agilent QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit>에 언급된 조작 방법에 따라 PCR, DpnI 소화, DH10B 형질전환, 시퀀싱 및 보존을 수행하여 필요한 IL-2 wt(C125A), IL-2 돌연변이체 1 내지 4 및 IL-2 복합물 1 내지 4의 플라스미드를 획득한다.
1.2 플라스미드 추출 및 HEK293 세포 준비
1.2.1 플라스미드 추출
<Qiagen Mini-prep Kit> 및 <Qiagen Endofree Maxi-prep Kit>에 기재된 조작 방법에 따라, IL-2 wt(C125A), IL-2 돌연변이체 1 내지 4 및 IL-2 복합물 1 내지 4의 플라스미드를 제조한다.
1.2.2 HEK293 세포 준비
신선하게 계대된 밀도가 1-1.2 x 10^6/ml의 HEK293 세포(National Research Council, Canada)를 일과성 발현에 사용한다.
1.3 HEK293 일과성 발현
1.3.1 시약 제조
A) G418 용액: GeneticinTM 250mg을 칭량하고 초순수 4.5ml를 넣어 용해시키며 초순수로 5ml까지 용량을 만들고 0.22um 여과막으로 여과하여 -20℃에서 보관한다.
B) PEI 용액: 50mg의 PEI를 칭량하고 45ml의 초순수를 첨가하며, 1M NaOH로 pH를 7.0으로 조정하고, 초순수로 50ml까지 용량을 만들어 0.22um 여과막으로 여과하고, -20℃에서 보관한다.
C) 배지: 1L FreeStyleTM 293 발현 배지에 10ml PluronicdTM F-68 및 500ul G418을 첨가한다.
D) 플라스미드는 2ml 내독소가 없는 원심분리 튜브에서 미리 준비한다.
E) 형질감염에 필요한 부피에 따라 1-1.2 x 106cells/ml으로 신선하게 계대된 세포 현탁액을 준비한다.
1.3.2 형질감염 시약-플라스미드 복합물 제조
A액: 플라스미드 1ug/ml + Opti-MEMTM 33.3ul/ml
B액: PEI 2ug/ml + Opti-MEMTM 33.3ul/ml
B액을 A액에 붓고 잘 섞어 10분 동안 배양한 다음 세포 현탁액을 첨가한다.
형질감염 시 IL-2 wt(C125A) 및 IL-2 돌연변이체 1 내지 4 플라스미드를 각각 별도로 형질감염시킨다. IL-2 복합물 1 내지 4의 플라스미드는 두 가지 플라스미드를 혼합한 후 형질감염시켰다.
1.3.3 환액
115rpm, 36.8℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양한 후, 800g에서 5분 동안 원심분리하고 F68 및 G418를 첨가하지 않은 FreeStyleTM 293 발현 배지로 변경한다.
1.3.4 발현 배양 및 수확
115rpm, 36.8℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양한 후, 8500rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 세포 상청액을 수집하였다.
1.4 정제 제조
모든 IL-2 관련 유도체 C 말단에 HPC4 태그가 있다. 따라서 HPC4 항체가 결합된 필러를 이용해 친화성 정제를 수행한 후, 다시 겔여과 크로마토그래피(superdex200)로 추가 정제하여 고순도 단백질을 획득한다. SDS-PAGE 분석은 <분자 클론>에 설명된 방법에 따라 수행한다.
결과는 도 1과 같이, 플라스미드가 세포 내로 형질감염된 후 IL-2 wt(C125A), IL-2 돌연변이체 1 내지 4 및 IL-2 복합물 1 내지 4에 상응하는 단백질 및 복합물이 모두 생성되어 플라스미드 구축 및 단백질 발현 및 정제에 성공한 것으로 나타났다.
실시예 2 생물층 간섭 기술(biolayer interferomeory, BLI)을 통해 IL-2 wt(C125A), IL-2 돌연변이체 1 내지 4 및 IL-2 복합물 1 내지 4 각각과 IL2Rβγ 및 IL2Rα의 친화력 측정
1. 실험재료
실험에 사용된 단백질은 모두 Beijing Zhidao Biotechnology에서 생산된 것이며, IL2Rα-his(Beijing Zhidao Biotechnology에서 구매), IL2Rβγ-Fc(Beijing Zhidao Biotechnology에서 구매) 및 IL2 돌연변이체는 HEK293 일과성 발현 및 친화성 정제를 통해 획득하였다. 완충액 배합 방법: 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.1% BSA 및 0.05% Tween 20, ProA 센서(Pall Fortebio사, 제품번호 #18-5010), HISIK 센서(Pall Fortebio사, 제품 번호 #18-5120), BLI 장비는 Pall Fortebio에서 생산한 Octet RED96, 데이터 수집 및 분석 작업은 각각 Data acquisition 11.0 및 Data analysis 11.0 소프트웨어로 수행한다.
2. 실험방법
1) IL2Rβγ-Fc 준비
완충액을 이용해 IL2Rβγ-Fc를 10ug/ml의 농도로 희석하고, 96웰 검출 플레이트 제2열을 첨가하며, 제어 프로그램을 Loading, 600s로 설정한다.
2) IL2Rα-his 준비
완충액을 이용해 IL2Rα-his를 10ug/ml의 농도로 희석하고, 96웰 검출 플레이트 제3열을 첨가하며, 제어 프로그램을 Loading, 600s로 설정한다.
3) 샘플 준비
IL-2 유도체를 완충액으로 100nM로 희석한 후, 6개 구배(총 7개 구배)를 1.625nM 및 0 농도의 1:1로 연속 희석하고, 각각 96웰 검출 플레이트 5 내지 9열을 첨가하며, 제어 프로그램에서 Association, 200s로 설정한다. 96웰 검출 플레이트에서 1, 4, 10, 11열에 완충액을 넣고 12열에 pH 1.7의 글리신을 첨가한다. 상기 샘플과 용액의 샘플 첨가량은 모두 200ul이다.
4) IL2Rβγ-Fc과의 친화력 검출
8개의 ProA 센서를 취하여 각각 센서 브래킷의 제1열의 A-H에 놓는다. Data acquisition 11.0 소프트웨어에서 검출 조건을 다음과 같이 설정한다. 1 프리웨팅: Baseline, 60s, 위치: 제1열. 2 순환 검출: 제2열: loading, 600s; 제4열: Baseline1, 60s; 샘플 5 내지 9열: Association, 200s; 제10열: Dissociation, 600s; 제11열: 중화; 제12열: 재생.
5) IL2Rα와의 결합 검출
8개의 HISIK 센서를 취하여 각각 센서 브래킷의 제2열의 A-H에 놓는다. Data acquisition 11.0 소프트웨어에서 검출 조건을 다음과 같이 설정한다. 1 프리웨팅: Baseline, 60s, 위치: 제1열. 2 순환 검출: 제3열: loading, 600s; 제4열: Baseline1, 60s; 샘플 5 내지 9열: Association, 200s; 제10열: Dissociation, 600s; 제11열: 중화; 제12열: 재생.
6) 데이터 분석
데이터 분석 11.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 0 농도를 대조군으로 하여 배경을 뺀 후 Fitting 곡선으로 KD 값을 계산하였다.
3. 결과
도 2에 도시된 바와 같이, IL-2 유도체와 IL2Rα 수용체의 결합곡선을 보면 IL-2 돌연변이체 1은 IL2Rα 수용체와의 결합이 크게 약화된 것 외에, 나머지 IL-2 유도체는 거의 결합하지 않았다. 도 3에 도시된 바와 같이, IL-2 유도체와 IL2Rβγ 수용체 결합곡선을 보면 IL-2wt C125A에 비해 유의한 변화가 없었다(도 3).
실시예 3 T 세포의 증식 촉진 실험
CTLL-2(T 세포)의 증식 실험은 세포 수준에서 인터류킨 자극 면역 세포의 활성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 실험이다. 따라서 여기에서는 CTLL-2 세포의 증식 실험을 통해 IL-2 유도체의 생물학적 활성을 조사하였다.
1) CTLL-2 세포 준비: FBS 및 Rat-T-Stim이 포함된 배양액에서 세포를 재현탁한다.
2) 로딩: 96-웰 배양 플레이트에 웰당 0.1 ml의 세포를 접종한다. 동시에, 시험할 샘플 IL-2 유도체 11, 18, 21, 28의 단백질(즉, 실시예 1에서 제조한 단백질)을 각각 배수에 비례하도록 희석하고, 각 웰에 0.1ml씩 첨가하며, 각 희석 농도에 대해 3개의 이중 웰을 설정한다. 배양액 대조군 웰(100 ul 세포 + 100 ul 배양액)를 별도로 설정한다. 37°C, 5% CO2에서 72시간 동안 배양한다.
3) MTS 첨가: 20μl의 CellTiter96® AQueous One Solution Reagent를 각 웰에 추가하고 37°C, 5% CO2에서 2 내지 4시간 동안 배양한다.
4) 측정: 마이크로플레이트 리더를 이용해 490nm 파장에서 흡광도 값(A)을 측정하고 EC50 값을 계산한다.
5) 결과: 선택된 대표적인 IL-2 복합물 2 및 IL-2 돌연변이체 4는 모두 CTLL-2(T 세포)의 증식 활성을 가지며, 이는 β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물의 신호 전달 기능에 심각하게 영향을 미치지 않음을 의미한다(도 4).
SEQUENCE LISTING
<110> 北京志道生物科技有限公司
<120> 白介素-2衍生物
<160> 146
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<400> 77
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 133
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tctctgtaca tgctgtgcac cggcaacagc agccacagca gctgggataa tcagtgccag 180
tgcaccagca gcgctacaag aaacaccaca aaacaagtga ccccccagcc cgaggagcaa 240
aaggaaagaa agaccaccga aatgcagtcc cccatgcagc ccgtggatca agcctctctg 300
cccggccact gtagagagcc ccctccttgg gaaaatgagg ccacagagag gatctaccac 360
tttgtggtgg gacagatggt ctactaccag tgtgtccaag gctatagagc tctccacaga 420
ggccccgccg agagcgtctg caaaatgaca cacggcaaga caagatggac ccaaccccag 480
ctgatttgta ccggc 495
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<213> Artificial Sequence
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aaggagggaa ccatgctcaa ctgcgagtgc aagaggggat ttaggtgtat caagagcggc 120
tctctgtaca tgctgtgcac cggcaacagc agccacagca gctgggataa tcagtgccag 180
tgcaccagca gcgctacaag aaacaccaca aaacaagtga ccccccagcc cgaggagcaa 240
aaggaaagaa agaccaccga aatgcagtcc cccatgcagc ccgtggatca agcctctctg 300
cccggccact gtagagagcc ccctccttgg gaaaatgagg ccacagagag gatctaccac 360
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ctgatttgta ccggc 495
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tgcaccagca gcgctacaag aaacaccaca aaacaagtga ccccccagcc cgaggagcaa 240
aaggaaagaa agaccaccga aatgcagtcc cccatgcagc ccgtggatca agcctctctg 300
cccggccact gtagagagcc ccctccttgg gaaaatgagg ccacagagag gatctaccac 360
tttgtggtgg gacagatggt ctactaccag tgtgtccaag gctatagagc tctccacaga 420
ggccccgccg agagcgtctg caaaatgaca cacggcaaga caagatggac ccaaccccag 480
ctgatttgta ccggc 495
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<400> 142
gagctctgcg acgatgatcc ccccgaaatc ccccacgcca cattcaaggc catggcctac 60
aaggagggaa ccatgctcaa ctgcgagtgc aagaggggat ttaggaggat caagagctgt 120
tctctgtaca tgctgtgcac cggcaacagc agccacagca gctgggataa tcagtgccag 180
tgcaccagca gcgctacaag aaacaccaca aaacaagtga ccccccagcc cgaggagcaa 240
aaggaaagaa agaccaccga aatgcagtcc cccatgcagc ccgtggatca agcctctctg 300
cccggccact gtagagagcc ccctccttgg gaaaatgagg ccacagagag gatctaccac 360
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gagctctgcg acgatgatcc ccccgaaatc ccccacgcca cattcaaggc catggcctac 60
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<212> DNA
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<400> 146
gcccccacaa gctccagcac caagaagaca cagctgcagc tggaacatct gctgctggac 60
ctccagatga ttctgaacgg catcaacaac tacaagaatc ccaagctgac aagaatgctc 120
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gaggagctga agcctctgga agaggtgctg aatctggccc agtccaagaa cttccatctg 240
aggcctagag atctgatcag caacatcaac gtcatcgtgc tggagctgaa gggcagcgag 300
accaccttca tgtgcgagta cgccgatgag accgccacca tcgtggagtt tctgaataga 360
tggatcacct tctgccagag catcatcagc acactgacc 399
Claims (35)
- IL-2 유도체에 있어서,
상기 IL-2 유도체는 야생형 IL-2를 기반으로 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입함으로써, IL-2 유도체와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면을 부분적으로 또는 완전히 폐쇄하고, 동시에 β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물에 대한 친화력을 기본적으로 유지하는 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제1항에 있어서,
야생형 IL-2를 기반으로 도입된 적어도 하나의 시스테인 잔기는,
a) IL-2 유도체의 분자 내 이황화 결합을 형성하거나, 또는
b) IL-2 유도체가 분자 간 이황화 결합을 통해 폐쇄 모듈과 결합할 수 있도록 만들 수 있는 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제2항에 있어서,
상기 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입하는 것은 점 돌연변이의 방식을 통해 적어도 하나의 시스테인 잔기를 도입하는 것인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제3항에 있어서,
야생형 IL-2를 기반으로 점 돌연변이 방식을 통해 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기를 도입하고, 상기 제1 시스테인 잔기와 상기 제2 시스테인 잔기 중 하나 또는 둘은 야생형 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면과 관련된 아미노산 또는 그 근처의 아미노산인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제4항에 있어서,
상기 제1 시스테인 잔기는 야생형 IL-2의 37번째, 38번째, 41번째, 42번째, 43번째, 44번째, 45번째, 61번째, 62번째 아미노산 또는 그 근처의 아미노산이고, 상기 제2 시스테인 잔기는 야생형 IL-2의 61번째, 62번째, 65번째, 68번째, 72번째 아미노산 또는 그 근처의 아미노산인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제4항에 있어서,
상기 제1 시스테인 잔기는 K35C, L36C, R38C, M39C, L40C, T41C, F42C, K43C, F44C 및 E61C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제4항에 있어서,
상기 제2 시스테인 잔기는 V69C, E62C, P65C, T111C, Y107C, A112C, T113C, I114C, L72C 및 A73C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제4항에 있어서,
분자 내 이황화 결합을 형성하는 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기의 조합은 M39C와 V69C, F44C와 E62C, F44C와 P65C, F42C와 V69C, E61C와 Y107C, F42C와 P65C, F42C와 T111C, F42C와 A112C, F42C와 T113C, T41C와 A112C, L40C와 A112C, L40C와 T113C, L40C와 I114C, M39C와 L72C, M39C와 A73C, R38C와 V69C, R38C와 L72C, L36C와 V69C, L36C와 L72C, L36C와 A73C, K35C와 V69C 및 K43C와 A112C로 이루어진 군의 아미노산 점 돌연변이에서 선택되는 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제4항에 있어서,
상기 제1 시스테인 잔기와 상기 제2 시스테인 잔기의 잔기 센트로이드 벡터 거리는 6Å보다 작은 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제3항에 있어서,
야생형 IL-2를 기반으로 점 돌연변이 방식을 통해 제3 시스테인 잔기를 도입하고, 상기 제3 시스테인 잔기는 야생형 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면과 관련된 아미노산 또는 그 근처의 아미노산인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제10항에 있어서,
상기 제3 시스테인 잔기는 야생형 IL-2의 37번째, 38번째, 41번째, 42번째, 43번째, 44번째, 45번째, 61번째, 62번째, 65번째, 68번째, 72번째 아미노산 또는 그 근처의 아미노산인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제10항에 있어서,
상기 제3 시스테인 잔기는 P34C, K35C, T37C, R38C, T41C, K43C, F44C, Y45C, E61C, E62C, K64C, P65C, E68C 및 L72C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제10항에 있어서,
상기 폐쇄 모듈 상에 제4 시스테인 잔기가 구비 또는 도입되고, 상기 IL-2 유도체 상의 제3 시스테인 잔기와 상기 폐쇄 모듈 상의 제4 시스테인 잔기는 분자 간 이황화 결합을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제13항에 있어서,
상기 제3 시스테인 잔기와 상기 제4 시스테인 잔기의 잔기 센트로이드 벡터 거리는 6Å보다 작은 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제13항에 있어서,
상기 폐쇄 모듈은 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제3항에 있어서,
상기 점 돌연변이의 방식을 통해 야생형 IL-2 125번째 시스테인 잔기를 기타 아미노산 잔기로 전환하는 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제16항에 있어서,
야생형 IL-2 125번째 점 돌연변이는 C125A인 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 제3항에 있어서,
상기 IL-2 유도체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 3 내지 SEQ ID NO. 24로 표시되거나, 또는 SEQ ID NO. 26 내지 40으로 표시되는 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체. - 복합물에 있어서,
1) 야생형 IL-2를 기반으로 제3 시스테인 잔기를 도입한 IL-2 유도체; 및
2) 제4 시스테인 잔기를 구비하거나 도입한 폐쇄 모듈을 포함하고,
상기 IL-2 유도체 상의 제3 시스테인 잔기와 상기 폐쇄 모듈 상의 제4 시스테인 잔기는 분자 간 이황화 결합을 형성함으로써, IL-2와 폐쇄 모듈의 복합물을 형성하고, IL-2 유도체와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면을 부분적으로 또는 완전히 폐쇄하는 동시에, β와 γ 수용체 서브 유닛 복합물에 대한 친화력을 기본적으로 유지하는 것을 특징으로 하는 복합물. - 제19항에 있어서,
상기 제3 시스테인 잔기는 야생형 IL-2와 α 수용체 서브 유닛의 결합 평면과 관련된 아미노산 또는 그 근처의 아미노산인 것을 특징으로 하는 복합물. - 제20항에 있어서,
상기 제3 시스테인 잔기와 상기 제4 시스테인 잔기의 잔기 센트로이드 벡터 거리는 6Å보다 작은 것을 특징으로 하는 복합물. - 제19항에 있어서,
상기 제3 시스테인 잔기는 P34C, K35C, T37C, R38C, T41C, K43C, F44C, Y45C, E61C, E62C, K64C, P65C, E68C 및 L72C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이인 것을 특징으로 하는 복합물. - 제19항에 있어서,
상기 폐쇄 모듈은 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인이고, 이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 25로 표시되는 것을 특징으로 하는 복합물. - 제23항에 있어서,
α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인 상의 상기 제4 시스테인 잔기 위치는 D4C, D5C, M25C, N27C, R35C, R36C, K38C, S39C, G40C, S41C, L42C, I118C, Y119C 및 H120C로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 점 돌연변이로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합물. - 제23항에 있어서,
분자 간 이황화 결합을 형성하는 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기의 조합은 T41C와 N27C, P34C와 D4C, E68C와 L42C, Y45C와 R35C, R38C와 H120C, L72C와 M25C, E61C와 S39C, T41C와 I118C, K35C와 D4C, T37C와 D4C, R38C와 D4C, R38C와 D5C, T41C와 L42C, T41C와 Y119C, K43C와 R35C, K43C와 R36C, F44C와 L42C, K43C와 L42C, E61C와 K38C, E62C와 K38C, K64C와 S39C, K64C와 G40C, K64C와 S41C, P65C와 K38C로 이루어진 군의 아미노산 점 돌연변이 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합물. - 제19항에 있어서,
야생형 IL-2 125번째의 점 돌연변이는 C125A인 것을 특징으로 하는 복합물. - 제23항에 있어서,
상기 IL-2 유도체의 아미노산 서열과 상기 α 수용체 서브 유닛의 세포외 도메인의 서열 조합은 SEQ ID NO. 26과 SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 27과 SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 28과 SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 29와 SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 30과 SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 31과 SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 32와 SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 33과 SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 34와 SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 35와 SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 36과 SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 37과 SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 38과 SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 39와 SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 40과 SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 41과 SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 42와 SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 43과 SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 44와 SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 45와 SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 46과 SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 47과 SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO. 48과 SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 49와 SEQ ID NO. 73으로 이루어진 군의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합물. - 분리된 폴리뉴클레오티드에 있어서,
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 유도체를 인코딩하거나, 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 복합물을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드. - 발현 벡터에 있어서,
제28항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터. - 숙주 세포에 있어서,
제28항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포. - 조성물에 있어서,
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 유도체 또는 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 복합물, 및 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 유도체 또는 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 복합물을 질병 치료용 약물 또는 제제의 제조에 사용하는 용도.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 유도체 또는 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 복합물을 개체의 면역계 자극용 조성물의 제조에 사용하는 용도.
- IL-2 유도체의 생성 방법에 있어서,
상기 방법은 상기 IL-2 유도체 발현에 적합한 조건 하에서 제30항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-2 유도체의 생성 방법. - 복합물의 생성 방법에 있어서,
상기 방법은 상기 복합물 발현에 적합한 조건 하에서 제30항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합물의 생성 방법.
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