KR101904385B1 - 고안정성의 t 세포 수용체 및 이의 제조방법과 응용 - Google Patents

고안정성의 t 세포 수용체 및 이의 제조방법과 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고안정성의 T 세포 수용체를 제공하는 바, 상기 T 세포 수용체는 이의 소수성 코어 영역에서 돌연변이를 발생하여 그 안정성의 향상을 유발한다. 본 발명은 상기 T 세포 수용체의 제조방법과 응용을 더 제공한다.

Description

고안정성의 T 세포 수용체 및 이의 제조방법과 응용{High-stability T-cell Receptor and Preparation Method and Application Thereof}
본 발명은 생물 기술 분야에 관한 것으로, 더 구체적으로 소수성 코어(hydrophobic core) 영역이 돌연변이된, 고안정성의 가용성 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)에 관한 것이다. 본 발명은 상기 수용체의 제조와 응용에도 관한 것이다.
단지 두 가지 유형의 분자만 특이성으로 항원을 식별할 수 있다. 그 중의 한 가지는 면역 글로불린(globulin) 또는 항체이고, 다른 한 가지는 T 세포 수용체(TCR)이며, 이는 α사슬/β사슬 또는 α사슬/α사슬이 헤테로다이머(heterodimer)의 형식으로 존재하는 세포막 표면의 당단백질(glycoprotein)이다. 면역 시스템(immune system)의 TCR 스코어(Score)의 조성은 흉선에서 V(D)J 재조합을 진행한 다음, 양성 선택과 음성 선택을 진행하여 발생된 것이다. 세포 주위 환경에서, TCR는 T 세포가 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)-펩타이드(peptide) 복합체(pMHC)에 대한 특이성 식별을 매개로 함으로써, 이는 면역 시스템의 세포 면역 기능에 대하여 지극히 중요하다.
TCR은 주조직 적합성 복합체(MHC)에 제시되는 특이성 항원 펩타이드의 유일한 수용체이고, 이러한 외인성 펩타이드 또는 내인성 펩타이드는 세포에 이상이 생기는 유일한 징조일 수 있다. 면역 시스템에 있어서, 항원 특이성의 TCR과 pMHC 복합체의 결합을 통하여 T 세포와 항원제시세포(antigen-presenting cell, APC)의 직접적인 물리적 접촉을 유발시킨 다음, T 세포 및 APC 양자의 기타 세포막 표면 분자들에서는 상호작용이 발생되고, 이에 따라 일련의 후속의 세포 신호 전달과 기타 생리적 반응이 유발되어, 상이한 항원 특이성의 T 세포는 그 표적 세포(target cell)에 대하여 면역효과를 발휘한다.
T 세포막에서, TCR과 신호 전달에 관여하는 불변 단백질 CD3이 결합되어 복합체를 형성한다. TCR는 다양한 형식으로 존재하고 구조적으로 유사하지만, 이러한 TCR를 발현하는 T 세포는 상이한 해부학적 부위에 존재할 수 있고, 상이한 기능을 규비할 수 있다. TCR의 세포외 부분은 2개의 세포내 막곁(juxtamembrane)의 불변 구조적 도메인(Structural Domain)과 2개의 세포외 막곁의 가변 구조적 도메인으로 이루어지고, 상기 가변 구조적 도메인은 항체의 상보성 결정 영역(complementarity-determining regions, CDRs)과 유사한 다형성 고리를 구비한다. 바로 이러한 고리 모양이 T 세포 수용체 분자의 결합 부위를 형성하고 또한 펩타이드의 특이성을 결정한다. TCR와 서로 대응되는 MHC I류와 MHC II류의 분자 리간드(ligand)도 면역 글로불린 슈퍼 패밀리(immunoglobulin superfamily)의 단백질이지만 항원에 대한 제시는 특이성을 가지고, 이들은 다형성의 펩타이드 결합 부위를 구비한 바, 이러한 부위는 이들이 여러 가지의 짧은 펩타이드(short peptide)의 단편(fragment)를 항원제시세포(antigen presentation cell, APC)의 세포 표면으로 제시하도록 한다.
면역 글로불린(항체)이 항원 식별 분자로 사용되는 바와 같이, TCR도 진단과 치료에 응용되도록 개발될 수 있다. 하지만 (수)가용성 형태로 이와 같은 한 가지 이상의 폴리펩타이드(polypeptide)로 이루어지면서 하나의 막 스패닝 영역(membrane spanning region)을 구비하는 단백질을 제조하기 어렵다. 그 원인은, 많은 경우에서 이와 같은 단백질은 그 막 스패닝 영역으로 안정되기 때문이다. TCR의 상황은 이러하고, 상기 내용은 과학 문헌에 이미 반영되어 있으며, 일부 문헌에서는 잘린 형태의 TCR를 설명한 바, 이는 단지 세포외 영역(extracellular region)을 포함하거나 또는 단지 세포외 영역과 세포질 영역(cytoplasmic region)을 포함하고, 이와 같은 TCR는 TCR 특이성의 항체에 의해 식별될 수 있지만(이것은 항체에 식별된 재조합 TCR 부분이 이미 정확하게 중첩(folding)된 것을 나타냄), 생산량이 높지 않고, 낮은 농도일 때 안정하지 않으며, 및/또는 주조직적합성 복합체-펩타이드 복합체를 식별하지 못한다.
가용성 TCR는 광범위한 용도가 있는 바, 이는 TCR-pMHC의 상호작용의 연구에 사용될 뿐만 아니라, 감염을 검출하는 진단 도구 또는 자가 면역 질환의 마커로 사용될 수도 있다. 유사하게, 가용성 TCR는 치료제(예를 들어, 세포 독성 화합물 또는 면역 자극성 화합물임)를 특이성 항원을 제시하는 세포로 수송하거나, 또는 T 세포(예를 들어, 자가 면역 펩타이드 항원과 반응하는 T 세포임)를 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, TCR 단백질의 수식은 지극히 중요하다. 특히, 원핵 또는 진핵 생물계통에서 TCR의 이형 발현(heterologous expression)은 매우 중요하다.
한편으로, 대장균에서 가용성 TCR를 발현시킴에 있어서, TCR과 막이 분리될 경우, 이의 불안정성과 단백질 생산량이 낮은 것이 TCR 또는 그 단편으로 치료제 또는 진단 시약을 개발하는 주요한 문제로 된다. 단일 가닥 TCR의 고유한 불안정성을 극복하기 위하여, 일부 문헌에서는 TCR 헤테로다이머의 제조방법을 설명한 바, 상기 헤테로다이머는 각 서브유닛(subunit)을 연결시키는 자연적인 이황화 결합(disulfide bond)을 구비한다(Garboczi, 등, (1996), 자연(Nature)384(6605):134-41; Garboczi, 등, (1996), 면역학 학술지(J Immunol)157(12): 5403-10; Chang 등, (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau 등, (1993), 생화학 학술지(J. Biol. Chem.)268(21): 15455-15460; Golden 등, (1997), 면역 방법학 학술지(J. Imm. Meth.)206: 163-169; US 특허번호 6080840). 비록 이와 같은 TCR는 TCR-특이성의 항체에 의해 식별될 수 있지만, 이는 농도가 상대적으로 높은 환경에서만 자연적인 리간드에 대한 식별을 표시할 수 있으므로, 상기 식별은 불안정한 것을 제시한다.
다른 한편으로, 원시적인 항원 특이성을 구비하는 TCR의 제조에 있어서, 수용성 TCR 단편의 안정성을 향상시키는 방면에는 많은 연구가 있는 바, 단일 가닥 TCR의 가변 도메인(Novotny, 등(1991) PNAS USA 88:8646-8650), 헤테로다이머 TCR의 세포외 영역(Garcia1 등(1996) 과학(Science)274:209-219), 또는 이러한 분자들의 개선방식(Shusta 등(2000) 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology)18:754-759), Boulter 등(2003) 단백질 공정(Protein Engineering)16:707-711)을 포함한다. 이러한 연구들 중에서, Novotny 등은 연성 펩타이드로 단일 가닥 가변 도메인을 연결시켜 TCR를 이루었지만, 수용성 측쇄(side chain)를 포함하는 친수성 잔기로 표면에 노출된 소수성 잔기를 치환한 후에만 안정된 분자를 얻을 수 있다. Shusta 등은 전체 분자들 중에 임의의 돌연변이를 인입시킨 다음, 효모균의 표면에 전시시켜 유세포 분석기(fluorescence activated cell sorter, FACS)로 선별하는 방법으로, TCR 단일 가닥 가변 도메인 구조를 더 수식한다. Garcia 등은 α/β TCR 2C의 세포외 구조적 도메인을 이루고, 여기서 자연적인 사슬간 이황화 결합은 구조 내에 보존된다. Boulter 등은 2개의 불변 도메인 사이에 매입된 하나의 이황화 결합을 인공적으로 인입하여, α/β 헤테로다이머의 구성물을 개선한다.
불변 도메인 사이의 이황화 결합을 이용하는 방법은 이미 파지(phage) 디스플레이 TCR 담체(carrier)에 사용되고, 이러한 담체는 많은 고친화성 TCR 를 생산하는데에 사용된다(Li 등(2005) 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology) 34:349-354; Liddy 등(2012) 자연 의학(Nature Medicine)18:980-987). 하지만 본 발명자가 연구한 결과는, 이와 같은 구성물로 고친화성의 TCR를 성공적으로 생산해 내는 가능성은 여전히 낮고, 또한 고친화적이고 고안정적인 TCR를 얻기 매우 어렵다는 것을 발견하였다. 따라서, 새로운 방법을 연구하여 수용성의 TCR, 고친화적이고 고안정적인 TCR, 및 이들의 활성 단편(active fragment)를 제조할 필요가 있다.
본 발명은 고안정성의 T 세포 수용체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 고안정성 T 세포 수용체의 제조 방법과 용도를 제공하는 것을 다른 하나의 목적으로 한다.
본 발명의 제1양태에서 T 세포 수용체(T-cell receptor, TCR)를 제공하는 바, 상기 T 세포 수용체는,
(ⅰ) 상기 TCR의 소수성 코어 영역이 돌연변이가 발생하는 특징; 및
(ⅱ) 상기 TCR의 안정성은 이에 대응되는 소수성 코어가 야생형인 TCR의 안정성보다 높은 특징을 포함한다.
다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 '돌연변이’는, 본 발명의 TCR의 소수성 코어 영역이 이와 대응되는 야생형의 TCR의 소수성 코어 영역에 대하여 돌연변이가 발생하는 것을 의미한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 '안정성은…보다 높다’는, 본 발명의 TCR는 이와 대응되는 야생형의 TCR의 소수성 코어에 비해 안정성이 5% 이상 향상되고, 바람직하게는 30% 이상 향상되며, 더 바람직하게는 80% 이상 향상되는 것을 의미한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 '야생형의 TCR의 소수성 코어’는, 자연적으로 생성된 TCR 중의 소수성 코어의 아미노산(amino acid) 잔기(서열)와 동일하고, 돌연변이가 발생되지 않는 소수성 코어를 의미한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 '이와 대응되는 소수성 코어가 야생형인 TCR이다’라는 것은, 본 발명의 소수성 코어 영역이 돌연변이가 발생하는 TCR와 비교해 보면, 소수성 코어가 야생형인 이외에, 기타 영역은 본 발명의 TCR과 동일한 TCR인 것을 의미한다. 그 외에는 또는 바람직하게는, 상기의 '이와 대응되는 소수성 코어가 야생형인 TCR이다’라는 것은, 자연적으로 생성된 것으로, 어떠한 돌연변이 부위를 포함하지 않는 야생형의 TCR를 의미하고, 특히 그 α사슬의 가변 도메인과 β사슬의 가변 도메인이 야생형의 sTv 분자인 것을 의미하며, 대표적인 예로는 LC13-WT를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR의 상보성 결정 영역과 야생형의 TCR의 상보성 결정 영역은 동일하거나, 또는 친화력을 향상시키는 돌연변이를 함유한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 친화력은 상기 TCR 분자와 그 상응한 항원 사이의 결합 친화력을 의미한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 T 세포 수용체 가변 도메인 프레임 워크(Framework)와 불변 도메인공치 중의 측쇄는 표면의 소수성 잔기를 지향하여 돌연변이가 발생된다. 즉, 상기 TCR의 가변 도메인 프레임 워크와 불변 도메인에서 표면에 노출된 아미노산 잔기는 돌연변이된다. 바람직하게는, 돌연변이가 발생된 상기 아미노산 잔기는 TCR의 α사슬 및/또는 β사슬의 가변 도메인에서 표면에 노출된 아미노산 잔기이다. 더 구체적으로, 상기의 가변 도메인에서 표면에 노출된 아미노산 부위는 TCR의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산의 4, 12, 16, 93, 97, 100, 105번째 부위와 α사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위와 TCR의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산의 4, 101번째 부위, β사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위와 β사슬의 J 유전자의 마지막 3번째 부위를 포함한다. 여기서, 아미노산의 위치 번호는 국제 면역 유전학 정보시스템(international immunogenetics information system, IMGT)에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 T 세포 수용체의 가변 도메인 프레임 워크(Framework)의 측쇄가 표면(가변 도메인에서 표면에 노출됨)의 소수성 잔기를 지향하는 돌연변이의 형식은, α사슬에서 I7S, A9S, A10S, V20S, A92E, A93S, J 유전자(gene)의 짧은 펩타이드 아미노산 위치의 마지막 2번째 부위가 I에서 T로 변하며, β사슬에서 I12S로 변형되거나, 또는 상기 돌연변이 중의 어느 한 조합을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않음), 여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 T 세포 수용체는 가용성이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 T 세포 수용체는 막 단백질(membrane protein)이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 T 세포 수용체는, (a) 막관통영역(transmembrane domain) 이외의 전부 또는 일부 TCR의 α사슬; 및 (b) 막관통영역 이외의 전부 또는 일부 TCR의 β사슬을 포함하고,
또한 (a)와 (b)는 기능성 가변 구조적 도메인을 각각 포함하거나, 또는 기능성 가변 구조적 도메인과 상기 TCR 사슬의 불변 구조적 도메인의 적어도 일부분을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR는 하나의 연성 펩타이드 연결자(linker)로 TCR의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인을 연결시켜 형성된 단일 가닥(single-strand) TCR이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 돌연변이에는 적어도 하나의 소수성 코어 위치의 돌연변이가 포함된다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 T 세포 수용체는 하기와 같은 위치에서 하나 또는 다수개의 돌연변이를 구비한 바, α사슬 및/또는 β사슬의 아미노산 서열의 가변 도메인 소수성 코어 위치는, 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 94번째 위치, 및/또는 α사슬의 J 유전의자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 3, 5, 7번째 부위, 및/또는 β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 2, 4, 6번째 부위를 포함하고, 여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR의 α사슬의 가변 도메인은, α사슬의 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91 또는 94번째 부위, 및/또는 α사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 3번째 부위, 마지막 5번째 부위 또는 마지막 7번째 부위 중의 하나 또는 다수개의 부위에서 돌연변이가 발생하고, 여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR는, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33으로 표시되는 α사슬의 가변 도메인의, α사슬의 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91번째 또는 94번째 부위, 및/또는 α사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 3번째 부위, 마지막 5번째 부위 또는 마지막 7번째 부위 중의 하나 또는 다수개의 부위에서 돌연변이가 발생하고, 여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR의 β사슬의 가변 도메인은, β사슬의 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91번째 또는 94번째 부위, 및/또는 β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 2번째 부위, 마지막 4번째 부위 또는 마지막 6번째 부위 중의 하나 또는 다수개의 부위에서 돌연변이가 발생하고, 여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR는, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 34로 표시되는 β사슬의 가변 도메인의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91번째 또는 94번째 부위, 및/또는 β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 2번째 부위, 마지막 4번째 부위 또는 마지막 6번째 부위 중의 하나 또는 다수개의 부위에서 돌연변이가 발생하고, 여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR의 α사슬의 가변 도메인은, 11L, 11M 또는 11E; 13V, 13R 또는 13K; 19V; 21I; 91L 또는 91I; 및 94V 또는 94I으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수개의 아미노산 잔기를 포함하고, 및/또는 상기 TCR의 β사슬의 가변 도메인은, 11L 또는 11V; 13V; 19V; 89L; 91F 또는 91I; 94V 또는 94L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수개의 아미노산 잔기를 포함하며; β사슬의 J 유전자의 마지막 6번째 부위가 T이고; β사슬의 J 유전자의 마지막 마지막 4번째 부위가 M이며, 여기서 아미노산의 서열 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR의 α사슬 및/또는 β사슬의 가변 도메인 중에서 표면에 노출된 아미노산 잔기는 돌연변이가 발생한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR는, 4L; 12N; 16S; 93N 또는 93R; 97N; 100G; 105S; 및 α사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위가 D인 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수개의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 포함하고, 및/또는 상기 TCR는, 4I; 101L; β사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위가 D이고; 및 β사슬의 J 유전자의 마지막 3번째 부위가 E인 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수개의, β사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 포함하며, 여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR, SEQ ID NO: 15, 17, 35, 37, 39, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 97, 99, 101, 103, 105 및 107인 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 중의 하나를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR, SEQ ID NO: 16, 18, 36, 38, 40, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 100, 102, 104, 106 및 108인 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 중의 하나를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 TCR의 α사슬의 가변 도메인과 β사슬의 가변 도메인의 조합은 하기와 같은 조합으로부터 선택되는 하나이다.
(a) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16인 조합;
(b) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 17이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18인 조합;
(c) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18인 조합;
(d) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 35이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 36인 조합;
(e) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 37이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 38인 조합;
(f) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 39이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 40인 조합;
(g) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 75이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 86인 조합;
(h) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 76이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 87인 조합;
(i) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 77이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 88인 조합;
(j) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 78이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 89인 조합;
(k) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 79이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 90인 조합;
(l) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 80이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 91인 조합;
(m) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 81이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 92인 조합;
(n) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 82이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 93인 조합;
(o) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 83이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 94인 조합;
(p) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 84이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 95인 조합;
(q) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 85이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 96인 조합;
(r) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 97이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 98인 조합;
(s) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 99和β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 100인 조합;
(t) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 101이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 102인 조합;
(u) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 103이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 104인 조합;
(v) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 105이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 106인 조합; 및
*(w) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 107이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 108인 조합.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 T 세포 수용체의 α사슬의 가변 도메인 소수성 코어는, 19번째 부위의 아미노산이 V로 돌연변이되는 것, 21번째 부위의 아미노산이 I로 돌연변이되는 것, 91번째 부위의 아미노산이L로 돌연변이되는 것 중의 적어도 하나의 돌연변이를 구비하고, 및/또는 β사슬의 가변 도메인 소수성 코어는, 91번째 부위의 아미노산이 F 또는 I로 돌연변이되는 것, 및/또는 사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산 서열의 마지막 4번째 부위의 아미노산이 M로 돌연변이되는 것 중의 적어도 하나의 돌연변이를 구비한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 돌연변이는 하기 군으로부터 선택된다.
(ⅰ) α사슬의 가변 도메인의 19번째 부위의 아미노산이 V로 돌연변이되고, 21번째 부위의 아미노산이 I로 돌연변이되며, 91번째 부위의 아미노산이 L로 돌연변이되고, β사슬의 가변 도메인의 91번째 부위의 아미노산이 F로 돌연변이되며, β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산 서열의 마지막 4번째 부위가 M으로 돌연변이 되는 것; 또는
(ⅱ) α사슬의 가변 도메인의 19번째 부위의 아미노산이 V로 돌연변이되고, 21번째 부위의 아미노산이 I로 돌연변이되며, β사슬의 가변 도메인의 91번째 부위의 아미노산이 I로 돌연변이되는 것; 또는
(ⅲ) α사슬의 가변 도메인의 19번째 부위의 아미노산이 V로 돌연변이되고, 21번째 부위의 아미노산이 I로 돌연변이되며, 91번째 부위의 아미노산이 L로 돌연변이되고, β사슬의 가변 도메인의 91번째 부위의 아미노산이 I로 돌연변이되는 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 T 세포 수용체의 α사슬의 가변 도메인 소수성 코어는, L19V, L21I, I91L 중의 적어도 하나의 돌연변이를 구비하고, 및/또는 β사슬의 가변 도메인 소수성 코어는, V91F 또는 V91I, 및/또는 β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산 서열의 마지막 4번째 부위가 L에서 M으로 돌연변이되는 것 중의 적어도 하나의 돌연변이를 구비한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 돌연변이는 하기 군으로부터 선택된다.
(ⅰ) α사슬의 가변 도메인의 L19V, L21I, I91L, β사슬의 가변 도메인의 V91F, β사슬 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산 서열의 마지막 4번째 부위가 L에서 M으로 변이되는 것; 또는
(ⅱ) α사슬의 가변 도메인의 L19V, L21I, β사슬의 가변 도메인의 V91I인 것; 또는
(ⅲ) α사슬의 가변 도메인의 L19V, L21I, I91L, β사슬의 가변 도메인의 V91I인 것이다.
여기서 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 T 세포 수용체는 TCR의 α사슬의 불변 도메인과 β사슬의 불변 도메인을 연결시키는 이황화 결합을 더 구비한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 이황화 결합은 자연적으로 TCR에 존재하거나 또는 인공적으로 인입된 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 인공적으로 인입된 이황화 결합은 TCR의 α사슬과 β사슬의 불변 구조적 도메인 사이에 위치한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 인공적으로 인입되고 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인(cysteine) 잔기는 하기와 같은 위치에서 적어도 하나의 조합의 α사슬과 β사슬의 아미노산 잔기를 치환하였지만 하기와 같은 위치에 한정되지 않는다.
(a) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 48번째 부위의 T와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 57번째 부위의 S; 또는
(b) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 45번째 부위의 T와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 77번째 부위의 S; 또는
(c) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 10번째 부위의 T와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 17번째 부위의 S; 또는
(d) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 45번째 부위의 T와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 59번째 부위의 D; 또는
(e) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 15번째 부위의 S와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 15번째 부위의 E; 또는
(f) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 61번째 부위의 S와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 57번째 부위의 S; 또는
(g) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 50번째 부위의 L과 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 57번째 부위의 S; 또는
(h) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 15번째 부위의 S와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 13번째 부위의 V; 또는
(i) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 12번째 부위의 L과 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 17번째 부위의 S; 또는
(j) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 61번째 부위의 S와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 79번째 부위의 R; 또는
(k) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 12번째 부위의 L과 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 14번째 부위의 F; 또는
(l) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 22번째 부위의 V와 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 14번째 부위의 F; 또는
(m) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 43번째 부위의 Y과 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 63번째 부위의 L; 또는
(n) TCR의 α사슬의 불변 도메인의 10번째 부위의 Y과 TCR의 β사슬의 불변 도메인의 17번째 부위의 S.
상기 TCR의 α사슬과 β사슬의 불변 도메인이 치환된 아미노산의 위치 번호는 '결정화 및 치료 응용에서 안정한 가용성 T 세포 수용체’(Stable, souble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics)(Jonathan M.Boulter 등, 2003, 단백질 공정(Protein Engineering)16(9):707-711)문헌에 열거된 위치번호에 따른 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 T 세포 수용체는 파지 디스플레이 기술(phage display technology)로 선별해 낸 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 T 세포 수용체에 컨쥬게이트(conjugate)가 결합(공유 결합 또는 기타 방식으로)되어 있다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 컨쥬게이트은 하기와 같은 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수개이다.
(1) 검출 가능한 표지자(marker);
(2) 치료제; 및/또는
(3) PK 수식 부분.
바람직하게는, 상기 검출 가능한 표지자는 형광 또는 발광표지자, 방사성 표지자, 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI) 또는 컴퓨터 단층촬영(computed tomography, CT)(전자 계산기 엑스레이 단층촬영 기술)조영제, 또는 산물을 검출할 수 있는 효소를 생성할 수 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 치료제는, 방사성 핵종, 생물 독소, 세포인자(IL-2 등과 같음), 항체, 항체 Fc 단편(Fc fragment), 항체 scFv 단편, 금 나노입자/나노로드(nanorod), 바이러스입자, 리포솜(liposome), 나노 자성입자, 전구약물 활성화 효소(prodrug activating enzyme)(예를 들면, DT-디아포라아제(DT-diaphorase, DTD) 또는 비페닐 히드로라아제-유사단백질(biphenyl hydrolase-like protein, BPHL)임), 화학 요법제(예를 들면, 시스플라틴(cisplatin)임) 또는 모든 형식의 나노입자 등을 포함한다.
다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 컨쥬게이트는 상기 TCR의 α사슬 및/또는 β사슬의 C-말단 또는 N-말단에 연결되는 항-CD3의 항체이다.
본 발명의 제2양태에서, 제1양태 중의 어느 하나에 따른 T 세포 수용체를 코딩하는 서열 또는 그 상보적 서열을 함유하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 제3양태에서, 본 발명의 제2양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 담체(carrier)를 제공한다.
본 발명의 제4양태에서, 숙주세포 또는 유전자 조작된 엔지니어링 세포(engineering cell)를 제공하는 바, 상기의 세포는 본 발명의 제3양태에 따른 담체를 함유하거나, 또는 염색체에 외인성의 본 발명의 제2양태에 따른 핵산 분자가 통합된다.
다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 숙주세포는 원핵세포와 진핵세포로부터 선택되는 바, 예를 들면, 대장균, 효모세포, 중국햄스터난소세포(Chinese hamster ovary cell, CHO) 등이다.
본 발명의 제5양태에서, 본 발명의 제1양태에 따른 T 세포 수용체를 제조하는 방법을 제공하는 바, 상기 T 세포 수용체를 제조하는 방법은,
(i) 본 발명의 제4양태에 따른 숙주세포를 배양하여, 본 발명의 T 세포 수용체를 발현시키는 단계;
(ii) 상기의 T 세포 수용체를 분리 또는 정제해 내는 단계를 포함한다.
본 발명의 제6양태에서, 본 발명의 제1양태 중의 어느 하나에 따른 T 세포 수용체를 함유하는 T 세포 수용체 복합체를 제공한다.
다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 복합체는, 본 발명의 T 세포 수용체와 치료제의 결합으로 형성되는 복합체 또는 본 발명의 T 세포 수용체와 검출 가능한 표지의 결합으로 형성되는 복합체를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 복합체는 두개 또는 다수개의 T 세포 수용체 분자를 포함한다.
본 발명의 제7양태에서, 본 발명의 상기와 같은 T 세포 수용체의 용도를 제공하는 바, 이는 종양, 바이러스 감염 또는 자가면역질환을 치료하는 약물을 제조하기 위한 것이다.
본 발명의 제8양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 안전유효량의 본 발명의 제1양태 중의 어느 하나에 따른 T 세포 수용체를 함유하는 약물 조성물을 제공한다.
본 발명의 제9양태에서, 질환을 치료하는 방법을 제공하는 바, 상기 질환을 치료하는 방법은 치료가 필요한 대상에게 본 발명의 제1양태 중의 어느 하나에 따른 T 세포 수용체, 또는 제6양태에 따른 T 세포 수용체 복합체, 또는 제8양태에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기의 질환는 종양, 자가면역질환과 바이러스 감염성 질환을 포함한다.
본 발명의 제10양태에서, 본 발명의 제1양태에 따른 T 세포 수용체를 제조하는 방법을 제공하는 바, 상기 T 세포 수용체를 제조하는 방법은,
(i) T 세포 수용체의 소수성 코어 영역에 아미노산 잔기를 인입시켜 돌연변이를 발생시키는 단계; 및
(ii) 안정성이 현저히 향상된 T 세포 수용체를 선별하여 본 발명의 제1양태 중의 어느 하나에 따른 T 세포 수용체를 얻는 단계를 포함한다.
다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 선별 방법은 파지 디스플레이 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 단계(ii)에서, 파지 디스플레이 기술로 소수성 코어 영역이 돌연변이가 발생된 T 세포 수용체를 전시하여 선별을 진행하는 단계를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 T 세포 수용체를 제조하는 방법은, 선별해 낸 T 세포 수용체의 서열, 활성 및/또는 기타 특성을 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 범위 내에서 본 발명의 상기 각 기술특징과 하문(예를 들면 실시예) 중의 구체적인 설명의 각 기술특징은 모두 상호 조합되어 새롭거나 또는 바람직한 기술적 해결방안을 구성하는 것으로 이해되어야 한다. 편폭의 제한으로, 일일이 설명하지 않는다.
도 1은 전형적인 TCR의 가변 도메인을 나타내는 구조 모식도이고, 상기 TCR는 암 항원 MAGE-A3 및 HLA-A1 특이성을 구비하는 야생형의 TCR이다.
도 2a와 2b는 위치지정돌연변이(sitedirected mutagenesis)된 후의 TCR의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열과 뉴클레오시드(nucleoside) 서열(SEQ ID NO: 9와 10임)을 각각 나타내는 도이다. 상기 아미노산 서열은 특허문헌(WO2012/013913)에서 공개된 TCR의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열을 더 최적화시킨 것이고, 더 구체적으로, 가변 도메인 중의 표면에 노출된 소수성 잔기를 친수성 또는 극성 잔기로 더 돌연변이시킨 것이며, 여기서 굵고 밑줄 친 자모는 돌연변이 후의 아미노산 잔기이다.
도 3a와 3b는 위치지정돌연변이 후의 TCR의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열과 뉴클레오시드 서열(SEQ ID NO: 11과 12임)을 각각 나타내는 도이다. 상기 아미노산 서열은 특허문헌(WO2012/013913)에서 공개된 TCR의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열을 더 최적화시킨 것이고, 더 구체적으로, 가변 도메인 중의 표면에 노출된 소수성 잔기를 친수성 또는 극성 잔기로 더 돌연변이시킨 것이며, 여기서 굵고 밑줄 친 자모는 돌연변이 후의 아미노산 잔기이다.
도 4는 MAGE-sTv-WT를 구축시 각 프라이머(primer)의 연결방식이다.
도 5a와 5b는 각각 sTv의 돌연변이주 라이브러리(mutant library)를 구축할 때의 α사슬과 β사슬 어댑터(adaptor)의 아미노산 서열과 뉴클레오시드 서열(SEQ ID NO: 13과 14임)이다.
도 6a와 6b는 각각 sTv의 돌연변이주 MG29의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 15와 16임)이고, MAGE-sTv-WT에 비해, 돌연변이의 잔기는 고딕체와 밑줄로 나타낸다.
도 7a와 7b는 각각 sTv의 돌연변이주 P8F1의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 17과 18임)이고, MAGE-sTv-WT에 비해, 돌연변이의 잔기는 고딕체와 밑줄로 나타낸다.
도 8a와 8b는 각각 sTv의 돌연변이주 P8F2의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 15와 18임)이고, MAGE-sTv-WT에 비해, 돌연변이의 잔기는 고딕체와 밑줄로 나타낸다.
도 9는 선별해 낸 상이한 돌연변이주 및 MAGE-sTv-WT가 항원 MAGEA3, EBV, Flu, NY-ESO에 대한 효소면역학적 반응(Enzyme-linked immuno sorbent assay , ELISA)실험의 광학밀도(optical density, OD) 값이다.
도 10a와 도 10b는 각각 LC13-WT의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 29임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 30임)의 아미노산 서열이다.
도 11a와 도 11b는 각각 JM22-WT의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 31임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 32임)의 아미노산 서열이다.
도 12a와 도 12b는 각각 1G4-WT의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 33임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 34임)의 아미노산 서열이다.
도 13a와 도 13b는 각각 LC13-sTv의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 35임)과 LC13-sTv의 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 36임)의 아미노산 서열이다.
도 14a와 도 14b는 각각 JM22-sTv의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 37임)과 JM22-sTv의 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 38임)의 아미노산 서열이다.
도 15a와 도 15b는 각각 1G4-sTv의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 39임)과 1G4-sTv의 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 40임)의 아미노산 서열이다.
도 16은 sTv의 단일 가닥 분자를 구축할 때 사용되는 짧은 펩타이드 연결체(linker)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 41임)이다.
도 17은 정제 후의 단백질 LC13-WT과 단백질 LC13-sTv의 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 도면이다. 레인(lane)1은 분자량 마커( molecular weight marker)이고, 레인2는 LC13-WT이며, 레인3은 LC13-sTv이다.
도 18a와 도 18b는 각각 정제 후의 단백질 LC13-WT와 단백질 LC13-sTv의 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)도이다.
도 19는 정제 후의 단백질 JM22-WT와 단백질 JM22-sTv의 SDS-PAGE 도면이다. 레인1은 분자량 마커이고, 레인2는 JM22-WT이며, 레인3은 JM22-sTv이다.
도 20a와 도 20b는 각각 정제 후의 단백질 JM22-WT와 단백질 JM22-sTv의 SEC도이다.
도 21은 정제 후의 단백질 1G4-WT와 단백질 1G4-sTv의 SDS-PAGE 도면이다. 레인1은 분자량 마커이고, 레인2는 1G4-WT이며, 레인3은 1G4-sTv이다.
도 22a와 도 22b는 각각 정제 후의 단백질1G4-WT와 단백질 1G4-sTv의 SEC도이다.
도 23은 1G4-sTv의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 42임)이다.
도 24는 1G4-sTv의 돌연변이주가 상이한 항원에 대한 OD값이다.
도 25는 선별해 낸 1G4-sTv의 고안정성 돌연변이주의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 75~85임)이다.
도 26은 선별해 낸 1G4-sTv의 고안정성 돌연변이주의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 86~96임)이다.
도 27은 1G4-sTv의 고안정성 돌연변이주의 시차주사 열량측정(differential scanning calorimetry, DSC) 곡선도이다.
도 28은 1G4-WT의 DSC 곡선도이다.
도 29a와 도 29b는 각각 고안정성 G15의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 97임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 98임)의 아미노산 서열이다.
도 30은 정제 후의 단백질 1G4-WT, 1G4-sTv, G13, G15, G9의 SDS-PAGE 도면이다. 레인1은 분자량 마커이고, 레인2는 1G4-WT이며, 레인3은 1G4-sTv이고, 레인4는 G13이며, 레인5는 G15이고, 레인6은 분자량 마커이며, 레인7은 G9이다.
도 31a, 도 31b와 도 31c는 각각 정제 후의 단백질G9, G13와 G15의 SEC도이다.
도 32a와 도 32b는 각각 LC13-G9의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 99임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 100임)의 아미노산 서열이다.
도 33a와 도 33b는 각각 LC13-G15의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 101임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 102임)의 아미노산 서열이다.
도 34a와 도 34b는 각각 JM22-G9의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 103임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 104)아미노산 서열이다.
도 35a와 도 35b는 각각 JM22-G15의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 105임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 106임)아미노산 서열이다.
도 36은 정제 후의 단백질 LC13-WT, LC13-sTv, LC13-G15, LC13-G9의 SDS-PAGE 도면이다. 레인1은 분자량 마커이고, 레인2는 LC13-WT이며, 레인3은 LC13-sTv이고, 레인4는 LC13-G15이며, 레인5는 분자량 마커이고, 레인6은 LC13-G9이다.
도 37은 정제 후의 단백질 LC13-G9의 SEC도이다.
도 38은 정제 후의 단백질 LC13-G15의 SEC도이다.
도 39는 정제 후의 단백질 JM22-WT, JM22-sTv, JM22-G15, JM22-G9의 SDS-PAGE 도면이다. 레인1은 분자량 마커이고, 레인2는 JM22-WT이며, 레인3은 JM22-sTv이고, 레인4는 JM22-G15이며, 레인5는 JM22-G9이다.
도 40은 정제 후의 단백질 JM22-G9의 SEC도이다.
도 41은 정제 후의 단백질 JM22-G15의 SEC도이다.
도 42a와 도 42b는 각각 MAGE-G15의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 107임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 108임)의 아미노산 서열이다.
도 43은 정제 후의 단백질 MAGE-G15의 SDS-PAGE 도면이다. 레인1은 분자량 마커이고, 레인2는 MAGE-G15이다.
도 44는 정제 후의 단백질 MAGE-G15의 SEC도이다.
도 45는 정제 후의 단백질 MAGE-G15의 DSC 곡선도이다.
도 46은 정제 후의 단백질 G15의 DSC 곡선도이다.
도 47은 정제 후의 단백질 LC13-sTv의 DSC 곡선도이다.
도 48a와 48b는 각각 정제 후의 단백질 JM22-WT와 JM22-sTv의 DSC 곡선도이다.
도 49a와 49b는 각각 정제 후의 단백질 LC13-G9와 LC13-G15의 DSC 곡선도이다.
본 발명자는 광범위하고 깊은 연구를 거쳐 표적적으로 T 세포 수용체의 소수성 코어 영역을 돌연변이시켜, 뜻밖에 고안정성의 돌연변이형 TCR을 얻을 수 있고, 특히는 가용성 TCR를 얻을 수 있는 것을 최초로 발견하였다. 이 기초상에서 본 발명을 완성하였다.
본 발명자는 최적화된 TCR의 단백질 구조를 사용하고, TCR의 소수성 코어를 개변시켜, 고안정성의 TCR 분자를 구축한다. 본 발명은 신규의 단일 가닥 TCR의 가변 도메인을 구축하고, 정향의 분자 진화법으로 최적의 소수성 코어를 분리해 낸다. 신규 소수성 코어의 TCR단편을 구비하고, 친수성 또는 극성 잔기로 TCR의 가변 도메인에서 표면에 노출된 소수성 잔기를 치환해 내 더 개량한다.
용어
TCR
자연적인 α-β 헤테로다이머의 TCR는 α사슬과 β사슬을 구비한다. 넓은 의미로 말하면, 각 사슬은 가변 도메인, 연결부(joining region)와 불변 도메인을 포함하고, β사슬은 일반적으로 가변 도메인과 연결부 사이에 짧은 다변부(diversity region)를 더 포함하지만, 상기 다변부는 일반적으로 연결부의 일부분으로 여긴다. 각 가변 도메인의 3개의 CDR(상보성 결정 영역)는 가변 도메인의 프레임 워크(framework)에 접합(inosculating)되고, 소수성 코어도 가변 도메인의 프레임 워크에 위치한다. α사슬의 가변 도메인(Vα)는 몇 가지 유형으로 나눌 수 있고, β사슬의 가변 도메인(Vβ)도 몇 가지 유형으로 나눌 수 있다. 국제 면역 유전학 정보시스템(IMGT)에서는 유일한 TRAV번호와 TRBV번호로 Vα 유형과 Vβ 유형을 각각 대신 지칭하고, TRAJ과 TRBJ로 TCR의 연결부를 대신 지칭한다. 본 발명에서 사용하는 α사슬의 J 유전자는 TRAJ를 의미하고, β사슬의 J 유전자는 TRBJ를 의미한다. TCR의 α사슬과 β사슬은 각각 2개의 '구조적 도메인’을 구비한 것으로 일반적으로 여기는 바, 즉‘가변 도메인’과 '불변 도메인’을 구비한 것으로 일반적으로 여긴다. 가변 도메인은 하나로 연결된 가변 도메인과 연결부로 구성된다. 따라서, 본원 발명의 명세서와 특허청구범위에서, 용어 'TCR의 α사슬의 가변 도메인’은 하나로 연결된 TRAV와 TRAJ를 의미하고, 용어 'TCR의 β사슬의 가변 도메인’은 하나로 연결된 TRBV와 TRBJ를 의미한다.
TCR 분야의 통상의 지식을 가진 자는 IMGT에서 제시한 TCR의 아미노산 서열, 및 소수성 코어의 위치를 포함하는 그 가변 도메인의 프레임 워크(framework)가 IMGT 중의 구체적인 위치 번호를 쉽게 알수 있고 얻을 수 있다. 예를 들면, IMGT의 공개 데이터 베이스에서 찾을 수 있다. 특별한 설명이 없는 한, 본 발명에서의 상기 TCR의 아미노산 위치 번호는 모두 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것이다. 만약 금후에 IMGT에서 제시한 위치 번호가 변동이 있으면, 2013년 1월 1일 버전의 IMGT에서 제시한 TCR의 아미노산 서열 위치번호를 기준으로 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 '소수성 코어’는 '소수성 핵심’라고도 부를 수 있는 바, 모든 단백질이 물에 용해 될 경우, 단백질 구조적 도메인에서 일반적으로 그 분자 구조 내부에 포함되고, 대부분 소수성 아미노산으로 구성된 핵심 영역에 포함되는 것을 의미한다. TCR에서, TCR의 α사슬의 가변 도메인의 소수성 코어는 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 94번째 부위와 α사슬의 J 유전자(TRAJ)의 짧은 펩타이드의 아미노산 위치의 마지막 3, 5, 7번째 부위이고, TCR의 β사슬의 가변 도메인의 소수성 코어는 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 94번째 부위와 β사슬의 J 유전자(TRAJ)의 짧은 펩타이드의 아미노산 위치의 마지막 2, 4, 6번째 부위를 의미한다. 상기 위치 번호는 IMGT에서 제시한 위치 번호를 사용한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 이는 암 항원 MAGE-A3, 암 항원 HLA-A1 특이성을 구비하는 야생형의 TCR의 가변 도메인의 구조 모식도이고, 모식도의 좌측 하방과 우측 하방의 2개의 타원형에서 굵게 표시된 아미노산 잔기가 바로 각각 α사슬과 β사슬의 가변 도메인 프레임 워크(framework) 위치의 소수성 코어이다. TCR의 항원 결합 부위는 CDRs에 있고, CDRs는 TCR와 그 대응되는 항원 사이의 결합 친화력을 결정한다. 도면으로부터 알 수 있는 바, 소수성 코어는 CDRs에 위치하지 않고, 이의 돌연변이는 응당 TCR와 그 대응되는 항원의 결합 및 결합 친화력에 영향을 미치지 않아야 하지만, 본 발명자의 연구에 따르면 소수성 코어의 개변은 TCR 분자의 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
상기 TCR의 구조 모식도는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이지, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정해서는 안되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 'sTv'는, 기능성 구조적 도메인은 하나의 연성 펩타이드 연결자로 연결된 TCR의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인으로 구성된 단일 가닥 TCR를 의미하고, 그 연성 펩타이드 연결자는 TCR의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 연결에 적합한 모든 펩타이드 연결자일 수 있으며, 펩타이드 연결자의 아미노산 잔기의 개수는 1 내지 50개일 수 있지만, 1 내지 50개에 한정되지 않는다.
용어 '안정성’은 단백질의 안정성의 모든 방면을 의미한다. 원 야생형의 단백질과 비교해 보면, 선별을 거쳐 얻은 고안정성 단백질은 하기와 같은 특징 중에서 하나 또는 하나 이상의 특징을 구비한다. 중첩풀림(unfolding)을 더 방지하고, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하며, 회복 능력이 더 강하고, 발현 능력이 더 강하며, 단백질 복원 수득률이 더 높고, 열 안정성이 향상되며, 다양한 환경(예를 들면, PH값, 염농도, 세제가 존재, 변성제가 존재함 등)에서 안정성이 향상된다.
파지 디스플레이 기술와 고안정성의 TCR 선별
파지 디스플레이 기술로 수용체를 분리할 경우, 일반적으로 두 가지 중요한 성질을 통하여 최종의 수용체를 선별해 낸다. 첫번째는 수용체와 리간드의 결합 강도 또는 친화력이고, 두번째는 수용체가 파지 표면에서의 디스플레이 강도이다. 첫번째 성질은 단백질 친화력 진화의 기초인 바, 이는 고친화성 수용체를 생성하는 모든 방법론의 발전을 이끌어 준다. 하나의 간단한 설명을 하면 다음과 같다. 수용체 디스플레이 라이브러리가 리간드에 샘플 로딩(sample loading)될 경우, 더 높은 결합 강도를 구비하는 수용체는 더 빠른 속도 및/또는 더 긴 머무름 시간으로 리간드에 결합되어, 더 높은 강도의 세척을 방지할 수 있다. 따라서, 이러한 수용체 및 그 코딩 유전자는 포획되어 후속 과정에서 확대된다. 다른 한편으로, 수용체-리간드의 상호작용의 친화력이 개변되지 않거나 또는 개변 수준이 크지 않고, 심지어 더 낮게 될 경우, 친화력 요소는 선별에 대하여 영향을 미치지 않아, 디스플레이 강도는 진화 결과를 주도하게 된다. 이것은 더 많은 정확하게 중첩된 수용체 분자가 하나의 파지 입자 위에 전시되거나 또는 더 많은 파지 입자가 하나 또는 다수개의 이러한 수용체에 전시될 경우, 상기 수용체와 코딩 유전자는 리간드와 결합하는 기회가 더 많고, 규정된 세척조건에서 더 많은 상기 수용체가 보존됨으로써, 포획되어 후속의 선별과정에서 확대되는 것을 의미한다. 두번째 성질에 기반해 보면, 파지 디스플레이 기술 또는 기타 정향의 분자 디스플레이 기술로 더 안정한 단백질을 분리할 수 있다. 본 발명자는 TCR의 단백질 소수성 코어의 정향진화 라이브러리를 이미 설계해 내서 더 안정한 단백질 또는 TCR를 분리한다. 이러한 소수성 코어는 TCR와 그 리간드 pMHC 또는 pHLA의 결합 강도에 기본상 영향이 없는데, 그 원인은, TCR는 그의 상보성 결정 영역(CDR)을 통하여 pMHC와 결합하는 때문인 것을 이미 증명하였다.
본 발명에서, 파지 디스플레이 기술로 더 안정한 단백질 구성물을 분리할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서, 암 항원 MAGE-A3, HLA-A1특이성을 구비하는 TCR(이하에서 MAGE-A3 TCR라고 약칭함)의 세포외 구조적 도메인으로 이 가상을 테스트한다. 특허문헌에서의 서열에 의하여 세포외 구조적 도메인을 합성하고, 이가 사상 파지의 표면에서 발현될 경우, TCR와 pMHC의 결합은 효소면역학적 반응법(ELISA)으로 검출하여 그 상호작용 강도를 얻을 수 있다. 하지만 이미 발표한 개량 방법으로 진행할 경우, 예를 들면 가변 도메인에서 표면에 노출된 소수성 잔기를 진수성 또는 극성의 잔기로 돌연변이한 후, ELISA로 파지를 통하여 디스플레이된 상기 TCR의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인이 구성한 단일 가닥 TCR를 검출하는 형식(sTv)으로 진행할 경우, 어떠한 결합 기능도 발견하지 못한다. 하지만 상기 단일 가닥 TCR(sTv)의 가변 도메인의 소수성 코어의 제한성 임의의 돌연변이의 라이브러리를 파지 디스플레이 담체에 복제해 넣어 몇번의 선별을 거친 후, 뜻밖에도 일부 고안정성의 클론(clone)을 얻었고, 다시 ELISA로 이러한 클론을 검출하면 대응되는 pMHC와의 결합을 검색해 낼 수 있다.
활성 폴리펩타이드
본 발명에서, 용어 '본 발명의 폴리펩타이드’, '본 발명의 TCR', '본 발명의 T 세포 수용체’는 상호 교환하여 사용할 수 있는 바, 모두 이러한 T 세포 수용체(TCR)를 의미하고, 상기 TCR의 소수성 코어 영역이 돌연변이가 발생하고, 또한 상기 TCR의 안정성은 이와 대응되는 소수성 코어가 야생형인 TCR보다 현저히 높다.
이 밖에, 본 발명의 폴리펩타이드는 소수성 코어 영역 밖의 기타 돌연변이를 더 포함할 수 있고, 특히 친화력을 향상시킬 수 있는 돌연변이 및 TCR의 가변 도메인에서 표면에 노출된 아미노산 잔기의 돌연변이를 도 포함할 수 있다.
이러한 소수성 코어 영역 밖의 기타 돌연변이 형식은 1~6개(일반적으로 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 더 바람직하게는 1~2개, 가장 바람직하게는 1개)의 아미노산을 결실, 개재 및/또는 치환하는 형식과, C 말단 및/또는 N 말단에 하나 또는 다수개의(일반적으로 5개 이내, 바람직하게는 3개 이내, 더 바람직하게는 2개 이내) 아미노산을 첨가하는 방식을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음). 예를 들면, 본 기술분야에서, 성능이 비슷하거나 또는 유사한 아미노산으로 치환할 경우, 일반적으로 단백질의 기능을 개변시키지 않는다. C 말단 및/또는 N 말단에 하나 또는 다수개의 아미노산을 첨가할 경우에도 단백질의 구조와 기능을 개변시키지 않는다. 이밖에, 상기 용어는 단량체와 폴리머(polymer) 형식의 본 발명의 폴리펩타이드를 더 포함한다.
본 명세서에서 아미노산 명칭은 국제적으로 통용되는 단일 영어 알파벳 표시를 사용하고, 이와 대응되는 아미노산 명칭의 3개의 영어 알파벳 약자는 각각 Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y), Val (V)인 것으로 이해해야 된다. 본 명세서에서 아미노산 치환의 필기 방식을 예를 들면, L19V는 IMGT에서 제시한 위치 번호에 따라 19번째 부위의 L(류신(Leucine))이 V(발린(valine))에 의해 치환된 것을 표시하고, 기타 동일한 아미노산 치환 필기 방식의 함의는 본 예제를 참조하길 바란다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드의 활성 단편, 유도체와 유사체를 더 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어‘단편’, '유도체’와 '유사체’는 리간드 분자와 결합될 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 또는 다수개의 보수성 또는 비보수성 아미노산 잔기(바람직하게는 보수성 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩타이드, 또는 (ii) 하나 또는 다수개의 아미노산 잔기에서 치환기를 구비하는 폴리펩타이드, 또는 (iii) 본 발명의 TCR과 다른 하나의 화합물(예를 들면 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜임)이 용합되어 형성하는 폴리펩타이드, 또는 (iv) 부가된 아미노산 서열이 그 폴리펩타이드 서열에 융합되어 형성되는 폴리펩타이드(선도 서열, 분비 서열 또는 6His 등 태그 서열과 융합되어 형성되는 융합 단백질)일 수 있다. 본 명세서의 시사에 따르면, 이러한 단편, 유도체와 유사체는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지 자들에게 공지된 범위이다.
한가지 종류의 바람직한 활성 유도체는 많아서 5개, 바람직하게는 많아서 3개, 더 바람직하게는 많아서 2개, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산이 성질이 유사거나 또는 비슷한 아미노산에 의해 치환되어 형성되는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 보수성 돌연변이 폴리펩타이드는 가장 바람직하게는 표 1에 따라 아미노산이 치환되어 발생하여 한다.
초기의 잔기 대표적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro; Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
본 발명은, 본 발명의 TCR의 유사체를 더 제공한다. 이러한 유사체와 본 발명의 원 TCR의 폴리펩타이드의 차이는 아미노산 서열 상의 차이일 수 있고, 서열에 영향을 미치지 않는 수식 형식 상의 차이일 수도 있거나, 또는 상기 차이를 동시에 갖출 수도 있다. 유사체는 자연적인 L-아미노산과 상이한 잔기(예를 들면 D-아미노산)를 구비하는 유사체, 및 비자연적으로 존재하거나 또는 합성된 아미노산(예를 들면 β-아미노산, γ-아미노산)을 구비하는 유사체를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 예를 든 대표적인 폴리펩타이드에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
수식(일반적으로 일급 구조를 개변시키지 않음) 형식은 아세틸화 또는 카르복시화와 같은 체내 또는 체외의 폴리펩타이드의 화학 유도 형식을 포함한다. 수식 형식은 폴리펩타이드의 합성과 가공 단계 또는 추가적인 가공 단계에서 글리코실화 수식을 거쳐 생성되는 폴리펩타이드와 같은 글리코실화(glycosylation)를 더 포함한다. 이와 같은 수식은 폴리펩타이드를 글리코실화를 거친 효소(예를 들면 포유동물의 글리코실화 효소 또는 탈당화 효소)에 노출시켜 완성할 수 있다. 수식 형식은 인산화 아미노산 잔기(포스포티로신(phosphotyrosine), 포스포세린(phosphoserine), 포스포트레오닌(phosphothreonine)과 같음)를 구비하는 서열을 더 포함한다. 수식 형식은 수식되어 이의 항단백질 가수 분해 성능이 향상되거나 또는 용해 성능이 최적화된 폴리펩타이드를 더 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 산 또는 염기가 유도하는 염 형식으로 사용될 수 있다. 이러한 염은, 염산, 브롬화수소산 , 황산, 구연산, 주석산, 인산, 락트산, 피루브산, 초산, 호박산, 수산, 푸마르산, 말레산, 옥살로아세트산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 또는 이세티온산과 같은 산과 형성되는 염을 포함한다(이에 한정되지 않는다). 기타 염은, 알칼리 금속 또는 알칼리 토류금속(나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘과 같음)과 형성되는 염, 및 에스테르, 카르밤산에스테르 또는 기타 통상적인 '프로드러그(prodrug)'의 형식을 더 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 다가(multivalent) 복합체의 형식을 제공할 수 있다. 본 발명의 다가 TCR복합체는 두개, 세개, 네개 또는 더 많은 개수의 분자가 다른 분자와 서로 연결되는 T 세포 수용체 분자를 포함한다.
코딩 서열
본 발명은, 또한 본 발명의 TCR를 코팅하는 폴리뉴틀레오티(polynucleotide)에 관한 것이다.
본 발명의 폴리뉴틀레오티는 DNA 형식 또는 RNA 형식일 수 있다. DNA는 코딩 사슬(coding strand) 또는 비코딩 사슬일 수 있다. 예를 들면, 코딩 성숙 폴리펩타이드의 코딩 영역(coding region) 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 코딩 영역 서열과 동일하거나 또는 축중(generacy)된 변이체일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, '축중된 변이체’는 본 발명에서 SEQ ID NO: 9인 단백질을 코딩하지만, SEQ ID NO: 10에서 상응한 코딩 영역 서열과 차이가 존재하는 핵산 서열을 의미한다.
본 발명의 뉴클레오시드의 전체 길이 서열(full-length sequence) 또는 그 단편은 일반적으로 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭법, 재조합법 또는 인공적 합성 방법으로 얻을 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 현재, 이미 완전히 화학적 합성을 거쳐 본 발명의 폴리펩타이드(또는 단편, 또는 그 유도체)를 코딩한 DNA서열을 얻을 수 있다. 그 다음 상기 DNA 서열을 본 기술분야에서 공지된 각종 기존의 DNA 분자(예를 들면 담체)와 세포에 인입시킨다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴틀레오티를 포함하는 담체, 및 본 발명의 담체 또는 코딩 서열로 유전자 공학을 거쳐 생성하는 숙주세포에 관한 것이다.
다른 한편으로, 본 발명은 본 발명의 TCR의 폴리펩타이드에 대하여 특이성을 구비하는 다클론성 항체와 단일 클론성 항체를 포함하고, 특히 단일 클론성 항체를 포함한다.
제조 방법
본 발명의 TCR를 생성하는 한 가지 방법은 그러한 유형의 TCR를 디스플레이하는 파지 입자의 다양성 라이브러리에서 고안정성의 TCR를 선택해 내는 것이다.
임의의 적합한 방법으로 돌연변이시킬 수 있는 바, 적합한 방법은, PCR에 의한 방법, 제한효소에 의한 클론방법 또는 연결에 의존하지 않는 클론(LIC) 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 많은 표준 분자 생물학 교재에서 이러한 방법을 상세히 설명한다. PCR의 돌연변이 유도와 제한효소에 의한 클론에 대한 더 자세한 내용은 'Sambrook와 Russell, (2001) 분자클론-실험실 수첩(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3판)CSHL출반사’를 참조할 수 있다. LIC방법에 대한 더 자세한 정보는 (Rashtchian, (1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6)를 참조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 화학적 합성되거나 또는 재조합된 것일 수 있다. 이와 상응하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상적인 방법으로 인공적으로 합성할 수 있고, 재조합 방법으로 생성할 수도 있다.
통상적인 재조합 DNA기술을 통하여, 본 발명의 폴리뉴틀레오티로 재조합된 본 발명의 폴리펩타이드를 발현 또는 생성할 수 있다. 일반적으로 상기 재조합 방법에는 하기와 같은 단계들이 있다.
(1) 본 발명의 TCR폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴틀레오티 (또는 변이체), 또는 상기 폴리뉴틀레오티를 함유하는 재조합 발현 담체로 적합한 숙주세포를 전환시키거나 또는 형질 도입시키는 단계;
(2) 적합한 배지에서 숙주세포를 배양하는 단계;
(3) 배지 또는 세포에서 분리시켜 본 발명의 TCR의 폴리펩타이드를 정제해 내는 단계.
재조합 폴리펩타이드는 세포 내 또는 세포막에서 발현되거나, 또는 세포 외에 분비될 수 있다. 만약 필요하면, 그 물리적, 화학적 또는 기타 특성을 이용하여 각종 분리 방법으로 재조합된 단백질을 분리 또는 정제할 수 있다. 이러한 방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 공지된 것이다. 이러한 방법에 대한 예로는 통상적인 재생처리, 단백질 침전제에 의한 처리(염석 방법), 원심 분리, 삼투시켜 균을 파멸하는 방법, 울트라 처리, 초원심 분리, 분자 체크로마토그래피(molecular sieve chromatography)(겔 여과), 흡착 크로마토 그래피(adsorption chromatorgraphy), 이온-교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)와 기타 각종 액체 크로마토그래피 및 이러한 방법들의 결합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
약물 조성물과 사용 방법
본 발명의 TCR와 본 발명의 TCR 형질주입의 T 세포는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약물 조성물에 제공될 수 있다. 본 발명의 TCR, 다가 TCR 복합체와 세포는 일반적으로 무균 약물 조성물의 일부분으로 제공되고, 상기 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 상기 약물 조성물은 임의의 적합한 형식(환자 투여에 필요하는 방법에 의존함)일 수 있다. 이는 단위 제형으로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉된 용기에 제공되며, 키트(kit)의 일부분으로 제공될 수 있다. 이런 유형의 키트는 사용 설명서를 포함(필수적이지 않음)한다. 이는 다수개의 상기 단위 제형을 포함할 수 있다.
이 밖에, 본 발명의 폴리펩타이드는 단독으로 사용될 수 있고, 기타 치료제와 하나로 결합 또는 접합되어 사용될 수도 있다(예를 들면 동일한 약물 조성물에 배합제조됨).
본 발명의 TCR와 결합 또는 접합될 수 있는 치료제는 하기와 같은 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 1. 방사성 핵종(Koppe 등, 2005, 암 전이 리뷰(Cancer metastasis reviews)24, 539); 2. 생물 독소(Chaudhary 등, 1989, 자연(Nature)339, 394; Epel 등, 2002, 암 면역학 및 면역 요법(Cancer Immunology and Immunotherapy)51, 565); 3. 세포인자(Gillies 등, 1992, 미국국립과학원회보(PNAS)89, 1428; Card 등, 2004, 암 면역학 및 면역 요법(Cancer Immunology and Immunotherapy) 53, 345; Halin 등, 2003, 암 연구(Cancer Research)63, 3202); 4. 항체 Fc 단편(Mosquera 등, 2005, 면역학 학술지(The Journal Of Immunology) 174, 4381); 5. 항체 scFv 단편 (Zhu 등, 1995, 국제 암 저널(International Journal of Cancer)62, 319); 6. 금 나노입자/나노로드(Lapotko 등, 2005, 암 저널(Cancer letters)239, 36; Huang 등, 2006, 미국 화학 학회지(Journal of the American Chemical Society)128, 2115); 7. 바이러스입자(Peng 등, 2004, 유전자 치료(Gene therapy)11, 1234); 8. 리포솜(Mamot 등, 2005, 암 연구(Cancer research)65, 11631); 9. 나노 자성입자; 10. 전구약물 활성화 효소(예를 들면, DT-디아포라아제(DTD) 또는 비페닐 히드로라아제-유사단백질(BPHL)); 11. 화학 요법제(예를 들면, 시스플라틴) 등이다.
약물 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 함유할 수 있다. 용어 '약학적으로 허용 가능한 담체’는 치료제 투여에 사용되는 담체를 의미한다. 상기 용어는 이들 자체는 상기 조성물을 접수하는 개체에 대한 해로운 항체를 유도 생성하지 않고, 투여후 과분한 독성이 없는 약제 담체들을 의미한다. 이러한 담체는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 공지된 것이다. 레밍턴 약제 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991))에서 약학적으로 허용 가능한 부형제에 관한 충분한 토론을 찾을 수 있다. 이런 유형의 담체는 염수, 완충액(buffer), 포도당, 물, 글리세린(glycerin), 에탄올(ethanol), 아쥬반트(adjuvant) 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
치료 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염수, 글리세린, 에탄올과 같은 액체를 함유할 수 있다. 이밖에, 이러한 담체에는 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조성의 물질이 더 존재할 수 있다.
일반적으로, 치료 조성물을 액체 용액 또는 서스펜션(suspension)과 같은 주입 가능한 약제로 제조될 뿐만 아니라, 주입 전 용액 또는 서스펜션, 액체 담체와의 배합에 적합한 고체 형식으로 제조될 수도 있다.
일단 본 발명의 조성물이 배합제조되면, 이를 통상적인 도경을 거쳐 투여할 수 있고, 상기 통상적인 도경에는 안내, 근육 내, 정맥 내, 피하, 피내, 또는 국부적인 투여 방식을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음). 예방 또는 치료하고자 하는 대상은 동물일 수 있고 특히는 사람일 수 있다.
본 발명의 약물 조성물이 실제 치료에 사용될 경우, 사용 상황에 따라 각종 상이한 제형의 약물 조성물을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 주사제, 경구제 등을 예를 들 수 있다.
이러한 약물 조성물은 통상적인 방법에 따라 혼합, 희석 또는 용해를 거쳐 조제하고, 또한 간혹 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 희석제, 완충액, 등장제(isotonicities), 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정제, 조용제와 같은 적합한 약물 첨가제를 첨가하며, 상기 배합제조과정은 제형에 따라 관습적인 방식으로 진행할 수 있다.
본 발명의 약물 조성물은 방출조절제 형식으로 투여할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드는 서방형 중합체를 담체로 하는 알약 또는 마이크로 캡슐(microcapsule)에 혼합된 다음, 상기 알약 또는 마이크로 캡슐을 시술을 거쳐 치료하고자 하는 조직에 주입할 수 있다. 서방형 중합체의 예로서, 에틸렌-비닐아세테이트(ethylene-vinyl acetate copolymer) 공중합체, 폴리하이드로메틸메타크릴레이트(polyhydromethacrylate), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 락트산(lactic acid) 폴리머, 락트산-글리콜산(Lactic acid-glycolic acid) 공중합체 등을 예를 들 수 있고, 바람직하게는 락트산 폴리머와 락트산-글리콜산 공중합체와 같은 생물 분해 가능한 폴리머를 예를 들 수 있다.
본 발명의 약물 조성물이 실제 치료에 사용될 경우, 활성 성분인 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염의 조제량은, 치료하고자 하는 각각의 환자의 체중, 연령, 성별, 증상 정도에 따라 합리하게 결정될 수 있다.
본 발명의 TCR의 용도
본 발명의 TCR는 약물 또는 진단 시약으로 사용될 수 있다. 수정 또는 기타 개량을 거쳐 그가 약물 또는 진단 시약으로 사용되는 더 적합한 특징을 얻을 수 있다. 상기 약물 또는 진단 시약은 여러 가지 상이한 질환의 치료 또는 진단에 사용될 수 있고, 상기 질환은 암(예를 들면 신장 암, 난소 암, 머리와 경부암, 고환암, 폐암, 위암, 자궁 경부암, 방광암, 전립선 암 또는 흑색종 등), 자가면역질환, 바이러스 감염성 질환, 이식편거부반응과 이식편대숙주병을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TCR의 특이성을 통하여 드러그 포지셔닝(drug positioning) 또는 타게팅 투여를 실현할 수 있어, 여러 가지 질환의 치료효과 또는 진단효과를 향상시킬 수 있다.
암에 있어서, 종양 또는 전이암의 부근에 포지셔닝되면 독소 또는 면역 자극제의 효과를 향상시킬 수 있다. 자가면역질환에서, 특이성적으로 정상 세포 또는 조직에 대한 면역 반응을 억제하거나, 또는 면역 억제제를 저속 방출하여, 그가 더 긴 시간범위 내에서 더 많은 국부효과를 발생시킴으로써, 시험자의 전체 면력 능력에 대한 영향을 최소로 감소시킬 수 있다. 이식편거부반응의 방지에 있어서, 동일한 방식으로 면역 억제의 작용을 최적화할 수 있다. HIV, SIV, EBV, CMV, HCV, HBV와 같은 약물의 병독성 질환이 이미 존재함에 있어서, 약물이 감염된 세포 영역 부근에서 활성 기능을 방출 또는 발휘하는 것도 유익한 것이다.
본 발명의 TCR는 T 세포의 활성을 조절할 수 있고, 본 발명의 TCR는 특이성의 pMHC와 결합하고, 이에 따라 T 세포의 활성화를 억제한다. T 세포가 매개하는 염증 및/또는 조직 손상에 관한 자가면역질환이 이런 방법에 적합하고, 예를 들면 Ⅰ형 당뇨병이 이런 방법에 적합하다.
본 발명의 TCR는 세포독성제를 암세포로 전달하는 목적으로 사용될 수도 있고, 또는 T 세포를 형질주입하는데 사용될 수도 있어, 이들이 HLA 복합체를 제시하는 종양세포를 파괴할 수 있으므로, 입양 면역 요법라고 불리우는 치료과정에서 환자에게 상기 TCL를 제공한다.
본 발명의 TCR는 진단 시약으로도 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지자로 본 발명의 TCR에 마킹하여, MHC-펩타이드와 MHC-펩타이드 특이성의 본 발명의 TCR 사이의 결합을 검출한다. 예를 들면 진단 목적에 적용되는 표지로 마킹하여 검출한다. 형광 표지된 TCR 폴리머는 FACS 분석에 적용되고, TCR 특이성의 펩타이드를 휴대한 항원제시세포를 검출하는데 사용될 수 있다.
컨쥬게이트와 결합한 본 발명의 TCR는 T 세포를 다시 정향할 수 있어, 이는 종양세포와 같은 특정 항원을 제시하는 세포를 타겟팅한다. 상기 컨쥬게이트는 항-CD3 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
공업상 이용성
본 발명의 고안정성 T 세포 수용체는 TCR와 pMHC(펩타이드-주조직적합성 복합체) 사이의 상호작용의 연구 및 질환의 진단과 치료 등 목적에 사용될 수 있다.
본 발명의 주요한 우점은,
(a) 본 발명의 TCR의 폴리펩타이드의 안정성이 높고;
(b) 고효율적이고 간단하게 고안정성의 TCR의 폴리펩타이드를 선별하여 얻을 수 있다.
(c) 고안정성과 고친화성의 TCR의 폴리펩타이드를 진일보로 선별하여 얻을 수 있다.
이하 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 더 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다. 하기의 실시예에서 구체적인 조건을 밝히지 않은 실험 방법은 일반적으로 통상적인 조건에 따르고, 예를 들면 Sambrook와 Russell 등, 분자 클론: 실험실 수첩(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3판)(2001)(CSHL 출판사)에 제시한 조건에 따르며, 또는 제조사에서 건의한 조건에 따라 실행한 것이다. 달리 명시하지 않으면, 백분비와 분수는 중량백분비와 중량분수이다.
실시예1. 초급 단일 가닥 TCR의 가변 도메인(sTv)의 구성과 서열의 최적화
표1에 도시된 바와 같은 프라이머를 설계하여 화학적 합성된 TCR의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(특허문헌 WO2012/013913을 인용함)을 각각 위치지정돌연변이시킨다. 이러한 돌연변이는 상기 TCR의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인에서 표면에 노출된 소수성 잔기를 친수성 또는 극성 잔기로 개변시킴으로써, 소수성 코어의 돌연변이 라이브러리의 템플릿(template)을 제조한다. α사슬의 20번째 부위의 표면의 소수성 잔기(V)를 친수성 잔기(S)로 돌연변이시키는 과정에 있어서, 소수성 코어의 돌연변이 라이브러리를 구축할 때, 위치지정돌연변이 기술로 완성한 것이다.
프라이머 명칭 프라이머 서열(5'-3') SEQ ID NO:
YW800 aacaggagtgacgcagtctccttcatctgtgagtg 1
YW801 ttagcgccatggcccaaaaacaggaggtgacgcagtc 2
YW802 gaatcttctcagcccggggac 3
YW803 cgggctgagaagattcaatg 4
YW804 gccaccgccagatccaccgggccctggagtgaccgag 5
YW805 gtggatctggcggtggcggtgaaggcggtggtggaa
gcggcggcggaggcgaaggaggctccggag		 6
YW806 gcgaaggaggctccggaggcaaggctggagtcactcaaac 7
YW807 ctagatgcggccgcctctgtgaccgtgagcctg 8
<표 2. 아미노산 서열의 프라이머 및 어댑터의 위치지정돌연변이에 사용>
여기서, YW800, YW801, YW802, YW803, YW804는 α사슬의 가변 도메인를 위치지정돌연변이시키기 위하여 설계한 프라이머이고, YW806, YW807은 β사슬의 가변 도메인을 위치지정돌연변이시키기 위하여 설계한 프라이머이며, YW805는 연성 펩타이드 연결자를 인입하기 위한 연결 프라이머이다. 도 4에 도시된 프라이머 연결 방식에 따라 PCR를 진행하여 sTv를 구축하고, 당해 sTv를 MAGE-sTv-WT으로 명명한다.
구체적인 PCR 의 돌연변이 유도 실험단계는 다음과 같다.
첫번째 PCR 단계에서, 합성된 α사슬 또는 β사슬을 각각 템플릿으로 하여, 프라이머 쌍 YW801/YW803 (α사슬), YW802/YW804(α사슬), YW806/YW807(β사슬)을 사용하여 PCR를 진행한다. 반응 과정은 98℃에서 30초 동안 한번 변성시키고, 94℃에서 5초 동안, 55℃에서 10초 동안, 72℃에서 20초 동안 25번 반복순환시킨다.
두번째 PCR 단계에서, 오버랩 중합효소연쇄반응(overlap PCR) 방법으로, 첫번째 PCR 단계에서 정제된 후의 산물과 화학적 합성된 연성 펩타이드의 단일 가닥 DNA를 템플릿으로 하고, YW800/YW807를 프라이머로 하여, PCR를 진행한다. 그 반응 과정은 98℃에서 30초 동안 한번 변성시키고, 94℃에서 5초 동안, 55℃에서 10초 동안, 72℃에서 30초 동안 30번 반복순환시키며, 72℃에서 5분 동안1번 반복순환시킨다. 정제 후의 두번째 PCR 단계의 산물은 효소 절단을 거친 후 파지 디스플레이 담체에 연결시킨다.
실시예2. MAGE-sTv-WT 서열을 pET-28a에 기반한 발현 플라스미드(expression plasmid)에 복제
<분자 클론 실험실 수첩>(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(제3판, Sambrook과 Russell)에서 설명한 표준 방법으로 MAGE-sTv-WT를 pET-28a(Novagen)에 의한 발현 플라스미드에 복제한다. ABI 회사의 3730 DNA 분석기로 플라스미드의 서열을 분석한다.
NcoI과 NotII가 절단된 코딩 MAGE-sTv-WT의 DNA 서열을 NcoI과 NotII가 절단된 pET-28a 담체(Novagen)에 연결시킨다.
연결된 플라스미드를 통상적인 컴피턴트 대장균(competent Escherichia coli) 균주 BL21(DE3)(merck 회사로부터 구매) 세포에 전환시키고, 50㎍/mL의 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB/한천평판에 이식한다. 37℃에서 하룻밤 항온 배양한 후, 하나의 콜로니(colony)를 피킹하고, 37℃에서 50㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 5ml의 LB에서 하룻밤 진탕시키면서 성장시킨다. Zymo 회사의 플라스미드로로 키트(Zyppy Plasmid Midiprep Kit, Zymo)를 추출하여 복제한 플라스미드를 정제하고, ABI 회사의 3730 DNA 측정기로 개재물의 서열을 분석한다.
도 2a와 3a는 MAGE-sTv-WT의 α사슬의 가변 도메인과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9와 11임)을 각각 나타내고, 최적화된 후의 아미노산 부위는 굵고 밑줄 친 것으로 표시한다. 도 2b와 3b는 MAGE-sTv-WT의 α사슬의 가변 도메인과 β사슬의 가변 도메인의 뉴클레오시드 서열(SEQ ID NO: 10과 12임)를 각각 나타낸다.
*실시예3. MAGE-sTv-WT의 발현, 복원과 정제
실시예2에서 얻은, MAGE-sTv-WT를 함유하는 발현 플라스미드를 대장균 균주 Rosetta(DE3)(Merck)의 배지 평판에 전환시키고, 37℃에서 하룻밤 배양하며, 단일 콜로니를 골라 37℃에서 카나마이신를 함유한 배지에서 OD600가 0.6~0.8일 때까지 배양한 다음, 0.5mM의 IPTG로 단백질을 유도하여 4시간 동안 발현시키고, FisherThermo Sovall R6+ 원심 분리기를 사용하여 5,000rpm으로 15분 동안 원심 분리시켜 세포를 얻는다. Bugbuster MasterMix(Merck)로 세포 침전물을 분해한다. FisherThermo Sovall X1R 원심 분리기로 6,000g을 15분 동안 원심 분리시켜 포함체 침전물을 회수한다. 그 다음 10배로 희석된 Bugbuster 용액으로 포함체를 3번 세척하여 세포 파괴물과 막 조정성분을 제거한다. 다음 pH가 9.0인 20mM의 트리스(Tris), 8 M의 요소인 완충액으로 포함체를 용해한다. 바이신코닉산(Bicinchoninic acid, BCA) 방법으로 정량한 후 각각의 시험관에 각각 10mg씩 넣어 -80℃에서 냉동시킨다.
용해된 MAGE-sTv-WT 포함체 단백질을 10mg 해동시키고, pH가 9.0인100mM의 Tris, 400mM의 L-아르기닌(arginine)이고, 2mM의 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)인 복원 완충액 200ml에 적가한다. 최종 농도가 각각 1mM과 10mM이 될 때까지 산화형과 환원형 글루타티온(Glutathione) 산화환원 쌍을 첨가하고, 용액을 10℃에서 10분 동안 교반한 후 100rpm으로 1~2일 동안 흔든다. 4℃~8℃에서, 분획분자량이 4kD인 셀룰로오스 막 투석 주머니와, pH가 9.0인 20mM의 Tris, 완충액 5L로 복원 MAGE-sTv-WT를 8시간 동안 투석시키고, 다시 동일하게 신선한 완충액를 교환하여 2번 투석시킨다.
투석 후의 복원 MAGE-sTv-WT를 원심 분리한 후 음이온 교환 컬럼 Q HP 5ml(GE 회사)를 첨가하고, AKTA 정제기(GE 회사)를 이용하여, pH가 9.0인 20mM의 Tris으로 배합제조된 0 M~1M의 NaCl을 이용하여, 결합된 단백질 10개의 칼럼용적만큼 선형적으로 기울기 용리(gradient elution)를 진행하고, 용출 피크(elution peak)(상대적 분자 질량은 약 28kD임)를 수집하고 SDS-PAGE(Bio-Rad)에서 런닝시켜 분석을 진행한다. MAGE-sTv-WT를 포함하는 조성성분을 농축한 후, 추가적으로 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)으로 정제한다. 정제한 후, 만약 타겟 조성성분을 얻을 수 있다면, 타겟 조성성분을 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜 분석하고, 다음 타겟 조성성분을 4℃에서 보관한다. 타겟 피크 조성성분을 병합하여 농축하고, pH가 7.4인 10mM의 HEPES 완충액에 의해 치환시킨다.
추가적으로 겔 여과법으로 용출 조성성분의 순도를 테스트한다. 조건은 다음과 같다. Agilent Bio SEC-3(300A, Φ7.8 x 300mm)인 크로마토 그래피 칼럼이고, 이동상은 150mM의 인산 완충액이며, 유속은 0.5mL/min이고, 칼럼 온도는 25℃이며, 자외선 검출 파장은 214nm이다.
실시예4. MAGE-sTv-WT를 생성하는 고안정성 변체
파지 디스플레이 기술로 MAGE-sTv-WT의 소수성 코어 변체 라이브러리를 구축하여, 고안정성의 돌연변이체를 선별 및 감정한다. MAGE-sTv-WT의 돌연변를 유도시키는 소수성 코어 부위를 통하여 소수성 코어의 돌연변이 라이브러리를 구축하여, 라이브러리를 패닝 및 선별한다. 상기 소수성 코어 라이브러리의 구축 및 선별 방법은 Li 등이 자연 생물 기술((2005)Nature Biotech 23(3):349-354)에서 설명한 파지 디스플레이와 고친화성 TCR의 파지 라이브러리의 구축 및 선별 방법을 참조할 수 있고, 설계 상의 상이한 점은, 소수성 코어 돌연변이 라이브러리를 구축할 경우, 템플릿 사슬의 소수성 코어 부위에 따라 프라이머를 설계해야 하지만, 고친화성 TCR 라이브러리의 구축은 템플릿 사슬의 CDR에 따라 프라이머를 설계하는 것이다. 소수성 코어 돌연변이 라이브러리를 구축할 때, 설계한 프라이머는 하가의 표 3에 표시된 바와 같다.
프라이머 명칭 프라이머 서열(5'-3') SEQ ID NO:
YW817 gttttctccttctgggacac 19
YW818 GtcccagaaggagaaaacNTKtctNTKaactgcagtttcactg 20
YW819 gtataaagtactacgtcctgatg 21
YW820 CaggacgtagtactttatacNTKgaatcttctcagc 22
YW821 ttgctgtcctctcgttttggac 23
YW822 CaaaacgagaggacagcaaNTKacaNTKagctgctcccctatc 24
YW823 attcatctcagagcgagag 25
YW824 CtcgctctgagatgaatNTKagcaccttggagctg 26
YW825 gccgcctctgtgaccgtmancctmrkgcccggcccgaagtac 27
YW826 acggtcacagaggcggccgcatctagaattc 28
<표 3. MAGE-sTv-WT의 소수성 코어 변체 라이브러리를 구축할 때 설계한 프라이머>
본 발명에서 사용되는 축중 염기는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 익숙히 알고 있는 것과 같이, 각각 대표할 수 있는 염기는 다음과 같다. B=C 또는 G 또는 T; D=A 또는 G 또는 T; H=A 또는 C 또는 T; K=G 또는 T; M=A 또는 C; N=A 또는 C 또는 G 또는 T; R=A 또는 G; S=C 또는 G; V=A 또는 C 또는 G; W=A 또는 T; Y=C 또는 T.
안정성이 낮은 돌연변이주가 파지 디스플레이 과정에서 도태되고, 더 안정한 돌연변이주를 선별해 내기 위하여, 다음과 같은 3가지 처리 방법을 사용한다. 1. 37℃에서 sTv를 디스플레이하고, 2. 유도제(예를 들면 IPTG)를 첨가하여 sTv가 파지 표면에 디스플레이되도록 유도하며, 3. 선별 전 sTv를 디스플레이하는 파지를 55℃에서 60분 배양한다.
서열 측정을 거쳐, 상기 방법으로 선별해 낸 고안정성 sTv의 돌연변이주의 소수성 코어는 모두 돌연변이가 발생한 것을 검출해 냈다. 선별해 낸 고안정성의 돌연변이주를 MG29, P8F1과 P8F2로 명명한다. IMGT 중의 위치 번호에 따라, 그 α사슬의 가변 도메인의 하나 또는 다수개의 소수성 코어 위치의 아미노산의 19, 21, 91 번째 부위에 돌연변이가 발생되고, 및/또는 그 β사슬의 가변 도메인의 하나 또는 다수개의 소수성 코어 위치의 아미노산의 91번째 부위 및 β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산 서열의 마지막 4번째 부위에 돌연변이가 발생된다. 더 구체적으로, IMGT 중의 위치번호에 따른 것이며, 이는 19V, 21I, 91L 중의 하나 또는 다수개의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 구비하고, 및/또는 91F 또는 91I 중의 하나 또는 다수개의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 구비하고, β사슬의 J 유전자의 마지막 4번째 부위가 M이다. 구체적인 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15와 17이고, β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16과 18이다. 여기서, 도 6a와 도 6b에 도시된 바와 같이, 돌연변이주 MG29의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인을 구성하는 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 15와 16이고, 도 7a와 도 7b에 도시된 바와 같이, 돌연변이주 P8F1의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인을 구성하는 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 17과 18이고, 도 8a와 도 8b에 도시된 바와 같이, 돌연변이주 P8F2의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인을 구성하는 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 15와 18이다.
상기 선별해 낸 OD값이 비교적 높은 고안정성 돌연변이주 MG29, P8F1, P8F2및 소수성 코어에 돌연변이가 발생하지 않은 MAGE-sTv-WT를 ELISA 실험을 거쳐 이들의 OD값을 비교하여, 돌연변이주의 특이성을 검증한다.
ELISA 실험 단계
1. MAGE-sTv-WT, MG29, P8F1, P8F2 글리세롤 박테리아를 5mL의 2xTY(100㎍/mL의 암피실린(ampicillin), 2%의 포도당)에 각각 이식시키고, 250rpm/min으로 37℃에서 하룻밤 배양한다.
2. 50μL의 하룻밤 배양한 박테리아 액체를 5mL의 신선한 2xTY(100㎍/mL의 암피실린, 2%의 포도당)에 각각 이식시키고, 250rpm/min으로 37℃에서 OD600=0.4까지 배양하고, 5?L(6.5 x 1010)를 사용하여 KM13 보조 파지(Source BioScience)를 감염시키며, 37℃에서 30min 동안 정지시킨 후, 200rpm/min으로 37℃에서 30 min 동안 진탕시키고, 원심 분리하여 침전을 30mL의 2xTY(100㎍/mL의 암피실린, 50㎍/mL의 카나마이신, 0.1%의 포도당)에 재부유시키며, 250rpm/min으로 30℃에서 하룻밤 배양한다.
3. 10㎍/mL의 스트렙타아비딘(resuspension)(PBS, pH=7.4)으로 면역 흡착판(NUNC)을 코팅하고, 매 하나의 웰에 100μL으로 넣어, 4℃에서 하룻밤 배양한다.
4. 원심 분리로 하룻밤 배양한 박테리아 액체의 상청액을 수집하고, 1/4 체적비의 PEG/NaCl로 상청액 중의 파지를 침전시키며, 얼음 위에 1 h 동안 적치시키고, 원심 분리로 침전을 수집하며, 3mL의 PBS에 재부유한다.
5. 0.1%의 PBST로 판을 3번 세척한 후, 매 하나의 웰에 400μL를 첨가하여, 3%의 Marvel-PBS(Cadbury Schweppes)로 37℃에서 2h 동안 밀폐하고, PBST로 판을 3번 세척하며, 매 하나의 웰에 100μL의 10ug/mL인 pMHC를 첨가하여 실온에서 1h 동안 적치시키고, 판을 3번 세척하며, 매 하나의 웰에 100μL의 파지 샘플(10μL의 PEG가 침전된 샘플과 3%의 Marvel-PBS를 실온에서 1h 동안 배양함)을 첨가하여 실온에서 1h 동안 적치시키고, 판을 3번 세척한 후, 매 하나의 웰에 100uL의 anti-M13-HRPconjugate(GE Healthcare)(1:5000으로 3%의 Marvel-PBS에 희석함)를 첨가하여 실온에서 1h 동안 적치시키며, 판을 6번 세척하고, 매 하나의 웰에 100μL의 TMD를 첨가하여 5 min 동안 적치시킨 후, 매 하나의 웰에 100μL의 황산 1M을 첨가하여 종려한다.
6. 450nm, 650nm의 흡광값을 읽는다.
상기 돌연변이주의 ELISA 실험의 OD값은 도 9에 도시된 바와 같고, 이 결과는 소수성 코어가 최적화된 후의 sTv 특이성은 야생형의 MAGE-sTv-WT의 소수성 코어와 동일함을 유지한 것을 나타낸다. 본 실험에서, MAGE-sTv-WT는 디스플레이가 너무 낮아, 그 OD값도 매우 낮고, 이것은 가령 α사슬과 β사슬의 가변 도메인에서 표면에 노출된 소수성 잔기를 친수성 또는 극성 잔기로 개변시켜도 그 단백질의 안정성은 여전히 낮음으로, 여전히 소수성 코어를 최적화 시켜야 되는 것을 설명한다. 소수성 코어가 최적화된 클론은 모두 상이한 수준으로 sTv를 디스플레이 할 수 있고, 그 원 리간드MAGE-A3, pHLA-A1 항원과 특이성 결합을 발생할 수 있지만, EBV, 독감, NY-ESO-1 항원과 같이 관계가 없는 기타 항원과 결합되지 않는다. MG29, P8F1과 P8F2 등과 같이 파지 디스플레이에 의해 검출해 내고 소수성 코어가 돌연변이된 sTv와 특이성 항원의 결합은 그 친화력이 야생의 TCR보다 강한 것이 아니다. 이것은 실시예15에서 증명된다.
실시예5. 소수성 코어가 돌연변이된 고안정성 sTv 분자를 구축
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 익숙히 알고 있는 위치지정돌연변이 방법에 의하여 실시예4에서 선별해 낸 고안정성 변체의 일부 소수성 코어를 몇 가지 기타 TCR 분자에 인입시켜, 고안정성 sTv 분자를 구축한다.
항원 짧은 펩타이드 HLA-B8/FLRGRAYGL(EB병독 항원 EBNA3A에 유래됨), HLA-A2 /GILGFVFTL(인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질에 유래됨) 및 HLA-A2/SLLMWITQC(NY-ESO-1 종양 특이성 항원) 각각에 대한 몇 가지 야생형의 TCR 분자의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인에 근거하여 상기 몇 가지 분자의 단일 가닥 형식을 각각 구축하여, 각각 LC13-WT, JM22-WT와 1G4-WT로 명명한다. 여기서, 도 10a와 도 10b에 도시된 바와 같이, LC13-WT의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 29와 SEQ ID NO: 30이고, 도 11a와 도 11b에 도시된 바와 같이, JM22-WT의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 31과 SEQ ID NO: 32이며, 도 12a와 도 12b에 도시된 바와 같이, 1G4-WT의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산의 서열은 각각 SEQ ID NO: 33과 SEQ ID NO: 34이다.
실시예4에서 선별해 낸 고안정성변체의 일부 소수성 코어를, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 익숙히 알고 있는 위치지정돌연변이 방법으로 LC13-WT, JM22-WT和1G4-WT 분자에 각각 인입시키고, 돌연변이를 인입한 후에 얻은 분자를 각각 LC13-sTv, JM22-sTv와 1G4-sTv로 명명하며, 인입된 소수성 코어를 밑줄 친 굵은 자모로 표시한다. 여기서, 도 13a와 도 13b에 도시된 바와 같이, LC13-sTv의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 35와 SEQ ID NO: 36이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 11L, 13V, 21I과 91I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 94L이고, 도 14a와 도 14b에 도시된 바와 같이, JM22-sTv의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 37과 SEQ ID NO: 38이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 19V와 21I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 91I과 94L이고, 도 15a와 도 15b에 도시된 바와 같이, 1G4-sTv의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 39와 SEQ ID NO: 40이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 19V와 21I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 19V, 91I, 94L와 J 유전자의 마지막 6번째 부위는 T이다. 상기 위치 번호는 IMGT에서 제시한 위치 번호를 사용한다. 상기 단일 가닥 분자를 구축하는데 사용되는 짧은 펩타이드 연결체(linker)는 모든 적합한 서열을 사용할 수 있고, 도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 41이다.
실시예6. 단백질 LC13-WT와 LC13-sTv의 안정성 테스트
실시예3에서 제시한 방법으로 단백질 LC13-WT와 LC13-sTv를 발현, 복원, 정제하고, 겔 여과 칼럼으로 정제한 후 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜, 겔 여과법으로 두 가지 단백질의 SEC도를 만들며, 동시에 그 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양과 단백질 복원수득율을 계산한다. 여기서, 발현양은1L의 대장균이 발현을 유도하여 정제 후의 포함체의 생산량이다. 정제 후 얻은 단백질 양은 1L의 대장균이 발현을 유도하여 정제 후 얻은 포함체가 복원, 정제를 거친 후 얻은 단백질의 량이다. 단백질 복원수득율의 계산식은 다음과 같다. 단백질 복원수득율(%)=100*정제 후 얻은 단백질 양(mg)/복원에 사용하는 포함체의 량(mg). 특별히 설명한 것 이외에, 본 발명에 언급된 발현양과 단백질 복원수득율은 모두 상기 계산방식으로 계산한다.
미국의 TA(waters) 회사의 시차주사 열량계(Nano DSC)로 상기 정제 후의 단백질 LC13-WT와 LC13-sTv의 Tm값을 측정한다. 그 스캔 범위는 10℃~90℃이고, 승온 속도는 1℃/min이며, 샘플 로딩양은 900μL이다. 여기서, Tm값은 분석 소프트웨어인 Nanoanalyze의 피팅 모델 TwostateScaled로 피팅하여 얻은 것이다.
하기 표 4는 LC13-WT와 LC13-sTv의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양 및 단백질 복원수득율의 수치를 나타낸다.
단백질 명칭 발현양(mg/L) 정제 후 얻은 단백질 양(mg/L) 수득율(%)
LC13-WT 231 1.3 0.56%
LC13-sTv 330 66.6 20.2%
상기 표의 수치로부터 알 수 있는 바, 정제를 거친 후, 소수성 코어의 돌연변이를 인입한 LC13-sTv 단백질은 소수성 코어에 돌연변이가 발생하지 않는 LC13-WT에 비해 단백질 복원수득율이 35배 향상된다.
도 17은 실시예3에서 제시한 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)을 거쳐 정제한 후 얻은 단백질 LC13-WT와 LC13-sTv의 SDS-PAGE 도면이다. 도면에 도시된 바와 같이, 정제 후 얻은 LC13-WT 단백질이 형성한 밴드는 균일하지 않지만, LC13-sTv는 단일의 밴드를 형성할 수 있으며 순도가 매우 높다. 이것은 LC13-sTv의 복원 상황이 LC13-WT보다 훨씬 좋다는 것을 설명한다.
도 18a와 18b는 각각 단백질 LC13-WT와 LC13-sTv의 SEC도이고, 도를 보면, 정제 후의 단백질 LC13-WT는 피크가 발생하지 않지만, LC13-sTv는 단일하고 대칭되는 용출 피크를 형성할 수 있으며, 이것은 LC13-sTv의 복원은 LC13-WT보다 현저히 우수하다는 것을 설명한다.
LC13-WT가 복원 정제된 후 정확한 배좌를 얻은 단백질 함량은 매우 적기 때문에, 선명한 단백질 중첩풀림 흡열 피크가 없고, 분석 소프트웨어인 Nanoanalyze로 그 Tm값을 얻지 못하며, 소수성 코어의 돌연변이를 거친 후의 LC13-sTv의 Tm값은 43.6℃이고, 그 DSC 고선도는 도 47에 도시된 바와 같다. 이것은 LC13-sTv는 LC13-WT에 비해 회복 능력이 더 강하고, 중첩풀림을 더 방지하며, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하고, 열 안정성이 현저히 향상된다는 것을 설명한다.
단백질 LC13-WT와 LC13-sTv의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양, 단백질 복원수득율, SDS-PAGE 도면, SEC도 및 Tm값의 비교를 통하여, 소수성 코어의 개량을 거친 LC13-sTv는 소수성 코어의 개량을 거치지 않은 LC13-WT에 비해 회복 능력이 더 강하고, 중첩풀림을 더 방지하며, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하고, 단백질 복원수득률이 더 높으며, 열 안정성이 현저히 향상된다는 것을 설명한다. 따라서, LC13-sTv는 LC13-WT에 비해, 안정성이 현저히 향상된다. 단백질 복원수득율의 수치로 안정성이 향상된 량을 계산하면, 본 발명에서 LC13-sTv는 LC13-WT에 비해, 안정성이 35배 향상된다.
실시예7. 단백질 JM22-WT와 JM22-sTv의 안정성 테스트
실시예3에서 제시한 방법으로 단백질 JM22-WT와 JM22-sTv를 발현, 복원, 정제하고, 겔 여과 칼럼으로 정제한 후 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜, 겔 여과법으로 두 가지 단백질의 SEC도를 만들며, 동시에 그 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양과 단백질 복원수득율을 계산하고, 실시예6에서 제시한 방법으로 그 Tm값을 측정한다.
하기 표 5는 JM22-WT와 JM22-sTv의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양 및 단백질 복원수득율의 수치를 표시한다.
단백질 명칭 발현양(mg/L) 정제 후 얻은 단백질 양(mg/L) 수득율(%)
JM22-WT 152 0.67 0.4%
JM22-sTv 350 60.04 17.2%
상기 표의 수치로부터 알수 있는 바, 정제를 거친 후, 소수성 코어의 돌연변이를 인입한 LC22-sTv 단백질은 소수성 코어에 돌연변이가 발생하지 않는 JM22-WT에 비해 단백질 복원수득율이 42배 향상된다.
도 19는 실시예3에서 제시한 것에 따라 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)를 거쳐 정제된 후 얻은 단백질 JM22-WT와 JM22-sTv의 SDS-PAGE 도면이다. 도면에 도시된 바와 같이, JM22-WT가 복원되어 형성한 단일 밴드는 균일하지 않고, 3개의 밴드가 있지만, JM22-sTv는 단일의 밴드를 형성할 수 있으며 순도가 매우 높다. 이것은 JM22-sTv의 복원 상황이 JM22-WT보다 훨씬 좋다는 것을 설명한다.
도 20a와 도 20b는 각가 단백질 JM22-WT와 JM22-sTv의 SEC도이고, 도를 보면, 정제 후의 단백질 JM22-WT가 형성하는 용출 피크는 단일하지 않고 신호가 매우 낮지만, 정제 후의 JM22-sTv는 단일하고 대칭되는 용출 피크를 형성할 수 있으며, 이것은JM22-sTv의 복원 상황이 JM22-WT보다 현저히 우수하다는 것을 설명한다.
도 48a와 도 48b는 각각 단백질 JM22-WT와 JM22-sTv의 DSC 곡선도이다. JM22-WT가 복원 정제된 후 정확한 배좌를 얻은 단백질 함량은 매우 적기 때문에, 선명한 단백질 중첩풀림 흡열 피크가 없고, 분석 소프트웨어인 Nanoanalyze로 그 Tm값을 얻지 못하며, 소수성 코어의 돌연변이를 거친 후의JM22-sTv의 Tm값은 43.7℃이다. 상기 DSC 곡선도로부터 알 수 있는 바, JM22-sTv는 JM22-WT에 비해 회복 능력이 더 강하고, 중첩풀림을 더 방지하며, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하고, 열 안정성이 현저히 향상된다.
단백질 JM22-WT와 JM22-sTv의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양, 단백질 복원수득율, SDS-PAGE 도면, DSC 곡선도 및 SEC도의 비교 분석을 통하여 알 수 있는 바, 소수성 코어의 개량을 거친 JM22-sTv는 소수성 코어의 개량을 거치지 않은 JM22-WT에 비해, 회복 능력이 더 강하고, 중첩풀림을 더 방지하며, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하고, 열 안정성이 현저히 향상되며, 동시에 단백질 복원수득율도 현저히 향상된다. 따라서, 본 발명의 JM22-sTv는 JM22-WT에 비해 안정성이 현저히 향상된다. 단백질 복원수득율의 수치로 안정성이 향상된 량을 계산해 보면, 본 발명에서 JM22-sTv는 JM22-WT에 비해 안정성이 4200% 향상된다.
실시예8. 단백질 1G4-WT와 1G4-sTv의 안정성 테스트
실시예3에서 제시한 방법으로 단백질 1G4-WT와 1G4-sTv를 발현, 복원, 정제하고, 겔 여과 칼럼으로 정제한 후 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜, 겔 여과법으로 두 가지 단백질의 SEC도를 만들며, 동시에 그 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양과 단백질 복원수득율을 계산한다.
하기 표 6은 1G4-WT와 1G4-sTv의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양 및 단백질 복원수득율의 수치를 표시한다.
단백질 명칭 발현양(mg/L) 정제 후 얻은 단백질 양(mg/L) 수득율(%)
1G4-WT 290 8.08 2.8%
1G4-sTv 388 38.8 10%
상기 표의 수치로부터 알수 있는 바, 정제를 거친 후, 소수성 코어의 돌연변이를 인입한 1G4-sTv 단백질은 소수성 코어에 돌연변이가 발생하지 않는 1G4-WT에 비해 단백질 복원수득율이 2.6배 향상된다.
도 21는 실시예3에서 제시한 것에 따라 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)를 거쳐 정제된 후 얻은 단백질 1G4-WT와 1G4-sTv의 SDS-PAGE 도면이다. 도면에 도시된 바와 같이, JM22-WT가 복원되어 형성한 단일 밴드는 균일하지 않고, 2개의 밴드를 형성하였지만, 1G4-sTv는 단일의 밴드를 형성할 수 있으며 순도가 매우 높다. 이것은 1G4-sTv의 복원 상황이 1G4-WT보다 훨씬 좋다는 것을 설명한다.
도 22a와 도 22b는 각가 단백질 1G4-WT와 1G4-sTv의 SEC도이고, 도를 보면, 정제 후의 단백질 1G4-WT가 형성하는 용출 피크는 단일하지 않고 신호가 매우 낮지만, 정제 후의 1G4-sTv는 단일하고 대칭되는 용출 피크를 형성할 수 있으며, 이것은 1G4-sTv의 복원 상황이 1G4-WT보다 현저히 우수하다는 것을 설명한다.
단백질 1G4-WT와 1G4-sTv의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양, 단백질 복원수득율, SDS-PAGE 도면, DSC 곡선도 및 SEC도의 비교 분석을 통하여 알 수 있는 바, 소수성 코어의 개량을 거친 1G4-sTv는 소수성 코어의 개량을 거치지 않은 1G4-WT에 비해, 더 강한 회복 능력을 구비하고, 더 높은 발현양을 구비하며, 더 높은 단백질 복원수득율을 구비한다. 따라서, 본 발명의 1G4-sTv는 1G4-WT에 비해 안정성이 현저히 향상된다. 단백질 복원수득율의 수치로 안정성이 향상된 량을 계산해 보면, 본 발명에서 1G4-sTv는 1G4-WT에 비해 안정성이 260% 향상된다.
실시예9. 1G4-sTv를 템플릿으로 분자의 안정성을 더 최적화한다
1G4-sTv를 템플릿으로 그 소수성 코어 및 가변 도메인의 표면의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜, 라이브러리를 구축하여, 고안정성의 분자를 선별한다. 도 23에 도시된 바와 같이, 돌연변이시킬 소수성 코어 부위는 서열 SEQ ID NO: 42에서 밑줄 친 고딕체로 표기하였고, 돌연변이시킬 표면의 아미노산 잔기는 고딕체로 표시하였다.
라이브러리 구축에서 사용하는 기본 방법은 실시예4에서 설명하였다. 본 실시예에서, 돌연변이시킬 부위에 대하여 3개의 라이브러리를 구축하고, 돌연변이시키는 소수성 코어 부위는 전부 라이브러리1에 있고, 라이브러리2와 라이브러리3는 표면의 아미노산 잔기에 대하여 구축한 것이다. 더 구체적으로, 1G4-sTv 플라스미드를 템플릿으로, 설계해 놓은 돌연변이 프라이머로 오버랩 PCR(Overlap PCR)하여 돌연변이 DNA 단편을 얻은 후, NcoI/NotI 효소 절단을 통하여, 단편을 pUC19 프레임 워크에 의한 파지 플라스미드 담체pLitmus28(NEB)에 복제한다. 연결 후의 DNA가 TG1 컴피턴트세포(lucigen)를 전기 전환시켜, 모두 3개의 파지 플라스미드 담체 라이브러리를 얻고, 그 저장량은 콜로니 계수에 따라 약 1x109-3x109이다. 상기 3개의 라이브러리에서 성장한 균태를 각각 긁어 내, 최종 농도가 20%의 글리세린에 첨가하여 -80℃에서 보관한다. 이하 표 9, 표 10와 표 11은 각각 라이브러리1, 라이브러리2와 라이브러리3에 대하여 설계한 프라이머이다.
프라이머 명칭 프라이머 서열(5'-3') SEQ ID NO:
L1-01 CCGGCCATGGCCAAGCAGGAANTKACGCAATCCCCGTCGTC 43
L1-02 AATCCCCGTCGTCAVDGTCTVDGCCGGAAGGCGAAAATGTC 44
L1-03 TCGCGGAGTCACCCGGCTGMANTGATTCAATATACAGG 45
L1-04 CAGCCGGGTGACTCCGCGACGTACTTTTGTG 46
L1-05 TTCGGCGTTTGGGTMANACCCGCATTAC 47
L1-06 ACCCAAACGCCGAAATACVDGAGCVDGAAGACGGGTCAGTC 48
L1-07 GCGGAGTCACTCGGGGTMANTGATTCAATGC 49
L1-08 ACCCCGAGTGACTCCGCADBGTATCTGTGTGCTTCG 50
L1-09 TCGAGTGCGGCCGCCGTCACCGTCA 51
<표 7. 라이브러리1를 구축하기 위하여 설계한 프라이머>
프라이머 명칭 프라이머 서열(5'-3') SEQ ID NO:
L2-01 AGCCGGCCATGGCCAAGCAGGAAGTCAC 52
L2-02 GATTGAGACATTTTCMYYTTCCGGGACAG 53
L2-03 GTCACTGTCTGTCCCGGAARRKGAAAATGTCTCAATC 54
L2-04 CACAAAAGTACGTCGCMYYGTCMYYCGGCTGCGATGAT 55
L2-05 CGACGTACTTTTGTGCGGTTCGTCC 56
L2-06 CAGCTTCGTACCCTTGCCGAAGGTC 57
L2-07 TTCGGCAAGGGTACGAAGCTGRRKGTCACGCC 58
L2-08 CATTGCAGGGTCACMYYCTGMYYCGTMYYCAGGCTCTGGT 59
L2-09 GTGACCCTGCAATGCGCCCAGGATATG 60
L2-10 CACAGATAAACTGCGGAGTCMYYCGGGGTCAG 61
L2-11 GACTCCGCAGTTTATCTGTGTGCTTCGTCC 62
L2-12 GAGTGCGGCCGCCGTCACMYYCAGGCGCGTG 63
<표 8. 라이브러리2를 구축하기 위하여 설계한 프라이머>
프라이머 명칭 프라이머서 열(5'-3') 서열 번호
L3-01 CCGGCCATGGCCAAGCAGGAAGTCACGCAATCCCCGTCGTC 64
L3-02 ACGCAATCCCCGTCGTCACTGRRKGTCCCGGAAGG 65
L3-03 GGAGTCACCCGGCTGMANMYYTTCAATATACAGGGTAC 66
L3-04 CAGCCGGGTGACTCCRRKACGTACTTTTGTGCG 67
L3-05 TTCGCTGCCGCCCCCMYYCGTGACGCTCAGCTT 68
L3-06 AAGCTGAGCGTCACGRRKGGGGGCGGCAGC 69
L3-07 GCATTGCAGGGTCACAGACTGACCMYYCTTCAGGCTC 70
L3-08 GTCAGTCTGTGACCCTGCAATGCGCCCAGGATATG 71
L3-09 CTGCGGAGTCACTCGGMYYCAGMYYTTCAATGCG 72
L3-10 CCGAGTGACTCCGCAGTTTATCTGTGTGCTTCGTCC 73
L3-11 AGTGCGGCCGCMYYCACCGTCAG 74
<표 9. 라이브러리3를 구축하기 위하여 설계한 프라이머>
고안정성의 sTv 클론을 얻기 위하여, 라이브러리에서 성장한 파지를 침전 및 농축한 후, 65℃에서 열충격 처리하고, 동시에 선별력을 더 향상시키기 위하여, 0.02%의 SDS를 더 첨가하여 같이 배양하며, 그 다음 처리한 후의 파지를 후속 선별한다. 3개의 라이브러리에서 선별해 낸 OD값이 비교적 높은 클론을 조합하여 최종적으로 11 개의 클론을 얻는다.
실시예10. 실시예9에서 선별해 낸 클론의 안정성을 검증
실시예9에서 선별해 낸 11개의 클론을 실시예4에서 제시한 ELISA 실험 단계로 그 OD값을 검출하여 항원특이성을 검증하고, 그 결과는 도 24에 도시된 바와 같다. 이 결과에 나타난 바와 같이, 11개의 클론의 OD값은 모두 높고, 이의 원 리간드 항원HLA-A2/SLLMWITQC(NY-ESO-1종양 특이성 항원)와 특이성 결합할 수 있으며, 관계가 없는 기타 항원과 거의 결합이 없다. 상기와 같이 파지 디스플레이를 통하여 검출해 낸 sTv와 항원 HLA-A2/SLLMWITQC의 결합은 그 친화력이 야생의 TCR보다 강한 것이 아니다. 이것은 실시예11에서 증명된다.
IMGT에서 제시한 위치 번호에 따라, 상기 11개의 돌연변이주는 α사슬의 가변 도메인의 11, 13번째 부위 또는 94번째 부위 및/또는 β사슬의 가변 도메인의 11, 13번째 부위 또는 94번째 부위 중의 하나 또는 다수개의 소수성 코어 위치에서 돌연변이가 발생한다. 구체적으로, 이는11M, 11E, 13R, 13K, 94V 또는 94I 중의 하나 또는 다수개의 α사슬의 가변 도메인의 소수성 코어의 아미노산 잔기를 함유하고 및/또는 11L, 11V, 13V또는 94V 중의 하나 또는 다수개의 β사슬의 가변 도메인의 소수성 코어의 아미노산 잔기를 함유한다. 소수성 코어 이외에, 저희가 선별해 낸 클론은 4L, 12N, 16S, 93N, 93R, 97N, 100G, 105S 또는 α사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위가 D인 것 중에서 하나 또는 다수개의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 함유하고 및/또는 4I, 101L, β사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위가 D거나 또는 마지막 3번째 부위가 E인 것 중에서 하나 또는 여러개의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 함유한다.
선별해 낸 고안정성의 상기 클론의 α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 75~85임)와 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 86~96임)은 각각 도 25와 도 26에 도시된 바와 같다.
*실시예2와 실시예3에서 제시한 방법으로 선별해 낸 11개의 클론을 연결, 발현, 복원 및 정제한다. 미국 TA(waters) 회사의 시차주사 열량계(Nano DSC)로 상기 11개의 클론의 Tm값을 측정한다. 그 스캔 범위는 10℃~90℃이고, 승온 속도는 1℃/min이며, 샘플 로딩양은 900μL이다. 여기서, Tm값은 분석 소프트웨어인 Nanoanalyze의 피팅 모델 TwostateScaled로 피팅하여 얻은 것이다. 결과는 도 27 및 표 10에 표시된 바와 같이, 그 Tm 값은 모두 37.9℃보다 작지 않고, 또한 선명한 단백질 중첩풀림 흡열 피크를 구비한다. 상기 클론의 발현, 복원, 정제 과정 및 DSC 실험 조건과 완전히 동일한 1G4-WT의 DSC 결과는 도 28에 도시된 바와 같고, 도로부터 알 수 있는 바, 이는 선명한 단백질 중첩풀림의 흡열 피크가 없고, 이것은 정확한 배좌의 단백질 함량이 극히 적은 것을 설명한다. 상기 11개의 클론의 DSC도와 1G4-WT의 DSC도를 비교한 결과로부터 알 수 있는 바, 선별해 낸 클론은 1G4-WT에 비해, 중첩풀림을 더 방지하고, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하며, 회복 능력이 더 강하고, 열 안정성이 현저히 향상된다. 따라서, 저희가 선별해 낸 클론의 안정성은 소수성 코어에 돌연변이가 발생하지 않는 1G4-WT보다 훨씬 높다.
상기 1G4-WT가 복원 정제된 후 정확한 배좌를 얻은 단백질 함량은 매우 적기 때문에, 선명한 단백질 중첩풀림 흡열 피크가 없고, 분석 소프트웨어인 Nanoanalyze로 그 Tm값을 얻지 못하며, 상기 소수성 코어가 돌연변이된 TCR는 약 38℃ 또는 더 높은 Tm값을 구비하고, 이것은 본 발명의 상기 G3~G7 및 G9~G14 등 11가지 돌연변이 TCR의 안정성은 모두 현저하게 향샹된다는 것을 제시한다(적어도 1배 향상됨).\
클론 명칭 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열
α β		 Tm(℃)
G3 75 86 37.90
G4 76 87 48.22
G5 77 88 41.89
G6 78 89 48.30
G7 79 90 43.33
G9 80 91 49.55
G10 81 92 40.01
G11 82 93 46.57
G12 83 94 44.32
G13 84 95 49.63
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 선별해 낸 고안정성 돌연변이 부위를 재조합하여 신안정성 돌연변이주를 구축할 수 있다. 저희는 상기 돌연변이 부위를 재조합하여, 신규의 α사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 97임)과 β사슬의 가변 도메인(SEQ ID NO: 98임)을 구축하였고, 그 아미노산 서열은 각각 도 29a와 도 29b에 도시된 바와 같다. 이러한 α사슬의 가변 도메인과 β사슬의 가변 도메인으로 sTv 분자를 구축하고, 이를 G15로 명명한다.
실시예11. 1G4-WT 돌연변이주 안정성에 대한 추가적인 테스트
실시예3에서 제시한 방법으로 실시예10에서 제시한 돌연변이주 G9, G13과 G15를 발현, 복원, 정제하고, 겔 여과 칼럼으로 정제한 후 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜, 겔 여과법으로 세 가지 단백질의 SEC도를 만들며, 동시에 그 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양과 단백질 복원수득율을 계산하고, 1G4-WT와 비교한다.
표 11은 1G4-WT, G9, G13과 G15의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양 및 단백질 복원수득율의 수치를 표시한다.
단백질 명칭 발현양(mg/L) 정제 후 얻은 단백질 양(mg/L) 수득율(%)
1G4-WT 290 8.08 2.8%
G9 356 55.18 15.5%
G13 223 101.15 45.4%
G15 279 129.7 46.5%
상기 표의 수치로부터 알수 있는 바, 정제를 거친 후, 돌연변이주 G9, G13과 G15는 1G4-WT에 비해 단백질 복원수득율이 모두 4.5배, 15.2배, 15.6배 향상된다.
도 30은 실시예3에서 제시한 것에 따라 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)를 거쳐 정제된 후 얻은 단백질 1G4-WT, G9, G13과 G15의 SDS-PAGE 도면이다. 도면에 도시된 바와 같이, 1G4-WT 단백질이 형성한 단일 밴드는 균일하지 않지만, 개량을 거친 G9, G13과 G15는 모두 단일 밴드의 단량체를 형성하고 순도가 매우 높다. 이것은 G9, G13과 G15의 복원 상황이 1G4-WT보다 훨씬 좋다는 것을 설명한다.
도 31a, 도 31b와 31c는 각가 단백질 G9, G13과 G15의 SEC도이고, 도 22a의 1G4-WT의 SEC도로부터 알 수 있는 바, 정제 후의 단백질 1G4-WT가 형성하는 용출 피크는 단일하지 않고 신호가 매우 낮지만, 정제 후의 G9, G13과 G15는 단일하고 대칭되는 용출 피크를 형성할 수 있으며, 이것은 G9, G13과 G15의 복원 상황이 1G4-WT보다 현저히 우수하다는 것을 설명한다.
실시예10에서 제기한 방법으로 G15를 측정한 Tm값은 46.6℃이고, 그 DSC 곡선도는 도 46에 도시된 바와 같다. 실시예10 중의 측정 결과에 따르면, 돌연변이주 G9와 G13의 Tm값도 상응하게 높고, 각각 49.55℃와 49.63℃이다.
BIAcore T200 실시간 분석 시스템으로 단백질 G9, G13과 G15와 그 리간드의 결합을 검출한 결과, 3가지 sTv 단백질과 항원HLA-A2/SLLMWITQC의 친화력은 야생형 1G4TCR와 그 항원의 결합보다 우수하지 않고, 야생형 1G4TCR 결합 항원 HLA-A2/SLLMWITQC의 해리 평형 상수는 32μM(Li 등((2005)Nature Biotech 23(3):349-354)을 참조바람)이다.
단백질 1G4-WT와 G9, G13과 G15의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양, 단백질 복원수득율, SDS-PAGE 도면 및 SEC도의 비교 분석을 통하여 알 수 있는 바, 소수성 코어의 개량을 거친 돌연변이주의 복원 능력, 열 안정성과 단백질 복원수득율은 모두 소수성 코어의 개량을 거치지 않은 1G4-WT보다 높다. 따라서, 소수성 코어의 개량을 거친 돌연변이주의 안정성은 1G4-WT에 비해 현저히 향상된다. 단백질 복원수득율의 수치로 안정성이 향상된 량을 계산하면, 본 발명의 G9, G13과 G15는 1G4-WT에 비해, 안정성이 각각 450%, 1520%와 1560%가 향상된다.
실시예12. 소수성 코어가 돌연변이된 고안정성 sTv 분자를 구축
실시예9에서 선별해 낸 고안정성변체의 소수성 코어 및 가변 도메인 프레임 워크의 표면 아미노산 잔기에 따라 고안정성 sTv 분자를 구축한다.
실시예9에서 선별해 낸 고안정성변체의 일부 소수성 코어 및 가변 도메인 프레임 워크의 표면 아미노산 잔기를, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 익숙히 알고 있는 위치지정돌연변이 방법으로 LC13-WT, JM22-WT와 MAGE-sTv-WT 분자에 각각 인입시키고, 돌연변이를 인입한 후에 얻은 분자를 각각 LC13-G9, LC13-G15, JM22-G9, JM22-G15와 MAGE-G15로 명명하며, 인입된 소수성 코어를 밑줄 친 굵은 자모로 표시한다.
여기서, 도 32a와 도 33b에 도시된 바와 같이, LC13-G9의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 99와 SEQ ID NO: 100이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 13V, 21I, 91I과 94I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 11V, 13V와 94V이고, 도 33a와 도 33b에 도시된 바와 같이, LC13-G15의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 101과 SEQ ID NO: 102이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 11L, 13V, 21I, 91I과 94I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 11L, 13V과 94V이고, 도 34a와 도 34b에 도시된 바와 같이, JM22-G9의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 103와 SEQ ID NO: 104이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는11M, 13V, 19V, 21I과 94I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는11V, 13V, 91I과 94V 이며, 도 35a와 도 35b에 도시된 바와 같이, JM22-G15의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 105와 SEQ ID NO: 106이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 13V, 19V, 21I과 94I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 13V, 91I과 94V이며, 도 42a와 도 42b에 도시된 바와 같이, MAGE-G15의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 107와 SEQ ID NO: 108이고, 그 α사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 19V, 21I과 94I이며, 그 β사슬의 가변 도메인에 인입된 소수성 코어는 13V, 89L, 91I과 94V이다.
상기 위치 번호는 IMGT에서 제시한 위치 번호를 사용한다. 상기 단일 가닥 분자를 구축하는데 사용되는 짧은 펩타이드 연결체(linker)는 모든 적합한 서열을 사용할 수 있고, 도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 41이다.
실시예13. 단백질 LC13-G9와 LC13-G15의 안정성 테스트
시예3에서 제시한 방법으로 단백질 LC13-G9와 LC13-G15를 발현, 복원, 정제하고, 겔 여과 칼럼으로 정제한 후 SDS-PAGE 겔에 런닝시켜, 겔 여과법으로 두 가지 단백질의 SEC도를 만들며, 동시에 그 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양과 단백질 복원수득율을 계산한다.
하기 표 12는 LC13-G9와 LC13-G15의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양 및 단백질 복원수득율 방명의 수치를 표시하고, 동시에 LC13-WT의 관련 수치를 표시하여 분석하도록 한다.
단백질 명칭 발현양(mg/L) 정제 후 얻은 단백질 양(mg/L) 수득율(%)
LC13-WT 231 1.3 0.56%
LC13-G9 233 1.37 0.59%
LC13-G15 185 61.05 33%
상기 표의 수치로부터 알수 있는 바, 정제를 거친 후, LC13-G9 단백질과 LC13-G15단백질은 소수성 코어에 돌연변이가 발생하지 않는 11G4-WT에 비해 단백질 복원수득율이 5.4% 및 57.9배 향상된다.
도 36은 실시예3에서 제시한 것에 따라 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)를 거쳐 정제된 후 얻은 단백질 LC13-G9와 LC13-G15의 SDS-PAGE 도면이다. 도면에 도시된 바와 같이, LC13-WT가 형성한 단일 밴드는 균일하지 않지만, LC13-G9와 LC13-G15는 모두 단일의 밴드를 형성할 수 있으며 순도가 매우 높다. 이것은 LC13-G9와 LC13-G15의 복원 상황이 LC13-WT보다 훨씬 좋다는 것을 설명한다.
도 37와 도 38는 각가 단백질 LC13-G9와LC13-G15의 SEC도이고, LC13-WT의 SEC도에 도시된 바와 같이 이는 용출 피크가 없으며, 단백질 LC13-G9와 LC13-G15는 모두 단일하고 대칭되는 용출 피크를 형성할 수 있으며, 이것은 1G4-sTv의 복원 상황이 1G4-WT보다 현저히 우수하다는 것을 설명한다.
실시예10에서 제시한 방법으로 단백질 LC13-G9와 LC13-G15의 Tm값을 측정하고, 도 49a와 도 49b는 각각 단백질 LC13-G9와 LC13-G15의 DSC 곡선도이고, 그 Tm값은 각각 43℃와 50.5℃이다. LC13-WT는 복원 후 정확한 배좌를 얻은 단백질 함량은 매우 적기 때문에, 선명한 단백질 중첩풀림 흡열 피크가 없고, 그 Tm값을 얻지 못한다. 이것은 본 발명의 LC13-G9와 LC13-G15는LC13-WT에 비해 열 안정성이 적어도 1배 향상된다는 것을 설명한다. 동시에 본 발명의 LC13-G9와 LC13-G15는 LC13-WT에 비해 중첩풀림을 더 방지하고, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하며, 회복 능력이 더 강하다는 것을 설명한다.
단백질 LC13-G9와 LC13-G15의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양, 단백질 복원수득율, SDS-PAGE 도면, SEC도 및 TLC13-W의 관련 수치를 비교 분석하여 알 수 있는 바, 소수성 코어의 개량을 거친 LC13-G9와 LC13-G15는 소수성 코어의 개량을 거치지 않은 LC13-WT에 비해, 중첩풀림을 더 방지하고, 불적합 또는 비소망의 중첩을 더 방지하며, 회복 능력이 더 강하고, 열 안정성이 더 높으며, 단백질 복원 수득률이 더 높다. 따라서, 본 발명의 LC13-G9와 LC13-G15는 LC13-WT에 비해, 안정성이 현저히 향상된다. 단백질 복원수득율의 수치로 안정성이 향상된 량을 계산하면, 본 발명에서 LC13-G9와 LC13-G15는 LC13-WT에 비해, 안정성이 각각 5.4% 및 57.9배 향상된다.
실시예14. 단백질 JM22-G9와 JM22-G15의 안정성 테스트
실시예3에서 제시한 방법으로 단백질 JM22-G9와 JM22-G15를 발현, 복원, 정제하고, 겔 여과 칼럼으로 정제한 후 SDS-PAGE 겔에 런닝시켜, 겔 여과법으로 두 가지 단백질의 SEC도를 만들며, 동시에 그 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양과 단백질 복원수득율을 계산한다.
하기 표 13은 JM22-G9와 JM22-G15의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양 및 단백질 복원수득율 방명의 수치를 표시하고, 동시에 JM22-WT의 관련 수치를 표시하여 분석하도록 한다.
단백질 명칭 발현양(mg/L) 정제 후 얻은 단백질 양(mg/L) 수득율(%)
JM22-WT 152 0.67 0.4%
JM22-G9 358 42.2 11.8%
JM22-G15 240 123.18 51.3%
상기 표의 수치로부터 알 수 있는 바, 정제를 거친 후, JM22-G9 단백질과 JM22-G15 단백질은 소수성 코어에 돌연변이가 발생하지 않는 JM22-WT에 비해 단백질 복원수득율이 28.5배 및 127.25배 향상된다.
도 39는 실시예3에서 제시한 것에 따라 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)를 거쳐 정제된 후 얻은 단백질 JM22-G9와 JM22-G15의 SDS-PAGE 도면이다. 도면에 도시된 바와 같이, JM22-WT가 복원 형성한 단일 밴드는 균일하지 않고, 3개의 밴드가 있지만, JM22-G9와 JM22-G15는 모두 단일의 밴드를 형성할 수 있으며 순도가 매우 높다. 이것은 JM22-G9와 JM22-G15의 복원 상황이 JM22-WT보다 훨씬 좋다는 것을 설명한다.
도 40과 도 41는 각가 단백질 JM22-G9와 JM22-G15의 SEC도이고, JM22-WT의 SEC도에서 도시된 바와 같이 이가 형성하는 용출 피크는 단일하지 않으며 신호가 낮지만, 단백질 JM22-G9와 JM22-G15는 거의 단일하고 대칭되는 용출 피크를 형성할 수 있으며, 이것은 JM22-G9와 JM22-G15의 복원 상황이 모두 JM22-WT보다 현저히 좋다는 것을 더 설명한다.
단백질 JM22-G9와 JM22-G15의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양, 단백질 복원수득율, SDS-PAGE 도면 및 SEC도와 JM22-WT의 관련 수치를 비교 분석하여 알 수 있는 바, 소수성 코어의 개량을 거친 JM22-G9와 JM22-G15는 소수성 코어의 개량을 거치지 않은 JM22-WT에 비해, 더 강한 복원능력, 더 높은 발현양과 단백질 복원수득율을 구비한다. 따라서, 본 발명의 JM22-G9와 JM22-G15는 JM22-WT에 비해, 안정성이 현저히 향상된다. 단백질 복원수득율의 수치로 안정성이 향상된 량을 계산하면, 본 발명에서 JM22-G9와 JM22-G15는 JM22-WT에 비해, 안정성이 각각 28.5배 및 127.25배 향상된다.
실시예15. 단백질 MAGE-sTv-WT와 MAGE-G15의 안정성 테스트
실시예3에서 제시한 방법으로 단백질 MAGE-G15를 발현, 복원, 정제하고, 겔 여과 칼럼으로 정제한 후 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜, 겔 여과법으로 두 가지 단백질의 SEC도를 만들며, 동시에 그 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양과 단백질 복원수득율을 계산한다.
표 14는 MAGE-sTv-WT와 MAGE-G15의 발현양, 정제 후 얻은 단백질 양 및 단백질 복원수득율의 수치를 표시한다.
단백질 명칭 발현양(mg/L) 정제 후 얻은 단백질 양(mg/L) 수득율(%)
MAGE-sTv-WT 270 0 0
MAGE-G15 220 19.8 9%
단백질 MAGE-sTv-WT는 실시예3에서 제시한 겔 여과 칼럼을 거친 후, 타겟 조성성분을 얻지 못하였으므로, 그 SDS-PAGE 도면, SEC도와 DSC 곡선도(Tm값)를 얻을 수 없다.
도 43에 도시된 바와 같이, 소수성 코어의 개량을 거친 후의 MAGE-G15는 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)으로 정제된 후 단백질의 SDS-PAGE 도면를 얻는다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, MAGE-G15는 단일 밴드를 형성할 수 있고 순도가 높은 바, 이것은 단백질 MAGE-G15의 복원 능력은 MAGE-sTv-WT보다 훤씰 강하다는 것을 설명한다. 동시에, 도 44에 도시된 MAGE-G15의 SEC도에는 단일하고 대칭되는 용출 피크를 구비하는 바, 이것은 단백질 MAGE-G15의 복원 능력은 MAGE-sTv-WT보다 훨씬 강하다는 것을 설명할 수도 있다.
도 45는 단백질 MAGE-G15의 DSC 곡선도이고, 분석 소프트웨어인 Nanoanalyze의 피팅 모델 TwostateScaled로 피팅하여 그 Tm값이 46.7℃인 것을 얻었다.
BIAcore T200 실시간 분석 시스템으로 단백질 MAGE-G15와 그 리간드의 결합을 검출한 결과, 단백질 MAGE-G15와 그 리간드의 친화력은 이와 대응되는 야생형의 TCR보다 우수하지 않고, 그 KD값은 30.4μM이다.
단백질 복원수득율의 수치로 안정성이 향상된 량을 계사하면, 표 14로부터 알 수 있는 바, 본 발명의 MAGE-G15는 MAGE-sTv-WT에 비해 안정성이 무한대배 확대 되었다(적어도 10000배).
상기 수치로부터 알 수 있는 바, 본 발명의 MAGE-G15의 복원 능력, 단백질 복원수득율 및 열 안정성은 MAGE-sTv-WT에 비해 모두 매우 선명하게 향상되므로, 본 발명의 MAGE-G15의 안정성은 MAGE-sTv-WT에 비해 현저하게 향상되었다.
실시예16. 질량분석
저희가 구축한 단백질은 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)을 거쳐 정제된 후 질량 분석 장치로 그 전체 단백질 분자량을 측정하고, 질량 측정된 분자량과 그 원리 분자량이 서로 일치한지 여부를 측정하며, 이에 따라 정제 후 얻은 단백질 서열과 원 설계 서열이 동일한지 여부를 점검한다.
미국 AB SCIEX 회사의 질량 분석 장치;(Eksigent nano LC(nanoflex)-Triple TOF 5600 액체 색층 분석 매스)로 샘플의 전체 단백질 분자량을 측정한다. 10%인 아세토나이트릴(acetonitrile)(FisherA955-4), １％인 포름산(formic acid)(Fisher A11750)과 물(Sigma39253-1L-R)로 샘플을 희석한 후 질량분석을 한다. 시스템 분석 조건은 다음과 같다.
ＬＣ 부분
AB SCIEX의 Eksigent nano LC(nanoflex)
보호 컬럼(guard column): C4-3μm 300Å 200μmx0.5mm; Lot 804-00019.
분석 컬럼(analytical column): C4; 3um, 300Å; 75um*15cm, Lot 804-00018.
이동상Ａ: ２％인 아세토나이트릴, 0.1％인 포름산.
이동상Ｂ: 98％인 아세토나이트릴, 0.1％인 포름산.
유속: 300nl/min.
구배: 10분 내 Ｂ액의 비례가 5％에서 90％로 상승하고, 전체 작동시간은 30분이다.
질량 부분
Nanospray원을 휴대한 Triple TOF 5600 분석 칼럼 중의 용출액,
수치 수집 방법: 양이온 ＭＳ.
수치 수집 범위: 400~200m/z.
수집된 질량 수치는 Bioanalyst 소프트웨어를 거쳐 디콘볼루션(deconvolution) 처리된 후 샘플의 완전한 단백질 분자량 정보를 얻는다.
분석을 거쳐, 본 발명에서 구축한 분자는 발현, 복원과 정제를 거친 후, 질량 분석기로 측정한 전체 단백질 분자량과 그 이론 분자량은 모두 서로 일치하므로, 이것은 정제 후 얻은 단백질 서열과 원 설계된 단백질 서열이 동일하다는 것을 설명한다.
본 발명에서 선별해 낸 소수성 코어는 TCR의 분자의 안정성을 현저시 향상시킬 수 있다. 동시에 상기 실시예는 본 발명에서 선별해 낸 소수성 코어를 기타 TCR의 분자에 인입시키는 것도 안정성을 향상시키는 작용을 발휘할 수 있다는 것을 설명한다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 모두 본원 발명에 참조로 인용되고, 마치 매 한편의 문헌이 참조로 단독으로 인용되는 것과 같다. 본 발명의 상기 설명한 내용을 열독한 후, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에 대하여 다양한 개변 또는 수정을 진행할 수 있고, 이러한 균등 형식은 본원 발명에 첨부된 특허청구범위에 한정된 범위 내에 속한다.
<110> 광주시썅쒜제약주식유한회사 리이(李懿) <120> 고안정성의 T세포 수용체 및 이의 제조방법과 응용 <130> P2014-0668 <150> 201310263384.1 <151> 2013-06-26 <160> 108 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 1 aacaggagtg acgcagtctc cttcatctgt gagtg 35 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 2 ttagcgccat ggcccaaaaa caggaggtga cgcagtc 37 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 3 gaatcttctc agcccgggga c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 4 cgggctgaga agattcaatg 20 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 5 gccaccgcca gatccaccgg gccctggagt gaccgag 37 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 6 gtggatctgg cggtggcggt gaaggcggtg gtggaagcgg cggcggaggc gaaggaggct 60 ccggag 66 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 7 gcgaaggagg ctccggaggc aaggctggag tcactcaaac 40 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> 프라이머 <400> 8 ctagatgcgg ccgcctctgt gaccgtgagc ctg 33 <210> 9 <211> 114 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 9 Lys Gln Glu Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn 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<400> 38 Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Ser Arg Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Ile Thr Ser 65 70 75 80 Leu Gln Lys Asn Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Arg 85 90 95 Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 39 <211> 114 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 39 Lys Gln Glu Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Ser Ile Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 35 40 45 Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 50 55 60 Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Glu Ser Ser 65 70 75 80 Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Val Arg 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Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr 50 55 60 Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Ile Glu Ser 65 70 75 80 Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Tyr Val 85 90 95 Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 Asp <210> 96 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 96 Asn Ala Gly Ile Thr Gln Thr Pro Lys Tyr Val Ser Val Lys Thr Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met 20 25 30 Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 35 40 45 Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr 50 55 60 Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Ile Glu Ser 65 70 75 80 Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Tyr Val 85 90 95 Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 Asp <210> 97 <211> 114 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 97 Lys Gln Glu Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asn Val Pro Glu Ser 1 5 10 15 Glu Asn Val Ser Ile Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 35 40 45 Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 50 55 60 Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Glu Arg Ile 65 70 75 80 Gln Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser 85 90 95 Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val 100 105 110 Thr Asn <210> 98 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 98 Asn Ala Gly Ile Thr Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Ser Val Lys Thr Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met 20 25 30 Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 35 40 45 Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Arg Tyr 50 55 60 Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Ile Glu Ser 65 70 75 80 Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Tyr Val 85 90 95 Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 Asp <210> 99 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 99 Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Asn Ser Met Ser Val Asn Glu Glu Glu 1 5 10 15 Pro Val Ser Ile Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val Ile 35 40 45 His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Arg Arg Ala Ser Leu Ala Ile 50 55 60 Ala Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Tyr Ile His Arg Ile Thr Pro 65 70 75 80 Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Val Pro Leu Ala Gly Gly Thr 85 90 95 Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr 100 105 110 Asn <210> 100 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 100 Gly Ala Gly Ile Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Val Ser Val Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asp Val Thr Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Ser Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Gln Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 Asp <210> 101 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 101 Asp Ala Lys Val Thr Gln Pro Asn Ser Leu Asn Val Asn Glu Glu Glu 1 5 10 15 Pro Val Ser Ile Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val Ile 35 40 45 His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Gly Arg Leu Ser Leu Ala Ile 50 55 60 Ala Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Tyr Ile Glu Arg Ile Thr Pro 65 70 75 80 Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Val Pro Leu Ala Gly Gly Thr 85 90 95 Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr 100 105 110 Asn <210> 102 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 102 Gly Ala Gly Ile Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Leu Ser Val Lys Thr Gly 1 5 10 15 Gln Asp Val Thr Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Ser Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Gln Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 Asp <210> 103 <211> 110 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 103 Thr Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Ser Met Ser Val Gln Glu Ser 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Ile Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Thr Leu Leu Val Thr 35 40 45 Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln 50 55 60 Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Arg Ile Gln 65 70 75 80 Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Val Ala Gly Ser Gln Gly 85 90 95 Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn 100 105 110 <210> 104 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 104 Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Val Ser Val Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Ile Thr Ser 65 70 75 80 Val Thr Lys Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Arg 85 90 95 Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val Asp 100 105 110 <210> 105 <211> 110 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 105 Thr Gln Leu Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu Asn Val Gln Glu Ser 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Ile Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Thr Leu Leu Val Thr 35 40 45 Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln 50 55 60 Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Glu Arg Ile Gln 65 70 75 80 Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Val Ala Gly Ser Gln Gly 85 90 95 Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn 100 105 110 <210> 106 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 106 Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Ser Val Lys Thr Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Arg Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Ile Thr Ser 65 70 75 80 Val Thr Lys Ser Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Arg 85 90 95 Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val Asp 100 105 110 <210> 107 <211> 114 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 107 Asp Gln Glu Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asn Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Ser Ile Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 35 40 45 Leu Val Arg Pro Tyr Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 50 55 60 Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Glu Arg Ile 65 70 75 80 Gln Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Val Arg Pro Gly Gly 85 90 95 Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val 100 105 110 Thr Asp <210> 108 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <400> 108 Lys Ala Gly Ile Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ser Val Lys Thr Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe Glu 35 40 45 Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Leu Asn Ile Glu Ser 65 70 75 80 Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro Asn 85 90 95 Met Ala Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val Asp 100 105 110

Claims (29)

  1. T 세포 수용체(TCR)에 있어서,
    (i) 상기 TCR의 소수성 코어(hydrophobic core)에서 돌연변이가 발생하고; 또한
    (ⅱ) 상기 TCR의 안정성은, 이에 대응되는 소수성 코어가 야생형인 TCR의 안정성보다 높고,
    상기 TCR의 α사슬의 가변 도메인은, α사슬의 가변 도메인의 아미노산(amino acid)의 11, 13, 19, 21, 91번째 또는 94번째 부위 중의 하나 이상의 부위에서 돌연변이가 발생하고,
    상기 TCR의 β사슬의 가변 도메인은, β사슬의 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 89, 91번째 또는 94번째 부위, 및 β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 4번째 부위 또는 마지막 6번째 부위 중의 하나 이상의 부위에서 돌연변이가 발생하고,
    아미노산의 위치 번호는 국제 면역 유전학 정보시스템(international immunogenetics information system, IMGT)에 열거된 위치번호에 따르고,
    상기 TCR의 α사슬의 가변 도메인은,
    11L, 11M 또는 11E; 13V, 13R 또는 13K;19V;21I; 91L 또는 91I; 및 94V 또는 94I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하되,
    19V 및 21I;
    11L, 13V, 21I 및 91I; 및
    94I로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하며,
    상기 TCR의 β사슬의 가변 도메인은,
    11L 또는 11V; 13V; 19V; 89L; 91F 또는 91I; 및 94V 또는 94L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고; β사슬의 J 유전자의 마지막 6번째 부위가 T이고; β사슬의 J 유전자의 마지막 마지막 4번째 부위가 M을 포함하되,
    91F 및 TRBJ4M;
    91I;
    11V, 13V 및 94V;및
    11L, 13V 및 94V;
    으로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 T 세포 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TCR의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)은 야생형의 TCR의 상보성 결정 영역과 동일하거나, 또는 친화력의 상승을 초래하는 돌연변이를 함유하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기의 T 세포 수용체는 가용성(soluble)인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기의 T 세포 수용체는,
    (a) 막관통영역(transmembrane domain) 이외의 전부 또는 일부 TCR의 α사슬; 및
    (b) 막관통영역 이외의 전부 또는 일부 TCR의 β사슬을 포함하고,
    상기 (a)와 (b)는 기능성 가변 도메인(functional variable domain)을 각각 독립적으로 포함하거나, 또는 기능성 가변 도메인과 상기 TCR α사슬 및 TCR β사슬의 불변 도메인의 적어도 일부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 TCR는 하나의 연성 펩타이드(peptide) 연결자(linker)로 TCR의 α사슬과 β사슬의 가변 도메인(variable domain)을 연결시켜 형성된 단일-사슬(single-chain) TCR인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR은 막단백질인 T 세포 수용체.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR는, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33으로 표시되는 α사슬의 가변 도메인의, α사슬의 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 21, 91번째 또는 94번째 부위 중의 하나 이상의 부위에서 돌연변이가 발생하고,
    아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 T 세포 수용체.
  8. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 변이는 TCR의 야생형 소수성 코어 도메인에 대응되는 TCR의 소수성 코어 도메인을 말하는 T 세포 수용체.
  9. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR는, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 34로 표시되는 β사슬의 가변 도메인의 β사슬의 가변 도메인의 아미노산의 11, 13, 19, 89, 91번째 또는 94번째 부위 및 β사슬의 J 유전자의 짧은 펩타이드의 아미노산의 마지막 4번째 부위 또는 마지막 6번째 부위 중의 하나 이상의 부위에서 돌연변이가 발생하고, 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  10. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 및 β사슬의 가변 도메인 중에서 표면에 노출된 아미노산 잔기는 돌연변이가 발생하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 TCR은, 4L; 12N; 16S; 93N 또는 93R; 97N; 100G; 105S; 및 α사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위가 D인 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수개의, α사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 포함하고,
    상기 TCR는, 4I; 101L; β사슬의 J 유전자의 마지막 1번째 부위가 D이고; 및 β사슬의 J 유전자의 마지막 3번째 부위가 E인 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수개의, β사슬의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 포함하며, 아미노산의 위치 번호는 IMGT에 열거된 위치번호에 따른 T 세포 수용체.
  12. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR는, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 15, 17, 35, 37, 39, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 97, 99, 101, 103, 105 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 α사슬 가변 도메인을 포함하고,
    상기 TCR는, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 16, 18, 36, 38, 40, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 100, 102, 104, 106 및 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 β사슬 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  13. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬의 가변 도메인과 β사슬의 가변 도메인의 조합은 하기와 같은 조합으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
    (a) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16인 조합;
    (b) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 17이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18인 조합;
    (c) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18인 조합;
    (d) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 35이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 36인 조합;
    (e) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 37이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 38인 조합;
    (f) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 39이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 40인 조합;
    (g) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 75이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 86인 조합;
    (h) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 76이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 87인 조합;
    (i) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 77이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 88인 조합;
    (j) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 78이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 89인 조합;
    (k) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 79이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 90인 조합;
    (l) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 80이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 91인 조합;
    (m) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 81이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 92인 조합;
    (n) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 82이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 93인 조합;
    (o) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 83이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 94인 조합;
    (p) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO:84이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 95인 조합;
    (q) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO:85이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 96인 조합;
    (r) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 97이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 98인 조합;
    (s) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 99和β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 100인 조합;
    (t) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 101이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 102인 조합;
    (u) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 103이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 104인 조합;
    (v) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 105이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 106인 조합; 및
    (w) α사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 107이고 β사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 108인 조합.
  14. 제4항에 있어서,
    상기 TCR는, α사슬 불변 도메인 서열 및 β사슬 불변 도메인 서열을 가지는 αβ 헤테로다이머(heterodimer)이며, 시스테인(cysteine) 잔기는 상기 TCR의 α사슬 불변 도메인과 β사슬 불변 도메인 사이에서 이황화 결합(disulfide bond)을 형성하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  15. 제14항에 있어서,
    시스테인 잔기는 상기 TCR의 α사슬과 β사슬의 불변 도메인 사이에서 이황화 결합을 인공적으로 형성하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  16. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 및 β사슬의 C-말단 또는 N-말단에 컨쥬게이트(conjugate)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 TCR에 결합되는 컨쥬게이트는 검출 가능한 표지자(marker), 치료제, PK 수식 부분 또는 이러한 물질의 임의의 조합인 T 세포 수용체.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체와 결합되는 치료제는, 상기 TCR의 α사슬 또는 β사슬의 C-말단 또는 N-말단에 연결되는 항-CD3 항체인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  19. 제1항에 있어서,
    상기의 T 세포 수용체 중의 돌연변이는 파지 디스플레이 기술(phage display technology)로 선별하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체.
  20. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR을 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  21. 제20항에 따른 핵산 분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터(vector).
  22. 제20항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 함유하거나, 또는 염색체 내에서 외인성의 제20항에 따른 핵산 분자가 통합(integration)되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  23. (i) 숙주세포를 배양하여 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR를 발현시키는 단계;
    (ii) 상기의 TCR를 분리 또는 정제해 내는 단계를 포함하며,
    상기 숙주세포는, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR를 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 가지는 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR를 제조하는 방법.
  24. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR 분자들을 하나 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체 복합체.
  25. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 안전유효량의 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR를 함유하는, 종양, 바이러스 감염 또는 자가면역질환을 치료하기 위한 약물 조성물.
  26. 제1항에 따른 TCR를 제시하는 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  27. (i) TCR의 소수성 코어 영역에 아미노산 잔기의 돌연변이를 발생시키는 단계; 및
    (ii) 안정성이 현저히 향상된 TCR를 선별하여 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 TCR를 제조하는 방법.
  28. 삭제
  29. 삭제
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