KR20220088410A - 메탈로프로테아제 adamts-7의 면역원성 펩티드 단편 및 항죽상동맥경화증 및 관련 질환에서의 응용 - Google Patents

메탈로프로테아제 adamts-7의 면역원성 펩티드 단편 및 항죽상동맥경화증 및 관련 질환에서의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메탈로프로테아제 ADAMTS-7의 면역원성 펩티드 단편 및 항죽상동맥경화증 및 관련 질환에서의 응용에 관한 것이다. 본 발명은 아미노산 서열이 서열표 중 서열 1로 표시되는 짧은 펩티드; 아미노산 서열이 서열표 중 서열 2로 표시되는 짧은 펩티드; 아미노산 서열이 서열표 중 서열 3으로 표시되는 짧은 펩티드; 및 아미노산 서열이 서열표 중 서열 4로 표시되는 짧은 펩티드 중 어느 하나를 포함하는 짧은 펩티드를 제공한다. 여기에는 상기 짧은 펩티드의 컨쥬게이트, 컨쥬게이트를 포함하는 백신 및 그 응용이 포함된다. 여기에서 짧은 펩티드를 포함하는 백신은 혈관재협착증 마우스 모델의 내막 신생 및 고지방식 마우스의 죽상동맥경화증 발생을 현저하게 억제할 수 있어, 죽상동맥경화증 및/또는 혈관재협착증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

메탈로프로테아제 ADAMTS-7의 면역원성 펩티드 단편 및 항죽상동맥경화증 및 관련 질환에서의 응용
본 발명은 생명공학 및 의약 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메탈로프로테아제 ADAMTS-7의 면역원성 펩티드 단편 및 항죽상동맥경화증 및 관련 질병에서의 응용에 관한 것이다.
관상동맥심장질환은 높은 이환율과 높은 사망률로 인해 인간의 신체 건강을 심각하게 위협하므로 "인류의 제1의 살인자"로 불린다. 관상동맥심장질환의 주요 발병 원인은 죽상동맥경화증이다. 그 병리학적 과정은 혈관벽에서 지질이 비정상적으로 축적되어 혈관벽 내피 세포 손상, 혈관 평활근 세포 증식과 이동 및 염증 세포 침윤 등이 유발되며 관광 내로 돌출된 플라크를 형성한다. 플라크의 형성은 관강을 좁히며 혈액 공급이 충분하지 않게 만든다.
관상동맥심장질환의 치료를 위해 현재 다음 세 가지 전략에 중점을 둔다. (1) 약물 치료이다. 목적은 증상을 완화하고 협심증의 발작과 심근경색증을 줄이며, 관상 죽상동맥경화증 병변의 진행을 지연시키고, 관상동맥심장질환으로 인한 사망을 줄이는 것이다. 스타틴계(statins) 지질강하제는 심혈관계 케이스를 25% 감소시킬 수 있지만 당뇨병 등의 발병 위험도 증가시킬 수 있다. 새로 나온 에제티미브(ezetimibe) 또는 PCSK9 단일 클론 항체 등은 새로운 희망을 가져왔으나 여전히 지질을 낮추는 전략 중심으로 접근한다. 그러나 현재의 의학 수준으로는 관상동맥심장질환을 완치할 수 있는 약물이 없고 관상동맥심장질환의 치료는 사실상 관상동맥심장질환의 상태를 조절하고 질환의 악화로 인한 합병증을 예방하는 것을 중심으로 한다. (2) 경피적 관상동맥 개입술(PCI)이다. 경피적 관상동맥 성형술(PTCA)은 특수 제작한 풍선 카테터를 이용하여 말초동맥(대퇴동맥 또는 요골동맥)을 통해 관상동맥 협착 부위에 전달된다. 풍선을 팽창시켜 협착된 관강을 확장시키고 혈류를 개선하며 확장된 협착부에 스텐트를 삽입하여 재협착을 예방할 수 있다. 그러나 스텐트 내 혈전증(ST) 및 스텐트 내 재협착증(ISR)을 포함한 스텐트 실패의 위험은 여전히 있다. 스텐트 내 혈전증은 임상적으로 비교적 심각한 합병증이며, 혈전 형성 구간의 상승 심근경색증까지 유발할 수 있다. 사망률은 20% 내지 40%에 이를 수 있으며, 스텐트 내 재협착증의 발생은 PCI 이후의 장기 예후에 매우 큰 영향을 미친다. 정상적인 내피 세포 장벽 하에서 동맥벽은 지질 침착을 피할 수 있다. 그러나 약물 용출 스텐트는 내피 세포 구조 및 기능에 손상을 일으키므로 내피 치유를 지연시켜 신생 죽상동맥경화증 형성을 유발할 수 있다. 또한 수술 재치료 중의 동맥우회술과 외과적 최소침습적 수술은 모두 수술 난이도가 높고 손상이 심각하여 대부분의 혈관재협착증 치료에 적합하지 않다. 따라서 확장술 후 재협착 및 혈전 형성을 예방 및 치료하기 위한 새로운 방법이 시급히 요구되고 있다.
스텐트와 우회 수술이 임상의와 환자에게 완전히 만족스러운 효과를 나타내지 못하였기 때문에, 각국 의학자들은 관상동맥심장질환과 혈관협착증의 원인에 대해 연구하기 시작했다. 최근 몇 년 동안 사람들은 항죽상동맥경화증 백신의 연구개발에 큰 관심을 가졌다. 1983년 헝가리의
Figure pct00001
교수는 정상 인체 내에서 콜레스테롤 항체의 존재를 처음으로 발견하고 콜레스테롤 항원 백신을 개발하였다. 2002년 헝가리 국립의료관리국의 승인을 거쳐 인체 임상 시험에 돌입하여 현재까지 10년 가까이 약 4만 명의 환자가 치료를 받았다. 효과가 현저하여 인류가 심혈관 질환 정복에 있어서 중요한 한 걸음을 내디딘 것으로 평가된다. 1983년
Figure pct00002
교수의 콜레스테롤 면역 백신 개발에 이어, 스웨덴 Karolinska Institutet의 과학자들은 콜레스테롤 백신을 개발하였다. 이 백신은 콜레스테롤이 동맥혈관을 손상시키는 것을 방지하고 심장병 발병률을 2/3로 줄일 수 있다. 또한 병원성 LDL 아포지질단백(Apolipoprotein) ApoB100과 LDLR 분해효소 PCSK9를 표적으로 하는 단클론 항체나 짧은 펩티드 백신이 잇따라 개발돼 예비 동물모델 실험과 전임상 검증 등 작업이 진행 중이다. 최근 승인될 가능성이 가장 높은 인체 치료용은 전구단백질 전환효소 서브틸리신 9(PCSK9)에 대한 단클론 항체(REGN727)이다. 1상 임상 시험 결과, 저용량 REGN727이 피험자의 LDL 수치를 30% 이상 낮출 수 있는 것으로 나타났다. 스타틴 치료를 견딜 수 없는 환자의 경우 REGN727은 광범위한 임상 적용 가능성을 가지고 있다. 또한 아포지질단백 ApoB100에 작용하도록 설계된 짧은 펩티드 백신은 실험 동물에서 모두 일정한 항죽상동맥경화증 작용을 나타냈다. 이러한 작업은 모두 특정 표적에 대한 짧은 펩티드 백신의 개발 및 설계와 생성된 상응하는 단클론 항체가 질병의 예방 및 치료에 잠재적인 변형적 의미가 있음을 시사한다.
ADAMTS-7(disintegrin-like and metalloprotease-7, I형 혈소판 결합 단백질 모티프를 함유하는 분해 단백질 유사 메탈로프로테아제)은 2004년에 복제된 새로운 메탈로프로테아제이며 Zn2+ 의존성 메탈로프로테아제 패밀리에 속한다. 인류 I형 혈소판 결합 단백질 모티프(TSP)를 함유하는 분해 단백질 유사 메탈로프로테아제(ADAMTS) 패밀리는 19개 분비형 다중 도메인 아연 집게 메탈로프로테아제로 구성된다. 이러한 ADAMTS 메탈로프로테아제는 세포외 기질 성분(ECM)을 분해할 수 있으며, 여기에는 프로콜라겐, 프로테오글리칸 및 COMP(cartilage oligomeric matrix protein)가 포함된다. ADAMTS 프로테아제는 다양한 조직 세포외 기질 성분의 전환에 중요한 역할을 하며, 이러한 효소의 비정상적인 발현은 통상적으로 종양, 류마티스 관절염과 같은 염증성 병리학적 과정과 밀접한 관련이 있다. 소간섭 RNA 침묵, 아데노바이러스 과발현 ADAMTS-7, ADAMTS-7 유전자 녹아웃 동물 모델 구축 등 방법을 사용하여, 메탈로프로테아제 ADAMTS-7이 COMP를 분해함으로써 혈관 평활근 세포 이동 및 혈관 손상 후 신생 내막 형성을 촉진한다는 것이 밝혀졌다(Wang,L.et al.Adamts-7 mediates vascular smooth muscle cell migration and neointima formation in balloon-injured rat arteries.Circ Res.2009;104:688-698). 또한 ADAMTS-7은 TSP-1을 통해 내피 복구를 억제하여 이중 메커니즘에서 신생 내막 형성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(Kessler T,Zhang L.et al.Adamts-7 inhibits re-endothelialization of injured arteries and promotes vascular remodeling through cleavage of thrombospondin-1.Circulation.2015;131:1191-1201).
그러나 현재로서는 ADAMTS-7과 관련된 유효 짧은 펩티드 백신에 대한 보고가 없다.
본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 메탈로프로테아제 ADAMTS-7의 면역원성 펩티드 단편을 어떻게 획득하여 죽상동맥경화증 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료하는가에 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 먼저 짧은 펩티드를 제공한다. 상기 짧은 펩티드는,
A1) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 1로 표시되는 짧은 펩티드;
A2) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 2로 표시되는 짧은 펩티드;
A3) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 3으로 표시되는 짧은 펩티드; 및
A4) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 4로 표시되는 짧은 펩티드 중 어느 하나이다.
구체적으로 상기 짧은 펩티드는,
A1) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 1로 표시되는 짧은 펩티드; 또는
A2) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 2로 표시되는 짧은 펩티드이다.
보다 구체적으로 상기 짧은 펩티드의 아미노산 서열은 서열표 중 서열 1로 표시되는 짧은 펩티드이다.
상기 짧은 펩티드의 응용도 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명의 상기 짧은 펩티드의 응용은,
B1) 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
B2) 혈관재협착증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
B3) 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소시키는 제품의 제조에 사용하는 응용; 및
B4) 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 제품의 제조에 사용하는 응용 중 어느 하나를 포함한다.
상기 응용에서 상기 제품은 약물, 시약 또는 백신 등일 수 있다.
본 발명은 상기 짧은 펩티드의 컨쥬게이트를 더 제공한다. 상기 컨쥬게이트는 상기 짧은 펩티드와 담체 단백질이 접합되어 획득하는 완전 항원이다.
상기 컨쥬게이트에 있어서, 상기 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌, 재조합 Qβ 파지 입자 단백질, 재조합 소 유두종 바이러스 단백질, 재조합 B형 간염 바이러스 단백질 또는 파상풍 톡소이드일 수 있다.
상기 컨쥬게이트에 있어서, 상기 접합에 사용되는 접합제는 이종이관능성 가교제이다. 구체적으로 상기 이종이관능성 가교제는 SMCC, Sulfo-SMCC 또는 LC-SMCC일 수 있다.
상기 컨쥬게이트의 응용도 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명의 상기 컨쥬게이트의 응용은,
B1) 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
B2) 혈관재협착증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
B3) 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소시키는 제품의 제조에 사용하는 응용; 및
B4) 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 제품의 제조에 사용하는 응용 중 어느 하나를 포함한다.
상기 응용에서 상기 제품은 약물, 시약 또는 백신 등일 수 있다.
본 발명은 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적과 신생 중막 면적 비율을 낮추는 백신을 더 제공한다.
상기 백신은,
A1) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 1로 표시되는 짧은 펩티드;
A2) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 2로 표시되는 짧은 펩티드;
A3) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 3으로 표시되는 짧은 펩티드; 및
A4) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 4로 표시되는 짧은 펩티드 중 어느 하나의 짧은 펩티드와 담체 단백질 접합되어 획득한 컨쥬게이트를 포함한다.
상기 백신에 있어서, 상기 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 재조합 Qβ 파지 입자 단백질, 재조합 소 유두종 바이러스 단백질, 재조합 B형 간염 바이러스 단백질 또는 파상풍 톡소이드일 수 있다.
상기 백신은 면역 보조제를 더 포함한다.
상기 백신에 있어서, 상기 면역 보조제는 수산화알루미늄 보조제, 명반 보조제 또는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)일 수 있다.
상기 백신을 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적과 신생 중막 면적 비율을 낮추는 제품을 제조하는 데 사용하는 응용도 본 발명의 보호 범위 내에 속한다.
상기 응용에 있어서, 상기 제품은 약물 또는 시약일 수 있다.
본 발명은 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 방법을 제공한다. 여기에는 상기 컨쥬게이트 또는 상기 백신을 투여하여, 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 단계가 포함된다.
본 발명에 따른 짧은 펩티드는 제1 연결 부위를 포함하고, 하나의 공유 결합을 통해 담체 단백질의 제2 연결 부위와 적어도 결합할 수 있다. 재조합 Qβ 파지 입자 단백질, 재조합 소 유두종 바이러스 단백질, 재조합 B형 간염 바이러스 단백질, 키홀 림펫 헤모시아닌, 파상풍 톡소이드를 담체 단백질로 사용한다. 이러한 담체 단백질은 하나의 제2 연결 부위를 적어도 구비한다. 바람직하게는 제2 연결 부위는 아미노, 카르복실 및 설피드릴을 포함하며, 구체적으로 라이신 잔기, 아르지닌 잔기, 글루탐산 잔기, 아스파르트산 잔기 및 시스테인 잔기로부터 선택된다. 이종이관능성 가교제를 사용하여 ADAMTS-7 짧은 펩티드를 상기 담체 단백질과 접합 결합하여, 질서 있게 중복된 짧은 펩티드-담체 백신을 형성한다. 짧은 펩티드는 반복되어 일정한 밀도로 전시되어 담체 또는 표면에 배열되며 고항원성의 어레이 전시를 형성하여 고효율의 특이적 항인간 및 마우스 ADAMTS-7 면역원성 펩티드 단편 항체 생성에 도움이 된다. 이는 ADAMTS-7의 가수분해효소 기능을 효과적으로 차단할 수 있으며, 혈관재협착증 마우스 모델의 내막 신생 및 고지방식 마우스의 죽상동맥경화증 발생을 현저하게 억제할 수 있다.
도 1에서 A는 ADAMTS-7 면역원성 펩티드 단편의 아미노산 서열이며, B는 ADAMTS-7 백신 접종 시간과 역가 검출 시간의 개략도이며, C는 ADAMTS-7 백신 역가의 검출 결과이다.
도 2에서 A는 ADAMTS-7 백신 접종 시간과 역가 검출 시간 및 총경동맥 결찰 수술 시간의 개략도이고, B는 ADAMTS-7 백신 역가의 검출 결과이고, C는 HE 염색 결과이고, D는 결찰 모델 마우스 신생 내막 면적이고, E는 결찰 모델 마우스 신생 내막 면적과 중막 면적의 비율이고, F는 결찰 모델 마우스 외부 탄성판 둘레 길이(즉, 외주 길이)이고, G는 결찰 모델 마우스 중막 면적이다.
도 3에서 A는 ADAMTS-7 백신 접종 시간과 역가 검출 시간 및 가이드와이어 손상 수술 시간의 개략도이고, B는 ADAMTS-7 백신 역가의 검출 결과이고, C는 HE 염색 결과이고, D는 가이드와이어 손상 모델 마우스 신생 내막 면적이고, E는 가이드와이어 손상 모델 마우스 신생 내막 면적과 중막 면적의 비율이고, F는 가이드와이어 손상 모델 마우스 외부 탄성판 둘레 길이(즉, 외주 길이)이고, G는 가이드와이어 손상 모델 마우스 중막 면적이다.
도 4에서 A는 ADAMTS-7 백신 접종 시간, 역가 검출 시간 및 고지방식 시간의 개략도이고, B는 ADAMTS-7 백신 역가의 검출 결과이고, C는 마우스 체중의 검출 결과이고, D는 죽상동맥경화증 모델 마우스의 플라크 면적(왼쪽에서 오른쪽 순서대로 대조군, 실험군 1, 실험군 2)이고, E는 죽상동맥경화증 모델 마우스의 플라크 면적의 통계적 결과이다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 주어진 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
하기 실시예의 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한 모두 통상적인 방법이다.
하기 실시예에 사용된 재료, 시약 등은 달리 명시되지 않는 한 모두 상업적 경로를 통해 얻을 수 있다.
실시예 1. ADAMTS-7 백신의 제조 및 역가의 검출
1. 메탈로프로테아제 ADAMTS-7의 면역원성 펩티드 단편의 스크리닝
ADAMTS7은 주로 COMP에 결합 및 분해함으로써 VSMC의 이동을 촉진하고 혈관 신생 내막 형성을 촉진한다. 본 발명은 catalytic domain과 4 TSP-1 like domain을 짧은 펩티드를 스크리닝하기 위한 표적 영역으로 선정한다. catalytic domain과 4 TSP-1 like domain의 아미노산 서열을 각각 IEDB B Cell Epitope Prediction의 대화상자에 입력한다. 그 예측 점수를 기반으로 점수가 비교적 높은 것에서 8, 9, 10, 11, 12개 아미노산을 단위로 전체 점수가 비교적 높은 짧은 펩티드를 선택한다. 동시에 상기 2개 영역의 아미노산 서열을 IEDB의 대화상자 내에 입력하고, 기존의 ADAMTS7과 유사도가 가장 높은 Crystal Structure Of Adamts4 With Inhibitor Bound를 모델로 선택하여 에피토프 예측을 수행한다. 이 둘의 결과를 결합하고, ADAMTS7 분자 human과 mouse 서열 비교 결과에 따라 2개 이상의 아미노산 차이가 없는 것을 표준으로 예비 짧은 펩티드 서열을 선정한다. 다시 스크리닝한 짧은 펩티드 서열을 PIR Peptide Match 및 BLAST 등 툴을 이용해 ADAMTS 패밀리의 단백질 분자의 서열 및 기타 단백질 서열과 비교하여, 최대한 상동성이 비교적 낮은 짧은 펩티드 서열을 선택한다. 상기 원칙을 종합하여, 4개의 면역원성 펩티드 단편(4개 짧은 펩티드)을 스크리닝한다. 결과는 도 1에서 A에 도시된 바와 같으며, 이는 각각 다음과 같다.
DP9: DCEPVGKRP(서열 1)
CD9: CLDDPPAKD(서열 2)
CP9: CNMKGDAHP(서열 3)
CD8: CSSGRDED(서열 4)
2. 컨쥬게이트의 제조는 이종이관능성 가교제 Sulfo-SMCC(Thermofisher에서 구입, 제품 번호 22122)를 사용하여 4개의 면역원성 펩티드 단편을 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 접합한다. 그 단계는 다음과 같다. (1) Sulfo-SMCC 시약 2mg를 칭량하여 순수 400uL를 완전히 용해시킨 20mg의 KLH(10mg/mL)에 첨가하여 균일하게 섞고 상온에서 30분간 방치하여 활성화된 담체를 획득한다 (2) 활성화된 담체를 100K의 TFF 농축 컬럼(Merck-Millipore)에 첨가하고, 50mM PBS(1mM EDTA 함유, pH 7.2)를 첨가하며 5000g에서 3회 원심분리하고 유리 Sulfo-SMCC를 제거하여 정제된 담체를 획득한다. (3) 짧은 펩티드(DP9, CD9, CP9 또는 CD8) 약 5mg를 칭량하고, 1mL의 50mM PBS(1mM EDTA 함유, pH 7.2)를 충분히 용해하여 정제된 담체에 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시키며, 20분마다 부드럽게 1회 진탕하여 백신 혼합물을 획득한다. (4) 백신 혼합물을 100K의 TFF 농도 컬럼에 첨가하고, 5000g에서 3회 원심분리하여 유리된 미반응의 상응하는 짧은 펩티드를 제거한다.
상기 커플링 반응을 통해 최종적으로 4가지 컨쥬게이트 건조 분말, 즉 KLH-CP9(CP9와 KLH를 접합하여 획득한 컨쥬게이트), KLH-DP9(DP9와 KLH를 접합하여 획득한 컨쥬게이트), KLH-CD9(CD9와 KLH를 접합하여 획득한 컨쥬게이트), KLH-CD8(CD8와 KLH를 접합하여 획득한 컨쥬게이트)을 획득한다.
3. 역가의 검출
실험용 마우스는 생후 6주된 수컷 C57BL/6 마우스(베이징대학교 의과대학 동물과에서 구입)로, 체중 21 내지 23g의 마우스 총 40마리를 무작위로 각 8마리씩 5개 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 8마리이며 각각 실험군 1, 실험군 2, 실험군 3, 실험군 4 및 대조군이다.
2단계에서 획득한 4가지 컨쥬게이트 건조 분말을 각각 멸균 생리 식염수에 용해시켜 농도가 1mg/mL인 4가지 컨쥬게이트 용액을 얻었다. 4가지 컨쥬게이트 용액을 각각 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구입, 제품 번호 BF040)와 모두 10:1의 부피비로 혼합하여 4가지 백신, 즉 백신 CP-9, 백신 DP-9, 백신 CD-9 및 백신 CD-8를 획득한다. 각각 피하 3-4점 주사 방식을 채택해 실험군 1, 실험군 2, 실험군 3, 실험군 4의 마우스에 주사한다. KLH를 멸균 식염수에 용해시켜 농도가 1mg/mL인 KLH 용액을 획득한다. KLH 용액과 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구입, 제품 번호 BF040)를 10:1 부피비로 혼합하여 KLH 혼합액을 획득하고, 피하 3-4점 주사 방식으로 대조군의 마우스에 주사한다. 실험군 1 내지 4 중 각 마우스의 주사용량은 컨쥬게이트에 따라 50ug로 계산하며, 대조군 중 각 마우스의 주사용량은 KLH에 따라 50ug으로 계산한다. 도 1의 B에 도시된 바와 같이, 총 2회 주사하며, 6주령일 때 1차 백신 접종(0주차, 즉 0W로 표기)을 수행하고, 마우스 꼬리 혈액을 취하여 1차 역가를 수행한다. 2주차에 2차 백신 접종을 수행하고 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16주차에 마우스 꼬리 혈액을 취하여 역가 검출을 수행한다. 역가 검출 결과는 도 1에서 C에 도시된 바와 같다. 도면에서 알 수 있듯이 4가지 백신으로 생쥐를 면역시킨 후 12주 이상 지속되는 항체 역가를 생산할 수 있다.
상기 백신 역가의 검출 방법은 다음과 같다. (1) 코팅된 ELISA 플레이트의 각 웰에 희석 비율이 다른 실험군 1 내지 4의 마우스 혈청 100ul를 첨가하고, 대조군의 마우스 혈청 샘플을 첨가한다. 37℃에서 1.5시간 동안 배양한다. (2) PBST로 5회 세척하고 가볍게 두드려 건조하며 희석된 HRP 표지의 이차 항체 100ul를 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 동안 배양한다. (3) PBST로 5회 세척 및 가볍게 두드려 건조한 후 각 웰에 TMB(Biolegend에서 구매, 품목 번호 421106) 100ul를 첨가하며, 대조 웰이 파란색으로 변하면 각 웰에 묽은 염산 100ul를 첨가하여 반응을 종료하고, ELISA 플레이트 상에서 A450 흡수값을 판독한다. 실험군 1 내지 4 마우스 혈청 판독값은 대조군 마우스 혈청 판독값의 2.1배인 최대 희석 배수보다 크다. 여기에서 코팅된 ELISA 플레이트에는 4가지가 있으며, 이는 각각 코팅 항원이 BSA-CP9인 ELISA 플레이트, 코팅 항원이 BSA-DP9인 ELISA 플레이트, 코팅 항원이 BSA-CD9인 ELISA 플레이트, 코팅 항원이 BSA-CD8인 ELISA 플레이트이다. BSA-CP9, BSA-DP9, BSA-CD9, BSA-CD8은 단계 2의 접합 방법에 따라 짧은 펩티드(CP9, DP9, CD9 또는 CD8)를 소혈청 알부민(BSA)과 접합하여 획득한 컨쥬게이트이다. ELISA 플레이트의 코팅 방법은 다음과 같다. (1) pH9.6의 탄산염 코팅 버퍼로 코팅 항원을 용해시켜, 코팅 항원의 농도를 15ug/ml로 만들고, 96웰 ELISA 플레이트(Biolegend에서 구입, 제품 번호 423501)에 100ul/well 첨가하며, 밤새 4℃에 방치한다. (2) 다음날, 코팅액을 버리고 두드려 건조시키며, 각 웰에 1% BSA(Solarbio에서 구입, 제품 번호 A8020-100) 120ul를 첨가하고, 37℃에서 1.5시간 동안 밀봉한 다음 부어서 두드려 건조시킨다.
실시예 2. 백신 DP-9와 백신 CD-9의 결찰 모델에 의한 신생 내막 형성 억제
1. 면역 후 마우스에서 좌측 총경동맥 결찰 모델의 구축
실험용 마우스는 생후 6주된 수컷 C57BL/6 마우스(베이징대학교 의과대학 동물과에서 구입)로, 체중 21 내지 23g의 마우스 총 40마리를 무작위로 각 8마리씩 5개 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 8마리이며 각각 실험군 1, 실험군 2, 실험군 3, 실험군 4 및 대조군이다.
실시예 1 중 단계 2에서 획득한 4가지 컨쥬게이트 건조 분말(KLH-CP9, KLH-DP9, KLH-CD9, KLH-CD8)을 각각 멸균 생리식염수에 용해시켜 4가지의 농도가 모두 1mg/mL인 컨쥬게이트 용액을 획득한다. 4가지 컨쥬게이트 용액을 각각 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구입, 제품 번호 BF040)와 모두 10:1의 부피비로 혼합하여 4가지 백신, 즉 백신 CP-9, 백신 DP-9, 백신 CD-9 및 백신 CD-8를 획득한다. 각각 피하 3-4점 주사 방식을 채택해 실험군 1, 실험군 2, 실험군 3, 실험군 4의 마우스에 주사한다. KLH를 멸균 식염수에 용해시켜 농도가 1mg/mL인 KLH 용액을 획득한다. KLH 용액과 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구입, 제품 번호 BF040)를 10:1 부피비로 혼합하여 KLH 혼합액을 획득하고, 피하 3-4점 주사 방식으로 대조군의 마우스에 주사한다. 실험군 1 내지 4 중 각 마우스의 주사용량은 컨쥬게이트에 따라 50ug로 계산하며, 대조군 중 각 마우스의 주사용량은 KLH에 따라 50ug으로 계산한다. 도 2의 A에 도시된 바와 같이, 6주령일 때 1차 백신 접종(0주차, 즉 0W로 표기)을 수행하고, 마우스 꼬리 혈액을 취하여 1차 역가 및 체중 측정을 수행한다. 2주차에 2차 백신 접종을 수행하고, 3주차에 마우스 꼬리 혈액을 취하여 2차 역가를 수행한다. 여기에서 역가의 검출 방법은 실시예 1과 동일하다. 도 2에서 B에 도시된 바와 같이, 3주차에 면역 반응을 일으킨 마우스는 좌측 총경동맥 결찰 실험(즉, 모델링)을 수행한다. 실험 전에 1% 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium) 150ul를 복강 주사하고, 6-0 봉합사(HARVEYBIO에서 구매, 제품 번호 FX-6-0)로 좌측 총경동맥 근처 교차 지점에서 결찰을 수행한다. 모델링 4주 후(즉, 7주차), 마우스 꼬리 혈액을 취하여 3차 역가 검출을 수행한다. 면역 역가 결과는 도 2에서 B에 도시된 바와 같다. 도면에서 알 수 있듯이, 4가지 백신 면역 마우스는 3주 및 7주 후, 더 높은 항체 역가가 생성될 수 있다.
2. 신생 내막 억제
모델링 4주 후 샘플을 고정하고 재료를 취한다. 4% 파라포름알데히드로 밤새 고정한 다음 OCT(미국 사쿠라에서 구입, 제품 번호 4583) 젤에 포매하고 후속 냉동 절편을 위해 -80℃에서 보관한다. 냉동 절편은 결찰 지점에서 시작해 200um, 350um, 500um, 1mm, 1.5mm, 2mm의 6개 위치의 절편을 유지한다. 각 절편은 7um으로 만든 후 HE 염색을 수행한다. 각 군 마우스의 염색 결과는 도 2에서 C와 같으며, 신생 내막 면적과 중막 면적의 비율, 외부 탄성판 둘레 길이 및 중막 면적 4개 지표를 계산하며, 도 2에서 D, E, F 및 G에 도시된 바와 같고, Image Pro Plus 소프트웨어를 사용하여 통계를 획득한다. 총경동맥 결찰 마우스는 백신 DP-9(도면에서 "DP-9"로 표시) 및 CD-9(도면에서 "CD-9"로 표시)를 주사한 후 대조군(도면에서 "KLH"로 표시) 마우스의 혈관 신생 내막 면적 및 내막 면적과 중막 면적의 비율보다 현저하게 낮았다. 동시에 CP-9(도면에서 "CP-9"로 표시)와 CD-8(도면에서 "CD-8"로 표시)을 주사한 면역 마우스의 혈관 신생 내막 면적 및 내막 면적과 중막 면적 비율은 대조군(도면에서 "KLH"로 표시)과 비교하여 통계학적 차이가 없었다. 따라서 백신 DP-9와 백신 CD-9는 결찰 모델로 인한 신생 내막 형성 억제에서 현저한 효과를 나타낸다.
실시예 3. 백신 DP-9와 백신 CD-9의 가이드와이어 손상 모델에 의한 신생 내막 형성 억제
1. 면역 후 마우스에서 가이드와이어 손상 모델의 구축
실험용 마우스는 생후 6주된 수컷 C57BL/6 마우스(베이징대학교 의과대학 동물과에서 구입)로, 체중 21 내지 23g의 마우스 총 30마리를 무작위로 각 6마리씩 5개 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 6마리이며 각각 실험군 1, 실험군 2, 실험군 3, 실험군 4 및 대조군이다.
실시예 1 중 단계 2에서 획득한 4가지 컨쥬게이트 건조 분말(KLH-CP9, KLH-DP9, KLH-CD9, KLH-CD8)을 각각 멸균 생리식염수에 용해시켜 4가지의 농도가 모두 1mg/mL인 컨쥬게이트 용액을 획득한다. 4가지 컨쥬게이트 용액을 각각 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구입, 제품 번호 BF040)와 모두 10:1의 부피비로 혼합하여 4가지 백신, 즉 백신 CP-9, 백신 DP-9, 백신 CD-9 및 백신 CD-8를 획득한다. 각각 피하 3-4점 주사 방식을 채택해 실험군 1, 실험군 2, 실험군 3, 실험군 4의 마우스에 주사한다. KLH를 멸균 식염수에 용해시켜 농도가 1mg/mL인 KLH 용액을 획득한다. KLH 용액과 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구입, 제품 번호 BF040)를 10:1 부피비로 혼합하여 KLH 혼합액을 획득하고, 피하 3-4점 주사 방식으로 대조군의 마우스에 주사한다. 실험군 1 내지 4 중 각 마우스의 주사용량은 컨쥬게이트에 따라 50ug로 계산하며, 대조군 중 각 마우스의 주사용량은 KLH에 따라 50ug으로 계산한다. 도 3의 A에 도시된 바와 같이, 6주령일 때 1차 백신 접종(0주차, 즉 0W로 표기)을 수행하고, 마우스 꼬리 혈액을 취하여 1차 역가 및 체중 측정을 수행한다. 2주차에 2차 백신 접종을 수행하고, 3주차에 마우스 꼬리 혈액을 취하여 2차 역가를 수행한다. 여기에서 역가의 검출 방법은 실시예 1과 동일하다. 도 3에서 B에 도시된 바와 같이, 면역반응 후 마우스는 좌측 총경동맥 가이드와이어 손상 실험(즉, 모델링)을 수행하였다. 실험 전, 1% 펜토바르비탈 나트륨 150ul를 복강내 주사하고, 경부 피부를 소독하고, 경부 전방 정중앙을 절개하여 외경동맥을 결찰하고 혈관 클립으로 내동맥과 총경동맥의 혈류를 일시적으로 차단한다. 바나스 가위(vannas scissors)를 이용하여 외경동맥 원위단 결찰 부근에 비스듬한 개구부를 절개하고 직경 0.38mm의 금속 가이드와이어를 삽입하며, 전후 5회 회전시켜 혈관벽을 마찰시켜 총경동맥 손상을 유발한다. 가이드와이어를 빼내고 동맥 절개의 근위단을 결찰하고 피부를 봉합한다. 모델링 4주 후(즉, 7주차), 마우스 꼬리 혈액을 취하여 3차 역가 검출을 수행한다. 백신 역가 결과는 도 3의 B에 도시된 바와 같다. 백신 CP-9 및 DP-9는 마우스를 면역시킨 후 더 높은 항체 역가를 생성할 수 있음을 도면으로부터 알 수 있다.
2. 신생 내막 억제
모델링 4주 후 샘플을 고정하고 재료를 취한다. 4% 파라포름알데히드로 밤새 고정한 다음 OCT(미국 사쿠라에서 구입, 제품 번호 4583) 젤에 포매하고 후속 냉동 절편을 위해 -80℃에서 보관한다. 냉동 절편은 결찰 지점에서 시작해 200um, 350um, 500um, 1mm, 1.5mm, 2mm의 6개 위치의 절편을 유지한다. 각 절편은 7um으로 만든 후 HE 염색을 수행한다. 각 군 마우스의 염색 결과는 도 3에서 C와 같으며, 신생 내막 면적 및 내막 면적과 중막 면적의 비율, 외부 탄성판 둘레 길이 및 중막 면적 4개 지표를 계산하며, 도 3에서 D, E, F 및 G에 도시된 바와 같고, Image Pro Plus 소프트웨어를 사용하여 통계를 획득한다. 총경동맥 가이드와이어 손상 마우스는 백신 DP-9(도면에서 "DP-9"로 표시) 및 CD-9(도면에서 "CD-9"로 표시)를 주사한 후 대조군(도면에서 "KLH"로 표시) 마우스의 혈관 신생 내막 면적 및 내막 면적과 중막 면적의 비율보다 현저하게 낮았다. 따라서 백신 DP-9와 백신 CD-9는 가이드와이어 손상 모델로 인한 신생 내막 형성 억제에서 현저한 효과를 나타낸다.
실시예 4. 백신 DP-9의 LDLR-/-마우스 고지방식 유도의 죽상동맥경화증의 형성 억제
1. 죽상동맥경화증 모델의 구축
실험 마우스는 8주령의 LDLR-/- 수컷 마우스(베이징대학교 의과대학 동물과에서 구입)이며, 총 18마리의 체중이 23-25g이었고, 무작위로 3군으로 나누었다. 각 군은 6마리이며 각각 실험군 1, 실험군 2 및 대조군이다.
실시예 1의 단계 2에서 획득한 2가지 컨쥬게이트 건조 분말(KLH-DP9, KLH-CD9)을 각각 멸균 생리 식염수에 용해시켜 농도가 모두 1mg/mL인 2가지의 컨쥬게이트 용액을 얻었다. 2가지 컨쥬게이트 용액을 각각 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구매, 제품 번호 BF040)와 모두 10:1의 부피비로 혼합하여 2가지 백신, 즉 백신 DP-9 및 백신 CD-9를 획득한다. 각각 피하 3-4점 주사의 방식으로 실험군 1, 실험군 2의 마우스에게 주사한다. KLH를 멸균 생리식염수에 용해시켜 1mg/mL 농도의 KLH 용액을 획득하며, KLH 용액과 수산화알루미늄 보조제(HEART에서 구입, 제품 번호 BF040)를 10:1의 부피비로 혼합하여 KLH 혼합액을 획득하며, 피하 3-4점 주사의 방식으로 대조군의 마우스에 주사한다. 실험군 1 및 2 중 각 마우스의 주사용량은 컨쥬게이트에 따라 50ug로 계산하며, 대조군 중 각 마우스의 주사용량은 KLH에 따라 50ug으로 계산한다. 도 4의 A에 도시된 바와 같이, 8주령일 때 1차 백신 접종(0주차, 즉 0W로 표기)을 수행하고, 각각 2, 4, 12, 15주차에 백신 접종을 수행하고, 4주차에서 18주차까지 지속하여 죽상동맥경화증 식이(즉, 고지방 식이, 사료는 Research Diets에서 구입, 제품 번호: D12108C, 주성분 함량은 1.25% 콜레스테롤, 40kcal% 지방)를 진행한다. 또한 3, 9, 13, 18주차에 백신 역가 검출 및 체중 검출을 수행하였다. 여기에서 역가 검출 방법은 실시예 1과 동일하다. 도 4의 B 및 C에 도시된 바와 같이, 결과는 백신 CD-9 및 DP-9가 마우스를 면역시킨 후 더 높은 항체 역가를 생성할 수 있고, 18주차에서 여전히 더 높은 항체 역가가 검출될 수 있음을 나타낸다.
2. 죽상동맥경화증의 형성 억제
현미경 하에서 마우스의 전혈관을 현미경 기구로 박리한 후 4% 파라포름알데히드에 6시간 동안 고정한 다음, 60% 이소프로판올에 5분 동안 침지시킨다. 그 후 암실에서 Oil Red O로 30분간 염색한 후 60% 이소프로필알코올 용액으로 피부색을 씻은 후 현미경으로 외막 지방을 계속 벗겨낸다. 깨끗이 벗겨낸 후 미세 가위로 혈관을 종방향으로 절개하고 동일한 단계를 반복하며, 60% 이소프로판올에 5분간 침지시킨 후 암실에서 Oil Red O로 30분간 염색한 후 60% 이소프로필알코올 용액으로 피부색을 씻는다. 마지막으로 염색된 혈관을 플레이트에 고정하여 대략적인 도면을 얻는다. 도 4의 D에 도시된 바와 같이 대조군, 실험군 1, 실험군 2 모두 죽상동맥경화증 플라크가 형성된다. Image Pro Plus 소프트웨어를 사용하여 플라크 면적을 통계하고, 대조군(도면에서 "KLH"로 표시)의 플라크 면적을 1로 하여 실험군 2(도면에서 "CD-9"로 표시)와 실험군 1(도면에서 "DP-9"로 표시)의 상대 플라크 면적을 계산하였다. 결과에 따르면, 대조군(도면에서 "KLH"로 표시)에 비해 실험군 1(도면에서 "DP-9"로 표시)의 상대 플라크 면적이 현저하게 감소하였고(p<0.001), 실험군 2(도면에서 "CD-9"로 표시)의 상대 플라크 면적은 차이가 없었다(p>0.05). 이는 백신 DP-9가 죽상동맥경화증 플라크의 형성을 현저하게 억제하고, 백신 CD-9는 대조군 KLH와 현저한 차이가 없음을 의미한다.
본 발명은 분석을 위해 다음과 같은 통계적 방법을 채택하였다. (1) 정규 분포의 연속 확률 변수는 평균 ± 표준 오차(Mean ± SEM)로 표시한다. (2) 쌍을 이루는 데이터는 모두 쌍을 이루는 t 검정(양측 검정)을 채택한다. (3) 쌍을 이루지 않은 데이터는 그룹 t 검정(양측 검정)을 채택한다. (4) 여러 그룹 간의 단일 요인 결과 비교 시, 일원 ANOVA를 채택하고, 그룹 간 둘씩 비교 시에는 Student-Newman-Keuls 검정을 채택한다. (5) 여러 그룹 간의 이중 원소 결과 비교 시, 양방향 결과를 비교할 때는 이원 ANOVA를 채택하고, 그룹 간의 둘씩 비교 시에는 Bonferroni 검정을 채택한다.
상기에서는 본 발명을 상세하게 설명하였다. 본 기술분야의 당업자라면, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 불필요한 실험 없이, 본 발명은 등가의 파라미터, 농도 및 조건 하에서 본 발명을 비교적 넓은 범위로 실시할 수 있다. 본 발명에 구체적인 실시예가 제공되었지만, 본 발명은 추가로 수정될 수 있음을 이해해야 한다. 결론적으로, 본 발명의 원리에 따라, 본 출원은 본 출원에 개시된 범위를 벗어나는 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 이루어진 변경을 포함하는 본 발명의 임의의 변경, 사용 또는 개선을 포함하도록 의도된다. 이하의 첨부된 청구항의 범위에 따라 일부 기본적인 특징의 응용을 수행할 수 있다.
1. 본 발명에서 스크리닝된 메탈로프로테아제 ADAMTS-7의 짧은 펩티드는 야생형 C57BL/6 마우스 및 ApoE-/- 마우스 내에서 특이적 면역반응을 일으킬 수 있고, 짧은 펩티드에 대한 특이적 항체를 생성할 수 있다. 상기 항체는 메탈로프로테아제 ADAMTS-7의 촉매 영역과 특이적으로 결합하고 그 가수분해효소 활성을 차단할 수 있다.
2. 본 발명에 의해 제조된 백신은 혈관재협착증 마우스 모델(즉, 결찰 모델 및 가이드와이어 손상 모델)의 내막 신생 및 고지방식 마우스의 죽상동맥경화증의 발생을 유의하게 억제할 수 있고, 죽상동맥경화증 및/또는 혈관재협착증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
3. 본 발명의 백신 제조 과정에 사용되는 이종이관능성 가교제는 2가지 그룹을 동시에 연결할 수 있는 특징이 있으며, 상이한 그룹은 두 단계를 통해 앞뒤 연결될 수 있어 조작이 간단하고 빠르다.
SEQUENCE LISTING <110> PEKING UNIVERSITY <120> IMMUNOGENIC PEPTIDE FRAGMENTS OF METALLOPROTEASE ADAMTS-7 AND USES THEREOF IN ANTI-ATHEROSCLEROSIS AND RELATED DISEASES <130> GNPFY20056 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Asp Cys Glu Pro Val Gly Lys Arg Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Cys Leu Asp Asp Pro Pro Ala Lys Asp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Cys Asn Met Lys Gly Asp Ala His Pro 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Cys Ser Ser Gly Arg Asp Glu Asp 1 5

Claims (8)

  1. 짧은 펩티드에 있어서,
    상기 짧은 펩티드는,
    A1) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 1로 표시되는 짧은 펩티드;
    A2) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 2로 표시되는 짧은 펩티드;
    A3) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 3으로 표시되는 짧은 펩티드; 및
    A4) 아미노산 서열이 서열표 중 서열 4로 표시되는 짧은 펩티드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 짧은 펩티드.
  2. 제1항에 따른 짧은 펩티드의 컨쥬게이트에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는 제1항에 따른 짧은 펩티드와 담체 단백질이 접합되어 획득하는 완전 항원인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌, 재조합 Qβ 파지 입자 단백질, 재조합 소 유두종 바이러스 단백질, 재조합 B형 간염 바이러스 단백질 또는 파상풍 톡소이드인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  4. 응용에 있어서,
    상기 응용은,
    P1) 제1항에 따른 짧은 펩티드를 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P2) 제2항에 따른 컨쥬게이트를 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P3) 제3항에 따른 컨쥬게이트를 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P4) 제1항에 따른 짧은 펩티드를 혈관재협착증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P5) 제2항에 따른 컨쥬게이트를 혈관재협착증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P6) 제3항에 따른 컨쥬게이트를 혈관재협착증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P7) 제1항에 따른 짧은 펩티드를 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P8) 제2항에 따른 컨쥬게이트를 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P9) 제3항에 따른 컨쥬게이트를 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P10) 제1항에 따른 짧은 펩티드를 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소시키는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P11) 제2항에 따른 컨쥬게이트를 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소시키는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P12) 제3항에 따른 컨쥬게이트를 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소시키는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P13) 제1항에 따른 짧은 펩티드를 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 제품의 제조에 사용하는 응용;
    P14) 제2항에 따른 컨쥬게이트를 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 제품의 제조에 사용하는 응용; 및
    P15) 제3항에 따른 컨쥬게이트를 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 제품의 제조에 사용하는 응용 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 응용.
  5. 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 백신에 있어서,
    상기 백신은 제2항 또는 제3항에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 백신은 제2항 또는 제3항에 따른 컨쥬게이트와 면역 보조제로 구성되는 것을 특징으로 하는 백신.
  7. 제5항 또는 제6항에 따른 백신을 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 제품의 제조에 사용하는 응용.
  8. 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 방법에 있어서,
    상기 방법은 동물에게 제2항 또는 제3항에 따른 컨쥬게이트 또는 제5항 또는 제6항에 따른 백신을 투여하여, 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료 및/또는 혈관재협착증을 예방 또는 치료 및/또는 손상 동맥의 신생 내막 면적을 감소 및/또는 손상 동맥의 내막 면적과 중막 면적 비율을 낮추는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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