JP2022549579A - メタロプロテアーゼａｄａｍｔｓ－７の免疫原性ペプチドセグメント、ならびに抗アテローム性動脈硬化症及び関連疾患におけるその使用 - Google Patents

メタロプロテアーゼａｄａｍｔｓ－７の免疫原性ペプチドセグメント、ならびに抗アテローム性動脈硬化症及び関連疾患におけるその使用 Download PDF

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Abstract

メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ－７の免疫原性ペプチドセグメント、ならびに抗アテローム性動脈硬化症及び関連疾患におけるその使用。アミノ酸配列が配列表の配列１に示される短いペプチド、アミノ酸配列が配列表の配列２に示される短いペプチド、アミノ酸配列が配列表の配列３に示される短いペプチド、アミノ酸配列が配列表の配列４に示される短いペプチドのいずれかを含む短いペプチドを提供する。上記短いペプチドを含むコンジュゲート、前記コンジュゲートを含むワクチン、及びその使用。短いペプチドを含むワクチンは、血管再狭窄マウスモデルの内膜新生及び高脂肪飼育マウスのアテローム性動脈硬化症の発生を顕著に抑制し、アテローム性動脈硬化症及び／又は血管再狭窄の予防又は治療に有用である。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオテクノロジー及び医薬の分野に関し、特に、メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ－７の免疫原性ペプチドセグメント、ならびに抗アテローム性動脈硬化症及び関連疾患におけるその使用に関する。
冠状動脈性心臓病は、高発症率や高死亡率により、人間の健康を厳重に危害するため、「人間の第一のキラー」と呼ばれている。冠状動脈性心臓病の主な病因は冠状動脈アテローム性硬化であり、その病理過程は、脂質が血管壁に異常に堆積することによる血管壁内皮細胞の損傷、血管平滑筋細胞の増殖や移動、及び炎症細胞の浸潤などにより、管腔内に突出するプラークを形成し、プラークの形成は管腔狭窄と血液供給不足を招く。
冠状動脈性心臓病に対する治療には、現在、主として以下の３つの治療法がある。（１）薬物治療。症状を緩和し、狭心症の発作や心筋梗塞を減少し、冠状動脈アテローム性動脈硬化症の進行を遅延させ、冠状動脈性心臓病による死亡を減少させることを目的とする。スタチン類の脂質低下薬は心血管イベントを２５％減らすことができるが、糖尿病などの新たな発症リスクを増加させ、新たに登場したエゼチミブやＰＣＳＫ９モノクローナル抗体などは期待できるものの、やはり脂質低下という戦略について工夫したものである。しかし、現在の医療レベルでは、冠状動脈性心臓病を根治できる薬物はなく、冠状動脈性心臓病に対する治療は実際には、冠状動脈性心臓病の病状をコントロールし、病状の悪化による合併症を避けることが主である。（２）経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）。経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）では、特別なバルーンカテーテルを使用して末梢動脈（大腿動脈又は橈骨動脈）を経て冠状動脈狭窄部に送り、バルーンを充満させると、狭窄部を拡張して血流を改善し、拡張された狭窄部にステントを配置して再狭窄を防止することができる。しかし、現在、ステント内血栓症（ＳＴ）やステント内再狭窄（ＩＳＲ）など、ステントが失敗するリスクはまだある。ステント内血栓形成は臨床上比較的に厳重な合併症であり、深刻な場合、血栓形成部分の上昇型心筋梗塞を引き起こす恐れがあり、死亡率は２０％～４０％に達し、ステント内再狭窄の発生はＰＣＩ術後の長期予後に極めて大きな影響を与える。動脈壁は、正常な内皮細胞バリア下で脂質沈着を回避できる。しかしながら、薬物溶出ステントは内皮細胞の構造と機能の損傷を引き起こす可能性があり、内皮癒合の遅延を招き、ネオアテローム性動脈硬化症を形成する傾向がある。さらに、手術再治療では、動脈バイパス移植術及び介入低侵襲技術は、いずれも、操作難度が大きい、損傷が深刻であることにより、大多数の血管再狭窄の治療には適さない。そのため、拡張術後の再狭窄と血栓形成を予防、治療するにも新しい手段が必要とされる。
ステント及びバイパス手術は臨床医師と患者にとって完全に満足のいく効果を達成しないため、各国の医学科学者らは、冠状動脈性心臓病を誘発し、血管狭窄を引き起こす誘因について研究を行った。近年、抗アテローム性動脈硬化症ワクチンの開発に注目していき、ハンガリーのホルワット・イーストマン（Ｄｒ．Ｈｏｒｖaｔｈ Ｉｓｔｖaｎ）教授は１９８３年に初めて正常な人の体内にコレステロール抗体が存在することを発見し、コレステロール抗原ワクチンを開発し、２００２年にハンガリー国家医療管理局の承認を受けて人体臨床実験に入り、今日まで約１０年を経て、すでに四万人余りの患者が治療を受けており、効果が顕著であり、心臓血管疾患を完治する分野では重要な一歩を踏み出した。イーストマン教授が１９８３年にコレステロール免疫ワクチンを開発して以降、スウェーデンのカロリンスカ大学の科学者は、コレステロールが動脈血管に危害を及ぼすのを防ぎ、心臓病の発症率を３分の２低下させるコレステロールワクチンを開発した。また、病原性ＬＤＬアポリポタンパク質ＡｐｏＢ１００とＬＤＬＲ分解酵素ＰＣＳＫ９を標的としたモノクローナル抗体又は短鎖ペプチドワクチンが次々と開発され、初歩的な動物モデル実験と臨床前期検証などが行われている。最近、人体治療に使用される承認を受けることが最も期待されるのはプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）に対するモノクローナル抗体（ＲＥＧＮ７２７）であり、Ｉ期臨床試験の結果、低用量のＲＥＧＮ７２７は被験者のＬＤＬレベルを３０％以上下げることができ、スタチンによる治療に耐えられない患者に対して、ＲＥＧＮ７２７は更に広範な臨床応用が期待できる。さらに、アポリポタンパク質ＡｐｏＢ１００に作用する短鎖ペプチドワクチンを設計した結果、実験動物において一定の抗アテローム性動脈硬化症作用を示した。これらのことから、すべて、特定の標的に対する短鎖ペプチドワクチンの研究・開発、設計及び対応するモノクローナル抗体の産生が疾患の予防・治療に対して潜在的な意義があることを示した。
ＡＤＡＭＴＳ－７（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｌｉｋｅ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－７、Ｉ型血小板結合タンパク質モチーフを含むディスインテグリン様及びメタロプロテアーゼ）は、２００４年にクローニングされた新規メタロプロテアーゼであり、Ｚｎ２＋依存性メタロプロテアーゼファミリーに属する。ヒトＩ型血小板結合タンパク質モチーフ（ＴＳＰ）を含むディスインテグリン様及びメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）ファミリーは、プロトコラーゲン、プロテオグリカン及び軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）を含む細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）を分解する１９個の分泌型マルチドメインジンクフィンガーメタロプロテアーゼからなる。ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼは各種組織の細胞外マトリックス成分の反転において重要な作用を有し、これらの酵素の異常発現は通常、炎症性病理過程、例えば腫瘍、関節リウマチと密接に関連している。低分子干渉ＲＮＡサイレンシング、アデノウイルスによるＡＤＡＭＴＳ－７の過剰発現、ＡＤＡＭＴＳ－７遺伝子ノックアウト動物モデルの構築などの方法によれば、メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ－７は軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の分解を通じて血管平滑筋細胞の移動と血管損傷後の新生内膜形成を促進することを発見し( Ｗａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａｄａｍｔｓ－７ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｏｉｎｔｉｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｌｌｏｏｎ－ｉｎｊｕｒｅｄ ｒａｔ ａｒｔｅｒｉｅｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００９；１０４：６８８－６９８)、また、ＡＤＡＭＴＳ－７はＴＳＰ－１を介して内皮修復を抑制することを見出し、このため、二重機構から新生内膜の形成が促進される(Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｔ， Ｚｈａｎｇ Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａｄａｍｔｓ－７ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｒｅ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｊｕｒｅｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０１５；１３１：１１９１－１２０１)。
しかし、現在、ＡＤＡＭＴＳ－７に関連する有効な短鎖ペプチドワクチンの報告はなかった。
本発明が解決しようとする技術的課題は、アテローム性動脈硬化症及び／又は血管再狭窄を予防又は治療するために、メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ－７の免疫原性ペプチドセグメントをどのように取得するかことである。
上記技術的課題を解決するために、本発明は、まず、Ａ１）～Ａ４）のいずれかである短いペプチドを提供する。
Ａ１）アミノ酸配列が配列表の配列１に示される短いペプチド、
Ａ２）アミノ酸配列が配列表の配列２に示される短いペプチド、
Ａ３）アミノ酸配列が配列表の配列３に示される短いペプチド、
Ａ４）アミノ酸配列が配列表の配列４に示される短いペプチド。
具体的には、前記短いペプチドは、下記のＡ１）又はＡ２）である。
Ａ１）アミノ酸配列が配列表の配列１に示される短いペプチド、
Ａ２）アミノ酸配列が配列表の配列２に示される短いペプチド。
より具体的には、前記短いペプチドは、アミノ酸配列が配列表の配列１に示される短いペプチドである。
上記短いペプチドの使用も本発明の範囲内である。
本発明の上記短いペプチドの使用は、下記のＢ１）～Ｂ４）のいずれかを含む。
Ｂ１）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における使用、
Ｂ２）血管再狭窄を予防又は治療する製品の製造における使用、
Ｂ３）損傷動脈の新生内膜面積を減少させる製品の製造における使用、
Ｂ４）損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる製品の製造における使用。
上記使用において、前記製品は、医薬品、試薬又はワクチンなどであってもよい。
本発明は、さらに、上記短いペプチドとキャリアタンパク質とを結合させた完全抗原である上記短いペプチドのコンジュゲートを提供する。
上記コンジュゲートにおいて、前記キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、組換えＱβファージ粒子タンパク質、組換えウシパピローマウイルスタンパク質、組換えＢ型肝炎ウイルスタンパク質、又は破傷風トキソイドであってもよい。
上記コンジュゲートにおいて、前記結合に使用される結合剤はヘテロ二機能性架橋剤であり、具体的には、前記ヘテロ二機能性架橋剤は、ＳＭＣＣ、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ又はＬＣ－ＳＭＣＣであってもよい。
上記コンジュゲートの使用も本発明の保護範囲内である。
本発明の上記コンジュゲートの使用は、下記のＢ１）～Ｂ４）のいずれかを含む。
Ｂ１）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における使用、
Ｂ２）血管再狭窄を予防又は治療する製品の製造における使用、
Ｂ３）損傷動脈の新生内膜面積を減少させる製品の製造における使用、
Ｂ４）損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる製品の製造における使用。
上記使用において、前記製品は、医薬品、試薬又はワクチンなどであってもよい。
本発明は、さらに、アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の新生中膜面積に対する新生内膜面積の比を減少させるワクチンを提供する。
上記ワクチンは、下記のＡ１）～Ａ４）のいずれかに記載の短いペプチドとキャリアタンパク質とを結合させたコンジュゲートを含む。
Ａ１）アミノ酸配列が配列表の配列１に示される短いペプチド、
Ａ２）アミノ酸配列が配列表の配列２に示される短いペプチド、
Ａ３）アミノ酸配列が配列表の配列３に示される短いペプチド、
Ａ４）アミノ酸配列が配列表の配列４に示される短いペプチド。
上記ワクチンにおいて、前記キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、組換えＱβファージ粒子タンパク質、組換えウシパピローマウイルスタンパク質、組換えＢ型肝炎ウイルスタンパク質、又は破傷風トキソイドであってもよい。
上記ワクチンは、免疫アジュバントをさらに含む。
上記ワクチンにおいて、前記免疫アジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント、ミョウバンアジュバント、フロイントアジュバントであってもよい。
アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は、損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の新生中膜面積に対する新生内膜面積の比を減少させる製品の製造における上記ワクチンの使用も本発明の保護範囲内である。
上記使用において、前記製品は、医薬品又は試薬であってもよい。
本発明は、さらに、アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる方法を提供する。
アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる本発明の方法は、アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させるために、上記コンジュゲート又は上記ワクチンを動物に投与することを含む。
本発明の上記短いペプチドは、キャリアタンパク質の第２の連結部位と１つの共有結合を介して結合可能な第１の連結部位を含む。組換えＱβファージ粒子タンパク質、組換えウシパピローマウイルスタンパク質、組換えＢ型肝炎ウイルスタンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドをキャリアタンパク質とし、これらのキャリアタンパク質は、少なくとも１つの第２の連結部位を有し、好ましくは、第２の連結部位は、アミノ基、カルボキシル基及びメルカプト基を含み、具体的には、リジン残基、アルギニン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基及びシステイン残基から選択される。ヘテロ二機能性架橋剤を用いて、ＡＤＡＭＴＳ－７短いペプチドを上記キャリアタンパク質と結合し、規則的かつ反復的な短いペプチド－ベクターワクチンを形成する。短いペプチドは繰り返されて、ある密度でベクター上又は表面上に配列されて表示され、高抗原性を有するアレイディスプレイを形成し、ヒト及びマウスのＡＤＡＭＴＳ－７免疫原性ペプチドセグメントに対する効率的かつ特異的な抗体の生成に有利であり、ＡＤＡＭＴＳ－７の加水分解酵素機能を効果的に遮断し、血管再狭窄マウスモデルの内膜新生、及び高脂肪飼育マウスのアテローム性動脈硬化症の発生を顕著に抑制することができる。
ＡはＡＤＡＭＴＳ－７免疫原性ペプチドセグメントのアミノ酸配列であり、ＢはＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン接種時間と力価検出時間の模式図であり、ＣはＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン力価の検出結果である。 ＡはＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン接種時間と力価検出時間、及び総頸動脈結紮手術時間の模式図であり、ＢはＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン力価の検出結果であり、ＣはＨＥ染色の結果であり、Ｄは結紮モデルマウスの新生内膜面積であり、Ｅは結紮モデルマウスの中膜面積に対する新生内膜面積の比であり、Ｆは結紮モデルマウスの外弾性板周長（すなわち外周長）であり、Ｇは結紮モデルマウスの中膜面積である。 ＡはＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン接種時間と力価検出時間、及びガイドワイヤ引掻き手術時間の模式図であり、ＢはＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン力価の検出結果であり、ＣはＨＥ染色の結果であり、Ｄはガイドワイヤ引掻きモデルマウスの新生内膜面積であり、Ｅはガイドワイヤ引掻きモデルマウスの中膜面積に対する新生内膜面積の比であり、Ｆはガイドワイヤ引掻きモデルマウスの外弾性板周長（すなわち外周長）であり、Ｇはガイドワイヤ引掻きモデルマウスの中膜面積である。 Ａは、ＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン接種時間、力価検出時間及び高脂肪食飼育時間の模式図であり、ＢはＡＤＡＭＴＳ－７ワクチン力価の検出結果であり、Ｃはマウスの体重の検出結果であり、Ｄはアテローム性動脈硬化症モデルマウスのプラーク面積であり（左から順に対照群、実験群１、及び実験群２）、Ｅはアテローム性動脈硬化症モデルマウスのプラーク面積の統計結果である。
以下では、本発明について具体的な実施形態を参照してさらに詳細に説明し、示される実施例は本発明の範囲を限定するためではなく、本発明を明確にするために過ぎない。
下記実施例における実験方法は、特に断らない限り、全て通常の方法である。
下記実施例に用いられる材料、試薬などは、特に断らない限り、いずれも商業経路から入手することができる。
実施例１、ＡＤＡＭＴＳ－７ワクチンの製造及び力価の検出
１、メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ－７の免疫原性ペプチドセグメントのスクリーニング
ＡＤＡＭＴＳ－７は、主にＣＯＭＰを結合して分解することにより、ＶＳＭＣの移動を促進し、血管新生内膜の形成を促進するものであり、本発明では、短いペプチドをスクリーニングするためのターゲット領域として、触媒ドメイン及び４ ＴＳＰ－１様ドメインを選択した。触媒ドメイン及び４ ＴＳＰ－１様ドメインのアミノ酸配列をそれぞれＩＥＤＢ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎのダイアログボックスに入力し、それにより予測されるスコアに基づいて、スコアの高いものの中から、８、９、１０、１１、１２個のアミノ酸を単位として、総合スコアが高い短いペプチドを選択し、以上の２つの領域のアミノ酸配列をＩＥＤＢのダイアログボックスに入力し、ＡＤＡＭＴＳ－７と類似性が最も高い既存のＣｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｄａｍｔｓ４ Ｗｉｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｂｏｕｎｄをモデルとしてエピトープ予測を行い、両者の結果を組み合わせ、そしてＡＤＡＭＴＳ－７分子のヒトとマウス配列の比較結果に基づき、２つ以上のアミノ酸の差がないことを基準として、最初の短いペプチド配列を選択した。さらに、スクリーニングした短いペプチド配列を、ＰＩＲ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｔｃｈ及びＢＬＡＳＴなどのツールを用いて、ＡＤＡＭＴＳファミリーのタンパク質分子の配列及びその他のタンパク質配列とアラインメントし、できるだけ相同性の低い短いペプチド配列を選択した。以上の原則を組み合わせて、４つの免疫原性ペプチドセグメント（４つの短いペプチド）をスクリーニングし、結果を図１のＡに示し、それぞれ次のようになる。
ＤＰ９：ＤＣＥＰＶＧＫＲＰ（配列１）
ＣＤ９：ＣＬＤＤＰＰＡＫＤ（配列２）
ＣＰ９：ＣＮＭＫＧＤＡＨＰ（配列３）
ＣＤ８：ＣＳＳＧＲＤＥＤ（配列４）。
２、コンジュゲートの製造
ヘテロ二機能性架橋剤Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入、品番２２１２２）を使用して、４つの免疫原性ペプチドセグメントをそれぞれキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合し、そのステップは以下の通りであった。（１）Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ試薬２ｍｇを秤量して、純水４００μＬに完全に溶解した後、ＫＬＨ（１０ｍｇ／ｍＬ）２０ｍｇに加えて均一混合し、室温で３０分間放置し、活性化したベクターを得た。（２）活性化したベクターを１００ＫのＴＦＦ濃縮カラム（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に加え、５０ｍＭ ＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、ｐＨ ７．２）を添加し、５０００ｇを３回遠心分離し、遊離したＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣを除去し、精製したベクターを得た。（３）短いペプチド（ＤＰ９、ＣＤ９、ＣＰ９又はＣＤ８）約５ｍｇを秤量して、５０ｍＭ ＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２を含む）１ｍＬに十分に溶解し、精製したベクターを加え、室温で１時間反応し、２０分ごとに軽く振とうし、ワクチン混合物を得た。（４）ワクチン混合物を１００ＫのＴＦＦ濃縮カラムに加え、５０００ｇを３回遠心分離し、遊離した未反応の対応する短いペプチドを除去した。
上記の結合反応により、最終的に、ＫＬＨ－ＣＰ９（ＣＰ９とＫＬＨとが結合したコンジュゲート）、ＫＬＨ－ＤＰ９（ＤＰ９とＫＬＨとが結合したコンジュゲート）、ＫＬＨ－ＣＤ９（ＣＤ９とＫＬＨとが結合したコンジュゲート）、ＫＬＨ－ＣＤ８（ＣＤ８とＫＬＨとが結合したコンジュゲート）の４種類のコンジュゲート乾燥粉末を得た。
３、力価の検出
実験マウスとして体重２１～２３ｇの６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（北京大学医学部動物部から購入）合計４０匹を、実験群１、実験群２、実験群３、実験群４、及び対照群の５群にランダムに分け、１群ごとに８匹とした。
ステップ２で得られた４種類のコンジュゲート乾燥粉末をそれぞれ無菌生理食塩水に溶解し、それぞれ濃度１ｍｇ／ｍＬの４種類のコンジュゲート溶液を得た。４種類のコンジュゲート溶液のそれぞれを、水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）と体積比１０：１で混合して、４種類のワクチン、すなわちワクチンＣＰ－９、ワクチンＤＰ－９、ワクチンＣＤ－９、及びワクチンＣＤ－８を得、それぞれ３－４点皮下注射により実験群１、実験群２、実験群３、実験群４のマウスに注射し、ＫＬＨを無菌生理食塩水に溶解し、濃度１ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ溶液を得、このＫＬＨ溶液と水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）を体積比１０：１で混合し、ＫＬＨ混合液を得、３－４点皮下注射により対照群のマウスに投与した。実験群１～４のマウス１匹あたりの注射用量はコンジュゲート換算で５０μｇ、対照群のマウス１匹あたりの注射用量はＫＬＨ換算で５０μｇとした。図１のＢに示すように、合計２回注射し、６週齢時に１回目のワクチン注射（０週目、すなわち０Ｗと表記）を行い、マウスの尾から採血して１回目の力価検出を行い、２週目に２回目のワクチン注射を行い、３、６、８、１０、１２、１４、１６週目にマウスの尾から採血して力価検出を行い、力価検出結果を図１のＣに示し、当該図から分かるように、４種類のワクチンでマウスを免疫した後、１２週以上持続する抗体力価を発生することができた。
上記ワクチン力価の検出方法は以下の通りであった。（１）コーティングされたＥＬＩＳＡプレートの各ウェル内に異なる倍比の希釈度の実験群１～４のマウス血清を１００μｌ加え、対照群のマウス血清サンプルを加え、３７℃で１．５時間インキュベートした。（２）ＰＢＳＴで洗浄して５回軽くたたいて乾かし、希釈後のＨＲＰ標識二次抗体を１００μｌ加え、３７℃で０．５時間インキュベートした。（３）ＰＢＳＴで洗浄して５回軽くたたいて乾かし、各ウェルにＴＭＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、品番４２１１０６）を１００μｌ加え、対照ウェルが青くなる時に、各ウェルに希塩酸を１００μｌ加えて停止し、マイクロプレートリーダでＡ４５０吸収値を読み取り、実験群１～４マウスの血清の読み取り値が対照群のマウスの血清読み取り値より２．１倍大きい最大希釈倍数を算出した。ここで、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートは、ＢＳＡ－ＣＰ９をコーティング抗原としたもの、ＢＳＡ－ＤＰ９をコーティング抗原としたもの、ＢＳＡ－ＣＤ９をコーティング抗原としたもの、ＢＳＡ－ＣＤ８をコーティング抗原としたものという４種類であった。ＢＳＡ－ＣＰ９、ＢＳＡ－ＤＰ９、ＢＳＡ－ＣＤ９、ＢＳＡ－ＣＤ８は、短いペプチド（ＣＰ９、ＤＰ９、ＣＤ９又はＣＤ８）とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とをステップ２の結合法により結合させたコンジュゲートである。ＥＬＩＳＡプレートのコーティング方法は以下の通りであった。（１）コーティング抗原の濃度が１５μｇ／ｍｌになるようにｐＨ９．６の炭酸塩コーティング緩衝液でコーティング抗原を溶解し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、品番４２３５０１）に加え、４℃で一晩放置した。（２）翌日、コーティング液を捨てて軽くたたいて乾かし、各ウェルに１％ＢＳＡ（Ｓｏｌａｒｂｉｏから購入、品番Ａ８０２０－１００）を１２０μｌ加え、３７℃で１．５時間ブロックし、捨てて軽くたたいて乾かした。
実施例２、結紮モデルによる新生内膜形成に対するワクチンＤＰ－９及びワクチンＣＤ－９による抑制
１、免疫後マウスの左総頸動脈結紮モデルの作成
実験マウスとして体重２１～２３ｇの６週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（北京大学医学部動物部から購入）合計４０匹を、実験群１、実験群２、実験群３、実験群４、対照群の５群にランダムに分け、１群ごとに８匹とした。
実施例１のステップ２で得られた４種類のコンジュゲート乾燥粉末（ＫＬＨ－ＣＰ９、ＫＬＨ－ＤＰ９、ＫＬＨ－ＣＤ９、ＫＬＨ－ＣＤ８）をそれぞれ無菌生理食塩水に溶解し、それぞれ濃度１ｍｇ／ｍＬの４種類のコンジュゲート溶液を得た。４種類のコンジュゲート溶液のそれぞれを、水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）と体積比１０：１で混合して、４種類のワクチン（ワクチンＣＰ－９、ワクチンＤＰ－９、ワクチンＣＤ－９、及びワクチンＣＤ－８）を得、それぞれ３－４点皮下注射により実験群１、実験群２、実験群３、実験群４のマウスに注射し、ＫＬＨを無菌生理食塩水に溶解し、濃度１ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ溶液を得、このＫＬＨ溶液と水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）を体積比１０：１で混合し、ＫＬＨ混合液を得、３－４点皮下注射により対照群のマウスに投与した。実験群１～４のマウス１匹あたりの注射用量はコンジュゲート換算で５０μｇ、対照群のマウス１匹あたりの注射用量はＫＬＨ換算で５０μｇとした。図２のＡに示すように、６週齢時に１回目のワクチン注射（０週目、すなわち０Ｗと表記）を行い、マウスの尾から採血して１回目の力価と体重の測定を行い、２週目に２回目のワクチン注射を行い、３週目にマウスの尾から採血して２回目の力価検出を行い、ここで、力価検出方法は実施例１と同様であった。図２のＢに示すように、３週目に免疫反応を起こしたマウスには、左総頸動脈結紮実験（すなわち、モデル作成）を行う準備ができている。すなわち、実験前に、１％ペントバルビタール１５０μｌを腹腔内注射し、６－０縫合糸（ＨＡＲＶＥＹＢＩＯから購入、品番ＦＸ－６－０）を用いて総頸動脈分岐付近で結紮を行った。モデルを作成してから４週間後（すなわち７周目）、マウスの尾から採血して３回目の力価検出を行った。ワクチン力価の結果を図２のＢに示し、当該図から分かるように、４種類のワクチンで免疫したマウスでは、３週間及び７週間後、全て高い抗体力価が生成された。
２、内膜新生の抑制
モデルを作成してから４週間後、固定して材料を採取し、すなわち、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、ＯＣＴ（米国桜社から購入、品番４５８３）ゲルに包埋し、凍結切片まで－８０℃で保存した。凍結切片は、結紮したところから２００μｍ、３５０μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、及び２ｍｍの６箇所の切片を残し、切片１枚あたり７μｍとし、その後、ＨＥ染色を行い、マウスの群ごとの染色結果を図２のＣに示し、新生内膜面積、中膜面積に対する新生内膜面積の比、外弾性板周長、及び中膜面積の４つの指標を計算し、図２のＤ、Ｅ、Ｆ、及びＧに示すように、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して統計した結果、総頸動脈結紮マウスは、ワクチンＤＰ－９（図中の「ＤＰ－９」で表す）及びＣＤ－９（図中の「ＣＤ－９」で表す）を注射した後、対照群（図中の「ＫＬＨ」で表す）のマウスと比較して、血管新生内膜面積及び中膜面積に対する内膜面積の比が有意に低下し、また、ＣＰ－９（図中の「ＣＰ－９」で表す）及びＣＤ－８（図中の「ＣＤ－８」で表す）を注射したマウスは、血管新生内膜面積及び中膜面積に対する内膜面積の比が、対照群（図中の「ＫＬＨ」で表す）と比較して、統計的に有意差が認められなかった。このため、ワクチンＤＰ－９及びワクチンＣＤ－９は、結紮モデルによる新生内膜形成を抑制するのに顕著な効果を有した。
実施例３、ガイドワイヤ引掻きモデルによる新生内膜形成に対するワクチンＤＰ－９及びワクチンＣＤ－９による抑制
１、免疫後マウスのガイドワイヤ引掻きモデルの作成
実験マウスとして体重２１～２３ｇの６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（北京大学医学部動物部から購入）合計３０匹を、実験群１、実験群２、実験群３、実験群４、及び対照群の５群にランダムに分け、１群ごとに６匹とした。
実施例１のステップ２で得られた４種類のコンジュゲート乾燥粉末（ＫＬＨ－ＣＰ９、ＫＬＨ－ＤＰ９、ＫＬＨ－ＣＤ９、ＫＬＨ－ＣＤ８）をそれぞれ無菌生理食塩水に溶解し、それぞれ濃度１ｍｇ／ｍＬの４種類のコンジュゲート溶液を得た。４種類のコンジュゲート溶液のそれぞれを、水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）と体積比１０：１で混合して、４種類のワクチン、すなわち、ワクチンＣＰ－９、ワクチンＤＰ－９、ワクチンＣＤ－９、及びワクチンＣＤ－８を得、それぞれ３－４点皮下注射により実験群１、実験群２、実験群３、実験群４のマウスに注射し、ＫＬＨを無菌生理食塩水に溶解し、濃度１ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ溶液を得、このＫＬＨ溶液と水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）を体積比１０：１で混合し、ＫＬＨ混合液を得、３－４点皮下注射により対照群のマウスに注射した。実験群１～４のマウス１匹あたりの注射用量はコンジュゲート換算で５０μｇ、対照群のマウス１匹あたりの注射用量はＫＬＨ換算で５０μｇとした。図３のＡに示すように、６週齢時に１回目のワクチン注射（０週目、すなわち０Ｗと表記）を行い、マウスの尾から採血して１回目の力価と体重測定を行い、２週目に２回目のワクチン注射を行い、３週目にマウスの尾から採血して２回目の力価検出を行い、ここで、力価検出方法は実施例１と同様であった。図３のＢに示すように、免疫反応を引き起こした後のマウスは、左総頸動脈ガイドワイヤ引掻き実験（すなわちモデル作成）を行う準備ができている。すなわち、実験前、１％ペントバルビタールナトリウムを１５０μｌ腹腔内注射し、頚部皮膚を消毒した後、頚部の前正中切開を行い、頚外動脈を結紮し、血管クリップで頚内動脈と総頸動脈の血流を一時的に遮断した。マイクロベンネスはさみで外頸動脈の遠心端に近い結紮箇所を斜めにカットし、直径０．３８ｍｍの金属ガイドワイヤを挿入し、回転しながら５回で進退し血管壁を摩擦し、総頸動脈損傷を引き起こした。ガイドワイヤを引き込んで、動脈切開の近心端を結紮し、皮膚を縫合した。モデルを作成してから４週間後（すなわち７周目）に、マウス尾から採血して３回目の力価検出を行った。ワクチン力価の結果を図３のＢに示し、当該図から分かるように、ワクチンＣＰ－９とＤＰ－９はマウスを免疫した後に高い抗体力価を産生できた。
２、内膜新生の抑制
モデルを作成してから４週間後、固定して材料を採取し、すなわち、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、ＯＣＴ（米国桜社から購入、品番４５８３）ゲルに包埋し、凍結切片まで－８０℃で保存した。凍結切片は、結紮したところから２００μｍ、３５０μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍの６箇所の切片を残し、切片１枚あたり７μｍとした。その後、ＨＥ染色を行い、マウスの群ごとの染色結果を図３のＣに示し、新生内膜面積、中膜面積に対する内膜面積の比、外弾性板周長、及び中膜面積の４つの指標を計算し、図３のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇに示すように、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して統計した結果、総頸動脈ガイドワイヤ引掻きマウスは、ワクチンＤＰ－９（図中の「ＤＰ－９」で表す）及びＣＤ－９（図中の「ＣＤ－９」で表す）を注射した後、対照群（図中の「ＫＬＨ」で表す）のマウスと比較して、新生内膜面積、及び中膜面積に対する内膜面積の比が有意に低下した。このため、ワクチンＤＰ－９及びワクチンＣＤ－９は、ガイドワイヤ引掻きモデルによる新生内膜形成を抑制するのに顕著な効果を有した。
実施例４、ＬＤＬＲ－／－マウスの高脂肪給餌によるアテローム性動脈硬化症の形成に対するワクチンＤＰ－９による抑制
１、アテローム性動脈硬化症モデルの作成
実験マウスとして体重２３～２５ｇの８週齢のＬＤＬＲ－／－雄マウス（北京大学医学部動物部から購入）合計１８匹を、実験群１、実験群２、及び対照群の３群にランダムに分け、１群ごとに６匹とした。
実施例１のステップ２で得られた２種類のコンジュゲート乾燥粉末（ＫＬＨ－ＤＰ９、ＫＬＨ－ＣＤ９）をそれぞれ無菌生理食塩水に溶解し、濃度１ｍｇ／ｍＬのコンジュゲート溶液を２種類得た。２種類のコンジュゲート溶液と水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）を体積比１０：１で混合し、２種類のワクチン（ワクチンＤＰ－９、ワクチンＣＤ－９）を得、それぞれ３－４点皮下注射により実験群１、実験群２のマウスに注射し、ＫＬＨを無菌生理食塩水に溶解し、濃度１ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ溶液を得、このＫＬＨ溶液と水酸化アルミニウムアジュバント（ＨＥＡＲＴから購入、品番ＢＦ０４０）を体積比１０：１で混合し、ＫＬＨ混合液を得、３－４点皮下注射により対照群のマウスに投与した。実験群１と実験群２のマウス１匹あたりの注射用量はコンジュゲート換算で５０μｇ、対照群のマウス１匹あたりの注射用量はＫＬＨ換算で５０μｇとした。図４のＡに示すように、８週齢時に１回目のワクチン注射（０週目、すなわち０Ｗと表記）を行い、２、４、１２、１５週目にワクチン注射をそれぞれ行い、４週目から１８週目まで継続してアテローム性動脈硬化症食（高脂肪食、飼料はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓから購入、品番：Ｄ１２１０８Ｃ、主成分の含有量はコレステロール１．２５％、脂肪４０ｋｃａｌ％）を行った。そして、３、９、１３、１８週目にワクチン力価検出と体重検出を行い、ここで、力価の検出方法は実施例１と同様であった。図４のＢ及びＣに示すように、ワクチンＣＤ－９及びＤＰ－９は、マウスを免疫した後に高い抗体力価を産生することができ、しかも１８週目にも高い抗体力価を検出できることが示された。
２、アテローム性動脈硬化症の形成の抑制
顕微鏡下、顕微機器を使ってマウスの血管全体を剥ぎ取り、その後４％パラホルムアルデヒドで６ｈ固定し、次に、６０％イソプロピルアルコールで５分間浸漬し、その後、遮光条件でオイルレッドＯで３０分、染色し、その後、６０％イソプロパノール液体にて皮膚の色を洗い流し、引き続き、顕微鏡下、外膜の脂肪を剥ぎ取り、きれいに剥ぎ取った後、マイクロハサミで血管を縦方向に切り開き、その後、同じステップを繰り返し、６０％イソプロパノールで５分、浸漬し、その後、遮光条件でオイルレッドＯで３０分、染色し、その後、６０％イソプロパノール液体にて皮膚の色を洗い流した。最後に、染色した血管をプレートに固定し、概略図を得て、図４のＤに示すように、対照群、実験群１、実験群２は全てアテローム性動脈硬化プラークが形成された。Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用してプラークの面積を統計した結果、対照群（図中の「ＫＬＨ」で表す）のプラーク面積を１とすると、実験群２（図中の「ＣＤ－９」で表す）と実験群１（図中の「ＤＰ－９」で表す）の相対プラーク面積を計算した結果、対照群（図中の「ＫＬＨ」で表す）と比較して、実験群１（図中の「ＤＰ－９」で表す）の相対プラーク面積は有意に減少し（ｐ＜０．００１）、実験群２（図中の「ＣＤ－９」で表す）の相対プラーク面積は差がなく（ｐ＞０．０５）、このことから、ワクチンＤＰ－９はアテローム性動脈硬化プラークの形成を有意に抑制し、ワクチンＣＤ－９は対照群ＫＬＨと比較して有意差がなかった。
本発明では、以下の統計学的手法を用いて分析を行った。（１）正規分布の連続ランダム変数は平均±標準偏差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）として表される。（２）ペアデータは、全て対応のあるｔ検定（両側検定）を使用する。（３）非ペアデータは、スチューデントのｔ検定（両側検定）を使用する。（４）多群間の単一要因の結果比較を行う場合、単一要因分散分析を使用し、さらに群間の２つずつの比較を行う場合、Ｓｔｕｄｅｎｔ－Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ検定を使用する。（５）複数群間の２要因結果比較を行う場合、２要因分散分析を使用し、さらに群間の２つずつの比較を行う場合、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用する。
以上、本発明について詳述した。当業者にとっては、本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく、また、不必要な実験を行うことなく、同様のパラメータ、濃度及び条件で、より広い範囲で本発明を実施することができる。本発明は特定の実施例を示しているが、本発明はさらに改良されてもよいと理解されるべきである。要するに、本発明の原理によれば、本願は、本願において開示されている範囲から逸脱しているが、当該技術において知られている従来技術による変更を含む、本発明の任意の変更、使用や本発明の改良を含むことを意図している。以下の添付の特許請求の範囲に応じて、いくつかの基本的特徴の適用を行うことができる。
１、本発明によりスクリーニングされたメタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ－７の短いペプチドは、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス、ＡｐｏＥ－／－マウスにおいて特異的な免疫応答を引き起こし、メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ－７の触媒ドメインに特異的に結合し、その加水分解酵素の活性を遮断することができる、短いペプチドに対する特異的抗体を産生することができる。
２、本発明により製造されたワクチンは、血管再狭窄マウスモデル（すなわち、結紮モデル及びガイドワイヤ引掻きモデル）の内膜新生、及び高脂肪食飼育マウスのアテローム性動脈硬化症の発生を有意に抑制することができ、アテローム性動脈硬化症及び／又は血管再狭窄症の予防又は治療に有用である。
３、本発明のワクチンの製造過程で使用するヘテロ二機能性架橋剤は、２種類の基を同時に連結できる特徴があり、しかも、異なる基は２段階で順に連結することができ、操作が簡単で、効率的である。

Claims (8)

  1. 以下のＡ１）～Ａ４）のいずれかである、ことを特徴とする短いペプチド：
    Ａ１）アミノ酸配列が配列表の配列１に示される短いペプチド、
    Ａ２）アミノ酸配列が配列表の配列２に示される短いペプチド、
    Ａ３）アミノ酸配列が配列表の配列３に示される短いペプチド、
    Ａ４）アミノ酸配列が配列表の配列４に示される短いペプチド。
  2. 請求項１に記載の短いペプチドとキャリアタンパク質とを結合させた完全抗原である、ことを特徴とする請求項１に記載の短いペプチドのコンジュゲート。
  3. 前記キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、組換えＱβファージ粒子タンパク質、組換えウシパピローマウイルスタンパク質、組換えＢ型肝炎ウイルスタンパク質、又は破傷風トキソイドである、ことを特徴とする請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 以下のいずれかである、ことを特徴とする使用：
    Ｐ１）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における請求項１に記載の短いペプチドの使用、
    Ｐ２）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における請求項２に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ３）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における請求項３に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ４）血管再狭窄を予防又は治療する製品の製造における請求項１に記載の短いペプチドの使用、
    Ｐ５）血管再狭窄を予防又は治療する製品の製造における請求項２に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ６）血管再狭窄を予防又は治療する製品の製造における請求項３に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ７）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における請求項１に記載の短いペプチドの使用、
    Ｐ８）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における請求項２に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ９）アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する製品の製造における請求項３に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ１０）損傷動脈の新生内膜面積を減少させる製品の製造における請求項１に記載の短いペプチドの使用、
    Ｐ１１）損傷動脈の新生内膜面積を減少させる製品の製造における請求項２に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ１２）損傷動脈の新生内膜面積を減少させる製品の製造における請求項３に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ１３）損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる製品の製造における請求項１に記載の短いペプチドの使用、
    Ｐ１４）損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる製品の製造における請求項２に記載のコンジュゲートの使用、
    Ｐ１５）損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる製品の製造における請求項３に記載のコンジュゲートの使用。
  5. アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させるワクチンであって、
    請求項２又は３に記載のコンジュゲートを含む、ことを特徴とするワクチン。
  6. 請求項２又は３に記載のコンジュゲートと、免疫アジュバントとからなる、ことを特徴とする請求項５に記載のワクチン。
  7. アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる製品の製造における、請求項５又は６に記載のワクチンの使用。
  8. アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させる方法であって、
    アテローム性動脈硬化症を予防又は治療する、及び／又は血管再狭窄を予防又は治療する、及び／又は損傷動脈の新生内膜面積を減少させる、及び／又は損傷動脈の中膜面積に対する内膜面積の比を減少させるために、請求項２又は３に記載のコンジュゲート又は請求項５又は６に記載のワクチンを動物に投与することを含む、ことを特徴とする方法。
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