RU2799526C1 - Иммуногенный пептидный фрагмент металлопротеиназы ADAMTS-7 и его применение в противодействии атеросклерозу и родственным заболеваниям - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пептиду для индуцирования иммунного ответа против ADAMTS-7, а также к содержащему его конъюгату и вакцине. Изобретение эффективно для предупреждения или лечения атеросклероза, а также для уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях и/или отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях. 10 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к иммуногенным пептидным фрагментам металлопротеиназы ADAMTS-7 и их применениям против атеросклероза и родственных заболеваниях.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Коронарная болезнь сердца известна как "убийца номер один для человека" ввиду ее высокой распространенности и высокой смертности, что серьезно угрожает здоровью человека. Главной причиной коронарной болезни сердца является атеросклероз коронарной артерии, и его патологический процесс обусловлен аномальным накоплением липидов в стенке сосуда, что приводит к повреждению эндотелиальных клеток стенки сосуда, пролиферации и миграции гладкомышечных клеток сосуда, инфильтрации воспалительных клеток и т.д., и затем к образованию бляшек, выступающих в просвет, что приводит к стенозу просвета и недостаточному кровоснабжению.

Лечение коронарной болезни сердца в настоящее время сосредоточено на следующих трех стратегиях: (1) лекарственная терапия; цель которой заключается в облегчении симптомов, уменьшении возникновения стенокардии и инфаркта миокарда, задержке развития коронарных атеросклеротических повреждений и снижении смертности от коронарной болезни сердца; липид-понижающие лекарственные средства, такие как статины, снижают сердечно-сосудистые явления на 25%, но также повышают риск впервые выявленного диабета; появление эзетимиба или mAb к PCSK9 (пропротеиновая конвертаза субтилизин-кексинового типа 9) принесло новую надежду, но они по-прежнему сосредоточены на стратегии вмешательств для снижения уровней липидов; однако, исходя из современного уровня медицины, не существует лекарственного средства, которое может вылечить коронарную болезнь сердца, и лечение коронарной болезни сердца фактически направлено, главным образом, на контроль состояния заболевания коронарной болезни сердца, чтобы избежать ухудшения заболевания до возникновения осложнений; (2) чрескожное коронарное вмешательство (PCI); в процессе чрескожной транслноминальной коронарной ангиопластики (РТСА) специально разработанный балонный катетер доставляется через периферической артерии (бедренной или лучевой артерии) в участок стеноза коронарной артерии и потом баллон надувают для расширения суженного просвета и улучшения кровотока, и стент помещают в расширенный участок стеноза для предупреждения рестеноза; однако, по-прежнему существуют риски нарушения нормальной работы стента, включая тромбоз стента (ST) и внутристентовый рестеноз (ISR); тромбоз стента представляет собой серьезное клиническое осложнение и даже может приводить к повышению числа инфарктов миокарда в сегменте образования тромбов с коэффициентом смертности до 20% - 40%; возникновение внутристентового рестеноза оказывает огромное влияние на долгосрочный прогноз после PCI; при нормальном барьере эндотелиальных клеток артериальная стенка может избежать отложения липидов; однако стенты, элюирующие лекарственное средство, могут вызывать структурное и функциональное нарушение эндотелиальных клеток, которое приводит к замедленному заживлению эндотелия и к тенденции к образованию нового атеросклероза. Кроме того, артериальное шунтирование и минимально инвазивные технологии при повторном хирургическом лечении не подходят для лечения большей части рестеноза сосудов из-за сложности оперативного вмешательства и серьезного повреждения. Следовательно, крайне необходимы новые способы предупреждения рестеноза и тромбоза после дилатации.

Поскольку эффект от стента и операции шунтирования не полностью удовлетворял лечащих врачей и пациентов, ученые-медики со всего мира начали изучать причины коронарной болезни сердца и рестеноза сосудов. В последние годы проявлялся большой интерес к разработке вакцины против атеросклероза. В 1983 году доктор Иштван Хорват из Венгрии первым обнаружил существование антитела к холестерину в нормальном организме человека и разработал вакцину на основе антигена к холестерину. В 2002 году она была одобрена Венгерским национальным управлением здравоохранения и включена в клинические исследования с участием людей. Почти десятилетие, на текущий момент, более 40000 пациентов получили лечение, и были достигнуты значительные результаты, позволяющие человечеству сделать важный шаг в области заболеваний сердечно-сосудистой системы. После разработки доктором Иштваном Хорватом вакцины для иммунизации против холестерина в 1983 году, ученые Каролинского института в Швеции разработали вакцину против холестерина, которая может предупреждать повреждение артерий от холестерина и снижать частоту возникновения сердечного заболевания на две трети. Кроме того, моноклональные антитела или вакцины на основе коротких пептидов, нацеленные на патогенный LDL (липопротеин низкой плотности) аполипо протеин АроВ100 и LDLR (рецептор липопротеинов низкой плотности)) - расщепляющий фермент PCSK9, были разработаны одни за другими, и ведутся предварительные эксперименты на животных моделях и доклиническая валидация. Наиболее вероятно, что для лечения людей в ближайшем будущем будет одобрено моноклональное антитело (REGN727) против пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9), и результаты фазы I клинических исследований показали, что низкие дозы REGN727 могут снижать уровень LDL у пациентов более чем на 30%. Для пациентов, которые не могут переносить терапию статинами, REGN727 имеет широкие перспективы клинического применения. Кроме того, вакцины на основе коротких пептидов, разработанные для воздействия на аполипопротеин АроВ100, показали некоторый антиатеросклеротический эффект у экспериментальных животных. Все эти достижения показывают, что разработка и конструирование вакцин на основе коротких пептидов против конкретных мишеней и продуцированные соответствующие моноклональные антитела имеют потенциальную значимость для предупреждения и лечения заболеваний.

ADAMTS-7 (дезинтегрин-подобный и металлопротеиназа-7, дезинтегрин-подобный и металлопротеиназа-7 с мотивом тромбоспондина типа I) представляет собой новую металлопротеиназу, клонированную в 2004, и принадлежит к семейству Zn²⁺-зависимых металлопротеиназ. Семейство дезинтегрин-подобных и металлопротеиназ (ADAMTS) человека, содержащее мотив тромбоспондина (TSP) типа I, состоит из 19 секретируемых мультидомеиных металлопротеиназ с «цинковыми пальцами», которые могут расщеплять компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ), включая проколлаген, протеогликаны и олигомерный матриксный белок хряща (СОМР). Протеазы ADAMTS играют важную роль в обновлении компонентов внеклеточного матрикса в различных тканях, и аномальная экспрессия этих ферментов обычно тесно связана с воспалительными патологическими процессами, такими как опухоли и ревматоидный артрит. Используя сайленсинг малыми интерферирующими РНК, аденовирусную сверхэкспрессию ADAMTS-7 и конструирование животных моделей с нокаутом гена ADAMTS-7, обнаружили, что металлопротеиназа ADAMTS-7 стимулирует миграцию гладкомышечных клеток сосудов и образование неоинтимы после повреждения сосудов в результате расщепления олигомерного матриксного белка хряща(СОМР) (Wang, L. et al. Adamts-7 mediates vascular smooth muscle cell migration and neointima formation in balloon-injured rat arteries. Circ Res. 2009; 104: 688-698), и также было обнаружено, что ADAMTS-7 ингибирует восстановление эндотелия с помощью TSP-1,25, обеспечивая таким образом образование неоинтимы за счет двойного механизма (Kessler Т, Zhang L. et al. Adamts-7 inhibits re-endothelialization of injured arteries and promotes vascular remodeling through cleavage thrombospondin-1. Circulation. 2015; 131:1191-1201).

В настоящее время отсутствуют сообщения об эффективной пептидной вакцине, относящейся к ADAMTS-7.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача, подлежащая решению посредством настоящего изобретения, заключается в том, как получить иммуногенный пептидный фрагмент металлопротеиназы ADAMTS-7 для предупреждения или лечения атеросклероза и/или рестеноза сосудов.

Для решения указанной выше технической задачи в настоящем изобретении впервые предложен короткий пептид, и этот короткий пептид представляет собой любой из следующих от А1) до А4):

А1) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 в перечне последовательностей;

А2) короткий пептид имеющий, аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2 в перечне последовательностей;

A3) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3 в перечне последовательностей;

А4) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 в перечне последовательностей.

Конкретно, короткий пептид представляет собой следующий А1) или А2):

А1) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 в перечне последовательностей;

А2) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2 в перечне последовательностей.

Более конкретно, короткий пептид представляет собой короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 в перечне последовательностей.

Применение указанного выше короткого пептида также попадает в рамки объема правовой защиты настоящего изобретения.

Применение указанного выше короткого пептида по настоящему изобретению включает любое из следующих от В1) до В4):

B1) в получении продуктов для предупреждения или лечения атеросклероза;

B2) в получении продуктов для предупреждения или лечения рестеноза сосудов;

B3) в получении продуктов для уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях;

B4) в получении продуктов для уменьшения отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях.

В указанном выше применении, продукт может представлять собой лекарственное средство, реагент или вакцину и т.д.

В настоящем изобретении дополнительно предложен конъюгат указанного выше короткого пептида, где конъюгат представляет собой полный антиген, полученный посредством связывания указанного выше короткого пептида и белка-носителя.

В указанном выше конъюгате белок-носитель может представлять собой гемоцианин лимфы улитки, рекомбинантный белок частиц фага Qβ, рекомбинантный белок вируса папилломы крупного рогатого скота, рекомбинантный белок вируса гепатита В или столбнячный анатоксин.

В указанном выше конъюгате связывающий агент, используемый в связывании, представляет собой гетеробифункциональный сшивающий агент; конкретно, гетеробифункциональный сшивающий агент может представлять собой SMCC (сукцинимидил-4- (N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат), сульфо-SMCC или LC-SMCC (длинноцепочечный SMCC).

Применение указанного выше конъюгата также находится в рамках объема правовой защиты настоящего изобретения.

Применение указанного выше конъюгата по настоящему изобретению включает любое из следующих от В1) до В4):

B1) в получении продуктов для предупреждения или лечения атеросклероза;

B2) в получении продуктов для предупреждения или лечения рестеноза сосудов;

B3) в получении продуктов для уменьшения площади неоинтимы поврежденных артерий;

В4) в получении продуктов для уменьшения отношение площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях.

В указанном выше применении продукт может представлять собой лекарственное средство, реагент или вакцину, и т.д.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается вакцина для предупреждения или лечения атеросклероза, и/или предупреждения или лечения рестеноза сосудов, и/или уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях, и/или уменьшения отношения площади неоинтимы к площади неомедиа в поврежденных артериях.

Указанная выше вакцина содержит конъюгат, полученный путем связывания короткого пептида в любом из следующих от А1) до А4) с белком-носителем:

А1) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 в перечне последовательностей;

А2) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2 в перечне последовательностей;

A3) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3 в перечне последовательностей;

А4) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 в перечне последовательностей.

В указанной выше вакцине белок-носитель может представлять собой гемоцианин лимфы улитки (KLH), рекомбинантный белок частиц фага Qβ, рекомбинантный белок вируса папилломы крупного рогатого скота, рекомбинантный белок вируса гепатита В или столбнячный анатоксин.

В указанной выше вакцине также содержится иммунный адъювант.

В указанной выше вакцине иммунный адъювант может представлять собой, без ограничения ими, адъювант на основе гидроксида алюминия, квасцовый адъювант или адъювант Фрейнда.

Применение указанной выше вакцины в получении продуктов для предупреждения или лечения атеросклероза, и/или предупреждения или лечения рестеноза сосудов, и/или уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях, и/или уменьшения отношения площади неоинтимы к площади неомедиа в поврежденных артериях также находится в рамках объема правовой защиты настоящего изобретения.

В указанном выше применении продукт может представлять собой лекарственное средство или реагент.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ предупреждения или лечения атеросклероза, и/или предупреждения или лечения рестеноза сосудов, и/или уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях, и/или уменьшения отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях.

Способ по настоящему изобретению для предупреждения или лечения атеросклероза, и/или предупреждения или лечения рестеноза сосудов, и/или уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях, и/или уменьшения отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях включает стадию введения указанного выше конъюгата или указанной выше вакцины животному для предупреждения или лечения атеросклероза, и/или предупреждения или лечения рестеноза сосудов, и/или снижения площади неоинтимы в поврежденных артериях и/или снижения отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях.

Указанный выше короткий пептид по настоящему изобретению содержит первый сайт присоединения, и может связываться по меньшей мере со вторым сайтом присоединения белка-носителя посредством по меньшей мере одной ковалентной связи. Рекомбинантный белок частиц фага Qβ, рекомбинантный белок вируса папилломы крупного рогатого скота, рекомбинантный белок вируса гепатита В, гемоцианин лимфы улитки и столбнячный анатоксин используют в качестве белков-носителей, и такие белки-носители имеют по меньшей мере один второй сайт присоединения. Предпочтительно, второй сайт присоединения содержит аминогруппу, карбоксильную группу и сульфгидрильную группу и конкретно выбран из остатков лизина, остатков аргинина, остатков глутаминовой кислоты, остатков аспарагиновой кислоты и остатков цистеина. Короткий пептид ADAMTS-7 конъюгировали с указанным выше белком-носителем, используя гетеробифункциональный сшивающий агент, с образованием вакцины на основе регулярного и повторяющегося короткого пептида-носителя. Короткий пептид повторяется и экспонируется с определенной плотностью на носителе или поверхности с образованием дисплея с высокоантигенным чипом, который создает основу для образования высокоэффективных и специфических антител к иммуногенным пептидам человеческого и мышиного ADAMTS-7, которые могут эффективно блокировать гидролазную функцию ADAMTS-7 и значительно ингибировать интимальный неогенез в мышиных моделях рестеноза сосудов и возникновение атеросклероза у мышей, получавших корм с высоким содержанием жира.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1, панель А показывает аминокислотные последовательности иммуногенных пептидных фрагментов ADAMTS-7; панель В представляет собой схематическую диаграмму временных точек вакцинации ADAMTS-7-вакциной и временных точек определения титра; на панели С показаны результат определения титра ADAMTS-7-вакцин.

На Фиг. 2, панель А представляет собой схематическую диаграмму временных точек вакцинации ADAMTS-7-вакциной, временных точек определения титра и временной точки операции по лигированию общей сонной артерии; на панели В показаны результаты определения титра ADAMTS-7-вакцин; на панели С показаны результаты окрашивания НЕ (гематоксилином и эозином); на панели D показаны площади неоинтимы в мышиной модели лигирования; на панели Е показаны отношения площади неоинтимы к площади медиа в мышиной модели лигирования; на панели F показаны периметры внешних эластичных пластин (то есть внешние периметры) в мышиной модели лигирования; на панели G показаны площади медиа в мышиной модели лигирования.

На Фиг. 3 панель А представляет собой схематическую диаграмму временных точек вакцинации ADAMTS-7-вакциной, временных точек определения титра и момента времени операции по повреждению проводника; на панели В показаны результаты определения титра ADAMTS-7-вакцин; на панели С показаны результаты окрашивания НЕ; на панели D показаны площади неоинтимы в мышиной модели с повреждением проводника; на панели Е показаны отношения площади неоинтимы к площади медиа в мышиной модели с повреждением проводника; на панели F показаны периметры внешних эластичных пластин (то есть внешние периметры) в мышиной модели с повреждением проводника; на панели G показаны площади медиа в мышиной модели с повреждением проводника.

На Фиг. 4 панель А представляет собой схематическую диаграмму временных точек вакцинации ADAMTS-7-вакциной, моменты времени определения титра и временные точки диеты с высоким содержанием жира; на панели В показаны результаты определения титра ADAMTS-7-вакцин; на панели С показаны результаты измерения массы тела мышей; на панели D показаны площадей бляшек в мышиной модели атеросклероза (контрольная группа, экспериментальная группа 1 и экспериментальная группа 2 слева направо); на панели Е показаны статистические результаты для площадей бляшек в мышиной модели атеросклероза.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже настоящее изобретение дополнительно подробно описано со ссылкой на конкретные воплощения, и данные примеры используются только для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Все экспериментальные способы в следующих примерах представляют собой общепринятые способы, если не указано иное.

Все вещества и реагенты, используемые в следующих примерах, имеются в продаже, если не указано иное.

Пример 1. Получение ADAMTS-7-вакцин и определение титра

1. Скрининг иммуногенных пептидных фрагментов металлопротеиназы ADAMTS-7

ADAMTS7 связывается главным образом с СОМР и затем расщепляет его, тем самым обеспечивая миграцию VSMC (гладкомышечные клетки сосудов) и образование сосудистой неоинтимы. В настоящем изобретении выбран каталитический домен и 4 TSP-1-подобный домен в качестве целевых участков для скрининга коротких пептидов. Посредством ввода аминокислотных последовательностей каталитического домена и 4 TSP-1-подобного домена в диалоговое окно IEDB В Cell Epitope Prediction (Прогнозирование В-клеточных эпитопов IEDB» (База данных иммунных эпитопов)) соответственно, были получены прогнозируемые баллы. Среди более высоких баллов, используя 8, 9, 10, 11 и 12 аминокислот в качестве единиц, выбирали короткие пептиды с более высокими общими баллами. Тем временем, аминокислотные последовательности указанных выше двух доменов вводили в диалоговое окно IEDB, и в качестве модели для прогнозирования эпитопа выбирали существующую кристаллическую структуру Adamts4 со связанным ингибитором (Crystal Structure Of Adamts4 With Inhibitor Bound), которая имеет наибольшее сходство с ADAMTS7. При комбинировании этих двух результатов, согласно результатам сравнения последовательностей молекул человеческого и мышиного ADAMTS7, выбирали предварительные последовательности коротких пептидов на основе стандарта по отсутствию различия более чем в 2 аминокислотах. Затем отобранные последовательности коротких пептидов выравнивали с последовательностями молекул белка семейства ADAMTS и другими последовательностями белков при помощи таких инструментов, как PIR Peptide Match и BLAST, и, по мере возможности, выбирали последовательности коротких пептидов с более низкой гомологией. На основе указанных выше принципов, были отобраны четыре иммуногенных пептидных фрагмента (четыре коротких пептида). Результаты показаны на Фиг. 1, панель А, и эти четыре иммуногенные пептидные фрагмента представляли собой, соответственно:

DP9: DCEPVGKRP (SEQ ID NO: 1)

CD9: CLDDPPAKD (SEQ ID NO: 2)

CP9: CNMKGDAHP (SEQ ID NO: 3)

CD8: CSSGRDED (SEQ ID NO: 4).

2. Получение конъюгатов

Четыре иммуногенных пептидных фрагмента конъюгировали, соответственно, с гемоцианином лимфы улитки (KLH), используя гетеробифункциональный сшивающий агент Sulfo-SMCC (приобретенный в Thermofisher, Item No.: 22122), и стадии были следующими: (1)2 мг Sulfo-SMCC агента взвешивали, полностью растворяли в 400 мкл чистой воды и затем добавляли к 20 мг KLH (10 мг/мл), тщательно перемешивали и помещали при комнатной температуре на 30 минут с получением активированного носителя; (2) активированный носитель добавляли в колонку для концентрирования 100К TFF (фильтрация с тангенциальным потоком) (Merck-Millipore), добавляли 50 мМ PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (содержащего 1 мм EDTA (этилендиаминтетерауксусная кислота), рН 7,2) и смесь центрифугировали 3 раза при 5000g для удаления свободного Sulfo-SMCC и получали очищенный носитель; (3) примерно 5 мг короткого пептида (DP9, CD9, СР9 или CD8) взвешивали, полностью растворяли в 1 мл 50 мм PBS (содержащего 1 мм EDTA, рН 7,2) и затем добавляли к очищенному носителю, проводили взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 часа и осторожно встряхивали каждые 20 минут с получением вакцинной смеси; (4) вакцинную смесь добавляли в колонку для концентрирования 100К TFF и центрифугировали три раза при 5000 g для удаления свободного и не прореагировавшего соответствующего короткого пептида.

В итоге, посредством указанной выше реакции связывания, получали четыре сухих порошковых конъюгата, то есть KLH-CP9 (конъюгат, полученный путем связывания СР9 и KLH), KLH-DP9 (конъюгат, полученный путем связывания DP9 и KLH), KLH-CD9 (конъюгат, полученный путем связывания CD9 и KLH) и KLH-CD8 (конъюгат, полученный путем связывания CD8 и KLH).

3. Определение титра

В общей сложности 40 экспериментальных мышей, самцов в возрасте 6 недель, C57BL/6 массой 21-23 г (приобретенных в Animal Department of Peking University Health Science Center), случайным образом разделяли на 5 групп по 8 мышей в каждой группе, а именно экспериментальную группу 1, экспериментальную группу 2, экспериментальную группу 3, экспериментальную группу 4 и контрольную группу.

Четыре сухих порошка конъюгатов, полученных на стадии 2, соответственно растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением четырех растворов конъюгатов с концентрацией 1 мг/мл. Четыре раствора конъюгатов соответственно смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением четырех вакцин, то есть вакцины CD-9, вакцины CP-9, вакцины CD-9 и вакцины CD-8. Четыре вакцины инъецировали мышам в экспериментальной группе 1, экспериментальной группе 2, экспериментальной группе 3 и экспериментальной группе 4 посредством подкожной инъекции в 3-4 точках соответственно. KLH растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением раствора KLH с концентрацией 1 мг/мл и раствор KLH смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением смеси с KLH. Смесью с KLH инъецировали мышей в контрольной группе посредством подкожной инъекции в 3-4 точках. Инъецированная доза для каждой мыши в экспериментальных группах 1-4 составляла 50 мкг (в расчете на конъюгат), и инъецированная доза для каждой мыши в контрольной группе составляла 50 мкг (в расчете на KLH). Как показано на Фиг. 1, панель В, выполняли всего две инъекции. Первую инъекцию вакцины выполняли в возрасте 6 недель (регистрируется как 0-ая неделя, то есть 0W) и отбирали кровь из мышиного хвоста для первого определения титра. Вторую инъекцию вакцины выполняли во 2-ую неделю, и в 3-ю, 6-ую, 8-ую, 10-ую, 12-ую, 14-ую и 16-ую неделю отбирали кровь из мышиного хвоста для определения титра. Результаты определения титра показаны на Фиг. 1, панель С.Из Фиг. 1 можно видеть, что после иммунизации мышей с помощью четырех вакцин могли генерироваться титры антител, сохраняющиеся на протяжении более 12 недель.

Метод определения титра указанных выше вакцин был следующим: (1) 100 мкл мышиной сыворотки от экспериментальных групп 1-4 разных удвоенных степеней разведения добавляли в каждую лунку покрытого планшета для ELISA и также добавляли мышиную сыворотку от контрольной группы; планшет инкубировали при 37° в течении 1,5 часов; (2) планшет промывали с помощью PBST (фосфатно-солевой буферный раствор с Твин 20) 5 раз и промакивали, добавляли 100 мкл разбавленного меченного HRP (пероксидаза хрена) вторичного антитела и инкубировали при 37° в течение 0,5 часов; (3) планшет промывали с помощью PBST 5 раз и промакивали, и 100 мкл ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (приобретенный в Biolegend, Item No.: 421106) добавляли в каждую лунку; когда контрольная лунка была готова посинеть, в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенной соляной кислоты для прекращения взаимодействия, измеряли коэффициент поглощения А450 с помощью микропланшетного ридера, и максимальную степень разведения вычисляли, когда данные для сыворотки мышей в экспериментальных группах 1-4 были в 2,1 раза больше данных для сыворотки мышей в контрольной группе. Среди них было 4 типа покрытых планшетов для ELISA, которые представляли собой планшет для ELISA с покрывающим антигеном BSA-CP9, планшет для ELISA с покрывающим антигеном BSA-DP9, планшет для ELISA с покрывающим антигеном BSA-CD9 и планшет для ELISA с покрывающим антигеном BSA-CD8. BSA-CP9, BSA-DP9, BSA-CD9 и BSA-CD8 были получены путем связывания коротких пептидов (СР9, DP9, CD9 или CD8) с бычьим сывороточным альбумином (BS А) согласно способу связывания на стадии 2. Способ покрытия планшета для ELISA был следующим: (1) покрывающий антиген растворяли в карбонатном покрывающем буфере (рН 9,6) до концентрации 15 мкг/мл, раствор покрывающего антигена добавляли в 96-луночный планшет для ELISA (приобретенный в Biolegend, Item No.: 423501) в объеме 100 мкл/лунка и планшет помещали при 4° на ночь; (2) на следующий день покрывающий раствор отбрасывали и протирали, 120 мкл 1% BS А (приобретенный в Solarbio, Item No.: А8020-100) добавляли в каждую лунку для блокирования при 37° в течение 1,5 часов и затем жидкость отбрасывали и планшет вытирали насухо.

Пример 2. Вакцина DP-9 и вакцина CD-9 ингибируют образование неоинтимы в модели лигирования

1. Создание модели перевязки левой общей сонной артерии у иммунизированных мышей

Всего 40 экспериментальных мышей, самцов в возрасте 6 недель, C57BL/6 массой 21-23 г (приобретенные в Animal Department of Peking University Health Science Center), случайным образом разделяли на 5 групп по 8 мышей в каждой группе, а именно в экспериментальную группу 1, экспериментальную группу 2, экспериментальную группу 3, экспериментальную группу 4 и контрольную группу.

Четыре сухих порошка конъюгатов (KLH-CP9, KLH-DP9, KLH-CD9 и KLH-CD8), полученных на стадии 2 в Примере 1, соответственно растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением четырех растворов конъюгатов с концентрацией 1 мг/мл. Четыре раствора конъюгатов соответственно смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением четырех вакцин, то есть вакцины СР-9, вакцины DP-9, вакцины CD-9 и вакцины CD-8. Четыре вакцины инъецировали мышам в экспериментальной группе 1, экспериментальной группе 2, экспериментальной группе 3 и экспериментальной группе 4 посредством подкожной инъекции в 3-4 точках соответственно. KLH растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением раствора KLH с концентрацией 1 мг/мл, и раствор KLH смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением смеси KLH. Смесь KLH инъецировали мышам в контрольной группе посредством подкожной инъекции в 3-4 точках. Инъецированная доза для каждой мыши в экспериментальных группах 1-4 составляла 50 мкг (в расчете на конъюгат), и инъецированная доза для каждой мыши в контрольной группе составляла 50 мкг (в расчете на KLH). Как показано на Фиг. 2, панель А, первую инъекцию вакцины выполняли в возрасте 6 недель (регистрируется как 0-ая неделя, то есть 0W) и отбирали кровь из мышиного хвоста для первого определения титра и выполняли измерение массы тела, и вторую инъекцию вакцины выполняли на 2-ой неделе и на 3-ей неделе, отбирали кровь из мышиного хвоста для второго определения титра, где способ определения титра был таким же, как в Примере 1. Как показано на Фиг. 2, панель В, мышей на 3-ей неделе после иммунизации подвергали эксперименту по лигированию левой общей сонной артерии (то есть моделированию): до эксперимента внутрибрюшинно инъецировали 150 мкл 1% пентобарбитала натрия, и лигирование выполняли около бифуркации общей сонной артерии, используя хирургическую нить 6-0 (приобретенная в HARVEYBIO, Item No.: FX-6-0). Через четыре недели после моделирования (то есть на 7-ую неделю) отбирали кровь из мышиного хвоста для третьего определения титра. Результаты титров вакцин показаны на Фиг. 2, панель В. На Фиг. 2 можно видеть, что четыре вакцины были способны продуцировать более высокие титры антител у мышей через 3 недели и 7 недель после иммунизации.

2. Ингибирование неоинтимы

Через четыре недели после моделирования образцы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи и затем погружали в гель ОСТ (гель для получения срезов при оптимальной температуре) (приобретенный в US SAKURA, Item No.: 4583) и хранили при -80°С для следующих замороженных срезов. Замороженные срезы готовили в шести положениях 200 мкм, 350 мкм, 500 мкм, 1 мм, 1,5 мм и 2 мм от участка лигирования, каждый срез составлял 7 мкм, и затем выполняли окрашивание НЕ. Результаты окрашивания для каждой группы мышей показаны на Фиг. 2, панель С. Вычисляли четыре показателя: площадь неоинтимы, отношение площади неоинтимы к площади медиа, внешний периметр эластичных пластин и площадь медиа. Результаты показаны на панелях D, Е, F и G на Фиг. 2 и для статистического анализа использовали программу Image Pro Plus: площадь неоинтимы сосуда и отношение площади интимы к площади медиа у мышей с лигированной общей сонной артерией после инъекции вакциной DP-9 (обозначена "DP-9" на Фиг. ) или CD-9 (обозначена "CD-9" на Фиг. ) были значительно ниже данных показателей в контрольной группе (обозначена "KLH" на фигуре); при этом не было статистически значимых различий в площади неоинтимы сосуда и отношения площади интимы к площади медиа у мышей, инъецированных вакциной СР-9 (обозначена "СР-9" на фигуре) или CD-8 (обозначена "CD-8" на фигуре) и таковых у контрольной группы (обозначена "KLH" на фигуре). Следовательно, вакцина DP-9 и вакцина CD-9 оказывают значительное влияние на ингибирование образования неоинтимы, вызванное в модели лигирования.

Пример 3. Вакцина DP-9 и вакцина CD-9 ингибируют образование неоинтимы в модели повреждения проводника

1. Создание модели повреждения проводника у иммунизированных мышей

Всего 30 экспериментальных мышей, самцов в возрасте 6 недель, C57BL/6 массой 21-23 г (приобретенные в Animal Department of Peking University Health Science Center), случайным образом разделяли на 5 групп по 6 мышей в каждой группе, а именно в экспериментальную группу 1, экспериментальную группу 2, экспериментальную группа 3, экспериментальную группу 4 и контрольную группу.

Четыре сухих порошка конъюгатов (KLH-CP9, KLH-DP9, KLH-CD9 и KLH-CD8), полученных на стадии 2 в Примере 1, соответственно растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением четырех растворов конъюгатов с концентрацией 1 мг/мл. Четыре раствора конъюгатов соответственно смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением четырех вакцин, то есть вакцины СР-9, вакцины DP-9, вакцины CD-9 и вакцины CD-8. Четыре вакцины инъецировали мышам в экспериментальной группе 1, экспериментальной группе 2, экспериментальной группе 3 и экспериментальной группе 4 посредством подкожной инъекции в 3-4 точках соответственно. KLH растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением раствора KLH с концентрацией 1 мг/мл, и этот раствор KLH смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением смеси KLH. Смесь KLH инъецировали мышам в контрольной группе посредством подкожной инъекции в 3-4 точках. Инъецированная доза для каждой мыши в экспериментальных группах 1-4 составляла 50 мкг (в расчете на конъюгата), и инъецированная доза для каждой мыши в контрольной группе составляла 50 мкг (в расчете на KLH). Как показано на Фиг. 3, панель А, первую инъекцию вакцины выполняли в возрасте 6 недель (регистрируется как 0-ая неделя, то есть 0W) и отбирали кровь из мышиного хвоста для первого определения титра и выполняли измерение массы тела, и вторую инъекцию вакцины выполняли во 2-ую неделю и в 3-ю неделю, отбирали кровь из мышиного хвоста для второго определения титра, где способ определения титра был такой же, как в Примере 1. Как показано на Фиг. 3, панель В, мышей после иммунизации подвергали эксперименту повреждения проводника левой общей сонной артерии (то есть моделированию): до эксперимента инъецировали внутрибрюшинно 150 мкл 1% пентобарбитала натрия; затем кожу шеи дезинфицировали, на шее выполняли передний срединный разрез, наружную сонную артерию лигировали, и кровоток внутренней сонной артерии и общей сонной артерии временно блокировали сосудистым зажимом; микроножницы VANNAS использовали для разрезания косого отверстия около участка лигирования дистального конца наружной сонной артерии, вставляли металлический проводник с диаметром 0,38 мм и прокручивали его вперед и назад 5 раз для стирания стенки сосуда, вызывая повреждение общей сонной артерии; проводник извлекали, проксимальный конец разреза артерии лигировали и кожу сшивали. Через четыре недели после моделирования (то есть на 7-ую неделю) отбирали кровь из мышиного хвоста для третьего определения титра. Результаты титров вакцин показаны на Фиг. 3, панель В. На фигуре можно видеть, что вакцины СР-9 и DP-9 могли продуцировать более высокие титры антител у иммунизированных мышей.

2. Ингибирование неоинтимы

Через четыре недели после моделирования образцы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи и затем погружали в гель ОСТ (приобретенный в US SAKURA, Item No.: 4583) и хранили при -80°С для следующих замороженных срезов. Замороженные срезы готовили в шести положениях 200 мкм, 350 мкм, 500 мкм, 1 мм, 1,5 мм и 2 мм от участка лигирования, каждый срез составлял 7 мкм, и затем выполняли окрашивание с помощью НЕ. Результаты окрашивания НЕ каждой группы мышей показаны на Фиг. 3, панель С. Вычисляли четыре показателя: площадь неоинтимы, отношение площади интимы к площади медиа, внешний периметр эластичных пластин и площадь медиа. Результаты показаны на панелях D, Е, F и G на Фиг. 3, и для статистического анализа использовали программу Image Pro Plus: площадь неоинтимы и отношение площади интимы к площади медиа у мышей с общей сонной артерии, поврежденной проводником, после инъекции вакцины DP-9 (обозначена "DP-9" на Фиг. ) или CD-9 (обозначена "CD-9" на Фиг. ) были значительно ниже чем у контрольной группы (обозначена "KLH" на Фиг). Следовательно, вакцина DP-9 и вакцина CD-9 оказывают значительное влияние на ингибирование образования неоинтимы у модели, вызванное повреждением проводником.

Пример 4. Вакцина DP-9 ингибирует образование атеросклероза, индуцированного у мышей LDLR-/- кормом с высоким содержанием жира

1. Создание модели атеросклероза

Всего 18 экспериментальных мышей, самцов в возрасте 8 недельных, LDLR-/- с массой 23-25 г (приобретенные в Animal Department of Peking University Health Science Center), случайным образом разделяли на 3 группы по 6 мышей в каждой группе, а именно в экспериментальную группу 1, экспериментальную группу 2 и контрольную группу.

Два сухих порошка конъюгатов (KLH-DP9 и KLH-CD9), полученных на стадии 2 в Примере 1, соответственно растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением двух растворов конъюгатов с концентрацией 1 мг/мл. Два раствора конъюгата соответственно смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением двух вакцин, то есть вакцины DP-9 и вакцины CD-9. Их инъецировали мышам в экспериментальной группе 1 и экспериментальной группе 2 посредством подкожной инъекции в 3-4 точках соответственно. KLH растворяли в стерильном изотоническом растворе с получением раствора KLH с концентрацией 1 мг/мл, и раствор KLH смешивали с адъювантом на основе гидроксида алюминия (приобретенный в HEART, Item No.: BF040) в объемном соотношении 10:1 с получением смеси KLH. Смесь KLH инъецировали мышам в контрольной группе посредством подкожной инъекции в 3-4 точках. Инъецированная доза для каждой мыши в экспериментальных группах 1 и 2 составляла 50 мкг (в расчете на конъюгат), и инъецированная доза для каждой мыши в контрольной группе составляла 50 мкг (в расчете на KLH). Как показано на Фиг. 4, панель А, первую инъекцию вакцины выполняли в возрасте 8 недель (регистрируется как 0-ая неделя, то есть 0W) и инъекции вакцины выполняли на 2-ой, 4-ой, 12-ой и 15-неделях соответственно; с 4-ой недели по 18-ую неделю мышам давали атерогенную диету (то есть пищу с высоким содержанием жира, приобретенную в Research Diets, Item No.: D12108C, главные компоненты которой представляли собой 1,25% холестерина, жира 40% ккал); на 3-ю, 9-ую, 13-ую и 18-ую недели выполняли определение титра вакцин и измерение массы тела, где способ определения титра был таким же, как в Примере 1. Как показано на Фиг. 4, панели В и С, результаты показывают, что вакцины CD-9 и DP-9 были способны продуцировать более высокие титры антител у иммунизированных мышей, и более высокие титры антител все еще определялись на 18-ую неделю.

2. Ингибирование образования атеросклероза

Под микроскопом целый кровеносный сосуд мыши вырезали с помощью микроскопических инструментов и затем фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 6 часов, замачивали в 60% изопропаноле на 5 минут, окрашивали Oil Red О в течение 30 минут в темноте; затем всплывающий краситель отмывали в 60% изопропаноле, и затем адвентициальный жир слущивали под микроскопом; после слущивания кровеносный сосуд разрезали в продольном направлении с помощью микроножниц и повторяли те же самые стадии замачивания в 60% изопропаноле на 5 минут, затем окрашивания Oil Red О в течение 30 минут в темноте и затем отмывания всплывающего красителя в 60% изопропаноле; наконец, окрашенный кровеносный сосуд фиксировали на пластине для получения общих картин, как показано на Фиг. 4, панель D. Атеросклеротические бляшки образовались в контрольной группе, экспериментальной группе 1 и экспериментальной группе 2. Программу Image Pro Plus использовали для вычисления площадей бляшек и, принимая площадь бляшек контрольной группы (обозначена "KLH" на Фиг.) за 1, вычисляли относительные площади бляшек экспериментальной группы 2 (обозначена "CD-9" на Фиг.) и экспериментальной группы 1 (обозначена "DP-9" на Фиг). Результаты показывают, что: по сравнению с контрольной группой (представлена как "KLH" на Фиг), относительная площадь бляшек экспериментальной группы 1 (обозначена "DP-9" на Фиг. ) значительно уменьшена (р<0,001), и относительная площадь бляшек экспериментальной группы 2 (обозначена "CD-9" на Фиг. ) не изменилась (р>0,05), что означает, что вакцина DP-9 значительно ингибирует образование атеросклеротических бляшек, и отсутствовало значительное различие между вакциной CD-9 и контрольной группой KLH.

В настоящем изобретении использовали следующие статистические способы для анализа: (1) непрерывные случайные величины нормального распределения были представлены средним значением ± стандартная ошибка (среднее ± 8ЕМ); (2) парный t-критерий (двусторонний критерий) использовали для всех парных данных; (3) групповой t-критерий (двусторонний критерий) использовали для непарных данных; (4) односторонний ANOVA (дисперсионный анализ) использовали для сравнения односторонних результатов между несколькими группами, а критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса использовали для дополнительного сравнения между двумя группами; (5) двусторонний ANOVA использовали для сравнения двусторонних результатов между несколькими группами, и тест Бонферрони использовали для дополнительного сравнения между двумя группами.

Выше настоящее изобретение было описано подробно. Специалистами в данной области техники, без отступления от существа и объема настоящего изобретения и без ненужного экспериментирования, настоящее изобретение может быть осуществлено в широком диапазоне при эквивалентных параметрах, концентрациях и условиях. Хотя в настоящем изобретении приведены конкретные примеры, следует понимать, что настоящее изобретение может быть дополнительно модифицировано. В заключение, в соответствии с принципами настоящего изобретения, предполагается, что настоящая заявка охватывает любые изменения, применения или улучшения настоящего изобретения, включая изменения, сделанные с использованием общепринятых технологий, известных в данной области техники, отступающих от объема, раскрытого в данной заявке. Применение некоторых существенных признаков может быть осуществлено в рамках следующей прилагаемой формулы изобретения.

Промышленное применение

1. Короткие пептиды металлопротеиназы ADAMTS-7, отобранные в настоящем изобретении, могут вызывать специфические иммунные ответы у мышей дикого типа C57BL/6 и мышей АроЕ-/- и продуцировать специфические антитела против коротких пептидов, которые могут специфически связываться с каталитической областью металлопротеиназы ADAMTS-7 и блокировать ее гидролазную активность.

2. Вакцины, полученные в настоящем изобретении, могут значительно ингибировать неогенез интимы в мышиных моделях рестеноза сосудов (то есть модели лигирования и модели повреждения проводником) и возникновение атеросклероза у мышей, получавших корм с высоким содержанием жира, и могут применяться для предупреждения или лечения атеросклероза и/или рестеноза сосудов.

3. Гетеробифункциональный сшивающий агент, используемый в получении вакцин по настоящему изобретению характеризуется способностью связывать две группы одновременно, и разные группы могут быть успешно связаны за две стадии, и эта операция является простой и быстрой.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PEKING UNIVERSITY

<120> ИММУНОГЕННЫЙ ПЕПТИДНЫЙ ФРАГМЕНТ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ ADAMTS-7 И ЕГО

ПРИМЕНЕНИЕ В ПРОТИВОДЕЙСТВИИ АТЕРОСКЛЕРОЗУ И РОДСТВЕННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

<130> GNPFY20056

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Asp Cys Glu Pro Val Gly Lys Arg Pro

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Cys Leu Asp Asp Pro Pro Ala Lys Asp

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Cys Asn Met Lys Gly Asp Ala His Pro

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Cys Ser Ser Gly Arg Asp Glu Asp

1 5

<---

Claims (16)

1. Короткий пептид для индуцирования иммунного ответа против ADAMTS-7, который представляет собой любой из следующих (Al)-(А4):

А1) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 в перечне последовательностей;

А2) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2 в перечне последовательностей;

A3) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3 в перечне последовательностей;

А4) короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 в перечне последовательностей.

2. Конъюгат короткого пептида по п. 1 для индуцирования иммунного ответа против ADAMTS-7, который представляет собой полный антиген, полученный путем связывания короткого пептида по п. 1 с белком-носителем.

3. Конъюгат по п. 2, где белок-носитель представляет собой гемоцианин лимфы улитки, рекомбинантный белок частиц фага Qβ, рекомбинантный белок вируса папилломы крупного рогатого скота, рекомбинантный белок вируса гепатита В или столбнячный анатоксин.

4. Применение короткого пептида по п. 1, имеющего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, или конъюгата по п. 2 или 3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, в получении продуктов для предупреждения или лечения атеросклероза и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов.

5. Применение короткого пептида по п. 1, имеющего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2, или конъюгата по п. 2 или 3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2, в получении продуктов для уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях или отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов.

6. Вакцина для предупреждения или лечения атеросклероза и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов, где вакцина содержит конъюгат по п. 2 или 3, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.

7. Вакцина для уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях и/или отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов, где вакцина содержит конъюгат по п. 2 или 3, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2.

8. Вакцина по п. 6 или 7, которая состоит из указанного конъюгата по п. 2 или 3 и иммунного адъюванта.

9. Применение вакцины по п. 6, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, в получении продуктов для предупреждения или лечения атеросклероза и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов.

10. Применение вакцины по п. 7, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, в получении продуктов для уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях и/или отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов.

11. Способ предупреждения или лечения атеросклероза, включающий стадию введения конъюгата по п. 2 или 3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, или вакцины по п. 6, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, животному для предупреждения или лечения атеросклероза и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов.

12. Способ уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях и/или отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов, включающий стадию введения конъюгата по п. 2 или 3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или вакцины по п. 7, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, животному для уменьшения площади неоинтимы в поврежденных артериях и/или отношения площади интимы к площади медиа в поврежденных артериях и тем самым предупреждения или лечения рестеноза сосудов.

Images