KR20220086708A - 암치료법의 치료 효능 및 암 예후 예측용 방법 및 조성물 - Google Patents

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오즐렘 퉤레시
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아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 일반적으로 암치료법의 치료 효능 및 암 예후 예측용 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 특정 암치료법에서 바람직하거나 바람직하지 않은 결과와 각각 연관되고 암의 예후 마커로서 유용한 마커를 개시한다. 이러한 마커를 포함하는 방법은 암 치료 효과를 예측하고 암환자에 대한 임상 결과를 예측하기 위해 개시된다.

Description

암치료법의 치료 효능 및 암 예후 예측용 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREDICTION OF THERAPEUTIC EFFICACY OF CANCER TREATMENTS AND CANCER PROGNOSIS}
본 발명은 일반적으로 암치료법의 치료 효능 및 암 예후 예측용 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 특정 암치료법에서 바람직하거나 바람직하지 않은 결과와 각각 연관되고 암의 예후 마커로서 유용한 마커를 개시한다. 이러한 마커를 포함하는 방법은 암 치료 효과를 예측하고 암환자에 대한 임상 결과를 예측하기 위해 개시된다.
위암 및 식도암(위식도; GE)은 가장 충족되지 않은 의학적 니즈를 가진 악성종양 중 하나이다. 위암은 전 세계적으로 두 번째로 큰 사망 원인이다. 식도암의 발생률이 최근 수십 년 동안 증가하여 왔으며, GE암에 대한 전체의 5년-생존율은 확립된 표준 치료법의 공격성에도 불구하고 상당한 부작용과 관련되어 20-25%이다. 이 암종으로 고통받는 환자의 의학적 니즈가 높으며 혁신적인 약물이 필요하다.
밀착연접 분자인 클라우딘18 동종형 2(CLDN18.2)는 클라우딘18의 암-관련 스플라이스 변이체이다[Niimi, T., et al., Mol Cell Biol, 2001. 21(21): p. 7380-90; Tureci, O., et al., Gene, 2011. 481(2): p. 83-92]. CLDN18.2는 2개의 작은 세포외 루프(소수성 영역 1 및 소수성 영역 2에 의해 둘러싸인 루프1; 소수성 영역 3 및 4에 의해 둘러싸인 루프2)를 갖는 4개의 막을 가로지르는 도메인을 포함하는 27.8kDa 막관통 단백질이다. CLDN18.2는 매우 선택적인 위 계통 항원이며, 짧은 수명의 분화된 위 상피 세포에서만 독점적으로 발현되며 다른 임의의 정상 인간 조직에서는 검출되지 않는다. 상기 항원은 위식도암 및 췌장암을 포함하는 다양한 종류의 인간 암에서 유의한 수준으로 이소성 발현된다[Sahin, U., et al., Clin Cancer Res, 2008. 14(23): p. 7624-34]. 또한, CLDN18.2 단백질은 위암의 림프절 전이 및 원격 전이에서 종종 검출된다. CLDN18.2는 CLDN18.2 양성 종양세포의 증식에 관여하는 것으로 보이는데, 이는 siRNA 기술에 의한 표적의 하향 조절이 위암 세포의 증식을 억제하기 때문이다.
IMAB362는 CLDN18.2에 대한 IgG1 아형의 키메라 단일 클론 항체이다. IMAB362는 CLDN18.2의 제1 세포밖 도메인을 높은 친화도 및 특이성으로 인식하며 클라우딘18(CLDN18.1)과 밀접하게 관련된 스플라이스 변이체 1을 포함하는 다른 클라우딘 패밀리 구성원에는 결합하지 않는다.
CLDN18.2를 발현하는 인간 이종 이식에서는, IMAB362 투여 후 마우스에서 생존 이점 및 종양 퇴행이 관찰되었다. 관련 동물 종에서 정맥내 투여시, 표적 에피토프에 접근할 수 없기 때문에 위 조직에서의 독성은 관찰되지 않는다. 그러나, 종양 표적은 악성 변환 동안에 IMAB362에서 접근 가능하게 된다. IMAB362는 4개의 독립적인 매우 강력한 작용 메커니즘을 제공한다: (i) 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC), (ii) 보체-의존적 세포독성(CDC), (iii) 종양 표면에서 표적의 교차 결합에 의해 유도된 세포예정사 유도, 및 (iv) 직접적인 확산 억제를 들 수 있다.
이전 I상 임상시험에서는 후기-단계 위식도암 환자에서 단일요법(monotherapy)으로서 단일 용량으로 IMAB362를 평가하였다. 이 시험에서 5개의 IMAB362 용량(33, 100, 300, 600 및 1000mg/m2)이 단일요법으로 적용되었다. 이 연구는 이 항체의 단일 투여가 AE 프로파일(AE=부작용) 및 다른 안전성 파라미터에서 투여군 간의 관련된 차이점이 보이지 않기 때문에, 1000 mg/m2까지의 용량으로 안전하고 잘 견딜 수 있음을 보여준다. 300　mg/m2 및 600　mg/m2 그룹에서 항종양 활성에 관한 최상의 결과를 얻었다. 300　mg/m2 그룹의 2명의 환자에서 질병은 통제되고, 이들은 비-표적 병변만을 가졌기 때문에 비-CR, 비-PD(CD=완전 반응, PD=진행성 질환)으로서 평가되었다. 비-CR, 비-PD의 지속 기간은 각각 약 2개월 및 6주이었다. 이들 3명 환자의 종양 마커 수준은 안정을 유지하였다. 600　mg/m2 그룹의 한 환자는 안전병변(SD)을 나타냈다. SD 기간은 약 2개월이었다.
IMAB362의 유도된 세포 살상, CLDN18.2-양성 종양을 보여한 IMAB362-처리된 마우스의 생존 이점, IMAB362-관련 독성에 대한 어떠한 표시도 부재한 것, 및 I상 임상시험의 유망한 결과에 대한 매우 강력한 작용 메커니즘에 근거하여, IIa상 연구를 개시하였다. 이 IIa상 임상시험은 조직학에 의해 입증된 위 또는 하부 식도의 진행성 선암의 전이성, 불응성 또는 재발성 질환이 있는 환자에서 IMAB362의 반복 투여량의 안전성, 내약성 및 항종양 활성을 결정하기 위해 실시하였다.
이 IIa상 임상시험에서 연구용 약물은 순차적으로 동원된 3개의 코호트에 적용하였다. 3명 환자의 제1코호트는 낮은 용량 수준(300 mg/m2 체표면적)에서 IMAB362의 반복된 용량을 수여받았다. 항체를 2시간 정맥내 주입으로 투여하였다. 제1코호트에서 IMAB362-관련 독성에 대한 징후가 검출되지 않았기 때문에, 제2코호트(3명 환자)의 IMAB362 용량은 600mg/m2 체표면적으로 증가하였다. 제3코호트에서, 19명의 환자는 동일한 용량으로 할당되었다(600mg/m2 체표면적의 반복 적용). 이 코호트로부터의 환자 시료를 몇 가지 동반 분석, 즉 ADCC, CDC, 면역표현형 및 유전적 면역 다형성에 대해 분석하였다. 모든 코호트의 모든 환자는 2, 5, 6, 7 및 8회 방문시 2주마다 IMAB362의 반복된 용량을 부여하였다(5회 적용).
IMAB362와 같은 치료용 단일 클론 항체에 대한 중재에 대한 반응성과 관련하여 항원 양성 종양(표적 항원을 유사한 정도로 과발현한다)의 불일치는 치료 결과와 관련된 추가 요인이 있음을 시사한다. 이는 항체 요법의 이점을 가질 수 있는 환자를 신중하게 선택해야 한다.
그러므로, 항체 요법에 대한 환자의 적합성을 측정하기 위한 시험을 개발할 필요가 있다. 본 발명은 항체 요법에서 바람직하거나 바람직하지 않은 결과와 관련된 마커를 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다. 또한, 본 발명은 이들 마커가 암환자의 임상 결과를 예후하기 위한 마커로서 유용하다는 것을 입증한다.
본원에서 제시된 발견은 암환자에 대한 적절한 치료법을 선택하고, 특히 항체 요법을 암환자에게 투여해야 하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 치료 또는 예방 요법을 선택할 때 암의 치료적 처치에 반응하는 개체의 가능성을 평가하는데(예를 들어, 암을 가진 개체에게 특정 치료제를 투여할지 말지 여부를 결정하거나 또는 누가 미래에 암 발달의 위험이 높은지를 결정할 때), 또는 질병의 중증도 및 회복에 대한 개인의 예후를 평가하는데 사용하기 위한 것과 같은 SNP(단일-뉴클레오티드 다형성) 유전자형질분석의 방법을 제공한다.
본 발명은 SNP에 대한 특정 유전자형이 CLDN18.2 양성 암, 특히 IMAB362를 갖는 CLDN18.2 양성 위식도암의 치료와 같은 항체 치료에 대한 암의 감수성/무감각과 관련된다는 발견에 기초한다. 본 발명은 또한 SNP에 대한 특정 유전자형이 암환자에 대한 임상 결과와 관련되어 있어 암을 예후하는데 유용하다는 발견에 기초한다.
일 양상에서, 본 발명은 평가 방법으로서,
(i) 종양 항원-양성 종양을 가진 암환자가 종양 항원에 대한 항체 치료에 대한 반응자인 경우, 및/또는
(ii) 암환자, 바람직하게는 종양 항원-양성 종양을 가진 암환자가 무진행 생존을 경험할 경우,
상기 방법은 환자로부터 획득된 시료에서 FCGR2A rs1801274, MUC1 rs4072037, IL-10 rs1800896, DNMT3A rs1550117, SMAD4 rs12456284, EGF rs4444903, CDH1 rs16260, ERCC1 rs11615, 및 FCGR3A rs396991로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형을 결정하는 것을 포함하는, 평가 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 이형접합적 FCGR2A rs1801274 [CT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 FCGR2A rs1801274 [TT] 유전자형 및/또는 동형접합적 FCGR2A rs1801274 [CC] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 MUC1 rs4072037 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 MUC1 rs4072037 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 IL-10 rs1800896 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 DNMT3A rs1550117 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 SMAD4 rs12456284 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 EGF rs4444903 [AA] 유전자형은 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 CDH1 rs16260 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 ERCC1 rs11615 [TT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 FCGR3A rs396991 [TG] 유전자형 및/또는 동형접합적 FCGR3A rs396991 [TT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 FCGR3A rs396991 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 종양 항원은 CLDN18.2 단백질이다.
일 양상에서, 본 발명은 평가 방법으로서,
(i) CLDN18.2-양성 종양을 가진 암환자가 CLDN18.2 단백질에 대한 항체 치료에 대한 반응자인 경우, 및/또는
(ii) 암환자, 바람직하게는 CLDN18.2-양성 종양을 가진 암환자가 무진행 생존을 경험할 경우,
상기 방법은 환자로부터 획득된 시료에서 FCGR2A rs1801274, MUC1 rs4072037, IL-10 rs1800896, DNMT3A rs1550117, SMAD4 rs12456284, EGF rs4444903, CDH1 rs16260, ERCC1 rs11615, 및 FCGR3A rs396991로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형을 결정하는 것을 포함하는, 평가 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 이형접합적 FCGR2A rs1801274 [CT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 FCGR2A rs1801274 [TT] 유전자형 및/또는 동형접합적 FCGR2A rs1801274 [CC] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 MUC1 rs4072037 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 MUC1 rs4072037 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 IL-10 rs1800896 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 DNMT3A rs1550117 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 SMAD4 rs12456284 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 EGF rs4444903 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 CDH1 rs16260 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 ERCC1 rs11615 [TT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 FCGR3A rs396991 [TG] 유전자형 및/또는 동형접합적 FCGR3A rs396991 [TT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 FCGR3A rs396991 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험 및/또는 무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 증가된 위험을 나타낸다.
본 발명의 모든 양상의 일 실시형태에서, 항체는 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용한다. 일 실시형태에서, 항체는 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 통해 작용한다. 일 실시형태에서, 항체는 단일 클론 항체이다. 본 발명의 모든 양상의 일 실시형태에서, 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 모든 양상의 일 실시형태에서, 항체 치료에 대한 비-반응성은 생존, 무진행 생존, 무재발 생존, 원격 무재발 생존, 및 안전병변 중 하나 이상에서 상대적인 감소를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 암환자 치료 방법으로서,
a. 본 발명의 방법에 의해 암환자가 항체 치료에 대한 반응자인지를 평가하는 단계, 및
b. (i) 환자가 항체 치료에 대한 반응자가 아니어서 감소된 위험을 가진 경우 항체로 암환자를 치료하는 단계 또는 (ii) 환자가 항체 치료에 대한 반응자가 아니어서 증가된 위험을 가진 경우 항체 치료와 상이한 치료를 포함하는 항체로 암환자를 치료하지 않는 단계 및/또는 치료 요법으로 암환자를 치료하는 단계를 포함하는, 암환자 치료 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 치료 요법은 환자의 면역계에 의존적이지 않는 치료를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료 요법은 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는 항체에 의한 치료를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 치료 요법은 수술, 화학요법 및/또는 방사선을 포함한다. 일 실시형태에서, 치료 요법은 종양 항원의 소분자 억제제 및/또는 항체-약물 접합체에 의한 치료를 포함하고, 여기서 항체는 종양 항원에 대한 것이다. 일 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 방사성, 화학요법성 또는 독소 일부분에 결합된 항체이다. 일 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 세포증식억제성 또는 세포독성 화합물에 결합된 항체이다.
일 양상에서, 본 발명은 암환자의 임상 결과 평가 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 환자로부터 획득된 시료에서 FCGR2A rs1801274, MUC1 rs4072037, IL-10 rs1800896, DNMT3A rs1550117, SMAD4 rs12456284, EGF rs4444903, CDH1 rs16260, ERCC1 rs11615, 및 FCGR3A rs396991로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형을 결정하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 이형접합적 FCGR2A rs1801274 [CT] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 FCGR2A rs1801274 [TT] 유전자형 및/또는 동형접합적 FCGR2A rs1801274 [CC] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 MUC1 rs4072037 [AA] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 MUC1 rs4072037 [GG] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 IL-10 rs1800896 [GG] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 DNMT3A rs1550117 [GA] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 SMAD4 rs12456284 [GA] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 EGF rs4444903 [AA] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 CDH1 rs16260 [AA] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 ERCC1 rs11615 [TT] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이형접합적 FCGR3A rs396991 [TG] 유전자형 및/또는 동형접합적 FCGR3A rs396991 [TT] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 동형접합적 FCGR3A rs396991 [GG] 유전자형의 존재는 나쁜 임상 결과의 증가된 위험을 나타낸다.
일 실시형태에서, 암환자의 임상 결과를 평가하는 것은 생존, 무진행 생존, 무재발 생존, 원격 무재발 생존 및 안전병변 중 하나 이상의 가능성을 예측하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 나쁜 임상 결과는 생존, 무진행 생존, 무재발 생존, 원격 무재발 생존 및 안전병변 중 하나 이상에서 상대적인 감소를 포함한다.
일 실시형태에서, 환자는 종양 항원-양성 종양을 가지고 있고 종양 항원에 대한 항체로 치료를 받는다.
본 발명의 모든 양상의 일 실시형태에서, 시료는 DNA를 포함하는 시료이다. 일 실시형태에서, DNA는 환자의 신체 시료로부터 추출된다. 일 실시형태에서, DNA는 혈액으로부터 추출된다.
본 발명의 모든 양상의 일 실시형태에서, 종양은 고형 종양이다. 일 실시형태에서, 종양은 위식도 종양이다. 일 실시형태에서, 종양은 위 또는 하부 식도의 진행성 선암이다. 일 실시형태에서, 암은 위식도 암이다. 일 실시형태에서, 암은 위 또는 하부 식도의 진행성 선암이다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 환자로부터 획득된 시료에서 FCGR2A rs1801274, MUC1 rs4072037, IL-10 rs1800896, DNMT3A rs1550117, SMAD4 rs12456284, EGF rs4444903, CDH1 rs16260, ERCC1 rs11615, 및 FCGR3A rs396991로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형을 결정하기 위한 수단을 포함하는, 키트에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 키트는 본 발명의 모든 양상의 방법을 행하는데 유용하다. 일 실시형태에서, 상기 키트는 데이터 담체를 추가로 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 데이터 담체는 전자적 또는 비-전자적 데이터 담체이다. 일 실시형태에서, 상기 데이터 담체는 본 발명의 모든 양상의 방법을 실시하는 방법에 관한 지시를 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 환자와 대조군 집단 간의 통계적으로 유의한 유전자형 빈도 변화를 가진 단일 뉴클레오티드 다형성을 나타낸다(χ2-테스트, p<0.05). 막대 부분에 SNP-특이 유전자형의 배치를 나타낸다. Pat. 환자 집단, Co. 대조군 집단.
도 2는 환자당 조사된 SNP 위험 인자의 수에 대한 환자당 동형접합적 위험 유전자형의 상대 빈도를 나타낸다. 환자는 축적된 동형접합적 위험 인자의 빈도가 증가함에 따라 분류된다.
도 3은 rs1801274 (FCGR2A) 유전자형에 의해 차별화된 PP 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선).
도 4는 rs1801274 (FCGR2A) 유전자형에 의해 차별화된 FAS 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 5는 rs1800896 (IL-10) 유전자형에 의해 차별화된 PP 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 6은 rs1800896 (IL-10) 유전자형에 의해 차별화된 FAS 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 7은 rs1550117 (DNMT3A) 유전자형에 의해 차별화된 FAS 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 8은 rs12456284 (SMAD4) 유전자형에 의해 차별화된 PP 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 9는 rs4072037 (MUC1) 유전자형에 의해 차별화된 PP 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 10은 rs4072037 (MUC1) 유전자형에 의해 차별화된 FAS 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 11은 rs4444903 (EGF) 유전자형에 의해 차별화된 FAS 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 12는 rs16260 (CDH1) 유전자형에 의해 차별화된 FAS 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 13은 rs11615 (ERCC1) 유전자형에 의해 차별화된 PP 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
도 14는 rs396991 (FCGR3A) 유전자형에 의해 차별화된 PP 환자의 무진행 생존을 나타낸다(카플란-마이어 곡선).
이하에 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 방법론, 프로토콜 및 시약들이 다양한 만큼 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어들은 특정 구현예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
이하에서, 본 발명의 구성 요소들을 설명한다. 이 구성 요소들은 특정 구현예와 함께 열거되지만, 이들은 여하한 방식 및 여하한 횟수로든 조합되어 부가적인 구현예를 구현할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기재된 구현예 및 바람직한 구현예들은 다양하게 설명된 구체예와 바람직한 구현예들은 단지 명시적으로 설명된 구현예들만으로 본 발명을 한정짓는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서는 명시적으로 기재된 구현예들과 개시된 및/또는 바람직한 여하한 수의 구성 요소들을 조합하는 구현예들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 출원의 모든 설명된 멤버들의 여하한 순열 및 조합들은 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
바람직하게, 본원에 사용되는 용어는 문헌 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 기재되어 있는 바와 같이 정의된다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 본 분야의 문헌에서 설명되어 있는 종래의 화학적, 생화학적, 세포 생물학적, 면역학적 방법, 및 재조합 DNA 기술의 상법을 채용할 것이다(예컨대, 참고로, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
본 명세서 및 하기의 특허청구범위 전반에서, 문맥이 달리 요구하지 않는다면, 단어 "포함하다", 및 "포함한다"와 "포함하는"과 같이 변형어는 명시된 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 의미하되, 비록 일부 구현예에서 이러한 다른 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 배제할 수도 있지만, 임의의 다른 멤버, 정수 또는 단계, 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이며, 즉 본 발명의 청구대상은 명시된 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 포함하는 것이다. 본 발명을 설명하는 문맥에서(특히, 본 청구범위의 문맥상) 사용되는 용어 "하나"와 "한(부정관사)" 및 "정관사" 및 유사한 참조용어는 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 분명하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 별개의 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 본원에서 달리 명시되지 않으면, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내로 편입된 것으로 간주한다. 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 적절한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된, 임의 및 모든 실례, 또는 예시적 어법(가령, "예를 들면")의 이용은 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위해 의도된 것이고, 청구되는 본 발명의 범위에 한정을 달리 부가하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떠한 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성 요소를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 몇가지 문헌들이 인용된다. 본원에서 인용된 각각의 상기 또는 하기 문헌들(모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 그 내용 전체가 그 이상 또는 그 이하를 불문하고 본원에 참조 병합된다. 이들 문헌들이 선행발명임을 이유로, 본 발명이 이러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명자들은 특정 암 치료법, 특히 항체 요법에 대한 환자의 적합성을 측정하고 암환자의 예후에 대해 추단하기 위한 검정법을 제공한다. 이들 검정을 사용하여 얻은 결과로 의사는 암환자에 대한 적절한 치료법을 결정할 수 있으며, 특히 항체 요법을 특정 암환자에게 투여해야 하는지 여부를 결정할 수 있다.
용어 "단일 뉴클레오티드 다형성" 또는 "SNP"는 게놈(또는 다른 공유 서열)에서 단일 뉴클레오티드가 생물학적 종의 구성원들 또는 쌍으로 된 염색체들 간에 상이한 집단 내에서 공통적으로 발생하는 DNA 서열 변이에 관련된다. SNP는 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 영역, 또는 유전자간 영역(유전자 사이의 영역)에서 발생할 수 있다. 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 축퇴로 인해, 생성된 단백질의 아미노산 서열을 반드시 변화시키지 않을 수 있다. 따라서, 코딩 영역의 SNP는 동의 SNP와 비동의 SNP의 2가지 유형이 있다. 동의 SNP는 단백질 서열에 영향을 주지 않는 반면, 비동의 SNP는 단백질의 아미노산 서열을 변화시킨다. 비동의 SNP에는 미스센스 및 넌센스의 2가지 유형이 있다. 단백질-코딩 영역에 없는 SNP는 그럼에도 유전자 스플라이싱, 전사 인자 결합, 메신저 RNA 분해 또는 비-코딩 RNA의 서열에 영향을 줄 수 있다. 이러한 유형의 SNP에 영향을 받는 유전자 발현은 eSNP(발현 SNP, expression SNP)라고 하며 유전자로부터 상류 또는 하류가 있을 수 있다.
SNP에 대한 유전자형을 결정하기 위해 본 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 신규한 SNP를 발견하고 알려진 SNP를 검출하는 분석 방법은, 예를 들어 DNA 시퀀싱, 모세관 전기영동, 질량 분석, 외가닥 구조 다형성(SSCP), 전기화학적 분석, 변성 HPLC 및 겔 전기영동, 제한효소 단편길이 다형성(RFLP) 및 혼성화 분석을 포함한다.
어느 하나 또는 두 대립유전자에 대해, 본원에 기재된 특정 SNP 위치에 존재하는 뉴클레오티드를 결정하는 공정은 "SNP에 대한 유전자형을 결정" 또는 "SNP 유전자형질분석"과 같은 문구로 언급될 수 있다. 따라서, 이들 문구는 SNP 위치에서 단일 대립유전자(뉴클레오티드)를 검출하는 것을 지칭할 수 있거나 SNP 위치에서 대립유전자들(뉴클레오티드들)을 모두 검출하는 것(SNP 위치의 동형접합적 또는 이형접합적 상태를 결정하는 것처럼)을 포함할 수 있다. 또한, 이들 구문은 SNP에 의해 암호화되는 아미노산 잔기(SNP 위치에서 대체 뉴클레오티드에 의해 생성된 상이한 코돈에 의해 암호화되는 대체 아미노산 잔기와 같은)를 검출하는 것을 지칭할 수도 있다.
본원에 기재된 특정 표적 SNP 위치를 특이적으로 검출하고, 바람직하게는 표적 SNP 위치의 특정 뉴클레오티드(대립유전자)에 특이적인 시약(즉, 시약은 바람직하게는 표적 SNP 위치에서 상이한 대체 뉴클레오티드들 간에 구별할 수 있으므로, 결정될 표적 SNP 위치에 존재하는 뉴클레오티드의 동일성을 허용한다)은 SNP 검출을 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 검출 시약은 서열 특이적 방식으로 상보적 염기쌍에 의해 표적 SNP-함유 핵산 분자에 혼성화하고, 시험 시료에서 본 기술 분야에 공지된 형태와 같이 표적 변이체 서열을 다른 핵산 서열과 식별한다. 검출 시약의 예로서는 본원에 개시된 SNP를 함유하는 표적 핵산에 혼성화하는 비-천연 발생 핵산 프라이머 또는 프로브이다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 프라이머 또는 프로브는 동일한 표적 SNP 위치에 상이한 뉴클레오티드를 갖는 다른 핵산으로부터 표적 SNP 위치에서 특정 뉴클레오티드(대립유전자)를 갖는 핵산을 구별할 수 있다. 또한, 검출 시약은 SNP 위치의 특정 영역 5' 및/또는 3'에 혼성화될 수 있다. 이러한 프라이머 및 프로브와 같은 검출 시약은 본원에 개시된 SNP 중 하나 이상을 유전자형질분석용 시약으로서 직접적으로 유용하며 임의의 키트 형태로 혼입될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
SNP를 분석하기 위해서는, 대체 SNP 대립유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 적절할 수 있다. 표적 서열의 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하는 이러한 올리고뉴클레오티드는, "대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드", "대립유전자-특이적 프로브", 또는 "대립유전자-특이적 프라이머"와 같은 용어로 지칭될 수 있다.
SNP 검출 시약은 검출 가능한 신호를 방출하는 형광원 리포터 염료와 같은 리포터로 표지될 수 있다. 바람직한 리포터 염료는 형광 염료이지만, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머와 같은 검출 시약에 부착될 수 있는 임의의 리포터 염료가 본 발명에 적합하다. 또 다른 실시형태에서, 특히 시약이 TaqMan 프로브와 같은 자가-퀀칭 프로브로서 사용될 때, 검출 시약은 소광제 염료로 추가로 표지될 수 있다. 본원에 개시된 SNP 검출 시약은 다른 표지를 포함하고, 스트렙타아비딘 결합을 위한 비오틴, 항체 결합을 위한 햅틴, 및 또 다른 상보적 올리고뉴클레오티드에 결합하기 위한 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따라, 확인될 SNP 뉴클레오티드를 함유하지 않지만(또는 이에 상보적이지 않지만) 본원에 개시된 하나 이상의 SNP를 검정하는데 사용되는 시약도 고려된다. 예를 들어, 옆에 배치되지만 표적 SNP 위치에 직접 혼성화되지 않는 프라이머는, 프라이머가 표적 SNP 위치에 인접한 영역(즉, 표적 SNP 부위로부터 하나 이상의 뉴클레오티드 내에 있다)에 혼성화하는 프라이머 신장 반응에 유용하다. 프라이머 신장 반응 동안에, 특정 뉴클레오티드(대립유전자)가 그 표적 SNP 부위에 존재하는 경우, 프라이머는 전형적으로 표적 SNP 부위를 지나서 연장할 수 없으며, 어떤 SNP 대립 유전자가 표적 SNP 사이트에 존재하는지를 결정하기 위해 프라이머 신장 생성물을 검출할 수 있다. 예를 들어, 특정 ddNTP는 전형적으로 ddNTP가 신장 생성물에 혼입되면 프라이머 신장을 종결시키는 프라이머 신장 반응에 사용된다. 따라서, 결합된 서열이 반드시 SNP 부위 자체를 포함하지 않을지라도, SNP 부위에 인접한 영역에서 핵산 분자에 결합하는 시약 및 SNP 부위를 검정하는데 사용되는 시약이 또한 본 발명에 따라 고려된다.
용어 "FCGR2A"는 인간 FCGR2A 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 낮은 친화도의 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-a(CD32)를 암호화하며 면역글로불린 Fc 수용체 유전자의 패밀리의 일원이다. 이 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 대식세포 및 호중구와 같은 식세포에서 발견되는 세포 표면 수용체이며, 식균 작용 및 면역 복합체의 제거 과정에 관여한다. 선택적 스플라이싱으로 인해 다양한 전사 변이체가 야기된다.
바람직하게는, 용어 "FCGR2A"는 서열 목록의 서열번호 61의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체를 포함하고, 바람직하게는 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 바람직하게는 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 62의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs1801274는 FCGR2A 유전자의 SNP이다. rs1801274 (C)는 변이 히스티딘(H)을 암호화하는 (T) 대립유전자와 함께 아르기닌(R) 대립유전자를 암호화한다. 이 SNP는 다음의 코돈 변화인 CAT, CGT를 갖는 유전자내 전이 치환(transition substitution)이고, 미스센스 돌연변이를 일으킨다. SNP는 문헌에서 A519C 및 R131H를 포함하는 많은 이름으로 알려져 있다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
TGGGATGGAGAAGGTGGGATCCAAA[C/T]GGGAGAATTTCTGGGATTTTCCATT
용어 "MUC1"은 인간 MUC1 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 Mucin 1, 세포 표면 관련(MUC1) 또는 뮤신 패밀리의 구성원인 다형성 상피 뮤신(PEM)을 암호화하고 막 결합된, 글리코실화된 인단백질이다. 단백질은 막관통 도메인에 의해 많은 상피의 선단 표면에 고정된다. 막관통 도메인 너머에는 큰 세포밖 도메인의 방출을 위한 분열 부위를 포함하는 SEA 도메인이 있다. 이 단백질은 병원체에 결합함으로써 보호 기능을 수행하며 또한 세포 신호전달 능력을 발휘한다.
바람직하게는, 용어 "MUC1"은 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 63의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 바람직하게는 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 64의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs4072037은 MUC1 유전자의 SNP이다. 이 SNP는 다음의 코돈 변화인 ACA, ACG를 갖는 유전자내 전이 치환이고, 침묵 돌연변이를 일으킨다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
CCCCTAAACCCGCAACAGTTGTTAC[A/G]GGTTCTGGTCATGCAAGCTCTACCC
용어 "IL-10"은 인간 IL-10 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 항염증성 사이토카인인 사이토카인 합성 억제 인자(CSIF)로도 알려진, 인터루킨-10(IL-10)을 암호화한다.
바람직하게는, 용어 "IL-10"은 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 65의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs1800896은 IL-10 유전자의 SNP이다. 이 SNP는 유전자간/알려지지 않은 유전자내 전이 치환이다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
CAACACTACTAAGGCTTCTTTGGGA[A/G]GGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGA
용어 "DNMT3A"는 인간 DNMT3A 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 DNA(시토신-5)-메틸전달효소 3A를 암호화한다. 이 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 DNA에서 특정 CpG 구조로 메틸기를 이동시키는 것을 촉매하는 효소이다.
바람직하게는, 용어 "DNMT3A"는 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 67의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs1550117은 DNMT3A 유전자에서의 SNP이다. 이 SNP는 DNMT3A 프로모터 영역에서 유전자내 전이 치환이다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
AATTCCACCAGCACAGCCACTCACT[A/G]TGTGCTCATCTCACTCCTCCAGCAG
용어 "SMAD4"는 인간 SMAD4 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 데카펜타플렉 상동체 4(decapentaplegic homolog 4)에 대한 모체를 암호화한다. 이 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 세포 신호전달에 관여하며 TGFβ 단백질 수퍼패밀리의 구성원을 조절하는 Darfwin 단백질 패밀리에 속한다. 그것은 SMAD1 및 SMAD2와 같은 수용체-조절된 SMAD를 결합시키고, DNA에 결합하고 전사 인자로서 작용하는 복합체를 형성한다. 이는 유일하게 알려진 포유류 coSMAD이다.
바람직하게는, 용어 "SMAD4"는 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 69의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs12456284는 SMAD4 유전자의 SNP이다. 이 SNP는 3'-UTR에서 유전자내 전이 치환이다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
AGGTCCAGAGCCAGTGTTCTTGTTC[A/G]ACCTGAAAGTAATGGCTCTGGGTTG
용어 "EGF"는 인간 EGF 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 상피 성장인자를 암호화한다. EGF는 수용체 EGFR에 결합함으로써 세포 성장, 증식 및 분화를 촉진시키는 성장인자이다.
바람직하게는, 용어 "EGF"는 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 71의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 72의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs4444903은 EGF 유전자의 SNP이다. 이 SNP는 5'-UTR에서 유전자내 전이 치환이다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
CTTTCAGCCCCAATCCAAGGGTTGT[A/G]GCTGGAACTTTCCATCAGTTCTTCC
용어 "CDH1"은 인간 CDH1 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 CAM 120/80 또는 상피 카데린(E-카데린) 또는 우보모룰린(uvomorulin)으로도 알려진 카데린-1을 암호화한다. 상기 단백질은 카데린 슈퍼패밀리의 전형적인 구성원이다. 이는 5개의 세포밖 카데린 반복부, 막관통 영역 및 고도로 보존된 세포질 꼬리로 구성된, 칼슘-의존성 세포-세포 부착 당단백질이다. 기능상실은 증식, 침습, 및/또는 전이를 증가시킴으로써 암의 진행에 기여하는 것으로 생각된다.
바람직하게는, 용어 "CDH1"은 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 73의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 74의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs16260은 CDH1 유전자에서의 SNP이다. 이 SNP는 CDH1 유전자의 프로모터 영역에 위치한 유전자내 전환 치환(transversion substitution)이다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
CTAGCAACTCCAGGCTAGAGGGTCA[A/C]CGCGTCTATGCGAGGCCGGGTGGGC
용어 "ERCC1"은 인간 ERCC1 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 DNA 절단 수선 단백질 ERCC-1을 암호화한다. ERCC1 단백질의 기능은 주로 손상된 DNA의 뉴클레오티드 절단 수선을 하는 것이다.
바람직하게는, 용어 "ERCC1"은 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 75의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 76의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs11615는 ERCC1 유전자에서의 SNP이다. 이 SNP는 침묵하는 유전자내 전이 치환이다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
ATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA[C/T]GTGCCCTGGGAATTTGGCGACGTAA
용어 "FCGR3A"는 인간 FCGR3A 유전자에 관한 것이다. 이 유전자는 낮은 친화도의 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III-A를 암호화한다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 분화 세포 표면 분자들 중 클러스터의 일부이다.
바람직하게는, 용어 "FCGR3A"는 서열 목록의 서열번호 77의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고, 바람직하게는 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이고, 바람직하게는 서열 목록의 서열번호 78의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
rs396991은 FCGR3A 유전자에서의 SNP이다. 이 SNP는 다음의 코돈 변화인 GTT, TTT를 갖는 유전자내 전환 치환이고, 미스센스 돌연변이를 일으킨다. rs396991 (T)는 페닐알라닌 (F) 대립유전자를 암호화하고, (G) 대립유전자는 변이된 발린 (V)을 암호화한다. 컨텍스트 시퀀스는 다음과 같다:
CGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTT[G/T]TTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGA
클라우딘은 밀착연접의 가장 중요한 성분인 단백질들의 패밀리인데, 상피의 세포들 간의 세포간 공간에서 분자 흐름을 제어하는 세포간(paracellular) 장벽을 이룬다. 클라우딘은 N-말단 및 C-말단이 모두 세포질에 존재하면서, 막을 4회 가로지르는 막관통 단백질이다. 제1 세포밖 루프 또는 도메인은 평균 53개의 아미노산으로 이루어지고, 제2 세포밖 루프 또는 도메인은 약 24개의 아미노산으로 이루어진다. 클라우딘 패밀리 중 세포 표면 단백질, 예를 들어 CLDN18.2는 다양한 기원의 종양에서 발현되며, 선택적 발현(독성 관련 정상 조직에서의 발현 없음) 및 원형질막으로의 국소화로 인해 항체-매개성 암 면역요법과 관련하여 표적 구조로서 특히 적합하다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "CLDN"은 클라우딘을 의미하며 CLDN18.2를 포함한다. 바람직하게는, 클라우딘은 인간 클라우딘이다.
용어 "CLDN18"은 클라우딘18에 관한 것이고, 클라우딘18 스플라이스 변이체 1(클라우딘18.1 (CLDN18.1)) 및 클라우딘18 스플라이스 변이체 2(클라우딘18.2 (clDN18.2))를 포함하는 모든 변이체를 포함한다.
용어 "CLDN18.2"는 바람직하게는 인간 CLDN18.2에 관한 것이고, 특히 서열 목록의 서열번호 1에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다. CLDN18.2의 제1 세포밖 루프 또는 도메인은 바람직하게는 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 27 내지 81개, 보다 바람직하게는 아미노산 29 내지 78개를 포함한다. CLDN18.2의 제2 세포밖 루프 또는 도메인은 바람직하게는 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 140 내지 180개를 포함한다. 상기 제1 및 제2 세포밖 루프 또는 도메인은 바람직하게는 CLDN18.2의 세포밖 부분을 형성한다.
CLDN18.2는 정상 조직에서 위점막의 분화된 상피 세포에서 선택적으로 발현된다. CLDN18.2는 췌장 암종, 식도 암종, 위 암종, 기관지 암종, 유방 암종, 및 ENT 종양과 같은 다양한 기원의 암에서 발현된다. CLDN18.2는 위암, 식도암, 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC)과 같은 폐암, 난소암, 대장암, 간암, 두경부암, 담낭암 및 이의 전이, 특히 위암 전이 예컨대 크루켄버그 종양, 복막 전이, 및 림프절 전이와 같은 원발성 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 중요한 표적이다.
용어 "CLDN18.1"은 바람직하게는 인간 CLDN18.1에 관한 것이고, 특히 바람직하게는 서열목록의 서열번호 2에 따른 아미노산 서열로 이루어지거나 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "예후"는 결과의 예측, 특히 무진행 생존(PFS) 또는 무병 생존(DFS)의 확률을 일컫는다. 생존율은 일반적으로 환자의 50%가 생존하는 평균 개월 수(또는 년) 또는 1, 5, 15 및 20년 후에 살아있는 환자의 퍼센트로 계산한다. 예후가 좋은 환자는 일반적으로 덜 침습적인 치료법이 제공되는 반면 예후가 나쁜 환자는 일반적으로보다 광범위한 화학요법 약물과 같이, 보다 적극적인 치료법이 제공되기 때문에, 예후는 치료 결정에 중요한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "예측"은 질병의 가능한 반응에 관한 정보를 별개의 치료적 처치에 제공하는 것을 일컫는다.
"위험을 나타낸다"라는 문구는 특정 정도의 가능성 또는 확률을 일컫는다. "감소된 위험을 나타낸다"라는 문구는 낮은 정도의 가능성 또는 확률을 일컫는다. "증가된 위험을 나타낸다"라는 문구는 특정 정도, 보다 높거나 또는 높은 정도의 가능성 또는 확률을 일컫는다.
사례가 "항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내는 경우", 상기 사례는 암환자가 항체 치료에 대한 반응자임을 나타내는 것으로, 즉 환자가 항체 치료에 대한 반응자일 가능성이 있고, 선택적으로 환자가 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 것보다는 환자가 항체 치료에 대한 반응자일 가능성이 더 높다.
사례가 "항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험을 나타내는 경우", 상기 사례는 암환자가 항체 치료에 대한 반응자가 아님을 나타내는 것으로, 즉 환자가 항체 치료에 대한 반응자가 아닐 가능성이 있고, 선택적으로 환자가 항체 치료에 대한 반응자인 것보다는 환자가 항체 치료에 대한 반응자가 아닐 가능성이 더 높다.
사례가 "나쁜 임상 결과의 감소된 위험을 나타내는 경우", 상기 사례는 좋은 임상 결과임을 나타내는 것으로, 즉 좋은 임상 결과가 있을 가능성이 있고, 선택적으로 나쁜 임상 결과가 있는 것보다는 좋은 임상 결과가 있을 가능성이 더 높다.
사례가 "나쁜 임상 결과의 증가된 위험을 나타내는 경우", 상기 사례는 나쁜 임상 결과를 나타내는 것으로, 즉 나쁜 임상 결과가 있을 가능성이 있고, 선택적으로 좋은 임상 결과가 있는 것보다는 나쁜 임상 결과가 있을 가능성이 더 높다.
사례가 "무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 감소된 위험을 나타내는 경우", 상기 사례는 암환자가 무진행 생존을 경험함을 나타내는 것으로, 즉 환자가 무진행 생존을 경험할 가능성이 있고, 선택적으로 환자가 무진행 생존을 경험하지 않는 것보다는 환자가 무진행 생존을 경험할 가능성이 더 높다.
사례가 "무진행 생존을 경험하지 않은 암환자의 증가된 위험을 나타내는 경우", 상기 사례는 암환자가 무진행 생존을 경험하지 않음을 나타내는 것으로, 즉 환자가 무진행 생존을 경험하지 않을 가능성이 있고, 선택적으로 환자가 무진행 생존을 경험하는 것보다는 환자가 무진행 생존을 경험하지 않을 가능성이 더 높다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시료"는 대상체로부터 수득되는 것이고 분석 목적, 특히 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형의 결정에 사용될 수 있는 임의의 물질을 일컫는다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 시료는 예를 들어 시험될 포유류 또는 인간으로부터의 임의의 조직, 세포 및/또는 생물학적 유체 중의 세포일 수 있거나 또는 이로부터 유도될 수 있다. 시료는 환자, 예를 들어 인체로부터 분리될 수 있다. 시료는 분획화 및/또는 정제된 시료일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 시료는 조직(예를 들어 섹션 또는 외식편) 시료, 단일 세포 시료, 세포 콜로니 시료, 세포 배양 시료, 혈액(예를 들어 전혈 또는 혈액 세포 분획과 같은 혈액 분획, 혈청 또는 혈장) 시료, 소변 시료 또는 기타 주변 공급원으로부터의 시료일 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 특히 바람직한 일 실시형태에서, 시료는 조직 시료(예를 들어, 암성 조직을 가지거나 또는 암성 조직을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 생체검사)이다. 예를 들어, 시료는 종양의 생체검사일 수 있다. 시료는 치료적 처치의 개시 이전에, 치료적 처치 중에, 및/또는 치료적 처치 후, 예를 들어 암 치료요법의 투여 이전, 중에 또는 이후에 환자로부터 수득될 수 있다.
시료 물질은 임의의 체액(예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 객담, 위액, 정액, 눈물, 땀 등), 피부, 모발, 세포(특히 유핵세포), 생검, 구강상피세포(buccal swabs) 또는 조직이나 종양 표본으로부터 핵산 추출물(DNA 및/또는 RNA 포함한다), 단백질 또는 막 추출물을 생산하는 데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형을 결정하기 위한 시약과 같은 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "키트의 부품(간단히 말해, 키트)"은 기능적 단위에 공간적으로 공존하면서 조합된 것, 및 추가 구성 요소를 포함할 수 있는, 본원에서 확인된 성분의 적어도 일부의 임의의 조합으로 이해된다. 예를 들어, 키트는 유전자형이 결정되어야 하는 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성을 포함하는 핵산 서열에 대해 특이적인, 미리 선택된 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 핵산 증폭용으로 적합한 효소(예를 들어, Taq와 같은 중합효소), 및 증폭을 위한 반응 혼합물에 필요한 데옥시뉴클레오티드 및 완충액을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 특이적인 프로브를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 수단은 검출 가능하게 표지된다.
본 발명의 키트는 (i) 용기, 및/또는 (ii) 데이터 담체를 포함할 수 있다. 상기 용기는 상술한 수단 또는 시약 중 하나 이상으로 충전할 수 있다. 상기 데이터 담체는 비-전자적 데이터 담체, 예를 들면 정보 리플릿, 정보 시트, 바코드 또는 액세스 코드와 같은 그래픽 데이터 담체, 또는 전자적 데이터 담체, 예를 들면 플로피 디스크, 콤팩트 디스크(CD), 디지털 다용도 디스크(DVD), 마이크로칩 또는 다른 반도체 기반의 전자화 데이터 담체일 수 있다. 액세스 코드는 데이터베이스, 예를 들면 인터넷 데이터베이스, 집중형 데이터베이스, 또는 분산형 데이터베이스로의 접근을 가능하게 한다. 상기 데이터 담체는 상기 키트로 수득된 결과의 분석을 가능하게 하는 설명서 및 특히 본 발명의 방법에서 키트의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안으로, 상기 키트는 완충제, 시약 및/또는 희석제를 포함하는 상업적 견지 및 사용자 견지에서 바람직한 재료를 포함할 수 있다.
수득된 결과에 기반하여(즉, 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형에 기반하여), 의사는 환자가 반응하는 것으로 예측되는 암 치료요법, 특히 항체 요법을 선택할 수 있다. 바람직하게는, 환자가 반응하지 않을 것으로 예측되는 암 치료요법은 환자에게 투여되지 않는다.
환자가 항체 치료요법, 특히 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는 항체 치료요법에 반응하지 않을 것으로 예측되는 결과에 의거하여, 의사는 항체 요법, 특히 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는 항체 요법과는 상이한 암 치료요법을 투여하도록 선택할 수 있다. 특히, 의사는 화학요법을 투여하도록 선택할 수 있다.
환자가 항체 요법, 특히 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는 항체 요법에 반응할 것으로 예측되는 결과에 의거하여, 의사는 항체 요법, 특히 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는 항체 요법을 투여하도록 선택할 수 있고, 선택적으로 화학요법과 병용하여 투여하도록 선택할 수 있다.
용어 "(치료적) 처치"는, 특히 본원에서 사용된 바와 같이 암의 치료와 관련하여, 환자의 건강 상태를 개선 및/또는 환자의 수명을 연장 (증가)시키는 것을 목적으로 하는 임의의 치료에 관한 것이다. 상기 치료는 암을 제거하거나, 환자에서의 종양 크기 또는 수를 감소시키거나, 환자에서 암의 발달을 막거나 저감시키거나, 환자에서 새로운 암의 발달을 억제하거나 저감시키거나, 환자에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고/거나 현재 암에 걸렸거나 이전에 암에 걸렸던 환자에서 재발을 감소시킬 수 있다. 환자 및/또는 이전에 암에 걸렸던 환자에서 재발을 감소시킬 수 있다. 암의 (치료적) 처치는 수술, 화학요법, 방사선 치료 및 표적 치료로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 하나의 특히 바람직한 치료는 표적 세포 상에 발현된 CLDN18.2와 같은 종양 항원에 대한 치료적 단일 클론 항체를 포함하는 암의 치료이다.
보조 요법은 일차 치료, 주치료 또는 최초 치료에 추가적으로 주어진다. 암 치료에 이용되는 외과수술 및 복합 치료요법은 주로 보조 암 치료요법을 설명하기 위해 사용될 용어가 되었다. 보조 요법의 예로서는 일반적으로 검출 가능한 질환이 모두 제거되었지만, 잠재적 질환으로 인해 여전히 통계적 재발 위험이 잔존하는 경우, 대개 수술 후에 행해지는 부가적인 치료이다.
"반응적인" 또는 "반응자"와 같은 용어는 치료 환경에서 환자가 주어진 치료 방식에서 치료적 이점이 있다는 사실을 말하며, 질병의 지속 기간을 단축함, 질병의 진행 또는 악화를 억제하거나 저감시킴, 새로운 질병 및/또는 재발의 발달을 억제하거나 저감시킴, 질병의 발병 또는 그 증상의 예방하거나 지연시킴, 현재 질병을 앓고 있거나 이전에 앓았던 환자에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시킴 및/또는 환자의 수명을 연장시키는 것을 포함하는, 특히 질병의 완화, 예방 또는 제거의 관찰을 일컫는다. 특히, 이들은 종양의 양에서의 감소 또는 종양이 없는 시간, 무재발 시간 또는 전반적인 생존 시간의 증가의 관찰을 의미한다.
"비-반적응" 또는 "비-반응자"와 같은 용어는 치료 환경에서 환자가 주어진 치료 방식으로 치료 효과가 없다는 사실을 말하며, 특히 질병의 완화, 예방 또는 제거에 대한 관찰된 바가 없는, 즉 환자는 치료에 내성이 있는 상태를 말한다.
완전한 반응은 암과 같은 임의의 잔류 질환이 없는 것으로 정의되며, 일반적으로는 획득된 조직 시료의 병리학적 분석에 의해 평가된다. 이러한 맥락에서 "병리적 완전 반응"(pCR)이라는 용어가 자주 사용된다. 특히, pCR은 원래의 종양상(tumor bed)에서 잔여 침윤성 종양세포가 없는 것으로 정의된다. 그러나, pCR의 정의는 상이한 등급 시스템에 따라 다를 수 있다. 병리적 완전 반응은 보다 나은 생존을 위한 예후 인자로 나타낼 뿐만 아니라, 무병 생존 및 무재발 생존에 대한 예후 인자로도 나타내어졌다.
무재발 생존은 무작위화로부터 재발생 또는 재발까지가 첫 번째, 암 또는 사망까지가 두번째 시간으로서 정의된다.
무진행 생존율(Progression-free survival, PFS)은 치료될 질병(일반적으로 암)이 악화되지 않는 동안에 투약 중 및 투약 후 또는 치료 중 및 치료 후의 시간 길이를 측정하는 생존율의 한 유형이다. 질병에 걸린 사람의 건강을 연구하기 위하여 새로운 치료법이 얼마나 효과적인지 판단하기 위한 척도로 사용되기도 하고, 종종 암 치료를 위한 무작위 통제된 임상시험에서의 임상적 종점으로서 사용된다.
본 발명에 따르면, 용어 "무진행 생존을 경험한 암환자"는 특히 환자의 평균과 비교할 때, 및/또는 주어진 치료 방식에 비-반응자인 환자와 비교할 때, 질환의 진행 없이 연장된 기간을 갖는 암환자에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 연장된 기간은 적어도 4, 바람직하게는 적어도 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6개월, 예컨대 적어도 7개월 또는 적어도 8개월이고, 상기 기간은 예를 들어 치료 첫 투여 시점부터 시작된다.
"임상 결과"라는 용어는 질병의 임상 결과, 예를 들어 특히 치료 후 증상의 감소 또는 개선으로 정의된다.
암과 관련하여 "재발"이라는 용어는 원발 질환의 동일한 부위 및 기관에서 종양세포의 발생, 암의 초기 진단 및 치료 후 수년 동안 나타날 수 있는 원격 전이, 또는 국소 림프절 내로 종양세포의 침윤과 같은 국소적인 사례를 포함한다
"개체" 및 "대상체"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들은 질병이나 장애(예를 들어, 암)로 고통받거나 취약하지만, 질병이나 장애가 있을 수 있거나 없을 수 있는 인간, 비-인간 영장류 또는 기타 포유류(예를 들어 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 많은 실시형태에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않는 한, "개체" 및 "대상체"라는 용어는 특정 연령을 나타내지 않으므로, 성인, 연장자, 어린이 및 신생아를 아우른다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, "개체" 또는 "대상체"는 "환자"이다. 용어 "환자"는 본 발명에 따라 치료 대상, 특히 질환이 있는 대상을 의미한다.
특히 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 암을 가진 것으로 이미 진단된 환자에 대해 수행된다.
"표적 세포"는 암세포와 같은 바람직하지 않은 임의의 세포를 의미할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 CLDN18.2를 발현한다.
본 발명의 문맥에서, "보호하다", "예방하다" 또는 "예방적"과 같은 용어는 대상체에서 질병의 발생 및/또는 전파를 예방하는 것에 관한 것이고, 특히, 대상체는 질병을 발달시킬 수 있는 가능성을 최소화하거나 질병 발달을 지연시키는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 암에 걸릴 위험이 있는 환자는 암을 예방하기 위한 치료법의 후보자가 될 수 있다.
"위험이 있는"이란, 일반 집단과 비교하여, 질병, 특히 암을 발달시킬 확률이 정상보다 높은 것으로 확인된 대상체를 의미한다. 또한, 질병, 특히 암을 앓았거나 현재 앓고 있는 대상체는 질병을 발달할 위험이 증가된 대상체이며, 예컨대 대상체는 계속 질병을 발달할 수 있다. 현재 암을 갖고 있거나 암에 걸린 적 있는 대상체는 암 전이 위험이 증가한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료의 투여와 관련하여 용어 "조합"은 하나 이상의 치료요법 또는 치료제의 사용을 일컫는다. "조합하여"라는 용어의 사용은 치료요법 또는 치료제가 대상에게 투여되는 순서를 제한하는 것은 아니다. 치료요법 또는 치료제는 제2 치료요법 또는 치료제를 대상체에게 투여하기 전에, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 치료요법 또는 치료제는 치료요법 또는 치료제가 함께 작용할 수 있는 순서, 양 및/또는 시간 간격으로 환자에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 치료요법 또는 치료제는 달리 투여된 경우, 특히 서로 독립적으로 투여된 경우보다, 증가된 이익을 제공하는 순서, 양 및/또는 시간 간격으로 대상체에게 투여된다. 바람직하게, 증가된 이익은 상승 효과가 있다.
"질병"이란 용어는 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 말한다. 질병은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 건강 상태로 해석된다. 질병은 전염병과 같은 외부 원인에 기인한 인자에 의해 야기 될 수 있으며, 자가면역질환과 같은 내부 기능장애에 의해 야기될 수 있다. 인간의 경우, "질병"은 통증, 기능장애, 고통, 사회적 문제, 또는 고통을 당한 개체에게 죽음, 또는 개체와 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 초래하는 임의의 상태를 지칭하기 위해 더 광범위하게 사용된다. 보다 넓은 의미에서는, 때때로 상해, 장애, 장애증상, 증후군, 감염, 격리된 증상, 비정상적인 행동, 및 구조와 기능의 비정형 변형을 포함하지만 다른 맥락 또는 다른 목적을 위해 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 질병은 대개 신체적으로뿐만 아니라 감정적으로도 개인에게 영향을 미치며, 많은 질병에 걸리고 질병과 삶을 사는 것은 삶에 대한 자신의 견해와 개인의 성격을 바꿀 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "질병"은 암, 특히 본원에 기재된 암의 형태를 포함한다. 암 또는 암의 특정 형태에 대한 임의의 언급은 이의 암 전이를 또한 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 따라 치료될 질병은 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 발현하는 세포를 포함한다.
"종양 항원을 발현하는 세포를 포함하는 질병"은 본 발명에 따라 CLDN18.2와 같은 종양 항원이 병든 조직 또는 기관의 세포에서 발현된다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 병든 조직 또는 기관의 세포에서 종양 항원의 발현은 건강한 조직 또는 기관의 상태와 비교하여 증가된다. 증가는 적어도 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 이상으로 증가하는 것을 일컫는다. 일 실시형태에서, 발현은 병든 조직에서만 발견되는 반면, 상응하는 건강한 조직에서 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, 종양 항원을 발현하는 세포를 포함하는 질환은 암 질환을 포함한다. 또한, 본 발명에 따르면, 암 질환은 바람직하게는 암세포가 종양 항원을 발현하는 질환이다.
용어 "암 질환" 또는 "암"은 일반적으로 조절되지 않은 세포 성장인 것을 특징으로 하는 개체의 생리 조건을 나타내거나 설명한다. 암의 예로서는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 이러한 암의 예로서는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성기 및 생식 기관의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장세포암종, 신우암, 중추신경 종양(CNS), 신경외배엽 암, 척추 축 종양, 신경교종, 뇌수막종 및 뇌하수체 선종이다. 본 발명에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다. 바람직하게는, "암 질환"은 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 발현하는 세포인 것을 특징으로 하며, 암세포는 이러한 종양 항원을 발현한다. CLDN18.2와 같은 종양 항원을 발현하는 세포는 바람직하게는 본원에 기재된 암의 암세포이다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양" 또는 "종양 질환"은 바람직하게는 종창 또는 병변을 형성하는, 비정상적인 성장하는 세포(종양(neoplastic) 세포, 종양유전자성(tumorigenous) 세포 또는 종양세포라고 함)를 지칭한다. "종양 세포"란 급속하고 통제되지 않은 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 시작한 자극이 중단된 후에도 계속해서 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 구조적 조직체 및 기능적 협응이 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있고, 일반적으로 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는 별개의 조직 덩어리를 형성한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 암은 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 발현하는 암세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 암은 CLDN18.2 양성과 같은 종양 항원 양성이다. 일 실시형태에서, CLDN18.2와 같은 종양 항원의 발현은 세포 표면에서 일어난다. 일 실시형태에서, 암세포의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%는 CLDN18.2 양성과 같은 종양 항원 양성이고/이거나, 암세포의 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%는 CLDN18.2와 같은 종양 항원의 표면 발현에 대해 양성인 것이다. 일 실시형태에서, 암세포의 적어도 95% 또는 적어도 98%는 CLDN18.2 양성과 같은 종양 항원 양성이다. 일 실시형태에서, 암세포의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 CLDN18.2와 같은 종양 항원의 표면 발현에 양성인 것이다.
일 실시형태에서, CLDN18.2을 발현하는 암세포를 포함하는 암 또는 CLDN18.2 양성 암은 위암, 식도암, 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC)과 같은 폐암, 난소암, 대장암, 간암, 두경부암, 및 담낭암과 이들의 전이, 특히 위암 전이, 예컨대 크루켄버그 종양, 복막 전이 및 림프절 전이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 암은 선암, 특히 진행성 선암이다. 특히 바람직한 암 질환은 위암, 식도, 췌관, 담관, 폐 및 난소의 선암이다. 일 실시형태에서, 암은 위암, 식도암, 특히 하부 식도암, 식도-위 접합부의 암 및 위식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 암은 위식도암, 예컨대 전이성, 불응성 또는 재발성 진행성 위식도암이다. 일 실시형태에서, CLDN18.2 양성 종양은 상기 암 유형의 종양이다.
CLDN18.2 양성 종양 또는 CLDN18.2를 발현하는 암세포와 관련된 실시형태는 바람직하게는 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체의 사용을 포함한다. 일 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 단일 클론 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체 또는 항체의 단편이다.
본 발명에 따르면, "암종"은 상피 세포로부터 유래된 악성 종양이다. 이 그룹은 일반적인 형태의 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암의 흔한 형태를 포함하는, 가장 흔한 암을 나타낸다.
"선암"은 선 조직에서 발생하는 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직으로 알려진 더 큰 조직 카테고리의 일부이다. 상피 조직에는 피부, 선 및 신체의 체강 및 기관을 정렬하는 다양한 조직이 포함된다. 상피는 발생학적으로 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래된다. 선암으로 분류되기 위해, 세포가 분비 성질을 가지는 한, 반드시 선의 일부일 필요는 없다. 선종의 이러한 형태는 인간을 포함한 일부 고등 포유류에서 발생할 수 있다. 잘 분화된 선암은 그들이 유래한 선 조직과 유사한 경향이 있는 반면에, 열악하게 분화된 것은 그러하지 않은 것이다. 생검으로부터 세포를 염색함으로써, 병리학자는 종양이 선암인지 또는 다른 유형의 암인지 여부를 결정할 것이다. 선암은 신체 내 어디에나 있는 선의 특성상 신체의 많은 조직에서 발생할 수 있다. 각각의 선은 동일한 물질을 분비하지 않을 수 있지만, 세포에 외분비 기능이 있는 한, 이는 선으로 간주되며, 따라서 악성 형태는 선암으로 명명된다. 악성 선암은 다른 조직을 침범하고 그렇게 하기에 충분한 시간이 주어지면 종종 전이된다. 난소 선암은 가장 흔한 유형의 난소 암종이다. 이는 장액 및 점점액성 선암, 투명세포 선암 및 자궁내막양 선암을 포함한다.
"전이"란 암세포가 원래 위치에서 다른 신체 부위로 전파되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발성 종양으로부터 악성 세포를 분리하고, 세포외 기질로 침투하며, 내피 기저막으로 침투하여 체강과 혈관에 침투한 다음, 혈액에 의해 운반된 후, 표적 기관으로 침투한다. 마지막으로, 표적 부위에서 새로운 종양의 성장은 신생혈관에 달려있다. 종양 전이는 종종 종양세포 또는 성분이 전이 잠재성을 유지하고 발달시킬 수 있기 때문에 원발성 종양의 제거 후에도 발생한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따르면 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 떨어진 전이와 관련된 "원격 전이"에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따르면 용어 "전이"는 림프절 전이에 관한 것이다. 본 발명의 치료요법을 사용하여 치료할 수 있는 특정 전이 형태는 일차 부위로서 위암으로부터 기원하는 전이인 것이다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 위암 전이는 크루켄버그 종양, 복막 전이 및/또는 림프절 전이이다.
불응성 암은 특정 치료가 비효율적이거나, 치료 초기에는 반응이 없거나, 또는 시간이 지남에 따라 무반응이 되는 악성 종양이다. "불응성", "무반응성" 또는 "내성"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
크루켄버그 종양은 모든 난소 종양 중 1 내지 2%를 차지하는 난소의 드문 전이성 종양이다. 크루켄버그 종양의 예후는 여전히 매우 열악하며 크루켄버그 종양에 대해 확립된 치료법은 전무하다. 크루켄버그 종양은 난소의 전이성 인환세포 선암이다. 위장은 대부분의 크루켄버그 종양 사례에서 원발성 병소이다(70%). 대장, 맹장 및 유방(주로 침윤성 소엽 암종)의 암종은 다음으로 가장 흔한 원발성 병소이다. 담낭, 담관, 췌장, 소장, 파터팽대, 자궁 경부암 및 방광/요막관의 암종으로부터 유래한 크루켄버그 종양의 드문 사례가 보고되고 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수술"은 수술 중에 종양의 제거를 포함한다. 이는 암에 대한 일반적인 치료법이다. 외과 의사는 국소 절제술을 사용하여 종양을 제거할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화학요법"은 화학요법성 제제의 사용 또는 화학요법성 제제의 조합을 사용하는 것을 의미하며, 바람직하게는 세포를 죽이거나 분열을 중단시킴으로써 암세포의 성장을 중단시키는 것을 의미한다. 화학요법을 구강 섭취 또는 정맥이나 근육에 주사하면, 그 약물이 혈류에 들어가 몸 전체의 암세포에 도달할 수 있다(전신성 항암화학요법). 화학요법이 뇌척수액, 기관 또는 복부와 같은 체강에 직접적으로 배치되면, 그 약물은 주로 해당 부분의 세포에 영향을 준다(국소성 화학요법).
본 발명에 따른 화학요법성 제제는 세포증식억제제 화합물 및 세포독성 화합물을 포함한다. 전통적인 화학요법성 제제는 대부분의 암세포의 주요 특성 중 하나인, 급속하게 분열하는 세포를 죽임으로써 작용한다. 또한, 이는 화학요법이 골수, 소화관 및 모낭에 있는 세포와 같이 정상적인 상황에서 빠르게 분열하는 세포에도 해를 끼친다는 것을 의미한다. 이는 화학요법의 가장 흔한 부작용을 초래한다. 본 발명에 따르면, 용어 "화학요법"은 바람직하게는 암세포(종양 항원)에서 비정상적으로 발현되는 단백질을 표적으로 하고 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 암세포(종양 항원)에서 비정상적으로 발현되고 항체에 접합된 치료적 일부분 또는 제제를 통해 작용하는 단백질을 표적으로 하는 항체는, 화학요법의 한 형태로 볼 수 있다. 그러나, 가장 엄격한 의미에서, 본 발명에 따른 용어 "화학요법"은 표적화된 치료를 포함하지 않는다.
본 발명에 따르면, 용어 "화학요법성 제제"는 탁산, 백금 화합물, 뉴클레오 시드 유사체, 캠토테신(camptothecin) 유사체, 안트라사이클린, 에토포시드(etoposide), 블레오마이신(bleomycin), 비노렐빈(vinorelbine), 시클로포스파미드, 및 이들의 조합물을 포함한다. 본 발명에 따르면, 화학요법성 제제에 대한 언급은 임의의 전구약물, 예컨대 에스테르, 상기 제제의 접합체와 같은 염 또는 유도체를 포함하는 것이다. 예로서는 담체 물질과 상기 제제의 접합체, 예를 들어 단백질-결합된 파클릭탁셀(paclitaxel), 예컨대 알부민-결합된 파클리탁셀을 들 수 있다. 바람직하게는, 상기 제제의 염은 약제적으로 수용 가능하다.
탁산은 주목(Taxus)속 식물과 같은 천연 원천에서 처음으로 유래된 디테르펜 화합물의 부류이지만, 일부는 인공적으로 합성된 것도 있다. 탁산 계열 약물의 주요 작용 기작은 미세소관 기능의 파괴로, 세포 분열의 과정을 억제하는 것이다. 탁산은 도세탁셀(탁소텔) 및 파클릭탁셀(탁솔)을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "도세탁셀"은 하기 화학식을 갖는 화합물을 나타낸다:
Figure pat00001
특히, 용어 "도세탁셀"은 화합물 1,7β,10β-트리히드록시-9-옥소-5β,20-에폭시탁스-11-엔-2α,4,13α-트리일 4-아세테이트 2-벤조에이트 13-{(2R,3S)-3-[(tert-부톡시카르보닐)-아미노]-2-히드록시-3-페닐프로파노에이트}를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "파클리탁셀"은 하기 화학식을 갖는 화합물을 나타낸다:
Figure pat00002
특히, 용어 "파클릭탁셀"은 화합물 (2α,4α,5β,7β,10β,13α)-4,10-비스-(아세틸옥시)-13-{[(2R,3S)-3-(벤조일아미노)-2-히드록시-3-페닐프로파노일]옥시}-1,7-디히드록시-9-옥소-5,20-에폭시탁스-11-엔-2-일 벤조에이트를 지칭한다.
본 발명에 따르면, "백금 화합물"이라는 용어는 백금 착물과 같은 그 구조 내에 백금을 함유하는 화합물을 지칭하며, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴과 같은 화합물을 포함한다.
용어 "시스플라틴" 또는 "시스플라티넘"은 하기 화학식의 화합물 시스-디암민디클로로플라티넘(II)(CDDP)을 지칭한다:
Figure pat00003
용어 "카보플라틴"은 하기 화학식의 화합물 시스-디암민(1,1-시클로부탄디카복실라토)플라티넘(II)을 지칭한다:
Figure pat00004
용어 "옥살리플라틴"은 하기 화학식의 디아미노시클로헥산 담체 리간드와 착물화된 백금 화합물인 화합물을 지칭한다:
Figure pat00005
특히, 용어 "옥살리플라틴"은 화합물 [(1R,2R)-시클로헥산-1,2-디아민](에탄디오아토-O,O')플라티넘(II)을 지칭한다. 또한, 주사용 옥살리플라틴은 상품명 엘록사틴(Eloxatine)으로 시판되고 있다.
용어 "뉴클레오시드 유사체"는 퓨린 유사체 및 피리미딘 유사체 모두를 포함하는 범주인, 뉴클레오시드의 구조 유사체를 지칭한다.
용어 "겜시타빈"은 하기 화학식의 뉴클레오시드 유사체인 화합물이다:
Figure pat00006
특히, 이 용어는 화합물 4-아미노-1-(2-데옥시-2,2-디플루오로-β-D-에리트로-펜토푸라노실)피리미딘-2(1H)-온 또는 4-아미노-1-[(2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-4-히드록시-5-(히드록시메틸)옥솔란-2-일]-1,2-디히드로피리미딘-2-온을 지칭한다.
용어 "뉴클레오시드 유사체"는 플루오로피리미딘 유도체, 예컨대 플루오로우라실 및 이의 전구약물을 포함한다. 용어 "플루오로우라실" 또는 "5-플루오로우라실"(5-FU 또는 f5U)(상표명 Adrucil, Carac, Efudix, Efudex 및 Fluoroplex로 시판되고 있음)은 하기 화학식의 피리미딘 유사체인 화합물이다:
Figure pat00007
특히, 이 용어는 화합물 5-플루오로-1H-피리미딘-2,4-디온을 지칭한다.
용어 "카페시타빈"(Xeloda, Roche)은 조직에서 5-FU로 전환되는 전구약물인 화학요법성 제제를 지칭한다. 경구 투여될 수 있는 카페시타빈은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pat00008
특히, 이 용어는 화합물 펜틸[1-(3,4-디히드록시-5-메틸테트라히드로푸란-2-일)-5-플루오로-2-옥소-1H-피리미딘-4-일]카바메이트를 지칭한다.
용어 "폴리닌산" 또는 "류코보린"은 화학요법성 제제인 5-플루오로우라실과의 상승작용성 조합물로 유용한 화합물을 지칭한다. 따라서, 본원에서 5-플루오로우라실 또는 이의 전구약물의 투여를 언급하면, 일 실시형태에서 상기 투여는 폴리닌산과 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다. 폴리닌산은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pat00009
특히, 이 용어는 화합물 (2S)-2-{[4-[(2-아미노-5-포르밀-4-옥소-5,6,7,8-테트라히드로-1H-프테리딘-6-일)메틸아미노]벤조일]아미노}펜탄디온산을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "캠토테신 유사체"는 화합물 캠토테신(CPT; (S)-4-에틸-4-히드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-3,14-(4H,12H)-디온)의 유도체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "캠토테신 유사체"는 하기 구조를 포함하는 화합물을 지칭한다:
Figure pat00010
본 발명에 따르면, 바람직한 캠토테신 유사체는 DNA 효소 토포이소머라아제 I(topo I)의 저해제이다. 본 발명에 따른 바람직한 캠토테신 유사체는 이리노테칸 및 토포테칸이다.
이리노테칸은 DNA가 토포이소머라아제 I의 억제에 의해 풀리는 것을 막는 약물이다. 화학적으로 말하면, 이는 하기 화학식을 갖는 천연 알칼로이드 캠토테신의 반합성(semisynthetic) 유사체이다:
Figure pat00011
특히, 용어 "이리노테칸"은 화합물 (S)-4,11-디에틸-3,4,12,14-테트라히드로-4-히드록시-3,14-디옥소1H-피라노[3',4':6,7]-인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-9-일-[1,4'-바이피페리딘]-1'-카복실레이트를 지칭한다
토포테칸은 화학식의 토포이소머라아제 저해제이다:
Figure pat00012
특히, 용어 "토포테칸"은 화합물 (S)-10-[(디메틸아미노)메틸]-4-에틸-4,9-디히드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 모노히드로클로라이드를 지칭한다.
안트라사이클린은 항생제이기도 한 암 화학요법에서 흔히 사용되는 약물 계열이다. 구조적으로, 모든 안트라사이클린은 통상적인 4개의 환형 7,8,9,10-테트라히드로테트라센-5,12-퀴논 구조를 공유하며, 일반적으로 특정 부위에서 글리코실화가 요구된다.
안트라사이클린은 하기 작용 기작 중 하나 이상을 일으키는 것이 바람직한다: 1. DNA/RNA 가닥의 염기쌍 사이에 삽입함으로써 DNA 및 RNA 합성을 억제하여 급속 성장하는 암세포의 복제를 막는다. 2. 토포이소머라아제 II 효소를 억제하고, 초나선 DNA의 이완을 방지하여 DNA 전사와 복제를 차단한다. 3. DNA 및 세포막을 손상시키는 철-매개성 자유 산소 라디칼을 생성한다.
본 발명에 따르면, 용어 "안트라사이클린"은 바람직하게는 토포이소머라아제 II에서 DNA의 재결합을 억제함으로써 바람직하게는 제제, 바람직하게는 세포예정사를 유도하기 위한 항암제에 관한 것이다.
안트라사이클린 및 안트라사이클린 유사체의 예로서는 다우노루비신 (다우노마이신), 독소루비신 (아드리아마이신), 에피루비신, 아이다루비신, 로도마이신, 피라루비신(pyrarubicin), 발루비신(valrubicin), N-트리플루오로-아세틸 독소루비신-14-발레레이트, 아클라시노마이신, 모르폴리노독소루비신 (모르폴리노-DOX), 시아노모르폴리노-독소루비신 (시아노-모르폴리노-DOX), 2-피롤리노-독소루비신 (2-PDOX), 5-이미노다우노마이신, 미톡산트론 및 아클라시노마이신 A (아클라루비신)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 미톡산트론은 안트라사이클린의 슈가 일부분은 결여되지만 DNA 내로 삽입을 허용하는 평면형 다환방향족 고리 구조를 유지하는 안트라사이클린 유사체인, 화합물의 안트라센디온 계열의 구성원이다.
본 발명의 문맥 상에서 안트라사이클린으로서 구체적으로 고려되는 것은 에피루비신이다. 에피루비신은 하기 화학식을 갖는 안트라사이클린 약물이다:
Figure pat00013
또한, 미국에서는 상표명 Ellence으로 시판되고 있고, 그 밖의 국가에서는 Pharmorubicin 또는 Epirubicin Ebewe라는 상표명으로 시판되고 있다. 특히, 용어 "에피루비신"은 화합물 (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-아미노-5-히드록시-6-메틸-옥산-2-일]옥시-6,11-디히드록시-8-(2-히드록시아세틸)-1-메톡시-8-메틸-9,10-디히드로-7H-테트라센-5,12-디온을 지칭한다. 에피루비신은 부작용이 적은 것으로 나타나기 때문에 일부 화학요법에서 가장 널리 사용되는 안트라사이클린인 독소루비신보다 선호된다.
용어 "에토포시드"는 항종양 활성을 나타내는 포도필로톡신의 반합성 유도체를 지칭한다. 에토포시드는 토포이소머라아제 II 및 DNA와 복합체를 형성함으로써 DNA 합성을 억제한다. 이 복합체는 이중가닥 DNA에서 절단을 유도하고 토포이소머라아제 II 결합에 의한 수선을 방지한다. 축적된 DNA 단절은 세포 분열의 유사분열 단계로의 진입을 막아 세포 사멸을 유도한다. 에토포시드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pat00014
특히, 이 용어는 화합물 4'-데메틸-에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-베타-D-글루코피라노시드], 4'-(디히드로겐 포스페이트)를 지칭한다.
용어 "블레오마이신"은 세균 Streptomyces verticillus에 의해 생산된 당펩티드 항생제를 지칭한다. 항암제로 사용되는 경우 DNA가 파괴되어 작동한다. 블레오마이신은 바람직하게는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pat00015
용어 "비노렐빈"은 반-합성 빈카 알칼로이드이며 유방암과 비소세포성 폐암을 포함하는 일부 유형의 암 치료제로서 사용되는 항-유사분열 화학요법 약물을 지칭한다. 비노렐빈은 바람직하게는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pat00016
시클로포스파미드는 옥사조포린 그룹으로부터의 질소 머스타드 알킬화제이다. 시클로포스파미드의 주요 용도는 일부 형태의 암 치료에 다른 화학요법 제제와 함께 사용하는 것이다. 시클로포스파미드는 바람직하게는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
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본 발명의 문맥 상에서, 용어 "방사선 요법"은 고-에너지 x선 또는 다른 유형의 방사선을 사용하여 암세포를 죽이거나 이들의 성장을 막는 것을 지칭한다. 방사선 요법에는 두 가지 유형이 있다. 외부 방사선 요법은 신체 외부의 기계를 사용하여 암 쪽으로 방사선을 보내는 것이다. 내부 방사선 요법은 암의 내부로 또는 암의 근방에 직접 배치되는 니들, 씨드, 와이어, 또는 카테터에 밀봉된 방사성 물질을 사용하는 것이다. 방사선 요법의 방법은 치료될 암의 유형 및 단계에 따라 다르게 부여된다.
본 발명에 따르면, 용어 "표적 치료"는 암세포와 같은 우선적으로 병든 세포를 표적화하지만, 질환이 없는 세포는 보다 적은 정도로 표적화되거나 표적화되지 않는데 사용될 수 있는 임의의 요법에 관한 것이다. 병든 세포의 표적화는 바람직하게는 병든 세포의 증식 또는 생존력의 감소 및/또는 손상을 야기한다. 이러한 요법은 i) 종양 항원, 예를 들어, CLDN18.2와 같은 병든 세포 상의 특정 세포 표면 표적을 표적으로 하는 치료적 일부분에 네이키드된(naked) 또는 접합된 항체, 항체 단편 및 단백질(예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 CLDN18.2에 대한 항체 또는 항체 접합체) 또는 ii) 병든 세포의 증식 또는 생존력을 저해하는 작은 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제제는 정상 줄기세포보다 병든 세포 상에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, 제제는 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 전통적인 화학요법 또는 방사선요법은 종종 종양을 목표로 하고 있음에도 불구하고 "표적 치료"로 간주되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 용어 "항체 요법"은 바람직하게는 치료적 일부분에 접합된 항체, 단편 또는 이의 유도체로 하는 요법을 포함하지 않지만, 단지 이는 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는 항체, 단편 또는 이의 유도체로 하는 요법에 관한 것이다.
용어 "항원"은 면역반응이 생성되도록 하는 것 및/또는 유도되도록 하는 에피토프를 포함하는 제제에 관한 것이다. 용어 "항원"은 특히 단백질, 펩티드, 다당류, 핵산, 특히 RNA와 DNA, 및 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 용어 "항원"은 형질전환을 통해서(예를 들어, 분자 내에서 개재하거나 단백질 몸체로 완결됨으로써) 항원성 및 증감작용성만을 가지게 되는 제제를 포함한다. 항원 또는 이의 가공 생성물은 바람직하게는 T 또는 B 세포 수용체, 또는 항체와 같은 면역글로불린 분자에 의해 인식 가능하다. 바람직한 실시형태에서, 항원은 CLDN18.2와 같은 종양 항원과 같은 질환 관련 항원이다.
본 발명의 문맥 상에서, 용어 "종양 항원" 또는 "종양-관련 항원"은 종양세포에 존재하는 항원에 관한 것이다. 바람직하게는 항원은 종양세포의 표면 상에서와 같이 종양세포 상에 존재한다. 바람직하게는, "종양 항원"은 종양세포에 의해 발현된다. 일 실시형태에서, 용어 "종양 항원"은 정상세포, 즉 비-종양세포와 비교할 경우 종양세포에서 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 발현은 종양세포에서만 발견될 수 있지만 정상세포, 즉 비-종양세포에서는 발견될 수 없거나, 발현 수준은 정상세포, 즉 비-종양세포와 비교하여 종양세포에서 더 높을 수 있다. 일 실시형태에서, 용어 "종양 항원"은 정상 조건 하에서 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되고 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 문맥 상에서, 종양 항원은 바람직하게는 암세포의 세포 표면과 관련되며, 바람직하게는 정상 조직 및 정상 세포에서 발현되지 않거나, 드물게 발현되거나 보다 낮은 수준으로 발현된다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 종양 항원은 발현 수준이 검출 한계 미만인 경우 및/또는 발현 수준이 너무 낮아 세포에 첨가된 종양 항원-특이적 항체에 의한 결합을 허용할 수 없는 경우, 세포에서 발현되지 않는다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 종양 항원은 CLDN18.2이다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양 항원-양성 암" 또는 "종양 항원-양성 종양" 또는 이와 유사한 용어는 종양 항원을 발현하는 암 또는 종양세포를 포함하는 암 또는 종양을 의미하고, 바람직하게는 상기 암세포 또는 종양의 표면에 종양 항원을 발현하는 암 또는 종양세포를 포함하는 암 또는 종양을 의미한다. 종양 항원은 상기 세포의 표면에 위치하고, 세포에 첨가된 종양 항원-특이적 항체에 의한 결합을 허용 가능하다면 세포 표면 상에 발현된다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, "종양 항원-양성 암" 또는 "종양 항원-양성 종양"은 "CLDN18.2-양성 암" 또는 "CLDN18.2-양성 종양"이다. 본 발명에 따르면, 용어 "CLDN18.2 양성 암" 또는 "CLDN18.2-양성 종양"은 CLDN18.2를 발현하는 암 또는 종양세포를 포함하는 암 또는 종양을 의미하고, 바람직하게는 상기 암세포 또는 종양세포의 표면 상에 CLDN18.2를 발현하는 암 또는 종양세포를 포함하는 암 또는 종양을 의미한다.
"세포 표면"은 본 기술분야에서 이의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 다른 분자에 의한 결합이 허용 가능한 세포의 외부를 포함한다.
본 발명의 문맥 상에서 용어 "세포밖 부분"은 세포의 세포밖 공간을 향하고, 바람직하게는 예를 들어 세포 외부에 위치한 항체와 같은 항원-결합 분자에 의해 상기 세포의 외부로부터 접근 가능한 단백질과 같은 분자의 일부를 지칭한다. 바람직하게는, 이 용어는 하나 이상의 세포밖 루프 또는 도메인 또는 이의 단편을 지칭한다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2는 발현 수준이 위 세포 또는 위 조직에서의 발현과 비교하여 더 낮으면 세포에서 실질적으로 발현되지 않는다. 바람직하게는, 발현 수준은 위 세포 또는 위 조직에서의 발현의 10% 미만, 바람직하게는 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.05% 미만이거나 심지어 더 낮다. 바람직하게는, 발현 수준이 위 이외의 비-암성 조직에서의 발현 수준을 단지 2배, 바람직하게는 1.5배로 초과하고, 바람직하게는 상기 비-암성 조직에서의 발현 수준을 초과하지 않는 경우, CLDN18.2는 세포에서 실질적으로 발현되지 않는다. 바람직하게는, CLDN18.2는 발현 수준이 검출 한계 미만인 경우 및/또는 발현 수준이 너무 낮아 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용할 수 없는 경우, 세포에서 실질적으로 발현되지 않는다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2는 발현 수준이 위 이외의 비-암성 조직에서의 발현 수준을 2배 초과, 바람직하게는 10배, 100배, 1000배, 또는 10000배 초과하는 경우 세포에서 발현된다. 바람직하게는, CLDN18.2는 발현 수준이 검출 한계를 초과하는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 충분히 높은 경우 세포에서 발현된다. 바람직하게는, 세포에서 발현된 CLDN18.2는 상기 세포 표면에 발현되거나 노출된다.
용어 "에피토프"는 분자 내의 항원 결정기, 즉 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어 항체에 의해 인식되는 분자 내의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 에피토프는 면역계에 의해 인식되는 항원 상의 별개의 3차원 부위이다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며 일반적으로 특정 3차원 구조 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성을 가지고 있다. 구조적 및 비-구조적 에피토프는 변성 용매 존재에서 전자에 대한 결합은 손실되지만 후자에 대한 결합은 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적인 부분을 포함하고, 길이가 바람직하게는 5~100, 바람직하게는 5~50, 더욱 바람직하게는 8~30, 가장 바람직하게는 10~25개의 아미노산이고, 예를 들어, 에피토프는 길이가 바람직하게는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 아미노산일 수 있다.
용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개 이상의 중(H) 사슬 및 2개 경(L) 사슬을 포함하는 당단백질 및 이러한 당단백질의 항원-결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 용어 "항체"는 단일 클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일사슬 항체, 예를 들어 scFv 및 항원-결합 항체 단편 예컨대 Fab 및 Fab' 단편을 제한없이 포함하는, 항체의 단편 또는 유도체를 포함하고, 항체의 모든 재조합 형태, 예를 들어, 원핵생물에서 발현된 항체, 비글리코실화된 항체, 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체도 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역(본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역(본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크영역(FR)으로 지칭되는, 더욱 보전된 영역으로 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변적 영역으로 추가적으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지에 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 고전 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일 클론 항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 조제물질을 일컫는다. 단일 클론 항체는 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 일 실시형태에서, 단일 클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된, 비인간 동물, 예를 들어, 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 혼성세포에 의해 생성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 분리된 모든 항체, 예컨대 (a) 면역글로불린 유전자에 대하여 유전자이식(transgenic) 또는 염색체이식(transchromosomal)한 동물(예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 혼성세포로부터 분리된 항체들, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주세포, 예를 들어 형질감염세포(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합의 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 분리된 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변영역 및 불변영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간종의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기서 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형일 수 있거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있고, 예를 들어 인간 면역글로불린과 더 유사하게 변형될 수 있다. 인간화 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열(예를 들어, 마우스 항체로부터 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태는 원래의 항체와 관련하여 변형된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열들과 상동성인 반면, 사슬의 남아있는 세그먼트는 다른 사슬에서의 상응하는 서열과 상동성인 이들 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변영역은 포유류의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 또 다른 것으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이다. 이러한 키메라 형태에 대한 하나의 분명한 이점은 가변영역이 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변영역과 조합하여 비-인간 숙주 유기체로부터의 용이하게 이용가능한 B-세포 또는 혼성세포를 사용하여 현재 알려진 공급원으로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변영역은 제조의 용이함이라는 이점을 가지고, 특이성은 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 인간의 것인 불변영역은 항체들이 비-인간 공급원으로부터의 불변영역인 것보다는 주입될 때 인간 대상체로부터의 면역반응을 이끌어 낼 확률이 낮다. 그러나, 정의는 이러한 특정 예에 제한되는 것은 아니다.
항체는 마우스, 랫, 토끼, 기니아 피그 및 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에 기재된 항체들은 IgA, 예컨대 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM 및 IgD 항체를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 항체는 IgG1의 항체이고, 더욱 상세하게는 IgG1, 카파 또는 IgG1, 람다 동종형(예를 들어 IgG1, κ, λ), IgG2a 항체(예를 들어 IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체(예를 들어 IgG2b, κ, λ) IgG3 항체(예를 들어 IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체(예를 들어 IgG4, κ, λ)를 들 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이종 항체(heterologous antibody)"는 이러한 항체를 생산하는 유전자이식 유기체와 관련하여 규정된다. 이 용어는 유전자이식 유기체로 이루어지지 않은 유기체에서 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 암호화 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭하고, 일반적으로 유전자이식 유기체 이외의 종들로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "헤테로하이브리드 항체"는 다른 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.
본원에 기재된 항체는 바람직하게 분리된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "분리된 항체"는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 종양 항원 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, 인간 종양 항원의 에피토프, 동형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 예를 들어 다른 종(예를 들어, 종양 항원 종 상동체)으로부터의 다른 관련된 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 가지지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, "분리된" 단일 클론 항체의 조합은 상이한 특이성을 가지며, 명확히 정의된 조성물 또는 혼합물로 조합되어 있는 항체에 관한 것이다.
항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편"(또는 간단히 "결합 단편")이라는 용어 또는 유사한 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 실행될 수 있는 것을 나타내고 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로서는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 경첩 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진, dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (vii) 선택적으로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합을 들 수 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 재조합 방법을 이용하여, 이들은 VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 짝을 이루는 단일 단백질 사슬(단일사슬 Fv(scFv)로서 알려져 있다; 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883을 참조)로서 제작하는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 또한, 이러한 단일사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 또 다른 예로서는 (i) 면역글로불린 경첩 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 경첩 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변영역, 및 (iii) CH2 불변영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 미국 특허출원 제 2003/0118592호 및 미국 특허출원 제 2003/0133939호에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 본 기술분야에서 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 상기 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 스크리닝한다.
용어 "결합 도메인"은 본 발명과 관련하여, 주어진 표적 구조/항원/에피토프에 결합하거나/이에 상호작용하는 구조, 예를 들어 항체인 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 도메인은 "항원-상호작용-부위"를 나타낸다.
본 발명의 목적을 위해 본원에 기재된 바와 같이 모든 항체 및 항체의 유도체 예컨대 항체 단편은 용어 "항체"에 포함된다. 용어 "항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 항체, 예를 들어, 항체와 다른 제제의 접합체 또는 항체, 또는 항체 단편을 지칭한다.
천연 발생적인 항체들은 일반적으로 단일 특이성이고, 즉 이들은 단일 항원에 결합한다. 본 발명은 표적 세포(종양 항원을 관여시킴으로써) 및 세포독성 세포와 같은 제2 실체(예를 들어, CD3 수용체를 관여시킴으로써)에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 이중특이성 또는 삼중특이성, 및 사중특이성 등과 같은 다중특이성일 수 있다.
용어 "이중특이적 분자"는 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원, 및 (b) 효과기 세포의 표면 상의 수용체 예컨대 Fc 수용체에 결합하거나 이들과 상호작용할 수 있다. 용어 "다중특이적 분자"는 2개 초과의 상이한 결합 특이성을 갖는 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 효과기 세포의 표면 상의 수용체 예컨대 Fc 수용체, 및 (c) 적어도 하나의 다른 성분에 결합하거나 이들과 상호작용할 수 있다. 따라서, 용어 "종양 항원에 대한 항체"는 종양 항원, 및 효과기 세포 상의 Fc 수용체와 같은 다른 표적에 대한 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적, 및 기타 다중특이적 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 용어 "이중특이적 항체"는 디아바디(diabody)도 포함한다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬에서 발현되지만, 동일한 사슬 상의 2개 도메인 사이에 짝을 이루게 하기에는 너무 짧아서 링커를 사용하고, 이에 따라 그 도메인을 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 이루게 하고 2개의 항원 결합 부위를 창출하는, 2가의 이중특이적 항체이다(예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123을 참조).
본 발명에 따르면, 항체는 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 및/또는 항체에 결합된 치료적 일부분 또는 제제를 통해 이의 치료 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 항체 접합체는 "화학요법성 제제"라는 용어에 포함되는 것으로 간주될 수 있지만, 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 이들의 치료 효과를 발취하는 항체들은 그렇지 않다.
본 발명의 문맥 상에서, 항체는 바람직하게는 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용할 수 있으며, 즉 항체가 특히 병든 세포 상의 종양 항원과 같은 그 표적에 결합된 경우, 본원에 기재된 바와 같이 면역 효과기 기능을 유도한다. 바람직하게는, 상기 면역 효과기 기능은 이들 표면 상에 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 보유하는 암세포와 같은 세포에 대해 작용한다.
본 발명의 문맥 상에서 용어 "면역 효과기 기능"은 예를 들어 종양 파종 및 전이의 억제를 포함하는, 종양 성장의 억제 및/또는 종양 발달의 억제를 야기하는 면역계의 성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 면역 효과기 기능은 암세포의 사멸을 야기한다. 이러한 기능들은 보체 의존적 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포-매개 식세포작용(ADCP), 종양 항원을 운반하는 세포에서의 세포예정사의 유도, 종양 항원을 운반하는 세포의 세포용해 및/또는 종양 항원을 운반하는 세포의 증식 억제를 포함한다. 결합제는 또한 암세포 표면 상의 종양 항원에 결합함으로써 간단히 효과를 발휘할 수도 있다. 예를 들어, 항체는 암세포 표면의 종양 항원에 결합함으로써 종양 항원의 기능을 차단하거나 세포예정사를 유도할 수 있다.
항체-의존적 세포-매개 세포독성
ADCC는 바람직하게는 표적 세포가 항체에 의해 표지되도록 요구하는, 효과기 세포, 특히 림프구의 세포-살상 능력을 설명한다.
ADCC는 바람직하게는 항체가 종양세포 상의 항원에 결합하고 항체 Fc 도메인이 면역 효과기 세포의 표면의 Fc 수용체(FcR)와 결합하는 경우에 발생한다. Fc 수용체의 여러 패밀리가 확인되었으며, 특정 세포 집단은 특징적으로 규정된 Fc 수용체를 발현한다. ADCC는 항원 제시 및 종양-유도성 T 세포 반응의 유도를 나타내는 다양한 정도의 즉각적인 종양 파괴를 직접 유도하는 메커니즘으로서 보여질 수 있다. 바람직하게는, ADCC의 생체내 유도는 종양-지향성 T-세포 반응 및 숙주-유래 항체 반응을 나타낼 것이다.
보체-의존적 세포독성
CDC는 항체에 의해 지시될 수 있는 또 다른 세포-살상 방법이다. IgM은 보체 활성화에 가장 효과적인 동종형이다. 또한, IgG1 및 IgG3는 모두 고전적인 보체-활성화 경로를 통해 CDC를 유도하는데 매우 효과적이다. 바람직하게는, 이 캐스캐이드에서, 항원-항체 복합체의 형성은 IgG 분자와 같은 참가하는 항체 분자의 CH2 도메인 상에서 가깝게 근접하고 있는 복수의 C1q 결합 부위의 노출을 야기한다(C1q는 보체 C1의 3개 소성분 중 하나이다). 바람직하게는 이들 노출된 C1q 결합 부위는 이전에 저친화도의 C1q-IgG 상호작용을 높은 결합활성(avidity)으로 변환하고, 이는 일련의 다른 보체 단백질을 포함하는 일련의 사건을 유발하고 효과기-세포 주 화성 제제/활성화 제제 C3a 및 C5a의 단백질 분해 방출을 유도한다. 바람직하게는, 보체 캐스케이드는 막 상해 복합체의 형성으로 종결되고, 이는 세포막에 구멍을 생성하여 막 내외로 물 및 용질의 자유통과를 촉진시킨다.
본 발명에 따르면, 종양 성장 및/또는 종양 발달을 억제하기 위해, 항체는 세포독소, 약물(예를 들어, 면역 억제제) 또는 방사성동위원소와 같은 치료적 일부분 또는 제제에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 제제는 세포에 유해하고 특히 세포를 죽이는 임의의 제제를 포함한다. 예로서는, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화 에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 아마니틴, 1-디히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 들 수 있다. 항체 접합체를 형성하기 위한 적절한 치료제는 대사길항물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈(fludarabin), 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC, anthramycin), 및 항-유사분열 제제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시형태에서, 치료제는 세포독성 제제 또는 방사성독성 제제이다. 또 다른 실시형태에서, 치료제는 면역억제제이다. 또 다른 실시형태에서, 치료제는 GM-CSF이다. 바람직한 실시형태에서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 황산염, 카르무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드 또는 리신 A이다.
또한, 항체는 방사성동위원소, 예를 들어 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111에 접합되어 세포독성 방사성 의약품을 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키는데 사용될 수 있고, 약물 일부분은 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 일부분은 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 효소적 활성 독소, 또는 이의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장인자와 같은 생명학적 반응 조절제를 포함할 수 있다.
이러한 치료적 일부분을 항체에 접합시키는 기술은 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)를 참고한다.
용어 "종양 항원에 대한 항체" 또는 유사한 용어는 종양 항원에 결합하는 능력에 대한 항체 또는 이를 갖는 항체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 항체는 하기 소정의 표적에 대해 유의한 친화도를 갖고 표준 검사에서 하기 소정의 표적에 결합하면 소정의 표적에 결합할 수 있다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 종종 평형 해리상수(KD)로 측정된다. 바람직하게는, 용어 "유의한 친화도"는 해리상수(KD)가 10-5M 이하, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하, 또는 10-12M 이하인 소정의 표적에 대한 결합을 지칭한다.
항체는 상기 표적에 대해 유의한 친화도를 나타내지 않으면 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없고, 표준 검정에서 상기 표적에 유의적으로 결합하지 않고, 특히 검출 가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항체는 2 이하, 바람직하게는 10, 보다 바람직하게는 20, 특히 50 또는 100㎍/ml 이상의 농도로 존재한다면 상기 표적에 검출 가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항체가 결합 가능한 소정의 표적에 결합하는 것에 대한 KD보다 적어도 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 또는 106-배 초과인 KD를 갖는 상기 표적에 결합하면, 항체는 표적에 대한 유의한 친화도를 갖지 않는다. 예를 들면, 항체가 결합 가능한 표적에 대한 항체의 결합에 대한 KD가 10-7M이면, 항체가 유의한 친화도를 갖지 않는 표적에의 결합에 대한 KD는 적어도 10-6M, 10-5M, 10-4M, 10-3M, 10-2M, 또는 10-1M일 수 있다.
항체는 하기 소정의 표적에 결합할 수 있으나 다른 표적에는 결합할 수 없으면 소정의 표적에 특이적이고, 즉 다른 표적에 대해서는 유의한 친화도를 갖지 않고 표준 검정에서 다른 표적에 유의적으로 결합하지 않는다. 본 발명에 따르면, 항체는 종양 항원에 결합할 수 있지만 다른 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없으면 종양 항원에 특이적인 것이다. 바람직하게는, 항체는 이러한 다른 표적에 대한 친화력 및 결합이 종양 항원-비관련 단백질 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 비-종양 항원 막관통 단백질 예컨대 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체 또는 다른 임의의 특정 폴리펩티드에 대한 친화도 또는 결합도가 유의적으로 넘어서지 않으면 종양 항원에 특이적이다. 바람직하게는, 항체는 특이적이지 않은 표적에 결합하는 것에 대한 KD보다 적어도 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 또는 106-배 미만인 KD를 갖는 표적에 결합하면 제제는 소정의 표적에 대해 특이적이다. 예를 들어, 특이적인 표적에 대한 항체의 결합에 대한 KD가 10-7M이면, 특이적이지 않은 표적에 결합하는 것에 대한 KD는 적어도 10-6M, 10-5M, 10-4M, 10-3M, 10-2M, 또는 10-1M일 수 있었다.
표적에 대한 항체의 결합은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), 및 본원에 기재된 방법을 참조한다. 친화도는 평형 투석법에 의하거나; 제조자가 설명한 일반 절차를 사용하는 BIAcore 2000 기기를 사용하거나; 방사성표지된 표적 항원을 사용하는 방사면역측정법에 의하거나; 또는 숙련된 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해서와 같이 통상적인 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는, 예를 들어 Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)의 방법에 분석될 수 있다. 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건, 예를 들어, 염 농도, pH 하에서 측정되는 경우 다양해질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터, 예를 들어 KD, IC50은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액 및 표준화된 완충액으로 측정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "동종형"은 중쇄 불변영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "동종형 스위칭"은 항체의 부류 또는 동종형이 하나의 Ig 부류에서부터 다른 Ig 부류 중 하나로 변화하는 현상을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 대상에 적용되는 것으로서 "천연 발생하는"이라는 용어는 대상이 천연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 천연 공급원으로부터 분리될 수 있는 유기체(바이러스를 포함한다)에 존재하고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생적이다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "재배열된"은 V 세그먼트가 기본적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 각각 암호화하는 입체배좌에서 D-J 또는 J 세그먼트에 직접 인접하여 위치하는, 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 입체배치를 지칭한다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 좌위는 생식계열 DNA와 비교하여 동정할 수 있고; 재배열된 유전자좌는 적어도 하나의 재조합된 7량체/9량체 상동성 요소를 가질 것이다.
V 세그먼트와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식계열 입체배치"는 V 세그먼트가 D 또는 J 세그먼트에 직접 인접하도록 재조합되지 않는 입체배치를 지칭한다.
바람직하게는, 종양 항원을 발현하는 세포에 대해 종양 항원에 대한 항체의 결합은 종양 항원을 발현하는 세포의 사멸을 유도하거나 매개한다. 종양 항원을 발현하는 세포는 바람직하게는 암세포이고, 특히 본원에 기재된 암 질환의 세포이다. 바람직하게는, 항체는 보체 의존적 세포독성(CDC) 매개성 용균, 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC) 매개성 용균, 세포예정사, 및 종양 항원을 발현하는 세포의 증식 억제 중 하나 이상을 유도함으로써 세포의 사멸을 유도하거나 매개한다. 바람직하게는, 세포의 ADCC 매개성 용균은 효과기 세포의 존재하에 발생하며, 특정 실시형태에서는 단핵구, 단핵성 세포, NK 세포 및 PMN으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 세포의 증식 억제는 브로모데옥시우리딘(5-브로모-2'-데옥시우리딘, BrdU)을 사용하는 분석에서 세포의 증식을 결정함으로써 시험관내 측정할 수 있다. BrdU는 티미딘의 유사체인 합성 뉴클레오시드이고 복제하는 세포의 새롭게 합성된 DNA(세포주기의 S기 동안)에 통합되어, DNA 복제 중에 티미딘으로 대체될 수 있다. 예를 들어, BrdU에 특이적인 항체를 사용하여 포함된 화학물질을 검출하는 것은 이들 DNA를 활발히 복제하고 있던 세포를 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 하나 이상의 하기 특성들에 의해 특징화될 수 있다:
*a) 종양 항원에 대한 특이성;
b) 약 100nM 이하, 바람직하게는, 약 5-10nM 이하 및 더욱 바람직하게는, 약 1-3nM 이하의 종양 항원에 대한 결합 친화도;
c) 종양 항원 양성 세포에서 CDC를 유도하거나 매개하는 능력;
d) 종양 항원 양성 세포에서 ADCC를 유도하거나 매개하는 능력;
e) 종양 항원 양성 세포의 성장을 억제하는 능력;
f) 종양 항원 양성 세포의 세포예정사를 유도하는 능력.
일 실시형태에서, 종양 항원에 대한 항체는 종양 항원에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 종양 항원의 세포밖 도메인 내에 위치한 에피토프에 결합하는 능력을 갖는다. 바람직하게는, 종양 항원에 대한 항체는 종양 항원에 특이적이다. 바람직하게는, 종양 항원에 대한 항체가 세포 표면에 발현된 종양 항원에 결합한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 종양 항원에 대한 항체는 생세포의 표면에 존재하는 종양 항원의 고유한 에피토프에 결합한다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체 또는 CLDN18.2에 대한 항체는 CLDN18.2에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 CLDN18.2의 세포밖 도메인, 특히 제1 세포밖 도메인 내에 위치한 에피토프, 바람직하게는 CLDN18.2의 아미노산 위치 29 내지 78에 결합할 수 있는 항체이다. 특정 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 (i) CLDN18.1 상에 존재하지 않는 CLDN18.2 상의 에피토프, 바람직하게는 서열번호 3, 4, 및 5, (ii) CLDN18.2-루프1 상에 위치하는 에피토프, 바람직하게는 서열번호 8, (iii) CLDN18.2-루프2 상에 위치하는 에피토프, 바람직하게는 서열번호 10, (iv) CLDN18.2-루프D3 상에 위치하는 에피토프, 바람직하게는 서열번호 11, (v) CLDN18.2-루프1 및 CLDN18.2-루프D3을 포함하는 에피토프, 또는 (vi) CLDN18.2-루프D3 상에 위치하는 비-글리코실화된 에피토프, 바람직하게는 서열번호 9에 결합할 수 있는 항체이다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 바람직하게는 CLDN18.2에는 결합하지만 CLDN18.1에는 결합할 수 없는 능력을 갖는 항체이다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2에 특이적이다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 세포 표면에 발현되는 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체이다. 특히 바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 생세포의 표면 상에 존재하는 CLDN18.2의 고유한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 1, 3-11, 44, 46, 및 48-50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드에 결합한다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 상술한 단백질, 펩티드 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체에 특이적이다. CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 1, 3-11, 44, 46, 및 48-50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 펩티드 또는 상기 단백질 또는 펩티드를 발현하는 핵산 또는 숙주세포로 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 암세포, 특히 상기 언급된 암 유형의 세포에 결합하고, 바람직하게는 실질적으로 비-암성 세포에 결합하지 않는다.
바람직하게는, CLDN18.2를 발현하는 세포에 대해 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체의 결합은 CLDN18.2를 발현하는 세포의 사멸을 유도하거나 매개한다. CLDN18.2를 발현하는 세포는 바람직하게는 암세포이고, 특히 종양형성성 위, 식도, 췌장, 폐, 난소, 대장, 간, 두경부 및 담낭 암세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 항체는 보체 의존적 세포독성(CDC) 매개성 용균, 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC) 매개성 용균, 세포예정사, 및 CLDN18.2를 발현하는 세포의 증식 억제 중 하나 이상을 유도함으로써 세포의 사멸을 유도하거나 매개한다. 바람직하게는, 세포의 ADCC 매개성 용균은 효과기 세포의 존재하에 발생하며, 특정 실시형태에서는 단핵구, 단핵성 세포, NK 세포 및 PMN으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 하나 이상의 하기 특성들에 의해 특징화될 수 있다:
a) CLDN18.2에 대한 특이성;
b) 약 100nM 이하, 바람직하게는, 약 5-10nM 이하 및 더욱 바람직하게는, 약 1-3nM 이하의 CLDN18.2에 대한 결합 친화도;
c) CLDN18.2 양성 세포에서 CDC를 유도하거나 매개하는 능력;
d) CLDN18.2 양성 세포에서 ADCC를 유도하거나 매개하는 능력;
e) CLDN18.2 양성 세포의 성장을 억제하는 능력;
f) CLDN18.2 양성 세포의 세포예정사를 유도하는 능력.
특히 바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Germany; 신규 주소: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Germany)에서 기탁된 혼성세포에 의해 생성되며, 이하의 표시 및 기탁번호를 가진다:
a. 2005년 10월 19일에 기탁된 182-D1106-055, 수탁번호 DSM ACC2737
b. 2005년 10월 19일에 기탁된 182-D1106-056, 수탁번호 DSM ACC2738
c. 2005년 10월 19일에 기탁된 182-D1106-057, 수탁번호 DSM ACC2739
d. 2005년 10월 19일에 기탁된 182-D1106-058, 수탁번호 DSM ACC2740
e. 2005년 10월 19일에 기탁된 182-D1106-059, 수탁번호 DSM ACC2741
f. 2005년 10월 19일에 기탁된 182-D1106-062, 수탁번호 DSM ACC2742
g. 2005년 10월 19일에 기탁된 182-D1106-067, 수탁번호 DSM ACC2743
h. 2005년 11월 17일에 기탁된 182-D758-035, 수탁번호 DSM ACC2745
i. 2005년 11월 17일에 기탁된 182-D758-036, 수탁번호 DSM ACC2746
j. 2005년 11월 17일에 기탁된 182-D758-040, 수탁번호 DSM ACC2747
k. 2005년 11월 17일에 기탁된 182-D1106-061, 수탁번호 DSM ACC2748
l. 2006년 10월 26일에 기탁된 182-D1106-279, 수탁번호 DSM ACC2808
m. 2006년 10월 26일에 기탁된 182-D1106-294, 수탁번호 DSM ACC2809
n. 2006년 10월 26일에 기탁된 182-D1106-362, 수탁번호 DSM ACC2810
본 발명에 따른 바람직한 항체는 상기 기재된 혼성세포에 의해 생산되고 상기 혼성세포로부터 수득 가능한 것이고; 즉 182-D1106-055의 경우 37G11, 182-D1106-056의 경우 37H8, 182-D1106-057의 경우 38G5, 182-1106-058의 경우 38H3, 182-D1106-059의 경우 39F111, 182-D1106-062의 경우 43A11, 182-D1106-067의 경우 61C2, 182-D758-035의 경우 26B5, 182-D758-036의 경우 26D12, 182-D758-040의 경우 28D10, 182-D1106-061의 경우 42E12, 182-D1106-279의 경우 125E1, 182-D1106-294의 경우 163E12, 및 182-D1106-362의 경우 175D10이고; 이의 키메라화 및 인간화된 형태를 포함한다.
일 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 (i) 수탁번호 DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, 또는 DSM ACC2810으로 기탁된 클론에 의해 생산 및/또는 이로부터 수득가능한 항체, (ii) (i)에서의 항체의 키메라화 또는 인간화된 형태인 항체, (iii) (i)에서의 항체의 특이성을 갖는 항체, 및 (iv) (i)에서의 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위, 특히 가변 영역을 포함하고 바람직하게는 (i)에서의 항체의 특이성을 갖는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이다.
바람직한 키메라화된 항체 및 이들의 서열을 하기 표에서 나타내고 있다.
Figure pat00018
바람직한 실시형태에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라화 형태는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편과 같은 인간 중쇄 불변영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역(CH)을 포함하는 항체를 포함한다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라화 형태는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편과 같은 인간 경쇄 불변영역으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 항체를 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라화 형태는 서열번호 13에 의해 나타내지는 아미노산 서열 또는 이의 단편과 같은 인간 CH로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 CH를 포함하는 항체 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편과 같은 인간 CL로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 CL을 포함하는 항체를 포함한다.
일 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 카파, 뮤린 가변 경쇄, 인간 카파 경쇄 불변영역 동종이인자형 Km(3), 뮤린 중쇄 가변영역, 인간 IgG1 불변영역, 동종이인자형 G1m(3)을 포함하는 키메라 마우스/인간 IgG1 단일 클론 항체이다.
특정의 바람직한 실시형태에서, 키메라화된 형태의 항체는 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 이의 단편을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 이의 단편을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다.
특정의 바람직한 실시형태에서, 항체의 키메라화 형태는 이하의 가능성 (i) 내지 (ix)로부터 선택된 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체를 포함한다:
(i) 중쇄는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(ii) 중쇄는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(iii) 중쇄는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(iv) 중쇄는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(v) 중쇄는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(vi) 중쇄는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(vii) 중쇄는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(viii) 중쇄는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(ix) 중쇄는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(x) 중쇄는 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 경쇄는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
(v) 또는 (x)에 따른 항체가 특히 바람직하다.
상기에서 사용된 바와 같은 "단편" 또는 "아미노산 서열의 단편"은 항체 서열의 일부, 즉 N 및/또는 C 말단이 짧아진 항체 서열을 나타내는 서열에 관한 것이며, 이는 항체에서 상기 항체 서열을 대체하는 경우에는 CLDN18.2에 대한 상기 항체의 결합을 유지하고 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 상기 항체의 기능, 예를 들어 CDC 매개성 용균 또는 ADCC 매개성 용균을 유지한다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 단편은 상기 아미노산 서열로부터 아미노산 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 단편은 바람직하게는 상기 서열에 관한 것이고, 여기서 N 말단에서의 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 아미노산은 제거된다.
바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 이의 단편을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 이의 단편을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함한다.
특정의 바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 이하의 가능성 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)의 조합을 포함한다:
(i) VH는 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(ii) VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(iii) VH는 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(iv) VH는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(v) VH는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(vi) VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(vii) VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(viii) VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고,
(ix) VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
(v)에 따른 항체가 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 용어 "단편"은 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 바람직하게는 적어도 CDR3 가변영역, 하나 이상의 중쇄 가변영역(VH) 및/또는 하나 이상의 경쇄 가변영역(VL)을 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)은 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 용어 "단편"은 중쇄 가변영역(VH)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 가변영역(VL)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 지칭한다.
바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 이하의 실시형태 (i) 내지 (vi)로부터 선택되는 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 VH를 포함한다:
(i) CDR1 : 서열번호 14의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 14의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 14의 위치 116-125,
(ii) CDR1 : 서열번호 15의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 15의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 15의 위치 116-126,
(iii) CDR1 : 서열번호 16의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 16의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 16의 위치 116-124,
(iv) CDR1 : 서열번호 17의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 17의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 17의 위치 116-126,
(v) CDR1 : 서열번호 18의 위치 44-51, CDR2 : 서열번호 18의 위치 69-76, CDR3 : 서열번호 18의 위치 115-125, 및
(vi) CDR1 : 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2 : 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3 : 서열번호 19의 위치 117-128.
바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 이하의 실시형태 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 VL을 포함한다:
(i) CDR1 : 서열번호 20의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 20의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 20의 위치 115-123,
(ii) CDR1 : 서열번호 21의 위치 49-53, CDR2 : 서열번호 21의 위치 71-73, CDR3 : 서열번호 21의 위치 110-118,
(iii) CDR1 : 서열번호 22의 위치 47-52, CDR2 : 서열번호 22의 위치 70-72, CDR3 : 서열번호 22의 위치 109-117,
(iv) CDR1 : 서열번호 23의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 23의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 23의 위치 115-123,
(v) CDR1 : 서열번호 24의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 24의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 24의 위치 115-123,
(vi) CDR1 : 서열번호 25의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 25의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 25의 위치 115-122,
(vii) CDR1 : 서열번호 26의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 26의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 26의 위치 115-123,
(viii) CDR1 : 서열번호 27의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 27의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 27의 위치 115-123 및
(ix) CDR1 : 서열번호 28의 위치 47-52, CDR2 : 서열번호 28의 위치 70-72, CDR3 : 서열번호 28의 위치 109-117.
바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 이하의 실시형태 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 각각 포함하는 VH 및 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH : CDR1 : 서열번호 14의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 14의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 14의 위치 116-125, VL : CDR1 : 서열번호 21의 위치 49 -53, CDR2 : 서열번호 21의 위치 71-73, CDR3 : 서열번호 21의 위치 110-118,
(ii) VH : CDR1 : 서열번호 15의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 15의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 15의 위치 116-126, VL : CDR1 : 서열번호 20의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 20의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 20의 위치 115-123,
(iii) VH : CDR1 : 서열번호 16의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 16의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 16의 위치 116-124, VL : CDR1 : 서열번호 22의 위치 47 -52, CDR2 : 서열번호 22의 위치 70-72, CDR3 : 서열번호 22의 위치 109-117,
(iv) VH : CDR1 : 서열번호 18의 위치 44-51, CDR2 : 서열번호 18의 위치 69-76, CDR3 : 서열번호 18의 위치 115-125, VL : CDR1 : 서열번호 25의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 25의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 25의 위치 115-122,
(v) VH : CDR1 : 서열번호 17의 위치 45-52, CDR2 : 서열번호 17의 위치 70-77, CDR3 : 서열번호 17의 위치 116-126, VL : CDR1 : 서열번호 24의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 24의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 24의 위치 115-123,
(vi) VH : CDR1 : 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2 : 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3 : 서열번호 19의 위치 117-128, VL : CDR1 : 서열번호 23의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 23의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 23의 위치 115-123,
(vii) VH : CDR1 : 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2 : 서열번호 19의 71-78, CDR3 : 서열번호 19의 위치 117-128, VL : CDR1 : 서열번호 26의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 26의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 26의 위치 115-123,
(viii) VH : CDR1 : 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2 : 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3 : 서열번호 19의 위치 117-128, VL : CDR1 : 서열번호 27의 위치 47-58, CDR2 : 서열번호 27의 위치 76-78, CDR3 : 서열번호 27의 위치 115-123, 및
(ix) VH : CDR1 : 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2 : 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3 : 서열번호 19의 위치 117-128, VL : CDR1 : 서열번호 28의 위치 47 -52, CDR2 : 서열번호 28의 위치 70-72, CDR3 : 서열번호 28의 위치 109-117.
추가적인 바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 바람직하게는 CLDN18.2에 대한 단일 클론 항체, 바람직하게는 본원에 기재된 CLDN18.2의 단일 클론 항체의 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR), 바람직하게는 적어도 CDR3 가변영역, 하나 이상의 중쇄 가변영역(VH) 및/또는 하나 이상의 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고, 바람직하게는 본원에 기재된 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR), 바람직하게는 적어도 CDR3 가변영역, 하나 이상의 중쇄 가변영역(VH) 및/또는 하나 이상의 경쇄 가변영역(VL)을 포함한다. 일 실시형태에서 상기 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR)은 본원에 기재된 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시형태에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 바람직하게는 CLDN18.2에 대한 단일 클론 항체, 바람직하게는 본원에 기재된 CLDN18.2에 대한 단일 클론 항체의 중쇄 가변영역(VH)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 가변영역(VL)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 바람직하게는 본원에 기재된 중쇄 가변영역(VH)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 가변영역(VL)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR, CDR 세트 또는 CDR 세트의 조합을 포함하는 항체는 이들의 사이에 있는 프레임워크영역과 함께 상기 CDR을 포함한다. 바람직하게는, 그 부분은 또한 제1 및 제4 프레임워크영역 중 어느 하나 또는 둘 모두의 적어도 약 50%를 포함할 것이고, 50%는 제1 프레임워크영역의 C-말단 50% 및 제4 프레임워크영역의 N-말단 50%인 것이다. 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 항체의 구축은 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 암호화되는 가변 영역에 잔기 N-말단 또는 C- 말단을 도입시킬 수 있으며, 면역 글로불린 중쇄, 다른 가변 도메인(예를 들어, 디아바디의 생산에서) 또는 단백질 표지를 포함하는 추가적인 단백질 서열에 본 발명의 가변영역을 결합시키는 링커의 도입을 포함한다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR, CDR 세트 또는 CDR 세트의 조합을 포함하는 항체는 인간 항체 프레임워크에 상기 CDR을 포함한다.
본원에서 항체의 중쇄와 관련하여 특정 사슬, 또는 특정 영역 또는 서열을 포함하는 항체는 바람직하게는 상기 항체의 모든 중쇄가 상기 특정 사슬, 영역 또는 서열을 포함하는 상황에 관한 것이다. 이는 항체의 경쇄에 상응하여 적용된다.
본원에 기재된 항체는 항체를 암호화하는 RNA와 같은 핵산을 투여하는 것 및/또는 항체를 암호화하는 RNA와 같은 핵산을 포함하는 숙주세포를 투여하는 것에 의해 환자에게 전달될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 환자에게 투여될 때 항체를 암호화하는 핵산은 네이키드 형태 또는 적합한 전달 운반체, 예컨대 리포솜 또는 바이러스 입자 형태로 혹은 숙주세포 내에 존재시킬 수 있다. 제공된 핵산은 치료적 항체에 대해 적어도 부분적으로 관찰된 불안정성을 완화시키는 일관된 방식으로 장시간에 걸쳐 항체를 생산할 수 있다. 환자에게 전달되는 핵산은 재조합 수단에 의해 생산할 수 있다. 핵산이 숙주세포 내에 존재하지 않은 채로 환자에게 투여되는 경우, 이는 핵산에 의해 암호화되는 항체의 발현을 위해 환자의 세포에 의해 흡수되는 것이 바람직하다. 핵산이 숙주세포 내에 존재하는 동안 환자에게 투여되는 경우, 핵산에 의해 암호화되는 항체를 생산하도록 환자 내 숙주세포에 의해 핵산이 발현되는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 DNA 및 RNA, 예컨대 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산된 분자 및 화학적으로 합성된 분자를 포함하도록 의도된다. 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. RNA에는 시험관내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA가 포함된다.
핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노 바이러스 벡터 또는 바큘로 바이러스 벡터, 또는 인공 염색체 벡터, 예컨대 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 P1 인공 염색체(PAC)를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 벡터뿐만 아니라 클로닝 벡터(cloning vector)를 포함한다. 발현 벡터는 바이러스 벡터뿐만 아니라 플라스미드를 포함하고, 일반적으로 원하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류) 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 DNA 서열을 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 소정의 원하는 DNA 단편을 조작하고 증폭시키는데 사용되며, 원하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능 서열이 결여될 수 있다.
본 발명의 문맥 상에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자에 관한 것이고, 바람직하게는 완전히 또는 대체로 리보뉴클레오티드 잔기로 이루어진 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 히드록실기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 이 용어는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연-발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 비-뉴클레오티드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자의 뉴클레오티드는 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 천연 발생 RNA의 유사체로 지칭할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "RNA"는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"를 포함하고 바람직하게는 이에 관한 것이며, DNA를 주형으로 사용하여 생산될 수 있는 "전사체"에 관한 것이고, 펩티드 또는 단백질을 암호화한다. mRNA는 전형적으로 5' 비번역영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩티드 코딩 영역 및 3' 비번역영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포 내에 및 시험관내에서는 제한된 반감 시간을 갖는다. 바람직하게는, mRNA는 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 본 발명의 일 실시형태에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학 합성에 의해 수득된다. 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있는 것이다. 예를 들어, 시판되어 있는 다양한 시험관내 전사 키트가 존재한다.
본 발명에 따라 사용된 RNA의 발현 및/또는 안정성을 증가시키기 위해, 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않고 이를 변형시킬 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 문맥에서 RNA의 "변형"이라는 용어는 상기 RNA에 천연적으로 존재하지 않는 임의의 RNA의 변형을 포함한다. 이러한 변형된 RNA는 본원에서 용어 "RNA"로 포함된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 RNA는 그 안정성을 증가시키고 및/또는 세포독성을 감소시키기 위해 천연 발생 또는 합성 리보뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 전적으로 시티딘으로 대신하고, 바람직하게는 전적으로 시티딘으로 대신한다. 대안으로 또는 부가적으로, 일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 슈도우리딘은 부분적으로 또는 전적으로 우리딘으로 대신하고, 바람직하게는 전적으로 우리딘으로 대신한다.
일 실시형태에서, 용어 "변형"은 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 RNA에 제공하는 것에 관한 것이다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며 일반적으로 흔치않은 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 실시형태에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 천연 발생적인 RNA 5'-캡을 지칭하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 지칭한다. 본 발명의 문맥 상에서, 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사한 5'-캡 유사체를 포함하고, 바람직하게는 생체 내 및/또는 세포내에서 이에 부착된 경우 RNA를 안정화시키는 능력을 갖도록 변형된다.
바람직하게는, RNA가 세포, 특히 생체내에 존재하는 세포에 전달, 즉 형질주입되는 경우, RNA는 그것이 암호화하는 단백질 또는 펩티드를 발현한다.
용어 "형질주입"은 세포 내로의 핵산, 특히 RNA의 도입에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, 용어 "형질주입"은 세포 내로의 핵산의 도입 또는 이러한 세포에 의한 핵산의 흡수를 포함하며, 여기서 세포는 대상체, 예를 들어 환자에 존재하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 핵산의 형질주입을 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에서 존재할 수 있고, 예를 들어 상기 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 형질주입은 일시적 또는 안정적일 수 있다. 형질주입을 적용한 일부 경우에, 형질주입된 유전 물질이 일시적으로만 발현되는 것으로 충분하다. 형질주입 과정에서 도입된 핵산은 일반적으로 핵 게놈에는 결합되지 않기 때문에 외래 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 분해된다. 핵산의 에피솜 증폭을 허용하는 세포들은 희석율을 크게 감소시킨다. 형질주입된 핵산이 실제로 세포 및 이의 딸 세포의 게놈에 남아있는 것이 바람직하다면, 안정적인 형질주입이 발생해야만 한다. RNA는 이의 암호화된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포로 형질주입될 수 있다.
RNA의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양, 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 시간을 말한다. 본 발명의 문맥 상에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 지속 시간"에 영향을 줄 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장시간에 걸쳐 발현될 것으로 예상될 수 있다.
본 발명의 문맥 상에서, 용어 "전사"는 DNA 서열 내의 유전 암호가 RNA로 전사되는 과정에 관한 것이다. 이어서, 그 RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포계에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관내 합성되는 공정에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터가 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 나타내고, 본 발명에 따르면 용어 "벡터"에 포함되는 것이다.
본 발명에 따르면 용어 "번역"은 메신저 RNA의 가닥이 펩티드 또는 단백질을 제작하기 위해 아미노산의 서열 조립을 유도하는 세포의 리보솜에서의 과정에 관한 것이다.
용어 "발현"은 가장 일반적인 의미로 본 발명에 따라 사용되며, 예를 들어 전사 및/또는 번역에 의한 RNA 및/또는 펩티드 또는 단백질의 생성을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩티드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다. 또한, 이는 핵산의 부분적인 발현도 포함한다. 또한, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 발현은 또한 "정상에서 벗어난 발현" 또는 "비정상적인 발현"도 포함한다.
"정상에서 벗어난 발현" 또는 "비정상적 발현"은 본 발명에 따라, 발현이 예를 들면 특정 단백질, 예를 들면 종양 항원의 정상에서 벗어난 발현 또는 비정상적인 발현에 따른 질환을 갖지 않은 대상체에서의 상태를 기준과 비교하여 변경된 것, 바람직하게는 증가된 것을 의미한다. 발현에서의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100% 이상 증가된 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 그 발현은 병든 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.
"특이적으로 발현되는"이란 용어는 단백질이 본질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 위점막에서 특이적으로 발현되는 종양 항원은 상기 단백질이 위점막에서 주로 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 다른 조직 또는 기관 유형에서 유의한 정도로 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 위점막의 세포에서만 독점적으로 발현되고, 다른 어떤 조직, 예컨대 고환에서 유의적으로 낮은 정도로 발현되는 단백질은 위점막의 세포에서 특이적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 또한 2가지 또는 3가지 조직 유형 또는 기관에서와 같이 하나 이상의 조직 유형 또는 기관에서 정상 조건 하에서 특이적으로 발현될 수 있지만, 바람직하게는 3가지를 초과하지 않는 다른 조직 또는 기관 유형에서 특이적으로 발현될 수 있다. 이 경우, 종양 항원은 이들 기관에서 특이적으로 발현된다. 예를 들어, 종양 항원이 바람직하게는 폐 및 위에서 대략 동등한 정도로 정상 조건 하에 발현되는 경우, 상기 종양 항원은 폐 및 위에서 특이적으로 발현된다.
본 발명에 따르면, 용어 "RNA 암호화"는 RNA가 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우, RNA가 암호화하여 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 몇몇 측면들은 핵산 예컨대 본원에 기재된 항체를 암호화하는 RNA로 시험관내 형질주입시키고 바람직하게는 낮은 전구체 빈도로부터 임상적으로 타당한 세포 수까지 생체외 증폭된 후, 환자와 같은 수용자에게 전달되는 숙주세포의 양자전이에 의존한다. 본 발명에 따라 치료를 위해 사용되는 숙주세포는 처치된 수용자에 대해서 자가(autologous), 동종이계(allogeneic), 또는 동계(syngeneic)일 수 있다.
용어 "자가"는 어떠한 것이든 동일한 대상체로부터 유래된 것을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 대상체로부터 유래된 조직 또는 기관의 이식을 지칭한다. 이러한 절차는 그렇지 않다면 거부 반응을 일으키는 면역 장벽을 극복해주므로 유리하다.
용어 "동종이계"는 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 것을 설명하는데 사용된다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체가 서로 동종이계에 있다고 한다.
용어 "동계"는 동일한 유전자형,을 갖는 개체 또는 조직, 즉 일란성 쌍생아 또는 동일한 동계교배계의 동물 또는 이들의 조직으로부터 유래한 것을 설명하는데 사용된다.
용어 "이종"은 다양한 다른 요소로 구성된 것을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 한 개체의 골수를 다른 개체로 옮기는 것은 이종 이식을 구성한다. 이종 유전자는 대상체 이외의 공급원으로부터 유래된 유전자이다.
본 발명에 따른 용어 "펩티드"는 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 포함하고, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 21개 이상이고, 보다 바람직하게는 8개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개 이하, 특히 100개 이하의 펩티드 결합에 의해 공유결합된 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 큰 펩티드를 지칭하고, 바람직하게는 100개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 용어 "펩티드" 및 "단백질"은 동의어이며 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
특이 아미노산 서열, 예컨대 서열목록에 나타난 아미노산 서열에 관한 본 발명의 교시 내용은 상기 특이 서열들과 기능적으로 동등한 서열들, 예컨대 상기 특이적인 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 특성을 갖는 아미노산 서열들을 야기시키는 상기 특이 서열들의 변이체에 관한 것으로 이해되어야 한다.
한가지 중요한 특성은 항체의 표적에 대한 결합을 유지하는 것 또는 항체의 효과기 기능을 유지하는 것이다. 바람직하게는, 특이 서열에 대한 변이체인 서열은 항체 내의 특이 서열을 대체할 경우 상기 항체의 표적에 대한 결합을 유지하고, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 항체의 기능, 예를 들어 CDC 매개성 용균 또는 ADCC 매개성 용균을 유지한다.
특히 CDR 영역, 초가변영역 및 가변영역의 서열이 그 타겟에 결합하는 항체의 능력을 손실하지 않고 변형될 수 있다는 것은 당업자가 이해할 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 본원에서 특정된 항체의 영역과 동일하거나 고도로 상동적일 수 있다. "고도의 상동성"이란 CDR 내에 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 예컨대 1 내지 3개 또는 1개 또는 2개 치환이 있을 수 있는 것으로 의도된다. 또한, 초가변영역 및 가변영역은 본원에서 구체적으로 개시된 항체의 영역과 실질적인 상동성을 나타내도록 변형될 수도 있다.
본 발명에 따른 용어 "변이체"는 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 입체배좌체, 이소형체, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 천연적으로 존재하는 것들을 지칭한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열에서의 변경에 관한 것이고, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 동정한다. 종 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다. 용어 "변이체"는 번역후 변형된 모든 변이체 및 입체배좌 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 또한, 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에서 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N 말단 및/또는 C 말단 절단 변이체라고도 불린다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 둘 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 결과 생성물의 적절한 스크리닝을 통한 무작위 삽입이 또한 가능하다.
아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 아미노산의 아미노말단 및/또는 카복시말단 융합체를 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 아미노산을 제거하는 것을 특징으로 한다. 결실은 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열 중 적어도 1개의 잔기가 제거되고 또 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다. 상동성 단백질 또는 펩타이드 간에 보존되지 않은 아미노산 서열에서의 위치에 있는 변형 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 변형이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 비하 전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 이들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나로의 치환을 포함한다. 천연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리로 나뉘는데, 산성 아미노산(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성 아미노산(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비전하성 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신)으로 나뉜다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로도 분류된다.
바람직하게는 유사성의 정도, 바람직하게는 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체 인 아미노산 서열 사이의 동일성은 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 기준 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 부여된다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열이 200개의 아미노산으로 구성되는 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 약 20개, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개의 아미노산, 바람직하게는 연속적인 아미노산에 대해 부여된다. 바람직한 실시형태에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 주어진다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 도구를 사용하여, 바람직하게는 가장 양호한 서열 정렬을 사용하여, 예를 들어, Align을 사용하여, 표준 설정을 사용하여, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5을 사용하여 행할 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 퍼센트를 나타낸다. 두 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열들 간의 동일한 아미노산의 퍼센트를 나타낸다.
"퍼센트 동일성"이란 용어는 최상의 정렬 후에 수득된 비교될 두 서열 간에 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내고, 이 백분율은 오직 통계적이며, 두 서열 간의 차이가 무작위로 그리고 그 전체 길이에 걸쳐 분포된다. 2개의 아미노산 서열 간의 서열 비교는 통상적으로 이들을 최적으로 정렬시킨 후 이들 서열을 비교함으로써 실시하며, 상기 비교는 서열 유사성의 국부적 영역을 동정하고 비교하기 위해 세그먼트 또는 "비교 윈도우"에 의해 실시한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 수동 외에도 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 검색방법 또는 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 사용하는 컴퓨터 프로그램에 의해 생성될 수 있다.
퍼센트 동일성은 비교될 2개의 서열 간의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 간의 퍼센트 동일성을 수득함으로써 계산된다.
"세포" 또는 "숙주세포"라는 용어는 바람직하게는 무손상 세포, 즉 효소, 세포 기관 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 무손상 막을 갖는 세포에 관한 것이다. 무손상 세포는 바람직하게는 생세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행 가능한 생세포이다. 바람직하게는 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산으로 형질주입될 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 외인성 핵산으로 형질주입된 세포는 핵산을 발현할 수 있다. 바람직하게는, 외인성 핵산으로 형질주입되어 수용자에게 전달될 때 세포는 수용자에서 핵산을 발현할 수 있다. 용어 "세포"는 박테리아 세포를 포함하고; 다른 유용한 세포는 효모 세포, 진균 세포 또는 포유류 세포이다. 적절한 박테리아 세포는 그람-음성 세균 균주 예컨대 Escherichia coli, Proteus, 및 Pseudomonas의 균주, 및 그람-양성 세균 균주 예컨대 Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, 및 Lactococcus의 균주로부터의 세포를 포함한다. 적합한 진균 세포는 Trichoderma, Neurospora, 및 Aspergillus의 종으로부터의 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 Saccharomyces (예를 들어 Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (예를 들어 Schizo saccharomyces pombe), Pichia (예를 들어 Pichia pastoris 및 Pichia methanolicd), 및 Hansenula의 종으로부터의 세포를 포함한다. 적합한 포유류 세포는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, 및 293 HEK 등을 포함한다. 그러나, 양서 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질의 발현을 위해 당업계에서 사용되는 임의의 다른 세포도 또한 사용할 수 있다. 포유류 세포, 예컨대 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류로부터의 세포들이 양자전이에 특히 바람직하다. 그 세포는 다양한 조직 유형으로부터 유래될 수 있고, 여기에는 일차 세포들 및 세포주들 예컨대 면역계 세포들, 특히 항원-제시 세포 예컨대 수지상 세포 및 T 세포, 조혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포 및 그 밖의 세포 종류가 포함된다. 항원-제시 세포는 이의 표면에서 주요 조직적합성 복합체 관점에서 항원을 나타내는 세포이다. T 세포는 이들의 T세포 수용체(TCR)를 이용하여 이 복합체를 인식할 수 있다.
용어 "유전자이식 동물"은 하나 이상의 이식유전자, 바람직하게는 중쇄 및/또는 경쇄 이식유전자, 또는 이식염색체(동물의 천연 게놈 DNA 내에 통합되거나 통합되지 않은 것)를 포함하는 게놈을 지니는 동물을 지칭하며, 바람직하게는 이식유전자를 발현할 수 있다. 예를 들어, 유전자이식 마우스는 종양 항원 및/또는 종양 항원을 발현하는 세포로 면역화될 때 마우스가 인간 항-종양 항원 항체를 생성하도록 인간 경쇄 이식유전자 및 인간 중쇄 이식유전자 또는 인간 중쇄 이식염색체를 가질 수 있다. 인간 중쇄 이식유전자는 유전자이식 마우스, 예를 들어 HCo7 또는 HCol2 마우스와 같은 HuMAb 마우스의 경우에서와 같이, 마우스의 염색체 DNA에 통합될 수 있거나, 또는 인간 중쇄 이식유전자는 WO 02/43478에 기재된 바와 같이 염색체이식(예를 들어, KM) 마우스의 경우와 같이, 염색체 외에서 유지될 수 있다. 이러한 유전자이식 및 염색체이식 마우스는 V-D-J 재조합 및 동종형 스위칭을 수행함으로써 종양 항원(예를 들어, IgG, IgA 및/또는 IgE)에 대한 인간 단일 클론 항체의 다중 동종형을 생성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "감소", "저감" 또는 "억제"는 수준에서, 발현 수준 또는 세포의 증식 수준에서의 전체적인 감소 또는 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상의 감소, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 감소, 및 가장 바람직하게는 75% 이상 감소시키는 능력을 의미한다.
"증가" 또는 "증진"과 같은 용어는 바람직하게는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 이상으로의 증가 또는 증진에 관한 것이다.
본원에 기재된 항체는 종래의 단일 클론 항체 방법론, 예를 들어 Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 원칙적으로 바람직하지만, 단일 클론 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어, B-림프구의 바이러스성 형질전환 또는 발암성 형질전환 또는 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다.
단일 클론 항체를 분비하는 혼성세포를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 혼성세포 생성은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있는 것이다. 융합 파트너(예를 들어, 뮤린의 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있는 것이다.
단일 클론 항체를 분비하는 혼성세포를 제조하기 위한 다른 바람직한 동물 시스템은 랫 및 토끼 시스템이다 (예를 들어 Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995)에 기재된 것이고, 또한 Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005) 참조).
또 다른 바람직한 실시형태에서, 인간 단일 클론 항체는 마우스 시스템이 아닌 인간 면역계의 일부를 지닌 유전자이식 또는 염색체이식 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 유전자이식 및 염색체이식 마우스는 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 알려진 마우스를 포함하며, 총칭하여 본원에서 "유전자이식 마우스"로 지칭한다. 이러한 유전자이식 마우스에서의 인간 항체 생산은 WO2004-035607에서 CD20에 대해 상세히 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
단일 클론 항체를 생성하기 위한 또 다른 전략은 규정된 특이성의 항체를 생산하는 림프구로부터 항체를 암호화하는 유전자를 직접 분리하는 것이고 예를 들어 Babcock et al., 1996를 참고하고 규정된 특이성의 항체를 생산하는 단일하고 분리된 림프구로부터 단일 클론 항체를 생성하는 신규한 전략에 관한 것이다. 재조합 항체 공학에 대한 자세한 내용은 문헌[Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 및 Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.]을 참조한다.
항체를 생성하기 위해, 기재된 바와 같이, 항원 서열, 즉 항체에 대한 것일 수 있는 서열로부터 유래되는 담체-접합된 펩티드, 재조합적으로 발현된 항원 또는 이의 단편의 농축된 제조물 및/또는 항원을 발현하는 세포에 의해 마우스를 면역화할 수 있다. 또는, 마우스는 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA로 면역화시킬 수 있다. 또한, 정제되거나 농축된 항원 제조물을 사용하는 면역화가 항체를 야기하지 않는 경우에는, 마우스는 항원을 발현하는 세포, 예를 들어, 세포주로 면역화되어 면역반응을 촉진시킬 수 있다.
면역반응은 꼬리 정맥 또는 후안와(retroorbital) 출혈로 얻는 혈장 및 혈청 시료를 가지고 면역 프로토콜 과정을 통해 모니터링할 수 있다. 면역글로불린의 충분한 역가를 갖는 마우스는 융합에 사용할 수 있다. 특정 항체 분비 혼성세포의 비율을 증가시키기 위해 마우스를 희생시키고 비장을 제거하기 3일 전에 마우스에서는 항원 발현 세포로 복강 내 또는 정맥 내에서 증강시킬 수 있다.
단일 클론 항체를 생성하는 혼성세포를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포 및 림프절 세포를 분리하고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합시킬 수 있다. 이어서, 얻어진 혼성세포는 항원-특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 그 후, 개별적인 웰은 ELISA에 의해 항체를 분비하는 혼성세포를 스크리닝할 수 있다. 항원 발현 세포를 이용한 면역형광법 및 FACS 분석을 통해, 항원 특이성을 가진 항체를 동정할 수 있다. 항체 분비 혼성세포는 옮겨질 수 있고, 다시 스크리닝 될 수 있으며, 여전히 단일 클론 항체에 대해서 양성이면 한계 희석에 의해 서브클로닝될 수 있다. 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 특성화를 위해 조직 배양 배지에서 항체를 생성시킬 수 있다.
또한, 항체는 예를 들어 당업계에 잘 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질주입 방법의 조합을 사용하여 숙주세포 형질감염세포에서 생산될 수 있다(Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
예를 들어, 일 실시형태에서, 관심 유전자(들), 예를 들어, 항체 유전자는 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당업계에 공지된 다른 발현 시스템에 의해 사용되는 것과 같이 발현 벡터, 예컨대 진핵생물용 발현 플라스미드 내로 결찰시킬 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드는 진핵 숙주세포, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293T 세포 또는 HEK293 세포 또는 대안으로는 식물 유래 세포, 진균 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵 세포 내에 도입시킬 수 있다. 이들 유전자를 도입하는데 사용된 방법은 전기천공법, 리포펙틴(lipofectine), 리포펙타민(lipofectamine) 등의 당업계에 기재된 방법일 수 있다. 이들 항체 유전자가 숙주세포에 도입된 후, 항체를 발현하는 세포가 동정되고 선택될 수 있다. 이들 세포는 그 발현 수준이 증폭될 수 있고 업스케일(upscale)되어 항체를 생산할 수 있는 형질감염세포를 나타낸다. 재조합 항체는 이들 배양 상등액 및/또는 세포로부터 분리되고 정제될 수 있다.
또는, 클로닝된 항체 유전자는 원핵 세포, 예를 들어 미생물, 예를 들어 E. coli를 포함하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체는 양 및 토끼의 우유 또는 암탉의 난자 또는 유전자이식 식물과 같은 유전자이식 비인간 동물에서 생산될 수 있고, 예를 들어 Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839를 참조한다.
키메라화
뮤린 항체는 반복적인 적용시 사람에서 높은 면역원성을 나타내어 치료 효과의 저하를 일으킨다. 주요 면역원성은 중쇄 불변영역에 의해 매개된다. 사람에서의 뮤린 항체의 면역원성은 각각의 항체가 키메라화되거나 인간화되면 감소하거나 완전히 회피할 수 있다. 키메라 항체는 그 다양한 부분이 상이한 동물종으로부터 유래된 상이한 부분을 갖는 항체이고, 예컨대 뮤린 항체 및 인간 면역글로불린 불변영역으로부터 유래된 가변영역을 갖는 항체들이다. 항체의 키메라화는 뮤린 항체 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 인간 중쇄 및 경쇄의 불변영역과 결합시킴으로써 달성된다(예를 들어, 문헌 [Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8]에 기재되어 있다). 바람직한 실시형태에서, 키메라 항체는 인간 카파-경쇄 불변영역을 뮤린 경쇄 가변영역에 결합시킴으로써 생성한다. 또한 바람직한 실시형태에서, 키메라 항체는 인간 람다-경쇄 불변영역을 뮤린 경쇄 가변영역에 결합시킴으로써 생성시킬 수 있다. 키메라 항체를 생성하기 위해 바람직한 중쇄 불변영역은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 키메라 항체를 생성하기 위한 다른 바람직한 중쇄 불변영역은 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이다.
인간화
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체들 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더 다양성을 가진다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용에 관련되어 있으므로, 다른 성질을 가지는 다른 항체로부터 프레임워크 서열 상에 그래프트화되는 천연 발생적인 특이 항체로부터 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 천연 발생적인 특이 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(예를 들어, 문헌[Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033] 참조한다). 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 이 생식계열 서열은 B 세포 성숙 과정에서 V (D) J 결합에 의해 형성된, 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않기 때문에, 성숙한 항체 유전자 서열과는 다를 것이다. 생식계열 유전자 서열은 또한 가변영역 전체에 걸쳐 균일하게 고도로 친화적인 2차 레퍼토리 항체의 서열과 상이할 것이다.
항체가 항원에 결합하는 능력은 표준 결합 검정법(예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광법 및 유동 세포계측 분석)을 사용하여 결정할 수 있다.
항체를 정제하기 위해, 선택된 혼성세포는 단일 클론 항체 정제를 위해 2-리터 스피너 플라스크에서 성장시킬 수 있다. 대안으로, 항체는 투석 기반 생물반응기에서 생산될 수 있다. 상등액을 여과하고, 필요하다면, 단백질 G-세파로오즈 또는 단백질 A-세파로오즈를 사용하는 친화크로마토그래피 전에 농축시킬 수 있다. 용출된 IgG는 순도를 보장하기 위해 겔 전기영동 및 고속능액체크로마토그래피로 검사할 수 있다. 완충 용액은 PBS 내에서 교환될 수 있으며, 농도는 1.43 흡광계수를 사용하여 OD280에 의해 결정될 수 있다. 단일 클론 항체는 분주하여 -80℃에서 보관할 수 있다.
선택된 단일 클론 항체가 특유 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 부위-지정 또는 다중-위치 지정 돌연변이유발이 사용될 수 있다.
항체의 동종형을 결정하기 위해, 다양한 시판 키트(예를 들어, Zymed, Roche Diagnostics)로 동종형 ELISA를 수행할 수 있다. 미량정량판 플레이트의 웰은 항-마우스 Ig로 도포할 수 있다. 블로킹 후, 플레이트를 단일 클론 항체 또는 정제된 동종형 대조군으로 주위 온도에서 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3, IgA 또는 마우스 IgM-특이적인 퍼옥시다아제-컨쥬 게이트된 프로브와 반응시킬 수 있다. 세척 후, 플레이트는 ABTS 기질(1mg/ml)로 전개시키고 405-650의 OD에서 분석할 수 있다. 또는, IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche, Cat. No. 1493027)를 제조자의 설명대로 사용할 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 생세포에 단일 클론 항체의 결합을 입증하기 위해, 유동 세포계측법을 사용할 수 있다. 천연적으로 발현시킨 세포주 또는 항원의 형질주입 후 발현시킨 세포주 및 항원 발현이 결핍된 음성 대조군을 발현시킨 세포주(표준 성장 조건 하에서 성장시켰다)는 혼성세포 상등액 또는 1% FBS 함유 PBS에서 다양한 농도의 단일 클론 항체와 혼합하고, 4℃에서 30분간 인큐베이팅할 수 있다. 세척 후, APC- 또는 Alexa647-표지된 항 IgG 항체는 일차 항체 염색과 동일한 조건 하에서 항원-결합된 단일 클론 항체에 결합할 수 있다. 시료는 단일 생세포 상에 게이트로 빛과 측면 산란 성질을 사용하는 FACS 계측기로 유동 세포계측법으로 분석할 수 있다. 단일 측정에서 항원-특이적 단일 클론 항체를 비특이적 결합제로부터 구별하기 위해, 공동형질주입의 방법을 채용할 수 있다. 항원을 암호화하는 플라스미드 및 형광성 마커로 일시적으로 형질주입된 세포는 상기한 바와 같이 염색시킬 수 있다. 형질주입된 세포는 항체로 염색된 세포와는 상이한 형광 채널에서 검출될 수 있다. 형질주입된 세포의 대부분은 두 이식유전자 모두를 발현하기 때문에, 항원-특이적 단일 클론 항체는 형광 마커 발현 세포에 우선적으로 결합하는 반면, 비특이적 항체는 비-형질주입된 세포에 비교할만한 비율로 결합한다. 형광 현미경을 사용한 대체적인 검정법은 유동 세포계측 검정법에 더하거나 이 대신에 사용할 수 있다. 세포는 상기한 바와 같이 정확히 염색되어 형광 현미경으로 검사할 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 생세포에 단일 클론 항체의 결합을 입증하기 위해, 면역형광 현미경 분석을 사용할 수 있다. 예를 들어, 자발적으로 또는 항원을 형질주입 후 발현하는 세포주 및 항원 발현이 결핍된 음성 대조군은 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 2mM L-글루타민, 100IU/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 표준 성장 조건 하에 챔버 슬라이드에서 성장시킨다. 이어서, 세포를 메탄올 또는 파라포름알데히드로 고정하거나 치료하지 않고 방치할 수 있다. 다음, 세포를 25℃에서 30분간 항원에 대한 단일 클론 항체와 반응시킬 수 있다. 세척 후, 세포는 동일한 조건 하에서 Alexa555-표지된 항-마우스 IgG 2차 항체(Molecular Probes)와 반응시킬 수 있다. 이어서, 형광 현미경으로 세포를 검사할 수 있다.
항원을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물 및 적절한 음성 대조군을 준비하여 도데실황산나트륨(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 행할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스 막에 전달하고, 차단시키고 시험할 단일 클론 항체로 탐침된다. IgG 결합은 항-마우스 IgG 퍼옥시다아제를 사용하여 검출할 수 있고 ECL 기질로 전개할 수 있다.
항체는 항원과의 반응성을 당업계의 숙련된 자들에게 잘 알려진 방식으로, 면역조직화학법에 의해 추가로 시험할 수 있고, 예를 들어 일상적인 수술 절차 동안 환자로부터 또는 자발적으로 또는 항원을 형질주입 후 발현하는 세포주로 인큐베이팅된 이종이식된 종양을 보유한 마우스로부터 수득된 비-암 조직 또는 암 조직 시료로부터 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정된 동결절단 또는 파라포름알데히드로 고정된 파라핀 매립된 조직 섹션을 사용할 수 있다. 면역염색을 위해, 항원에 반응하는 항체를 인큐베이팅한 다음, 공급 업체의 지시에 따라 호스래디시-퍼옥시다아제 접합된 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 항체(DAKO)를 생성할 수 있다.
항체는 종양 항원을 발현하는 세포의 식세포작용 및 살상을 매개하는 이들의 능력을 시험할 수 있다. 시험관내 단일 클론 항체 활성의 시험은 생체내 모델을 시험하기 전에 초기 스크리닝을 제공할 것이다.
항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)
간략하게는, 건강한 공여자로부터의 다형핵 세포(PMN), NK 세포, 단핵구, 단핵성 세포 또는 다른 효과기 세포는 Ficoll Hypaque 밀도 원심분리법으로 정제시킨 다음, 오염 적혈구의 용균에 의해 정제할 수 있다. 세척된 효과기 세포를 10% 열-불활성화된 태아 송아지 혈청 또는 5% 열-불활성화된 인간 혈청으로 보충된 RPMI에 현탁시키고, 표적 세포에 대한 효과기 세포의 다양한 비율로 종양 항원을 발현하는 51Cr 표지된 표적 세포와 혼합할 수 있다. 또는, 표적 세포는 형광 강화 리간드(BATDA)로 표지될 수 있다. 죽은 세포로부터 방출되는 강화 리간드와 함께 고도의 유로퓸(Europium)의 형광 킬레이트는 형광 측정기로 측정할 수 있다. 다른 대안 기술은 루시퍼라제로 표적 세포의 형질주입을 이용할 수 있다. 이어서, 추가된 루시퍼 옐로우는 생세포에 의해서만 산화될 수 있다. 그 다음, 정제된 항-종양 항원 IgG를 다양한 농도로 첨가시킬 수 있다. 무관한 인간 IgG를 음성 대조군으로 사용할 수 있다. 검정법은 사용된 효과기 세포 유형에 따라 37℃에서 4시간 내지 20시간 동안 수행할 수 있다. 시료는 51Cr 방출 또는 배양 상등액에서 EuTDA 킬레이트의 존재를 측정하여 세포용해를 분석할 수 있다. 또는, 루시퍼 옐로우의 산화로 인한 발광으로 생세포를 측정할 수 있다.
또한, 항-종양 항원 단일 클론 항체는 세포용해가 다중 단일 클론 항체로 강화되는지 여부를 결정하기 위하여 다양한 조합으로 시험할 수 있다.
보체 의존적 세포독성(CDC)
단일 클론 항-종양 항원 항체는 다양한 공지된 기술을 사용하여 CDC를 매개하는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 보체에 대한 혈청은 당업자에게 공지된 방식으로 혈액으로부터 수득될 수 있다. mAb의 CDC 활성을 결정하기 위해, 다른 방법을 사용할 수 있다. 51Cr 방출을 예를 들어 측정하거나 증가된 막 투과성은 프로피디움 요오드화물(PI) 배제법을 사용하여 평가할 수 있다. 간략하게는, 표적 세포를 세척하고 5 x 105/ml를 10-30분 동안 실온 또는 37℃에서 mAb의 다양한 농도로 인큐베이팅할 수 있다. 이어서, 혈청 또는 혈장을 20% (v/v)의 최종 농도로 첨가하고 세포를 37℃에서 20-30분 동안 인큐베이팅하였다. 각 시료의 모든 세포는 FACS 튜브의 PI 용액에 첨가할 수 있다. 그 다음, FACSArray를 사용하여 유동 세포계측법 분석을 통해 즉각적으로 혼합물을 분석할 수 있다.
대체적인 분석에서, CDC의 유도는 접착성 세포에서 결정될 수 있다. 이 분석의 일 실시형태에서, 세포를 조직-배양 넓적 바닥 미량정량판 플레이트에서 3 x 104/웰의 밀도로 분석하기 24시간 전에 접종한다. 다음날 성장 배지를 제거하고 세포를 항체와 함께 3회 인큐베이팅한다. 대조군 세포는 각각 백그라운드 용균 및 최대 용균을 측정하기 위해 성장 배지 또는 각각 0.2% 사포닌을 함유하는 성장 배지와 함께 인큐베이팅한다. 20분 동안 인큐베이션 후, 상온에서 상등액을 제거하고 DMEM(37℃로 예열하였다)에서 20% (v/v) 인간 혈장 또는 혈청을 세포에 첨가하고 37℃에서 20분 동안 더 배양한다. 각 시료의 모든 세포를 프로피디움 요오드화물 용액(10㎍/ml)에 첨가한다. 그 다음에, 상등액을 2.5㎍/ml 브롬화 에티듐을 함유한 PBS로 대체하고 Tecan Safire를 사용하여 520nm에서 여기시의 형광 방출을 600nm에서 측정한다. 특이적 용균 퍼센트는 하기와 같이 계산한다:특이적 용균% = (형광 시료-형광 백그라운드)/(형광 최대 용균-형광 백그라운드) x 100
단일 클론 항체에 의한 세포예정사의 유도 및 세포 증식의 억제
세포예정사를 개시하는 능력을 시험하기 위해, 단일 클론 항-종양 항원 항체는 예를 들어 종양 항원 양성 종양세포 또는 종양 항원 형질주입된 종양세포와 37℃에서 약 20시간 동안 인큐베이팅할 수 있다. 세포를 수확하고, Annexin-V 결합 완충액(BD biosciences)에서 세척하고, 암소에서 FITC 또는 APC(BD biosciences)와 접합된 Annexin V와 15분 동안 인큐베이팅할 수 있다. 각 시료의 모든 세포는 FACS 튜브에 PI 용액(PBS에 10㎍/ml)에 추가하고 유동 세포계측법(상기와 같이)에 의해 즉각적으로 평가할 수 있다. 또는, 단일 클론 항체에 의한 세포 증식의 일반적인 억제는 시판되는 키트로 검출될 수 있다. DELFIA 세포 증식 키트(Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200)는 마이크로플레이트에서 증식하는 세포의 DNA 합성 동안에 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 함유를 측정하는 것을 기반으로 하는 비방사성동위원소면역측정법이다. 함유된 BrdU는 유로퓸으로 표지된 단일 클론 항체를 사용하여 검출된다. 항체 검출을 가능하게 하기 위해, 고정 용액을 사용하여 세포를 고정시키고 DNA를 변성시킨다. 결합되지 않은 항체를 세척하고, DELFIA 유도제를 표지된 항체로부터 용액 내에서 유로퓸 이온을 해리시키기 위해 첨가함으로써, DELFIA 유도제의 성분으로 고도의 형광 킬레이트를 형성한다. 검출 중 시간 경과에 따라 분해된 형광정량법을 이용하여 측정된 형광은 각각 웰의 세포에서의 DNA 합성에 비례한다.
전임상 연구
본원에 기재된 항체는 또한 생체내 모델(예를 들어, 종양 항원을 발현하는 종양세포의 성장을 제어할 시 이들의 효능을 결정하기 위해 종양 항원을 발현하는 세포주와 인큐베이팅한 이종이식된 종양을 보유하는 면역 결핍 마우스에서)에서 시험할 수 있다.
종양 항원 발현 종양세포를 면역약화된 마우스 또는 다른 동물로 이종이식한 후의 생체내 연구는 본원에 기재된 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 항체는 종양세포를 주입에 의해 종양이 없는 마우스에 투여되어 종양의 형성 또는 종양-관련 증상을 예방하는 항체의 효과를 측정할 수 있다. 항체를 종양-보유한 마우스에 투여하여 종양 성장, 전이 또는 종양 관련 증상을 감소시키는 각각의 항체의 치료 효능을 결정할 수 있다. 항체 적용은 세포분열억제 약물, 성장인자 저해제, 세포 주기 저지제, 혈관형성 저해제 또는 다른 항체와 같은 다른 물질의 적용과 조합하여, 조합물의 상승작용성 효능 및 잠재적 독성을 결정할 수 있다. 항체에 의해 매개되는 독성 부작용을 분석하기 위해, 동물에는 항체 또는 대조군 시약과 인큐베이팅하고 종양 항원-항체 요법과 관련될 가능성이 있는 증상을 철저히 조사할 수 있다. 종양 항원 항체의 생체내 적용의 가능한 부작용은 특히 종양 항원 발현 조직에서의 독성을 포함한다. 인간 및 다른 종, 예를 들어 마우스에서의 종양 항원을 인식하는 항체는 인간에서 단일 클론 종양 항원-항체의 적용에 의해 매개되는 잠재적 부작용을 예측하는데 특히 유용하다.
항체에 의해 인식되는 에피토프의 매핑은 문헌 ["Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 및 "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay]에 의해 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및 제제는 임의의 적합한 약제 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
약제 조성물은 바람직하게는 무균 상태이고, 원하는 반응 또는 원하는 효과를 발생시키기 위해 본원에 기재된 항체의 유효량 및 선택적으로 본원에서 논의된 바와 같은 첨가제의 유효량을 포함한다.
약제 조성물은 일반적으로 균일한 투여량으로 제공되며, 그 자체는 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약제 조성물은 예를 들어, 용액이나 현탁액의 형태일 수도 있다.
약제 조성물은 바람직하게는 모두 약제적으로 수용 가능한 염, 완충 물질, 방부제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. "약제적으로 수용 가능한"이라는 용어는 약제 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.
약제적으로 수용되지 않는 염은 약제적으로 수용 가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있으며 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약제적으로 수용 가능한 염은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산 및 숙신산 등의 산으로부터 제조된 것들을 비제한적으로 포함한다. 약제적으로 수용 가능한 염은 또한 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로서 제조될 수 있다.
약제 조성물에 사용하기에 적합한 완충 물질은 염의 아세트산, 염의 시트르산, 염의 붕산 및 염의 인산을 포함한다.
약제 조성물에 사용하기에 적합한 방부제는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.
주사 가능한 제형은 약제적으로 수용 가능한 부형제, 예컨대 링거 락테이트 (Ringer lactate)를 포함할 수 있다.
용어 "담체"는 천연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 말하며, 활성 성분이 적용을 촉진, 증진 또는 가능하게 하기 위해 조합되어 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "담체"는 또한 환자에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다.
가능한 비경구 투여용 담체 물질은 예를 들어, 멸균수, 링거(Ringer), 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히 생체혼용가능한 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드(glycolide) 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "부형제"는 약제 조성물에 존재할 수 있고 예를 들어 담체, 바인더, 윤활제, 증점제, 표면활성제, 방부제, 유화제, 완충액, 향료 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 모든 물질을 가리키도록 한다.
본원에 기재된 제제 및 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통해, 예컨대 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하는 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 비경구적으로, 예를 들어. 정맥내, 동맥내, 피하, 피부층 사이에 또는 근육내로 투여될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 활성 화합물의 멸균수용액 또는 비수성 제조물을 포함하며, 이는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성이다. 호환되는 담체 및 용매의 예로서는 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 일반적으로 멸균된 고정유가 용액 또는 현탁 매질로 사용된다.
본원에 기재된 제제 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 상태를 치료하는 경우에, 바람직한 반응은 바람직하게는 상기 질환의 경과의 억제에 관한 것이다. 이는 질병의 진행을 늦추고, 특히 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 증상의 치료에서 바람직한 반응은 또한 상기 질병 또는 상기 증상의 발병의 지연 또는 발병의 예방일 수 있다. 특히, 용어 "유효량"은 암 및 이의 하나 이상의 증상의 발달, 재발 또는 발병을 예방하고, 중증도, 암의 지속 기간을 줄이고, 암의 하나 이상의 증상을 개선하고, 암의 진행을 방지하며, 암의 퇴행을 유발하고 및/또는 암 전이를 예방하기에 충분한 치료의 양을 지칭한다. 본 발명의 실시형태에서, 치료의 양은 암 줄기세포 집단의 안정화, 감소 또는 제거 및/또는 원발성 암, 전이성 암 및/또는 재발성 암의 박멸, 제거 또는 제어를 달성하는데 효과적이다.
본원에 기재된 제제 또는 조성물의 유효량은 치료될 상태, 질환의 중증도, 환자의 연령, 생리 상태, 사이즈 및 중량, 치료 기간, 동반 요법의 종류(있는 경우), 특정 투여 경로 및 이와 유사한 인자들을 포함하는 환자의 개체맞춤 변수에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 기재된 제제의 용량은 이러한 변수의 다양성에 좌우될 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우에는, 보다 많은 용량(또는 보다 국소화된 상이한 투여 경로에 의해 달성되는 보다 높은 용량)이 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 동계, 동종이계 또는 비관련된 것)과 같은 통상적인 치료 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
*암의 치료는 2종, 3종, 4종 또는 그 이상의 항암제/치료요법의 조합 작용이 종종 단일 치료법 접근의 효과에 비해 훨씬 더 강력하게 상승효과를 발생하기 때문에, 조합 전략이 특히 바람직한 분야이다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태에서, 암치료법은 다양한 기타 약물과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들 중에는 예를 들어 종래의 종양 치료요법, 다중-에피토프 전략, 부가적인 면역요법 및 혈관신생 또는 세포예정사를 표적으로 하는 치료적 접근의 조합을 들 수 있다(검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743]을 참조한다). 상이한 제제의 순차적 투여는 상이한 체크 포인트에서 암세포 성장을 억제할 수 있지만, 다른 제제는 예를 들어 신혈관신생, 악성 세포의 생존 또는 전이, 암을 만성 질환으로의 전환시킴을 억제할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 유전적 면역 다형성의 기술적 분석
환자 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 개별 패턴은 치료용 항체 IMAB362의 반응 속도를 예측할 수 있었다. 이러한 SNP 패턴을 조사하기 위해, 모든 환자에서는 면역반응 및 위암 감수성에 대해 알려진 또는 추정된 역할을 하는 다수의 SNP에 대하여 유전자형을 분석하였다.
상세하게는, 이하 질문들을 다루었다.
a. 연구된 다형성과 관련하여 모든 환자의 SNP 유전자형.
b. 환자 집단에서 SNP 유전자형의 빈도.
c. IMAB362 작용 방식에 직접적으로 간섭할 수 있는 다형성을 가진 환자의 동정 (Fc 수용체 및 보체계 다형성).
d. 위암 감수성, 암 진행, 또는 암치료의 위험 인자로서 설명된 환자당 SNP 유전자형의 축적.
e. SNP 유전자형과 임상 결과의 상관관계.
f. SNP 유전자형과 무진행 생존(PFS)의 상관관계.
모든 코호트 1, 2, 3의 환자는 유전적 다형성을 분석하였다. 환자 혈액 시료를 1일차에 수집하였다(V2a, 사전-주입).
모든 환자에서 전혈 시료(9 ml, EDTA-Monovette)를 수집하였다. 연구 센터에서 -20℃에서의 시료 수집 직후에 EDTA 혈액을 1ml 분획량으로 보관하였다. EDTA 혈액 시료는 드라이아이스(-70℃) 상에서 배송되고 -20℃에서 보관하였다. 도착 직후에, 혈액 시료는 DNA 분리 시까지 -20℃에서 즉시 보관하였다.
관심있는 SNP는 면역계의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려진 SNP, 특히 Fc 수용체 및 보체계 다형성으로서의 치료용 항체의 작용 방식에 영향을 미치는 것으로 기재된 SNP에 초점을 둔 문헌 연구에 의해 선택되었다. 암환자의 생존, (위)암에 대한 감수성 또는 위암의 진행에 영향을 미치는 것으로 기술된 SNP를 선택하여 또한 연구하였다.
유전적 다형성은 Fluidigm Biomark™ 실시간 PCR 분석 플랫폼에서 SNP 유전자형질분석 TaqMan™ 분석(46개 표준, 5가지 맞춤 제작; Life Technologies)으로 분석하였다. DNA 분리는 전혈로부터 게놈 DNA를 분리하기 위한 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. Fluidigm Biomark™ 실시간 PCR 분석 플랫폼을 사용하면, 환자 시료 및 특정 SNP 프라이머를 환자 DNA 시료용 채널 96개와 SNP 분석용 직교 채널 96개의 실험용 칩에 적용할 수 있기 때문에, 한 번의 측정으로 96개 이하의 환자 시료를 96개의 SNP로 유전자 변형시킬 수 있다. 환자 게놈 DNA는 특정 표적 증폭(Specific　Target　Amplification, STA)에 의해 사전 증폭된다. 사전 증폭된 DNA는 Fluidigm Biomark™ 실시간 PCR 분석 플랫폼에서 표준 조건 하에서 TaqMan™ 실시간 PCR 분석을 행하였다. 등록상표명 Fluidigm 소프트웨어 및 통계 분석 소프트웨어 "R"을 사용하여 각 환자와 각 분석에 대해 SNP의 대립형질 결정을 수행하였다. Fluidigm 결과가 모호하기 때문에, 고전적인 생거 시퀀싱으로 SNP의 하위 집합을 확인하였다.
53명의 환자에 대해 51개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)의 유전적 다형성을 결정하였다. 환자 1명의 혈액 시료로는 SNP를 분석하기에 충분한 양의 DNA 추출을 할 수 없었다. 6개의 SNP 유전자형이 20명 환자들만의 하위 집단을 결정하였다. MDM2 SNP rs2279744의 유전자형은 기술적인 문제로 인해 9명의 환자에서 결정되지 않았다. 1명 환자에 대한 PTGS2 rs20417 유전자형질분석 결과는 모호하고 더 이상 조사하지 않았다.
테스트된 환자에 대한 SNP 유전자형 매트릭스의 결정은 코카시안종 대조군 집단에서의 유전자형 빈도와 비교한 유전자형의 빈도 변화에 대한 환자 집단의 통계 검정을 허용한다. 코카시안종 대조군 집단의 SNP 유전자형 빈도는 공공 데이터베이스인 dbSNP(National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD, USA))에 기탁된 국제 SNP 유전자형질분석 프로젝트(HapMap-CEU, PGA-EUROPEAN-PANEL, CAUC1, pilot_1_CEU_low_coverage_panel, CEU_GENO_PANEL, PDR-90)에 의해 수집된 데이터에 의거한다. 주어진 SNP의 유전자형당 환자의 수를 코카시안종 대조군 집단에서 유전자형당 환자의 수와 비교하였다. 대조군 집단에 대한 유전자형당 환자의 수는 모집단의 제공된 상대적 SNP 유전자형 빈도를 연구된 시료의 보고된 수와 곱함으로써 계산하였다. 이는 직접 카이제곱 검정을 통해 환자 집단과 해당 대조군 집단 간의 통계적으로 유의한 차이를 확인하도록 하였다.
카이제곱 검정은 51개의 연구된 SNP 중 48개에 대해 수행하였다. SNP 유전자형 빈도에 대한 데이터는 SNP C1QA (rs1044378), FCGR2C (Q57X (C->T)), 및 MDM2 (rs2279744)에 대해서는 아직 공공 데이터베이스에 기탁되어 있는 것이 없다. 환자와 대조군 간의 유전자형 빈도가 통계적으로 유의한 변화를 보이는 SNP(48개 SNP 중 5개, p<0.05)가 도 1에 나타나 있다.
이들 5개의 SNP 중 4개가 암/위암 감수성에 역할을 하는 것으로 보여지고 있다. 모든 4개의 암/위암 감수성 SNP는 위암 환자에게 기대되는 바와 같이, 환자 집단에서 각각의 암 관련 유전자형의 과대표시를 확실히 나타낸다(표 1).
이들 5개의 SNP 중 1개는 암 또는 위암의 위험/감수성 인자, rs12146727 (C1S)일 수 있다는 것이 지금까지는 밝혀지지 않았다. 이 SNP는 지금까지는 심혈관 질환에 대한 추정상의 위험 인자로서만 기재되어 있다.
Figure pat00019
환자 집단에서 51개의 연구된 SNP 중 49개는 연구된 환자 집단에서 변이 대립유전자 패턴을 나타낸다. 이는 환자 소집단들 간에 SNP 대립유전자의 빈도 변화를 시험하도록 하며, 이상적으로는 추정 반응자 집단의 식별에 도움이 될 수 있다. 오직 2개의 SNP, C1QA (rs1044378) 및 FCGR2C (AHN1ME8)는 모든 환자에서 불변의 SNP 유전자형을 나타내고, 다른 종류끼리의 차별을 분석하는 것을 방해한다. 5개의 SNP에 대해, SNP 대립유전자 빈도가 주어진 집단의 구성에 의존한다는 원칙을 증명하며, 통계적으로 유의한 대립유전자의 빈도 변화를 본 연구에서 대조군 집단과 비교하여 결정할 수 있다. 그러므로, 시험된 SNP 선별은 SNP 바이오마커 후보의 차후 식별에 매우 적합하다.
Fc 수용체 및 보체계 다형성은 IMAB362 작용 방식으로 직접적으로 간섭할 수 있다. FCGR3A (F176V[T→G], rs396991), FCGR2A (H131R [T→C], rs1801274), 및 C1QA ([276A→G], rs172378)와 같이, 환자가 항체-기반 치료법의 효능에 영향을 미칠 수 있는 유전자에서 SNP 대립유전자에 대한 유전자형을 분석하였다(표 2).
환자는 FCGR2C 유전자 (Q57X [C→T], rs 번호 없음) 및 보체계 인자 C1S (R119H [G→A], rs12146727) 및 C1QA (rs292001, rs1044378)의 공표된 SNP 대립유전자에 대하여 추가로 유전자형 분석하였다. 이들 SNP는 아직 항체 치료에 영향을 준다고 입증되지 않았지만 흥미있는 후보 SNP로서 포함하였다.
표 2는 Fc 수용체 및 보체계 다형성을 갖는 환자를 보여준다. 잘 기록된 Fc 수용체 및 보체계 다형성을 가진 환자의 SNP 유전자형이 열거되어 있다. 항체 요법에 대해 긍정적인 영향을 미칠 것으로 추정되는 FCGR3A Val/Val 다형성은 굵은 글씨와 밑줄로 묘사되어 있다. 항체 요법에 대해 부정적인 영향을 미칠 것으로 추정되는 FCGR2A (Arg/Arg) 및 C1QA [G/G]에서의 다형성은 회색 음영 및 굵은 글씨로 강조 표시되어 있다.
Figure pat00020
*총 23명의 환자에서, 적어도 하나의 잘 기록된 Fc 수용체 및 보체계 다형성을 보여준다. 4명의 환자(100411, 101120, 200336, 및 400109)는 FCGR3A 대립유전자(F176V [T→G])에 대해 동형접합이고, 항체 요법에서 반응 속도 및 무진행 생존율을 증가시키는 것으로 보고되고 있다. 12명의 환자가 FCGR2A 대립유전자 (H131R [T→C])에 대해 동형접합이고, 추가로 10명의 환자가 C1QA 대립유전자 ([276A→G])에 대해 동형접합이다. 이들 두 SNP 모두는 항체 요법에 부정적 영향을 주는 것으로 보여지고 있다. 전체로서, 총 21명의 환자가 FCGR2A 대립유전자 (H131R [T→C]) 또는 C1QA 대립유전자 ([276A→G] (환자 100511은 두 SNP 대립유전자 모두에 대해 동형접합이다)에 대해 동형접합이다.
상기 결과와 환자의 질환 진행과의 상관관계는 IMAB362 치료를 위한 Fc 수용체 및 보체계 다형성의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
환자에서 질환 진행 및 항체 치료의 효능은 위암 감수성, 암 진행 또는 암 치료의 위험 인자로서 기재된 SNP의 축적에 영향을 받을 수 있다. 조사된 51개의 SNP 중, 43개 이하의 SNP는 '위험' 대 '비-위험' 유전자형으로 각각의 SNP 유전자형을 범주화가 가능하도록 한다. 환자당 동형접합적 SNP 위험 인자 유전자형의 수는 이들이 일반적으로 가장 관련있는 위험 대립유전자로 기재되어 있어서 계수하였다. 환자당 조사된 SNP 위험 인자의 수와 관련하여 환자당 동형접합적 위험 유전자형의 수의 상대 빈도가 도 2에 묘사되어 있다.
환자당 조사된 위험 유전자형의 14 내지 46%의 축적이 관찰된다. 이 광범위한 분포는 환자당 SNP 위험 유전자형의 축적이 환자의 임상 결과와 상관관계가 있는지 여부를 조사하게 한다.
요약하면, 54명의 환자 중 53명이 SNP 51개에 대해 성공적으로 유전자형을 분석하였다. 51개의 SNP 중 49개는 변이체 SNP 대립유전자 패턴을 보여 주며, SNP 유전자형 빈도에서의 유의한 변화에 대한 환자 소집단의 분석을 가능케 한다. 항체 치료의 조절자로서 기재된 동형접합적 Fc 수용체 및 보체계 다형성은 53명의 환자 중 23명에서 발견된다. 환자당 조사된 위험 유전자형의 14 내지 46%의 축적이 관찰된다.
실시예 2: 임상 결과와 SNP 유전자형질분석의 상관관계
유전적 다형성의 유전자형과 임상 결과의 상관관계의 목적은 환자의 임상 결과를 예측하는 추정 SNP 바이오마커 후보를 동정하는 것이다. 이 분석에서 동정된 추정 바이오마커 후보는 후속 IIb상 및 III상 연구에서 검증될 것이다. IIb상에서 추정 바이오마커 후보의 검증은 추정적인 예상 및 예측 SNP 후보들 간의 차별화를 가능케 할 것이다.
임상 결과로 각 SNP에 대한 상관관계 분석은 2개의 정의된 IIa상 임상시험 환자 집단에 대해 독립적으로 수행하였다: '전체 분석 세트' 집단 (full Analysis set, FAS)은 40명의 환자이고, '프로토콜 세트별' 집단은 21명의 환자이다.
환자 집단의 각 임상 결과 그룹('반응자', '비-반응자')에 대한 각 SNP의 유전자형의 절대 빈도는 SAS Enterprise Guide 6.1. Absolute 유전자형 빈도에 의해 정량화하였다. 절대 유전자형 빈도는 임상 결과 및 SNP 유전자형으로 구조화된 분할표 (3x2 또는 2x2)로 정리하였다. 채용된 표준 통계 테스트는 Pearson의 카이제곱 검정이었다. 데이터 세트의 수치적 구조에 의해 Pearson의 카이제곱 검정을 사용하지 못하는 경우에는, 2x2 분할표에 대한 몇몇 경우에는 Fisher 정확검정을 적용하였다. 통계적으로 유의 수준은 p<0.05이었다. 상관관계 분석은 통계 분석 소프트웨어 SAS Enterprise Guide 6.1을 사용하여 실현하였다.
무진행 생존에 대한 SNP 유전자형의 영향을 조사하기 위해, 각 그룹에 대해 카플란-마이어 곡선을 계산한 다음 통계적 로그랭크(Logrank) 검정을 채용하여 공식적으로 비교하였다. 통계적으로 유의 수준은 p<0.05이었다. 로그랭크 통계는 통계 분석 소프트웨어인 SAS Enterprise Guide 6.1을 통해 실현하였다.
임상 결과와 SNP 유전자형질분석의 상관관계는 추정적인 예측 또는 예후 SNP 바이오마커 후보를 동정하기 위해 수행하였다. 상관관계는 2명의 환자 집단, FAS 집단 및 PP 집단에서 연구하였다.
FAS 집단은 40명의 환자인, '반응자'로서 정의된 12명의 환자(임상 결과 '부분 관해' 또는 '안전병변') 및 '비-반응자'로서 정의된 28명의 환자(임상 결과 '질환 진행')를 포함한다. FAS 집단의 환자 시료 하나(100801, 비-반응자)는 상기한 바와 같이, SNP 분석에 사용할 수 없으므로, 상관관계에 대해 분석된 FAS 환자의 최대 수는 39명으로 감소하였다. PP 집단은 반응자 환자가 10명이고 비-반응자 환자가 11명인 21명의 환자를 포함한다.
SNP당 조사된 환자의 수는 20 내지 39명(FAS 집단에서) 및 20 내지 21명(PP 집단에서)으로 상이하다.
상관관계 분석은 상기한 바와 같이 수행하였다. 전체로서, 연구된 51개의 SNP 중 2개는 FAS뿐만 아니라 PP 집단에서 임상 결과와 통계적으로 유의한 상관관계를 보여준다.
두 집단의 임상 결과와 각 SNP 유전자형 간에 통계적 상관관계를 보여주는 2개의 SNP는 FCGR2A rs1801274 (p=0.0004 [PP]; p=0.008 [FAS]), 및 IL-10 rs1800896 (p=0.042 [PP], p=0.022 [FAS])이다(표 3). SNP당 통계적으로 검사된 환자의 수는 이들 2개의 SNP 각각에 대해 21개(PP) 및 39개(FAS)이었다.
Figure pat00021
DNMT3A rs1550117 [PP, p=0.035], SMAD4 rs12456284 [FAS, p=0.02], MUC1 rs4072037 (FAS, p=0.03), EGF rs4444903 [FAS, p=0.049], 및 CDH1 rs16260 [FAS p=0.049])에 대해 보여지는 바와 같이, 5개의 SNP는 하나의 환자 집단(FAS 또는 PP)에서 임상 결과와 상관관계를 보여준다(표 4).
Figure pat00022
반응자/비-반응자 환자에서 SNP 유전자형의 과대 또는 과소표시에 대한 검사는 통계적으로 유의한 빈도 차이에 대한 과학적 설명을 제공하게 한다.
2개의 SNP의 유전자형, rs11615 (ERCC1) 및 rs396991 (FCGR3A)는 PP 집단에서 연장된 무진행 생존율(PFS)과 상관관계가 있다(표 5).
Figure pat00023
SNP당 통계적으로 검사된 환자의 수는 나열된 9개의 SNP 각각에 대해 21개(PP) 및 39개(FAS)이었다.
FCGR2A rs1801274 [C/T]: PP에서, 이형접합적 rs1801274 [CT] 유전자형을 가진 모든 환자가 통계적 검사의 고도로 유의한 p-값(0.0004)에 반영된 반응자(8명)이다. 모든 PR 환자(4명 중 4명)는 이 유전자형을 나타낸다. 대부분의 비-반응자(73%, 11명 중 8명)는 동형접합적 [TT] 유전자형을 나타낸다(표 6). 이 유전자형 분포 패턴은 PP 집단에서와 같이 별개는 아니지만 FAS 집단에서도 발견될 수 있다(표 7). 또한, FAS 집단에서 다수의 비-반응자 환자는 눈에 덜 띄지만 여전히 통계적으로 고도로 유의한 p-값을 유도하는 [CT] 유전자형(30%)도 가지고 있다.
Figure pat00024
Figure pat00025
생존 분석 FCGR2A rs1801274 [C/T]: 반응자 집단에서 rs1801274 유전자형 [CT]의 고도로 유의한 과대표시는 연장된 무진행 생존(PFS) 시간과의 매우 유의한 상관관계에도 반영될 것으로 기대된다. 실제로, PP (도 3) 및 FAS (도 4)의 두 집단 모두에서, [CT] 유전자형은 연장된 PFS와 상관관계가 있다(PP p=0.0007, FAS p=0.03). 처음 60일 처리 기간 동안 [TT] 유전자형을 가진 FAS 환자는 [CC] 또는 [CT] 유전자형을 가진 환자보다 PFS 비율이 더 높은 경향이 있다는 것이 중요하다. 따라서, 생존 분석을 통해, 예측 또는 예후 특성을 가진 매우 흥미있는 추정 바이오마커 후보로서 rs1801274 (FCGR2A)를 확인하였다.
IL-10 rs1800896 [A/G]: PP에서는 비-반응자 환자 중 동형접합적 rs1800896 [GG] 유전자형을 가진 환자는 없었다(표 8). 이 유전자형은 반응자 환자에서 높은 빈도(40%)에서 발견되었다(10명 중 4명). 10명의 반응자 중 1명(10%)만이 [AA] 유전자형을 보이고, 나머지 반응자는 이형접합적 [GA] 유전자형을 보였다. FAS에서, 비교할만한 유전자형 빈도 분포가 관찰될 수 있지만(표 9), 이 집단에서 낮은 빈도(11%, 27명 중 3명)로 비-반응자 환자에서 [GG] 유전자형이 관찰될 수 있다.
Figure pat00026
Figure pat00027
생존 분석 rs1800896 (IL-10) [A/G]: rs1800896 [GG] 유전자형은 반응자 환자에서 유의하게 과대표시되었다. PFS와 [GG] 유전자형의 통계적 상관관계는 PP 및 FAS 집단에서 [GG] 유전자형이 PFS와 유의한 상관관계가 없음을 보여주었다(PP p=0.27 (도 5); FAS p=0.08, (도 6)). 그러나, FAS 생존 상관관계에 대한 p-값은 통계적 노이즈가 감소된 더 큰 집단에서 유의성을 도달할 수 있는 표시일 수 있는 유의성에 국한된다. 전반적으로, rs1800896 (IL-10)은 흥미로운 추정 바이오마커 후보이다.
DNMT3A rs1550117 [G/A]: PP에서, 4명의 반응자 (40%)는 [GA] 유전자형을 나타내는 반면 모든 비-반응자는 [GG] 유전자형을 나타낸다 (p=0.03, 표 10).
Figure pat00028
생존 분석 rs1550117 (DNMT3A) [G/A]: rs1550117 [GA] 유전자형은 PP 집단의 반응자 환자에서 유의하게 과대표시되었다. FAS 집단에서, [GA]와 [GG] 담체 간의 PFS에서의 차이는 경계선의 유의성이 있다(FAS p=0.058) (도 7).
FAS 집단에서는, 단 1명의 환자만이 [AA] 유전자형의 담체가 있다.
SMAD4 rs12456284 [G/A]: FAS에서, [AA]와 [GG] 유전자형보다 [GA] 유전자형 (12명의 환자 중 7명, 58%)의 통계적으로 유의한 과대표시는 반응자 집단에서 발견될 수 있다(p=0.023, 표 11). FAS 비-반응자 집단에서 [GA] 유전자형의 빈도는 19%의 빈도(27명 중 5명이 비-반응자)로 발견될 수 있다. PP 집단에서 이러한 연관성은 경향 유의함(p=0.081, 데이터는 표시하지 않음)이 있음으로 나타낸다.
Figure pat00029
생존 분석 rs12456284 (SMAD4) [G/A]: rs12456284 [GA] 유전자형은 FAS 반응자 환자에서 유의하게 과대표시되고 PP 반응자에서 동일한 경향을 보여준다. PFS와 rs12456284 유전자형의 통계적 상관관계는 PP 집단에서 [GA] 유전자형이 Gehan-Brelow-Wilcoxon 검정법(도 8)을 사용하여 PFS (PP p=0.048)와 유의하게 상관관계가 있다는 반면 로그랭크 검정법을 사용한 유의성은 p=0.35이다. Gehan-Brelow-Wilcoxon 검정은 로그랭크 테스트보다 초기 시점에서 PFS 사례에 더 많은 비중을 두고 있으며, 실제로 이러한 각각 IIa상 임상시험의 첫 100일 동안 [GA]와 [AA] 담체 간의 차이가 가장 두드러진다. FAS 집단에서 [GA] 유전자형은 육안 검사로는 연장된 PFS에 대한 [GA] 담체의 경향을 암시하지만, PFS와 유의한 상관관계가 없다 (p=0.20 (로그랭크), p=0.23 (Gehan-Brelow-Wilcoxon)).
MUC1 rs4072037 [A/G]: FAS에서, 반응자 집단에서 67%의 가장 높은 빈도로 발견된 rs4072037 유전자형은 [AA] (12명 중 8명)인 반면, 비-반응자는 26%의 환자에서만이 이러한 유전자형을 나타낸다(27명 중 7명). 반응자 환자 누구도 동형접합적 [GG] 유전자형을 나타내지 않은 반면(표 12), 비-반응자는 22%의 비율로 [GG] 유전자형을 보였다(27명 중 6명). 반응자 및 비-반응자 FAS 환자에서의 이러한 상이한 유전자형 분포는 통계적으로 유의미하였다(p=0.03). 반응자가 FAS 집단에서와 마찬가지로 거의 동일한 상대적 [AA] 유전자형 빈도인 70%(10명 중 7명)를 나타내는(경향 유의성 p=0.11), PP 집단에서 비교할만한 유전자형 분포 패턴이 발견된다(데이터는 표시되지 않음).
Figure pat00030
생존 분석 rs4072037 (MUC1) [A/G]: 반응자 환자에서 rs4072037 유전자형 [AA]의 유의한 과대표시가 PFS와 이러한 유전자형의 상관관계를 나타낼 수 있다. 통계적 검정에 따르면 PP 및 FAS 집단에서 [AA] 유전자형은 PFS와 유의한 상관관계가 있다고 나타내고 있다(PP p=0.001, (도 9); FAS p=0.02, (도 10)). 이 생존 분석은 매우 흥미로운 추정적인 예측 또는 예후 바이오마커 후보로서 rs4072037 (MUC1)을 확인하였다.
EGF rs4444903 [G/A]: FAS에서, rs4444903 유전자형 [AA]은 비-반응자 집단 (27명 중 3명, 11%)에 비하여 반응자 집단 (12명 중 5명, 42%)에서 유의하게 과대표시되었다(p=0.049)(표 13). PP 집단에서 이러한 비대칭 분포는 통계적으로 유의하지 않았다 (p=0.32, 데이터는 표시되지 않음).
Figure pat00031
생존 분석 rs4444903 (EGF) [G/A]: PP 또는 FAS 집단에서 PFS와 rs4444903 [AA] 유전자형의 상관관계는 통계적으로 유의하지 않았다(FAS p=0.1; PP p=0.16). 그러나, PP 및 FAS 집단 모두에서 연장된 PFS 경향이 관찰될 수 있다(도 11).
CDH1 rs16260 [C/A]: FAS에서, rs16260 유전자형 [AA]는 비-반응자 집단(27명 중 3명, 11%)보다 반응자(12명 중 5명, 42%)에서 유의하게 높은 빈도로 발견하였다(p=0.049, 표 14). PP에서, 두 환자 그룹 간의 이러한 비대칭 분포는 유의하지 않았다(p=0.72, 데이터는 표시되지 않음).
Figure pat00032
생존 분석 rs16260 (CDH1) [C/A]: PFS와 rs16260 (CDH1) 유전자형 [AA] 상관관계는 FAS 집단에서 통계적 유의성에 대한 경계를 이룬다(로그랭크 검정 p=0.065, Gehan-Brelow-Wilcoxon 검정 p=0.032) (도 12).
ERCC1 rs11615 [C/T]: PP에서, 반응자 집단에서 rs11615 유전자형 [TT]의 높은 빈도(10명 중 3명, 30%)에 대한 경향성이 발견되었다(p=0.068; 비-반응자 집단 (0%)). 대조적으로, 동형접합적 [CC] 유전자형은 비-반응자 집단(환자 2명)에서만 발견된다(표 15).
Figure pat00033
생존 분석 rs11615 (ERCC1) [C/T]: rs11615 [TT] 유전자형은 독점적으로 PP 집단의 반응자 집단에서 발견된다. PFS와 rs11615 유전자형의 통계적 상관관계는 PP에서 rs11615 유전자형이 PFS와 매우 유의한 상관관계가 있고, [CC] 담체와 비교하여 [CT] 및 [TT] 담체는 연장된 생존율을 보여준다(PP p=0.0001) (도 13). 이 현저한 유의 값에도 불구하고, PP에 [CC] 유전자형이 2명뿐이고, [TT] 유전자형이 3명이라는 사실에 주목해야 한다. 그러나, 효과가 더 큰 환자 집단에서도 유효하면, FAS 집단에서 동일한 효과가 관찰될 수 있는 경향이 있다(FAS p=0.13, 데이터는 표시되지 않음).
생존 분석 FCGR3A rs396991 [T/G]: PP 또는 FAS에서, SNP rs396991의 유전자형은 임상 결과와 관련이 있다(FAS p=0.49; PP p=0.29, 데이터는 표시되지 않음). 그러나, PP 집단에서의 생존 분석은 유전자형 [TG] 및 [TT]를 가진 환자가 [GG]와 비교하여 개선된 PFS를 보여주는 높은 통계적 유의성을 갖는 것으로 나타났다 (p=0.0007, 도 14). 또한, 이 효과는 FAS 집단에서도 관찰될 수 있다 (p=0.25; 데이터는 표시되지 않음). PP 집단에 대해 얻은 유의한 값에도 불구하고, 3명의 PP 환자만이 [GG] 담체라는 점에 유의해야 한다.
실시예 3 : 동반되는 면역 다형성 분석에 대한 논의
이 임상 IIa상 시험의 주요 목적은 위식도 선암을 앓는 환자에서 치료용 항-CLDN18.2 단핵성 항체 IMAB362의 안전성과 효능을 평가하는 것이었다. 또한, 유전적 면역반응 다형성에 대한 동반 분석을 수행하여 IMAB362 치료와 관련하여 잠재적인 예측 또는 예후 바이오마커로서의 역할을 할 수 있는 파라미터를 평가하였다.
설명된 면역 다형성 분석에 대한 토론
환자 게놈에서의 유전적 다형성은 치료용 항체의 반응 속도를 변화시키는 것으로 나타났다. 개별적인 유전적 변이가 반응 속도에 미치는 영향을 조사하기 위해, 환자에서 면역반응 및 위암 감수성 또는 진행에서 알려거나 추정된 역할을 하는 51개의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 유전자형을 결정했다.
이 연구에서, 51개의 SNP는 성공적으로 연구된 54명의 환자 중 53명에 대해 유전자형 분석하였다. 대조군 집단과 비교하여 환자 집단에서 유전자형 빈도의 통계적으로 유의한 변화는 5개의 SNP에 대해 검출할 수 있었다. 이러한 SNP 중 4개는 이전에 암/위암 감수성과 연관되는 것으로 나타났다. 이들 4개 SNP의 각각의 암/위암 관련 유전자형은 후기의 GC를 가진 환자 집단에서 예상한 바와 같이, 연구 집단에서 과대-표시되었다. 각각의 동형접합적 유전자형의 과대-표시는 향상된 유전자 활동과 반대되는 것과 같이 약화된 유전자 기능을 시사하는 열성 작용 방식을 나타낼 수 있다. 이는 공표된 데이터에 강조되어 있고, 예를 들어 CDH1에서 SNP rs16260의 위암 연관된 AA 유전자형은 -160에서 CDH1의 프로모터에서 그 위치로 인해 CDH1 발현의 하향 조절을 일으키는 것으로 보고되어 있다.
이들 다형성이 이전에 위암 위험 인자로 기재되지 않았더라도, 면역 신호와 관련된 유전자의 다형성을 연구하였다. 면역 신호전달 인자를 암호화하는 유전자의 유전적 다형성은 위암을 발달시키는 위험을 유의하게 조절하는 것으로 나타났다. 따라서, 항체-기반 암 치료의 반응 속도는 이들 SNP에도 영향을 받을 수 있다.
환자 집단에서 과대-표시된 IL-2 유전자형 GG(SNP rs2069762)는 H. pylori 감염에 의해 유도된 위 위축의 증가된 위험과 관련이 있고, 위암에 취약할 수 있다. CTLA4 SNP rs231775 및 rs2274223 (PLCE1) 유전자형은 GC 감수성 위험 인자로 기재되어 있다. rs231775에 대한 공표된 연구로서, 유전자형의 서열에 모순이 있지만 여기에는 결론이 제시되지 않을 것이다.
본 연구에서는 Fcγ-수용체와 보체계 다형성을 조사하였다. Val/Val [GG]를 암호화하는 임의의 유익한 FCGR3A 유전자형이 4명의 APT 환자에서 검출되고, 잠재적으로 부정적인 영향을 미치는 FCGR2A 유전자형 (Arg/Arg) [CC]이 12명의 APT 환자에서 검출되었다.
제2효과기 메카니즘으로서 CDC는 SNP 다형성에 의해서도 영향을 받는 것으로 나타났다: 보체 성분 C1qA의 다형성의 대립유전자 담체([276A->G], rs172378)는 여포성 림프종의 리툭시맵(Rituximab) 치료 후 연장된 반응을 보여준다. 유전자형 'GG'를 가진 C1QA에서의 보체계 다형성은 10명의 환자에서 검출되며, 임의의 부정적 반응에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 보체 성분 C1S에서 SNP 다형성 rs12146727은 지금까지는 항체 요법이나 암과 관련없는 스크리닝에서만 기재되어 있다.
환자 및 대조군 집단 사이의 유의한 유전자형 빈도 변화의 확인은 SNP 유전자형 빈도 변화가 임상 연구에서 예측 및 예후 마커로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
SNP 위험 대립유전자의 축적은 환자의 임상 결과에도 영향을 줄 수 있다. 이러한 분석을 가능하게 하기 위해, 동형접합적 SNP 위험 유전자형의 수를 환자별로 계산하였다. 이들 수치와 치료 반응의 상관관계는 SNP 위험 인자 축적의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
SNP 유전자형질분석과 임상 결과의 상관관계에 대한 논의
FCGR2A rs1801274:
과대 또는 과소-표시된 FCGR2A 유전자형의 검사는 PP 집단에서 이형접합적 rs1801274 유전자형 [CT]을 가진 모든 환자가 반응자 환자인 것이고 부분적 반응 (PR)하는 환자가 독점적으로 이 유전자형을 보유한다는 것을 나타낸다. 비-반응자 집단에서 과대표시된 동형접합적 유전자형은 [TT]이다. 이들 빈도 분포의 단순한 관찰로는 [CT] 유전자형이 유익한 경우이거나 [TT]가 불리한 경우 결론을 내릴 수 없다. SNP 유전자형의 영향을 조사한 대부분의 연구에서, 각각의 동형접합적 유전자형은 가장 강력한 생물학적 효과를 나타내고, 향상된 유전자 활성과는 대조적으로 종종 두 대립유전자 모두의 약화된 유전자 기능을 반영하는 열성 작용 방식을 나타낸다. SNP 대립유전자가 증가된 유전적 활성을 유도하는 경우에는, 생물학적 효과의 단계적 효과가 종종 관찰될 수 있다: 하나의 대립유전자 (즉, 이형접합체)는 유전자 활성을 증가시키고, 2개의 대립유전자 (즉, 동형접합체)는 유전자 활성을 더욱 증가시킨다. 기능획득 또는 기능상실, 2가지 경우 모두에서, 가장 강력한 생물학적/임상 효과는 동형접합적 유전자형을 가진 환자에게서 관찰된다. 이 가정 하에서, PP 및 FAS 집단에서 비-반응자 집단에서 동형접합적 [TT] 유전자형의 과대표시는 불리한 결과를 초래할 것이다.
그러나, 이는 rs1801274 FCGR2A [TT] 유전자형이 많은 임상 연구에서 PFS에 대해 연장된 영향을 미치는 인자로 기재되어 있는 바와 같이 예상하지 못한 것이다. 본원의 IIa상 임상시험에서, FAS 비-반응자 환자에서 유전자형과 PFS 간의 연관을 면밀히 조사한 결과, [TT] 유전자형을 가진 FAS PD 환자는 [CT] 유전자형을 가진 FAS PD 환자와는 대조적으로 처음 60일간의 치료에서 실제로 PFS 시간이 증가하는 경향을 보였다(표 7 및 도 4를 비교한다). 연장된 PFS를 가진 반응자에서 [TT]의 과소표시와 일치하는 이러한 관찰로 인한 해석은 2개의 다른 분자 메커니즘의 중복이 될 수 있다: 첫째는, rs1801274 [CT] 유전자형이 반응자 환자의 마커일 수 있다. 이는 지금까지 문헌에 기술되지 않은 신규한 관찰이며, 이 유전자형이 IMAB362의 치료를 위한 예측 마커임을 제안할 수 있다. 이 신규한 관찰의 기본이 되는 분자 메커니즘은 아직 해결되지 않았다.
다른 치료 항암 항체에 대한 문헌에서 이미 기술된 두 번째 관찰은 FCGR2A [TT] 유전자형을 지닌 환자의 연장된 PFS일 것이다. 본원의 IIa상 임상시험에서 이 효과는 비-반응자 환자에서 경향성으로만 관찰 가능한 상정된 첫 번째 메커니즘의 중복으로 인한 것이다. 메카니즘적으로, 두 번째 관찰은 동형접합적 FCGR2A 131 Arg/Arg 수용체 대립유전자([CC] 유전자형에 의해 암호화된다)에 대한 약한 결합 친화도와는 대조적으로 FCGR2A 131 His/His 수용체 대립유전자([TT] 유전자형에 의해 암호화된다)에 대한 IgG1 항체의 증가된 결합 친화도에 의해 설명될 수 있다: Fcγ-수용체 다형성의 영향을 체계적으로 조사한 연구에서, IgG1 동종형의 항체가 실제로 R131보다 높은 친화도를 갖는 H131과 같이 Fcγ 수용체 IIA의 2개 대립형질 형태에 대해 상이한 친화도로 결합한다는 것이 최근에 밝혀졌다. FFCGR2A 수용체 대립유전자에 대한 IgG 항체의 상이한 친화도는 일반적으로 효과기 메커니즘의 촉발 속도에 영향을 준다고 가정하고 결과적으로 수용체 대립유전자를 보유하는 환자에서 PFS를 연장시킨다. 이 가설을 뒷받침하는 데이터는 Fcγ-수용체 다형성 FCGR2A H131R 및 FCGR3A F176V (Phe > Val, rs396991)이 전이성 유방암 환자에서 트라스투주맙(Trastuzumab)-기반 IgG1 항체 요법의 임상 효능에 영향을 줄 수 있다고 나타내는 보고서에 의해 제공되어 있다. 유전자형 FCGR3A 176 Val/Val 및 FCGR2A 131 His/His를 가진 환자는 유의하게 양호한 반응 속도 및 무진행 생존율을 나타내었다. 동일한 다형성은 또한 B 세포 림프종을 가진 리툭시맵 (IgG1)-처리된 환자의 반응 속도와 연관된다. 또 다른 연구에서는, 세툭시맙(Cetuximab)(IgG1) 요법 후에 연장된 PFS가 FCGR3A 176 Val/Val 유전자형과 연관될 수 있다.
논쟁의 여지가 있지만, Fcγ-수용체 다형성 및 생존율, 반응 속도 또는 논의된 항체의 무진행 생존율 간에 연관성이 없다고 보고하는 강력한 연구가 최근에 있다. 유방암 국제 연구 그룹(BCIRG, Breast Cancer International Research Group)의 BCIRG-006 시험에서, 1218명의 환자가 2개의 트라스투주맙-함유 팔 및 비-트라스투주맙 대조군 팔을 가지고 무작위 연구에서 처리하였다. 상기에서 보고된 Fcγ-수용체 다형성 및 트라스투주맙 효능 간의 연관성을 확인할 수 없었다. 여포성 림프종에서 화학요법과 병용된 리툭시맵을 채용하는 460명의 환자를 대상으로 한 장기간의 연구에서, Fcγ-수용체 다형성과 무진행 생존의 연관성은 보고되지 않았다. 환자들에게 플루다라빈 및 시클로포스파미드(FC) 또는 리툭시맵 플러스 FC를 투여 한 419명의 환자들에 대한 REACH 시험에서, FCGR2A 및 FCGR3A 다형성은 유의하게 결과에 영향을 미치지 않았다. 최근 세툭시맙 시험에서도 Fcγ 수용체 다형성을 유용한 바이오마커로 권장하지 않고 일관성 없는 결과를 수득하였다. 이는 내재적 집단 인자 또는 동시 화학요법의 차이를 반영할 수 있다.
MUC1 rs4072037:
*MUC1은 뮤신 패밀리의 막관통 당단백질이다. 뮤신은 올리고당 및 n-글리칸 사슬을 갖고 광범위하게 N-말단 세포밖 도메인에서 O-글리코실화된 고-분자량 단백질이다. 뮤신은 상피 내층 호흡기 및 위장관 및 간, 췌장 및 신장에서의 덕트의 선단 표면 상에 발현된다. 막관통 뮤신은 하나의 α-나선으로 막에 걸쳐있고 그들의 당 사슬과 함께 세포밖 공간에 보호 내층을 제공한다. 세포밖 공간으로 분비되는 뮤신은 상피에 대한 추가적인 물리적 보호 역할을 하는 점액질 겔층을 형성한다.
막관통 MUC1 및 분비된 뮤신 MUC5C와 MUC6는 위에서 발현되는 주요 뮤신이다. MUC1은 자가 절단의 대상이 되는 단일 폴리펩티드 사슬로서 번역된다. N-말단 세포밖 도메인(MUC1-N)은 초기에 막관통/세포질내 도메인(MUC1-C)에 비공유 결합으로 남아있다. 이 세포질내 도메인은 핵을 넣고 직접 유전자 발현을 활성화하는 여러 전사 인자와 연관될 수 있는 신호전달 도메인으로서 역할을 한다. 세포 스트레스는 제2 단백질분해성 부위를 통해 MUC1-N 및 MUC1-C 도메인의 단백질분해성 절단을 유도할 수 있다. 이는 MUC1이 세포의 선단 막에서 정렬된 방식으로 더 이상 발현되지 않는 암세포에서도 관찰될 수 있지만, 과발현되고 세포 전체에 국소화되는 것을 발견할 수 있다. 세포밖 공간으로의 세포밖 도메인(CA15-3으로도 알려짐)의 방출 및 MUC1-C의 세포내 국소화가 그 결과이다. 세포질내 신호전달 도메인은 예를 들어 Wnt/β-카테닌 신호전달의 활성화와 세포사멸 경로의 차단에 의해 종양유전자로서 작용한다.
그러나, MUC1의 세포밖 도메인은 정적인 구조적 성분일뿐만 아니라 세포막에서 신호전달 과정에서 중요한 역할을 한다. MUC1 세포밖 도메인의 글리코실화 및 발현 상태는 막 신호전달 분자 및 세포밖 기질의 상호작용을 조절하는 것으로 입증되었다. 종양세포에서 저글리코실화된 MUC1-N은 ICAM-1 또는 E-셀렉틴 및 MUC1 코어단백질과 같은 막 분자 사이의 신호 전달을 증가시키는 것으로 보고되었다. 또한, 뮤신 발현과 글리코실화 상태는 막 관련 분자를 가리는 것으로 보인다. 암세포에서, 뮤신 발현에 의한 HER2 단백질의 마스킹은 트라스투주맙 치료에 대한 가능한 저항 기전으로서 기술되고 있다.
MUC1 다형성 rs4072037 'A' 대립유전자는 위암 감수성의 위험 인자로서 기재되어 있다. 이 다형성은 MUC1의 예측된 신호 펩티드 절단 부위에서 정확히 MUC1의 선택적 스플라이싱을 초래하는, 엑손 2에서의 G→A 교환이다. 신호 펩티드의 결핍 분할은 비정상적인 MUC1 단백질의 국소화 또는 글리코실화 패턴을 초래하여 결과적으로 단백질 기능이 결핍될 수 있다.
이러한 IIa상 임상시험에서, rs4072037 [AA] 유전자형이 반응자 집단과 통계적으로 연관되어 있음을 밝혔다. 저글리코실화되거나 과소표시된 [AA] 대립형질 형태의 MUC1은 암세포에서 발현되는 막 표적 분자 CLDN18.2에 대한 IMAB362의 양호한 접근을 가능하게 하여, 결과적으로 치료 효능을 증진시킨다는 것이 추측될 수 있다. 이는 rs4072037을 예측 바이오마커로 만들 것이다.
IL-10 rs1800896:
IL-10은 다면발현 기능을 가진 면역계의 중요한 조절자이다. IL-10은 대식세포 의존성 항원 특이적 T 세포 증식 및 T 세포에 의한 대식세포 의존성 생산을 억제함으로써 항염증제, 면역억제성 사이토카인으로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, IL-10은 NK 세포 및 CD8+ T 세포 활성화뿐만 아니라 B-세포, 과립구 및 비만 세포 분화 및 성장을 향상시키는 면역자극성 사이토카인으로서도 기재되어 있다. IL-10의 다면발현 가능성은 또한 Th2 세포, Treg 세포, Th3 세포, NK T 세포, B 세포, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 많은 면역 세포 유형에서 IL-10의 광범위한 발현에 의해 반영된다. 이러한 IL-10의 이중 역할은 종양 촉진뿐만 아니라 종양 억제 잠재력에 반영된다: 면역 세포를 대식세포로서 침윤하는 종양세포 또는 종양에 의해 분비되는 IL-10은 부분적으로만 밝혀진 면역감시로부터 종양세포가 회피할 수 있게 한다. 기재된 하나의 메커니즘은 Treg 세포가 IL-10과 같은 면역조절 사이토카인의 발현을 통한 말초 내성의 유도에 기여한다는 것을 포함한다. 보고된 또 다른 메커니즘은 수지상 세포에 의한 종양 관련 항원의 교차 제시를 억제하므로, T 세포가 종양세포에 대한 효과적인 면역반응을 개시하는 것을 방지하는 것이다. 반면에, 악성 종양세포를 IL-10에 노출시키는 것은 HLA 클래스 I 단백질의 하향 조절이 일어나 NK 세포 세포독성에 대한 민감성을 증가시킨다.
'G' 대립유전자가 위암 위험 인자 및 신장암 위험 인자로 보고된 바에 따라, 위치(-1082)에서의 IL-10 프로모터 다형성 rs1800896이 중요하다. 이 다형성의 'G' 대립유전자는 'A' 대립유전자와 비교하여 IL-10 발현이 시험관내 감소된 것과 연관되는 것으로 보고되었다. 이러한 IIa상 임상시험의 반응자 환자에서, rs1800896의 [GG] 유전자형이 과대표시되어, IL-10의 낮은 상대적 발현 수준을 나타낼 가능성이 있다. [GG] 유전자형을 가진 환자는 IL-10 발현이 낮아서 종양세포가 상기한 메커니즘 중 하나에 의해 면역 감시에서 벗어나는 것을 더 어렵게 만들 수 있다고 추측할 수 있다. 사실, FAS 비-반응자 환자의 22%(27명 중 6명으로 측정된다)와는 대조적으로 12명의 FAS 반응자 환자 중 어느 누구도 상승된 IL-10 혈청 수준을 보이지 않았다. 그러나, 다른 저자들은 'A' 대립유전자가 감소된 IL-10 발현과 관련이 있다고 기술하고 있다.
또한, IL-10은 세포내 매개자 Stat3을 통해 신호 전달되고 Stat3 활성화는 MUC1-C에 의존한다는 점에 유의해야 한다. 따라서 MUC1과 IL-10의 기능적 상호작용은 이들 분자들이 이러한 IIa상 임상시험에서 통계적으로 유의한 바이오마커 후보인 것으로 판명된 이유가 될 수 있다. 마지막으로, FCGR2A는 종종 종양 미세환경에서 IL-10의 주요 공급원인 대식세포에서 발현된다. 이들 추정 바이오마커 후보가 진행중인 연구 및 앞으로의 연구에서 우위를 차지하면, 이들 인자들의 기능적 상호 작용에 대한 조사가 상당히 흥미로울 것이다.
rs1550117 (DNMT3A):
rs1550117은 후생유전 개량을 유도하는 DNA에서 특정 CpG 구조로의 메틸기의 이동을 촉매하는 효소 DNA (시토신-5)-메틸전달효소 3A를 암호화하는 DNMT3A 유전자에서의 SNP이다. 유전자형 [AA]은 [GG] 또는 [GA]에 비해 위암의 위험이 증가시킨다는 것을 보여주었다. 이 연구에서, [AA]는 FAS 집단에서 단 1명의 환자에서 발견될 수 있었고 PP 집단에서는 어느 환자에서도 발견되지 않았다. 또한, 이는 [AA]가 생존 위험도 부여하여, 이러한 IIa상 임상시험에서 [AA] 담체의 3차 및 4차 치료를 예방함을 나타낼 수 있다. [GA]가 PP에서의 임상 결과와 유의한 상관관계가 있다는 사실은 이 마커가 IMAB362 치료를 위한 예측 바이오마커로서의 잠재성을 보유하고 있음을 암시한다.
rs12456284 (SMAD4):
rs12456284는 세포내 TGFβ/BMP-신호전달 공-변환기인 "데카펜타플렉 상동체 4에 대한 모체"를 암호화하는 SMAD4 유전자에서의 SNP이다. [GG] 유전자형이 위암 위험을 유의하게 감소시켰다는 것이 공표되어 있다. FAS 반응자 집단에서 [AA] 유전자형에 비해 이형접합적 [GA] 유전자형의 통계적으로 유의한 과대표시는 이 유전자형이 예측 바이오마커 역할을 할 수 있음을 시사한다. [GA]를 가진 PP 집단의 환자의 연장된 PFS가 이를 뒷받침하는 사실이다.
rs4444903 (EGF):
EGF 유전자의 프로모터 영역에서 기능적 다형성 rs4444903이 EGF 단백질 수준을 조절하는 것으로 관찰되었지만, [GG] 담체의 혈청에서 더 많은 양의 EGF 인자가 검출되었다. 이 다형성의 G 대립유전자 및 [GG] 유전자형은 메타-분석에서 위장 암의 증가된 위험성과 유의한 상관관계를 보였다.
이러한 IIa상 임상시험에서, 유전자형 [AA]는 FAS 반응자에서 유의하게 과대표시되고, 이 유전자형을 가진 환자들은 FAS 및 PP 집단에서 연장된 PFS의 경향을 보였다. 이는 rs4444903 [AA] 유전자형이 예측 또는 예후 바이오마커임을 나타낼 수 있다.
rs16260 (CDH1):
세포 접착 단백질 카데린1(Cadherin1)(E-카데린)은 칼슘-의존성 카데린 수퍼패밀리의 구성원이다. 기능상실은 암의 진행과 관련되어 있다. CDH1 프로모터의 rs16260 [A] 대립유전자는 카데린1의 전사 효율을 감소시키는 것으로 입증되어 있다. 또한, CDH1의 -160A 대립유전자는 위암 발달의 감수성 인자로 기재되어 있다.
본 연구에서, rs16260 [AA] 유전자형 담체는 FAS 반응자에서 통계적으로 과대표시되었다. 이는 [AA] 유전자형이 추정 예측 바이오마커임을 시사할 수 있다.
rs11615 (ERCC1) 및 rs396991 (FCGR3A):
두 가지 SNPs rs11615 (ERCC1, DNA 수선 단백질 "절제 수선 교차-상보성 그룹 1") 및 rs396991 (FCGR3A, 낮은 친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III-A)는 연장된 PFS와 유전자형(ERCC1 [TT], FCGR3A [TG] 및 [TT])의 상관관계를 보여준다. 이는 이들 SNP가 예측 또는 예후 바이오마커임을 시사할 수 있다.
미생물 또는 생물학적 물질 기탁에 관한 기재(PCT 규칙 13 bis )
Figure pat00034
신규 국제 출원
가니메드 파마슈티칼스 아게, 외.
"암치료법의 치료 효능 및 암 예후 예측용 방법 및 조성물"
당소 번호: 342-85 PCT
생물학적 물질에 대한 별지
기탁 사항에 대한 추가 기재:
1) 수탁물 (DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748)에 대한 수탁 기관의 명칭 및 주소는:
DSMZ-독일 미생물보존센터 (독일 38124 브라운슈바이크 마스체로데르 베그 1b)이다.
2) 수탁물 (DSM ACC2808, DSM ACC2809, DSM ACC2810)에 대한 수탁 기관의 명칭 및 주소는:
DSMZ-독일 미생물보존센터 (독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라세 7B)이다.
Figure pat00035
상기에 언급된 모든 기탁에 대한 추가 기재 사항
-마우스 (Mus musculus) 비장 세포와 융합된 마우스 (Mus musculus) 미엘로마 P3X63Ag8U.1
-인간 클라우딘-18A2에 대한 항체를 분비하는 혼성세포
3) 기탁자:
상기 언급된 모든 기탁은 가니메드 파마슈티칼스 아게 (독일 55131 마인츠 프라일리그라트슈트라쎄 12)에 의하여 이루어졌다.
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2737 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2738 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2739 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2740 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2741 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2742 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2743 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2745 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2746 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2747 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2748 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2808 20061026 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2809 20061026 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2810 20061026
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREDICTION OF THERAPEUTIC EFFICACY OF CANCER TREATMENTS AND CANCER PROGNOSIS <130> 342-85 PCT <150> PCT/EP2015/058212 <151> 2015-04-15 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn 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tcggagggat tcccctaacc tcattcccca 1140 accacttcat tcttgaaagc tgtggccagc ttgttattta taacaaccta aatttggttc 1200 taggccgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggct gaggcgggtg 1260 gatcacttga ggtcaggagt tcctaaccag cctggtcaac atggtgaaac cccgtctcta 1320 ctaaaaatac aaaaattagc cgggcatggt ggcgcgcacc tgtaatccca gctacttggg 1380 aggctgaggc aagagaattg cttgaaccca ggagatggaa gttgcagtga gctgatatca 1440 tgcccctgta ctccagcctg ggtgacagag caagactctg tctcaaaaaa taaaaataaa 1500 aataaatttg gttctaatag aactcagttt taactagaat ttattcaatt cctctgggaa 1560 tgttacattg tttgtctgtc ttcatagcag attttaattt tgaataaata aatgtatctt 1620 attcacatc 1629 <210> 66 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu 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gctggagagg aagggatgaa accagctgct gttgcaaagg ctgcttgtca ttgatagaag 8340 gactcacggg cttggattga ttaagactaa acatggagtt ggcaaacttt cttcaagtat 8400 tgagttctgt tcaatgcatt ggacatgtga tttaagggaa aagtgtgaat gcttatagat 8460 gatgaaaacc tggtgggctg cagagcccag tttagaagaa gtgagttggg ggttggggac 8520 agatttggtg gtggtatttc ccaactgttt cctcccctaa attcagagga atgcagctat 8580 gccagaagcc agagaagagc cactcgtagc ttctgctttg gggacaactg gtcagttgaa 8640 agtcccagga gttcctttgt ggctttctgt atacttttgc ctggttaaag tctgtggcta 8700 aaaaatagtc gaacctttct tgagaactct gtaacaaagt atgtttttga ttaaaagaga 8760 aagccaacta aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 8789 <210> 70 <211> 552 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Met Asp Asn Met Ser Ile Thr Asn Thr Pro Thr Ser Asn Asp Ala Cys 1 5 10 15 Leu Ser Ile Val His Ser Leu Met Cys His Arg Gln Gly Gly Glu Ser 20 25 30 Glu Thr Phe Ala Lys Arg Ala Ile Glu Ser Leu Val Lys Lys Leu Lys 35 40 45 Glu Lys Lys Asp Glu Leu Asp Ser Leu Ile Thr Ala Ile Thr Thr Asn 50 55 60 Gly Ala His Pro Ser Lys Cys Val Thr Ile Gln 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tcagctgctg attttttttc ttcttcttct 2040 tccgcacatc catttctggc gaccccaaag ccatgtccac ctccagggcc ccgtgcccat 2100 tcactgcctc ctgagtgact ggggcctctg tcacctgcat ctcctttttc ttcttccctg 2160 aggtgagcag gttgggggcc aaggctgacc taggccctgt gactggtggg ttgcccccaa 2220 aggcacagaa ccgaggcctc aggccaggag ggatctgtgg tgggggactt gctgggatgg 2280 gctgcagagg gctccctgac agggattgct ggggaccctc aaggatcctt agggtgccct 2340 ggggggctga ggcacaggtg agtccacctc ctgcctccgt tgagggggcc agcagggtcg 2400 cttctccagc ttggggacag ctgctgagga ctcgatagcg gtgccgcttg cctgccaatt 2460 tgcccttgac gatctgggag ccagagagag gcacatgccg cccattgaag ctacagagag 2520 aaacagggag ggcagaggct taagtggaac aggagaggga aggttttttg attttttttt 2580 tgtttttttt tgagagagtc ttgctctgtt gcctaggctg gagtgcagtg gcatgatctc 2640 ggctcactgc aatgtccacc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctctcaagt 2700 agctgggatt acaggcacct gccaccacgc ccagccaatt tttgtatttt tagtagagac 2760 aatttcacta tgttggccag gctggtcttg aactcctgac ctcaagtgat ctgctcgcct 2820 cggcctccca aaggatggga ttacaggcac cagccactgc gcctggctgg cctctggttt 2880 ttaataaaac atgactagag tgactccatc ttaaagtgag tagctaggca cttacaaggt 2940 tcatgcttat ggcctgaaaa taaccacatc ccaggctgac caccaattat aattacagaa 3000 tatttatggc catacagaac atgttccacc aagcctgcag aatgtccaaa tgtcctaaga 3060 atgcagcccc cattacttaa atataacata aatgagcaag cttaggttgc aggattaatg 3120 gtcgtggata acaccaatag cccctacctt tagtgagctt atctgcacac tccaagttta 3180 actatagttc cttatagttt cttataagta gaaatactaa caaagggctg tgggtttctc 3240 cccctgcttt ctgaggacac tctactctgt aaaggagtag tttccaataa acttgtttct 3300 ttcactgtgc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3328 <210> 76 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Asp Pro Gly Lys Asp Lys Glu Gly Val Pro Gln Pro Ser Gly Pro 1 5 10 15 Pro Ala Arg Lys Lys Phe Val Ile Pro Leu Asp Glu Asp Glu Val Pro 20 25 30 Pro Gly Val Ala Lys Pro Leu Phe Arg Ser Thr Gln Ser Leu Pro Thr 35 40 45 Val Asp Thr Ser Ala Gln Ala Ala Pro Gln Thr Tyr Ala Glu Tyr Ala 50 55 60 Ile Ser Gln Pro Leu Glu Gly Ala Gly Ala Thr Cys Pro Thr Gly Ser 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ala Gly Glu Thr Pro Asn Gln Ala Leu Lys Pro Gly Ala 85 90 95 Lys Ser Asn Ser Ile Ile Val Ser Pro Arg Gln Arg Gly Asn Pro Val 100 105 110 Leu Lys Phe Val Arg Asn Val Pro Trp Glu Phe Gly Asp Val Ile Pro 115 120 125 Asp Tyr Val Leu Gly Gln Ser Thr Cys Ala Leu Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Tyr His Asn Leu His Pro Asp Tyr Ile His Gly Arg Leu Gln Ser Leu 145 150 155 160 Gly Lys Asn Phe Ala Leu Arg Val Leu Leu Val Gln Val Asp Val Lys 165 170 175 Asp Pro Gln Gln Ala Leu Lys Glu Leu Ala Lys Met Cys Ile Leu Ala 180 185 190 Asp Cys Thr Leu Ile Leu Ala Trp Ser Pro Glu Glu Ala Gly Arg Tyr 195 200 205 Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Tyr Glu Gln Lys Pro Ala Asp Leu Leu Met 210 215 220 Glu Lys Leu Glu Gln Asp Phe Val Ser Arg Ser Leu Glu Gln Leu Ile 225 230 235 240 Ala Ala Ser Arg Glu Asp Leu Ala Leu Cys Pro Gly Leu Gly Pro Gln 245 250 255 Lys Ala Arg Arg Leu Phe Asp Val Leu His Glu Pro Phe Leu Lys Val 260 265 270 Pro <210> 77 <211> 2204 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 ggagccccgg ctcctaggct gacagaccag cccagatcca gtggcccgga ggggcctgag 60 ctaaatccgc aggacctggg taacacgagg aagtcggttt ggtcccttta gggctccgga 120 tatctttggt gacttgtcca ctccagtgtg gcatcatgtg gcagctgctc ctcccaactg 180 ctctgctact tctagtttca gctggcatgc ggactgaaga tctcccaaag gctgtggtgt 240 tcctggagcc tcaatggtac agggtgctcg agaaggacag tgtgactctg aagtgccagg 300 gagcctactc ccctgaggac aattccacac agtggtttca caatgagagc ctcatctcaa 360 gccaggcctc gagctacttc attgacgctg ccacagtcga cgacagtgga gagtacaggt 420 gccagacaaa cctctccacc ctcagtgacc cggtgcagct agaagtccat atcggctggc 480 tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc 540 acagctggaa gaacactgct ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga 600 agtattttca tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct 660 cctacttctg cagggggctt tttgggagta aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca 720 ccatcactca aggtttggca gtgtcaacca tctcatcatt ctttccacct gggtaccaag 780 tctctttctg cttggtgatg gtactccttt ttgcagtgga cacaggacta tatttctctg 840 tgaagacaaa cattcgaagc tcaacaagag actggaagga ccataaattt aaatggagaa 900 aggaccctca agacaaatga cccccatccc atgggggtaa taagagcagt agcagcagca 960 tctctgaaca tttctctgga tttgcaaccc catcatcctc aggcctctct acaagcagca 1020 ggaaacatag aactcagagc cagatccctt atccaactct cgacttttcc ttggtctcca 1080 gtggaaggga aaagcccatg atcttcaagc agggaagccc cagtgagtag ctgcattcct 1140 agaaattgaa gtttcagagc tacacaaaca ctttttctgt cccaaccgtt ccctcacagc 1200 aaagcaacaa tacaggctag ggatggtaat cctttaaaca tacaaaaatt gctcgtgtta 1260 taaattaccc agtttagagg ggaaaaaaaa acaattattc ctaaataaat ggataagtag 1320 aattaatggt tgaggcagga ccatacagag tgtgggaact gctggggatc tagggaattc 1380 agtgggacca atgaaagcat ggctgagaaa tagcaggtag tccaggatag tctaagggag 1440 gtgttcccat ctgagcccag agataagggt gtcttcctag aacattagcc gtagtggaat 1500 taacaggaaa tcatgagggt gacgtagaat tgagtcttcc aggggactct atcagaactg 1560 gaccatctcc aagtatataa cgatgagtcc tcttaatgct aggagtagaa aatggtccta 1620 ggaaggggac tgaggattgc ggtggggggt ggggtggaaa agaaagtaca gaacaaaccc 1680 tgtgtcactg tcccaagttg ctaagtgaac agaactatct cagcatcaga atgagaaagc 1740 ctgagaagaa agaaccaacc acaagcacac aggaaggaaa gcgcaggagg tgaaaatgct 1800 ttcttggcca gggtagtaag aattagaggt taatgcaggg actgtaaaac caccttttct 1860 gcttcaatat ctaattcctg tgtagctttg ttcattgcat ttattaaaca aatgttgtat 1920 aaccaatact aaatgtacta ctgagcttcg ctgagttaag ttatgaaact ttcaaatcct 1980 tcatcatgtc agttccaatg aggtggggat ggagaagaca attgttgctt atgaaagaaa 2040 gctttagctg tctctgtttt gtaagcttta agcgcaacat ttcttggttc caataaagca 2100 ttttacaaga tcttgcatgc tactcttaga tagaagatgg gaaaaccatg gtaataaaat 2160 atgaatgata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2204 <210> 78 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250

Claims (22)

  1. CLDN18.2에 결합하는 항체를 포함하는, 암 질환 치료용 약학 조성물에 있어서,
    상기 조성물은 CLDN18.2에 대해 양성인 종양을 갖고 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성의 유전자형을 갖는 암환자에게 투여되고,
    (a) 동형접합적 MUC1 rs4072037 [AA] 유전자형;
    (b) 동형접합적 IL-10 rs1800896 [GG] 유전자형;
    (c) 이형접합적 DNMT3A rs1550117 [GA] 유전자형;
    (d) 이형접합적 SMAD4 rs12456284 [GA] 유전자형;
    (e) 동형접합적 EGF rs4444903 [AA] 유전자형;
    (f) 동형접합적 CDH1 rs16260 [AA] 유전자형; 및
    (g) 동형접합적 ERCC1 rs11615 [TT] 유전자형
    상기 환자가 상기 항체 치료에 대한 반응자 아닌 것에 대한 감소된 위험을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암환자는 환자로부터 획득된 시료에서 MUC1 rs4072037, IL-10 rs1800896, DNMT3A rs1550117, SMAD4 rs12456284, EGF rs4444903, CDH1 rs16260, 및 ERCC1 rs11615로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형의 결정에 의하여 CLDN18.2에 결합하는 항체 치료에 대한 반응자로 평가된 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서.
    상기 치료는 암환자가 평가 방법에 의해 CLDN18.2에 결합하는 항체 치료에 대한 반응자인지 평가하는 것을 포함하고,
    환자로부터 획득된 시료에서 MUC1 rs4072037, IL-10 rs1800896, DNMT3A rs1550117, SMAD4 rs12456284, EGF rs4444903, CDH1 rs16260 및 ERCC1 rs11615 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형을 결정하는 것을 포함하며,
    (a) 동형접합적 MUC1 rs4072037 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내고,
    (b) 동형접합적 MUC1 rs4072037 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험을 나타내며,
    (c) 동형접합적 IL-10 rs1800896 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (d) 이형접합적 DNMT3A rs1550117 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (e) 이형접합적 SMAD4 rs12456284 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (f) 동형접합적 EGF rs4444903 [AA] 유전자형은 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내는,
    (g) 동형접합적 CDH1 rs16260 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (h) 동형접합적 ERCC1 rs11615 [TT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내는, 평가 방법.
    상기 환자가 상기 항체 치료에 대한 반응자 아닌 것에 대한 감소된 위험을 가지는 경우 상기 항체로 암 환자를 치료하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는, 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 통해 작용하는, 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 17의 아미노산 위치 45-52를 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 17의 아미노산 위치 70-77을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 17의 아미노산 위치 116-126을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24의 아미노산 위치 47-58을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 24의 아미노산 위치 76-78을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 24의 아미노산 위치 115-123을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 요법은 항체-약물 접합체에 의한 치료를 포함하고, 상기 항체-약물 접합체는 CLDN18.2에 대한 항체를 포함하는, 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항체는 방사성, 화학요법성, 독소 일부분, 세포증식억제제 화합물 또는 세포독성 화합물에 결합된, 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 17의 아미노산 위치 45-52를 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 17의 아미노산 위치 70-77을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 17의 아미노산 위치 116-126을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24의 아미노산 위치 47-58을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 24의 아미노산 위치 76-78을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 24의 아미노산 위치 115-123을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 고형 종양 또는 이의 전이성 종양인, 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 위식도 종양 또는 이의 전이성 종양인, 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 위 또는 하부 식도의 진행성 선암 또는 이의 전이성 종양인, 약학 조성물.
  15. 평가 방법으로서,
    종양 항원-양성 종양을 가진 암환자가 종양 항원에 대한 항체 치료에 대한 반응자인 경우,
    상기 종양 항원은 CLDN18.2 단백질이고;
    상기 방법은 환자로부터 획득된 시료에서 MUC1 rs4072037, IL-10 rs1800896, DNMT3A rs1550117, SMAD4 rs12456284, EGF rs4444903, CDH1 rs16260 및 ERCC1 rs11615 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성에 대한 유전자형을 결정하는 것을 포함하며,
    (a) 동형접합적 MUC1 rs4072037 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내고,
    (b) 동형접합적 MUC1 rs4072037 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 증가된 위험을 나타내며,
    (c) 동형접합적 IL-10 rs1800896 [GG] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (d) 이형접합적 DNMT3A rs1550117 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (e) 이형접합적 SMAD4 rs12456284 [GA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (f) 동형접합적 EGF rs4444903 [AA] 유전자형은 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내는,
    (g) 동형접합적 CDH1 rs16260 [AA] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내며,
    (h) 동형접합적 ERCC1 rs11615 [TT] 유전자형의 존재는 항체 치료에 대한 반응자가 아닌 암환자의 감소된 위험을 나타내는, 평가 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 항체는 환자의 면역계를 동원하여 종양세포를 파괴하는 것을 통해 작용하는. 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 항체는 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 통해 작용하는, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 17의 아미노산 위치 45-52를 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 17의 아미노산 위치 70-77을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 17의 아미노산 위치 116-126을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24의 아미노산 위치 47-58을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 24의 아미노산 위치 76-78을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 24의 아미노산 위치 115-123을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.
  20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 고형 종양 또는 이의 전이성 종양인, 방법.
  21. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 위식도 종양 또는 이의 전이성 종양인, 방법.
  22. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 위 또는 하부 식도의 진행성 선암 또는 이의 전이성 종양인, 방법.


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