CN107873061B - 用于预测癌症治疗之治疗效力和癌症预后的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及用于预测癌症治疗之治疗效力和对癌症进行预后的方法和组合物。本发明公开了分别与某些癌症治疗中有利和不利的结果相关并且可用作癌症的预后性标志物的标志物。公开了涉及这些标志物的方法，其用于预测癌症治疗效益和对癌症患者的临床结局进行预后。

Description

用于预测癌症治疗之治疗效力和癌症预后的方法和组合物
技术领域
本发明一般地涉及用于预测癌症治疗的治疗效力和对癌症进行预后的方法和组合物。本发明公开了分别与某些癌症治疗中有利和不利的结果相关并且可用作癌症的预后性标志物的标志物。公开了涉及这些标志物的方法，其用于预测癌症治疗效益和对癌症患者的临床结局进行预后。
背景技术
胃和食管(胃食管(gastroesophageal)；GE)的癌症在恶性肿瘤中具有最高未满足的医疗需求。胃癌是世界范围内死亡的第二主要原因。尽管建立的与显著副作用相关的标准治疗的积极性，食管癌的发生率在近几十年内已经升高，并且GE癌症的总体五年存活率为20％至25％。患有这种癌症类型的患者的医疗需求高，并且需要创新药物。
紧密连接分子密封蛋白18同种型2(claudin 18 isotype 2，CLDN18.2)是密封蛋白18的癌症相关剪接变体[Niimi，T.，等，Mol Cell Biol，2001.21(21)：第7380-90页；Tureci，O.，等，Gene，2011.481(2)：第83-92页]。CLDN18.2是包含四个跨膜结构域和两个小细胞外环(环1被疏水区1和疏水区2包围；环2被疏水区3和4包围)的27.8kDa跨膜蛋白。CLDN18.2是高选择性胃谱系抗原，仅在短寿命的分化胃上皮细胞上表达，并且无法在任何其他正常人组织中检出。该抗原在包括胃食管癌和胰腺癌的多种人癌症中以显著水平异位表达[Sahin，U.，等，Clin Cancer Res，2008.14(23)：第7624-34页]。CLDN18.2蛋白在胃癌的淋巴结转移和远处转移中也被频繁检出。由于通过siRNA技术的靶标下调导致抑制胃癌细胞的增殖，因此CLDN18.2看来参与CLDN18.2阳性肿瘤细胞的增殖。
IMAB362是针对CLDN18.2的IgG1亚型的嵌合单克隆抗体。IMAB362以高亲和力和特异性识别CLDN18.2的第一细胞外结构域，并且不与包括密切相关的密封蛋白18剪接变体1(CLDN18.1)的任何其他密封蛋白家族成员结合。
在表达CLDN18.2的人异种移植物中，已经在施用IMAB362之后在小鼠中观察到存活效益和肿瘤消退。当在相关动物物种中静脉内施用后，由于靶表位不可及而未观察到胃组织中的毒性。然而，肿瘤靶标在恶性转化期间变得对IMAB362可及。IMAB362具有四种独立的高度有效的作用机制：(i)抗体依赖性细胞的细胞毒性(antibody-dependent cellularcytotoxicity，ADCC)；(ii)补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)；(iii)由靶标在肿瘤表面交联而诱导的凋亡诱导；以及(iv)直接抑制增殖。
先前的I期试验已经将IMAB362作为单一治疗以单剂量在患有晚期胃食管癌的患者中进行评价。在该试验中，使用五种IMAB362剂量(33mg/m2、100mg/m2、300mg/m2、600mg/m2和1000mg/m2)作为单一治疗。该研究表明这种抗体的单一施用在高至1000mg/m2的剂量下是安全的并且耐受良好，因为没有观察到剂量组之间AE分布和其他安全性参数的相关差异(AE＝不良事件)。300mg/m2组和600mg/m2组获得关于抗肿瘤活性的最佳结果。在300mg/m2组的两位患者中，疾病得到控制，且由于其只具有非靶标病变，因此将其评定为非CR、非PD(CD＝完全响应；PD＝疾病进展)。非CR、非PD的持续时间分别为约两个月和六周。这三位患者的肿瘤标志物水平保持稳定。600mg/m2组中的一位患者呈现病情稳定(SD)。SD的持续时间为约2个月。
基于IMAB362的诱导细胞杀伤的高度有效作用机制、经IMAB362处理的携带CLDN18.2阳性肿瘤之小鼠的存活效益、没有对IMAB362相关毒性的任何指示以及I期试验的有前途结果，开始了IIa期研究。进行该IIa期临床试验以确定重复剂量的IMAB362在患有通过组织学证明的晚期胃或下食管(lower esophagus)腺癌的转移性、顽固性或复发性疾病的患者中的安全性、耐受性和抗肿瘤活性。
在该IIa期试验中，将研究性药物应用于依次招募的三个组群(cohort)。使第一组群的三位患者以较低剂量水平(300mg/m2体表面积)接受重复剂量的IMAB362。以2小时静脉内输注给予抗体。由于在第一组群中未检测到对IMAB362相关毒性的指示，将第二组群(三位患者)的IMAB362剂量提高至600mg/m2体表面积。在第三组群中，向19位患者分配相同的剂量(重复施用600mg/m2体表面积)。对来自该组群的患者样品进行数种伴随分析物(即ADCC、CDC、免疫表型分析和遗传免疫多态性)的分析。所有组群的所有患者都每两周在第2、5、6、7和8次访视时接受重复剂量的IMAB362(5次施用)。
抗原阳性肿瘤(以类似的程度过表达靶抗原)关于针对治疗性单克隆抗体(例如IMAB362)干预的响应性的差异表明，存在与治疗结果相关的另外因素。这要求仔细选择可受益于抗体治疗的患者。
因此，需要开发测量患者对抗体治疗之适合性的测试。本发明通过提供分别与抗体治疗中的有利和不利结果相关的标志物而解决这一需求。此外，本发明表明这些标志物可用作用于对癌症患者的临床结局进行预后的标志物。
本文中提供的研究结果可用于选择用于癌症患者的合适治疗，并且特别地用于决定抗体治疗是否应施用于癌症患者。
发明概述
本发明提供了SNP(单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism))基因分型的方法，其例如用于评价个体对癌症的治疗性治疗作出响应的可能性、用于选择治疗或预防方案(例如，用于决定是否向患有癌症或未来发生癌症的风险提高的个体施用特定治疗剂)、或者用于评价个体关于疾病严重程度和恢复的预后。
本发明基于以下发现：SNP的某些基因型与癌症对抗体治疗(例如CLDN18.2阳性癌症，特别是CLDN18.2阳性胃食管癌的IMAB362治疗)的敏感性/不敏感性相关。本发明还基于以下发现：SNP的某些基因型与癌症患者的临床结局相关，并且因此可用于对癌症进行预后。
在一个方面，本发明涉及评估以下的方法：
(i)患有肿瘤抗原阳性肿瘤的癌症患者是否是用针对所述肿瘤抗原之抗体治疗的响应者，和/或
(ii)癌症患者(优选患有肿瘤抗原阳性肿瘤的癌症患者)是否将经历无进展存活，
所述方法包括确定从所述患者获得的样品中选自以下的一种或更多种单核苷酸多态性的基因型：FCGR2A rs1801274、MUC1 rs4072037、IL-10 rs1800896、DNMT3Ars1550117、SMAD4 rs12456284、EGF rs4444903、CDH1 rs16260、ERCC1 rs11615和FCGR3Ars396991。
在一个实施方案中，杂合FCGR2A rs1801274[CT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合FCGR2A rs1801274[TT]基因型和/或纯合FCGR2Ars1801274[CC]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险提高和/或癌症患者不经历无进展存活的风险提高。
在一个实施方案中，纯合MUC1 rs4072037[AA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合MUC1 rs4072037[GG]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险提高和/或癌症患者不经历无进展存活的风险提高。
在一个实施方案中，纯合IL-10 rs1800896[GG]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，杂合DNMT3A rs1550117[GA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，杂合SMAD4 rs12456284[GA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合EGF rs4444903[AA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合CDH1 rs16260[AA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合ERCC1 rs11615[TT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，杂合FCGR3A rs396991[TG]基因型和/或纯合FCGR3Ars396991[TT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合FCGR3A rs396991[GG]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险提高和/或癌症患者不经历无进展存活的风险提高。
在一个实施方案中，肿瘤抗原为CLDN18.2蛋白。
在一个方面，本发明涉及评估以下的方法：
(i)患有CLDN18.2阳性肿瘤的癌症患者是否是用针对CLDN18.2蛋白之抗体治疗的响应者，和/或
(ii)癌症患者(优选患有CLDN18.2阳性肿瘤的癌症患者)是否将经历无进展存活，
所述方法包括确定从所述患者获得的样品中选自以下的一种或更多种单核苷酸多态性的基因型：FCGR2A rs1801274、MUC1 rs4072037、IL-10 rs1800896、DNMT3Ars1550117、SMAD4 rs12456284、EGF rs4444903、CDH1 rs16260、ERCC1 rs11615和FCGR3Ars396991。
在一个实施方案中，杂合FCGR2A rs1801274[CT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合FCGR2A rs1801274[TT]基因型和/或纯合FCGR2Ars1801274[CC]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险提高和/或癌症患者不经历无进展存活的风险提高。
在一个实施方案中，纯合MUC1 rs4072037[AA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合MUC1 rs4072037[GG]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险提高和/或癌症患者不经历无进展存活的风险提高。
在一个实施方案中，纯合IL-10 rs1800896[GG]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，杂合DNMT3A rs1550117[GA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，杂合SMAD4 rs12456284[GA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合EGF rs4444903[AA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合CDH1 rs16260[AA]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合ERCC1 rs11615[TT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，杂合FCGR3A rs396991[TG]基因型和/或纯合FCGR3Ars396991[TT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
在一个实施方案中，纯合FCGR3A rs396991[GG]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险提高和/或癌症患者不经历无进展存活的风险提高。
在本发明所有方面的一个实施方案中，抗体通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞来发挥作用。在一个实施方案中，抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)来发挥作用。在一个实施方案中，抗体为单克隆抗体。在本发明所有方面的一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：17或51所示氨基酸序列或其片段，所述轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段。
在本发明所有方面的一个实施方案中，对用所述抗体治疗无响应性包括以下一种或更多种的相对降低：存活、无进展存活、无复发存活、无远处复发存活和病情稳定。
在一个方面，本发明涉及治疗癌症患者的方法，所述方法包括：
a.通过本发明的方法来评估癌症患者是否是用抗体治疗的响应者，以及
b.(i)如果患者不是用抗体治疗的响应者的风险降低，则用所述抗体治疗癌症患者；或者(ii)如果患者不是抗体之治疗的响应者的风险提高，则不用所述抗体治疗癌症患者和/或用包含不同于用所述抗体治疗之治疗的治疗方案治疗癌症患者。
在一个实施方案中，治疗方案包含不依赖于患者的免疫系统的治疗。在一个实施方案中，治疗方案不包含用通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞来发挥作用的抗体治疗。在一个实施方案中，治疗方案包含外科手术(surgery)、化学治疗(chemotherapy)和/或放射(radiation)。在一个实施方案中，治疗方案包含用该肿瘤抗原的小分子抑制剂和/或其中抗体针对该肿瘤抗原的抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate)治疗。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物为与放射性部分、化学治疗部分或毒素部分偶联的抗体。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物为与细胞抑制性或细胞毒性化合物偶联的抗体。
在一个方面，本发明涉及评估癌症患者的临床结局的方法，所述方法包括确定从所述患者获得的样品中选自以下的一种或更多种单核苷酸多态性的基因型：FCGR2Ars1801274、MUC1 rs4072037、IL-10 rs1800896、DNMT3A rs1550117、SMAD4 rs12456284、EGF rs4444903、CDH1 rs16260、ERCC1 rs11615和FCGR3A rs396991。
在一个实施方案中，杂合FCGR2A rs1801274[CT]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，纯合FCGR2A rs1801274[TT]基因型和/或纯合FCGR2Ars1801274[CC]基因型的存在指示不良临床结局的风险提高。
在一个实施方案中，纯合MUC1 rs4072037[AA]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，纯合MUC1 rs4072037[GG]基因型的存在指示不良临床结局的风险提高。
在一个实施方案中，纯合IL-10 rs1800896[GG]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，杂合DNMT3A rs1550117[GA]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，杂合SMAD4 rs12456284[GA]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，纯合EGF rs4444903[AA]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，纯合CDH1 rs16260[AA]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，纯合ERCC1 rs11615[TT]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，杂合FCGR3A rs396991[TG]基因型和/或纯合FCGR3Ars396991[TT]基因型的存在指示不良临床结局的风险降低。
在一个实施方案中，纯合FCGR3A rs396991[GG]基因型的存在指示不良临床结局的风险提高。
在一个实施方案中，评估癌症患者的临床结局包括预测以下一种或更多种的可能性：存活、无进展存活、无复发存活、无远处复发存活和病情稳定。在一个实施方案中，不良临床结局包括以下一种或更多种的相对降低：存活、无进展存活、无复发存活、无远处复发存活和病情稳定。
在一个实施方案中，患者患有肿瘤抗原阳性肿瘤并且接受用针对所述肿瘤抗原的抗体治疗。
在本发明所有方面的一个实施方案中，样品为包含DNA的样品。在一个实施方案中，DNA已从患者的身体样品中提取。在一个实施方案中，DNA已从血液中提取。
在本发明所有方面的一个实施方案中，肿瘤为实体瘤。在一个实施方案中，肿瘤为胃食管肿瘤。在一个实施方案中，肿瘤为晚期的胃或下食管腺癌。在一个实施方案中，癌症为胃食管癌。在一个实施方案中，癌症为晚期的胃或下食管腺癌。
在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含用于确定从患者获得的样品中选自以下的一种或更多种单核苷酸多态性的基因型的部件(means)：FCGR2A rs1801274、MUC1rs4072037、IL-10 rs1800896、DNMT3A rs1550117、SMAD4 rs12456284、EGF rs4444903、CDH1 rs16260、ERCC1 rs11615和FCGR3A rs396991。在一个实施方案中，所述试剂盒可用于进行本发明所有方面的方法。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含数据载体。在一个优选实施方案中，所述数据载体为电子或非电子数据载体。在一个实施方案中，所述数据载体包含关于如何进行本发明所有方面的方法的说明。
在结合附图考虑时，本发明的其他目的、优点和特征将通过以下详细描述而变得明显。
附图简述
图1：患者与对照群体之间具有统计学显著性基因型频移的单核苷酸多态性(χ2检验，p＜0.05)。
示出了SNP特异性基因型对条形部分的分配。Pat：患者群体，Co：对照群体。
图2：每位患者的纯合风险基因型相对于每位患者的所研究SNP风险因子数目的相对频率。患者按累积纯合风险因子的频率提高排序。
图3：由rs1801274(FCGR2A)基因型区分的PP患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图4：由rs1801274(FCGR2A)基因型区分的FAS患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图5：由rs1800896(IL-10)基因型区分的PP患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图6：由rs1800896(IL-10)基因型区分的FAS患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图7：由rs1550117(DNMT3A)基因型区分的FAS患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图8：由rs12456284(SMAD4)基因型区分的PP患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图9：由rs4072037(MUC1)基因型区分的PP患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图10：由rs4072037(MUC1)基因型区分的FAS患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图11：由rs4444903(EGF)基因型区分的FAS患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图12：由rs16260(CDH1)基因型区分的FAS患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图13：由rs11615(ERCC1)基因型区分的PP患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
图14：由rs396991(FCGR3A)基因型区分的PP患者的无进展存活(Kaplan-Meier曲线)。
发明详述
尽管下文详细描述了本发明，但是应理解，本发明不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
下文中，将描述本发明的要素。这些要素随具体实施方案列出，然而，应理解，可以以任何方式和任意数量对其进行组合以产生另外的实施方案。不同地描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限制于明确描述的实施方案。本说明书应被理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外说明，否则本申请中所有描述的要素的任意排列和组合应视为被本申请的说明书公开。
优选地，本文中使用的术语如″A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)″，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel；以及H.
Figure BPA0000248867100000101
编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland，(1995)中所述进行定义。
除非另外指出，否则本发明的实施将采用在本领域的文献中阐明的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见例如，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，J.Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文中另外要求，否则词语“包括/包含”及变化形式应理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可排除，即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文中另外说明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中值范围的描述仅旨在用作单独地提及落在该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外说明，否则将每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。除非本文中另外说明或另外明显与上下文相矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任意合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如/如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不对以其他方式要求保护的本发明范围造成限制。本说明书中的语言不应解释为表示对本发明的实施至关重要的任何非要求保护的要素。
在本说明书的整个文本中引用了数篇文献。本文中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)，无论在上文中还是在下文中都在此通过引用整体并入。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明无权由于在前的发明而早于这样的公开内容。
本发明人提供了测量患者对某些癌症治疗(特别是抗体治疗)的适合性并得出关于癌症患者预后的结论的测试。使用这些测试获得的结果使得医师能够决定用于癌症患者的合适治疗，并且特别是决定是否应向特定癌症患者施用抗体治疗。
术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是指通常在群体内发生的DNA序列变异，其中基因组(或其他共有序列)中的单个核苷酸在生物物种的成员之间或配对染色体之间不同。SNP可发生在基因的编码序列、基因的非编码区中或基因间区(基因之间的区域)中。由于遗传密码的简并性，编码序列内的SNP可以但不一定改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。因此，编码区中的SNP有同义SNP和非同义SNP两种类型。同义SNP不影响蛋白质序列，而非同义SNP改变蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP有两种类型：错义和无义。不在蛋白质编码区中的SNP仍可影响基因剪接、转录因子结合、信使RNA降解或非编码RNA的序列。受这种类型的SNP影响的基因表达被称为eSNP(表达SNP)，并且可以在基因的上游或下游。
可以使用本领域中已知的多种方法来确定SNP的基因型。发现新SNP和检测已知SNP的分析方法包括例如：DNA测序、毛细管电泳、质谱、单链构象多态性(single-strandconformation polymorphism，SSCP)、电化学分析、变性HPLC和凝胶电泳、限制性片段长度多态性和杂交分析。
可通过例如“确定SNP的基因型”或“SNP基因分型”的短语来提及确定哪种核苷酸存在于本文中所述的特定SNP位置(对于任一个或两个等位基因)的方法。因此，这些短语可以指在SNP位置处检测单个等位基因(核苷酸)，或者可涵盖在SNP位置处检测两个等位基因(核苷酸)(例如以确定SNP位置的纯合或杂合状态)。此外，这些短语还可以指检测由SNP编码的氨基酸残基(例如由SNP位置处的替代核苷酸产生的不同密码子编码的替代氨基酸残基)。
特异性检测本文中公开的特定靶SNP位置并且优选地对靶SNP位置的特定核苷酸(等位基因)具有特异性的试剂(即，试剂优选地可以区分靶SNP位置的不同替代核苷酸，从而允许确定存在于靶SNP位置的核苷酸的身份)可用于SNP检测。通常来说，这样的检测试剂以序列特异性方式通过互补碱基配对与含靶SNP的核酸分子杂交，并且将靶变体序列与受试样品中的其他核酸序列(例如，本领域中已知的形式)区分开。检测试剂的一个实例是与含有本文中公开的SNP的靶核酸杂交的非天然存在的核酸引物或探针。在一个优选实施方案中，这样的引物或探针可以将在靶SNP位置处具有特定核苷酸(等位基因)的核酸与在相同靶SNP位置处具有不同核苷酸的其他核酸区分开。此外，检测试剂可以与在SNP位置5’和/或3’的特定区域杂交。对本领域技术人员显而易见的是，这样的检测试剂(例如这样的引物和探针)可直接用作用于对本文中公开的一种或更多种SNP进行基因分型的试剂，并且可并入任何试剂盒形式中。
为了分析SNP，使用对替代SNP等位基因具有特异性的寡核苷酸可以是合适的。这样的检测靶序列中单核苷酸变异的寡核苷酸可被称为例如“等位基因特异性寡核苷酸”、“等位基因特异性探针”或“等位基因特异性引物”的术语。
SNP检测试剂可用发射可检测信号的报道子(例如荧光报道染料)进行标记。虽然优选的报道染料是荧光染料，但是根据本发明，可以与例如寡核苷酸探针或引物的检测试剂连接的任何报道染料都是合适的。在另一个实施方案中，检测试剂还可用猝灭剂染料标记，尤其是当试剂用作自猝灭探针(例如TaqMan探针)时。本文中公开的SNP检测试剂还可包含其他标记，包括但不限于用于链霉亲和素结合的生物素、用于抗体结合的半抗原和用于与其他互补寡核苷酸结合的寡核苷酸。
根据本发明，还考虑了不包含待鉴定的SNP核苷酸(或不与其互补)，但是用于测定本文中公开的一种或更多种SNP的试剂。例如，在靶SNP位置侧翼但不与其直接杂交的引物可用于其中引物与靶SNP位置相邻的区域(即，在从靶SNP位点的一个或更多个核苷酸内)杂交的引物延伸反应。在引物延伸反应期间，如果特定核苷酸(等位基因)存在于靶SNP位点，则引物通常不能够延伸通过该靶SNP位点，并且可以检测引物延伸产物以确定哪种SNP等位基因存在于靶SNP位点。例如，通常在引物延伸反应中使用特定ddNTP以一旦ddNTP并入延伸产物中就终止引物延伸。因此，根据本发明，即使结合的序列不一定包含SNP位点本身，与SNP位点相邻的区域中的核酸分子结合并用于测定SNP位点的试剂也在考虑之中。
术语“FCGR2A”涉及人FCGR2A基因。该基因编码低亲和力免疫球蛋白γFc区受体II-a(CD32)，并且是免疫球蛋白Fc受体基因家族的一个成员。由该基因编码的蛋白质是见于吞噬细胞(例如巨噬细胞和中性粒细胞)上的细胞表面受体，并且参与吞噬和免疫复合物清除的过程。选择性剪接产生多种转录物变体。
优选地，术语“FCGR2A”涉及包含序列表的SEQ ID NO：61的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ IDNO：62的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs1801274是FCGR2A基因中的SNP。rs1801274(C)编码精氨酸(R)等位基因，(T)等位基因编码变体组氨酸(H)。该SNP是具有以下密码子变化的基因内转换替换：CAT、CGT，并导致错义突变。该SNP在文献中被称为许多名称，包括A519C和R131H。背景序列如下：
TGGGATGGAGAAGGTGGGATCCAAA[C/T]GGGAGAATTTCTGGGATTTTCCATT。
术语“MUC1”涉及人MUC1基因。该基因编码黏蛋白1，细胞表面相关(MUC1)或多形上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin，PEM)，其是黏蛋白家族的成员，并且是膜结合的糖基化磷蛋白。该蛋白质通过跨膜结构域锚定至许多上皮的顶表面。在跨膜结构域之外是包含用于释放大细胞外结构域的切割位点的SEA结构域。该蛋白质通过与病原体结合而发挥保护作用并且还在细胞信号传导能力中发挥功能。
优选地，术语“MUC1”涉及包含序列表的SEQ ID NO：63的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ ID NO：64的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs4072037是MUC1基因中的SNP。该SNP是具有以下密码子变化的基因内转换替换：ACA、ACG，并导致沉默突变。背景序列如下：
CCCCTAAACCCGCAACAGTTGTTAC[A/G]GGTTCTGGTCATGCAAGCTCTACCC。
术语“IL-10”涉及人IL-10基因。该基因编码白介素-10(IL-10)，也称为人细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)，其为抗炎细胞因子。
优选地，术语“IL-10”涉及包含序列表的SEQ ID NO：65的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ IDNO：66的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs1800896是IL-10基因中的SNP。该SNP是基因间/未知的基因内转换替换。背景序列如下：
CAACACTACTAAGGCTTCTTTGGGA[A/G]GGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGA
术语“DNMT3A”涉及人DNMT3A基因。该基因编码DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A。由该基因编码的蛋白质是催化甲基转移到DNA中特定CpG结构的酶。
优选地，术语“DNMT3A”涉及包含序列表的SEQ ID NO：67的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ IDNO：68的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs1550117是DNMT3A基因中的SNP。该SNP是在DNMT3A启动子区内的基因内转换替换。背景序列如下：
AATTCCACCAGCACAGCCACTCACT[A/G]TGTGCTCATCTCACTCCTCCAGCAG。
术语“SMAD4”涉及人SMAD4基因。该基因编码母亲DPP同源物4(Mothers againstdecapentaplegic homolog 4)。由该基因编码的蛋白质参与细胞信号传导，并且属于调节TGFβ蛋白超家族成员的Darfwin蛋白质家族。其结合受体调节的SMAD，例如SMAD1和SMAD2，并且形成与DNA结合且用作转录因子的复合物。其是唯一已知的哺乳动物coSMAD。
优选地，术语“SMAD4”涉及包含序列表的SEQ ID NO：69的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ IDNO：70的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs12456284是SMAD4基因中的SNP。该SNP是3′-UTR中的基因内转换替换。背景序列如下：
AGGTCCAGAGCCAGTGTTCTTGTTC[A/G]ACCTGAAAGTAATGGCTCTGGGTTG。
术语“EGF”涉及人EGF基因。该基因编码表皮生长因子。EGF是通过与其受体EGFR结合而刺激细胞生长、增殖和分化的生长因子。
优选地，术语“EGF”涉及包含序列表的SEQ ID NO：71的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ ID NO：72的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs4444903是EGF基因中的SNP。该SNP是5′-UTR中的基因内转换替换。背景序列如下：
CTTTCAGCCCCAATCCAAGGGTTGT[A/G]GCTGGAACTTTCCATCAGTTCTTCC。
术语“CDH1”涉及人CDH1基因。该基因编码钙黏着蛋白-1，也称为CAM 120/80或上皮钙黏着蛋白(E-钙黏着蛋白)或桑椹黏着蛋白(uvomorulin)。所述蛋白质是钙黏着蛋白超家族的经典成员。其为由五个细胞外钙黏着蛋白重复、跨膜区和高度保守的细胞质尾构成的钙依赖性细胞-细胞黏附糖蛋白。功能丧失被认为通过提高增殖、侵袭和/或转移而促进癌症的进展。
优选地，术语“CDH1”涉及包含序列表的SEQ ID NO：73的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ ID NO：74的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs16260是CDH1基因中的SNP。该SNP是位于CDH1基因的启动子区内的基因内颠换替换。背景序列如下：
CTAGCAACTCCAGGCTAGAGGGTCA[A/C]CGCGTCTATGCGAGGCCGGGTGGGC。
术语“ERCC1”涉及人ERCC1基因。该基因编码DNA切除修复蛋白ERCC-1。ERCC1蛋白的功能主要在于受损DNA的核苷酸切除修复。
优选地，术语“ERCC1”涉及包含序列表的SEQ ID NO：75的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ IDNO：76的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs11615是ERCC1基因中的SNP。该SNP是沉默的基因内转换替换。背景序列如下：
ATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA[C/T]GTGCCCTGGGAATTTGGCGACGTAA。
术语“FCGR3A”涉及人FCGR3A基因。该基因编码低亲和力免疫球蛋白γFc区受体III-A。由该基因编码的蛋白质是分化细胞表面分子簇的一部分。
优选地，术语“FCGR3A”涉及包含序列表的SEQ ID NO：77的核酸序列或所述核酸序列的变体、优选由其组成的核酸，以及由该核酸编码的蛋白质，优选包含序列表的SEQ IDNO：78的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
rs396991是FCGR3A基因中的SNP。该SNP是具有以下密码子变化的基因内颠换替换：GTT、TTT，并导致错义突变。rs396991(T)编码苯丙氨酸(F)等位基因，(G)等位基因编码变体缬氨酸(V)。背景序列如下：
CGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTT[G/T]TTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGA。
密封蛋白是作为紧密连接中最重要组分的蛋白质家族，在紧密连接中其建立控制分子在上皮的细胞之间的细胞间隙中流动的细胞旁屏障。密封蛋白是跨膜4次的跨膜蛋白，具有均位于细胞质中的N端和C端。第一细胞外环或结构域平均由53个氨基酸组成，且第二细胞外环或结构域由约24个氨基酸组成。密封蛋白家族的细胞表面蛋白(例如CLDN18.2)在不同来源的肿瘤中表达，并且由于其选择性表达(在毒性相关正常组织中没有表达)和定位到质膜而特别适合作为与抗体介导的癌症免疫治疗相关的靶结构。
本文中使用的术语“CLDN”意指密封蛋白并且包括CLDN18.2。优选地，密封蛋白是人密封蛋白。
术语“CLDN18”涉及密封蛋白18并且包括任何变体，所述变体包括密封蛋白18剪接变体1(密封蛋白18.1(CLDN18.1))和密封蛋白18剪接变体2(密封蛋白18.2(CLDN18.2))。
术语“CLDN18.2”优选地涉及人CLDN18.2，且特别是涉及包含根据序列表的SEQ IDNO：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。CLDN18.2的第一细胞外环或结构域优选包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的第27至81位氨基酸，更优选第29至78位氨基酸。CLDN18.2的第二细胞外环或结构域优选包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的第140至180位氨基酸。所述第一和第二细胞外环或结构域优选形成CLDN18.2的细胞外部分。
CLDN18.2在胃黏膜的分化上皮细胞的正常组织中选择性表达。CLDN18.2在不同来源的癌症中表达，例如胰腺癌、食管癌、胃癌、支气管癌、乳腺癌和ENT肿瘤。CLDN18.2是用于预防和/或治疗原发性肿瘤(例如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌)及其转移(特别是胃癌转移(例如克鲁肯贝格肿瘤(Krukenberg tumor))、腹膜转移和淋巴结转移)的有价值的靶标。
术语“CLDN18.1”优选涉及人CLDN18.1，且特别是涉及包含根据序列表的SEQ IDNO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
本文中使用的“预后”是指结果的预测，特别是无进展存活(progression-freesurvival，PFS)或无疾病存活(disease-free survival，DFS)的可能性。存活通常计算为50％患者存活的平均月数(或年数)，或在1、5、15和20年后活着的患者的百分比。预后对治疗决定是重要的，因为预后良好的患者通常被提供侵入性较低的治疗，而预后不良的患者通常被提供更具攻击性的治疗，例如更广泛的化学治疗药物。
本文中使用的“预测”是指提供关于疾病对不同治疗性治疗的可能响应的信息。
短语“指示风险”是指某种程度的可能性或概率的指示。短语“指示风险降低”是指低程度的可能性或概率。短语“指示风险提高”是指某种更高或高程度的可能性或概率。
如果事件“指示癌症患者不是用抗体治疗的响应者的风险降低”，则所述事件指示癌症患者是用所述抗体治疗的响应者，即患者可能是用所述抗体治疗的响应者，并且任选地，与患者不是用所述抗体治疗的响应者相比，该患者更可能是用所述抗体治疗的响应者。
如果事件“指示癌症患者不是用抗体治疗的响应者的风险提高”，则所述事件指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者，即患者可能不是用所述抗体治疗的响应者，并且任选地，与患者是用所述抗体治疗的响应者相比，该患者更可能不是用所述抗体治疗的响应者。
如果事件“指示不良临床结局的风险降低”，则所述事件指示良好的临床结局，即可能将存在良好的临床结局，并且任选地，与存在不良临床结局相比，更可能将存在良好的临床结局。
如果事件“指示不良临床结局的风险提高”，则所述事件指示临床结局不良，即可能将存在不良临床结局，并且任选地与良好的临床结局相比，更可能将存在不良临床结局。
如果事件“指示癌症患者不经历无进展存活的风险降低”，则所述事件指示癌症患者经历无进展存活，即患者可能经历无进展存活，并且任选地，与患者不经历无进展存活相比，该患者更可能经历无进展存活。
如果事件“指示癌症患者不经历无进展存活的风险提高”，则所述事件指示癌症患者不经历无进展存活，即患者可能不经历无进展存活，并且任选地，与患者经历无进展存活相比，该患者更可能不经历无进展存活。
本文中使用的术语“样品”是指从对象获得并且可用于分析目的(特别是用于确定一种或更多种单核苷酸多态性的基因型)的任何材料。在某些实施方案中，本文中所述的样品可以是或可以来源于来自例如待测试哺乳动物或人的任何组织、细胞和/或生物流体中的细胞。样品可以从患者(例如从人体)分离。样品可以是经分级和/或经纯化的样品。例如，本发明涵盖的样品可以是或可以来源于组织(例如，切片或外植体)样品、单细胞样品、细胞集落样品、细胞培养物样品、血液(例如，全血或血液级分，例如血细胞级分、血清或血浆)样品、尿样品或来自其他外周来源的样品。在一个特别优选的实施方案中，样品是组织样品(例如，来自具有或怀疑具有癌组织的对象的活检物)。例如，样品可以是肿瘤的活检物。可以在治疗性治疗开始之前、在治疗性治疗期间和/或在治疗性治疗之后，例如在施用癌症治疗之前、期间或之后从患者获得样品。
可以使用样品材料从任何体液(例如血液、血清、血浆、尿、唾液、痰、胃液、精液、泪、汗等)、皮肤、毛发、细胞(尤其是有核细胞)、活检物、颊拭子(buccal swab)或者组织或肿瘤样品中产生核酸提取物(包括DNA和/或RNA)、蛋白质或膜提取物。
本发明还涉及试剂盒，其包含例如以下部件：用于确定如本文中所述的一种或更多种单核苷酸多态性的基因型的试剂。在本发明的上下文中，术语“成套试剂盒(kit ofparts)(简称：试剂盒)”应理解为本文中鉴定的至少一些组分的任意组合，其在空间上共存地组合成功能单元，并且可以包含其他组分。例如，试剂盒可以包含预先选择的对核酸序列具有特异性的引物或探针，所述核酸序列包含一个或更多个待确定其基因型的单核苷酸多态性。试剂盒还可包含适用于扩增核酸的酶(例如，聚合酶如Taq)以及用于扩增的反应混合物所需的脱氧核苷酸和缓冲液。试剂盒还可包含对一种或更多种单核苷酸多态性具有特异性的探针。在某些实施方案中，所述部件被可检测地标记。
本发明的试剂盒可包含(i)容器和/或(ii)数据载体。所述容器可填充有上述一种或更多种部件或试剂。所述数据载体可以是非电子数据载体，例如图形数据载体，例如信息传单、信息表、条形码或访问码；或者电子数据载体，例如软盘、光盘(compact disc，CD)、数字通用盘(digital versatile disk，DVD)、微芯片或其他基于半导体的电子数据载体。访问码可以允许访问数据库，例如互联网数据库、集中式或分散式数据库。所述数据载体可包含用于允许分析用所述试剂盒获得的结果、以及特别地在本发明的方法中使用试剂盒的说明。
作为替代或补充，所述试剂盒可包含从商业和使用者的角度所期望的材料，包括缓冲液、试剂和/或稀释剂。
基于所获得的结果(即，基于一种或更多种单核苷酸多态性的基因型)，医师可以选择患者被预测具有响应性的癌症治疗，特别是抗体治疗。优选地，不向患者施用患者被预测不具有响应性的癌症治疗。
基于预测患者不对抗体治疗(特别是通过募集患者的免疫系统破坏以肿瘤细胞而发挥作用的抗体治疗)具有响应性的结果，医师可以选择施用不同于抗体治疗(特别是通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞而发挥作用的抗体治疗)的癌症治疗。特别地，医师可以选择施用化学治疗。
基于预测患者对抗体治疗(特别是通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞而发挥作用的抗体治疗)具有响应性的结果，医师可以选择施用抗体治疗(特别是通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞而发挥作用的抗体治疗)，其任选地与化学治疗组合。
特别地与本文中针对癌症治疗使用的术语“(治疗性)治疗”涉及旨在改善患者的健康状况和/或延长(提高)患者寿命的任何治疗。所述治疗可消除癌症、减小患者中肿瘤的大小或数量、阻止或减缓患者中癌症的发生、抑制或减缓患者中新癌症的发生、降低患者中症状的频率或严重程度、和/或降低当前患有或先前曾患有癌症的患者中的复发。癌症的(治疗性)治疗可选自外科手术、化学治疗、放射治疗和靶向治疗。根据本发明的一种特别优选的治疗是涉及针对肿瘤抗原(例如靶细胞上表达的CLDN18.2)的治疗性单克隆抗体的癌症治疗。
辅助治疗是除初级、主要或初始治疗之外给予的治疗。用于癌症治疗的外科手术和综合治疗方案使该术语主要用于描述辅助性癌症治疗。辅助治疗的一个实例是通常在外科手术后给予的附加治疗，在此所有可检出的疾病已经被去除但是在此由于隐匿性疾病而仍然存在复发的统计学风险。
例如“响应性”或“响应者”的术语在治疗背景下是指患者具有来自给定治疗方式的治疗效益的事实，并且特别地是指观察到疾病的减轻、预防或消除，包括在目前患有或先前曾患有疾病的患者中缩短疾病的持续时间、阻止或减缓疾病的进展或恶化、抑制或减缓新疾病发生和/或复发、预防或延迟疾病或其症状的发作、降低症状的频率或严重程度，和/或延长患者寿命。特别地，其是指观察到肿瘤块的减小或者无肿瘤时间、无复发时间或总体存活时间的延长。
例如“无响应性”或“非响应者”的术语在治疗背景下是指患者不具有来自给定治疗方式的治疗效益的事实，特别地是指未观察到疾病的减轻、预防或消除，即患者对治疗具有抗性。
完全响应定义为不存在任何残留疾病(例如癌症)，并且通常通过对所获组织样品的病理学分析进行评估。在这种情况下，经常使用术语“病理学完全响应”(pathologicalcomplete response，pCR)。特别地，pCR被定义为在原始肿瘤床(original tumor bed)中不存在任何残留的侵袭性肿瘤细胞。然而，pCR的定义可以在不同的分级系统之间变化。病理学完全响应已显示是总体较好存活的预后因子，但也是无疾病存活和无复发存活的预后因子。
无复发存活定义为从随机化到第一次复发或再发、第二次癌症或死亡的时间。
无进展存活(PFS)是一种存活率，其测量在给药或治疗期间和之后在此期间所治疗疾病(通常为癌症)不变得更差的时间长度。其有时用作研究患有疾病的人的健康以试图确定新治疗如何工作的量度，并且其经常用作癌症治疗的随机对照试验中的临床终点。
根据本发明，术语“癌症患者经历无进展存活”涉及癌症患者具有延长的无疾病进展时期，特别是当与患者的平均值相比和/或当与为给定治疗模式之非响应者的患者相比时。优选地，所述延长的时期为至少4，优选至少5，更优选至少6个月，例如至少7个月或至少8个月，所述时期从例如第一次施用治疗的时间开始。
术语“临床结局”定义为疾病的临床结果，例如特别是治疗后症状的减轻或改善。
关于癌症的术语“复发”包括在原发疾病的相同部位和器官出现肿瘤细胞、甚至可在癌症的初始诊断和治疗后多年出现的远处转移，或局部事件例如肿瘤细胞浸润到局部淋巴结中。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。其是指人、非人灵长类或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)，其可以受疾病或病症(例如癌症)影响或者易患疾病或病症(例如癌症)，但可以患有或可以未患所述疾病或病症。在许多实施方案中，个体是人。除非另外说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成人、老年人、儿童和新生儿。在本发明的一些优选实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。术语“患者”根据本发明意指治疗对象，特别是患病对象。
在一个特别优选的实施方案中，对已经诊断为患有癌症的患者进行本发明的方法。
“靶细胞”应意指任何不期望的细胞，例如癌细胞。在一些优选实施方案中，靶细胞表达CLDN18.2。
在本发明的上下文中，例如“保护”、“预防”或“预防性”的术语涉及防止对象中疾病的发生和/或播散，且特别是使对象将发生疾病的机会最小化或延缓疾病的发生。例如，处于癌症风险之中的对象将成为预防癌症的治疗的候选者。
“处于风险之中”意指鉴定为与一般群体相比发生疾病(特别是癌症)的机会高于正常的对象。此外，曾患有或目前患有疾病(特别是癌症)的对象是发生疾病的风险提高的对象，因为对象可继续发生疾病。目前患有或曾患有癌症的对象癌症转移的风险也提高。
本文中使用的术语“组合”在施用治疗的上下文中是指使用多于一种治疗或治疗剂。术语“组合”的使用不限制治疗或治疗剂施用于对象的顺序。治疗或治疗剂可以在向对象施用第二治疗或治疗剂之前、与其伴随或之后施用。优选地，治疗或治疗剂以一定的顺序、量和/或在一定时间间隔内施用于对象，使得治疗或治疗剂可一起作用。在一个具体实施方案中，治疗或治疗剂以一定顺序、量和/或在一定时间间隔内施用于对象，使得与如果以其他方式(特别是彼此独立地)施用时相比，其提供提高的效益。优选地，提高的效益是协同效应。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。通常来说，疾病解释为与特定症状和体征相关的医学状况。疾病可由源自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者其可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。对于人，“疾病”通常更广泛地用于指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社交问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何状况。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、不正常行为、以及结构和功能的非典型变化，而在另一些背景下和出于另一些目的，这些可认为是可区别的类别。疾病通常不仅在身体上而且还在情感上影响个体，因为对许多疾病的染病和与其共存可以改变个体对生命的看法和个体的性格。根据本发明，术语“疾病”包括癌症，特别是本文中所述的那些癌症形式。本文中对癌症或具体癌症形式的任何提及还包括其癌症转移。在一个优选实施方案中，待根据本申请治疗的疾病涉及表达肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的细胞。
根据本发明，“涉及表达肿瘤抗原的细胞的疾病”意指肿瘤抗原(例如CLDN18.2)在患病组织或器官的细胞中表达。在一个实施方案中，与健康组织或器官中的状态相比，肿瘤抗原在患病组织或器官的细胞中的表达提高。提高是指提高至少10％，特别地至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一个实施方案中，表达仅见于患病组织，同时相应健康组织中的表达被抑制。根据本发明，涉及表达肿瘤抗原的细胞的疾病包括癌症疾病。此外，根据本发明，癌症疾病优选为其中癌细胞表达肿瘤抗原的那些。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌症、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。优选地，“癌症疾病”的特征在于表达肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的细胞，并且癌细胞表达这样的肿瘤抗原。表达肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的细胞优选是癌细胞，优选本文中所述的癌症的癌细胞。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(被称为赘生性细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长，优选形成肿胀或病变。“肿瘤细胞”意指通过迅速的不受控制的细胞增殖而生长并且在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出结构组织和与正常组织的功能协调的部分或完全缺失，并且通常形成独特的组织团块，其可以是良性的、恶化前的或恶性的。
在一个实施方案中，根据本发明的癌症涉及表达肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的癌细胞。在一个实施方案中，癌症是肿瘤抗原阳性的，例如CLDN18.2阳性的。在一个实施方案中，肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的表达是位于细胞的表面。在一个实施方案中，至少50％，优选60％、70％、80％或90％的癌细胞是肿瘤抗原阳性的(例如CLDN18.2阳性的)，和/或至少40％，优选至少50％的癌细胞对肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的表面表达呈阳性。在一个实施方案中，至少95％或至少98％的癌细胞是肿瘤抗原阳性的，例如CLDN18.2阳性的。在一个实施方案中，至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的癌细胞对于肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的表面表达是阳性的。
在一个实施方案中，涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症或CLDN18.2阳性癌症选自：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌、及其转移，特别是胃癌转移(例如克鲁肯贝格肿瘤)、腹膜转移和淋巴结转移。在一个实施方案中，癌症是腺癌，特别是晚期腺癌。特别优选的癌症疾病是胃、食管、胰管、胆管、肺和卵巢的腺癌。在一个实施方案中，癌症选自：胃癌、食管癌(特别是下食管癌)、食管-胃接合部(eso-gastric junction)的癌症和胃食管癌。在一个特别优选的实施方案中，癌症是胃食管癌，例如转移性、顽固性或复发性晚期胃食管癌。在一个实施方案中，CLDN18.2阳性肿瘤是上述癌症类型的肿瘤。
涉及CLDN18.2阳性肿瘤或表达CLDN18.2的癌细胞的实施方案优选涉及使用具有与CLDN18.2结合之能力的抗体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体、或抗体片段。
根据本发明，“癌”是源自上皮细胞的恶性肿瘤。该组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“腺癌”是源于腺组织的癌症。这种组织也是称为上皮组织的较大组织类别的一部分。上皮组织包括皮肤、腺和内衬于身体的腔和器官的多种其他组织。上皮在胚胎学上来自于外胚层、内胚层和中胚层。要分类为腺癌，细胞不一定需要是腺的一部分，只要其具有分泌特性即可。这种形式的癌可以发生在一些高级哺乳动物，包括人中。良好分化的腺癌倾向于类似于其所来源的腺组织，而分化较差的腺癌则可以不是这样。通过对来自活检物的细胞进行染色，病理学家将确定肿瘤是腺癌还是某种其他类型的癌症。由于体内腺的普遍存在性，腺癌可在身体的许多组织中出现。虽然每种腺可以不是分泌相同的物质，但是只要细胞有外分泌功能，其就被认为是腺性的，并且因此其恶性形式被称为腺癌。恶性腺癌侵袭其他组织并且经常转移(如果时间足够这样做的话)。卵巢腺癌是卵巢癌最常见的类型。其包括浆液性和黏液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到身体的其他部分。转移的形成是很复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离、侵袭细胞外基质、穿透内皮基底膜以进入体腔和血管、以及随后在通过血液转运后浸润靶器官。最后，在靶部位处新肿瘤的生长取决于血管生成。甚至在去除原发性肿瘤之后，也经常发生肿瘤转移，这是因为肿瘤细胞或组分可保留并产生转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和局部淋巴结系统的转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。使用本发明治疗可治疗的一种特定形式的转移是源自作为原发性部位的胃癌的转移。在一些优选实施方案中，这样的胃癌转移是克鲁肯贝格肿瘤、腹膜转移和/或淋巴结转移。
顽固性癌症是特定治疗对其无效的恶性肿瘤，其最初对治疗无响应或随时间变得无响应。术语“顽固性”、“无响应性”或“抗性”在本文中可互换使用。
克鲁肯贝格肿瘤是卵巢的不常见转移性肿瘤，占所有卵巢肿瘤的1％至2％。克鲁肯贝格肿瘤的预后仍然很差，并且尚未建立克鲁肯贝格肿瘤的治疗。克鲁肯贝格肿瘤是卵巢的转移性印戒细胞腺癌。胃是大多数克鲁肯贝格肿瘤病例(70％)的原发性部位。结肠癌、阑尾癌和乳腺癌(主要是侵袭性小叶癌)是紧随其后最常见的原发性部位。已报道源自胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、小肠癌、法特壶腹(ampulla of Vater)癌、宫颈癌和膀胱/脐尿管癌的罕见克鲁肯贝格肿瘤病例。
本文中使用的术语“外科手术”包括在手术中移除肿瘤。外科手术是癌症的常见治疗。外科医生可以使用局部切除来移除肿瘤。
本文中使用的术语“化学治疗”是指使用化学治疗剂或化学治疗剂组合，优选地通过杀伤细胞或通过停止细胞分裂来停止癌细胞生长。当经口或者通过注射到静脉或肌肉中来接受化学治疗时，药物进入血流并且可到达遍及整个身体的癌细胞(全身性化学治疗)。当将化学治疗直接置于脑脊液、器官或体腔(例如腹)中时，药物主要影响那些区域的癌细胞(区域性化学治疗)。
根据本发明的化学治疗剂包括细胞抑制性化合物和细胞毒性化合物。传统的化学治疗剂通过杀伤迅速分裂(大多数癌细胞的主要特性之一)的细胞发挥作用。这意味着化学治疗也伤害在正常情况下迅速分裂的细胞，例如骨髓、消化道和毛囊中的细胞。这导致化学治疗最常见的副作用。根据本发明，术语“化学治疗”优选不包括靶向在癌细胞中异常表达的蛋白质(肿瘤抗原)并且通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞而发挥作用的抗体。然而，靶向在癌细胞中异常表达的蛋白质(肿瘤抗原)并通过与其缀合的治疗部分或治疗剂发挥作用的抗体可以被视为化学治疗的一种形式。然而，在最严格意义上，根据本发明的术语“化学治疗”不包括靶向治疗。
根据本发明，术语“化学治疗剂”包括紫杉烷类、铂化合物、核苷类似物、喜树碱类似物、蒽环类、依托泊苷、博来霉素、长春瑞滨、环磷酰胺、及其组合。根据本发明，提及化学治疗剂是包括所述药剂的任何前药，例如酯、盐或衍生物(例如缀合物)。实例是所述药剂与载体物质的缀合物，例如蛋白质结合的紫杉醇(protein-bound paclitaxel)，例如白蛋白结合的紫杉醇。优选地，所述药剂的盐是可药用的。
紫杉烷类是一类二萜化合物，其最初从天然来源例如红豆杉属(genus Taxus)植物获得，但已人工合成一些。紫杉烷类药物的主要作用机制是破坏微管功能，从而抑制细胞分裂过程。紫杉烷类包括多西他赛(泰素帝(Taxotere))和紫杉醇(泰素(Taxol))。
根据本发明，术语“多西他赛”是指具有下式的化合物：
Figure BPA0000248867100000261
特别地，术语“多西他赛”是指化合物1，7β，10β-三羟基-9-氧代-5β，20-环氧紫杉-11-烯-2α，4，13α-三基4-乙酸酯2-苯甲酸酯13-{(2R，3S)-3-[(叔丁氧基羰基)-氨基]-2-羟基3-苯基丙酸酯}。
根据本发明，术语“紫杉醇”是指具有下式的化合物：
Figure BPA0000248867100000262
特别地，术语“紫杉醇”是指化合物(2α，4α，5β，7β，10β，13α)-4，10-双-(乙酰氧基)-13-{[(2R，3S)-3-(苯甲酰基氨基)-2-羟基-3-苯基丙酰基]氧基}-1，7-二羟基-9-氧代-5，20-环氧紫衫-11-烯-2-基苯甲酸酯。
根据本发明，术语“铂化合物”是指其结构中含铂的化合物，例如铂络合物，并且包括例如顺铂、卡铂和奥沙利铂的化合物。
术语“顺铂(cisplatin或cisplatinum)”是指下式的化合物顺-二氨二氯铂(II)(CDDP)：
Figure BPA0000248867100000271
术语“卡铂”是指下式的化合物顺-二氨(1，1-环丁烷二羧酸)铂(II)：
Figure BPA0000248867100000272
术语“奥沙利铂”是指下式的与二氨基环己烷载体配体络合的铂化合物：
Figure BPA0000248867100000273
特别地，术语“奥沙利铂”是指化合物[(1R，2R)-环己烷-1，2-二胺](乙二酸-O，O′)铂(II)。注射用奥沙利铂还以商品名乐沙定(Eloxatine)市售。
术语“核苷类似物”是指核苷的结构类似物，类别包括嘌呤类似物和嘧啶类似物二者。
术语“吉西他滨”是作为下式的核苷类似物的化合物：
Figure BPA0000248867100000274
特别地，该术语是指化合物4-氨基-1-(2-脱氧-2，2-二氟-β-D-赤式-呋喃戊糖基)嘧啶-2(1H)-酮或4-氨基-1-[(2R，4R，5R)-3，3-二氟-4-羟基-5-(羟基甲基)氧杂环戊烷-2-基]-1，2-二氢嘧啶-2-酮。
术语“核苷类似物”包括氟嘧啶衍生物，例如氟尿嘧啶及其前药。术语“氟尿嘧啶”或“5-氟尿嘧啶”(5-FU或f5U)(以商品名Adrucil、Carac、Efudix、Efudex和Fluoroplex出售)是作为下式的嘧啶类似物的化合物：
Figure BPA0000248867100000281
特别地，该术语是指化合物5-氟-1H-嘧啶-2，4-二酮。
术语“卡培他滨”(Xeloda，Roche)是指为在组织中转化为5-FU的前药的化学治疗剂。可经口施用的卡培他滨具有下式：
Figure BPA0000248867100000282
特别地，该术语是指化合物[1-(3，4-二羟基-5-甲基四氢呋喃-2-基)-5-氟-2-氧代-1H-嘧啶-4-基]氨基甲酸戊酯。
术语“亚叶酸”或“甲酰四氢叶酸”是指可与化学治疗剂5-氟尿嘧啶协同组合使用的化合物。因此，如果本文中提及施用5-氟尿嘧啶或其前药，则在一个实施方案中所述施用可包括与亚叶酸联合施用。亚叶酸具有下式：
Figure BPA0000248867100000283
特别地，该术语是指化合物(2S)-2-{[4-[(2-氨基-5-甲酰基-4-氧代-5，6，7，8-四氢-1H-蝶啶-6-基)甲基氨基]苯甲酰基]氨基}戊二酸。
根据本发明，术语“喜树碱类似物”是指化合物喜树碱(CPT；(S)-4-乙基-4-羟基-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14-(4H，12H)-二酮)的衍生物。优选地，术语“喜树碱类似物”是指包含以下结构的化合物：
Figure BPA0000248867100000291
根据本发明，优选的喜树碱类似物是DNA酶拓扑异构酶I(topoisomerase I，topoI)的抑制剂。根据本发明的优选喜树碱类似物是伊立替康和拓扑替康。
伊立替康是通过抑制拓扑异构酶I来防止DNA解旋的药物。在化学术语中，其为具有下式的天然生物碱喜树碱的半合成类似物：
Figure BPA0000248867100000292
特别地，术语“伊立替康”是指化合物(S)-4，11-二乙基-3，4，12，14-四氢-4-羟基-3，14-二氧代1H-吡喃并[3’，4’：6，7]-吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-9-基-[1，4’-联哌啶]-1’-羧酸酯。
拓扑替康是下式的拓扑异构酶抑制剂：
Figure BPA0000248867100000293
特别地，术语“拓扑替康”是指化合物(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮单盐酸盐。
蒽环类是一类通常用于癌症化学治疗的药物，其也是抗生素。在结构上，所有的蒽环类都共有常见的四环的7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-醌结构，并且通常需要在特定位点处糖基化。
蒽环类优选引起一种或更多种以下作用机制：1.通过嵌入DNA/RNA链的碱基对之间来抑制DNA和RNA合成，从而阻止迅速生长的癌细胞的复制。2.抑制拓扑异构酶II酶，防止超螺旋DNA松弛并且因此阻断DNA转录和复制。3产生铁介导的氧自由基(free oxygenradical)，其损伤DNA和细胞膜。
根据本发明，术语“蒽环类”优选涉及药剂，优选用于诱导凋亡(优选通过抑制拓扑异构酶II中DNA的再结合)的抗癌剂。
蒽环类和蒽环类似物的实例包括但不限于：柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、紫红霉素、吡柔比星(pyrarubicin)、戊柔比星、N-三氟-乙酰基多柔比星-14-戊酸酯、阿克拉霉素、吗啉代多柔比星(吗啉代-DOX)、氰基吗啉代-多柔比星(氰基-吗啉代-DOX)、2-吡咯啉并-多柔比星(2-PDOX)、5-亚氨基道诺霉素、米托蒽醌和阿克拉霉素A(阿柔比星)。米托蒽醌是蒽二酮类化合物的成员，其是缺乏蒽环类的糖部分但保留允许嵌入DNA中的平面多环芳环结构的蒽环类似物。
在本发明的上下文中特别考虑作为蒽环类的是表柔比星。表柔比星是具有下式的蒽环类药物：
Figure BPA0000248867100000301
并且在美国以商品名Ellence市售，且在其他地方以商品名Pharmorubicin或Epirubicin Ebewe市售。特别地，术语“表柔比星”是指化合物(8R，10S)-10-[(2S，4S，5R，6S)-4-氨基-5-羟基-6-甲基-
Figure BPA0000248867100000302
烷-2-基]氧基-6，11-二羟基-8-(2-羟基乙酰基)-1-甲氧基-8-甲基-9，10-二氢-7H-并四苯-5，12-二酮。在一些化学治疗方案中，表柔比星优于多柔比星(最受欢迎的蒽环类)，因为其看来引起较少的副作用。
术语“依托泊苷”是指表现出抗肿瘤活性的鬼臼毒素的半合成衍生物。依托泊苷通过与拓扑异构酶II和DNA形成复合物来抑制DNA合成。该复合物诱导双链DNA断裂并通过拓扑异构酶II结合而阻止修复。DNA中累积的断裂阻止进入细胞分裂的有丝分裂期，并导致细胞死亡。依托泊苷具有下式：
Figure BPA0000248867100000311
特别地，该术语是指化合物4′-去甲基-表鬼臼毒素9-[4，6-O-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，4′-(磷酸二氢酯)。
术语“博来霉素”是指由细菌轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)产生的糖肽抗生素。当用作抗癌剂时，其通过引起DNA断裂而发挥作用。博来霉素优选包含具有下式的化合物：
Figure BPA0000248867100000312
术语“长春瑞滨”是指为半合成长春花生物碱的抗有丝分裂化学治疗药物，并且作为对某些类型癌症(包括乳腺癌和非小细胞肺癌)的治疗而给予。长春瑞滨优选包含具有下式的化合物：
Figure BPA0000248867100000313
环磷酰胺是来自氧氮磷环类(oxazophorine group)的氮芥烷化剂。环磷酰胺的主要用途是与其他化学治疗剂一起治疗一些形式的癌症。环磷酰胺优选包含具有下式的化合物：
Figure BPA0000248867100000321
在本发明的上下文中，术语“放射治疗”是指使用高能x射线或其他类型的辐射来杀伤癌细胞或使其不生长。有两种类型的放射治疗。外部放射治疗使用体外的机器向癌症发送辐射。内部放射治疗使用密封在直接放置在癌症中或癌症附近的针、种子状物(seed)、线或导管中的放射性物质。给予放射治疗的方式取决于所治疗癌症的类型和阶段。
根据本发明，术语“靶向治疗”涉及可用于优先地靶向患病细胞(例如癌细胞)而不靶向或在较小程度上靶向非患病细胞的任何治疗。患病细胞的靶向优选地导致杀伤患病细胞和/或损害其增殖或生存力。这样的治疗包括：i)靶向患病细胞上的某些细胞表面靶标(例如，肿瘤抗原，例如CLDN18.2)的裸露的或与治疗部分缀合的抗体、抗体片段和蛋白质(例如，本文中所述的针对CLDN18.2的抗体或抗体缀合物)；或者ii)损害患病细胞的增殖或生存力的小分子。在一个具体实施方案中，该药剂结合于与正常干细胞上相比在患病干细胞上以更高水平表达的抗原。在一个具体实施方案中，该药剂特异性结合于肿瘤抗原。传统的化学治疗或放射治疗不被认为是“靶向治疗”，尽管其经常针对肿瘤。此外，根据本发明的术语“抗体治疗”优选不包括用与治疗部分缀合的抗体、其片段或衍生物治疗，而仅涉及用通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞而发挥作用的抗体、其片段或衍生物治疗。
术语“抗原”涉及包含表位的物质，免疫应答针对所述表位产生和/或针对所述表位。术语“抗原”特别地包括蛋白质、肽、多糖、核酸(尤其是RNA和DNA)和核苷酸。术语“抗原”还包括仅通过转化(例如在分子中在中间或通过用机体蛋白质完成)就变得具有抗原性并致敏的物质。抗原或其加工产物优选地可被T细胞或B细胞受体或者被免疫球蛋白分子(例如抗体)识别。在一个优选实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原，例如CLDN18.2。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”涉及存在于肿瘤细胞中的抗原。抗原优选存在于肿瘤细胞上，例如肿瘤细胞表面上。优选地，“肿瘤抗原”由肿瘤细胞表达。在一个实施方案中，术语“肿瘤抗原”涉及当与正常(即非肿瘤)细胞相比时在肿瘤细胞中异常表达的蛋白质。例如，表达可仅见于肿瘤细胞中而不见于正常(即非肿瘤)细胞，或者与正常(即非肿瘤)细胞相比，在肿瘤细胞中表达水平可能较高。在一个实施方案中，术语“肿瘤抗原”涉及在正常条件下特异性表达于有限数量的组织和/或器官或特定发育阶段并且在一个或更多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达的蛋白质。在本发明的上下文中，肿瘤抗原优选与癌细胞的细胞表面相缔合，并且优选在正常组织和细胞中不表达、仅很少表达或以较低水平表达。优选地，根据本发明，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不允许被添加至细胞的肿瘤抗原特异性抗体结合，则肿瘤抗原在细胞中不表达。根据本发明的特别优选的肿瘤抗原是CLDN18.2。
根据本发明，术语“肿瘤抗原阳性癌症”或“肿瘤抗原阳性肿瘤”或类似术语意指包含表达肿瘤抗原之癌细胞或肿瘤细胞(优选在所述癌细胞或肿瘤细胞的表面上表达)的癌症或肿瘤。如果肿瘤抗原位于细胞的表面并且可被添加至细胞的肿瘤抗原特异性抗体接近以结合，则所述肿瘤抗原在所述细胞的表面上表达。
在本发明的一个优选实施方案中，“肿瘤抗原阳性癌症”或“肿瘤抗原阳性肿瘤”是“CLDN18.2阳性癌症”或“CLDN18.2阳性肿瘤”。根据本发明，术语“CLDN18.2阳性癌症”或“CLDN18.2阳性肿瘤”意指包含表达CLDN18.2之癌细胞或肿瘤细胞(优选地在所述癌细胞或肿瘤细胞的表面上表达)的癌症或肿瘤。
“细胞表面”根据其在本领域的正常含义使用，并因此包括可被蛋白质和其他分子接近以结合的细胞外部。
在本发明的上下文中，术语“细胞外部分”是指分子(例如蛋白质)的一部分，其朝向细胞的细胞外空间，并且优选地可从所述细胞的外部接近，例如被位于所述细胞外部的抗原结合分子(例如抗体)接近。优选地，该术语是指一个或更多个细胞外环或结构域或者其片段。
根据本发明，如果与胃细胞或胃组织中的表达相比，表达水平较低，则CLDN18.2在细胞中基本上不表达。优选地，表达水平是胃细胞或胃组织中表达的小于10％，优选小于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％或者甚至更低。优选地，如果表达水平超过除胃以外的非癌组织中的表达水平不超过2倍、优选1.5倍，并且优选地不超过所述非癌组织中的表达水平，则CLDN18.2在细胞中基本上不表达。优选地，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不允许被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体结合，则CLDN18.2在细胞中基本上不表达。
根据本发明，如果表达水平超过除胃以外的非癌组织中的表达水平优选多于2倍，优选10倍、100倍、1000倍或10000倍，则细胞中表达CLDN18.2。优选地，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平足够高以允许被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体结合，则CLDN18.2在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的CLDN18.2表达或暴露在所述细胞的表面上。
术语“表位”是指分子中的抗原决定簇，即分子中被免疫系统识别(例如被抗体识别)的部分。例如，表位是抗原上的离散的三维位点，其被免疫系统识别。表位通常由例如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面组群组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失而与后者的结合不丧失。蛋白质的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可以优选为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，以及包含这样的糖蛋白的抗原结合部分的任何分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体的片段或衍生物(包括但不限于单链抗体(例如scFv)和抗原结合抗体片段(例如Fab和Fab′片段))，并且还包括所有重组形式的抗体，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体、以及本文中所述的任何抗原结合抗体片段和衍生物。每个重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变区，其散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞))和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体显示出单一的结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的从非人动物(例如小鼠)获得的B细胞。
本文中使用的术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从相对于免疫球蛋白基因而言转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体；(b)从转化以表达抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体；(c)从重组的组合抗体文库分离的抗体；以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。
本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人源化抗体”是指具有基本上来源于来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中分子的剩余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完全可变结构域，或仅包含可变结构域中接枝到合适框架区上的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或者通过一个或更多个氨基酸替换修饰，例如被修饰以更接近类似于人免疫球蛋白。某些形式的人源化抗体保留所有的CDR序列(例如包含来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。另一些形式具有相对于原始抗体改变的一个或更多个CDR。
术语“嵌合抗体”是指以下这些抗体，其中重链和轻链的氨基酸序列各自的一部分与来源于特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的其余区段与另一个中的相应序列同源。通常来说，轻链和重链二者的可变区模拟来源于一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一种的抗体的序列同源。这种嵌合形式的一个明显优点在于：与来源于例如人细胞制备物的恒定区组合，使用来自非人宿主生物的容易获得的B细胞或杂交瘤可以方便地从目前已知的来源获得可变区。尽管可变区具有易于制备的优点并且特异性不受来源的影响，但是与来自非人来源的恒定区相比，当注射抗体时，恒定区是人的，较不可能引发来自人对象的免疫应答。然而，该定义不限于该特定实例。
抗体可来源于不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。
本文中所述的抗体包括IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在多个实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别地IgG1κ或IgG1λ同种型(即IgG1，κ、λ)；IgG2a抗体(例如IgG2a，κ、λ)；IgG2b抗体(例如IgG2b，κ、λ)；IgG3抗体(例如IgG3，κ、λ)；或IgG4抗体(例如IgG4，κ、λ)。
本文中使用的“异源抗体”相对于产生这样的抗体的转基因生物定义。该术语是指具有对应于见于以下生物体中的那些的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体，所述生物体不由转基因生物组成并且通常来源于除转基因生物以外的物种。
本文中使用的“异杂交抗体(heterohybrid antibody)”是指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异杂交抗体。
本文中所述的抗体优选地是分离的。本文中使用的“分离的抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与肿瘤抗原特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合不同于肿瘤抗原的抗原的抗体)。然而，与人肿瘤抗原的表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可与其他相关抗原(例如来自其他物种的其他相关抗原(例如，肿瘤抗原物种同源物))具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合涉及具有不同特异性并且以明确确定的组合物或混合物组合的抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简称“结合片段”)或者类似术语是指抗体的保留与抗原特异性结合能力的一个或更多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补性决定区(CDR)；以及(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过单独的基因编码，但其可以通过合成接头使用重组方法连接，使得其能够被制成单个的蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。另外的实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步公开在US 2003/0118592和US2003/0133939中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且所述片段以与完整抗体相同的方式根据用途进行筛选。
术语“结合结构域”结合本发明表征与给定靶结构/抗原/表位结合/相互作用的(例如抗体的)结构。因此，根据本发明的结合结构域表示“抗原相互作用位点”。
本文中出于本发明目的描述的所有抗体和抗体衍生物(例如抗体片段)涵盖在术语“抗体”中。术语“抗体衍生物”是指任何修饰形式的抗体，例如抗体与其他物质或抗体的缀合物，或者抗体片段。
天然存在的抗体通常是单特异性的，即其与单一抗原结合。本发明包括与靶细胞(通过接合肿瘤抗原)和第二实体如细胞毒性细胞(例如通过接合CD3受体)结合的抗体。本发明的抗体可以是双特异性或多特异性的，例如三特异性的、四特异性的等。
术语“双特异性分子”旨在包括具有两种不同结合特异性的物质。例如，所述分子可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面上的受体(例如Fc受体)结合或相互作用。术语“多特异性分子”旨在包括具有多于两种不同结合特异性的物质。例如，所述分子可与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面上的受体(例如Fc受体)和(c)至少一种其他组分结合或相互作用。因此，术语“针对肿瘤抗原的抗体”包括但不限于针对肿瘤抗原以及其他靶标(例如效应细胞上的Fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子。术语“双特异性抗体”还包括双链抗体(diabody)。双链抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短以致不允许同一链上两个结构域之间配对，从而迫使结构域与其他链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点的接头(参见例如，Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。
根据本发明，抗体可通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞和/或通过与抗体偶联的治疗部分或治疗剂来发挥其治疗效果。为了本发明的目的，这样的抗体缀合物可被认为被术语“化学治疗剂”所涵盖，而通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞来发挥其治疗效果的抗体则不是。
在本发明的上下文中，抗体优选能够通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞来发挥作用，即抗体，特别是当与其靶标(例如患病细胞上的肿瘤抗原)结合时，引发免疫效应功能，如本文所述。优选地，所述免疫效应功能针对细胞，例如在其表面上携带肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的癌细胞。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发生，包括抑制肿瘤播散和转移。优选地，免疫效应功能导致杀伤癌细胞。这样的功能包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬(antibody-dependent cell-mediatedphagocytosis，ADCP)、在携带肿瘤抗原的细胞中诱导凋亡、携带肿瘤抗原的细胞的细胞裂解、和/或抑制携带肿瘤抗原的细胞的增殖。结合剂也可以简单地通过与癌细胞表面上的肿瘤抗原结合来发挥作用。例如，抗体仅通过与癌细胞表面上的肿瘤抗原结合就可阻断肿瘤抗原的功能或诱导凋亡。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
ADCC描述了优选地需要靶细胞被抗体标记的效应细胞(特别是淋巴细胞)的细胞杀伤能力。
当抗体与肿瘤细胞上的抗原结合并且抗体Fc结构域与免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)接合时，优选发生ADCC。已经鉴定了数个Fc受体家族，并且特定细胞群特征性地表达限定的Fc受体。ADCC可被视为直接诱导导致抗原呈递和诱导肿瘤导向的T细胞应答的可变程度的立即肿瘤破坏的机制。优选地，ADCC的体内诱导将导致肿瘤导向的T细胞应答和宿主源性抗体应答。
补体依赖性细胞毒性
CDC是可由抗体指导的另一种细胞杀伤方法。IgM是补体激活最有效的同种型。IgG1和IgG3二者在通过经典补体激活途径指导CDC方面也非常有效。优选地，在该级联反应中，抗原-抗体复合物的形成导致参与抗体分子(例如IgG分子)的CH2结构域上紧密接近的多个C1q结合位点暴露(C1q是补体C1的三种亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将先前低亲和力的C1q-IgG相互作用转化为高亲合力相互作用，其触发涉及一系列其他补体蛋白的级联事件并导致效应细胞趋化/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，补体级联以形成膜攻击复合物结束，所述复合物在细胞膜中产生有利于水和溶质自由进入和离开细胞的孔。
为了抑制肿瘤生长和/或肿瘤发生，根据本发明，抗体可与治疗部分或治疗剂(例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性同位素)缀合。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害并且特别地杀伤细胞的任何药剂。实例包括泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、鹅膏蕈碱(amanitin)、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素、及其类似物或同源物。用于形成抗体缀合物的合适治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如，二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如，更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC)、以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。在一个优选实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或放射毒剂。在另一个实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。在另一个实施方案中，治疗剂是GM-CSF。在一个优选实施方案中，治疗剂是多柔比星、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒素A。
抗体也可以与放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)缀合以产生细胞毒性放射性药物。
本发明的抗体缀合物可用于调节给定的生物应答，并且药物部分不应被解释为限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括例如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A、假单胞菌(pseudomonas)外毒素或白喉毒素；例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ的蛋白质；或者生物应答调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
用于将这样的治疗部分与抗体缀合的技术是公知的，参见例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，在Controlled DrugDelivery(第2版)中，Robinson等(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，在Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications中，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，在MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy中，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)；以及Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
术语“针对肿瘤抗原的抗体”或类似术语涉及针对肿瘤抗原或具有与肿瘤抗原结合之能力的抗体。根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。
根据本发明，如果在标准测定中抗体对预定靶标具有显著亲和力并且与其结合，则所述抗体能够与所述预定靶标结合。通常通过平衡解离常数(KD)测量“亲和力”或“结合亲和力”。优选地，术语“显著亲和力”是指以以下解离常数(KD)与预定靶标结合：10-5M或更小、10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、或者10-12M或更小。
如果在标准测定中抗体对靶标不具有显著亲和力并且不与所述靶标显著地结合，特别是不可检测地结合，则所述抗体(基本上)不能够与所述靶标结合。优选地，如果以高至2、优选10、更优选20、特别是50或100μg/ml或更高的浓度存在，则抗体不与所述靶标可检测地结合。优选地，如果抗体与靶标结合的KD是与该抗体能够结合的预定靶标结合的KD的至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍高，则其对所述靶标不具有显著亲和力。例如，如果抗体与该抗体能够结合的靶标结合的KD为10-7M，则与该抗体对其不具有显著亲和力的靶标结合的KD为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
如果抗体能够与预定靶标结合而其不能够与其他靶标结合，即在标准测定中对其他靶标不具有显著亲和力并且不与其显著地结合，则所述抗体是所述预定靶标特异性的。根据本发明，如果抗体能够与肿瘤抗原结合但是(基本上)不能够与其他靶标结合，则所述抗体是所述肿瘤抗原特异性的。优选地，如果对这样的其他靶标的亲和力和结合不显著超过对肿瘤抗原不相关蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(HSA)或非肿瘤抗原跨膜蛋白(例如MHC分子或转铁蛋白受体)或者任何其他指定多肽)的亲和力或结合，则所述抗体是肿瘤抗原特异性的。优选地，如果抗体与预定靶标结合的KD是与其非特异性靶标结合的KD的至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍低，则所述抗体是所述靶标特异性的。例如，如果抗体与其特异性靶标结合的KD为10-7M，则与其非特异性靶标结合的KD为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M
抗体与靶标的结合可以使用任何合适的方法凭实验确定；参见例如Berzofsky等，″Antibody-Antigen Interactions″在Fundamental Immunology中，Paul，W.E.，编辑，Raven Press New York，N Y(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and CompanyNew York，N Y(1992)；以及本文中描述的方法。亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如通过平衡透析；通过使用制造商概述的一般操作来使用BIAcore 2000仪器；通过使用经放射性标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。亲和力数据可以例如通过Scatchard等，Ann N.Y.Acad.ScL，51：660(1949)的方法分析。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，特定抗体-抗原相互作用的测量的亲和力可变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
本文中使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
本文中使用的“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别改变为其他Ig类别之一的现象。
本文中使用的术语“天然存在的”在应用于物体时是指物体可以在自然界中发现的事实。例如，可以从天然来源分离并且没有在实验室中被人故意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文中使用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段在分别基本上编码完整VH或VL结构域的构象中紧邻D-J或J区段定位。可以通过与种系DNA比较来鉴定重排的免疫球蛋白(抗体)基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。
本文中关于V区段使用的术语“未重排的”或“种系构型”是指其中V区段未重组以紧邻D或J区段的构型。
优选地，针对肿瘤抗原的抗体与表达肿瘤抗原的细胞结合诱导或介导杀伤表达肿瘤抗原的细胞。表达肿瘤抗原的细胞优选为癌细胞，并且特别是本文中所述的癌症疾病的细胞。优选地，抗体通过诱导以下一种或更多种来诱导或介导细胞杀伤：补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)介导的裂解、凋亡和抑制表达肿瘤抗原的细胞的增殖。优选地，ADCC介导的细胞裂解发生在效应细胞的存在下，所述效应细胞在一些具体实施方案中选自单核细胞(monocyte)、单个核细胞(mononuclear cell)、NK细胞和PMN。抑制细胞增殖可以通过在使用溴脱氧尿苷(5-溴-2′-脱氧尿苷，BrdU)的测定中确定细胞增殖来体外测量。BrdU是一种合成核苷，其是胸苷的类似物并且可以并入正复制细胞(在细胞周期的S期期间)的新合成DNA中，从而在DNA复制期间置换胸苷。使用例如对BrdU具有特异性的抗体检测掺入的化学物质指示正在活跃地复制其DNA的细胞。
在一些优选实施方案中，本文中所述的抗体可以通过以下一种或更多种特性表征：
a)对肿瘤抗原的特异性；
b)与肿瘤抗原的结合亲和力为约100nM或更小，优选约5nM至10nM或更小，更优选约1nM至3nM或更小；
c)诱导或介导肿瘤抗原阳性细胞上CDC的能力；
d)诱导或介导肿瘤抗原阳性细胞上ADCC的能力；
e)抑制肿瘤抗原阳性细胞生长的能力；
f)诱导肿瘤抗原阳性细胞凋亡的能力。
在一个实施方案中，针对肿瘤抗原的抗体具有与存在于肿瘤抗原中的表位(优选位于肿瘤抗原的细胞外结构域内的表位)结合的能力。优选地，针对肿瘤抗原的抗体对肿瘤抗原是特异性的。优选地，针对肿瘤抗原的抗体与在细胞表面上表达的肿瘤抗原结合。在一些特别的优选实施方案中，针对肿瘤抗原的抗体与存在于活细胞表面上的肿瘤抗原的天然表位结合。
根据本发明，具有结合CLDN18.2的能力的抗体或针对CLDN18.2的抗体是能够与存在于CLDN18.2中的表位(优选位于CLDN18.2的细胞外结构域内的表位，特别是CLDN18.2的第一细胞外结构域，优选第29至78位氨基酸)结合的抗体。在一些特别的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是能够与以下表位结合的抗体：(i)CLDN18.2上的不存在于CLDN18.1上的表位，优选SEQ ID NO：3、4和5；(ii)位于CLDN18.2-环1上的表位，优选SEQ IDNO：8：(iii)位于CLDN18.2-环2上的表位，优选SEQ ID NO：10；(iv)位于CLDN18.2-环D3上的表位，优选SEQ ID NO：11；(v)包含CLDN18.2-环1和CLDN18.2-环D3的表位；或者(vi)位于CLDN18.2-环D3上的非糖基化表位，优选SEQ ID NO：9。
根据本发明，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体优选是具有与CLDN18.2结合但不与CLDN18.1结合之能力的抗体。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体对于CLDN18.2是特异性的。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是具有与细胞表面上表达的CLDN18.2结合之能力的抗体。在一些特别的优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与活细胞表面上存在的CLDN18.2的天然表位结合。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与选自SEQ ID NO：1、3至11、44、46和48至50的一种或更多种肽结合。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体对上述蛋白质、肽或其免疫原性片段或衍生物是特异性的。具有与CLDN18.2结合之能力的抗体可通过包括以下步骤的方法获得：用包含选自SEQID NO：1、3至11、44、46和48至50的氨基酸序列的蛋白质或肽或者表达所述蛋白质或肽的核酸或宿主细胞免疫接种动物。优选地，抗体与癌细胞(特别是上述癌症类型的细胞)结合，并且优选地基本上不与非癌细胞结合。
优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与表达CLDN18.2的细胞结合诱导或介导杀伤表达CLDN18.2的细胞。表达CLDN18.2的细胞优选为癌细胞，并且特别地选自致瘤性胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌细胞。优选地，抗体通过诱导以下一种或更多种来诱导或介导细胞杀伤：补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)介导的裂解、凋亡和抑制表达CLDN18.2的细胞的增殖。优选地，ADCC介导的细胞裂解发生在效应细胞的存在下，所述效应细胞在一些特别的实施方案中选自单核细胞、单个核细胞、NK细胞和PMN。
在一些优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体可以通过以下一种或更多种特性表征：
a)对CLDN18.2的特异性；
b)与CLDN18.2的结合亲和力为约100nM或更小，优选约5nM至10nM或更小，更优选约1nM至3nM或更小；
c)诱导或介导CLDN18.2阳性细胞上CDC的能力；
d)诱导或介导CLDN18.2阳性细胞上ADCC的能力；
e)抑制CLDN18.2阳性细胞生长的能力；
f)诱导CLDN18.2阳性细胞凋亡的能力。
在一个特别优选的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体由保藏在DSMZ(Mascheroder Weg 1b，31824 Braunschweig，Germany；新地址：Inhoffenstr.7B，31824Braunschweig，Germany)并且具有以下名称和登记号的杂交瘤产生：
a.182-D1106-055，登记号DSM ACC2737，于2005年10月19日保藏；
b.182-D1106-056，登记号DSM ACC2738，于2005年10月19日保藏；
c.182-D1106-057，登记号DSM ACC2739，于2005年10月19日保藏；
d.182-D1106-058，登记号DSM ACC2740，于2005年10月19日保藏；
e.182-D1106-059，登记号DSM ACC2741，于2005年10月19日保藏；
f.182-D1106-062，登记号DSM ACC2742，于2005年10月19日保藏；
g.182-D1106-067，登记号DSM ACC2743，于2005年10月19日保藏；
h.182-D758-035，登记号DSM ACC2745，于2005年11月17日保藏；
i.182-D758-036，登记号DSM ACC2746，于2005年11月17日保藏；
j.182-D758-040，登记号DSM ACC2747，于2005年11月17日保藏；
k.182-D1106-061，登记号DSM ACC2748，于2005年11月17日保藏；
l.182-D1106-279，登记号DSM ACC2808，于2006年10月26日保藏；
m.182-D1106-294，登记号DSM ACC2809，于2006年10月26日保藏；
n.182-D1106-362，登记号DSM ACC2810，于2006年10月26日保藏。
根据本发明的一些优选抗体是由上述杂交瘤产生和可从其获得的那些：即，在182-D1106-055的情况下为37G11，在182-D1106-056的情况下为37H8，在182-D1106-057的情况下为38G5，在182-D1106-058的情况下为38H3，在182-D1106-059的情况下为39F11，在182-D1106-062的情况下为43A11，在182-D1106-067的情况下为61C2，在182-D758-035的情况下为26B5，在182-D758-036的情况下为26D12，在182-D758-040的情况下为28D10，在182-D1106-061的情况下为42E12，在182-D1106-279的情况下为125E1，在182-D1106-294的情况下为163E12，在182-D1106-362的情况下为175D10，及其嵌合和人源化形式。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是选自以下的抗体：(i)由以以下登记号保藏的克隆产生和/或可从其获得的抗体：DSM ACC2737、DSM ACC2738、DSMACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSM ACC2743、DSM ACC2745、DSMACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748、DSM ACC2808、DSM ACC2809或DSM ACC2810；(ii)为(i)中抗体的嵌合或人源化形式的抗体；(iii)具有(i)中抗体的特异性的抗体；以及(iv)包含(i)中抗体的抗原结合部分或抗原结合位点(特别是可变区)，并且优选地具有(i)中抗体的特异性的抗体。
优选的嵌合抗体及其序列示于下表中。
Figure BPA0000248867100000461
在一些优选实施方案中，根据本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括包含重链恒定区(CH)的抗体，所述重链恒定区包含来源于人重链恒定区的氨基酸序列，例如SEQID NO：13所示氨基酸序列或其片段。在另一些优选实施方案中，根据本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括包含轻链恒定区(CL)的抗体，所述轻链恒定区包含来源于人轻链恒定区的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列或其片段。在一个特别优选实施方案中，根据本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括包含CH并且包含CL的抗体，所述CH包含来源于人CH的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列或其片段，所述CL包含来源于人CL的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列或其片段。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是包含κ鼠可变轻链、人κ轻链恒定区同种异型Km(3)、鼠重链可变区、人IgG1恒定区、同种异型G1m(3)的嵌合小鼠/人IgG1单克隆抗体。
在某些优选实施方案中，嵌合形式的抗体包括包含重链和/或包含轻链的抗体，所述重链包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、51的氨基酸序列及其片段，所述轻链包含选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26、27、28的氨基酸序列及其片段。
在某些优选实施方案中，嵌合形式的抗体包括包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链与轻链之组合的抗体：
(i)重链包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列或其片段；
(ii)重链包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或其片段；
(iii)重链包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列或其片段；
(iv)重链包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或其片段；
(v)重链包含SEQ ID NO：17所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段；
(vi)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：23所示氨基酸序列或其片段；
(vii)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：26所示氨基酸序列或其片段；
(viii)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列或其片段；
(ix)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段且，轻链包含SEQ ID NO：28所示氨基酸序列或其片段；以及
(x)重链包含SEQ ID NO：51所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段。
特别优选根据(v)或(x)的抗体。
如上文使用的“片段”或“氨基酸序列的片段”涉及抗体序列的一部分，即，表示在N端和/或C端缩短的抗体序列的序列，其当替代抗体中的所述抗体序列时保留所述抗体与CLDN18.2的结合，并且优选地保留本文中描述的所述抗体的功能，例如CDC介导的裂解或ADCC介导的裂解。优选地，氨基酸序列的片段包含来自所述氨基酸序列的至少80％，优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸残基。选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、51、20、21、22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的片段优选涉及其中在N端的17、18、19、20、21、22或23个氨基酸被除去的所述序列。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34的氨基酸序列及其片段。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43的氨基酸序列及其片段。
在某些优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合：
(i)VH包含SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：36所示氨基酸序列或其片段；
(ii)VH包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段；
(iii)VH包含SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：37所示氨基酸序列或其片段；
(iv)VH包含SEQ ID NO：33所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：40所示氨基酸序列或其片段；
(v)VH包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段；
(vi)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：38所示氨基酸序列或其片段；
(vii)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：41所示氨基酸序列或其片段；
(viii)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：42所示氨基酸序列或其片段；
(ix)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：43所示氨基酸序列或其片段。
特别优选根据(v)的抗体。
根据本发明，术语“片段”特别是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或更多个互补性决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或更多个互补性决定区(CDR)选自互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组。在一个特别优选的实施方案中，术语“片段”是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含VH，所述VH包含选自以下实施方案(i)至(vi)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组：
(i)CDR1：SEQ ID NO：14的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：14的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：14的第116至125位；
(ii)CDR1：SEQ ID NO：15的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：15的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：15的第116至126位；
(iii)CDR1：SEQ ID NO：16的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：16的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：16的第116至124位；
(iv)CDR1：SEQ ID NO：17的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：17的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：17的第116至126位；
(v)CDR1：SEQ ID NO：18的第44至51位，CDR2：SEQ ID NO：18的第69至76位，CDR3：SEQ ID NO：18的第115至125位；以及
(vi)CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含VL，所述VL包含选自以下实施方案(i)至(ix)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组：
(i)CDR1：SEQ ID NO：20的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：20的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：20的第115至123位；
(ii)CDR1：SEQ ID NO：21的第49至53位，CDR2：SEQ ID NO：21的第71至73位，CDR3：SEQ ID NO：21的第110至118位；
(iii)CDR1：SEQ ID NO：22的第47至52位，CDR2：SEQ ID NO：22的第70至72位，CDR3：SEQ ID NO：22的第109至117位；
(iv)CDR1：SEQ ID NO：23的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：23的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：23的第115至123位；
(v)CDR1：SEQ ID NO：24的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：24的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：24的第115至123位；
(vi)CDR1：SEQ ID NO：25的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：25的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：25的第115至122位；
(vii)CDR1：SEQ ID NO：26的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：26的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：26的第115至123位；
(viii)CDR1：SEQ ID NO：27的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：27的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：27的第115至123位；以及
(ix)CDR1：SEQ ID NO：28的第47至52位，CDR2：SEQ ID NO：28的第70至72位，CDR3：SEQ ID NO：28的第109至117位。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含VH和VL的组合，所述VH和VL各自包含选自以下实施方案(i)至(ix)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组：
(i)VH：CDR1：SEQ ID NO：14的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：14的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：14的第116至125位，VL：CDR1：SEQ ID NO：21的第49至53位，CDR2：SEQ IDNO：21的第71至73位，CDR3：SEQ ID NO：21的第110至118位；
(ii)VH：CDR1：SEQ ID NO：15的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：15的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：15的第116至126位，VL：CDR1：SEQ ID NO：20第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：20的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：20的第115至123位；
(iii)VH：CDR1：SEQ ID NO：16的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：16的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：16的第116至124位，VL：CDR1：SEQ ID NO：22的第47至52位，CDR2：SEQ IDNO：22的第70至72位，CDR3：SEQ ID NO：22的第109至117位；
(iv)VH：CDR1：SEQ ID NO：18的第44至51位，CDR2：SEQ ID NO：18的第69至76位，CDR3：SEQ ID NO：18的第115至125位，VL：CDR1：SEQ ID NO：25的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：25的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：25的第115至122位；
(v)VH：CDR1：SEQ ID NO：17的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：17的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：17的第116至126位，VL：CDR1：SEQ ID NO：24的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：24的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：24的第115至123位；
(vi)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：23的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：23的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：23的第115至123位；
(vii)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：26的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：26的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：26的第115至123位；
(viii)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：27的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：27的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：27的第115至123位；以及
(ix)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：28的第47至52位，CDR2：SEQ IDNO：28的第70至72位，CDR3：SEQ ID NO：28的第109至117位。
在另一些优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体优选包含针对CLDN18.2的单克隆抗体(优选本文中所述的针对CLDN18.2的单克隆抗体)的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或更多个互补性决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区，并且优选地包含本文中所述的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或更多个互补性决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或更多个互补性决定区(CDR)选自本文中所述的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组。在一个特别优选的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体优选包含针对CLDN18.2的单克隆抗体(优选本文中所述的针对CLDN18.2的单克隆抗体)的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且优选地包含本文中所述的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，本文中所述的包含一个或更多个CDR、CDR组或CDR组的组合的抗体包含所述CDR以及其间插框架区。优选地，该部分将还包括第一和第四框架区中任一个或两个的至少约50％，该50％是第一框架区的C端50％和第四框架区的N端50％。通过重组DNA技术进行抗体构建可导致在可变区的N端或C端引入由为了便于克隆或其他操作步骤而引入的接头编码的残基，包括引入将本发明的可变区与另外的蛋白质序列(包括免疫球蛋白重链、其他可变区(例如在双链抗体的产生中)或蛋白质标记)连接的接头。
在一个实施方案中，本文中所述的包含一个或更多个CDR、CDR组或CDR组的组合的抗体包含在人抗体框架中的所述CDR。
本文中提及抗体关于其重链包含特定链或特定区域或序列优选地涉及其中所述抗体的所有重链都包含所述特定链、区域或序列的情况。这相应地适用于抗体的轻链。
应理解，本文中所述的抗体可通过施用编码抗体的核酸(例如RNA)和/或通过施用包含编码抗体的核酸(例如RNA)的宿主细胞来向患者递送。因此，当向患者施用时，编码抗体的核酸可以以裸露的形式或在合适的递送载剂中(例如以脂质体或病毒颗粒的形式)存在，或者存在于宿主细胞内。提供的核酸可在较长的时间段内以持续的方式产生抗体，从而至少部分地减轻对于治疗性抗体所观察到的不稳定性。待向患者递送的核酸可通过重组手段产生。如果核酸在不存在于宿主细胞内的情况下向患者施用，则其优选地被患者的细胞摄取用于表达由所述核酸编码的抗体。如果核酸在存在于宿主细胞内的同时向患者施用，则其优选地在患者内由宿主细胞表达，从而产生由所述核酸编码的抗体。
本文中使用的术语“核酸”旨在包括DNA和RNA，例如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。
核酸可包含在载体中。本文中使用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如腺病毒或杆状病毒载体)或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。所述载体包括表达载体和克隆载体。表达载体包含质粒和病毒载体，并且通常含有期望的编码序列和在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的合适DNA序列。克隆载体通常用于改造和扩增某一期望的DNA片段，并且可缺乏表达期望DNA片段所需的功能序列。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2’位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA)、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、置换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在RNA的经修饰RNA。这样的改变可包括添加非核苷酸物质，例如添加至RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可称为类似物或天然存在RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并且优选地涉及“mRNA”，其意指“信使RNA”并且涉及可以使用DNA作为模板产生且编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA通常包含5′非翻译区(5′-UTR)、蛋白质或肽编码区和3′非翻译区(3′-UTR)。mRNA在细胞中和体外具有有限的半衰期。优选地，mRNA通过使用DNA模板进行体外转录产生。在本发明的一个实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成获得。体外转录方法是技术人员已知的。例如，存在多种可商购获得的体外转录试剂盒。
为了提高根据本发明使用的RNA的表达和/或稳定性，可对其进行修饰，优选不改变表达的肽或蛋白质的序列。
在根据本发明使用的RNA的情况下，术语“修饰”包括在所述RNA中不天然存在的任何RNA修饰。这样的经修饰RNA在本文中由术语“RNA”涵盖。
例如，根据本发明的RNA可具有经修饰的天然存在或合成的核糖核苷酸，以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷部分或完全地(优选完全地)置换胞苷。作为替代或补充，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷部分或完全地(优选完全地)置换尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’端上的帽结构，并且一般由通过不常见的5’-5’三磷酸连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位被甲基化。术语“常规的5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽，优选是指7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构并且被修饰以具有稳定化RNA(如果附接于RNA的话，优选在体内和/或在细胞中)的能力的5’-帽类似物。
优选地，如果被递送至(即转染进)细胞(特别是体内存在的细胞)中，RNA表达其编码的蛋白质或肽。
术语“转染”涉及将核酸(特别是RNA)引入细胞中。对于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞中或核酸被这样的细胞所摄取，其中所述细胞可存在于对象(例如，患者)中。因此，根据本发明，用于转染本文中所述的核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，所述细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，只要转染的遗传物质仅被瞬时表达就足够了。由于在转染过程中被引入的核酸通常没有整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂被稀释或被降解。允许附加体扩增核酸的细胞大大降低了稀释率。如果期望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须进行稳定转染。RNA可以转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子活性、量或数目的一半所需的时间段。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA的“表达持续时间”。可以预期具有长半衰期的RNA将长时间表达。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可以翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中在无细胞系统中(优选使用合适的细胞提取物)在体外合成RNA(特别是mRNA)的过程。优选地，克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体通常被称为转录载体，并且根据本发明涵盖在术语“载体”内。
根据本发明，术语“翻译”涉及在细胞核糖体中通过信使RNA的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质的过程。
根据本发明，术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA和/或肽或蛋白质，例如，通过转录和/或翻译。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别地涉及产生肽或蛋白质。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“不正常表达”。
根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”意指与参考(例如未患与某种蛋白质(例如肿瘤抗原)之异常或不正常表达相关的疾病的对象中的状态相比，表达改变(优选提高)。表达提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％或至少100％，或者更多。在一个实施方案中，表达仅存在于患病组织中，同时健康组织中的表达受到抑制。
术语“特异性表达”是指蛋白质基本上仅在特定组织或器官中表达。例如，在胃黏膜中特异性表达的肿瘤抗原意味着所述蛋白质主要在胃黏膜中表达，并且不在其他组织中表达，或在其他组织或器官类型中不表达至显著程度。因此，仅在胃黏膜的细胞中表达并且在任何其他组织(例如睾丸)中以显著更低程度表达的蛋白质在胃黏膜的细胞中特异性表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原也可在正常条件下在多于一种组织类型或器官中(例如在2或3种组织类型或器官中，但优选在不超过3种不同的组织或器官类型中)特异性地表达。在这种情况下，则肿瘤抗原在这些器官中特异性表达。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下在肺和胃中优选在大致相等的程度上表达，则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
根据本发明，术语“编码…的RNA”意指RNA如果存在于合适的环境中(优选在细胞内)，可以被表达以产生其编码的蛋白质或肽。
本发明的一些方面依赖宿主细胞的过继转移：用编码本文中所述的抗体的核酸(例如RNA)体外转染宿主细胞并将其(优选在从低前体频率离体扩增到临床上相关细胞数之后)转移至接受者(例如患者)。根据本发明用于治疗的宿主细胞可以相对于所治疗的接受者是自体的、同种异体的或同基因的(syngeneic)。
术语“自体的”用于描述来自同一对象的任何物质。例如，“自体移植物”是指来自同一对象的组织或器官的移植物。这样的操作是有利的，因为其克服了在其他情况下会导致排斥的免疫障碍。
术语“同种异体的”用于描述来自相同物种的不同个体的任何物质。当一个或更多个基因座上的基因不相同时，认为两个或更多个个体彼此是同种异体的。
术语“同基因的”用于描述来自具有相同基因型的个体或组织，即同卵双生或同一近交系的动物或者其组织的任何物质。
术语“异源的”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例，将一个个体的骨髓转移到不同个体中构成异源移植物。异源基因是来自除对象以外的来源的基因。
根据本发明，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键共价连接的2个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选9个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个，并且多至优选8、10、20、30、40或50个，特别是100个氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，优选具有多于100个氨基酸残基的肽，但通常术语“肽”和“蛋白质”是同义词并且在本文中可互换使用。
本文中关于特定氨基酸序列(例如序列表中示出的那些)给出的教导应解释为还涉及所述特定序列的变体，其产生与所述特定序列在功能上等同的序列，例如显示出与特定氨基酸序列的特性相同或相似的特性的氨基酸序列。
一个重要特性是保留抗体与其靶标的结合或维持抗体的效应子功能。优选地，相对于特定序列为变体的序列当其替代抗体中的该特定序列时保留所述抗体与其靶标的结合，并且优选地保留本文中所述的所述抗体的功能，例如CDC介导的裂解或ADCC介导的裂解。
本领域技术人员将理解，特别地，可修饰CDR、高变区和可变区的序列，而不丧失抗体与其靶标结合的能力。例如，CDR区与本文中指定的抗体的区域相同或高度同源。“高度同源”意指在CDR中可以进行1至5个、优选1至4个，例如1至3个或1个或2个替换。此外，可以修饰高变区和可变区使得其与本文中具体公开的抗体的区域显示出显著同源性。
根据本发明的术语“变体”特别是指突变体、剪接变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体(species variant)和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其意义常常是不清楚的。全基因测序通常鉴定出给定基因的多种等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应涵盖任何翻译后修饰的变体和构象变体。
对于本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。在蛋白质的N端和/或C端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。
氨基酸插入变体在特定氨基酸序列中包含单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或更多个氨基酸残基插入到氨基酸序列的特定位点，但是也可以随机插入并适当地筛选所得产物。
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基端和/或羧基端融合。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或更多个氨基酸，例如在于除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。
氨基酸替换变体的特征在于序列中的至少一个残基被除去并且在其位置插入另一个残基。优选的是修饰在氨基酸序列中在同源蛋白质或肽之间不保守的位置和/或用具有类似特性的其他氨基酸替代氨基酸。优选地，蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电荷的氨基酸的替换。保守氨基酸变化涉及其侧链相关的氨基酸的家族中一种的替换。通常来说，天然存在的氨基酸分为以下四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。有时，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸共同地分类为芳香族氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列与为所述给定氨基酸序列之变体的氨基酸序列之间的相似性(优选同一性)程度为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，相似性或同一性程度给予为参考氨基酸序列全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选地相似性或同一性程度给予至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸。在一些优选实施方案中，相似性或同一性程度给予参考氨基酸序列的全长。用于确定序列相似性(优选序列同一性)的比对可以用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如使用Align，采用标准设置(优选地EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，缺口开放10.0，缺口延伸0.5)来进行。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“同一性百分比”旨在表示在最佳比对后获得的两个待比较序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，两个序列之间的差异是随机分布的并且在其整个长度上。两个氨基酸序列之间的序列比较常规地通过在将这些序列最佳比对后对其进行比较来进行，所述比较通过区段或通过“比较窗”来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对除人工外还可如下产生：通过Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法；通过Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法；通过Pearson和Lipman，1988，Proc.NatlAcad.Sci.USA 85，2444的相似性检索方法；或者通过使用这些算法的计算机程序(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis中)。
同一性百分比如下计算：确定两个比较序列之间的相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100，以获得这两个序列之间的同一性百分比。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选涉及完整的细胞，即未释放其正常细胞内组分(例如酶、细胞器或遗传物质)的具有完整膜的细胞。完整的细胞优选是活细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地，根据本发明，所述术语涉及可用外源核酸转染的任何细胞。优选地，细胞当转染有外源核酸并转移至接受者中时可在所述接受者中表达所述核酸。术语“细胞”包括细菌细胞；另一些可用的细胞是酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括来自以下的细胞：革兰氏阴性细菌菌株，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、变形杆菌(Proteus)和假单胞菌(Pseudomonas)的菌株；以及革兰氏阳性细菌菌株，例如芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、葡萄球菌(Staphylococcus)和乳球菌(Lactococcus)的菌株。合适的真菌细胞包括来自木霉(Trichoderma)、脉孢霉(Neurospora)和曲霉(Aspergillus)物种的细胞。合适的酵母细胞包括来自酵母(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizo saccharomyces pombe))、毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))以及汉逊酵母(Hansenula)物种的细胞。合适的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、293HEK等。然而，也可使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞以及本领域中用于表达异源蛋白质的任何其他细胞。特别优选哺乳动物细胞用于过继转移，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类的细胞。细胞可来源于大量组织类型，并且包括原代细胞和细胞系，例如免疫系统的细胞(特别是抗原呈递细胞，例如树突细胞和T细胞)、干细胞(例如造血干细胞和间充质干细胞)以及其他细胞类型。抗原呈递细胞是在主要组织相容性复合物的情况下在其表面上展示抗原的细胞。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)来识别该复合物。
术语“转基因动物”是指具有包含一个或更多个转基因(优选重链和/或轻链转基因)或转染色体(整合或未整合到动物的天然基因组DNA中)的基因组并且优选能够表达所述转基因的动物。例如，转基因小鼠可具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体，使得当用肿瘤抗原和/或表达肿瘤抗原的细胞免疫接种时，小鼠产生人抗肿瘤抗原抗体。人重链转基因可整合到小鼠的染色体DNA中，如转基因小鼠(例如HuMAb小鼠，如HCo7或HCol2小鼠)的情况，或者人重链转基因可保持在染色体外，如在WO 02/43478中所述的转染色体(例如，KM)小鼠的情况。这样的转基因和转染色体小鼠可以能够通过进行V-D-J重组和同种型转换来产生针对肿瘤抗原的人单克隆抗体的多种同种型(例如，IgG、IgA和/或IgE)。
本文中使用的“减小”、“降低”或“抑制”意指水平(例如表达水平或细胞增殖水平)的以下总体降低或引起以下总体降低的能力：优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，并且最优选75％或更大。
术语例如“提高”或“增强”优选地涉及提高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更高。
本文中所述的抗体可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管优选体细胞杂交方法，但是原则上，可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是得到充分确立的方法。免疫接种方案和用于分离用于融合的经免疫接种脾细胞的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的另一些优选动物系统是大鼠和兔系统(例如，在Spieker-Polet等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)中进行描述；还参见Rossi等，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。
在另一个优选实施方案中，可使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生人单克隆抗体。这些转基因和转染色小鼠包括分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。可如WO2004035607中对CD20详细描述的在这样的转基因小鼠中进行人抗体的产生。
用于产生单克隆抗体的另一策略是从产生具有确定特异性的抗体的淋巴细胞直接分离编码抗体的基因，例如，参见Babcock等，1996；A novel strategy for generatingmonoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producing antibodiesof defined specificities。关于重组抗体工程的细节，还参见Welschof和Kraus，Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8和Benny K.C.LoAntibody Engineering ISBN 1-58829-092-1。
为了产生抗体，可以如所述用来自抗原序列(即，抗体针对的序列)的载体缀合肽、重组表达抗原或其片段的富集制备物和/或表达抗原的细胞免疫接种小鼠。或者，可用编码抗原或其片段的DNA免疫接种小鼠。如果使用抗原的纯化制备物或富集制备物的免疫接种不产生抗体，还可用表达抗原的细胞(例如，细胞系)免疫接种小鼠来促进免疫应答。
可在免疫接种方案的过程中用通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品监测免疫应答。具有足够免疫球蛋白效价的小鼠可用于融合。在处死和摘出脾前3天，可用抗原表达细胞腹膜内或静脉内加强小鼠以提高特异性抗体分泌杂交瘤的比例。
为了产生产生单克隆抗体的杂交瘤，可从经免疫接种的小鼠中分离出脾细胞和淋巴结细胞，并将其与合适的永生化细胞系(例如，小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后，可针对抗原特异性抗体的产生筛选获得的杂交瘤。然后可以通过ELISA对单个孔进行筛选以获得分泌抗体的杂交瘤。使用抗原表达细胞通过免疫荧光和FACS分析，可以鉴定对抗原具有特异性的抗体。可将分泌抗体的杂交瘤重新平板接种，再次筛选，并且如果对单克隆抗体仍呈阳性，则可通过有限稀释进行亚克隆。然后，可在组织培养基中体外培养稳定的亚克隆以产生抗体用于表征。
如本领域中公知的，还可使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生抗体(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，在一个实施方案中，可将目的基因(例如，抗体基因)连接至表达载体(例如，真核表达质粒)中，例如WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338841中公开的GS基因表达系统或本领域公知的其他表达系统所使用的。可将具有所克隆抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞(例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293细胞或者作为替代的其他真核细胞(如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞))中。用于引入这些基因的方法可以是本领域中所述的方法，例如电穿孔、lipofectine、lipofectamine等。在将这些抗体基因引入宿主细胞后，可以鉴定并选择表达抗体的细胞。这些细胞代表随后可根据其表达水平扩增并扩大规模以生产抗体的转染瘤。可从这些培养物上清液和/或细胞中分离并纯化重组抗体。
或者，可在其他表达系统(包括原核细胞，例如微生物，如大肠杆菌(E.coli))中表达克隆的抗体基因。此外，抗体可在非人转基因动物中(例如在来自绵羊和兔的乳中或在来自母鸡的卵中)产生，或者在转基因植物中产生；参见例如，Verma，R.，等(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock，等(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157；以及Fischer，R，等(1999)Biol.Chem.380：825-839。
嵌合
当重复应用时，鼠抗体在人中是高免疫原性的，导致治疗效果降低。主要的免疫原性是由重链恒定区介导的。如果相应的抗体是嵌合的或人源化的，则可以降低或完全避免人中鼠抗体的免疫原性。嵌合抗体是这样的抗体，其不同部分来自不同的动物物种，例如具有来自鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。通过将鼠抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区连接实现抗体的嵌合(例如，如Kraus等，在Methods inMolecular Biology series中，Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8所述)。在一个优选实施方案中，通过将人κ-轻链恒定区连接到鼠轻链可变区来产生嵌合抗体。在一个同样优选的实施方案中，可通过将人λ-轻链恒定区连接到鼠轻链可变区来产生嵌合抗体。用于产生嵌合抗体的优选重链恒定区是IgG1、IgG3和IgG4。用于产生嵌合抗体的另一些优选重链恒定区是IgG2、IgA、IgD和IgM。
人源化
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补性决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，CDR内的氨基酸序列较CDR外的序列在个体抗体之间更多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含接枝到来自具有不同特性之不同抗体的框架序列上的来自特定天然存在抗体的CDR序列(参见，例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；以及Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这样的框架序列可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序列，因为其不包含在B细胞成熟期间由V(D)J连接形成的完全组装的可变基因。种系基因序列将也不同于高亲和力次级库抗体单独地均匀分布在可变区的序列。
可使用标准结合测定(例如，ELISA、Western印迹、免疫荧光和流式细胞术分析)来确定抗体结合抗原的能力。
为了纯化抗体，可将所选择的杂交瘤在两升旋转瓶中培养以纯化单克隆抗体。或者，可以在基于透析的生物反应器中产生抗体。可将上清液过滤并(如有需要的话)浓缩，之后用蛋白G琼脂糖或蛋白A琼脂糖进行亲和色谱。可通过凝胶电泳和高效液相色谱检查经洗脱的IgG，以确保纯度。可将缓冲溶液更换成PBS，并可以使用1.43消光系数通过OD280确定浓度。可将单克隆抗体分成等分试样并贮存于-80℃。
为了确定所选择的单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用定点诱变或多位点定向诱变。
为了确定抗体的同种型，可用多种商业试剂盒(例如Zymed，Roche Diagnostics)进行同种型ELISA。可用抗小鼠Ig包被微量滴定板的孔。封闭后，使板与单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应2小时。然后可使孔与小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3、IgA或小鼠IgM特异性过氧化物酶缀合探针反应。洗涤后，可用ABTS底物(1mg/ml)使板显色，并在405至650的OD下进行分析。或者，可以如制造商所述使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Roche，目录号1493027)。
为了证明在经免疫接种小鼠的血清中存在抗体或者单克隆抗体与表达抗原的活细胞结合，可以使用流式细胞术。可将天然或在转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照(在标准培养条件下培养)与在杂交瘤上清液中或在含有1％FBS的PBS中的不同浓度单克隆抗体混合，并且可以在4℃下孵育30分钟。洗涤后，经APC或Alexa647标记的抗IgG抗体可在与一抗染色相同的条件下与抗原结合的单克隆抗体结合。可通过流式细胞术使用FACS仪器利用光和侧向散射特性对单个活细胞设门来分析样品。为了在单测量中区分抗原特异性单克隆抗体与非特异性结合剂，可以采用共转染的方法。瞬时转染有编码抗原和荧光标志物的质粒的细胞可如上所述进行染色。可在与经抗体染色的细胞不同的荧光通道中检测经转染的细胞。由于大多数经转染的细胞表达两个转基因，抗原特异性单克隆抗体优先与表达荧光标志物的细胞结合，而非特异性抗体以相当的比例与未转染的细胞结合。作为流式细胞术测定的补充或替代，可使用利用荧光显微术的作为替代的测定。可完全如上所述准确地染色细胞，并通过荧光显微术检查。
为了证明在经免疫接种小鼠的血清中存在抗体或单克隆抗体与表达抗原的活细胞结合，可使用免疫荧光显微术分析。例如，将自发或在转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基中的标准培养条件下在室载玻片(chamber slide)中培养。然后用甲醇或多聚甲醛固定细胞或不做处理。然后，可使细胞与针对抗原的单克隆抗体于25℃下反应30分钟。在洗涤之后，使细胞与经Alexa555标记的抗小鼠IgG第二抗体(Molecular Probes)于相同条件下反应。然后，通过荧光显微术检查细胞。
可制备来自表达抗原的细胞和合适阴性对照的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分开的抗原转移至硝酸纤维素膜，封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可使用抗小鼠IgG过氧化物酶检测IgG结合并用ECL底物显色。
还可以按照技术人员公知的方式，通过免疫组织化学来测试抗体与抗原的反应性，例如，使用来自在常规外科手术操作期间从患者获得或者从携带接种有自发或在转染后表达抗原之细胞系的异种移植肿瘤的小鼠获得的非癌组织或癌组织样品的经多聚甲醛或丙酮固定的冷冻切片或经多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片。对于免疫染色，可孵育与抗原反应的抗体，然后根据供应商的说明孵育辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体(DAKO)。
可对抗体介导吞噬和杀伤表达肿瘤抗原之细胞的能力进行测试。单克隆抗体活性的体外测试将在测试体内模型前提供初步筛选。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
简言之，可通过Ficoll Hypaque密度离心然后裂解污染性红细胞来纯化来自健康供体的多形核细胞(PMN)、NK细胞、单核细胞、单个核细胞或其他效应细胞。可将经洗涤的效应细胞悬浮于补充有10％热灭活胎牛血清或者作为替代地补充有5％热灭活人血清的RPMI中，并以不同的效应细胞：靶细胞比例与经51Cr标记的表达肿瘤抗原的靶细胞混合。或者，可用荧光增强配体(BATDA)标记靶细胞。可通过荧光计测量铕与从死细胞中释放的增强配体的高度荧光螯合物。另一种作为替代的技术可利用具有萤光素酶的靶细胞的转染。然后，仅活细胞可氧化添加的荧光黄。然后，可以以不同的浓度添加经纯化的抗肿瘤抗原IgG。可使用不相关的人IgG作为阴性对照。根据使用的效应细胞类型，测定可在37℃下进行4至20小时。可通过测量培养物上清液中的51Cr释放或EuTDA螯合物的存在来测定样品的细胞裂解。或者，由荧光黄氧化产生的发光可以是活细胞的量度。
还可以以多种组合来测试抗肿瘤抗原单克隆抗体以确定用多种单克隆抗体是否增强细胞裂解。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
可使用多种已知的技术来测试单克隆抗肿瘤抗原抗体介导CDC的能力。例如，可以以技术人员已知的方式从血液中获得补体血清。为了确定mAb的CDC活性，可使用不同的方法。可测量例如51Cr释放或可使用碘化丙啶(PI)排除测定来评估提高的膜渗透性。简言之，可洗涤靶细胞，并将5×105/mL与不同浓度的mAb在室温下或在37℃下孵育10至30分钟。然后，可添加血清或血浆至终浓度为20％(v/v)，并将细胞在37℃下孵育20至30分钟。可向FACS管中的PI溶液添加来自每个样品的全部细胞。然后，可使用FACSArray通过流式细胞术分析来立即分析混合物。
在一种作为替代的测定中，可在贴壁细胞上确定CDC的诱导。在该测定的一个实施方案中，在测定前24小时，以3×104/孔的密度将细胞接种于组织培养平底微量滴定板中。第二天，去除生长培养基并将细胞与抗体一式三份地孵育。将对照细胞与生长培养基或包含0.2％皂苷的生长培养基孵育用于分别确定背景裂解和最大裂解。在室温下孵育20分钟之后，去除上清液，并向细胞添加DMEM中的20％(v/v)人血浆或血清(预温热至37℃)并在37℃下再孵育20分钟。向碘化丙啶溶液(10μg/mL)添加来自每个样品的全部细胞。然后，用含有2.5μg/ml溴化乙锭的PBS替换上清液，并使用Tecan Safire在600nm下测量在520nm处激发后的荧光发射。如下计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝(样品荧光-背景荧光)/(最大裂解荧光-背景荧光)×100。
通过单克隆抗体诱导凋亡和抑制细胞增殖
可将单克隆抗肿瘤抗原抗体例如与肿瘤抗原阳性肿瘤细胞或转染有肿瘤抗原的肿瘤细胞在37℃下孵育约20小时以测试引发凋亡的能力。可以收获细胞，在膜联蛋白-V结合缓冲液(BD biosciences)中洗涤，并用与FITC或APC缀合的膜联蛋白-V(BDbiosciences)在暗处孵育15分钟。可向FACS管中的PI溶液(在PBS中10μg/ml)添加来自每个样品的全部细胞，并立即通过流式细胞术进行评估(如上)。或者，可用可商购获得的试剂盒来检测单克隆抗体对细胞增殖的一般抑制。DELFIA细胞增殖试剂盒(Perkin-Elmer，目录号AD0200)为基于在微板中测量在增殖细胞DNA合成期间的5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)掺入的非同位素免疫测定。使用经铕标记的单克隆抗体来检测掺入的BrdU。使用固定溶液固定细胞并使DNA变性以允许抗体检测。洗去未结合的抗体，并添加DELFIA诱导剂以从经标记抗体中解离铕离子至溶液中，在此其与DELFIA诱导剂的组分形成高荧光螯合物。在检测中利用时间分辨荧测定法测量的荧光与每个孔的细胞中的DNA合成成比例。
临床前研究
还可在体内模型中(例如，在携带接种有表达肿瘤抗原之细胞系的异种移植肿瘤的免疫缺陷型小鼠中)测试本文中所述的抗体以确定其控制表达肿瘤抗原之肿瘤细胞生长的效力。
在将表达肿瘤抗原之肿瘤细胞异种移植到免疫受损小鼠或其他动物中后，可使用本文中所述的抗体进行体内研究。可将抗体施用于无肿瘤小鼠，随后注射肿瘤细胞以测量抗体预防肿瘤形成或肿瘤相关症状的作用。可将抗体施用于携带肿瘤的小鼠以确定相应抗体降低肿瘤生长、转移或肿瘤相关症状的治疗效力。抗体施用可与其他物质(如细胞抑制性药物、生长因子抑制剂、细胞周期阻滞剂、血管生成抑制剂或其他抗体)的施用组合，以确定组合的协同效力和潜在毒性。为了分析由抗体介导的毒性副作用，可用抗体或对照试剂接种动物，并彻底研究可能与肿瘤抗原-抗体治疗相关的症状。体内施用肿瘤抗原抗体的可能副作用特别地包括在表达肿瘤抗原的组织处的毒性。在人和其他物种(例如，小鼠)中识别肿瘤抗原的抗体特别可用于预测由在人中施用单克隆肿瘤抗原抗体介导的潜在副作用。
由抗体识别的表位的作图可按照在″Epitope Mapping Protocols(Methods inMolecular Biology)，Glenn E.Morris ISBN-089603-375-9中和在″Epitope Mapping：APractical Approach″Practical Approach Series，248，Olwyn M.R.Westwood，FrankC.Hay中详细描述进行。
本文中所述的化合物和药剂可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
药物组合物优选是无菌的并且含有有效量的本文中所述的抗体以及任选地本文所讨论的其他药剂以产生期望反应或期望效果。
药物组合物通常以均匀剂型提供，并且可以以本身已知的方式制备。药物组合物可以例如是溶液剂或混悬剂的形式。
药物组合物可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，其全部优选是可药用的。术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。
不可药用的盐可用于制备可药用的盐，并且包括在本发明中。这类可药用盐以非限制性方式包含由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐还可制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
用于药物组合物的合适缓冲物质包括盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。
用于药物组合物的合适防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
可注射制剂可包含可药用的赋形剂，例如乳酸林格液(Ringer lactate)。
术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现应用。根据本发明，术语“载体”还包括适用于向患者施用的一种或更多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。
用于肠胃外施用的可能的载体物质是例如无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘，以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。
在本文中使用的术语“赋形剂”旨在表示可存在于药物组合物中但不是活性成分的所有物质，例如如载体、黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
本文中所述的药剂和组合物可通过任何常规途径施用，例如，通过肠胃外施用，包括通过注射或输注。施用优选肠胃外(例如静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内)进行。
适于肠胃外施用的组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制剂，其优选与接受者的血液等张。相容性载体和溶剂的实例是林格液和等张氯化钠溶液。此外，通常使用无菌的固定油作为溶液剂或混悬剂介质。
本文中所述的药剂和组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望的反应优选地是指抑制疾病的进程。这包括减缓疾病的进展，以及特别是中断或逆转疾病的进展。在治疗疾病或病症中期望的反应也可以是延迟或预防所述疾病或所述病症的发作。特别地，术语“有效量”是指这样的治疗量，其足以使得预防癌症及其一种或更多种症状的发生、复发或发作，降低癌症的严重程度、持续时间，改善癌症的一种或更多种症状，预防癌症的进展，引起癌症的消退和/或预防癌症的转移。在本发明的一个实施方案中，治疗的量对于实现癌症干细胞群体的稳定化、减小或消除和/或根除、去除或控制原发性癌症、转移性癌症和/或复发性癌症是有效的。
本文中所述的药剂或组合物的有效量将取决于待治疗病症、疾病严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型大小和体重)、治疗持续时间、伴随治疗的类型(如果存在的话)、具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述的药剂的施用剂量可取决于多个这样的参数。在初始剂量下患者中反应不充足的情况下，可使用更高剂量(或者通过不同的更局部施用途径来实现有效更高的剂量)。
本文中提供的药剂和组合物可以单独或与常规治疗方案(例如外科手术、辐照、化学治疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或不相关的))组合使用。
癌症的治疗代表其中尤其期望组合策略的领域，因为两种、三种、四种或甚至更多种癌症药物/治疗的组合作用经常产生比单一治疗方法的影响显著更强的协同作用。因此，在本发明的另一个实施方案中，癌症治疗可以有效地与多种其他药物组合。其中有例如与常规肿瘤治疗、多表位策略、另外的免疫治疗和靶向血管生成或凋亡的治疗方法的组合(综述参见例如，Andersen等2008：Cancer treatment：the combination of vaccinationwith other therapies.Cancer Immunology lmmunotherapy，57(11)：1735-1743)。不同药剂的依次施用可抑制不同检查点的癌细胞生长，而另一些药剂可例如抑制新血管生成、恶性细胞的存活或转移，潜在地将癌症转化为慢性疾病。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：遗传免疫多态性的描述性分析
患者基因组中单核苷酸多态性(SNP)的个体模式可预测治疗性抗体IMAB362的响应率。为了研究这样的SNP模式，对所有患者的多个在免疫应答和胃癌易感性方面具有已知或推定作用的SNP进行基因分型。
具体地，解决了以下问题：
a.关于所研究多态性的每位患者的SNP基因型。
b.患者群体中SNP基因型的频率。
c.鉴定具有可直接干预IMAB362作用模式的多态性(Fc受体和补体系统多态性)的患者。
d.每位患者的描述为胃癌易感性、癌症进展或癌症治疗的风险因子的SNP基因型的积累。
e.SNP基因型与临床结局的相关性。
f.SNP基因型与无进展存活(PFS)的相关性。
对组群1、2和3的所有患者进行遗传多态性分析。在第1天(V2a，输注前)收集患者血液样品。
从所有患者收集全血样品(9ml，EDTA-Monovette)。在研究中心，在收集样品之后将EDTA血液立即以1ml等分试样储存于-20℃下。将EDTA血液样品在干冰上(-70℃)运输并储存在-20℃下。到达后，将血液样品立即储存在-20℃下，直到DNA分离。
通过文献研究集中于已知影响免疫系统功能的SNP，且尤其是已被描述影响治疗性抗体的作用模式的SNP(如Fc受体和补体系统多态性)来选择目的SNP。还选择和研究已经被描述影响胃癌患者存活、(胃)癌症易感性或胃癌进展的SNP。
在Fluidigm BiomarkTM实时PCR分析平台上通过SNP基因分型TaqManTM测定(46标准，5定制；Life Technologies)分析遗传多态性。根据用于从全血中分离基因组DNA的标准方案进行DNA分离。Fluidigm BiomarkTM实时PCR分析平台允许在一次测量中对多至具有96个SNP的96个患者样品进行基因分型，因为向患者样品和特异性SNP引物应用具有用于患者DNA样品的96个通道和用于SNP测定的96个正交通道的实验室芯片。患者基因组DNA通过特异性靶标扩增(Specific Target Amplification，STA)预扩增。在Fluidigm BiomarkTM实时PCR分析平台中在标准条件下对预扩增的DNA进行TaqManTM实时PCR分析。对每位患者进行SNP的等位基因确定，并且每个测定使用专有的Fluidigm软件和统计学分析软件“R”来进行。由于Fluidigm结果不明确，通过经典的Sanger测序确定SNP的亚组。
对53位患者确定51个单核苷酸多态性(SNP)的遗传多态性。来自1位患者的血液样品不允许足够量的DNA提取以分析SNP。对20位患者的亚组仅确定6个SNP基因型。由于技术问题，在9位患者中未确定到MDM2SNP rs2279744的基因型。1位患者的PTGS2rs20417基因分型结果不明确，并且未进一步研究。
确定受试患者的SNP基因型的矩阵允许在统计学上测试与高加索人对照群体中的基因型频率相比患者群体的基因型频移。高加索人对照群体中的SNP基因型频率基于存储在公共数据库dbSNP(National Center for Biotechnology Information，Bethesda(MD，USA)中的由国际SNP基因分型项目(HapMap-CEU，PGA-EUROPEAN-PANEL，CAUC 1，pilot_1_CEU_low_coverage_panel，CEU_GENO_PANEL，PDR-90)所收集的数据。将给定SNP的每种基因型的患者数目与高加索人对照群体中每种基因型的患者数目进行比较。通过将提供的群体中的相对SNP基因型频率乘以报告的研究样品数目来计算对照群体的每种基因型的患者数目。这允许直接的卡方检验(Chi square test)来确定患者群体与相应对照群体之间的统计学显著性差异。
对51个所研究SNP中的48个进行了卡方检验。对于SNP C1QA(rs1044378)、FCGR2C(Q57X(C-＞T))和MDM2(rs2279744)在公共数据库中尚未存储有SNP基因型频率的数据。患者与对照群体之间在基因型频率方面具有统计学显著性变化的SNP(48个SNP中的5个，p＜0.05)示于图1中。
已经显示这5个SNP中的4个在癌症/胃癌易感性中发挥作用。所有4个癌症/胃癌易感性SNP在患者群体中确实显示出各自癌症相关基因型的代表性过高(overrepresentation)，如对胃癌患者所预期的(表1)。
迄今为止，这5个SNP中的1个(rs12146727(C1S))尚未显示为癌症或胃癌方面的风险/易感性因子。迄今为止，该SNP仅曾经被描述为心血管疾病的推定风险因子。
表1：患者与对照群体之间在基因型频率方面具有统计学显著性差异的胃癌易感性相关SNP。
Figure BPA0000248867100000711
患者群体中的51个研究SNP中有49个在研究的患者群体中显示出变异等位基因模式。这允许测试患者亚群之间的SNP等位基因的频移，其理想地可帮助鉴定推定的响应者群体。仅2个SNP，C1QA(rs1044378)和FCGR2C(AHN1ME8)在所有患者中显示出不变的SNP基因型，从而阻止任何类型的差异分析。对于5个SNP，在本研究中与对照群体相比较地可确定统计学上显著的等位基因频移，这提供SNP等位基因频率依赖于给定群体的组成的原理证明。因此，受试SNP选择非常适合于未来鉴定SNP生物标志物候选物。
Fc受体和补体系统多态性可直接干预IMAB362作用模式。针对基因中可影响基于抗体之治疗的效力的SNP等位基因(如FCGR3A(F176V[T→G]，rs396991)、FCGR2A(H131R[T→C]，rs1801274)和C1QA([276A→G]，rs172378)(表2))对患者进行基因分型。
还针对FCGR2C基因(Q57X[C→T]，无rs号)以及补体系统因子C1S(R119H[G→A]，rs12146727)和C1QA(rs292001，rs1044378)的公开SNP等位基因对患者进行基因分型。尚未证明这些SNP影响抗体治疗，但作为感兴趣的候选SNP包括在内。
表2：具有Fc受体和补体系统多态性的患者。列出了具有充分记载的Fc受体和补体系统多态性的患者的SNP基因型。对抗体治疗具有推定积极影响的FCGR3AVal/Val多态性以粗体表示并加有下划线。对抗体治疗具有推定不利影响的FCGR2A(Arg/Arg)和C1QA[G/G]多态性加有灰色阴影并以粗体突出显示。
Figure BPA0000248867100000721
总共23位患者显示出至少一种充分记载的Fc受体和补体系统多态性。4位患者(100411、101120、200336和400109)对于FCGR3A等位基因(F176V[T→G])是纯合的，其被报道在抗体治疗中提高响应率和无进展存活。12位患者对于FCGR2A等位基因(H131R[T→C])是纯合的，另外10位患者对于C1QA等位基因([276A→G])是纯合的。已经证明这两个SNP都会对抗体治疗产生不利影响。总共，21位患者对于FCGR2A等位基因(H131R[T→C])或C1QA等位基因([276A→G])是纯合的(患者100511对于两个SNP等位基因都是纯合的)。
以上研究结果与患者疾病进展的相关性可得到Fc受体和补体系统多态性对IMAB362治疗的作用的了解。
患者中疾病的进展和抗体治疗的效力可受描述为胃癌易感性、癌症进展或癌症治疗之风险因子的SNP的积累影响。在所研究的51个SNP中，多达43个SNP允许将各自SNP基因型分类为“风险”与“非风险”基因型。对每位患者的纯合SNP风险因子基因型的数目进行计数，因为这些一般被描述为最相关的风险等位基因。图2中示出了每位患者的纯合风险基因型数目相对于每位患者的所研究SNP危险因子数目的相对频率。
观察到每位患者的所研究风险基因型的积累为14％至46％。这种广泛分布允许研究每位患者的SNP风险基因型的积累是否与患者的临床结局相关联。
总之，54位患者中的53位对51个SNP成功基因分型。51个SNP中的49个显示变异SNP等位基因模式，允许分析患者亚群的SNP基因型频率的显著变化。在53位患者中的23位中发现了被描述为抗体治疗调节剂的纯合Fc受体和补体系统多态性。观察到每位患者的所研究风险基因型的积累为14％至46％。
实施例2：SNP基因分型与临床结局的相关性
使临床结局与遗传多态性基因型相关的目的是鉴定预测患者临床结局的推定SNP生物标志物候选物。在本分析中鉴定的推定生物标志物候选物将在随后的IIb期和III期研究中验证。在IIb期中验证推定的生物标志物候选物将允许区分推定的预后与预测性SNP候选物。
对两个限定的IIa期临床试验患者群体独立地进行每个SNP与临床结局的相关性分析：具有40位患者的“全分析组”群体(full analysis set，FAS)和具有21位患者的“符合方案组(per protocol set)”群体。
通过SAS Enterprise Guide 6.1量化患者群体的每个临床结局组(“响应者”、“非响应者”)中各SNP的基因型的绝对频率。绝对基因型频率组织在通过临床结局和SNP基因型结构化的列联表(3×2或2×2)中。所采用的标准统计学检验是皮尔逊卡方检验(Pearson’sChi square test)。如果数据集的数值结构禁止使用皮尔逊卡方检验，则在某些情况下对2×2列联表应用Fisher精确检验。应用的统计学显著性水平为p＜0.05。用统计学分析软件SAS Enterprise Guide 6.1实现相关性分析。
为了研究SNP基因型对无进展存活的作用，计算每组的Kaplan-Meier曲线，并随后使用统计学对数秩检验进行正式比较。应用的统计学显著性水平为p＜0.05。用统计学分析软件SAS Enterprise Guide 6.1实现对数秩统计学。
进行临床结局与SNP基因分型的相关性以鉴定推定的预测性或预后SNP生物标志物候选物。在两个患者群体(FAS群体和PP群体)中研究了相关性。
FAS群体包括40位患者，12位患者限定为“响应者”(临床结局“部分缓解”或“病情稳定”)，28位患者为“非响应者”(临床结局“疾病进展”)。FAS群体中的一个患者样品(100801，非响应者)不可用于如上所述的SNP分析，因此分析相关性的最大FAS患者数目降低至39。PP群体包括21位患者，其中10位响应者患者和11位非响应者患者。
每个SNP所研究的患者数目为20至39(在FAS群体中)和20至21(在PP群体中)不同。
如上所述进行相关性分析。总计，在所研究的51个SNP中，2个在FAS以及PP群体中显示出与临床结局的统计学显著相关性。
在两个群体中均显示临床结局与各自SNP基因型之间在统计学上相关的2个SNP是FCGR2A rs1801274(p＝0.0004[PP]；p＝0.008[FAS])和IL-10 rs1800896(p＝0.042[PP]，p＝0.022[FAS])(表3)。对于这2个SNP中的每一个，每个SNP统计学检验的患者数目为21(PP)和39(FAS)。
表3：在PP以及FAS群体中在临床结局与SNP基因型之间显示出统计学相关性的SNP。
Figure BPA0000248867100000741
5个SNP在一个患者群体(FAS或PP)中显示出与临床结局的相关性，如对于DNMT3Ars1550117[PP，p＝0.035]、SMAD4 rs12456284[FAS，p＝0.02]、MUC1 rs4072037(FAS，p＝0.03)、EGF rs4444903[FAS，p＝0.049]和CDH1 rs16260[FAS p＝0.049])可显示的(表4)。
表4：在PP或FAS群体中在临床结局与SNP基因型之间显示出统计学相关性的SNP。
Figure BPA0000248867100000742
(卡方检验，统计学显著性：p＜0.05)
在响应者/非响应者患者中检查SNP基因型的代表性过高或代表性不足可允许为统计学上显著的频率差异提供科学解释。
两个SNP(rs11615(ERCC1)和rs396991(FCGR3A))的基因型与PP群体中延长的无进展存活(PFS)相关(表5)。
表5：在PP群体中在延长的PFS与SNP基因型之间显示出统计学相关性的SNP。
Figure BPA0000248867100000751
对于所列出的9个SNP中的每一个，每个SNP统计学检验的患者数目为21(PP)和39(FAS)。
FCGR2A rs1801274[C/T]：在PP中，携带杂合rs1801274[CT]基因型的所有患者都确实是响应者(8)，这反映在统计学检验的高显著性p值(0.0004)。所有PR患者(4个中的4个)都显示该基因型。大多数非响应者(73％，11个中有8个)显示纯合[TT]基因型(表6)。这种基因型分布模式也可见于FAS群体中，但是不如PP群体中明显(表7)。FAS群体中的多个非响应者患者也具有[CT]基因型(30％)，这导致较不明显但仍具有高统计学显著性的p值。
表6：PP患者中的rs1801274(FCGR2A)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000761
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
表7：FAS患者中的rs1801274(FCGR2A)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000771
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析FCGR2A rs1801274[C/T]：预计响应者群体中rs1801274基因型[CT]的高显著性过高代表也反映在与延长无进展存活(PFS)时间的相关性。实际上，在两个群体PP(图3)和FAS(图4)中，[CT]基因型也都与延长的PFS高度显著性相关(PP p＝0.0007，FAS p＝0.03)。但是感兴趣的是，在前60个治疗日期间，与具有[CC]或[CT]基因型的患者相比，具有[TT]基因型的FAS患者显示出更高PFS率的趋势。因此，存活分析证实rs1801274(FCGR2A)是具有预测或预后性质的非常令人感兴趣的推定生物标志物候选物。
IL-10 rs1800896[A/G]：在PP中，非响应者患者均未携带纯合rs1800896[GG]基因型(表8)。这种基因型在响应者患者中以升高的频率(40％)发现(10个中有4个)。10个响应者中只有1个(10％)显示[AA]基因型，其余的响应者显示杂合[GA]基因型。在FAS中，可以观察到可比较的基因型频率分布(表9)，但是在该群体中的非响应者患者中可以以低频率观察到[GG]基因型(11％，27个中的3个)。
表8：PP患者中的rs1800896(IL-10)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000781
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
表9：FAS患者中的rs1800896(IL-10)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000791
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析rs1800896(IL-10)[A/G]：在响应者患者中rs1800896[GG]基因型显著代表性过高。[GG]基因型与PFS的统计学相关性显示，在PP和FAS群体中，[GG]基因型与PFS无显著相关性(PP p＝0.27(图5))；FAS p＝0.08，(图6))。然而，FAS存活相关性的p值接近显著性，这可指示在统计噪声降低的较大群体中，显著性可很好地达到。总体而言，rs1800896(IL-10)是令人感兴趣的推定生物标志物候选物。
DNMT3A rs1550117[G/A]：在PP中，4个响应者(40％)显示[GA]基因型，而所有的非响应者均显示[GG]基因型(p＝0.03，表10)。
表10：PP患者中的rs1550117(DNMT3A)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000801
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析rs1550117(DNMT3A)[G/A]：在PP群体的响应者患者中，rs1550117[GA]基因型显著代表性过高。在FAS群体中，[GA]与[GG]携带者之间的PFS差异具有边界显著性(FAS p＝0.058)(图7)。
在FAS群体中，仅一位患者是[AA]基因型的携带者。
SMAD4 rs12456284[G/A]：在FAS中，在响应者群体中可发现相对于[AA]和[GG]基因型，[GA]基因型在统计学上显著代表性过高(12位患者中的7位，58％)(p＝0.023，表11)。在FAS非响应者群体中，[GA]基因型的频率可以以19％的频率(27个非响应者中的5个)存在。在PP群体中，这种关联由趋势显著性所指明(p＝0.081，数据未示出)。
表11：FAS患者中的rs12456284(SMAD4)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000811
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析rs12456284(SMAD4)[G/A]：rs12456284[GA]基因型在FAS响应者患者中显著代表性过高，并且在PP响应者中呈现相同的趋势。rs12456284基因型与PFS的统计学相关性显示，在PP群体中，使用Gehan-Brelow-Wilcoxon检验，[GA]基因型与PFS显著相关(PPp＝0.048)(图8)，而使用对数秩检验的显著性为p＝0.35。与对数秩检验相比，Gehan-Brelow-Wilcoxon检验在早期时间点给予PFS事件较高的权重，并且实际上在该IIa期临床试验的各前100天期间，[GA]与[AA]携带者之间的差异最显著。在FAS群体中，[GA]基因型与PFS没有显著相关性(p＝0.20(对数秩)，p＝0.23(Gehan-Brelow-Wilcoxon))，但是目测检查表明[GA]携带者具有延长PFS的趋势。
MUC1 rs4072037[A/G]：在FAS中，在响应者群体中发现具有最高频率67％的rs4072037基因型是[AA](12个中的8个)，而非响应者仅在26％患者中显示该基因型(27个中的7个)。响应者患者都不显示纯合[GG]基因型(表12)，而非响应者以22％的比例显示[GG]基因型(27个中的6个)。响应者和非响应者FAS患者中的该差异基因型分布是统计学上显著的(p＝0.03)。在PP群体中发现相当的基因型分布模式(数据未示出)，其中响应者显示与FAS群体中几乎相同的相对[AA]基因型频率70％(10个中的7个)(趋势显著性p＝0.11)。
表12：FAS患者中的rs4072037(MUC1)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000831
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析rs4072037(MUC1)[A/G]：响应者患者中rs4072037基因型[AA]的显著代表性过高可表明这种基因型与PFS的相关性。统计学检验显示，在PP和FAS群体中，[AA]基因型与PFS显著相关(PP p＝0.001，(图9)；FAS p＝0.02，(图10))。该存活分析证实rs4072037(MUC1)是非常令人感兴趣的推定预测性或预后生物标志物候选物。
EGF rs4444903[G/A]：在FAS中，与非响应者群体相比(27个中有3个；11％)，rs4444903基因型[AA]在响应者群体中显著代表性过高(p＝0.049)(12个中有5个；42％)(表13)。在PP群体中，这种不对称分布没有统计学显著性(p＝0.32，数据未示出)。
表13：FAS患者中的rs4444903(EGF)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000841
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析rs4444903(EGF)[G/A]：PP或FAS群体中rs4444903[AA]基因型与PFS的相关性无统计学显著性(FAS p＝0.1；PP p＝0.16)。然而，在PP和FAS两个群体中都可观察趋于延长PFS的趋势(图11)。
CDH1 rs16260[C/A]：在FAS中，与非响应者群体(27个中的3个，11％)相比，rs16260基因型[AA]在响应者中以显著更高的频率存在(12个中的5个，42％)(p＝0.049，表14)。在PP中，两个患者组之间的这种不对称分布不显著(p＝0.72，数据未示出)。
表14：FAS患者中的rs16260(CDH1)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000851
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析rs16260(CDH1)[C/A]：在FAS群体中，rs16260(CDH1)基因型[AA]与PFS的相关性接近统计学显著性(对数秩检验p＝0.065，Gehan-Brelow-Wilcoxon检验p＝0.032)(图12)。
ERCC1 rs11615[C/T]：在PP中，发现响应者群体中具有较高rs11615基因型[TT]频率(10个中有3个；30％)的趋势(p＝0.068；非响应者群体(0％))。相反，纯合[CC]基因型仅在非响应者群体(2位患者)中存在(表15)。
表15：PP患者中的rs11615(ERCC1)基因型以及在响应者(PR和SD)和非响应者患者(PD)中各自的频率的列表。
Figure BPA0000248867100000861
RESP：响应者，NONRESP：非响应者，PFS：无进展存活，abs freq.：绝对频率，relfreq.：相对频率
存活分析rs11615(ERCC1)[C/T]：rs11615[TT]基因型仅在PP群体中的响应者群体中存在。rs11615基因型与PFS的统计学相关性显示PP中的rs11615基因型与PFS高度显著性地相关，其中与[CC]携带者相比，[CT]和[TT]携带者显示出延长的存活(PP p＝0.0001)(图13)。尽管该突出的显著性值，但应注意，PP中只有2位具有[CC]基因型的患者和3位具有[TT]基因型的患者。然而，在FAS群体中，作为趋势可以观察到相同的效应(FAS p＝0.13，数据未示出)，表明该效应在较大的患者群体中也是有效的。
存活分析FCGR3A rs396991[T/G]：在PP或FAS中，SNP rs396991的基因型均不与临床结局相关(FAS p＝0.49；PP p＝0.29，数据未示出)。然而，PP群体中的存活分析以高统计学显著性表明，与[GG]相比，具有基因型[TG]和[TT]的患者显示出改善的PFS(p＝0.0007，图14)。这种效应也可在FAS群体中观察到(p＝0.25；数据未示出)。尽管PP群体达到显著性值，但应注意，只有3位PP患者是[GG]携带者。
实施例3：伴随免疫多态性分析的讨论
该临床IIa期试验的主要目的是评价治疗性抗CLDN18.2单个核抗体IMAB362在患有胃食管腺癌的患者中的安全性和效力。此外，对遗传免疫应答多态性进行伴随分析以评价可用作与IMAB362治疗相关的潜在预测性或预后性生物标志物的参数。
描述性免疫多态性分析的讨论
已显示患者基因组中的遗传多态性改变治疗性抗体的响应率。为了研究单独遗传变异对响应率的影响，在患者中确定在免疫应答和胃癌易感性或进展中具有已知或推定作用的51个单核苷酸多态性(SNP)的基因型。
在该研究中，对54位研究患者中53位的51个SNP成功进行了基因分型。对于5个SNP，可检测到与对照群体相比患者群体中基因型频率的统计学显著变化。先前已经显示这些SNP中的4个与癌症/胃癌易感性相关。在研究群体中，这4个SNP各自的癌症/胃癌相关基因型均代表性过高，如在患有晚期GC的患者群体中预期的。各自纯合基因型的代表性过高可指示隐性作用模式，暗示与增强的基因活性相对的受损基因功能。这由公开的数据所强调，例如，已报道CDH1中SNP rs16260的胃癌相关AA基因型引起CDH1表达的下调，原因是其在CDH1的启动子中的位置在-160处。
研究了参与免疫信号传导的基因中的多态性，即使这些多态性以前未被描述为胃癌风险因子。已显示编码免疫信号传导因子的基因中的遗传多态性显著地调节发生胃癌的风险。因此，基于抗体的癌症治疗的响应率也可能受这些SNP影响。
患者群体中代表性过高的IL-2基因型GG(SNP rs2069762)与由幽门螺杆菌(H.pylori)感染诱发的胃萎缩的风险提高有关，并且可易患胃癌。CTLA4SNP rs231775和rs2274223(PLCE1)基因型已被描述为GC易感性风险因子。然而，由于关于rs231775的已公开研究在基因型的序列上相矛盾，在此不会得出结论。本研究中研究了Fcγ受体和补体系统多态性。在4位APT患者中检测到编码Val/Val[GG]的可能有益的FCGR3A基因型，在12位APT患者中可检测到具有潜在不利影响的FCGR2A基因型(Arg/Arg)[CC]。
已经证明作为第二效应机制的CDC也受SNP多态性影响：补体组分C1qA中多态性([276A-＞G]，rs172378)的A等位基因携带者在利妥昔单抗治疗滤泡性淋巴瘤后表现出延长的响应。在10位患者中检测到具有基因型‘GG’的C1QA中的补体系统多态性，可能会不利地影响响应。然而，补体组分C1S中的SNP多态性rs12146727迄今仅在与抗体治疗或癌症不相关的筛选中被描述。
患者与对照群体之间显著性基因型频移的确定表明SNP基因型频移可用作临床研究中的预测性和预后性标志物。
SNP风险等位基因的累积也可对患者的临床结局产生影响。为了允许这样的分析，对每位患者计数纯合SNP风险基因型的数目。这些数目与治疗响应的相关性可深入了解SNP风险因子积累的作用。
SNP基因分型与临床结局的相关性的讨论
FCGR2A rs1801274：
检查代表性过高或代表性不足的FCGR2A基因型显示，在PP群体中，所有具有杂合rs1801274基因型[CT]的患者均为响应者患者，并且具有部分响应(PR)的患者仅具有该基因型。非响应者群体中代表性过高的纯合基因型是[TT]。仅观察这些频率分布不允许得出[CT]基因型是否是有益的或者[TT]是否是不利的结论。在大多数研究SNP基因型影响的研究中，各自的纯合基因型显示出最强的生物学效应，表明通常是隐性作用模式，反映两个等位基因与增强的基因活性相对的受损基因功能。在SNP等位基因导致遗传活性提高的情况下，经常可观察到生物学效应的逐步效应：一个等位基因(即，杂合的)提高基因活性，两个等位基因(即，纯合的)甚至更加提高基因活性。在功能获得或功能丧失两种情况下，通常在具有纯合基因型的患者中观察到最强的生物学/临床效应。在这种假设下，在PP和FAS群体中的非响应者群体中纯合[TT]基因型的代表性过高将导致不利影响。
然而，这是出乎意料的，因为rs1801274 FCGR2A[TT]基因型已经在许多临床研究中被描述为对PFS具有延长效应的因子。在我们的IIa期临床试验中，更严格检查FAS非响应者患者中基因型与PFS之间的关联表明，在治疗的前60天期间，具有[TT]基因型的FAS PD患者确实显示更高PFS时间的趋势，如与具有[CT]基因型的FAS PD患者相对(比较表7和图4)的那样。对于使这一观察结果与具有延长PFS的响应者中[TT]代表性不足一致的解释可以是两种不同分子机制的叠加：首先，rs1801274[CT]基因型可以是响应者患者的标志物。这是迄今为止文献中尚未描述的新观察结果，并且这可表明这种基因型是IMAB362治疗的预测性标志物。这一新观察结果潜在的分子机制尚未得到解决。
在文献中针对其他治疗性抗癌抗体已经描述的第二观察结果会是具有FCGR2A[TT]基因型的患者的延长PFS。在我们的IIa期研究中，这种效应是由于仅可在非响应者患者中作为一种趋势观察到的推断的第一机制的叠加。在机制上，第二观察结果可通过如与纯合FCGR2A 131Arg/Arg受体等位基因(由[CC]基因型编码)的结合亲和力较弱相对，IgG1抗体与FCGR2A 131 His/His受体等位基因(由[TT]基因型编码)的结合亲和力提高来解释：在系统性研究Fcγ受体多态性影响的研究中，最近已经显示，IgG1同种型的抗体的确以不同的亲和力与Fcγ受体IIA的两种等位基因形式结合，与R131相比，H131具有较高的亲合力。通常推定IgG抗体与FCGR2A受体等位基因的差异亲和力影响效应机制的触发速率，并且因此在携带高亲和力受体等位基因的患者中影响延长PFS。报告提供了支持该假设的数据，其显示Fcγ受体多态性FCGR2A H131R和FCGR3A F176V(Phe＞Val，rs396991)可对基于曲妥珠单抗的IgG1抗体治疗在转移性乳腺癌患者中的临床效力有影响。具有基因型FCGR3A176Val/Val和FCGR2A 131 His/His的患者显示出显著更好的响应率和无进展存活。相同的多态性也与利妥昔单抗(IgG1)治疗的B细胞淋巴瘤患者的响应率相关。在另一项研究中，西妥昔单抗(IgG1)治疗后的延长PFS可与FCGR3A 176Val/Val基因型相关。有争议的是，最近有很权威的研究报道Fcγ受体多态性与关于抗体所讨论的存活、响应率或无进展存活之间无关联。在乳腺癌国际研究组(Breast Cancer International Research Group，BCIRG)的BCIRG-006试验中，1218位患者在随机研究中以两个含有曲妥珠单抗的组和一个无曲妥珠单抗的对照组进行治疗。无法确认以上报道的Fcγ受体多态性与曲妥珠单抗效力之间的关联。关于滤泡性淋巴瘤中与化学治疗组合使用利妥昔单抗对460位患者进行长期研究报告Fcγ受体多态性与无进展存活没有关联。在其中患者接受氟达拉滨和环磷酰胺(FC)或利妥昔单抗加FC的具有419位患者的REACH试验中，FCGR2A和FCGR3A多态性并没有显著影响结果。最近的西妥昔单抗试验也得到不一致的研究结果，不推荐Fcγ受体多态性作为可用的生物标志物。这可反映出内在群体因素或并行化学治疗方案中的差异。
MUC1 rs4072037：
MUC1是黏蛋白家族的跨膜糖蛋白。黏蛋白是高分子量蛋白质，其在N端细胞外结构域中被寡糖和n-聚糖链广泛地O-糖基化。黏蛋白在肝、胰和肾中内衬于呼吸和胃肠之道和管的上皮的顶端表面上表达。跨膜黏蛋白以一个α-螺旋跨越膜并用其糖链提供对细胞外空间的保护性衬里。分泌到细胞外空间的黏蛋白构建黏液凝胶层，其用作上皮的额外物理保护。跨膜MUC1以及分泌的黏蛋白MUC5C和MUC6是在胃中表达的主要黏蛋白。MUC1翻译为单多肽链，其进行自动切割。N端细胞外结构域(MUC1-N)最初保持与跨膜/胞质内结构域(MUC1-C)非共价连接。这种胞质内结构域用作信号传导结构域，其可以进入细胞核并与许多转录因子缔合以直接活化基因表达。细胞应激可导致MUC1-N和MUC1-C结构域通过第二蛋白水解位点进行蛋白水解切割。这也可在癌细胞中观察到，其中MUC1不再以有序的方式在细胞的顶膜表达，而是可发现在整个细胞过表达并定位。后果是细胞外结构域(也称为CA15-3)向细胞外空间的脱落和MUC1-C的细胞内定位。胞质内信号传导结构域充当癌基因(例如通过活化Wnt/β-联蛋白信号传导和阻断凋亡途径)。
然而，MUC1的细胞外结构域不仅是静态结构组分，而且在细胞膜的信号传导事件期间发挥重要作用。已经证明MUC1细胞外结构域的糖基化和表达状态调节膜信号传导分子和细胞外基质的相互作用。已经报道肿瘤细胞中糖基化不足的MUC1-N提高膜分子(如ICAM-1或E-选择蛋白)和MUC1核心蛋白之间的信号传导。此外，黏蛋白表达和糖基化状态看来掩盖膜缔合分子。在癌细胞中，通过黏蛋白表达掩盖HER2蛋白已被描述为曲妥珠单抗治疗的可能抗性机制。
MUC1多态性rs4072037‘A’等位基因已被描述为胃癌易感性的风险因子。该多态性是外显子2中的G-＞A交换，这导致MUC1恰好在MUC1的预测信号肽切割位点中选择性剪接。信号肽的缺陷切割可导致异常的MUC1蛋白定位或糖基化模式，并因此导致蛋白质功能缺陷。
在该IIa期临床试验中，已发现rs4072037[AA]基因型与响应者群体统计学相关。可以推断，MUC1的糖基化不足或表达不足[AA]等位基因形式允许IMAB362更好地接近在癌细胞上表达的膜靶分子CLDN18.2，因此提升治疗效力。这使rs4072037成为预测性生物标志物。
IL-10 rs1800896：
IL-10是具有多效性功能的免疫系统的关键调节剂。已知IL-10通过抑制巨噬细胞依赖性抗原特异性T细胞增殖和通过T细胞对细胞因子的巨噬细胞依赖性产生而用作抗炎性免疫抑制性细胞因子。然而，IL-10也被描述为免疫刺激性细胞因子，增强B细胞、粒细胞和肥大细胞分化和生长以及NK细胞和CD8+T细胞活化。IL-10的多效性潜能还通过在许多免疫细胞类型(包括Th2细胞、Treg细胞、Th3细胞、NK T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞)中IL-10的广泛表达反映。IL-10的这种双重作用反映在肿瘤促进以及肿瘤抑制潜能：由肿瘤细胞或肿瘤浸润性免疫细胞(如巨噬细胞)分泌的IL-10允许肿瘤细胞通过已经仅部分阐明的机制逃避免疫监视。所描述的一种机制涉及通过免疫调节性细胞因子(如IL-10)的表达而有助于诱导外周耐受的Treg细胞。报道的另一种机制是抑制肿瘤相关抗原通过树突细胞的交叉呈递，并因此防止T细胞开始针对肿瘤细胞的有效免疫应答。另一方面，恶性肿瘤细胞对IL-10的展示导致HLA I类蛋白的下调，从而导致NK细胞细胞毒性的敏感性提高。
因为已报道‘G’等位基因作为胃癌风险因子和肾癌风险因子，因此在位置(-1082)的IL-10启动子多态性rs1800896是令人感兴趣的。已报道与‘A’等位基因相比，这种多态性的‘G’等位基因在体外与IL-10表达降低相关。在该IIa期临床试验的响应者患者中，rs1800896的[GG]基因型代表性过高，这可能表明IL-10的相对表达水平较低。可推断携带[GG]基因型的患者具有较低的IL-10表达，这进而可使得肿瘤细胞更加难以通过上述机制之一逃避免疫监视。实际上，12位FAS响应者患者都不显示升高的IL-10血清水平，如与22％的FAS非响应者患者(所测量的27位中有6位)相对。然而，另一些作者指出，‘A’等位基因与IL-10表达降低相关。
还应指出，IL-10通过细胞内介质Stat3传导信号，并且Stat3活化依赖于MUC1-C。因此，MUC1与IL-10的功能相互作用可以是在该IIa期临床试验中这两种分子均被证明是统计学上显著的生物标志物候选物的原因。最后，FCGR2A在巨噬细胞上表达，巨噬细胞通常是肿瘤微环境中IL-10的主要来源。如果这些推定生物标志物候选物在正进行和未来的研究中盛行，则对这些因子的功能相互作用的研究可相当令人感兴趣。
rs1550117(DNMT3A)：
rs1550117是DNMT3A基因中的SNP，所述基因编码催化甲基转移到DNA中的特定CpG结构从而诱导表观遗传修饰的酶DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A。已经表明，与[GG]或[GA]相比，基因型[AA]赋予提高的胃癌风险。在这项研究中，在FAS群体中的仅一位患者中和在PP群体中没有患者中可发现[AA]。这可表明[AA]也赋予存活风险，防止在该IIa期临床试验中对[AA]携带者进行三线和四线治疗。[GA]与PP中临床结局显著相关的发现表明该标志物具有作为IMAB362治疗的预测性生物标志物的潜力。
rs12456284(SMAD4)：
rs12456284是SMAD4基因中的SNP，所述基因编码细胞内TGFβ/BMP信号传导共转导子“母亲DPP同源物4”。已经公布[GG]基因型显著降低胃癌的风险。在FAS响应者群体中杂合[GA]基因型相对于[AA]基因型在统计学上显著代表性过高表明这种基因型可用作预测性生物标志物。携带[GA]的PP群体患者的延长PFS是支持性事实。
rs4444903(EGF)：
观察到EGF基因启动子区中的功能多态性rs4444903调节EGF蛋白水平，在[GG]携带者的血清中检测到较高量的EGF因子。该多态性的G等位基因和[GG]基因型在meta分析中显示与胃肠癌风险提高的显著相关性。
在该IIa期临床试验中，基因型[AA]在FAS响应者中显著代表性过高，并且具有这种基因型的患者在FAS和PP群体中显示出延长PFS的趋势。这可表明rs4444903[AA]基因型是预测性或预后性生物标志物。
rs16260(CDH1)：
细胞黏附蛋白钙黏着蛋白1(E-钙黏着蛋白)是钙依赖性钙黏着蛋白超家族的成员。功能丧失已与癌症的进展有关。已经证明CDH1启动子中的rs16260[A]等位基因降低钙黏着蛋白1的转录效率。此外，CDH1的-160A等位基因已被描述为胃癌发生的易感性因子。
在这项研究中，rs16260[AA]基因型携带者在FAS响应者中在统计学上代表性过高。这可表明[AA]基因型是推定的预测性生物标志物。
rs11615(ERCC1)和rs396991(FCGR3A)：
两种SNP，rs11615(ERCC1，DNA修复蛋白“切除修复交叉互补组1(Excision repaircross-complementation group 1)”)和rs396991(FCGR3A，低亲和力免疫球蛋白γFc区受体III-A)二者均显示基因型(ERCC1[TT]、FCGR3A[TG]和[TT])与延长的PFS相关。这可表明这些SNP是预测性或预后性生物标志物。
Figure BPA0000248867100000941
新国际专利申请
加尼梅德药物公司(Ganymed Pharmaceuticals AG)等
“用于预测癌症治疗之治疗效力和癌症预后的方法和组合物”
我方案号：342-85PCT
________________________________________
生物材料的附加页
另外保藏物的识别
1)保藏物(DSM ACC2738、DSM ACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSM ACC2743、DSM ACC2745、DSM ACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748)的保藏机构的名称和地址：
DSMZ-德国微生物菌种和细胞培养物保藏中心
Mascheroder Weg 1b
38124 Braunschweig
DE
2)保藏物(DSM ACC2808、DSM ACC2809、DSM ACC2810)的保藏机构的名称和地址：
DSMZ-德国微生物菌种和细胞培养物保藏中心
Inhoffenstr.7 B
38124 Braunschweig
DE
Figure BPA0000248867100000951
Figure BPA0000248867100000961
关于所有上述保藏物的其他说明：
-与小鼠(Mus musculus)脾细胞融合的小鼠(Mus musculus)骨髓瘤P3X63Ag8U.1
-分泌针对人密封蛋白-18A2之抗体的杂交瘤
3)保藏人：
所有上述保藏均由以下保藏人进行：
加尼梅德药物公司
Freiligrathstraβe 12
55131 Mainz
DE
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Claims (9)

1.用于对一种或更多种SNP进行基因分型的试剂用于制备用于评估以下的诊断剂的用途：
(i)患有肿瘤抗原阳性肿瘤的癌症患者是否是用针对所述肿瘤抗原之抗体治疗的响应者，和/或
(ii)患有肿瘤抗原阳性肿瘤的癌症患者是否将响应于用针对所述肿瘤抗原的抗体的治疗经历无进展存活，
其中所述肿瘤抗原为CLDN18.2蛋白，并且
其中所述抗体为单克隆抗体，其通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)来发挥作用，
所述评估包括确定从所述患者获得的样品中选自以下的一种或更多种单核苷酸多态性的基因型：FCGR2A rs1801274和FCGR3A rs396991，其中
(a)杂合FCGR2A rs1801274[CT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低；
(b)纯合FCGR2A rs1801274[TT]基因型或纯合FCGR2A rs1801274[CC]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险提高和/或癌症患者不经历无进展存活的风险提高；并且
(c)杂合FCGR3A rs396991[TG]基因型或纯合FCGR3A rs396991[TT]基因型的存在指示癌症患者不是用所述抗体治疗的响应者的风险降低和/或癌症患者不经历无进展存活的风险降低。
2.权利要求1所述的用途，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:17或51所示氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列。
3.权利要求1所述的用途，其中对用所述抗体治疗无响应性包括以下一种或更多种的相对降低：存活、无进展存活、无复发存活、无远处复发存活和病情稳定。
4.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述样品为包含DNA的样品。
5.权利要求4所述的用途，其中所述DNA已从血液中提取。
6.权利要求4所述的用途，其中所述DNA已从所述患者的身体样品中提取。
7.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述肿瘤为实体瘤。
8.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述肿瘤为胃食管肿瘤或其转移肿瘤。
9.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述肿瘤为晚期的胃或下食管腺癌。
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