ES2787708T3 - Métodos y composiciones para la predicción de la eficacia terapéutica de tratamientos contra el cáncer y el pronóstico del cáncer - Google Patents

Métodos y composiciones para la predicción de la eficacia terapéutica de tratamientos contra el cáncer y el pronóstico del cáncer Download PDF

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Abstract

Un método para evaluar (i) si un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo a un antígeno tumoral es un respondedor al tratamiento con un anticuerpo contra el antígeno tumoral, y/o (ii) si un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo a un antígeno tumoral, experimentará una supervivencia libre de progresión, en donde el antígeno tumoral es la proteína CLDN18.2; dicho método que comprende determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en rs4072037 de MUC1, rs1800896 de IL-10, rs1550117 de DNMT3A, rs12456284 de SMAD4, rs4444903 de EGF, rs16260 de CDH1, y rs11615 de ERCC1 en una muestra obtenida de un paciente, en donde (a) la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 [AA] de MUC1 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; (b) la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 [GG] de MUC1 indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; (c) la presencia del genotipo homocigoto rs1800896 [GG] de IL-10 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; (d) la presencia del genotipo heterocigoto rs1550117 [GA] de DNMT3A indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; (e) la presencia del genotipo heterocigoto rs12456284 [GA] de SMAD4 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; (f) la presencia del genotipo homocigoto rs4444903 [AA] de EGF indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; (g) la presencia del genotipo homocigoto rs16260 [AA] de CDH1 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; y (h) la presencia del genotipo homocigoto rs11615 [TT] de ERCC1 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para la predicción de la eficacia terapéutica de tratamientos contra el cáncer y el pronóstico del cáncer
Campo técnico de la invención
La invención se refiere generalmente a métodos y composiciones para la predicción de la eficacia terapéutica de tratamientos contra el cáncer y el pronóstico del cáncer. La invención describe marcadores que se asocian con resultados favorables y desfavorables, respectivamente, en ciertos tratamientos contra el cáncer y son útiles como marcadores pronósticos para el cáncer. Se describen métodos que involucran estos marcadores para predecir el beneficio de la terapia contra el cáncer y pronosticar el resultado clínico para pacientes con cáncer.
Antecedentes de la invención
Los cánceres del estómago y el esófago (gastroesofágico; GE) se encuentran entre los tumores malignos con la mayor necesidad médica insatisfecha. El cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte en todo el mundo. La incidencia de cáncer de esófago ha aumentado en las últimas décadas y la tasa general de supervivencia en cinco años para el cáncer GE es del 20-25 %, a pesar de la agresividad del tratamiento estándar establecido asociado con efectos secundarios sustanciales. La necesidad médica de los pacientes que padecen este tipo de cáncer es alta y se requieren fármacos innovadores.
La molécula de la unión estrecha claudina 18 isotipo 2 (CLDN18.2) es una variante de empalme asociada al cáncer de la Claudina 18 [Niimi, T., y otros, Mol Cell Biol, 2001. 21(21): p. 7380-90; Tureci, O., y otros, Gene, 2011. 481(2): p. 83-92]. La CLDN18.2 es una proteína transmembrana de 27,8 kDa que comprende cuatro dominios transmembrana con dos pequeños bucles extracelulares (bucle 1 abarcado por la región hidrófoba 1 y la región hidrófoba 2; bucle 2 abarcado por las regiones hidrófobas 3 y 4). La CLDN18.2 es un antígeno de linaje gástrico altamente selectivo, expresado exclusivamente en células epiteliales gástricas diferenciadas de corta duración y no detectable en ningún otro tejido humano normal. El antígeno se expresa ectópicamente a niveles significativos en una diversidad de cánceres humanos, lo que incluye el cáncer gastroesofágico y el pancreático [Sahin, U., y otros, Clin Cancer Res, 2008. 14(23): p. 7624-34]. La proteína CLDN18.2 se detecta con frecuencia, además, en metástasis de ganglios linfáticos de cáncer gástrico y en metástasis distantes. La CLDN18.2 parece involucrarse en la proliferación de células tumorales positivas para CLDN18.2, ya que la regulación negativa del objetivo mediante la tecnología ARNip resulta en la inhibición de la proliferación de células de cáncer gástrico.
El IMAB362 es un anticuerpo monoclonal quimérico del subtipo IgG1 dirigido contra la CLDN18.2. El IMAB362 reconoce el primer dominio extracelular de la CLDN18.2 con alta afinidad y especificidad y no se une a ningún otro miembro de la familia claudina, lo que incluye la variante 1 de empalme estrechamente relacionada de la Claudina 18 (CLDN18.1).
En xenoinjertos humanos que expresan CLDN18.2 se han observado beneficios de supervivencia y regresiones tumorales en ratones después de la administración del IMAB362. Cuando se administra por vía intravenosa en especies animales relevantes, no se observa toxicidad en el tejido gástrico ya que el epítopo objetivo no es accesible. Sin embargo, el objetivo del tumor se vuelve accesible para el IMAB362 durante la transformación maligna. El IMAB362 agrupa cuatro mecanismos de acción independientes altamente potentes: (i) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), (ii) citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), (iii) inducción de apoptosis inducida por reticulación del objetivo en la superficie del tumor y (iv) inhibición directa de la proliferación.
Un ensayo previo de fase I evaluó el IMAB362 como monoterapia en una dosis única en pacientes con cáncer gastroesofágico en etapa tardía (documento WO2014/146672). En este ensayo se aplicaron como monoterapia cinco dosis de IMAB362 (33, 100, 300, 600 y 1000 mg/m2). Este estudio muestra que una sola administración de este anticuerpo es segura y bien tolerada en una dosis de hasta 1000 mg/m2, ya que no pudieron observarse diferencias relevantes en el perfil de a E y otros parámetros de seguridad entre los grupos de dosis (Ae = evento adverso). Se obtuvieron los mejores resultados con respecto a la actividad antitumoral para los grupos de 300 mg/m2 y 600 mg/m2. En dos pacientes del grupo de 300 mg/m2 la enfermedad se controló y como solo tenían lesiones no objetivo se clasificaron como no CR, no PD (Cr = respuesta completa; PD = enfermedad progresiva). La duración de no CR, no PD fue de aproximadamente dos meses y seis semanas, respectivamente. Los niveles de marcadores tumorales de estos tres pacientes se mantuvieron estables. Un paciente en el grupo de 600 mg/m2 presentó enfermedad estable (SD). La duración de la SD fue de aproximadamente 2 meses.
Sobre la base de los mecanismos de acción altamente potentes para la muerte celular inducida del IMAB362, el beneficio de supervivencia de los ratones tratados con IMAB362 que portan un tumor positivo para la CLDN18.2, la ausencia de cualquier indicación de toxicidad relacionada con IMAB362 y los resultados prometedores del ensayo de fase I, se inició un estudio de fase IIa. Este ensayo clínico de fase IIa se realizó para determinar la seguridad, la tolerabilidad y la actividad antitumoral de dosis repetidas de IMAB362 en pacientes con enfermedad metastásica, refractaria o recurrente de adenocarcinoma avanzado del estómago o el esófago inferior comprobada mediante histología.
En este ensayo de fase IIa, el fármaco en investigación se aplicó en tres cohortes, que se reclutaron secuencialmente. Una primera cohorte de tres pacientes recibió dosis repetidas de IMAB362 a un nivel de dosis más bajo (300 mg/m2 de área superficial corporal). El anticuerpo se administró como una infusión intravenosa de 2 h. Como no se detectó ninguna indicación de toxicidad relacionada con IMAB362 en la primera cohorte, la dosis de IMAB362 de la segunda cohorte (tres pacientes) se aumentó a 600 mg/m2 de área superficial corporal. En una tercera cohorte, 19 pacientes se asignaron con la misma dosis (aplicación repetida de 600 mg/m2 de área superficial corporal). Las muestras de los pacientes de esta cohorte se analizaron por varias pruebas analíticas complementarias, es decir, ADCC, CDC, inmunofenotipaje y polimorfismos inmunitarios genéticos. Todos los pacientes de todas las cohortes han recibido dosis repetidas de IMAB362 cada dos semanas en las visitas 2, 5, 6, 7 y 8 (5 aplicaciones).
La discrepancia de los tumores positivos al antígeno (que sobreexpresan el antígeno objetivo en un grado similar) con respecto a la capacidad de respuesta a la intervención con anticuerpos monoclonales terapéuticos tales como IMAB362 sugiere que hay factores adicionales que se asocian con el resultado de la terapia. Esto exige una selección cuidadosa de los pacientes que pueden beneficiarse de la terapia con anticuerpos.
Documentos de la técnica anterior Mellor y otros, 2013 (Journal of Hematology & Oncology 6: 1-10) y Zhang y otros, 2007 (Journal of Clinical Oncology 25: 3712-3718) informan que los polimorfismos específicos en los receptores gamma Fc FCGR2A y FCGR3A afectan el grado de la respuesta ADCC observada en el tratamiento de pacientes con cáncer con cetuximab, rituximab y trastuzumab monoclonales. Sin embargo, estos estudios solo permiten conclusiones limitadas sobre la capacidad de respuesta de tumores positivos para la CLDN18.2 a un régimen de tratamiento basado en un anticuerpo monoclonal dirigido a la CLDN18.2. Por lo tanto, existe la necesidad desarrollar una prueba para medir la elegibilidad de los pacientes para la terapia con anticuerpos. La presente invención aborda esta necesidad al proporcionar marcadores que se asocian con resultados favorables y desfavorables, respectivamente, en la terapia con anticuerpo. Además, la presente invención demuestra que estos marcadores son útiles como marcadores para pronosticar el resultado clínico para pacientes con cáncer.
Los hallazgos presentados en la presente descripción pueden usarse para seleccionar un tratamiento adecuado para un paciente con cáncer y, en particular, para decidir si la terapia con anticuerpos debe administrarse a un paciente con cáncer.
Resumen
La presente enseñanza proporciona métodos de genotipado de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido), tales como para su uso para evaluar la posibilidad de un individuo de responder a un tratamiento terapéutico para el cáncer, para seleccionar un tratamiento o régimen preventivo (por ejemplo, para decidir si se administrará o no un agente terapéutico particular a un individuo que tiene cáncer, o que tiene un riesgo aumentado de desarrollar cáncer en el futuro), o para evaluar el pronóstico de un individuo para determinar la gravedad de la enfermedad y la recuperación.
La presente enseñanza se basa en el hallazgo de que ciertos genotipos para SNP se asocian con la sensibilidad/no sensibilidad del cáncer hacia el tratamiento con anticuerpos, tal como el tratamiento del cáncer positivo para la CLDN18.2, en particular el cáncer gastroesofágico positivo para la CLDN18.2 con IMAB362. La presente enseñanza se basa, además, en el hallazgo de que ciertos genotipos para SNP se asocian con el resultado clínico para pacientes con cáncer y, por lo tanto, son útiles para el pronóstico del cáncer.
En un aspecto, la enseñanza se refiere a un método para evaluar
(i) si un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo a un antígeno tumoral es un respondedor al tratamiento con un anticuerpo contra el antígeno tumoral, y/o
(ii) si un paciente con cáncer, preferentemente, un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo al antígeno tumoral, experimentará una supervivencia libre de progresión,
dicho método comprende determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en rs1801274 de FCGR2A, rs4072037 de MUC1, rs1800896 IL-10, rs1550117 de DNMT3A, rs12456284 de SMAD4, rs4444903 de EGF, rs16260 de CDH1, rs11615 de ERCC1 y rs396991 de FCGR3A en una muestra obtenida del paciente.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo heterocigoto rs1801274 de FCGR2A [CT] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo homocigoto rs1801274 de FCGR2A [TT] y/o el genotipo homocigoto rs1801274 de FCGR2A [CC] indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 de MUC1 [AA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión. En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 de MUC1 [GG] indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs1800896 de IL-10 [GG] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión. En una modalidad, la presencia del genotipo heterocigoto rs1550117 de DNMT3A [Ga ] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión. En una modalidad, la presencia del genotipo heterocigoto rs12456284 de SMAD4 [GA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión. En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4444903 de EGF [AA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión. En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs 16260 de CDH1 [AA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs11615 de ERCC1 [TT] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo heterocigoto rs396991 de FCGR3A [TG] y/o el genotipo homocigoto rs396991 de FCGR3A [TT] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo homocigoto rs396991 de FCGR3A [GG] indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, el antígeno tumoral es la proteína CLDN18.2.
En un aspecto, la enseñanza se refiere a un método para evaluar
(i) si un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo para la CLDN18.2 responde al tratamiento con un anticuerpo contra la proteína CLDN18.2, y/o
(ii) si un paciente con cáncer, preferentemente, un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo para la CLDN18.2, experimentará una supervivencia libre de progresión,
dicho método comprende determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en rs4072037 de MUC1, rs1800896 de IL-10, rs1550117 de DNMT3A, rs12456284 de SMAD4, rs4444903 de EGF, rs16260 de CDH1 y rs11615 de ERCC1, en una muestra obtenida del paciente.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo heterocigoto rs1801274 de FCGR2A [CT] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo homocigoto rs1801274 de FCGR2A [TT] y/o el genotipo homocigoto rs1801274 de FCGR2A [CC] indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 de MUC1 [AA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 de MUC1 [GG] indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs1800896 de IL-10 [GG] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo heterocigoto rs1550117 de DNMT3A[GA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo heterocigoto rs12456284 de SMAD4 [GA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4444903 de EGF [AA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs16260 de CDH1 [AA] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs11615 de ERCC1 [TT] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo heterocigoto rs396991 de FCGR3A [TG] y/o el genotipo homocigoto rs396991 de FCGR3A [TT] indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo homocigoto rs396991 de FCGR3A [GG] indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
En una modalidad de todos los aspectos de la enseñanza, el anticuerpo actúa mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales. En una modalidad, el anticuerpo actúa a través de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad de todos los aspectos de la enseñanza, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 17 o 51 o un fragmento de estas y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de esta.
En una modalidad de todos los aspectos de la enseñanza, la ausencia de capacidad de respuesta al tratamiento con el anticuerpo comprende una reducción relativa en una o más de supervivencia, supervivencia libre de progresión, supervivencia libre de recurrencia, supervivencia libre de recurrencia distante y enfermedad estable.
En un aspecto, la enseñanza se refiere a un método para tratar a un paciente con cáncer, dicho método comprende
a. evaluar si el paciente con cáncer es un respondedor al tratamiento con un anticuerpo mediante el método de la enseñanza y
b. (i) tratar al paciente con cáncer con un anticuerpo si el paciente tiene un riesgo reducido de no ser un respondedor al tratamiento con el anticuerpo o (ii) no tratar al paciente con cáncer con un anticuerpo y/o tratar al paciente con un régimen de tratamiento que comprende un tratamiento que es diferente de un tratamiento con un anticuerpo si el paciente tiene un riesgo aumentado de no ser un respondedor al tratamiento con el anticuerpo.
En una parte de la descripción, el régimen de tratamiento comprende un tratamiento que no depende del sistema inmunitario del paciente. En una parte de la descripción, el régimen de tratamiento no comprende un tratamiento con un anticuerpo que actúa mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales. En una parte de la descripción, el régimen de tratamiento comprende cirugía, quimioterapia y/o radiación. En una parte de la descripción, el régimen de tratamiento comprende un tratamiento con un inhibidor de molécula pequeña del antígeno tumoral y/o un conjugado anticuerpo-fármaco en donde el anticuerpo se dirige contra el antígeno tumoral. En una parte de la descripción, el conjugado anticuerpo-fármaco es un anticuerpo acoplado a un resto radioactivo, quimioterapéutico o de toxina. En una parte de la descripción, el conjugado anticuerpo-fármaco es un anticuerpo acoplado a un compuesto citostático o citotóxico.
En un aspecto, la enseñanza se relaciona con un método para evaluar el resultado clínico para un paciente con cáncer, dicho método comprende determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en rs1801274 de FCGR2A, rs4072037 de MUC1, rs1800896 de IL-10, rs1550117 de DNMT3A, rs12456284 de SMAD4, rs4444903 de EGF, rs16260 de CDH1, rs11615 de ERCC1 y rs396991 de FCGR3A en una muestra obtenida del paciente.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo heterocigoto rs1801274 de FCGR2A [CT] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo homocigoto rs1801274 de FCGR2A [TT] y/o el genotipo homocigoto rs1801274 de FCGR2A [CC] indica un riesgo aumentado de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 de MUC1 [AA] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 de MUC1 [GG] indica un riesgo aumentado de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs1800896 de IL-10 [GG] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo heterocigoto rs1550117 de DNMT3A[GA] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo heterocigoto rs12456284 de SMAD4 [GA] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs4444903 de EGF [AA] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs16260 de CDH1 [AA] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una modalidad, la presencia del genotipo homocigoto rs11615 de ERCC1 [TT] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo heterocigoto rs396991 de FCGR3A [TG] y/o el genotipo homocigoto rs396991 de FCGR3A [TT] indica un riesgo reducido de mal resultado clínico.
En una parte de la descripción, la presencia del genotipo homocigoto rs396991 de FCGR3A [GG] indica un riesgo aumentado de mal resultado clínico.
En una parte de la descripción, evaluar el resultado clínico para un paciente con cáncer comprende predecir la posibilidad de una o más de supervivencia, supervivencia libre de progresión, supervivencia libre de recurrencia, supervivencia libre de recurrencia distante y enfermedad estable. En una parte de la descripción, el mal resultado clínico comprende una reducción relativa en una o más de supervivencia, supervivencia libre de progresión, supervivencia libre de recurrencia, supervivencia libre de recurrencia distante y enfermedad estable.
En una parte de la descripción, el paciente tiene un tumor positivo a un antígeno tumoral y recibe un tratamiento con un anticuerpo contra el antígeno tumoral.
En todos los aspectos de la enseñanza, la muestra es una muestra que comprende ADN. En una modalidad, el ADN se ha extraído a partir de una muestra corporal del paciente. En una parte de la descripción, el ADN se ha extraído a partir de la sangre.
En una modalidad de todos los aspectos de la enseñanza, el tumor es un tumor sólido. En una modalidad, el tumor es un tumor gastroesofágico. En una modalidad, el tumor es un adenocarcinoma avanzado del estómago o el esófago inferior. En una modalidad, el cáncer es cáncer gastroesofágico. En una modalidad, el cáncer es un adenocarcinoma avanzado del estómago o el esófago inferior.
En una parte adicional de la descripción, la presente enseñanza se refiere a un kit que comprende medios para determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en rs1801274 de FCGR2A, rs4072037 de MUC1, rs1800896 de IL-10, rs1550117 de DNMT3A, rs12456284 de SMAD4, rs4444903 de EGF, rs16260 de CDH1, rs11615 de ERCC1 y rs396991 de FCGR3A en una muestra obtenida del paciente. En una parte de la descripción, dicho kit es útil para llevar a cabo los métodos de todos los aspectos de la presente enseñanza. En una parte de la descripción, dicho kit comprende, además, un soporte de datos. En una parte preferida de la descripción, dicho soporte de datos es un soporte de datos electrónico o no electrónico. En una modalidad, dicho soporte de datos comprende instrucciones sobre cómo llevar a cabo los métodos de todos los aspectos de la enseñanza.
Otros objetos, ventajas y características de la presente enseñanza serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada considerada junto con las figuras acompañantes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Polimorfismos de un solo nucleótido con un cambio de frecuencia de genotipo significativo estadísticamente entre la población de pacientes y de control (prueba x2, p <0,05).
Se indica la asignación de genotipos específicos de SNP a secciones de barra. Pac. Población de pacientes, Co. Población de control.
Figura 2: Frecuencia relativa de genotipos de riesgo homocigotos por paciente en relación con el número de factores de riesgo de SNP investigados por paciente. Los pacientes se clasifican según la frecuencia aumentada de factores de riesgo homocigotos acumulados.
Figura 3: Supervivencia libre de progresión de pacientes PP diferenciados por el genotipo rs1801274 (FCGR2A) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 4: Supervivencia libre de progresión de pacientes FAS diferenciados por el genotipo rs1801274 (FCGR2A) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 5: Supervivencia libre de progresión de pacientes PP diferenciados por el genotipo rs1800896 (IL-10) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 6: Supervivencia libre de progresión de pacientes FAS diferenciados por el genotipo rs1800896 (IL-10) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 7: Supervivencia libre de progresión de pacientes FAS diferenciados por el genotipo rs1550117 (DNMT3A) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 8: Supervivencia libre de progresión de pacientes PP diferenciados por el genotipo rs12456284 (SMAD4) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 9: Supervivencia libre de progresión de pacientes PP diferenciados por el genotipo rs4072037 (MUC1) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 10: Supervivencia libre de progresión de pacientes FAS diferenciados por el genotipo rs4072037 (MUC1) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 11: Supervivencia libre de progresión de pacientes FAS diferenciados por el genotipo rs4444903 (EGF) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 12: Supervivencia libre de progresión de pacientes FAS diferenciados por el genotipo rs16260 (CDH1) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 13: Supervivencia libre de progresión de pacientes PP diferenciados por el genotipo rs11615 (ERCC1) (curva de Kaplan-Meier)
Figura 14: Supervivencia libre de progresión de pacientes PP diferenciados por el genotipo rs396991 (FCGR3A) (curva de Kaplan-Meier)
Descripción detallada
Aunque la presente invención se describe en detalle más abajo, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente descripción, ya que pueden variar. Debe entenderse, también, que la terminología utilizada en la presente descripción es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención la cual se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica.
A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con modalidades específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear modalidades adicionales. Los ejemplos descritos de diversas maneras y las modalidades preferidas no deben interpretarse como que limitan la presente invención a solamente las modalidades descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción sustenta y abarca modalidades que combinan las modalidades descritas explícitamente con cualquier cantidad de elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquiera de las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse descritas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera.
Preferentemente, los términos que se usan en la presente descripción se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza, (1995).
La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique de cualquier otra manera, métodos convencionales de química, bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura del campo (consultar, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición, J. Sambrook y otros eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pero no la exclusión de ningún otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas aunque en algunas modalidades tal otro miembro entero, o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el tema consiste en la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el/la" y referentes similares usados en el contexto para describir la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de cualquier otra manera en la presente descripción, o claramente se contradiga por el contexto. La enumeración de los intervalos de valores en la presente descripción pretende servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. Todos los métodos que se describen en la presente descripción pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de otra manera. Los presentes inventores proporcionan pruebas para medir la elegibilidad de los pacientes para ciertos tratamientos contra el cáncer, en particular la terapia con anticuerpos, y para extraer conclusiones sobre el pronóstico de un paciente con cáncer. Los resultados obtenidos mediante el uso de estas pruebas le permiten al médico decidir un tratamiento adecuado para un paciente con cáncer y, en particular, decidir si la terapia con anticuerpos debe administrarse a un paciente con cáncer en particular.
El término "polimorfismo de un solo Nucleótido" o "SNP" se refiere a una variación de secuencia de ADN que se produce comúnmente dentro de una población en la que un solo nucleótido en el genoma (u otra secuencia compartida) difiere entre los miembros de una especie biológica o cromosomas apareados. Los SNP pueden producirse dentro de secuencias codificantes de genes, regiones no codificantes de genes, o en regiones intergénicas (regiones entre genes). Los SNP dentro de una secuencia codificante pueden pero no cambian necesariamente la secuencia de aminoácidos de la proteína que se produce, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto, los SNP en la región codificante son de dos tipos, SNP sinónimos y no sinónimos. Los SNP sinónimos no afectan la secuencia de la proteína, mientras que los SNP no sinónimos cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína. Los SNP no sinónimos son de dos tipos: con sentido erróneo y sin sentido. Los SNP que no se encuentran en regiones codificantes de proteínas aún pueden afectar el corte y empalme de genes, la unión del factor de transcripción, la degradación del ARN mensajero o la secuencia de ARN no codificante. La expresión génica afectada por este tipo de SNP se denomina como un eSNP (SNP de expresión) y puede estar aguas arriba o aguas abajo del gen.
Pueden usarse diversos métodos conocidos en la técnica para determinar el genotipo de los SNP. Los métodos analíticos para descubrir SNP nuevos y detectar SNP conocidos incluyen, por ejemplo, secuenciación de ADN, electroforesis capilar, espectrometría de masas, polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP), análisis electroquímico, HPLC desnaturalizante y electroforesis en gel, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción y análisis de hibridación.
El proceso de determinar qué nucleótido se presenta en una posición de SNP particular descrita en la presente descripción, para uno de los alelos o para ambos, puede denominarse mediante frases tales como "determinar el genotipo para un SNP" o "genotipado de SNP". Por lo tanto, estas frases pueden referirse a la detección de un solo alelo (nucleótido) en una posición de SNP o pueden abarcar la detección de ambos alelos (nucleótidos) en una posición de SNP (tal como para determinar el estado homocigoto o heterocigoto de una posición de SNP). Además, estas frases también pueden referirse a la detección de un residuo de aminoácido codificado por un SNP (tal como residuos de aminoácidos alternativos que se codifican por diferentes codones creados por nucleótidos alternativos en una posición de SNP).
Un reactivo que detecta específicamente una posición de SNP objetivo específica descrito en la presente descripción, y que es específico, preferentemente, para un nucleótido en particular (alelo) de la posición de SNP objetivo (es decir, el reactivo, preferentemente, puede diferenciar entre diferentes nucleótidos alternativos en una posición específica de SNP, lo que permite de esta manera identificar el nucleótido presente en la posición de SNP objetivo a determinar) puede usarse para la detección de SNP. Típicamente, dicho reactivo de detección se hibrida con una molécula de ácido nucleico que contiene el SNP objetivo mediante el emparejamiento de bases complementarias de una manera específica de secuencia, y discrimina la secuencia variable objetivo de otras secuencias de ácido nucleico tales como una forma conocida en la técnica en una muestra de prueba. Un ejemplo de un reactivo de detección es un cebador o sonda de ácido nucleico de origen no natural que se hibrida a un ácido nucleico objetivo que contiene un SNP descrito en la presente descripción. En una modalidad preferida, dicho cebador o sonda puede diferenciar entre ácidos nucleicos que tienen un nucleótido en particular (alelo) en la posición de SNP objetivo de otros ácidos nucleicos que tienen un nucleótido diferente en la misma posición de SNP objetivo. Además, un reactivo de detección puede hibridarse a una región específica en dirección 5' y/o 3' con respecto a la posición de SNP. Será evidente para un experto en la técnica que dichos reactivos de detección, tales como dichos cebadores y sondas, son directamente útiles como reactivos para genotipar uno o más de los SNP descritos en la presente descripción, y pueden incorporarse en cualquier formato de kit.
Para analizar los SNP, puede ser apropiado usar oligonucleótidos específicos para alelos de SNP alternativos. Dichos oligonucleótidos que detectan variaciones de un solo nucleótido en secuencias objetivo pueden denominarse mediante términos tales como "oligonucleótidos específicos de alelo", "sondas específicas de alelo" o "cebadores específicos de alelo".
Un reactivo de detección de SNP puede marcarse con un indicador tal como un colorante indicador fluorogénico que emite una señal detectable. Si bien el colorante indicador preferido es un colorante fluorescente, es adecuado cualquier colorante indicador que pueda unirse a un reactivo de detección tal como una sonda o cebador oligonucleotídico de acuerdo con la enseñanza. En aún otra modalidad, el reactivo de detección puede marcarse, además, con un colorante inhibidor, especialmente cuando el reactivo se usa como una sonda autoextinguible tal como una sonda TaqMan. Los reactivos de detección de SNP descritos en la presente descripción pueden contener, además, otros marcadores, lo que incluye, pero no se limita a, biotina para la unión a estreptavidina, hapteno para la unión a anticuerpo y oligonucleótido para la unión a otro oligonucleótido complementario.
De acuerdo con la presente enseñanza, también se contemplan reactivos que no contienen (o que no son complementarios a) un nucleótido de SNP a identificar, pero que se usan para analizar uno o más SNP descritos en la presente descripción. Por ejemplo, los cebadores que flanquean, pero no se hibridan directamente a una posición de SNP objetivo son útiles en reacciones de extensión por cebadores en las que los cebadores se hibridan a una región adyacente a la posición de SNP objetivo (es decir, dentro de uno o más nucleótidos a partir del sitio de SNP objetivo). Durante la reacción de extensión por cebador, un cebador típicamente no puede extenderse más allá de un sitio de SNP objetivo si un nucleótido en particular (alelo) se presenta en ese sitio de SNP objetivo, y el producto de extensión por cebador puede detectarse para determinar qué alelo de SNP se presenta en el sitio de SNP objetivo. Por ejemplo, los ddNTP particulares se usan típicamente en la reacción de extensión por cebador para terminar la extensión por cebador una vez que se incorpora un ddNTP en el producto de extensión. Por lo tanto, los reactivos que se unen a una molécula de ácido nucleico en una región adyacente a un sitio de SNP y que se usan para analizar el sitio de SNP, aunque las secuencias unidas no incluyen necesariamente el sitio de SNP en sí mismo, también se contemplan de acuerdo con la enseñanza.
El término "FCGR2A" se refiere al gen FCGR2A humano. Este gen codifica el receptor II-a de la región Fc de gamma inmunoglobulina de baja afinidad (CD32) y es un miembro de una familia de genes del receptor Fc de inmunoglobulina. La proteína codificada por este gen es un receptor de la superficie celular que se encuentra en células fagocíticas tales como macrófagos y neutrófilos, y se involucra en el proceso de fagocitosis y la eliminación de los complejos inmunitarios. El corte y empalme alternativo resulta en variantes de transcritos múltiples.
Preferentemente, el término "FCGR2A" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 61 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 62 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs1801274 es un SNP en el gen FCGR2A. rs1801274 (C) codifica el alelo arginina (R), y el alelo (T) codifica la variante de histidina (H). Este SNP es una sustitución de transición intragénica con el cambio de codón siguiente: CAT,CGT y resulta en una mutación de sentido erróneo. El SNP se conoce en la literatura por muchos nombres, lo que incluye A519C y R131H. La secuencia de contexto es la siguiente:
TGGGATGGAGAAGGTGGGATCCAAA[C/T] GGGAGAATTTCTGGGATTTTCCATT
El término "MUC1" se refiere al gen MUC1 humano. Este gen codifica la Mucina 1, que se asocia a la superficie celular (MUC1) o la mucina epitelial polimórfica (PEM), que es un miembro de la familia de las mucinas y es una fosfoproteína glicosilada unida a la membrana. La proteína se ancla a la superficie apical de muchos epitelios mediante un dominio transmembrana. Más allá del dominio transmembrana hay un dominio SEA que contiene un sitio de escisión para la liberación del dominio extracelular grande. La proteína cumple una función protectora mediante la unión a patógenos y también funciona en una capacidad de señalización celular.
Preferentemente, el término "MUC1" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 63 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 64 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs4072037 es un SNP en el gen MUC1. Este SNP es una sustitución de transición intragénica con el cambio de codón siguiente: ACA,ACG y resulta en una mutación silenciosa. La secuencia de contexto es la siguiente:
CCCCTAAACCCGCAACAGTTGTTAC[A/G] GGTTCTGGTCATGCAAGCTCTACCC
El término "IL-10" se refiere al gen de IL-10 humana. Este gen codifica la interleucina-10 (IL-10), también conocida como factor inhibidor de la síntesis de citocina humana (CSIF), que es una citocina antiinflamatoria.
Preferentemente, el término "IL-10" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 65 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 66 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs1800896 es un SNP en el gen IL-10. Este SNP es una sustitución de transición intragénica/intergénica desconocida. La secuencia de contexto es la siguiente:
CAACACTACTAAGGCTTCTTTGGGA[A/G] GGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGA
El término "DNMT3A" se refiere al gen DNMT3A humano. Este gen codifica la ADN (citosina-5)-metiltransferasa 3A. La proteína codificada por este gen es una enzima que cataliza la transferencia de grupos metilo hacia estructuras CpG específicas en el ADN.
Preferentemente, el término "DNMT3A" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 67 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 68 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs1550117 es un SNP en el gen DNMT3A. Este SNP es una sustitución de transición intragénica en la región promotora del DNMT3A. La secuencia de contexto es la siguiente:
AATTCCACCAGCACAGCCACTCACT[A/G] TGTGCTCATCTCACTCCTCCAGCAG
El término "SMAD4" se refiere al gen SMAD4 humano. Este gen codifica madres contra el homólogo decapentapléjico 4. La proteína codificada por este gen se implica en la señalización celular y pertenece a la familia de proteínas DarfWin que modulan miembros de la superfamilia de proteínas TGFp. Se une a los SMAD regulados por receptor, tales como SMAD1 y SMAD2, y forma un complejo que se une al ADN y sirve como un factor de transcripción. Es el único coSMAD de mamífero que se conoce.
Preferentemente, el término "SMAD4" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 69 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 70 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs12456284 es un SNP en el gen SMAD4. Este SNP es una sustitución de transición intragénica en la UTR 3'. La secuencia de contexto es la siguiente:
AGGTCCAGAGCCAGTGTTCTTGTTC[A/G] ACCTGAAAGTAATGGCTCTGGGTTG
El término "EGF" se refiere al gen EGF humano. Este gen codifica el factor de crecimiento epidérmico. El EGF es un factor de crecimiento que estimula el crecimiento, la proliferación y la diferenciación celular al unirse a su receptor EGFR. Preferentemente, el término "EGF" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 71 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 72 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs4444903 es un SNP en el gen EGF. Este SNP es una sustitución de transición intragénica en la UTR 5'. La secuencia de contexto es la siguiente:
CTTTCAGCCCCAATCCAAGGGTTGT[A/G] GCTGGAACTTTCCATCAGTTCTTCC
El término "CDH1" se refiere al gen CDH1 humano. Este gen codifica la cadherina-1, que se conoce también como CAM 120/80 o cadherina epitelial (E-cadherina) o uvomorulina. La proteína es un miembro clásico de la superfamilia de la cadherina. Es una glicoproteína de adhesión célula-célula dependiente de calcio compuesta por cinco repeticiones de cadherina extracelular, una región transmembrana y una cola citoplasmática altamente conservada. Se cree que la pérdida de función contribuye a la progresión del cáncer mediante el aumento de la proliferación, la invasión y/o la metástasis.
Preferentemente, el término "CDH1" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 73 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 74 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs16260 es un SNP en el gen CDH1. Este SNP es una sustitución de transversión intragénica ubicada en la región promotora del gen CDH1. La secuencia de contexto es la siguiente:
CTAGCAACTCCAGGCTAGAGGGTCA[A/C] CGCGTCTATGCGAGGCCGGGTGGGC
El término "ERCC1" se refiere al gen ERCC1 humano. Este gen codifica la proteína de reparación de escisión de ADN ERCC-1. La función de la proteína ERCC1 es predominantemente en la reparación por escisión de nucleótidos del ADN dañado.
Preferentemente, el término "ERCC1" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 75 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 76 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs11615 es un SNP en el gen ERCC1. Este SNP es una sustitución de transición intragénica silenciosa. La secuencia de contexto es la siguiente:
ATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA[C/T] GTGCCCTGGGAATTTGGCGACGTAA
El término "FCGR3A" se refiere al gen FCGR3A humano. Este gen codifica el receptor III-A de la región Fc de gamma inmunoglobulina de baja afinidad. La proteína codificada por este gen es parte del conglomerado de moléculas de diferenciación de la superficie celular.
Preferentemente, el término "FCGR3A" se refiere a un ácido nucleico que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 77 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico y a una proteína codificada por este ácido nucleico, preferentemente, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
rs396991 es un SNP en el gen FCGR3A. Este SNP es una sustitución de transversión intragénica con el cambio de codón siguiente: GTT,TTT y resulta en una mutación de sentido erróneo. rs396991 (T) codifica el alelo fenilalanina (F), y el alelo (G) codifica la variante de valina (V). La secuencia de contexto es la siguiente:
CGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTT[G/T] TTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGA
Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de las uniones estrechas, donde establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembranas que se extienden por la membrana 4 veces con el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, ambos localizados en el citoplasma. El primer bucle o dominio extracelular, consiste en un promedio de 53 aminoácidos, y el segundo bucle o dominio extracelular, consiste en alrededor de 24 aminoácidos. Las proteínas de la superficie celular de la familia de claudina, tal como CLDN18.2, se expresan en tumores de diferentes orígenes, y son particularmente adecuados como estructuras objetivo en relación con la inmunoterapia del cáncer mediada por anticuerpos debido a su expresión selectiva (sin expresión en un tejido normal relevante de toxicidad) y localización en la membrana plasmática.
El término "CLDN" como se usa en la presente descripción significa claudina e incluye CLDN18.2. Preferentemente, una claudina es una claudina humana.
El término "CLDN18" se refiere a la claudina 18 e incluye cualquiera de las variantes, que incluye la variante 1 de corte y empalme de claudina 18 (claudina 18.1 (CLDN18.1)) y la variante 2 de corte y empalme de claudina 18 (claudina 18.2 (CLDN18.2)).
El término "CLDN18.2" se refiere, preferentemente, a CLDN18.2 humana, y, en particular, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle o dominio extracelular de la CLDN18.2 comprende, preferentemente, los aminoácidos 27 al 81, con mayor preferencia, los aminoácidos 29 al 78 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. El segundo bucle o dominio extracelular de la CLD18.2 comprende, preferentemente, los aminoácidos 140 al 180 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Dicho primer y segundo bucles o dominios extracelulares forma, preferentemente, la porción extracelular de la CLDN18.2.
CLDN18.2 se expresa selectivamente en tejidos normales en células epiteliales diferenciadas de la mucosa gástrica. CLDN18.2 se expresa en cánceres de diferentes orígenes tales como carcinoma pancreático, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma de mama y tumores ENT. CLDN18.2 es un objetivo valioso para la prevención y/o tratamiento de tumores primarios, tales como cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, y cánceres de la vesícula biliar, y sus metástasis, en particular, metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos.
El término "CLDN18.1" se refiere, preferentemente, a CLDN18.1 humana, y, en particular, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
"Pronóstico" como se usa en la presente descripción, se refiere a una predicción del resultado y, en particular, la probabilidad de supervivencia libre de progresión (PFS) o supervivencia libre de enfermedad (DFS). La supervivencia se calcula generalmente como el número promedio de meses (o años) que sobrevive el 50 % de los pacientes, o el porcentaje de pacientes que están vivos después de 1, 5, 15 y 20 años. El pronóstico es importante para las decisiones de tratamiento porque a los pacientes con un buen pronóstico se les ofrecen generalmente tratamientos menos invasivos, mientras que a los pacientes con mal pronóstico se les ofrecen generalmente tratamientos más agresivos, tales como fármacos de quimioterapia más extensivos.
"Predicción", como se usa en la presente descripción, se refiere a proporcionar información sobre la posible respuesta de una enfermedad a un tratamiento terapéutico distintivo.
La frase "indica un riesgo" se refiere a la indicación de un cierto grado de posibilidad o probabilidad. La frase "indica un riesgo reducido" se refiere a un bajo grado de posibilidad o probabilidad. La frase "indica un riesgo aumentado" se refiere a un cierto, mayor o alto grado de posibilidad o probabilidad.
Si un evento "indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con un anticuerpo", dicho evento indica que un paciente con cáncer sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo, es decir, es probable que el paciente es un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y, opcionalmente, es más probable que el paciente es un respondedor al tratamiento con el anticuerpo que el paciente no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo.
Si un evento "indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con un anticuerpo", dicho evento indica que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo, es decir, es probable que el paciente no es un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y, opcionalmente, es más probable que el paciente no es un respondedor al tratamiento con el anticuerpo que el paciente sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo.
Si un evento "indica un riesgo reducido de mal resultado clínico", dicho evento indica un buen resultado clínico, es decir, es probable que haya un buen resultado clínico y, opcionalmente, es más probable que haya un buen resultado clínico de que haya un mal resultado clínico.
Si un evento "indica un riesgo aumentado de un mal resultado clínico", dicho evento indica un mal resultado clínico, es decir, es probable que haya un mal resultado clínico y, opcionalmente, es más probable que haya un mal resultado clínico de que haya un buen resultado clínico.
Si un evento "indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión", dicho evento indica un paciente con cáncer que experimenta una supervivencia libre de progresión, es decir, es probable que el paciente experimente una supervivencia libre de progresión y, opcionalmente, es más probable que el paciente experimente una supervivencia libre de progresión de que el paciente que no experimente una supervivencia libre de progresión.
Si un evento "indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión", dicho evento indica un paciente con cáncer que no experimenta una supervivencia libre de progresión, es decir, es probable que el paciente no experimente una supervivencia libre de progresión y opcionalmente, es más probable que el paciente no experimente una supervivencia libre de progresión de que el paciente experimente una supervivencia libre de progresión.
El término "muestra", como se usa en la presente, se refiere a cualquier material que se obtiene de un sujeto y que puede usarse para fines analíticos, en particular para la determinación del genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido. En ciertas modalidades, las muestras descritas en la presente descripción pueden ser o pueden derivarse de cualquier tejido, células y/o células en fluidos biológicos de, por ejemplo, un mamífero o un ser humano a analizar. Puede aislarse una muestra de un paciente, por ejemplo, del cuerpo humano. Una muestra puede ser una muestra fraccionada y/o purificada. Por ejemplo, las muestras abarcadas por la presente enseñanza pueden ser o pueden derivarse de muestras de tejidos (por ejemplo, corte histológico o explante), muestras de células individuales, muestras de colonias celulares, muestras de cultivo celular, muestras sanguíneas (por ejemplo, sangre total o fracción de sangre tal como fracción de células sanguíneas, suero o plasma), muestras de orina, o muestras de otras fuentes periféricas. En una modalidad particularmente preferida, la muestra es una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia de un sujeto con o sospechoso de tener tejido canceroso). Por ejemplo, la muestra puede ser una biopsia de un tumor. La muestra puede obtenerse de un paciente previo al inicio del tratamiento terapéutico, durante el tratamiento terapéutico, y/o después del tratamiento terapéutico, por ejemplo, durante o después de la administración de la terapia contra el cáncer.
Los materiales de muestra pueden usarse para producir extractos de ácido nucleico (lo que incluye ADN y/o ARN), proteínas o extractos de membrana de cualquier fluido corporal (tal como sangre, suero, plasma, orina, saliva, flema, jugos gástricos, semen, lágrimas, sudor, etcétera), piel, cabello, células (especialmente células nucleadas), biopsias, hisopados bucales o especímenes de tejido o tumor.
La presente enseñanza se refiere, además, a un kit que comprende medios tales como reactivos para determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido como se describe en la presente descripción. En el contexto de la presente enseñanza, se entiende que el término "kit de partes (en resumen: kit)" es cualquier combinación de al menos algunos de los componentes identificados en la presente descripción, que se combinan, coexisten espacialmente, en una unidad funcional, y que puede contener otros componentes. Por ejemplo, el kit puede comprender cebadores o sondas preseleccionados específicos para secuencias de ácido nucleico que comprenden uno o más polimorfismos de un solo nucleótido cuyo genotipo debe determinarse. El kit puede comprender, además, enzimas adecuadas para amplificar ácidos nucleicos (por ejemplo, polimerasas tales como Taq), y desoxinucleótidos y tampones necesarios para la mezcla de reacción para la amplificación. El kit puede comprender, además, sondas específicas para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido. En ciertas modalidades, dichos medios se marcan de forma detectable.
Un kit de la enseñanza puede comprender (i) un contenedor y/o (ii) un soporte de datos. Dicho contenedor puede rellenarse con uno o más de los medios o reactivos mencionados anteriormente. Dicho soporte de datos puede ser un soporte de datos no electrónico, por ejemplo, un soporte de datos gráficos tal como un folleto informativo, una hoja de información, un código de barras o un código de acceso, o un soporte de datos electrónico tal como un disquete, un disco compacto (CD), un disco versátil digital (DVD), un microchip u otro soporte de datos electrónicos basado en semiconductores. El código de acceso puede permitir el acceso a una base de datos, por ejemplo, una base de datos de Internet, una base de datos centralizada o una descentralizada. Dicho soporte de datos puede comprender instrucciones para permitir el análisis de los resultados obtenidos con dicho kit y, en particular, para el uso del kit en los métodos de la enseñanza.
Adicional o alternativamente, dicho kit puede comprender materiales convenientes desde el punto de vista comercial y del usuario, lo que incluye tampón(es), reactivo(s) y/o diluyente(s).
En función de los resultados obtenidos (es decir, en función del genotipo de uno o más polimorfismos de un solo nucleótido), el médico puede elegir una terapia contra el cáncer a la que se predice que el paciente es receptivo, en particular, la terapia con anticuerpos. Preferentemente, una terapia contra el cáncer a la que se predice que el paciente no es receptivo no se administra al paciente.
En función del resultado de que se predice que el paciente no es receptivo a la terapia con anticuerpos, en particular la terapia con anticuerpos que actúa mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales, el médico puede escoger administrar una terapia contra el cáncer que es diferente de la terapia con anticuerpos, en particular la terapia con anticuerpos que actúa mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales. En particular, el médico puede escoger administrar quimioterapia.
En función del resultado de que se predice que el paciente no es receptivo a la terapia con anticuerpos, en particular la terapia con anticuerpos que actúa mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales, el médico puede escoger administrar la terapia con anticuerpos, en particular la terapia con anticuerpos que actúa mediante el reclutamiento de sistema inmunitario del paciente para destruir células tumorales, opcionalmente, en combinación con quimioterapia.
El término "tratamiento (terapéutico)", en particular en relación con el tratamiento del cáncer como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier tratamiento que tenga como objetivo mejorar el estado de salud y/o prolongar (aumentar) la esperanza de vida de un paciente. Dicho tratamiento puede eliminar el cáncer, reducir el tamaño o la cantidad de tumores en un paciente, detener o retrasar el desarrollo del cáncer en un paciente, inhibir o retrasar el desarrollo de un nuevo cáncer en un paciente, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un paciente, y/o disminuir las recurrencias en un paciente que actualmente tiene o que previamente ha tenido cáncer. Puede seleccionarse un tratamiento (terapéutico) del cáncer del grupo que consiste en cirugía, quimioterapia, radioterapia y terapia dirigida. Un tratamiento particularmente preferido de acuerdo con la enseñanza es el tratamiento del cáncer que involucra anticuerpos monoclonales terapéuticos contra antígenos tumorales tales como la CLDN18.2 expresada en células objetivo.
La terapia adyuvante es un tratamiento que se administra adicionalmente al tratamiento primario, principal o inicial. Las cirugías y los regímenes de tratamiento complejos usados en la terapia contra el cáncer han llevado a usar el término principalmente para describir los tratamientos adyuvantes contra el cáncer. Un ejemplo de terapia adyuvante es el tratamiento adicional que se administra generalmente después de la cirugía en la que se ha eliminado toda la enfermedad detectable, pero donde permanece un riesgo estadístico de recaída debido a una enfermedad oculta.
Términos tales como "receptivo" o "respondedor" se refieren, en un contexto terapéutico, al hecho de que un paciente tiene un beneficio terapéutico de un modo de tratamiento dado y, en particular, a la observación de un alivio, prevención o eliminación de una enfermedad lo que incluye acortar la duración de una enfermedad, detener o retrasar la progresión o empeoramiento de una enfermedad, inhibir o retrasar el desarrollo de una nueva enfermedad y/o recurrencias, prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o sus síntomas, disminuir la frecuencia o la gravedad de los síntomas en un paciente que actualmente tiene o que previamente ha tenido una enfermedad y/o prolongar la esperanza de vida del paciente. En particular, se refieren a la observación de una reducción en la masa tumoral o de un aumento en el tiempo libre de tumor, el tiempo libre de recurrencia o el tiempo de supervivencia general.
Términos como "no receptivo" o "no respondedor" se refieren, en un contexto terapéutico, al hecho de que un paciente no tiene beneficio terapéutico de un modo de tratamiento dado y, en particular, a la no observación de un alivio, prevención o eliminación de una enfermedad, es decir, el paciente es resistente al tratamiento.
La respuesta completa se define como la ausencia de cualquier enfermedad residual tal como el cáncer, y se evalúa generalmente mediante análisis patológico de muestras de tejido adquiridas. En este contexto, se usa con frecuencia el término "respuesta patológica completa" (pCR). En particular, pCR se define como la ausencia de células tumorales invasivas residuales en el lecho tumoral original. Sin embargo, la definición de pCR puede variar entre sistemas de clasificación diferentes. La respuesta patológica completa ha demostrado ser un factor pronóstico para una mejor supervivencia general, pero también para la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia libre de recurrencia.
La supervivencia libre de recurrencia se define como el tiempo desde la aleatorización hasta el primero ya sea de recurrencia o recaída, segundo cáncer o muerte.
La supervivencia libre de progresión (PFS) es un tipo de tasa de supervivencia que mide la duración del tiempo durante y después de la medicación o el tratamiento durante el cual la enfermedad que se trata (generalmente cáncer) no empeora. A veces se usa como una medida para estudiar la salud de una persona con una enfermedad para tratar de determinar qué tan bien funciona un nuevo tratamiento y a menudo se usa como un criterio de valoración clínico en ensayos controlados aleatorizados para terapias contra el cáncer.
De acuerdo con la enseñanza, el término "paciente con cáncer que experimenta una supervivencia libre de progresión" se refiere a un paciente con cáncer que tiene un período de tiempo prolongado sin progresión de la enfermedad, en particular cuando se compara con el promedio de pacientes y/o cuando se compara con pacientes que son no respondedores a un modo de tratamiento dado. Preferentemente, dicho período de tiempo prolongado es al menos 4, preferentemente, al menos 5, con mayor preferencia, al menos 6 meses, tal como al menos 7 meses o al menos 8 meses, dicho período de tiempo inicia, por ejemplo, desde el momento de una primera administración de un tratamiento.
El término "resultado clínico" se define como el resultado clínico de una enfermedad, por ejemplo, reducción o mejora de los síntomas, en particular después de un tratamiento.
El término "recurrencia", con respecto al cáncer, incluye la aparición de células tumorales en el mismo sitio y órgano de la enfermedad de origen, metástasis a distancia que puede aparecer incluso muchos años después del diagnóstico inicial y la terapia del cáncer, o eventos locales tales como la infiltración de células tumorales en ganglios linfáticos regionales.
Los términos “individuo” y “sujeto” se usan indistintamente en la presente descripción. Se refieren a seres humanos, primates no humanos u otros mamíferos (por ejemplo ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, porcino, oveja, caballo o primate) que pueden afectarse con o son susceptibles a una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) pero pueden o no pueden tener la enfermedad o el trastorno. En muchas modalidades, el individuo es un ser humano. A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos "individuo" y "sujeto" no indican una edad particular, y por tanto abarcan adultos, ancianos, niños, y recién nacidos. En modalidades preferidas de la presente enseñanza, el "individuo" o "sujeto" es un "paciente". El término "paciente" significa de acuerdo con la enseñanza un sujeto para el tratamiento, en particular un sujeto enfermo.
En una modalidad particularmente preferida, un método de la enseñanza se realiza en un paciente que ya se ha diagnosticado como que tiene cáncer.
"Célula objetivo" significará cualquier célula no deseada tal como una célula cancerosa. En modalidades preferidas, la célula objetivo expresa CLDN18.2.
En el contexto de la presente enseñanza, términos tales como "proteger", "prevenir" o "profiláctico" se refieren a la prevención de la aparición y/o propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, a minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrollará una enfermedad o a retrasar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, un sujeto que está en riesgo de padecer cáncer sería un candidato para la terapia para prevenir el cáncer.
Por "que está en riesgo" se entiende un sujeto que se identifica que tiene una posibilidad mayor de la normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar el desarrollo de una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen o han tenido un cáncer tienen, además, un riesgo aumentado de metástasis de cáncer.
Como se usa en la presente, el término "combinación" en el contexto de la administración de una terapia se refiere al uso de más de una terapia o agente terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en el que se administran las terapias o agentes terapéuticos a un sujeto. Una terapia o agente terapéutico puede administrarse antes, de forma concomitante con o posterior a la administración de una segunda terapia o agente terapéutico a un sujeto. Preferentemente, las terapias o agentes terapéuticos se administran a un sujeto en una secuencia, cantidad y/o dentro de un intervalo de tiempo de manera que las terapias o agentes terapéuticos puedan actuar juntos. En una modalidad particular, las terapias o agentes terapéuticos se administran a un sujeto en una secuencia, cantidad y/o dentro de un intervalo de tiempo de manera que proporcionan un beneficio mayor que si se administraran de cualquier otra manera, en particular, independientemente entre sí. Preferentemente, el beneficio aumentado es un efecto sinérgico.
El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica que se asocia con signos y síntomas específicos. Una enfermedad puede causarse por factores originalmente de una fuente externa, tal como enfermedad infecciosa, o puede causarse por disfunciones internas, tal como enfermedades autoinmunitarias. En humanos, "enfermedad" se usa a menudo más ampliamente para referirse a cualquier condición que causa dolor, disfunción, sufrimiento, problemas sociales, o la muerte al individuo afectado, o problemas similares para aquellos en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, algunas veces incluye heridas, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, comportamientos anormales, y variaciones atípicas de la estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros propósitos estas pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades usualmente afectan a los individuos no solo físicamente, si no también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de uno de la vida y la personalidad de uno. De acuerdo con la enseñanza, el término "enfermedad" incluye cáncer, en particular aquellas formas de cáncer descritas en la presente descripción. Cualquier referencia en la presente descripción a cáncer o formas particulares de cáncer también incluye la metástasis del cáncer de estas. En una modalidad preferida, una enfermedad a tratar de acuerdo con la presente solicitud involucra células que expresan un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2.
"Enfermedad que involucra células que expresan un antígeno tumoral" significa, de acuerdo con la enseñanza que un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2 se expresa en células de un tejido u órgano enfermo. En una modalidad, la expresión de un antígeno tumoral en células de un tejido u órgano enfermo aumenta en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 10000 % o aún más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano correspondiente se reprime. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades que involucran células que expresan un antígeno tumoral incluyen las enfermedades cancerosas. Además, de acuerdo con la enseñanza, las enfermedades cancerosas son aquellas, preferentemente, en donde las células cancerosas expresan un antígeno tumoral.
Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren a o describen el estado fisiológico en un individuo que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de tales cánceres incluyen cáncer óseo, cáncer sanguíneo, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer uterino, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la vejiga, cáncer de los riñones, carcinoma celular renal, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (CNS), cáncer neuroectodermal, tumores del eje espinal, glioma, meningioma, y adenoma pituitario. El término "cáncer" de acuerdo con la presente invención comprende, además, las metástasis del cáncer. Preferentemente, una "enfermedad cancerosa" se caracteriza por células que expresan un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2 y una célula cancerosa que expresa dicho antígeno tumoral. Una célula que expresa un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2 es, preferentemente, una célula cancerosa, preferentemente, de los cánceres descritos en la presente descripción.
De acuerdo con la enseñanza, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas, células tumorígenas o células tumorales) que forman, preferentemente, una hinchazón o lesión. Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida y descontrolada y continúa su crecimiento después de que cesa el estímulo que inició el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una pérdida parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser ya sea benigna, premaligna o maligna.
En una modalidad, un cáncer de acuerdo con la enseñanza implica células cancerosas que expresan un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2. En una modalidad, el cáncer es positivo a un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2. En una modalidad, la expresión del antígeno tumoral tal como la CLDN18.2 es en la superficie de las células. En una modalidad, al menos 50 %, preferentemente, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de las células cancerosas son positivas para un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2 y/o al menos 40 %, preferentemente, al menos 50 % de las células cancerosas son positivas para la expresión superficial del antígeno tumoral tal como la CLDN18.2. En una modalidad, al menos el 95 % o al menos el 98 % de las células cancerosas son positivas para un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2. En una modalidad, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 % de las células cancerosas son positivas para la expresión superficial del antígeno tumoral tal como la CLDN18.2.
En una modalidad, un cáncer que involucra células cancerosas que expresan la CLDN18.2 o un cáncer positivo para la CLDN18.2, se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, y cánceres de la vesícula biliar y metástasis de estos, en particular metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos. En una modalidad, el cáncer es un adenocarcinoma, en particular un adenocarcinoma avanzado. Las enfermedades cancerosas particularmente preferidas son los adenocarcinomas del estómago, el esófago, el conducto pancreático, los conductos biliares, el pulmón y el ovario. En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de esófago, en particular el esófago inferior, cáncer de la unión eso-gástrica y cáncer gastroesofágico. En una modalidad particularmente preferida, el cáncer es cáncer gastroesofágico tal como el cáncer gastroesofágico avanzado metastásico, refractario o recurrente. En una modalidad, un tumor positivo para la CLDN18.2 es un tumor de los tipos de cáncer anteriores.
Las modalidades que involucran un tumor positivo para la CLDN18.2 o células cancerosas que expresan CLDN18.2 implican, preferentemente, el uso de un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2. En una modalidad, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo.
De acuerdo con la enseñanza, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, lo que incluye las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.
"Adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido es parte, además, de una categoría de tejido más grande conocido como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y los órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente a partir de ectodermo, endodermo y mesodermo. Para clasificarse como adenocarcinoma, las células no necesitan necesariamente formar parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, incluyendo los seres humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que se derivan, mientras que los pobremente diferenciados pueden no serlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Mientras que cada glándula puede no secretar la misma sustancia, siempre que exista una función exocrina para la célula, se considera glandular y su forma maligna se denomina, por lo tanto, adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, frecuentemente, con tiempo suficiente hacen metástasis. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrial.
Por "metástasis" se entiende la propagación de las células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de las células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales del endotelio para entrar en la cavidad y en los vasos del cuerpo, y después, tras haberse transportado por la sangre, la infiltración en los órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio objetivo depende de la angiogénesis. A menudo la metástasis del tumor ocurre incluso después de la remoción del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la descripción se refiere a "metástasis distante" que se relaciona con una metástasis que se halla remota del tumor primario y del sistema de nódulos linfáticos regional. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a la metástasis en ganglios linfáticos. Una forma particular de metástasis que es tratable mediante el uso de la terapia de la enseñanza es la metástasis que se origina del cáncer gástrico como sitio primario. En modalidades preferidas tal metástasis de cáncer gástrico son tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y/o metástasis de ganglios linfáticos.
Un cáncer refractario es una neoplasia maligna para la cual un tratamiento particular es ineficaz, que inicialmente no responde al tratamiento o que deja de responder con el tiempo. Los términos "refractario", "no receptivo" o "resistente" se usan indistintamente en la presente descripción.
El tumor de Krukenberg es un tumor metastásico infrecuente del ovario que representa del 1 % al 2 % de todos los tumores ováricos. El pronóstico del tumor de Krukenberg es todavía muy pobre y no hay tratamiento establecido para los tumores de Krukenberg. El tumor de Krukenberg es un adenocarcinoma del ovario metástasico de las células en forma de anillo de sello. El estómago es el sitio primario en la mayoría de los casos del tumor de Krukenberg (70 %). Los carcinomas de colon, apéndice, y mama (principalmente el carcinoma lobular invasivo) son los sitios primarios siguientes más comunes. Se han reportado casos raros del tumor de Krukenberg que se originan de carcinomas de la vesícula biliar, el tracto biliar, el páncreas, el intestino delgado, la ampolla de Vater, la cerviz, y la vejiga urinaria/uraco.
El término "cirugía", como se usa en la presente, incluye la extracción de tumores en una operación. Es un tratamiento común para el cáncer. Un cirujano puede extirpar los tumores mediante el uso de escisión local.
El término "quimioterapia", como se usa en la presente, se refiere al uso de agentes quimioterapéuticos o combinaciones de agentes quimioterapéuticos, preferentemente, para detener el crecimiento de células cancerosas, ya sea al destruir las células o al detener su división. Cuando la quimioterapia se toma por vía oral o se inyecta en una vena o músculo, los fármacos ingresan al torrente sanguíneo y pueden alcanzar las células cancerosas en todo el cuerpo (quimioterapia sistémica). Cuando la quimioterapia se coloca directamente en el fluido cerebroespinal, un órgano o una cavidad corporal tal como el abdomen, los fármacos afectan principalmente a las células cancerosas en esas áreas (quimioterapia regional). Los agentes quimioterapéuticos de acuerdo con la enseñanza incluyen compuestos citostáticos y compuestos citotóxicos. Los agentes quimioterapéuticos tradicionales actúan al destruir las células que se dividen rápidamente, una de las principales propiedades de la mayoría de las células cancerosas. Esto significa que la quimioterapia daña, además, las células que se dividen rápidamente en circunstancias normales, tales como las células de la médula ósea, el tracto digestivo y los folículos capilares. Esto resulta en los efectos secundarios más comunes de la quimioterapia. De acuerdo con la enseñanza, el término "quimioterapia" no incluye, preferentemente, anticuerpos que se dirigen a proteínas que se expresan de manera anormal en las células cancerosas (antígenos tumorales) y actúan mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales. Sin embargo, los anticuerpos que se dirigen a proteínas que se expresan de manera anormal en las células cancerosas (antígenos tumorales) y actúan a través de un resto o agente terapéutico conjugado con el anticuerpo, pueden considerarse como una forma de quimioterapia. Sin embargo, en el sentido más estricto, el término "quimioterapia", de acuerdo con la enseñanza, no incluye la terapia dirigida. De acuerdo con las enseñanzas, el término "agente quimioterapéutico" incluye taxanos, compuestos de platino, análogos de nucleósidos, análogos de camptotecina, antraciclinas, etopósido, bleomicina, vinorelbina, ciclofosfamida y sus combinaciones. De acuerdo con la enseñanza, una referencia a un agente quimioterapéutico incluye cualquier profármaco tal como éster, sal o derivado tal como el conjugado de dicho agente. Los ejemplos son conjugados de dicho agente con una sustancia portadora, por ejemplo, paclitaxel unido a proteínas, tal como paclitaxel unido a albúmina. Preferentemente, las sales de dicho agente son aceptables farmacéuticamente.
Los taxanos son una clase de compuestos de diterpeno que se derivaron primero de fuentes naturales tales como las plantas del género Taxus, pero algunos se han sintetizado artificialmente. El principal mecanismo de acción de la clase de fármacos de taxano es la interrupción de la función del microtúbulo, lo que inhibe de esta manera el proceso de división celular. Los taxanos incluyen docetaxel (Taxotere) y paclitaxel (Taxol).
De acuerdo con la enseñanza, el término "docetaxel" se refiere a un compuesto que tiene la siguiente fórmula:
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En particular, el término "docetaxel" se refiere al compuesto 1,7p,10p-trihidroxi-9-oxo-5p,20-epoxitax-11-eno-2a,4,13a-triil 4-acetato 2-benzoato 13-{(2R,3S)-3-[(terc-butoxicarbonil)-amino]-2-hidroxi-3-fenilpropanoato}.
De acuerdo con la enseñanza, el término "paclitaxel" se refiere a un compuesto que tiene la siguiente fórmula:
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En particular, el término "paditaxel" se refiere al compuesto (2a,4a,5p,7p,10p,13a)-4,10-bis-(acetiloxi)-13-{[(2R,3S)-3-(benzoilamino)-2-hidroxi-3-fenilpropanoil]oxi}-1,7-dihidroxi-9-oxo-5,20-epoxitax-1l-en-2-il benzoato.
De acuerdo con la enseñanza, el término "compuesto de platino" se refiere a compuestos que contienen platino en su estructura, tal como los complejos de platino, e incluye compuestos tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino. El término "cisplatino" o "cisplatinio" se refiere al compuesto c/s-diaminodicloroplatino(N) (CDDP) de la siguiente fórmula:
Figure imgf000018_0002
El término "carboplatino" se refiere al compuesto cis-diamino(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platino(II) de la siguiente fórmula:
Figure imgf000018_0003
El término "oxaliplatino" se refiere a un compuesto que es un compuesto de platino que forma un complejo con un ligando portador de diaminociclohexano de la siguiente fórmula:
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En particular, el término "oxaliplatino" se refiere al compuesto [(1R,2R)-ciclohexano-1,2-diamino] (etanodioato-0,0')platino(II). El oxaliplatino para inyección también se comercializa con el nombre comercial Eloxatina.
El término "análogo de nucleósido" se refiere a un análogo estructural de un nucleósido, una categoría que incluye tanto análogos de purina como análogos de pirimidina.
El término "gemcitabina" es un compuesto que es un análogo de nucleósido de la siguiente fórmula:
En particular, el término se refiere al compuesto 4-amino-1-(2-desoxi-2,2-difluoro-p-D-eritro-pentofuranosil)pirimidin-2(lH)-ona o 4-amino-1-[(2R,4R,5R)-3,3-difluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-1,2-dihidropirimidin-2-ona.
El término "análogo de nucleósido" incluye derivados de fluoropirimidina tales como fluorouracilo y profármacos de estos. El término "fluorouracilo" o "5-fluorouracilo" (5-FU o f5U) (vendido bajo las marcas comerciales Adrucil, Carac, Efudix, Efudexy Fluoroplex) es un compuesto que es un análogo de pirimidina de la siguiente fórmula:
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En particular, el término se refiere al compuesto 5-fluoro-1H-pirimidina-2,4-diona.
El término "capecitabina" (Xeloda, Roche) se refiere a un agente quimioterapéutico que es un profármaco que se convierte en 5-FU en los tejidos. La capecitabina, que puede administrarse por vía oral, tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000019_0002
En particular, el término se refiere al compuesto pentil [1-(3,4-dihidroxi-5-metiltetrahidrofurano-2-il)-5-fluoro-2-oxo-1H-pirimidin-4-il] carbamato.
El término "ácido folínico" o "leucovorina" se refiere a un compuesto útil en combinación sinérgica con el agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo. Por lo tanto, si se hace referencia en la presente descripción a la administración de 5-fluorouracilo o un profármaco de este, dicha administración en una modalidad puede comprender una administración junto con ácido folínico. El ácido folínico tiene la siguiente fórmula:
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En particular, el término se refiere al compuesto ácido (2S)-2-{[4-[(2-amino-5-formil-4-oxo-5,6,7,8-tetrahidro-1H-pteridin-6-il)metilamino]benzoil]amino}pentanodioico.
De acuerdo con la enseñanza, el término "análogo de camptotecina" se refiere a derivados del compuesto camptotecina (CPT; (S)-4-etil-4-hidroxi-1H-pirano[3',4':6,7] indolizino[1,2-b]quinolina-3,14-(4H,12H)-diona). Preferentemente, el término "análogo de camptotecina" se refiere a compuestos que comprenden la siguiente estructura:
Figure imgf000019_0004
De acuerdo con la enseñanza, los análogos de camptotecina preferidos son inhibidores de la enzima ADN topoisomerasa I (topo I). Los análogos de camptotecina preferidos de acuerdo con la enseñanza son irinotecán y topotecán.
El irinotecán es un fármaco que evita que el ADN se desenrolle mediante la inhibición de la topoisomerasa I. En términos químicos, es un análogo semisintético del alcaloide natural camptotecina que tiene la siguiente fórmula:
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En particular, el término "irinotecán" se refiere al compuesto (S)-4,11-dietil-3,4,12,14-tetrahidro-4-hidroxi-3,14-dioxo1H-pirano[3',4':6,7]-indolizino[1,2-b]quinolin-9-il-[1,4'-bipiperidina]-1'-carboxilato.
Topotecán es un inhibidor de la topoisomerasa de la fórmula:
Figure imgf000020_0002
En particular, el término "topotecán" se refiere al compuesto (monoclorhidrato de (S)-10[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-dihidroxi-1H-pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-3,14-(4H,12H)-diona).
Las antraciclinas son una clase de medicamentos usados comúnmente en la quimioterapia contra el cáncer que también son antibióticos. Estructuralmente, todas las antraciclinas comparten una estructura común de 7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12-quinona común en cuatro anillos y generalmente requieren glicosilación en sitios específicos. Las antraciclinas dan lugar, preferentemente, a uno o más de los siguientes mecanismos de acción: 1. Inhibe la síntesis de ADN y ARN al intercalarse entre pares de bases de la cadena de ADN/ARN, lo que evita por lo tanto la replicación de células cancerosas de rápido crecimiento. 2. Inhibe la enzima topoisomerasa II, lo que impide la relajación del ADN superenrollado y, por lo tanto, bloquea la transcripción y replicación del ADN. 3. Crea radicales libres de oxígeno mediados por hierro que dañan el ADN y las membranas celulares.
De acuerdo con la enseñanza, el término "antraciclina" se refiere, preferentemente, a un agente, preferentemente, un agente contra el cáncer para inducir apoptosis, preferentemente, mediante la inhibición de la reconexión del ADN en la topoisomerasa II.
Los ejemplos de antraciclinas y análogos de antraciclinas incluyen, pero no se limitan a, daunorrubicina (daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), epirrubicina, idarrubicina, rododicina, pirarrubicina, valrubicina, N-trifluoro-acetil doxorrubicin-14-valerato, aclacinomicina, morfolinodoxorrubicina (morfolino-DOX), cianomorfolino-doxorrubicina (cianomorfolino-DOX), 2-pirrolino-doxorrubicina (2-PDOX), 5-iminodaunomicina, mitoxantrona y aclacinomicina A (aclarrubicina). La mitoxantrona es un miembro de la clase de compuestos de antracendiona, que son análogos de antraciclina que carecen del resto de azúcar de las antraciclinas pero retienen la estructura de anillo aromático policíclico plano que permite la intercalación en el ADN.
Se contempla específicamente como antraciclina en el contexto de la presente enseñanza la epirubicina. La epirubicina es un fármaco antraciclina que tiene la siguiente fórmula:
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y se comercializa con el nombre comercial Ellence en los EE.UU. y Pharmorubicin o Epirubicin Ebewe en otros lugares. En particular, el término "epirubicina" se refiere al compuesto (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-amino-5-hidroxi-6-metil-oxan-2-il] oxi-6,11-dihidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-1-metoxi-8-metil-9,10-dihidro-7H-tetracen-5,12-diona. La epirubicina se favorece sobre la doxorrubicina, la antraciclina más popular, en algunos regímenes de quimioterapia, ya que parece provocar menos efectos secundarios.
El término "etopósido" se refiere a un derivado semisintético de podofilotoxina que exhibe actividad antitumoral. El etopósido inhibe la síntesis de ADN al formar un complejo con la topoisomerasa II y el ADN. Este complejo induce rupturas en el ADN bicatenario y evita la reparación mediante la unión de topoisomerasa II. Las rupturas acumuladas en el ADN impiden la entrada en la fase mitótica de la división celular y conducen a la muerte celular. El etopósido tiene la siguiente fórmula:
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En particular, el término se refiere al compuesto (4'-demetil-epipodofilotoxina 9-[4,6-O-(R)-etilideno-(beta)-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrógeno fosfato)).
El término "bleomicina" se refiere a un antibiótico glucopéptido producido por la bacteria Streptomyces verticillus. Cuando se usa como agente contra el cáncer, funciona al provocar rupturas en el ADN. La bleomicina comprende, preferentemente, un compuesto que tiene la siguiente fórmula:
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El término "vinorelbina" se refiere a un medicamento de quimioterapia antimitótico que es un alcaloide de vinca semisintético y se administra como un tratamiento para algunos tipos de cáncer, lo que incluye el cáncer de mama y el cáncer de pulmón de células no pequeñas. La vinorelbina comprende, preferentemente, un compuesto que tiene la siguiente fórmula:
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La ciclofosfamida es un agente alquilante de mostaza nitrogenada del grupo de las oxazoforinas. El uso principal de la ciclofosfamida es con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de algunas formas de cáncer. La ciclofosfamida comprende, preferentemente, un compuesto que tiene la siguiente fórmula:
En el contexto de la presente enseñanza, el término
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refiere al uso de rayos X de alta energía u otros tipos de radiación para destruir las células cancerosas o evitar que crezcan. Existen dos tipos de radioterapia. La radioterapia externa usa una máquina fuera del cuerpo para enviar radiación hacia el cáncer. La radioterapia interna usa una sustancia radiactiva sellada en agujas, semillas, alambres o catéteres que se colocan directamente dentro o cerca del cáncer. La forma en que se administra la radioterapia depende del tipo y la etapa del cáncer que se trata.
De acuerdo con la enseñanza, el término "terapia dirigida" se refiere a cualquier terapia que pueda usarse para atacar preferentemente células enfermas, tales como las células cancerosas, mientras que las células no enfermas no se toman como objetivo o se toman como objetivo en menor medida. El direccionamiento hacia las células enfermas, preferentemente, resulta en la destrucción y/o afectación de la proliferación o la viabilidad de las células enfermas. Dicha terapia incluye i) anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y proteínas desnudas o conjugadas con un resto terapéutico que se dirige a ciertos objetivos de la superficie celular en células enfermas, tales como antígenos tumorales, por ejemplo, CLDN18.2 (por ejemplo, anticuerpos o conjugados de anticuerpos contra la CLDN18.2 como se describe en la presente descripción) o ii) moléculas pequeñas que deterioran la proliferación o la viabilidad de las células enfermas. En una modalidad específica, el agente se une a un antígeno que se expresa a un nivel mayor en células madre enfermas que en células madre normales. En una modalidad específica, el agente se une específicamente a un antígeno tumoral. La quimioterapia o radioterapia tradicional no se considera una "terapia dirigida" a pesar de que a menudo se dirige a los tumores. Además, el término "terapia de anticuerpos" de acuerdo con la enseñanza no incluye, preferentemente, la terapia con anticuerpos, fragmentos o derivados de estos que se conjugan con un resto terapéutico, sino que simplemente se relaciona con la terapia con anticuerpos, fragmentos o derivados de estos que actúan mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales.
El término "antígeno" se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el cual se genera y/o se direcciona una respuesta inmunitaria. El término "antígeno" incluye en particular proteínas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, especialmente ARN y ADN, y nucleótidos. El término "antígeno" también incluye agentes, que se convierten en antigénicos - y sensibilizantes - solo a través de la transformación (por ejemplo de manera intermedia en la molécula o por terminación con la proteína del cuerpo). Un antígeno o un producto procesado de este se reconoce preferentemente por un receptor de células T o B, o por una molécula de inmunoglobulina tal como un anticuerpo. En una modalidad preferida, el antígeno es un antígeno asociado a enfermedad, tal como un antígeno tumoral, tal como la CLDN18.2.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a tumor" se refiere a un antígeno que se presenta en células tumorales. Preferentemente, el antígeno se presenta en células tumorales, tal como en la superficie de células tumorales. Preferentemente, el "antígeno tumoral" se expresa por las células tumorales. En una modalidad, el término "antígeno tumoral" se refiere a proteínas que se expresan de manera aberrante en células tumorales en comparación con las células normales, es decir, no tumorales. Por ejemplo, la expresión solo puede encontrarse en las células tumorales pero no en las células normales, es decir, no tumorales, o el nivel de expresión puede ser mayor en las células tumorales en comparación con las células normales, es decir, no tumorales. En una modalidad, el término "antígeno tumoral" se refiere a proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un número limitado de tejidos y/o órganos o en etapas específicas del desarrollo y se expresan o se expresan de manera aberrante en uno o más tumores o tejidos cancerosos. En el contexto de la presente enseñanza, un antígeno asociado a tumor se asocia, preferentemente, con la superficie celular de una célula cancerosa y, preferentemente, no se expresa, solo raramente, o a un menor nivel en tejidos y células normales. Preferentemente, de acuerdo con la enseñanza, un antígeno tumoral no se expresa en una célula si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión con los anticuerpos específicos al antígeno tumoral añadidos a las células. Un antígeno tumoral particularmente preferido de acuerdo con la enseñanza es la CLDN18.2.
De acuerdo con la enseñanza, el término "cáncer positivo para antígeno tumoral" o "tumor positivo para antígeno tumoral" o términos similares significa un cáncer o tumor que involucra células cancerosas o tumorales que expresan un antígeno tumoral, preferentemente, en la superficie de dichas células cancerosas o células tumorales. Un antígeno tumoral se expresa en la superficie de las células si se localiza en la superficie de dicha células y es accesible a la unión por los anticuerpos específicos del antígeno tumoral añadido a la célula.
En una modalidad preferida de la enseñanza, un "cáncer positivo para un antígeno tumoral" o "tumor positivo para un antígeno tumoral" es un "cáncer positivo para la CLDN18.2" o "tumor positivo para la CLDN18.2". De acuerdo con la enseñanza, el término "cáncer positivo para la CLDN18.2" o "tumor positivo para la CLDN18.2" significa un cáncer o tumor que involucra células cancerosas o tumorales que expresan la CLDN18.2, preferentemente, en la superficie de dichas células cancerosas o células tumorales.
"Superficie celular" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica, y por lo tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible a la unión por proteínas y otras moléculas.
El término "porción extracelular" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una parte de una molécula tal como una proteína que está de frente al espacio extracelular de una célula y, preferentemente, es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, por moléculas de unión a antígeno tales como anticuerpos localizados en el exterior de la célula. Preferentemente, el término se refiere a uno o más lazos extracelulares o dominios o un fragmento de estos.
De acuerdo con la enseñanza, CLDN18.2 no se expresa esencialmente en una célula si el nivel de expresión es menor en comparación a la expresión en las células estomacales o tejido estomacal. Preferentemente, el nivel de expresión es inferior al 10 %, preferentemente, inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,05 % de la expresión en las células estomacales o tejido estomacal o incluso inferior. Preferentemente, la CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en el tejido no canceroso distinto al tejido estomacal en no más de 2 veces, preferentemente, 1,5 veces, y preferentemente, no excede el nivel de expresión en dicho tejido no canceroso. Preferentemente, CLDN18.2 no se expresa esencialmente en una célula si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN18.2 añadidos a las células.
De acuerdo con la enseñanza, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en el tejido no canceroso distinto del tejido estomacal, preferentemente en más de 2 veces, preferentemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10 000 veces. Preferentemente, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión es suficientemente alto para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN18.2 añadidos a las células. Preferentemente, CLDN18.2 se expresa en una célula si se expresa o expone en la superficie de dicha célula.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula, es decir, a la parte en una molécula que se reconoce por el sistema inmunitario, por ejemplo, que se reconoce por un anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos son los sitios discretos, tridimensionales en un antígeno, que se reconocen por el sistema inmunitario. Los epítopos usualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen usualmente características específicas de estructura tridimensional, así como también características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Un epítopo de una proteína comprende, preferentemente, una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene, preferentemente, entre 5 y 100, preferentemente, entre 5 y 50, con mayor preferencia, entre 8 y 30, con la máxima preferencia, entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener, preferentemente, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud.
El término "anticuerpo" incluye una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que se interconectan por enlaces disulfuro, y cualquier molécula que comprende una porción de unión a antígeno de dicha glicoproteína. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, fragmentos o derivados de anticuerpos, lo que incluye, sin limitación, anticuerpos monocatenarios, por ejemplo, scFv y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno tales como fragmentos Fab y Fab' e incluye, además, todas las formas recombinantes de los anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos que se expresan en procariotas, anticuerpos no glicosilados y cualquiera de los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y derivados como se describe en la presente descripción. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente descripción como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente descripción como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro Fr , dispuestas desde el extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y al primer componente (C1q) del sistema clásico del complemento.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de unión y afinidad únicas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B que se obtiene de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que se fusiona a una célula inmortalizada.
El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente descripción, incluye todos los anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos que se aíslan de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma que se prepara a partir de estos, (b) anticuerpos que se aíslan de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos que se aíslan de una biblioteca recombinante, combinatoria, de anticuerpos y (d) anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el empalme de secuencias génicas de la inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura remanente de la inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender tanto dominios variables completos fusionados a dominios constantes como solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en las regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que se alteran con respecto al anticuerpo original.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase particular, mientras que el segmento remanente de la cadena es homólogo a secuencias correspondientes en otro. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada mimetiza las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas mediante el uso de células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos huéspedes no humanos en combinación con las regiones constantes que se derivan de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de ser fácil de preparar y que la fuente no afecta a la especificidad, la región constante que es humana, es menos probable que genere una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que si la región constante fuera de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.
Los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, que incluyen, pero no se limitan a, ratón, rata, conejo, cobayo y humano.
Los anticuerpos que se describen en la presente descripción incluyen IgAtal como anticuerpos IgA1 o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, e IgD. En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un IgG1, isotipo kappa o IgG1 isotipo lambda (es decir, IgG1, k, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo IgG2a, k, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo IgG3, k, A) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo IgG4, k, A).
Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante que corresponde a la que se encuentra en un organismo que no es el organismo transgénico, y que generalmente se deriva de una especie distinta a la del organismo transgénico.
Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere aun anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de diferentes organismos de origen. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción son, preferentemente, aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un antígeno tumoral, está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos del antígeno tumoral). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de un antígeno tumoral humano puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de antígenos tumorales). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la enseñanza, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen especificidades diferentes y que se combinan en una composición o mezcla bien definida.
Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") o términos similares, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa.
Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones aisladas determinantes de la complementariedad (CDR), y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, ellos pueden unirse, mediante el uso de métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite hacerlos como una proteína de cadena única en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); ver por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242: 423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena única se abarquen dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional son las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona a un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región bisagra y (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región constante CH2. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de la cadena pesada o una región variable de la cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen además en los documentos núms. US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante el uso de técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica, y se seleccionan los fragmentos para la utilidad de la misma manera que a los anticuerpos intactos.
El término "dominio de unión" caracteriza en relación con la presente enseñanza una estructura, por ejemplo, de un anticuerpo, que se une a/interactúa con una determinada estructura/antígeno/epítopo objetivo. Por lo tanto, el dominio de unión de acuerdo con la enseñanza designa un "sitio de interacción con el antígeno".
Todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos tales como fragmentos de anticuerpos como se describen en la presente descripción, para los fines de la enseñanza, se abarcan por el término "anticuerpo". El término "derivados de anticuerpos" se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo.
Los anticuerpos presentes de manera natural son generalmente monoespecíficos, es decir, se unen a un único antígeno. La presente enseñanza comprende anticuerpos que se unen a una célula objetivo (mediante la activación de un antígeno tumoral) y una segunda entidad tal como una célula citotóxica (por ejemplo, mediante la activación del receptor CD3). Los anticuerpos de la presente enseñanza pueden ser biespecíficos o multiespecíficos, tales como triespecíficos, tetraspecíficos, etcétera.
El término "molécula biespecífica" pretende incluir un agente que tiene dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a o interactuar con (a) un antígeno de la superficie celular, y (b) un receptor tal como un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora. El término "molécula multiespecífica" pretende incluir un agente que tiene más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a o interactuar con (a) un antígeno de la superficie celular, (b) un receptor tal como un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. En consecuencia, el término "anticuerpo contra un antígeno tumoral" incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras multiespecíficas que se dirigen a un antígeno tumoral, y a otros objetivos, tales como receptores de Fc en las células efectoras. El término "anticuerpos biespecíficos" incluye, además, diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica única, pero mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo cual fuerza, de ese modo, a que los dominios se aparean con dominios complementarios de otra cadena y crea dos sitios de unión al antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P., y otros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., y otros, (1994) Structure 2: 1121-1123).
De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo puede ejercer su efecto terapéutico mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales y/o mediante un resto o agente terapéutico acoplado al anticuerpo. Para el propósito de la presente enseñanza, dichos conjugados de anticuerpos pueden considerarse como abarcados por el término "agente quimioterapéutico", mientras que los anticuerpos que ejercen su efecto terapéutico a través del reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales no lo son.
En el contexto de la presente enseñanza, un anticuerpo es capaz, preferentemente, de actuar mediante el reclutamiento del sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales, es decir, el anticuerpo, en particular cuando se une a su objetivo tal como un antígeno tumoral en una célula enferma, provoca funciones efectoras inmunitarias como se describe en la presente descripción. Preferentemente, dichas funciones efectoras inmunitarias se dirigen contra células tales como células cancerosas que portan en su superficie un antígeno tumoral tal como la CLDN18.2 en su superficie.
El término "funciones efectoras inmunitarias", en el contexto de la presente enseñanza, incluye cualesquiera funciones mediadas por componentes del sistema inmunitario que resultan, por ejemplo, en la inhibición del crecimiento tumoral y/o la inhibición del desarrollo tumoral, lo que incluye la inhibición de la diseminación tumoral y la metástasis. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias resultan en la destrucción de células cancerosas. Dichas funciones comprenden la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), la inducción de apoptosis en las células que portan el antígeno tumoral, la citólisis de las células que portan el antígeno tumoral y/o la inhibición de la proliferación de las células que portan el antígeno tumoral. Los agentes de unión pueden también ejercer un efecto simplemente mediante la unión a los antígenos tumorales en la superficie de una célula cancerosa. Por ejemplo, los anticuerpos pueden bloquear la función del antígeno tumoral o inducir la apoptosis solo por la unión al antígeno tumoral en la superficie de una célula cancerosa.
Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos
La ADCC describe la capacidad de destruir células de las células efectoras, en particular linfocitos, que requieren preferentemente, que la célula objetivo esté marcada por un anticuerpo.
La ADCC ocurre preferentemente cuando los anticuerpos se unen a los antígenos en las células tumorales y los dominios Fc del anticuerpo se enlazan con los receptores Fc (FcR) en la superficie de las células efectoras inmunitarias. Se han identificado varias familias de receptores de Fc, y las poblaciones celulares específicas que expresan de manera característica los receptores definidos de Fc. La ADCC puede verse como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que conduce a la presentación del antígeno y a la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferentemente, la inducción in vivo de la ADCC conducirá a respuestas de células T dirigidas a los tumores y a respuestas de anticuerpos derivadas del huésped.
Citotoxicidad dependiente del complemento
La CDC es otro método de destrucción celular que puede ser dirigido por anticuerpos. La IgM es el isotipo más efectivo para la activación del complemento. Además, las IgG1 e IgG3 son ambas muy efectivas para dirigir la CDC a través de la vía clásica de activación del complemento. Preferentemente, en esta cascada, la formación de complejos antígenoanticuerpo resulta en la exposición de sitios de unión múltiples a C1q en estrecha proximidad en los dominios Ch2 de las moléculas de anticuerpos participantes, tales como las moléculas IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferentemente, estas exposiciones de los sitios de unión a C1q convierten la interacción C1q-IgG, previamente de baja afinidad, en una interacción de alta avidez, que dispara una cascada de eventos que implican una serie de otras proteínas del complemento y que conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos, y activadores de las células efectoras, C3a y C5a. Preferentemente, la cascada del complemento termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan el paso libre de agua y solutos dentro y fuera de la célula.
Para inhibir el crecimiento tumoral y/o el desarrollo tumoral, de acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo puede conjugarse con un resto o agente terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o un radioisótopo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial a y, en particular, mate a las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, amanitina, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y sus análogos u homólogos de estos. Los agentes terapéuticos adecuados para formar anticuerpos conjugados incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y platino cisdiclorodiamina (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). En una modalidad que se prefiere, el agente terapéutico es un agente citotóxico o un agente radiotóxico. En otra modalidad, el agente terapéutico es un inmunosupresor. En otra modalidad más, el agente terapéutico es GM-CSF. En una modalidad que se prefiere, el agente terapéutico es doxorrubicina, cisplatino, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida o ricina A.
Los anticuerpos también pueden conjugarse a un radioisótopo, por ejemplo, yodo 131, itrio 90 o indio 111, para generar radiofármacos citotóxicos.
Los anticuerpos conjugados de la enseñanza pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada y el resto de fármaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o su fragmento activo, tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-Y; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina 2 ("IL-2"), interleuquina 6 ("IL-6"), factor de estimulación de colonias de macrófagos granulocitos ("GM-CSF"), factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Las técnicas para conjugar tales restos terapéuticos a anticuerpos se conocen bien, ver, por ejemplo, Arnon y otros, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y otros (eds.), páginas. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y otros, "Antibodies For Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery (2da Ed.), Robinson y otros (eds.), páginas. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987);
Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y otros (eds.), páginas. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of
The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y otros (eds.), páginas. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y otros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58(1982).
El término "anticuerpo contra un antígeno tumoral" o términos similares, se refiere a un anticuerpo dirigido a o que tiene la capacidad de unirse al antígeno tumoral. De acuerdo con la enseñanza, el término "unión" se refiere, preferentemente, a una unión específica.
De acuerdo con la presente enseñanza, un anticuerpo es capaz de unirse a un objetivo predeterminado si tiene una afinidad significativa por dicho objetivo predeterminado y se une a dicho objetivo predeterminado en ensayos estándar.
La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación en equilibrio (Kd). Preferentemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a un objetivo predeterminado con una constante de disociación (Kd) de 10'5 M o inferior, 1°'6 M o inferior, 1°'7 M o inferior, 1°'8 M o inferior, 1°'9M o inferior, 1°'1° M o 1°'12 M o inferior.
Un anticuerpo no es (sustancialmente) capaz de unirse a un objetivo si no tiene una afinidad significativa por dicho objetivo y no se une significativamente, en particular no se une de manera detectable a dicho objetivo en ensayos estándar.
Preferentemente, el anticuerpo no se une de manera detectable a dicho objetivo si está presente en una concentración de hasta 2, preferentemente 1°, con mayor preferencia 2°, en particular 5° o 10° pg/ml o superior. Preferentemente, un anticuerpo no tiene afinidad significativa por un objetivo si se une a dicho objetivo con una Kd que es al menos 1° veces,
1°° veces, 1°3-veces, 1°4-veces, 1°5-veces, o 1°6-veces mayor que la Kd para unirse al objetivo predeterminado al cual el anticuerpo es capaz de unirse. Por ejemplo, si la Kd para la unión de un anticuerpo al objetivo al cual el anticuerpo es capaz de unirse es 1°'7 M, la Kd para unirse a un objetivo para el cual el anticuerpo no tiene afinidad significativa sería de al menos 1°-6 M, 1°'5 M, 1°'4 M, 1°'3 M, 1°'2 M o 1°'1 M.
Un anticuerpo es específico para un objetivo predeterminado si es capaz de unirse a dicho objetivo predeterminado mientras que no es capaz de unirse a otros objetivos, es decir, no tiene afinidad significativa por otros objetivos y no se une significativamente a otros objetivos en ensayos estándar. De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo es específico para un antígeno tumoral si es capaz de unirse al antígeno tumoral pero no es (sustancialmente) capaz de unirse a otros objetivos. Preferentemente, un anticuerpo es específico para un antígeno tumoral si la afinidad y la unión a dichos otros objetivos no excede significativamente la afinidad o unión a proteínas no relacionadas con el antígeno tumoral tales como la albúmina de suero bovino (BSA), la caseína, la albúmina de suero humano (HSA) o proteínas transmembrana distintas de antígenos tumorales tales como moléculas de MHC o receptor de transferrina o cualquier otro polipéptido especificado.
Preferentemente, un agente es específico para un objetivo predeterminado si se une a dicho objetivo con una Kd que es al menos 1° veces, 1°° veces, 1°3 veces, 1°4 veces, 1°5 veces, o 1°6 veces menor que la KDde unión a un objetivo para el que no es específico. Por ejemplo, si la Kd de unión de un anticuerpo al objetivo para el que es específico es 1°'7 M, la
Kd de unión a un objetivo para el que no es específico pudiera ser de al menos 1°'6 M, 1°'5 M, 1°'4 M, 1°'3 M, 1°'2 M, o
1°-1 M.
La unión de un anticuerpo a un objetivo puede determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado; ver, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos que se describen en la presente descripción. Las afinidades pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, tales como la diálisis de equilibrio; mediante el uso del instrumento BIAcore
2 °°°, mediante el uso de procedimientos generales delineados por el fabricante; por radioinmunoensayo mediante el uso del antígeno objetivo radiomarcado; o por otro método conocido por el experto en la técnica. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard y otros, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:66° (1949). La afinidad que se mide a una interacción particular antígeno anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo,
Kd, IC5Ü, se llevan a cabo preferentemente, con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.
Como se usa en la presente descripción, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que codifican los genes de la región constante de la cadena pesada.
Como se usa en la presente descripción, "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.
El término "presente de manera natural" como se usa en la presente descripción como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de un polipéptido o polinucleótido
que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio, está presente de manera natural.
El término "reordenado" como se usa en la presente descripción se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera en donde un segmento V está ubicado inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio completo VH o VL, respectivamente. Un locus del gen de la inmunoglobulina (anticuerpo) reordenado puede identificarse por comparación con el ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado.
El término "no reordenado" o "configuración de línea germinal" como se usa en la presente descripción en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no se recombina para estar inmediatamente adyacente a un segmento D o J.
Preferentemente, la unión de un anticuerpo contra un antígeno tumoral a células que expresan el antígenotumoral induce o media la destrucción de las células que expresan el antígeno tumoral. Las células que expresan un antígeno tumoral son, preferentemente, células cancerosas y son, en particular, células de las enfermedades cancerosas descritas en la presente descripción. Preferentemente, el anticuerpo induce o media la destrucción de las células al inducir una o más de lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), apoptosis e inhibición de la proliferación de células que expresan un antígeno tumoral. Preferentemente, la lisis de las células mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras, que en modalidades particulares se seleccionan del grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y las PMN. La inhibición de la proliferación de células puede medirse in vitro mediante la determinación de la proliferación de células en un ensayo mediante el uso de bromodeoxiuridina (5-bromo-2-desoxiuridina, BrdU). BrdU es un nucleósido sintético que es un análogo de la timidina y puede incorporarse en el ADN recién sintetizado de las células en replicación (durante la fase S del ciclo celular), mediante la sustitución de la timidina durante la replicación del ADN. La detección del químico incorporado mediante el uso, por ejemplo, de anticuerpos específicos para BrdU indica que las células estuvieron activamente replicando su ADN.
En modalidades preferidas, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden caracterizarse por una o más de las siguientes propiedades:
a) especificidad por un antígeno tumoral;
b) una afinidad de unión a un antígeno tumoral de aproximadamente 100 nM o menos, preferentemente, aproximadamente 5-10 nM o menos y, con mayor preferencia, aproximadamente 1-3 nM o menos,
c) la capacidad de inducir o mediar CDC en células positivas para el antígeno tumoral;
d) la capacidad de inducir o mediar ADCC en células positivas para el antígeno tumoral;
e) la capacidad de inhibir el crecimiento de células positivas para el antígeno tumoral;
f) la capacidad de inducir apoptosis de células positivas para el antígeno tumoral.
En una modalidad, un anticuerpo contra un antígeno tumoral tiene la capacidad de unirse a un epítopo presente en el antígeno tumoral, preferentemente, un epítopo ubicado dentro de los dominios extracelulares del antígeno tumoral. Preferentemente, un anticuerpo contra un antígeno tumoral es específico para el antígeno tumoral. Preferentemente, un anticuerpo contra un antígeno tumoral se une al antígeno tumoral expresado en la superficie de las células. En modalidades preferidas particulares, un anticuerpo contra un antígeno tumoral se une a epítopos nativos del antígeno tumoral presente en la superficie de las células vivas.
De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 o un anticuerpo contra la CLDN18.2, es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo presente en la CLDN18.2, preferentemente, un epítopo que se ubica dentro de los dominios extracelulares de la CLDN18.2, en particular el primer dominio extracelular, preferentemente, las posiciones de los aminoácidos 29 a 78 de la CLDN18.2. En modalidades particulares, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es un anticuerpo capaz de unirse a (i) un epítopo en la CLDN18.2 que no está presente en la CLDN18.1, preferentemente, SEQ ID NO: 3, 4 y 5, (ii) un epítopo localizado en el bucle 1 de la CLDN18.2, preferentemente, SEQ ID NO: 8, (iii) un epítopo localizado en el bucle 2 de la CLDN18.2, preferentemente, SEQ ID NO: 10, (iv) un epítopo localizado en el bucle D3 de la CLDN18.2, preferentemente, SEQ ID NO: 11, (v) un epítopo, que abarca el bucle 1 de la CLDN18.2 y el bucle D3 de la CLDN18.2, o (vi) un epítopo no glicosilado localizado en el bucle D3 de la CLDN18.2, preferentemente, SEQ ID NO: 9.
De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es, preferentemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 pero no a la CLDN18.1. Preferentemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es específico para la CLDN18.2. Preferentemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 expresada en la superficie de la célula. En modalidades particulares preferidas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 se une a epítopos nativos de la CLDN18.2 presentes en la superficie de las células vivas. Preferentemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 y 48-50. Preferentemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es específico para las proteínas, péptidos o fragmentos inmunogénicos o derivados de estos mencionados anteriormente. Un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 puede obtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 y 48-50, o un ácido nucleico o célula huésped que expresa dicha proteína o péptido. Preferentemente, el anticuerpo se une a las células cancerosas, en particular a las células de los tipos de cáncer mencionados anteriormente y, preferentemente, no se une sustancialmente a las células no cancerosas.
Preferentemente, la unión de un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 a células que expresan la CLDN18.2 induce o media la destrucción de células que expresan la CLDN18.2. Las células que expresan CLDN18.2 son, preferentemente, células cancerosas y, en particular, se seleccionan del grupo que consiste en células cancerosas tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas, pulmonares, ováricas, de colon, hepáticas, de cabeza y cuello y de vesícula biliar. Preferentemente, el anticuerpo induce o media la destrucción de las células al inducir una o más de lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), apoptosis e inhibición de la proliferación de células que expresan la CLDN18.2. Preferentemente, la lisis de las células mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras, que en modalidades particulares se seleccionan del grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NKy las PMN.
En modalidades preferidas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 puede caracterizarse por una o más de las siguientes propiedades:
a) especificidad por la CLDN18.2;
b) una afinidad de unión a la CLDN18.2 de aproximadamente 100 nM o menos, preferentemente, aproximadamente 5­ 10 nM o menos y, con mayor preferencia, aproximadamente 1-3 nM o menos,
c) la capacidad de inducir o mediar CDC en células positivas para la CLDN18.2;
d) la capacidad de inducir o mediar ADCC en células positivas para la CLDN18.2;
e) la capacidad de inhibir el crecimiento de células positivas para la CLDN18.2;
f) la capacidad de inducir apoptosis de células positivas para la CLDN18.2.
En una modalidad particularmente preferida, un hibridoma depositado en el DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Alemania; nueva dirección: Inhoffenstr.7B, 31824 Braunschweig, Alemania) produce un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 y tiene la siguiente designación y número de acceso:
a. 182-D1106-055, núm. de acceso DSM ACC2737, depositado el 19 de octubre de 2005
b. 182-D1106-056, núm. de acceso DSM ACC2738, depositado el 19 de octubre de 2005
c. 182-D1106-057, núm. de acceso DSM ACC2739, depositado el 19 de octubre de 2005
d. 182-D1106-058, núm. de acceso DSM ACC2740, depositado el 19 de octubre de 2005
e. 182-D1106-059, núm. de acceso DSM ACC2741, depositado el 19 de octubre de 2005
f. 182-D1106-062, núm. de acceso DSM ACC2742, depositado el 19 de octubre de 2005,
g. 182-D1106-067, núm. de acceso DSM ACC2743, depositado el 19 de octubre de 2005
h. 182-D758-035, núm. de acceso DSM ACC2745, depositado el 17 de noviembre de 2005
i. 182-D758-036, núm. de acceso DSM ACC2746, depositado el 17 de noviembre de 2005
j. 182-D758-040, núm. de acceso DSM ACC2747, depositado el 17 de noviembre de 2005
k. 182-D1106-061, núm. de acceso DSM ACC2748, depositado el 17 de noviembre de 2005
l. 182-D1106-279, núm. de acceso DSM ACC2808, depositado el 26 de octubre de 2006
m. 182-D1106-294, núm. de acceso DSM ACC2809, depositado el 26 de octubre de 2006,
n. 182-D1106-362, núm. de acceso DSM ACC2810, depositado el 26 de octubre de 2006.
Los anticuerpos preferidos de acuerdo con la enseñanza son los producidos por y que pueden obtenerse a partir de los hibridomas descritos anteriormente; es decir, 37G11 en el caso de 182-D1106-055, 37H8 en el caso de 182-D1106-056, 38G5 en el caso de 182-D1106-057, 38H3 en el caso de 182-D1106-058, 39F11 en el caso de 182-D1106-059, 43A11 en el caso de 182-D1106-062, 61C2 en el caso de 182-D1106-067, 26B5 en el caso de 182-D758-035, 26D12 en el caso de 182-D758-036, 28D10 en el caso de 182-D758-040, 42E12 en el caso de 182-D1106-061, 125E1 en el caso de 182-D1106-279, 163E12 en el caso de 182-D1106-294 y 175D10 en el caso de 182-D1106-362; y las formas quimerizadas y humanizadas de estos.
En una modalidad, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en (i) un anticuerpo producido por lo que puede obtenerse a partir de un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 o DSM ACC2810, (ii) un anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo bajo (i), (iii) un anticuerpo que tiene la especificidad del anticuerpo bajo (i) y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno, en particular la región variable, del anticuerpo bajo (i) y preferentemente, que tiene la especificidad del anticuerpo bajo (i).
Los anticuerpos quimerizados preferidos y sus secuencias se muestran en la siguiente tabla.
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En modalidades preferidas, los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos de acuerdo con la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada (CH) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena pesada humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 13 o un fragmento de esta. En modalidades preferidas adicionales, los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos de acuerdo con la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena ligera (CL) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena ligera humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 o un fragmento de esta. En una modalidad preferida particular, los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos de acuerdo con la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden una CH que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una CH humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 13 o un fragmento de esta y que comprende una CL que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una CL humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 o un fragmento de esta.
En una modalidad, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal IgG1 quimérico ratón/humano que comprende cadena ligera variable murina kappa, región constante de cadena ligera kappa humana alotipo Km(3), región variable de cadena pesada murina, región constante de IgG1 humana, alotipo Glm(3).
En ciertas modalidades preferidas, las formas quimerizadas de anticuerpos incluyen anticuerpos que comprenden una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51 y un fragmento de estas y/o que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y un fragmento de estas.
En ciertas modalidades preferidas, las formas de anticuerpos quimerizados incluyen anticuerpos que comprenden una combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras seleccionadas entre las siguientes posibilidades (i) a (ix):
(i) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 14 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 o un fragmento de esta,
(ii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 15 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 20 o un fragmento de esta,
(iii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 16 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 22 o un fragmento de esta,
(iv) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 18 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25 o un fragmento de esta,
(v) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 17 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de esta,
(vi) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o un fragmento de esta,
(vii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 26 o un fragmento de esta,
(viii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27 o un fragmento de esta,
(ix) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 28 o un fragmento de esta, y
(x) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 51 o un fragmento de esta y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de esta.
Se prefiere particularmente el anticuerpo de acuerdo con (v) o (x).
"Fragmento" o "fragmento de una secuencia de aminoácidos" como se usó anteriormente, se refiere a una parte de una secuencia de anticuerpos, es decir, una secuencia que representa la secuencia de anticuerpos acortada en el extremo N y/o C terminal, que cuando reemplaza dicha secuencia de anticuerpo en un anticuerpo retiene la unión de dicho anticuerpo a CLDN18.2 y, preferentemente, las funciones de dicho anticuerpo como se describe en la presente descripción, por ejemplo, lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC. Preferentemente, un fragmento de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 80 %, preferentemente, al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los residuos de aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28 se refieren, preferentemente, a dicha secuencia en donde se eliminan 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 aminoácidos en el extremo N-terminal.
En una modalidad preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y un fragmento de estas.
En una modalidad preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 y un fragmento de estas.
En ciertas modalidades preferidas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende una combinación de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) seleccionada entre las siguientes posibilidades (i) a (ix):
(i) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 36 o un fragmento de esta,
(ii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 35 o un fragmento de esta,
(iii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 37 o un fragmento de esta,
(iv) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 40 o un fragmento de esta,
(v) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39 o un fragmento de esta,
(vi) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 38 o un fragmento de esta,
(vii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 o un fragmento de esta,
(viii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 42 o un fragmento de esta,
(ix) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de esta y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43 o un fragmento de esta.
Se prefiere particularmente el anticuerpo de acuerdo con (v).
De acuerdo con la enseñanza, el término "fragmento" se refiere, en particular, a una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), preferentemente, al menos a la región variable CDR3, de la región variable de la cadena pesada (VH) y/o de la región variable de la cadena ligera (VL). En una modalidad dichas una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) se seleccionan de un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3. En una modalidad particularmente preferida, el término "fragmento" se refiere a las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) y/o de la región variable de la cadena ligera (VL).
En una modalidad preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende una VH que comprende un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes modalidades (i) a (vi):
(i) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 14, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 14, CDR3: posiciones 116-125 de la SEQ ID NO: 14,
(ii) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 15, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 15, CDR3: posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 15,
(iii) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 16, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 16, CDR3: posiciones 116-124 de la SEQ ID NO: 16,
(iv) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 17, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 17, CDR3: posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 17,
(v) CDR1: posiciones 44-51 de la SEQ ID NO: 18, CDR2: posiciones 69-76 de la SEQ ID NO: 18, CDR3: posiciones 115-125 de la SEQ ID NO: 18, y
(vi) CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19.
En una modalidad preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende una VL que comprende un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes modalidades (i) a (ix):
(i) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 20, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 20, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 20,
(ii) CDR1: posiciones 49-53 de la SEQ ID NO: 21, CDR2: posiciones 71-73 de la SEQ ID NO: 21, CDR3: posiciones 110-118 de la SEQ ID NO: 21,
(iii) CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 22, CDR2: posiciones 70-72 de la SEQ ID NO: 22, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 22,
(iv) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 23, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 23, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 23,
(v) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 24, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 24, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 24,
(vi) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 25, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 25, CDR3: posiciones 115-122 de la SEQ ID NO: 25,
(vii) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 26, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 26, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 26,
(viii) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 27, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 27, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 27, y
(ix) CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 28, CDR2: posiciones 70-72 de la SEQ ID NO: 28, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 28.
En una modalidad preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende una combinación de VH y VL que comprende cada una un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes modalidades (i) a (ix):
(i) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 14, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 14, CDR3: posiciones 116-125 de la SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: posiciones 49-53 de la SEQ ID NO: 21, CDR2: posiciones 71-73 de la SEQ ID NO: 21, CDR3: posiciones 110-118 de la SEQ ID NO: 21,
(ii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 15, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 15, CDR3: posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 20, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 20, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 20,
(iii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 16, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 16, CDR3: posiciones 116-124 de la SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 22, CDR2: posiciones 70-72 de la SEQ ID NO: 22, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 22,
(iv) VH: CDR1: posiciones 44-51 de la SEQ ID NO: 18, CDR2: posiciones 69-76 de la SEQ ID NO: 18, CDR3: posiciones 115- 125 de la SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 25, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 25, CDR3: posiciones 115-122 de la SEQ ID NO: 25,
(v) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 17, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 17, CDR3: posiciones 116- 126 de la SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 24, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 24, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 24,
(vi) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117- 128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 23, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 23, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 23,
(vii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 26, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 26, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 26,
(viii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 27, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 27, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 27, y
(ix) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 28, CDR2: posiciones 70-72 de la SEQ ID NO: 28, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 28.
En modalidades preferidas adicionales, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende, preferentemente, una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), preferentemente, al menos la región variable CDR3, de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra la CLDN18.2, preferentemente, de un anticuerpo monoclonal contra la CLDN18.2 descrito en la presente descripción, y preferentemente, comprende una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), preferentemente, al menos la región variable CDR3, de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o regiones variables de cadena ligera (VL) descritas en la presente descripción. En una modalidad dichas una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se seleccionan de un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 descritas en la presente descripción. En una modalidad particularmente preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a la CLDN18.2 comprende, preferentemente, las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra la CLDN18.2, preferentemente, de un anticuerpo monoclonal contra la CLDN18.2 descrito en la presente descripción, y preferentemente, comprende las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o regiones variables de cadena ligera (VL) descritas en la presente descripción.
En una modalidad, un anticuerpo que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de los conjuntos de CDR como se describe en la presente descripción comprende dichas CDR junto con sus regiones marco intermedias. Preferentemente, la porción además incluirá al menos aproximadamente 50 % de una o ambas de las regiones de marco primera y cuarta donde el 50 % del C-terminal es de la primera región marco y el 50 % del N-terminal es de la cuarta región marco. La construcción de los anticuerpos hechos por técnicas de ADN recombinante puede resultar en la introducción de residuos N- o C-terminales a las regiones variables codificadas mediante los enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación, lo que incluye la introducción de enlazadores para unir las regiones variables de la enseñanza a secuencias adicionales de proteínas que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulinas, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o marcadores de proteínas.
En una modalidad, un anticuerpo que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de conjuntos de CDR como se describe en la presente descripción comprende dichas CDR en un marco de anticuerpo humano.
La referencia en la presente descripción a un anticuerpo que comprende con respecto a la cadena pesada de la misma una cadena particular, o una región o secuencia particular se refiere, preferentemente, a la situación en donde todas las cadenas pesadas de dicho anticuerpo comprenden dicha cadena, región o secuencia particular. Esto se aplica correspondientemente a la cadena ligera de un anticuerpo.
Debe entenderse que los anticuerpos que se describen en la presente descripción pueden suministrarse a un paciente mediante la administración de un ácido nucleico tal como ARN que codifica al anticuerpo y/o mediante la administración de una célula huésped que comprende un ácido nucleico tal como ARN que codifica el anticuerpo. Por lo tanto, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo cuando se administra a un paciente puede presentarse en la forma desnuda o en un vehículo adecuado para el suministro tal como en forma de liposomas o partículas virales, o dentro de una célula huésped. El ácido nucleico proporcionado puede producir el anticuerpo durante períodos prolongados de manera sostenida lo que mitiga la inestabilidad al menos parcialmente observada para los anticuerpos terapéuticos. Los ácidos nucleicos para suministrarse a un paciente pueden producirse por medios recombinantes. Si un ácido nucleico se administra a un paciente sin presentarse dentro de una célula huésped, se capta, preferentemente, por las células del paciente para la expresión del anticuerpo codificado por el ácido nucleico. Si un ácido nucleico se administra a un paciente mientras se presenta dentro de una célula huésped, se expresa, preferentemente, por la célula huésped dentro del paciente para producir el anticuerpo codificado por el ácido nucleico.
El término "ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, pretende incluir ADN y ARN tal como moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm, producidas de manera recombinante y sintetizadas de manera química. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. El ARN incluye transcritos in vitro de ARN (IVT ARN) o ARN sintético.
Los ácidos nucleicos pueden comprenderse en un vector. El término "vector", como se usa en la presente, incluye cualquiera de los vectores conocidos por la persona experta, lo que incluye vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos tales como fago lambda, vectores virales tales como vectores de adenovirus o baculovirus, o vectores cromosómicos artificiales tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) o cromosomas artificiales P1 (PAC). Dichos vectores incluyen vectores de expresión así como también de clonación. Los vectores de expresión comprenden los plásmidos así como también vectores virales y generalmente contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacteria, levadura, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se usan generalmente para ingenierizar y amplificar un cierto fragmento de ADN deseado y pueden carecer de las secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y, preferentemente, se compone totalmente o sustancialmente de residuos de ribonucleótidos. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosa. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tales como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de manera recombinante, así como también ARN modificado que difiere del ARN presente de manera natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo, a uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN pueden comprender también nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos que no son de origen natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden referirse como análogos o análogos de ARN de origen natural.
De acuerdo con la presente enseñanza, el término "ARN" incluye y, preferentemente, se refiere a "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que puede producirse mediante el uso de ADN como molde y codifica un péptido o proteína. El ARNm comprende típicamente una región no traducida 5' (UTR 5'), una región que codifica la proteína o péptido y una región no traducida 3' (UTR 3'). El ARNm tiene una vida media limitada en las células e in vitro. Preferentemente, el ARNm se produce por transcripción in vitro mediante el uso de un molde de ADN. En una modalidad de la enseñanza, el ARN se obtiene por transcripción in vitro o síntesis química. La metodología de la transcripción in vitro se conoce por la persona experta. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles de manera comercial.
Para aumentar la expresión y/o la estabilidad del ARN usado de acuerdo con la presente enseñanza, este puede modificarse, preferentemente, sin alterar la secuencia del péptido o la proteína expresados.
El término "modificación", en el contexto del ARN, como se usa de acuerdo con la presente enseñanza, incluye cualquier modificación del ARN que no se presenta naturalmente en dicho ARN. Dicho ARN modificado se abarca en la presente descripción por el término "ARN".
Por ejemplo, el ARN de acuerdo con la enseñanza puede tener ribonucleótidos modificados de origen natural o sintéticos para aumentar su estabilidad y/o disminuir su citotoxicidad. Por ejemplo, en una modalidad, en el ARN usado de acuerdo con la enseñanza se sustituye parcialmente o completamente, preferentemente, completamente, la 5-metilcitidina por citidina. Alternativa o adicionalmente, en una modalidad, en el ARN usado de acuerdo con la enseñanza se sustituye parcialmente o completamente, preferentemente, completamente, la pseudouridina por uridina.
En una modalidad, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con una caperuza 5' o un análogo de la caperuza 5'. El término "caperuza 5'" se refiere a una estructura de caperuza que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y consiste, generalmente, en un nucleótido de guanosina que se conecta al ARNm a través de un enlace trifosfato inusual 5' a 5'. En una modalidad, esta guanosina se metila en la posición 7. El término "caperuza 5' convencional" se refiere a una caperuza 5' de ARN de origen natural, preferentemente, a la caperuza 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente enseñanza, el término "caperuza 5'" incluye un análogo de la caperuza 5' que se asemeja a la estructura de la caperuza de ARN y se modifica para que posea la capacidad de estabilizar el ARN si se une a este, preferentemente, in vivo y/o en una célula.
Preferentemente, el ARN si se suministra a, es decir, se transfecta en, una célula, en particular una célula presente in vivo, expresa la proteína o péptido que codifica.
El término "transfección" se refiere a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ARN, en una célula. Para los propósitos de la presente enseñanza, el término "transfección" incluye, además, la introducción de un ácido nucleico en una célula o la captación de un ácido nucleico por dicha célula, en donde la célula puede presentarse en un sujeto, por ejemplo, un paciente. Por lo tanto, de acuerdo con la presente enseñanza, una célula para la transfección de un ácido nucleico descrito en la presente descripción puede estar presentein vitro o in vivo, por ejemplo la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo de un paciente. De acuerdo con la enseñanza, la transfección puede ser transiente o estable. Para algunas aplicaciones de la transfección, es suficiente si el material genético transfectado se expresa solo transientemente. Como el ácido nucleico que se introduce en el proceso de transfección no se integra usualmente en el genoma nuclear, el ácido nucleico extraño se diluirá a través de la mitosis o se degradará. Las células que permiten la amplificación episomal de ácido nucleicos reducen grandemente la tasa de la dilución. Si se desea que el ácido nucleico transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe ocurrir una transfección estable. El ARN puede transfectarse en las células para expresar transientemente su proteína codificada.
El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. La "Vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad, o número de moléculas. En el contexto de la presente enseñanza, la vida media de un ARN indica la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influenciar la "duración de la expresión" del ARN. Puede esperarse que el ARN que tiene una vida media larga se expresará por un período de tiempo prolongado.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en donde el código genético en una secuencia de ADN se transcribe a ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en donde el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en donde el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferentemente, mediante el uso de extractos celulares apropiados. Preferentemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcritos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y son abarcados, de acuerdo con la presente enseñanza, por el término "vector".
El término "traducción", de acuerdo con la enseñanza, se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o proteína.
El término "expresión" se usa, de acuerdo con la enseñanza, en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o proteínas, por ejemplo, por transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. Comprende también la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede sertransitoria o estable. De acuerdo con la enseñanza, el término expresión incluye, además, una "expresión aberrante" o "expresión anormal".
De acuerdo con la enseñanza, "expresión aberrante" o "expresión anormal" significa que la expresión se altera, preferentemente, se aumenta, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una cierta proteína, por ejemplo, un antígeno tumoral. Un aumento de la expresión se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 % o al menos 100 %, o más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime.
El término "expresado específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente solo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno tumoral expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa primariamente en la mucosa gástrica, y no se expresa en otros tejidos o no se expresa en un grado significativo en otros tipos de tejidos u órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en las células de la mucosa gástrica y en un grado significativamente menor en cualquier otro tejido, tal como el testículo, se expresa específicamente en las células de la mucosa gástrica. En algunas modalidades, un antígeno tumoral también puede expresarse específicamente bajo condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejidos u órganos, pero preferentemente en no más de 3 tipos diferentes de tejidos u órganos. En este caso, el antígeno tumoral se expresa entonces específicamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno tumoral se expresa bajo condiciones normales, preferentemente, en un grado aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno tumoral se expresa específicamente en pulmón y estómago.
De acuerdo con la enseñanza, el término "ARN codificante" significa que el ARN, si se presenta en el ambiente apropiado, preferentemente, dentro de una célula, puede expresarse para producir una proteína o péptido que codifica.
Algunos aspectos de la enseñanza se basan en la transferencia adoptiva de células huésped que se transfectan in vitro con un ácido nucleico tal como ARN que codifica un anticuerpo descrito en la presente descripción y se transfieren a receptores tales como pacientes, preferentemente, después de la expansión ex vivo de bajas frecuencias precursoras a números de células clínicamente relevantes. Las células huésped usadas para el tratamiento de acuerdo con la enseñanza pueden ser autólogas, alogénicas o singénicas con respecto a un receptor tratado.
El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se deriva del mismo sujeto. Por ejemplo, "trasplante autólogo" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Dichos procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que de cualquier otra manera resulta en el rechazo.
El término "alogénico" se usa para describir cualquier cosa que se deriva de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.
El término "singénico" se usa para describir cualquier cosa que se deriva de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos, es decir, gemelos o animales idénticos de la misma cepa endogámica, o sus tejidos.
El término "heterólogo" se usa para describir algo que consiste de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta del sujeto.
De acuerdo con la invención, el término "péptido" comprende oligo- y polipéptidos y se refiere a las sustancias que comprenden dos o más, preferentemente, 3 o más, preferentemente, 4 o más, preferentemente, 6 o más, preferentemente, 8 o más, preferentemente, 9 o más, preferentemente, 10 o más, preferentemente, 13 o más, preferentemente, 16 o más, preferentemente, 21 o más y hasta, preferentemente, 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferentemente, a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptidos" y "proteínas" son sinónimos y se usan indistintamente en la presente descripción.
La enseñanza dada en la presente descripción con respecto a secuencias de aminoácidos específicas, por ejemplo, aquellas que se muestran en el listado de secuencias, debe interpretarse como que también se relacionan con variantes de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que muestran propiedades idénticas o similares a aquellas de las secuencias de aminoácidos específicas.
Una propiedad importante es conservar la unión de un anticuerpo a un objetivo o mantener las funciones efectoras de un anticuerpo. Preferentemente, una secuencia que es una variante con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un anticuerpo conserva la unión de dicho anticuerpo a su objetivo y, preferentemente, las funciones de dicho anticuerpo como se describe en la presente descripción, por ejemplo, la lisis mediada por CDC o la lisis mediada por ADCC.
Los expertos en la técnica apreciarán que en particular las secuencias de las CDR, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse sin perder la capacidad de un anticuerpo de unirse a su objetivo. Por ejemplo, las regiones CDR serán idénticas o altamente homólogas a las regiones de anticuerpos especificadas en la presente descripción. Por "altamente homóloga" se contempla que de 1 a 5, preferentemente, de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones pueden hacerse en las CDR. Además, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse de manera que muestren homología sustancial con las regiones de anticuerpos específicamente descritos en la presente descripción.
El término "variante" de acuerdo con la enseñanza se refiere, en particular, a mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que se presentan de manera natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya relevancia frecuentemente no está clara. La secuenciación génica completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con una especie de origen diferente de una secuencia determinada de un ácido nucleico o aminoácido. El término "variante" abarcará cualquiera de las variantes modificadas postraduccionalmente y variantes conformacionales.
Para los propósitos de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la deleción en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína se denominan también variantes de truncamiento N-terminal y/o C-terminal.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque es posible también una inserción aleatoria con el tamizaje apropiado del producto resultante.
Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones aminoterminales y/o carboxiterminales de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos.
Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tales como por la eliminación de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos. Las deleciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.
Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo en la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. La preferencia está dada a las modificaciones que están en las posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre las proteínas o péptidos homólogos y/o al reemplazo de aminoácidos con otros que tienen propiedades similares. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteína son cambios conservadores de aminoácidos, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio conservador de aminoácidos involucra la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). En ocasiones la fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.
Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente, de identidad entre una secuencia de aminoácidos determinada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de la secuencia de aminoácidos determinada será de al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %. El grado de similitud o de identidad está dado, preferentemente, para una región del aminoácido que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consiste en 200 aminoácidos, el grado de similitud o de identidad se da, preferentemente, para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180, o aproximadamente 200 aminoácidos, preferentemente, aminoácidos continuos. En modalidades preferidas, el grado de similitud o identidad está dado por la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. El alineamiento para determinar la similitud de secuencia, preferentemente, la identidad de secuencia, puede realizarse con herramientas conocidas en la técnica, preferentemente, mediante el uso del mejor alineamiento de secuencia, por ejemplo, mediante el uso de Align, mediante el uso de configuraciones estándar, preferentemente, EMBOSS:needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. "Identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.
El término "porcentaje de identidad" pretende indicar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a comparar, se obtiene después del mejor alineamiento, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen en forma aleatoria y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente mediante la comparación de estas secuencias después de haberlas alineado de forma óptima, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" con el fin de identificar y comparar las regiones locales con similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede producirse, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 2444, o por medio de programas de ordenador que usan estos algoritmos (Ga p , BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASt A en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula mediante la determinación del número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, se divide este número entre el número de posiciones comparadas, y se multiplica el resultado obtenido por 100 de forma que se obtiene el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
El término "célula" o "célula huésped" se refiere, preferentemente, a una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no libera sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, organelos, o material genético. Una célula intacta, preferentemente, es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferentemente, dicho término se refiere, de acuerdo con la enseñanza, a cualquier célula que puede transfectarse con un ácido nucleico exógeno. Preferentemente, la célula cuando se transfecta con un ácido nucleico exógeno y se transfiere a un receptor puede expresar el ácido nucleico en el receptor. El término "célula" incluye células bacterianas; otras células útiles son células de levadura, células fúngicas o células de mamífero. Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas gramnegativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas, y cepas bacterianas gram positivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizo saccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris y Pichia methanolicd) y Hansenula. Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, 293 HEK y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibios, células de insectos, células de plantas y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas. Se prefieren particularmente células de mamífero para la transferencia adoptiva, tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivarse de una gran cantidad de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares tales como células del sistema inmunitario, en particular células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas y células T, células madre tales como células madre hematopoyéticas y células madre mesenquimales y otros tipos de células. Una célula presentadora de antígeno es una célula que muestra antígeno en el contexto de un complejo principal de histocompatibilidad en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo mediante el uso de su receptor de células T (TCR).
El término "animal transgénico" se refiere a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferentemente, transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es, preferentemente, capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén de cadena ligera humana y ya sea un transgén de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos humanos contra el antígeno tumoral cuando se inmuniza con un antígeno tumoral y/o células que expresan un antígeno tumoral. El transgén de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo, los ratones HuMAb, tales como los ratones HCo7 o HCol2, o el transgén de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describe en el documento núm. WO 02/43478. Dichos ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para un antígeno tumoral (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) al experimentar recombinación V-D-J y cambio de isotipo.
Como se usa en la presente descripción "Reducir", "disminuir" o "inhibir" significan una disminución global o la capacidad para causar una disminución global, preferentemente de 5 % o mayor, 10 % o mayor, 20 % o mayor, con mayor preferencia de 50 % o mayor, y con la máxima preferencia de 75 % o mayor, en el nivel, por ejemplo en el nivel de expresión o en el nivel de proliferación de las células.
Los términos tales como "aumentar" o "potenciar", preferentemente, se refieren a un aumento o potenciación de aproximadamente al menos un 10 %, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30 %, con mayor preferencia al menos 40 %, con mayor preferencia al menos 50 %, incluso más con mayor preferencia al menos 80 %, y con la máxima preferencia al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 10000 % o incluso más.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden producirse mediante una variedad de técnicas, que incluyen la metodología convencional de anticuerpos monoclonales por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohlery Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de los linfocitos B o técnicas de presentación en fagos mediante bibliotecas de genes de anticuerpos.
El sistema animal que prefiere para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen las parejas de fusión (por ejemplo, las células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión.
Otros sistemas de animales que se prefieren para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y el de conejo (por ejemplo se describen en Spieker-Polet y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
92:9348 (1995), ver también Rossi y otros, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
Aún en otra modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse mediante el uso de ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones conocidos como HuMAb y KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en la presente descripción como "ratones transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en dichos ratones transgénicos puede realizarse como se describe en detalle para CD20 en el documento WO2004 035607.
Otra estrategia más para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente los genes que codifican los anticuerpos de linfocitos que producen anticuerpos de especificidad definida, por ejemplo, ver Babcock y otros, 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Para obtener detalles sobre la modificación genética de anticuerpos recombinantes, ver, además, Welschof y Kraus, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 y Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829­ 092-1.
Para generar los anticuerpos, los ratones pueden inmunizarse con portadores de péptidos conjugados derivados de la secuencia del antígeno, es decir, la secuencia contra la cual los anticuerpos deben dirigirse, una preparación enriquecida de antígeno expresado de manera recombinante o fragmentos de este y/o células que expresan el antígeno, como se describió. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica el antígeno o fragmentos de este. En caso de que las inmunizaciones que usan una preparación purificada o enriquecida del antígeno no resulten en anticuerpos, los ratones pueden también inmunizarse con células que expresan el antígeno, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.
La respuesta inmunitaria puede monitorearse en el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen por la vena de la cola o sangrados retroorbitales. Los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse de manera intraperitoneal o intravenosa con el antígeno que expresan las células 3 días antes del sacrificio y la eliminación del bazo para aumentar la tasa de hibridomas que secretan anticuerpos específicos.
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales, pueden aislarse los esplenocitos y las células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden luego tamizarse para la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Los pocillos individuales pueden luego tamizarse mediante ELISA para hibridomas que secretan anticuerpos. Por análisis de Inmunofluorescencia y FACS mediante el uso de las células que expresan el antígeno, pueden identificarse los anticuerpos con especificidad para el antígeno. Los hibridomas que secretan el anticuerpo pueden replaquearse, tamizarse de nuevo, y si todavía son positivos para los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse por dilución limitante. Los subclones estables pueden después cultivarse in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo tisular para la caracterización.
Los anticuerpos de la invención pueden producirse también en un transfectoma de células huésped mediante el uso, por ejemplo, de una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como se conoce bien en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Por ejemplo, en una modalidad, el o los genes de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, pueden ligarse en un vector de expresión tal como un plásmido de expresión eucariota tal como se usa por el sistema GS de expresión del gen descritos en los documentos núms. WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados puede introducirse en células huésped eucariotas, tales como las células CHO, células NS/0, células HEK293T o células HEK293 o alternativamente otras células eucariotas como células derivadas de plantas, células fúngicas o de levadura. El método que se usa para introducir estos genes puede estar entre los métodos que se describen en la técnica, tales como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de la introducción de estos genes de anticuerpos en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse. Estas células representan los transfectomas que luego pueden amplificarse para su nivel de expresión y aumentar su escala de producción de anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse a partir de estos sobrenadantes de cultivo y/o células.
Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión, que incluyen las células procariotas, tales como microorganismos, por ejemplo, E. coli. Además, los anticuerpos pueden producirse en animales transgénicos no humanos, tales como en la leche de ovejas y conejos o en huevos de gallinas, o en plantas transgénicas; ver por ejemplo Verma, R., y otros (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, y otros (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; y Fischer, R., y otros (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Quimerización
Los anticuerpos murinos son altamente inmunogénicos en el hombre cuando se aplican repetidamente lo que conduce a la reducción del efecto terapéutico. La inmunogenicidad principal está mediada por las regiones constantes de la cadena pesada. La inmunogenicidad de los anticuerpos murinos en el hombre puede reducirse o evitarse completamente si los respectivos anticuerpos se quimerizan o humanizan. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos, cuyas diferentes porciones se derivan de diferentes especies de animales, tales como aquellos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se logra por la unión de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo murino con la región constante de las cadenas pesada y ligera humana (por ejemplo como se describió por Kraus y otros, en Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). En una modalidad que se prefiere los anticuerpos quiméricos se generan mediante la unión de la región constante de la cadena ligera kappa humana a la región variable de la cadena ligera murina. En una modalidad que también se prefiere, los anticuerpos quiméricos pueden generarse mediante la unión de la región constante de la cadena ligera lambda humana a la región variable de la cadena ligera murina. Las regiones constantes de la cadena pesada que se prefieren para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgG1, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de la cadena pesada que se prefieren para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.
Humanización
Los anticuerpos interactúan con los antígenos objetivos predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que mimeticen las propiedades de los anticuerpos específicos presentes de manera natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo específico presente de manera natural injertado en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (ver,por ejemplo,Riechmann, L. y otros. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. y otros, (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. y otros, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Tales secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos públicas de ADN que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal diferirán de las secuencias génicas del anticuerpo maduro porque no incluirán los genes variables completamente ensamblados, que se forman por la unión V (D) J durante la maduración de la célula B. Las secuencias de genes de la línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad a nivel individual uniformemente a través de la región variable.
La capacidad de los anticuerpos para unirse a un antígeno puede determinarse mediante el uso de ensayos de unión estándar (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, Inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).
Para purificar los anticuerpos, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en frascos giratorios de dos litros para la purificación del anticuerpo monoclonal. Alternativamente, los anticuerpos pueden producirse en biorreactores basados en diálisis. Los sobrenadantes pueden filtrarse y, si es necesario, concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína G-sefarosa o proteína A-sefarosa. Las IgG eluidas pueden verificarse mediante la electroforesis en gel y la cromatografía líquida de alta resolución para asegurar la pureza. La solución tampón puede intercambiarse con PBS, y la concentración puede determinarse mediante OD280 mediante el uso de un coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden dividirse en alícuotas y almacenarse a -80 °C.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados se unen a epítopos únicos, puede usarse mutagénesis dirigida a sitio o dirigida a sitios múltiples.
Para determinar el isotipo de los anticuerpos, pueden realizarse ELISA de isotipo con varios kits comerciales (por ejemplo, Zymed, Roche Diagnostics). Los pocillos de las placas de microtitulación pueden recubrirse con Ig anti-ratón. Después del bloqueo, las placas se hacen reaccionar con anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. Los pocillos pueden hacerse reaccionar con IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3, IgA de ratón o sondas conjugadas con peroxidasa específicas de IgM de ratón. Después del lavado, las placas pueden revelarse con sustrato ABTS (1 mg/ml) y analizarse a una OD de 405-650. Alternativamente, puede usarse el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, No. Cat. 1493027) según lo descrito por el fabricante.
Con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan antígeno, puede usarse citometría de flujo. Las líneas celulares que expresan el antígeno natural o después de la transfección y los controles negativos que carecen de la expresión del antígeno (cultivadas en condiciones de crecimiento estándar) pueden mezclarse con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de hibridoma o en PBS que contiene un 1 % de FBS, y pueden incubarse a 4 °C durante 30 minutos. Después del lavado, el anticuerpo anti IgG marcado con APC o Alexa647 puede unirse al anticuerpo monoclonal unido a antígeno en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras pueden analizarse mediante citometría de flujo con un instrumento FACS mediante el uso de las propiedades de dispersión lateral de la luz para atravesar las células vivas únicas. Con el fin de distinguir los anticuerpos monoclonales específicos de antígeno de los ligandos no específicos en una única medición, puede emplearse el método de cotransfección. Las células transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican el antígeno y un marcador fluorescente pueden teñirse como se describió anteriormente. Las células transfectadas pueden detectarse en un canal de fluorescencia diferente al de las células teñidas con anticuerpos. Como la mayoría de las células transfectadas expresan ambos transgenes, los anticuerpos monoclonales antígeno específicos se unen preferentemente a las células que expresan marcadores de fluorescencia, mientras que los anticuerpos no específicos se unen en una proporción comparable a las células no transfectadas. Puede usarse un ensayo alternativo con microscopía de fluorescencia además de o en lugar del ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse exactamente como se describió anteriormente y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia.
Con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos en los sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan antígeno, puede usarse el análisis de microscopía de inmunofluorescencia. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan el antígeno de forma espontánea o después de la transfección y los controles negativos que carecen de la expresión del antígeno se cultivan en portaobjetos de cámara en condiciones de crecimiento estándar en medio DMEM/F12, complementado con suero fetal de ternera (FCS) al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 Ul/ml y estreptomicina 100 pg/ml. Las células pueden luego fijarse con metanol o paraformaldehído o dejarlas sin tratar. Las células pueden hacerse reaccionar con anticuerpos monoclonales contra el antígeno durante 30 min. a 25 °C. Después del lavado, las células pueden reaccionar con un anticuerpo secundario IgG anti-ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes) en las mismas condiciones. Las células se pueden examinar por microscopía de fluorescencia.
Pueden prepararse extractos de células que expresan antígeno y controles negativos apropiados y someterlos a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a las membranas de nitrocelulosa, se bloquearán y se analizarán con sondas con los anticuerpos monoclonales que se analizarán. La unión de IgG puede detectarse mediante el uso de peroxidasa anti-IgG de ratón y revelarse con sustrato ECL.
Los anticuerpos pueden probarse, además, para la reactividad con el antígeno mediante Inmunohistoquímica de una manera bien conocida por la persona experta, por ejemplo, por medio del uso de criosecciones fijadas con paraformaldehído o acetona o secciones de tejido embebidas en parafina fijadas con paraformaldehído de tejido no canceroso o muestras de tejido canceroso obtienidos de pacientes durante procedimientos quirúrgicos rutinarios o de ratones portadores de tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que expresan el antígeno espontáneamente o después de la transfección. Para la inmunotinción, los anticuerpos reactivos al antígeno pueden incubarse seguidos por anticuerpos conjugados de cabra anti-ratón o conjugados de cabra anti-conejo con peroxidasa de rábano (DAKO) de acuerdo con las instrucciones del vendedor.
Puede evaluarse la capacidad de los anticuerpos para mediar la fagocitosis y la destrucción de células que expresan un antígeno tumoral. La prueba de la actividad de anticuerpos monoclonales in vitro proporcionará un tamizaje inicial antes de probar modelos in vivo.
Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)
En resumen, las células polimorfonucleares (PMN), las células NK, los monocitos, las células mononucleares u otras células efectoras de donantes sanos pueden purificarse mediante centrifugación de densidad Ficol1Hypaque, seguido de lisis de eritrocitos contaminantes. Las células efectoras lavadas pueden suspenderse en RPMI suplementado con suero fetal de ternera inactivado por calor al 10 % o, alternativamente, con suero humano inactivado por calor al 5 % y mezclado con células objetivo marcadas con 51Cr que expresan un antígeno tumoral, a diversas relaciones de células efectoras con respecto a células objetivo. Alternativamente, las células objetivo pueden marcarse con un ligando potenciador de fluorescencia (BATDA). Un fluorómetro puede medir un quelato altamente fluorescente de Europio con el ligando potenciador que se libera de las células muertas. Otra técnica alternativa puede usar la transfección de células objetivo con luciferasa. El amarillo lucifer añadido puede oxidarse a continuación por solamente las células viables. Las IgG contra antígeno tumoral purificadas pueden añadirse a continuación a diversas concentraciones. La IgG humana irrelevante puede usarse como control negativo. Los ensayos pueden llevarse a cabo durante 4 a 20 horas a 37 °C, en dependencia del tipo de célula efectora usada. Las muestras pueden analizarse para determinar la citólisis mediante la medición de la liberación de 51Cr o la presencia del quelato EuTDA en el sobrenadante de cultivo. Alternativamente, la luminiscencia resultante de la oxidación del amarillo lucifer puede ser una medida de células viables.
Los anticuerpos monoclonales contra antigeno tumoral pueden probarse, además, en diversas combinaciones para determinar si la citólisis se potencia con múltiples anticuerpos monoclonales.
Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
Los anticuerpos monoclonales contra antígeno tumoral pueden probarse para determinar su capacidad para mediar la CDC mediante el uso de una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, el suero para el complemento puede obtenerse de la sangre de una manera conocida por el experto. Para determinar la actividad CDC de los AcM, pueden usarse diferentes métodos. La liberaci°n de 51Cr puede medirse, por ejemplo, o la permeabilidad de membrana elevada puede evaluarse mediante el uso de un ensayo de exclusión de yoduro de propidio (PI). Brevemente, las células objetivo pueden lavarse y 5 x 105/ml pueden incubarse con diversas concentraciones de AcM durante 10-30 min. a temperatura ambiente o a 37 °C. Después puede añadirse suero o plasma a una concentración final de 20 % (v/v) y las células se incuban a 37 °C durante 20-30 min. Todas las células de cada muestra pueden añadirse a la solución de PI en un tubo FACS. La mezcla puede analizarse inmediatamente mediante análisis de citometría de flujo por medio del uso de FACSArray.
En un ensayo alternativo, la inducción de CDC puede determinarse en células adherentes. En una modalidad de este ensayo, las células se siembran 24 h antes del ensayo con una densidad de 3 x 104/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano de cultivo de tejidos. Al día siguiente, se retira el medio de crecimiento y las células se incuban por triplicado con anticuerpos. Las células de control se incuban con medio de crecimiento o medio de crecimiento que contiene saponina al 0,2 % para la determinación de la lisis de fondo y la lisis máxima, respectivamente. Después de incubación durante 20 min. a temperatura ambiente, se extrae el sobrenadante y se añade a las células plasma o suero humano al 20 % (v/v) en DMEM (precalentado a 37 °C) y se incuba durante otros 20 min. a 37 °C. Todas las células de cada muestra se añaden a una solución de yoduro de propidio (10 pg/ml). Después, los sobrenadantes se reemplazan por PBS que contiene 2,5 pg/ml de bromuro de etidio y la emisión de fluorescencia tras la excitación a 520 nm se mide a 600 nm por medio del uso de un Tecan Safire. El porcentaje de lisis específica se calcula como sigue: % de lisis específica = (fluorescencia de la muestra-fluorescencia de fondo)/(fluorescencia de lisis máxima-fluorescencia de fondo) x 100.
Inducción de apoptosis e inhibición de la proliferación celular por anticuerpos monoclonales.
Para probar la capacidad de iniciar la apoptosis, los anticuerpos contra antígenos tumorales monoclonales pueden, por ejemplo, incubarse con células tumorales positivas para el antígeno tumoral o células tumorales transfectadas con antígeno tumoral a 37 °C durante aproximadamente 20 horas. Las células pueden cosecharse, lavarse en tampón de unión a Anexina-V (BD biosciences) e incubarse con Anexina V conjugada con FITC o APC (BD biosciences) durante 15 min. en la oscuridad. Todas las células de cada muestra pueden añadirse a la solución de PI (10 pg/ml en PBS) en un tubo FACS y evaluarse inmediatamente por citometría de flujo (como se indicó anteriormente). Alternativamente, una inhibición general de la proliferación celular por anticuerpos monoclonales puede detectarse con kits disponibles comercialmente. El kit de proliferación celular DELFIA (Perkin-Elmer, No. Cat. AD0200) es un inmunoensayo no isotópico basado en la medición de la incorporación de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) durante la síntesis de ADN de células en proliferación en microplacas. La BrdU incorporada se detecta mediante el uso de un anticuerpo monoclonal marcado con europio. Para permitir la detección de anticuerpos, las células se fijan y el ADN se desnaturaliza mediante el uso de solución Fix. El anticuerpo no unido se elimina por lavado y se agrega el inductor DELFIA para disociar los iones de europio del anticuerpo marcado en la solución, donde forman quelatos altamente fluorescentes con componentes del inductor DELFIA. La fluorescencia que se mide - mediante el uso de fluorometría resuelta en el tiempo en la detección -, es proporcional a la síntesis de ADN en la célula de cada pocillo.
Estudios preclínicos
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden analizarse, además, en un modelo en vivo (por ejemplo, en ratones inmunodeficientes que portan tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que expresan un antígeno tumoral para determinar su eficacia en el control del crecimiento de las células tumorales que expresan antígeno tumoral).
Estudios in vivo después de xenoinjertar células tumorales que expresan antígenos tumorales en ratones inmunocomprometidos u otros animales pueden realizarse mediante el uso de anticuerpos descritos en la presente descripción. Los anticuerpos pueden administrarse a ratones libres de tumor seguido de la inyección de células tumorales para medir los efectos de los anticuerpos para prevenir la formación de tumores o síntomas relacionados con el tumor. Los anticuerpos pueden administrarse a ratones con tumor para determinar la eficacia terapéutica de los anticuerpos respectivos para reducir el crecimiento tumoral, la metástasis o los síntomas relacionados con el tumor. La aplicación de anticuerpos puede combinarse con la aplicación de otras sustancias como fármacos citostáticos, inhibidores del factor de crecimiento, bloqueadores del ciclo celular, inhibidores de la angiogénesis u otros anticuerpos para determinar la eficacia sinérgica y la posible toxicidad de las combinaciones. Para analizar los efectos secundarios tóxicos mediados por anticuerpos, los animales pueden inocularse con anticuerpos o reactivos de control e investigarse a fondo en busca de síntomas relacionados posiblemente con la terapia anticuerpo contra antígeno tumoral. Los posibles efectos secundarios de la aplicación in vivo de anticuerpos contra antígenos tumorales incluyen particularmente toxicidad en tejidos que expresan antígeno tumoral. Los anticuerpos que reconocen un antígeno tumoral en humanos y en otras especies, por ejemplo, ratones, son particularmente útiles para predecir posibles efectos secundarios mediados por la aplicación de anticuerpos monoclonales contra antígenos tumorales en humanos.
El mapeo de epítopos reconocidos por anticuerpos puede realizarse como se describe en detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) por Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 y en "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 porOlwyn M. R. Westwood, FrankC. Hay.
Los compuestos y agentes descritos en la presente descripción pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada.
Las composiciones farmacéuticas son, preferentemente, estériles y contienen una cantidad eficaz de los agentes descritos en la presente descripción y opcionalmente de agentes adicionales como se analiza en la presente descripción para generar la reacción deseada o el efecto deseado.
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan usualmente en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse en una forma conocida per se. Una composición farmacéutica puede estar por ejemplo en la forma de una solución o una suspensión.
Una composición farmacéutica puede comprender sales, sustancias tamponantes, conservantes, portadores, diluyentes y/o excipientes todos los cuales son preferentemente aceptables farmacéuticamente. El término "aceptable farmacéuticamente" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.
Las sales que no son aceptables farmacéuticamente pueden usarse para preparar sales aceptables farmacéuticamente y se incluyen en la enseñanza. Las sales aceptables farmacéuticamente de este tipo comprenden en una manera no limitante, aquellas preparadas a partir de los ácidos siguientes: ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales aceptables farmacéuticamente pueden prepararse también como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.
Las sustancias tampón adecuadas para su uso en una composición farmacéutica incluyen ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.
Los conservantes adecuados para su uso en una composición farmacéutica incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno ytimerosal.
Una formulación inyectable puede comprender un excipiente aceptable farmacéuticamente tal como Lactato de Ringer.
El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de una naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina con el fin de facilitar, potenciar o habilitar la aplicación. De acuerdo con la enseñanza, el término "portador" incluye, además, uno o más agentes de relleno sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias de encapsulación, que son adecuadas para la administración a un paciente.
Las sustancias portadoras posibles para la administración parenteral son por ejemplo agua estéril, Ringer, lactato de Ringer, solución de cloruro de sodio estéril, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros biocompatibles de lactida, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.
El término "excipiente", cuando se usa en la presente descripción, pretende indicar todas las sustancias que pueden presentarse en una composición farmacéutica y que no son ingredientes activos tales como, por ejemplo, portadores, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes activos de superficie, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes, o colorantes.
Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse por cualquier vía convencional, tal como por administración parenteral que incluye por inyección o infusión. La administración es preferentemente parenteral, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica o intramuscular.
Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden usualmente una preparación acuosa o no acuosa estéril del componente activo, que es, preferentemente, isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de portadores y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, se usan aceites fijados, usualmente estériles, como solución o medio de suspensión.
Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se relaciona, preferentemente, con la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección puede ser también un retraso en la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o de dicha afección. En particular, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para resultar en la prevención del desarrollo, recurrencia o aparición de cáncer y uno o más síntomas de este, reducir la gravedad, la duración del cáncer, mejorar uno o más síntomas de cáncer, prevenir el avance del cáncer, provocar regresión del cáncer y/o prevenir la metástasis de cáncer. En una modalidad de la enseñanza, la cantidad de una terapia es eficaz para lograr una estabilización, reducción o eliminación de la población de células madre cancerosas y/o erradicación, eliminación o control de cáncer primario, cáncer metastásico y/o cáncer recurrente.
Una cantidad eficaz de un agente o composición descrito en la presente descripción dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, que incluyen la edad, la condición fisiológica, la talla y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si se presenta), la vía específica de administración y factores similares. En consecuencia, las dosis administradas de los agentes descritos en la presente descripción pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial pueden usarse dosis más altas (o dosis eficazmente mayores alcanzadas por una vía de administración diferente, más localizada).
Los agentes y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).
El tratamiento del cáncer representa un campo donde las estrategias de combinación son especialmente convenientes, ya que con frecuencia la acción combinada de dos, tres, cuatro o incluso más fármacos/terapias contra el cáncer genera efectos sinérgicos que son considerablemente más fuertes que el impacto de un enfoque monoterapéutico. Por lo tanto, en otra modalidad de la presente enseñanza, un tratamiento contra el cáncer puede combinarse eficazmente con diversos otros fármacos. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, combinaciones con terapias antitumorales convencionales, estrategias de múltiples epítopos, inmunoterapia adicional y enfoques de tratamiento dirigidos a la angiogénesis o la apoptosis (para revisión, ver, por ejemplo, Andersen y otros, 2008: Cancertreatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743). La administración secuencial de diferentes agentes puede inhibir el crecimiento de células cancerosas en diferentes puntos de control, mientras que otros agentes pueden, por ejemplo, inhibir la neoangiogénesis, la supervivencia de células malignas o metástasis, lo que convierte potencialmente el cáncer en una enfermedad crónica.
La presente enseñanza se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la enseñanza.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Análisis descriptivo de polimorfism os inm unitarios genéticos
El patrón individual de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el genoma del paciente podría ser predictivo de la tasa de respuesta del anticuerpo terapéutico IMAB362. Para investigar dichos patrones de s Np , todos los pacientes se genotiparon para una serie de SNP con un papel conocido o presunto en la respuesta inmunitaria y la susceptibilidad al cáncer gástrico.
En detalle, se abordaron las siguientes preguntas:
a. Los genotipos de SNP de cada paciente con respecto a los polimorfismos estudiados.
b. La frecuencia de los genotipos de SNP en la población de pacientes.
c. Identificación de pacientes con polimorfismos que pueden interferir directamente con el modo de acción de IMAB362 (receptor de Fc y polimorfismos del sistema del complemento).
d. La acumulación de genotipos de SNP por paciente descritos como factores de riesgo para la susceptibilidad al cáncer gástrico, la progresión del cáncer o el tratamiento del cáncer.
e. Correlación de genotipos de SNP con el resultado clínico.
f. Correlación de genotipos de SNP con la supervivencia libre de progresión (PFS).
Todos los pacientes de las cohortes 1,2 y 3 se analizaron en busca de polimorfismos genéticos. Se recolectaron muestras de sangre de pacientes el día 1 (V2a, preinfusión).
Se recolectaron muestras de sangre completa (9 ml, EDTA-Monovette) de todos los pacientes. La sangre con EDTA se almacenó en alícuotas de 1 ml inmediatamente después de la recolección de muestras en el centro de estudio a -20 °C. Las muestras de sangre con EDTA se enviaron en hielo seco (-70 °C) y se almacenaron a -20 °C. A su llegada, las muestras de sangre se almacenaron inmediatamente a -20 °C hasta el aislamiento del ADN.
Los SNP de interés se seleccionaron mediante una investigación bibliográfica centrada en los SNP que se conoce que afectan el funcionamiento del sistema inmunitario y especialmente los SNP que se han descrito que afectan el modo de acción de los anticuerpos terapéuticos como los receptores de Fc y los polimorfismos del sistema del complemento. Los SNP que se han descrito afectan la supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico, la susceptibilidad al cáncer (gástrico) o la progresión del cáncer gástrico también se seleccionaron y estudiaron.
Los polimorfismos genéticos se analizaron mediante ensayos de genotipado de SNP TaqMan™ (46 estándar, 5 personalizados; Life Technologies) sobre la plataforma de análisis de p Cr en tiempo real Fluidigm Biomark™. El aislamiento del ADN se realizó de acuerdo con protocolos estándar para el aislamiento del ADN genómico a partir de sangre completa. La plataforma de análisis de PCR en tiempo real Fluidigm Biomark™ permite genotipar hasta 96 muestras de pacientes con 96 SNP en una medición, ya que las muestras de pacientes y los cebadores de SNP específicos se aplican a un chip de laboratorio con 96 canales para muestras de ADN de pacientes y 96 canales ortogonales para los ensayos de SNP. El ADN genómico del paciente se preamplifica por amplificación específica de objetivo (STA). El ADN preamplificado se somete a análisis de PCR en tiempo real TaqMan™ en condiciones estándar en la plataforma de análisis de PCR en tiempo real Fluidigm Biomark™. La determinación alélica de los SNP se realizó para cada paciente y cada ensayo mediante el uso del programa informático patentado Fluidigm y el programa informático de análisis estadístico "R". Se confirmó un subconjunto de SNP mediante la secuenciación clásica de Sanger, ya que los resultados de Fluidigm eran ambiguos.
Se determinaron polimorfismos genéticos de 51 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) para 53 pacientes. La muestra de sangre de 1 paciente no permitió la extracción de ADN en cantidades suficientes para analizar los SNP. Se determinaron 6 genotipos de SNP para un subconjunto de 20 pacientes solamente. El genotipo para MDM2 SNP rs2279744 no se determinó en 9 pacientes debido a problemas técnicos. El resultado del genotipado PTGS2 rs20417 para 1 paciente fue ambiguo y no se investigó más a fondo.
La determinación de la matriz de genotipos de SNP para los pacientes probados permite realizar pruebas estadísticas de la población de pacientes en busca de cambios de frecuencia de genotipos en comparación con la frecuencia de genotipos en poblaciones de control caucásicas. Las frecuencias de genotipo de SNP en poblaciones de control caucásicas se basan en datos recogidos por proyectos internacionales de genotipado de SNP (HapMap-CEU, PGA-EUROPEAN-PANEL, CAUC1, pilot_1_CEU_low_coverage_panel, CEU_GENO_PANEL, PDR-90) depositados en la base de datos pública dbSNP (National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD, EE.UU.). El número de pacientes por genotipo de un SNP determinado se comparó con el número de pacientes por genotipo en poblaciones de control caucásicas. El número de pacientes por genotipo para las poblaciones de control se calculó mediante la multiplicación de la frecuencia relativa de genotipo de SNP proporcionada en la población con el número informado de muestras estudiadas. Esto permitió una prueba de Chi cuadrado directa para identificar diferencias estadísticamente significativas entre la población de pacientes y la población de control correspondiente.
La prueba de Chi cuadrado se realizó para 48 de los 51 SNP estudiados. Aún no se han depositado datos para las frecuencias de genotipo SNP en bases de datos públicas para SNP C1QA (rs1044378), FCGR2C (Q57X (C->T)) y MDM2 (rs2279744). Los SNP con un cambio estadísticamente significativo en la frecuencia del genotipo entre la población de pacientes y de control (5 de 48 SNP, p<0,05) se muestran en la Figura 1.
Se ha demostrado que 4 de estos 5 SNP desempeñan un papel en la susceptibilidad al cáncer/cáncer gástrico. Los 4 SNP de susceptibilidad al cáncer/cáncer gástrico muestran de hecho una sobrerrepresentación del genotipo asociado al cáncer respectivo en la población de pacientes, como se esperaba para los pacientes con cáncer gástrico (Tabla 1).
Hasta el momento, 1 de estos 5 SNP no ha demostrado hasta ahora ser un factor de riesgo/susceptibilidad en cáncer o cáncer gástrico, rs12146727 (C1S). Hasta ahora, este SNP solo se ha descrito una vez como un presunto factor de riesgo de enfermedad cardiovascular.
Tabla 1: SNP asociados a la susceptibilidad al cáncer gástrico con diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia del genotipo entre la población de pacientes y la de control.
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49 de los 51 SNP estudiados en la población de pacientes muestran un patrón de alelo variable en la población de pacientes estudiada. Esto permite probar los cambios de frecuencia de los alelos SNP entre las subpoblaciones de pacientes, lo que idealmente podría ayudar en la identificación de una supuesta población de respondedores. Solo 2 SNP, C1QA (rs1044378) y FCGr 2c (AHN1ME8) muestran un genotipo de SNP no variable en todos los pacientes, lo que impide cualquier tipo de análisis diferencial. Para 5 SNP, podría determinarse un cambio de frecuencia de alelo estadísticamente significativo en este estudio en comparación con las poblaciones de control, lo que proporciona una prueba de principio de que la frecuencia de alelo de SNP depende de la composición de una población dada. La selección de los SNP probada es, por lo tanto, adecuada para la identificación futura de candidatos a biomarcadores de SNP.
Los receptores de Fc y los polimorfismos del sistema del complemento pueden interferir directamente con el modo de acción de IMAB362. Los pacientes se genotiparon para alelos de SNP en genes que pueden afectar la eficacia de las terapias basadas en anticuerpos, como FCGR3A(F176V[T^-G], rs396991), FCGR2A(H131R [T^-C], rs1801274) y C1QA ([276A^G], rs172378) (Tabla 2).
Los pacientes se genotiparon para alelos de SNP publicados del gen FCGR2C (Q57X [C ^T ], sin número rs) y de los factores del sistema del complemento C1S (R119H [G ^A ], rs12146727) y C1QA (rs2920oi, rs1044378). Todavía no se ha demostrado que estos SNP afecten a la terapia con anticuerpos, pero se incluyeron como SNP candidatos interesantes.
Tabla 2: Pacientes con polimorfismos del receptor Fc y del sistema de complemento. Se enumeran los genotipos de SNP de pacientes con polimorfismos bien documentados del receptor Fc y del sistema del complemento. Los polimorfismos FCGR3A Val/Val con un presunto impacto positivo en la terapia con anticuerpos se representan en negritas y subrayados.
Los polimorfismos en FCGR2A (Arg/Arg) y C1QA [G/G] con un presunto impacto negativo en la terapia con anticuerpos se sombrean en gris y se resaltan en negritas.
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Un total de 23 pacientes muestran al menos uno de los polimorfismos bien documentados del receptor Fc y del sistema del complemento. 4 pacientes (100411, 101120, 200336 y 400109) eran homocigotos para el alelo FCGR3A (F176V [T^-G]), que se ha informado que aumenta las tasas de respuesta y la supervivencia libre de progresión en la terapia con anticuerpos. 12 pacientes son homocigotos para el alelo FCGR2A (H131R [T^-C]), otros 10 pacientes son homocigotos para el alelo C1QA ([276A^-G]). Se ha demostrado que ambos SNP tienen un impacto negativo en la terapia con anticuerpos. En total, 21 pacientes son homocigotos ya sea para el alelo FCGR2A (H131R [T ^C ]) o para el alelo C1QA ([276A^G ] (el paciente 100511 es homocigoto para ambos alelos de SNP).
Una correlación de los hallazgos anteriores con la progresión de la enfermedad de los pacientes puede dar una idea del papel del receptor de Fc y los polimorfismos del sistema del complemento para el tratamiento con IMAB362.
La progresión de la enfermedad y la eficacia del tratamiento con anticuerpos en pacientes podrían afectarse por la acumulación de SNP descritos como factores de riesgo para la susceptibilidad al cáncer gástrico, la progresión del cáncer o el tratamiento del cáncer. Entre los 51 SNP investigados, hasta 43 SNP permiten la categorización de los respectivos genotipos de SNP como genotipos de "riesgo" frente a "sin riesgo". Se contó el número de genotipos de factor de riesgo de SNP homocigotos por paciente, ya que estos se describen en general como los alelos de riesgo más relevantes. La Figura 2 representa la frecuencia relativa del número de genotipos de riesgo homocigotos por paciente en relación con el número de factores de riesgo de SNP investigados por paciente.
Se observa una acumulación del 14 al 46 % de los genotipos de riesgo investigados por paciente. Esta amplia distribución permite investigar si la acumulación de genotipos de riesgo de SNP por paciente se correlaciona con el resultado clínico del paciente.
En resumen, 53 de 54 pacientes se genotiparon con éxito para 51 SNP. 49 de 51 SNP muestran un patrón de alelo de SNP variable, lo que permite el análisis de subpoblaciones de pacientes en busca de un cambio significativo en la frecuencia del genotipo SNP. Polimorfismos del receptor Fc y del sistema del complemento homocigotos descritos como moduladores de la terapia con anticuerpos se descubren en 23 de 53 pacientes. Se observa una acumulación del 14 al 46 % de los genotipos de riesgo investigados por paciente.
Ejemplo 2: Correlación del genotipado de SNP con resultados clínicos
El objetivo de la correlación del resultado clínico con los genotipos de polimorfismos genéticos es la identificación de presuntos candidatos a biomarcadores de SNP que predicen el resultado clínico de los pacientes. Los presuntos candidatos a biomarcadores identificados en este análisis se verificarán en estudios posteriores de Fase IIb y Fase III. La verificación de los presuntos candidatos a biomarcadores en la Fase IIb permitirá la diferenciación entre los presuntos candidatos a SNP predictivos y de pronóstico.
El análisis de correlación para cada SNP con el resultado clínico se realizó de forma independiente para dos poblaciones de pacientes de ensayos clínicos de fase IIa definidos: La población de 'conjunto de análisis completo' (FAS) con 40 pacientes y la población de 'conjunto por protocolo' con 21 pacientes.
Se cuantificaron por SAS Enterprise Guide 6.1 las frecuencias absolutas de los genotipos del SNP respectivo para cada grupo de resultados clínicos ("respondedor", "no respondedor") de la población de pacientes. Las frecuencias absolutas del genotipo se organizaron en tablas de contingencia (3x2 o 2x2) estructuradas por resultado clínico y genotipo de SNP. La prueba estadística estándar empleada fue la prueba de Chi cuadrado de Pearson. La prueba exacta de Fisher se aplicó en algunos casos para tablas de contingencia de 2x2 si la estructura numérica del conjunto de datos impedía el uso de la prueba de Chi cuadrado de Pearson. El nivel de significación estadística aplicado fue p<0,05. El análisis de correlación se realizó con el programa informático de análisis estadístico SAS Enterprise Guide 6.1.
Para investigar el efecto de los genotipos de SNP sobre la supervivencia libre de progresión, se calcularon las curvas de Kaplan-Meier para cada grupo y después se compararon formalmente mediante el empleo de la prueba estadística de rango logarítmico. El nivel de significación estadística aplicado fue p<0,05. Las estadísticas de rango logarítmico se realizaron con el programa informático de análisis estadístico SAS Enterprise Guide 6.1.
La correlación del resultado clínico con el genotipo de SNP se realiza para identificar presuntos candidatos a biomarcadores de SNP predictivos o de pronóstico. La correlación se estudió en dos poblaciones de pacientes, la población FAS y la población PP.
La población FAS comprende 40 pacientes, 12 pacientes definidos como 'respondedores' (resultado clínico 'remisión parcial' o 'enfermedad estable') y 28 pacientes como 'no respondedores' (resultado clínico 'progresión de la enfermedad'). Una muestra de paciente (100801, no respondedor) de la población FAS no estaba disponible para el análisis de SNP como se describió anteriormente, por lo tanto, el número máximo de pacientes FAS analizados para correlaciones se redujo a 39. La población PP comprende 21 pacientes con 10 pacientes respondedores y 11 pacientes no respondedores.
El número de pacientes investigados por SNP difiere entre 20 y 39 (en la población FAS) y 20 a 21 (en la población PP).
El análisis de la correlación se realizó como se describió anteriormente. En total, de los 51 SNP estudiados, 2 muestran una correlación estadísticamente significativa con el resultado clínico en la población FAS así como también en la población PP.
Los 2 SNP que muestran correlación estadística entre el resultado clínico y el genotipo de SNP respectivo en ambas poblaciones son rs1801274 de FCGR2A (p=0,0004 [PP]; p=0,008 [FAS]) e rs1800896 de IL-10 (p=0,042 [PP], p=0,022 [FAS]) (Tabla 3). El número de pacientes evaluados estadísticamente por SNP fue de 21 (PP) y 39 (FAS) para cada uno de estos 2 SNP.
Tabla 3: SNP que muestran una correlación estadística entre el resultado clín ico y el genotipo de SNP en la población PP, así como también en la población FAS.
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(Prueba de chi cuadrado, estadísticamente significativa: p <0,05)
5 SNP muestran una correlación con el resultado clínico en una población de pacientes (FAS o PP), como puede mostrarse para rs1550117 de DNMT3A [PP, p=0,035], rs12456284 de SMAD4 [FAS, p=0,02], rs4072037 de MUC1 (FAS, p=0,03), rs4444903 de EGF [FAS, p=0,049], y rs16260 de CDH1 [FAS p=0,049]) (Tabla 4).
Tabla 4: SNP que muestran correlación estadística entre el resultado clín ico y el genotipo de SNP en la población PP o FAS.
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La inspección de la sobre o subrepresentación de los genotipos de SNP en pacientes respondedores/no respondedores puede permitir proporcionar una explicación científica de las diferencias en frecuencia estadísticamente significativas. Los genotipos de dos SNP, rs11615 (ERCC1) y rs396991 (FCGR3A), se correlacionan con la supervivencia libre de progresión prolongada (PFS) en la población PP (Tabla 5).
Tabla 5: SNP que muestran correlación estadística entre la PFS prolongada y el genotipo SNP en la población
PP.
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El número de pacientes evaluados estadísticamente por SNP fue 21 (PP) y 39 (FAS) para cada uno de los 9 SNP enumerados.
rs1801274 de FCGR2A [C/T]: En PP, todos los pacientes que albergan el genotipo heterocigoto rs1801274 [CT] son realmente respondedores (8), lo que se refleja en el valor p altamente significativo (0,0004) de la prueba estadística. Todos los pacientes con PR (4 de 4) muestran este genotipo. La mayoría de los no respondedores (73 %, 8 de 11) muestran el genotipo homocigoto [TT] (Tabla 6). Este patrón de distribución del genotipo puede encontrarse también en la población FAS, aunque no tan distinto como en la población PP (Tabla 7). Varios pacientes no respondedores en la población FAS también albergan el genotipo [CT] (30 %), lo que conduce a un valor de p menos pronunciado pero aún estadísticamente muy significativo.
Tabla 6 : Listado de genotipos rs1801274 (FCGR2A) en pacientes PP y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y pacientes no respondedores (PD).
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Tabla 7: Listado de genotipos rs1801274 (FCGR2A) en pacientes FAS y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs1801274 de FCGR2A[C/T]: Se espera que la sobrerrepresentación altamente significativa del genotipo rs1801274 [CT] en la población de respondedores se refleje también en una correlación con el tiempo de supervivencia libre de progresión (PFS) prolongada. De hecho, en ambas poblaciones, PP (Fig. 3) y FAS (Fig.4), el genotipo [CT] se correlaciona con PFS prolongada (PP p=0,0007, FAS p=0,03) también altamente significativo. Sin embargo, es interesante que durante los primeros 60 días de tratamiento los pacientes FAS con el genotipo [TT] muestran una tendencia a una tasa de PFS más alta que los pacientes con genotipo [CC] o [CT]. El análisis de supervivencia confirma por lo tanto a rs1801274 (FCGR2A) como un presunto candidato biomarcador muy interesante de naturaleza predictiva o pronóstica.
rs1800896 de IL-10 [A/G]: En PP, ninguno de los pacientes no respondedores alberga el genotipo homocigoto rs1800896 [GG] (Tabla 8). Este genotipo se encuentra con frecuencia elevada (40 %) en pacientes respondedores (4 de cada 10). Solo 1 de cada 10 respondedores (10 %) muestra el genotipo [AA], el resto de los respondedores muestran el genotipo heterocigoto [GA]. En FAS, puede observarse una distribución de frecuencia de genotipo comparable (Tabla 9), aunque el genotipo [Gg ] puede observarse en los pacientes no respondedores en esta población a una baja frecuencia (11 %, 3 de 27).
Tabla 8: Listado de genotipos rs1800896 (IL-10) en pacientes PP y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Tabla 9: Listado de genotipos rs1800896 (IL-10) en pacientes FAS y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs1800896 (IL-10) [A/G]: El genotipo rs1800896 [GG] se sobrerrepresenta significativamente en pacientes respondedores. La correlación estadística del genotipo [GG] con PFS muestra que en la población PP y FAS, el genotipo [GG] no se correlaciona significativamente con PFS (PP p=0,27 (Fig. 5); FAS p=0,08, (Fig. 6)). Sin embargo, el valor p para la correlación de supervivencia de FAS limita con la significación, lo que puede ser una indicación de que en poblaciones más grandes con una significación del ruido estadístico reducida bien pudiera alcanzarse. En general, rs1800896 (IL-10) es un presunto candidato biomarcador interesante.
rs1550117 de DNMT3A [G/A]: En PP, 4 respondedores (40 %) muestran el genotipo [GA] mientras que todos los no respondedores muestran el genotipo [GG] (p=0,03, Tabla 10).
Tabla 10: Listado de genotipos rs1550117 (DNMT3A) en pacientes PP y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs1550117 (DNMT3A) [G/A]: El genotipo rs1550117 [GA] se sobrerrepresenta significativamente en pacientes respondedores de la población PP. En la población FAS, la diferencia en PFS entre portadores [GA] y [GG] es de significación límite (FAS p=0,058) (Figura 7).
En la población FAS, solo un paciente es portador del genotipo [AA].
rs12456284 de SMAD4 [G/A]: En FAS, puede encontrarse una sobrerrepresentación estadísticamente significativa del genotipo [GA] (7 de 12 pacientes, 58 %) sobre el genotipo [AA] y [GG] en la población de respondedores (p=0,023, Tabla 11). En la población de no respondedores FAS, la frecuencia del genotipo [GA] puede encontrarse a una frecuencia del 19 % (5 de 27 no respondedores). En la población PP, esta asociación se indica por la significación de la tendencia (p=0,081, datos no mostrados).
Tabla 11: Listado de genotipos rs12456284 (SMAD4) en pacientes FAS y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs12456284 (SMAD4) [G/A]: El genotipo rs12456284 [GA] se sobrerrepresenta significativamente en pacientes respondedores a FAS y muestra la misma tendencia en los respondedores PP. La correlación estadística de los genotipos rs12456284 con PFS muestra que en la población PP, el genotipo [GA] se correlaciona significativamente con PFS (PP p=0,048) mediante el uso de la prueba de Gehan-Brelow-Wilcoxon (Figura 8), mientras que la significación mediante el uso de la prueba de rango logarítmico es p=0,35. La prueba de Gehan-Brelow-Wilcoxon da más peso a los eventos de PFS en los puntos temporales tempranos que la prueba de rango logarítmico y, de hecho, la diferencia entre los portadores [GA] y [AA] es más pronunciada durante los primeros 100 días respectivos de este ensayo clínico de fase IIa. En la población FAS, el genotipo [GA] no se correlaciona significativamente con PFS (p=0,20 (rango logarítmico), p=0,23 (Gehan-Brelow-Wilcoxon)), aunque la inspección visual sugiere una tendencia de los portadores de [GA] a PFS prolongado.
rs4072037 de MUC1 [A/G]: En FAS, el genotipo rs4072037 encontrado con la frecuencia más alta del 67 % en la población de respondedores es [AA](8 de 12), mientras que los no respondedores muestran este genotipo en solo el 26 % de los pacientes (7 de 27). Ninguno de los pacientes respondedores muestra el genotipo [GG] homocigoto (Tabla 12) mientras que los no respondedores muestran el genotipo [GG] a una tasa del 22 % (6 de 27). Esta distribución diferencial del genotipo en pacientes FAS respondedores y no respondedores es estadísticamente significativa (p=0,03). Se encuentra un patrón de distribución de genotipo comparable en la población de PP (datos no mostrados), donde el respondedor muestra casi la misma frecuencia de genotipo relativa [a A] del 70 % (7 de 10) que en la población FAS (significación de tendencia p=0,11).
Tabla 12: Listado de genotipos rs4072037 (MUC1) en pacientes FAS y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs4072037 (MUC1) [A/G]: La sobrerrepresentación significativa del genotipo rs4072037 [AA] en pacientes respondedores puede indicar la correlación de este genotipo con PFS. Las pruebas estadísticas revelan que en la población Pp y FAS, el genotipo [AA] se correlaciona significativamente con PFS (PP p=0,001, (Fig. 9); FAS p=0,02, (Fig. 10)). Este análisis de supervivencia confirma rs4072037 (MUC1) como un presunto candidato a biomarcador predictivo o de pronóstico muy interesante.
rs4444903 de EGF [G/A]: En FAS, el genotipo rs4444903 [AA] se sobrerrepresenta significativamente (p=0,049) en la población respondedora (5 de 12; 42 %) en comparación con la población no respondedora (3 de 27; 11 %) (Tabla 13). En la población PP, esta distribución asimétrica no es estadísticamente significativa (p=0,32, datos no mostrados).
Tabla 13: Listado de genotipos rs4444903 (EGF) en pacientes FAS y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs4444903 (EGF) [G/A]: La correlación del genotipo rs4444903 [AA] con PFS en la población PP o FAS no es estadísticamente significativa (FAS p=0,1; PP p=0,16). Sin embargo, puede observarse una tendencia hacia la PFS prolongada tanto en la población PP como en la FAS (Figura 11).
rs16260 de CDH1 [C/A]: En FAS, el genotipo rs16260 [AA] se encuentra a una frecuencia significativamente mayor en la población respondedora (5 de 12; 42 %) que en la no respondedora (3 de 27; 11 %) (p=0,049, Tabla 14). En PP, esta distribución asimétrica entre ambos grupos de pacientes no es significativa (p=0,72, datos no mostrados).
Tabla 14: Listado de genotipos rs16260 (CDH1) en pacientes FAS y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs16260 (CDH1) [C/A]: La correlación del genotipo [AA] rs16260 (CDH1) con PFS limita con la significación estadística en la población FAS (prueba de rango logarítmico p=0,065, prueba de Gehan-Brelow-Wilcoxon p=0,032) (Figura 12).
rs11615 de ERCC1 [C/T]: En PP, se encuentra una tendencia a una mayor frecuencia del genotipo rs11615 [TT] en la población respondedora (3 de 10; 30 %) (p=0,068; población no respondedora (0 %)). Inversamente, el genotipo homocigoto [CC] solo se encuentra en la población no respondedora (2 pacientes) (Tabla 15).
Tabla 15: Listado de genotipos rs11615 (ERCC1) en pacientes PP y frecuencias respectivas en pacientes respondedores (PR y SD) y no respondedores (PD).
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Análisis de supervivencia de rs11615 (ERCC1) [C/T]: El genotipo rs11615 [TT] se encuentra exclusivamente en la población de respondedores en la población PP. La correlación estadística de los genotipos rs11615 con PFS muestra que el genotipo rs11615 en PP se correlaciona altamente con PFS, con portadores [CT] y [TT] que muestran una supervivencia prolongada en comparación con los portadores [CC] (PP p=0,0001) (Figura 13). A pesar de este sorprendente valor de significación, debe señalarse que solo hay 2 pacientes con el genotipo [CC] y 3 pacientes con el genotipo [TT] en PP. Sin embargo, en la población FAS puede observarse el mismo efecto como una tendencia (FAS p=0,13, datos no mostrados), lo que sugiere que el efecto también es válido en poblaciones de pacientes más grandes. Análisis de supervivencia de rs396991 de FCGR3A [T/G]: Ni en PP o FAS, el genotipo de SNP rs396991 se correlaciona con el resultado clínico (FAS p=0,49; PP p=0,29, datos no mostrados). Sin embargo, el análisis de supervivencia en la población PP indica con alta significación estadística que los pacientes con los genotipos [TG] y [TT] muestran una PFS mejorada en comparación con [GG] (p=0,0007, Figura 14). Este efecto puede observarse, además, en la población FAS (p=0,25; datos no mostrados). A pesar del valor de significación recibido para la población de PP, debe señalarse que solo 3 pacientes PP son portadores [GG].
Ejemplo 3: Discusión de los análisis complementarios de polimorfism o inmunitario
El objetivo principal de este ensayo clínico de fase IIa fue la evaluación de la seguridad y la eficacia del anticuerpo mononuclear terapéutico anti-CLDN18.2 IMAB362 en pacientes con adenocarcinomas gastroesofágicos. Además, se realizaron análisis complementarios sobre polimorfismos de respuesta inmunitaria genética para evaluar los parámetros que pueden servir como biomarcadores predictivos o de pronóstico potenciales en correlación con la terapia con IMAB362. Discusión del análisis descriptivo del polimorfism o inmunitario
Se ha demostrado que los polimorfismos genéticos en el genoma del paciente alteran la tasa de respuesta de los anticuerpos terapéuticos. Para investigar el impacto de la variación genética individual en la tasa de respuesta, se determinaron los genotipos de 51 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con papel conocido o presunto en la respuesta inmunitaria y la susceptibilidad o el progreso del cáncer gástrico en los pacientes.
En este estudio, se genotiparon con éxito 51 SNP para 53 de 54 pacientes estudiados. Pudo detectarse un cambio estadísticamente significativo de la frecuencia del genotipo en la población de pacientes en comparación con las poblaciones de control para 5 SNP. 4 de estos SNP han demostrado antes asociarse con la susceptibilidad al cáncer/cáncer gástrico. Los respectivos genotipos asociados a cáncer/cáncer gástrico de estos 4 SNP se sobrerrepresentan en la población de estudio, como se esperaba en una población de pacientes con GC avanzado. La sobrerrepresentación del genotipo homocigoto respectivo puede indicar un modo de acción recesivo que implica una función genética comprometida en lugar de una actividad genética potenciada. Esto se subraya con datos publicados, por ejemplo, se ha informado que el genotipo AA asociado a cáncer gástrico de SNP rs16260 en CDH1 provoca una regulación negativa de la expresión de CDH1 debido a su posición en el promotor de CDH1 en -160.
Los polimorfismos en los genes que se involucran en la señalización inmunitaria se investigaron incluso si estos polimorfismos no se habían descrito antes como factores de riesgo de cáncer gástrico. Se ha demostrado que los polimorfismos genéticos en genes que codifican factores de señalización inmunitaria modulan significativamente el riesgo de desarrollar cáncer gástrico. La tasa de respuesta de una terapia contra el cáncer basada en anticuerpos también podría afectarse por estos SNP.
El genotipo de IL-2 GG sobrerrepresentado (SNP rs2069762) en la población de pacientes se asocia con un riesgo aumentado de atrofia gástrica inducida por infección con H. pylori y puede predisponer al cáncer gástrico. Los genotipos CTLA4 SNP rs231775 y rs2274223 (PLCE1) se han descrito como factores de riesgo de susceptibilidad para GC. Como los estudios publicados sobre rs231775 son contradictorios sobre la secuencia del genotipo, sin embargo, no se extraerá ninguna conclusión aquí. Los polimorfismos del receptor Fc y del sistema del complemento se investigaron en este estudio. El genotipo FCGR3A posiblemente beneficioso que codifica Val/Val [GG] se detecta en 4 pacientes con APT, el genotipo FCGR2A con un impacto potencialmente negativo (Arg/Arg) [CC] puede detectarse en 12 pacientes con APT.
La CDC como un segundo mecanismo efector se ha demostrado también que se afecta por los polimorfismos de SNP: Un portador de alelos de un polimorfismo en el componente del complemento C1qA ([276A->G], rs172378) muestra una respuesta prolongada después de la terapia con Rituximab del linfoma folicular. El polimorfismo del sistema del complemento en C1QA con el genotipo 'Gg ' se detecta en 10 pacientes, lo que afecta posiblemente la respuesta negativamente. Sin embargo, el polimorfismo de SNP rs12146727 en el componente C1S del complemento se ha descrito hasta ahora solo en un tamiz no relacionado con terapias de anticuerpos o cáncer.
La identificación de cambios significativos en la frecuencia del genotipo entre las poblaciones de pacientes y de control demuestra que los cambios en la frecuencia del genotipo SNP pueden servir como marcadores predictivos y de pronóstico en estudios clínicos.
La acumulación de alelos de riesgo de SNP también puede tener un impacto en el resultado clínico de los pacientes. Para permitir dicho análisis, se contó el número de genotipos de riesgo de SNP homocigotos por paciente. La correlación de estos números con la respuesta a la terapia puede dar una idea del papel de la acumulación de factores de riesgo de SNP.
Discusión de la correlación del genotipado de SNP con el resultado clínico
rs1801274 de FCGR2A:
La inspección de los genotipos FCGR2A sobrerrepresentados o subrepresentados revela que en la población PP todos los pacientes con el genotipo heterocigoto rs1801274 [CT] son pacientes respondedores y que los pacientes con respuesta parcial (PR) albergan exclusivamente este genotipo. El genotipo homocigoto sobrerrepresentado en la población no respondedora es [TT]. La simple observación de estas distribuciones de frecuencia no permite concluir si el genotipo [CT] es beneficioso o si el [TT] es desventajoso. En la mayoría de los estudios que investigan el impacto de los genotipos de SNP, los genotipos homocigotos respectivos muestran los efectos biológicos más fuertes, lo que indica a menudo un modo de acción recesivo que refleja la función genética comprometida de ambos alelos en oposición a la actividad genética potenciada. En caso de que los alelos SNP conduzcan a una mayor actividad genética, a menudo puede observarse un efecto gradual del efecto biológico: Un alelo (es decir, heterocigoto) aumenta la actividad del gen, dos alelos (es decir, homocigoto) aumentan la actividad del gen aún más. En ambos casos, la ganancia de función o la pérdida de función, los efectos biológicos/clínicos más fuertes se observan generalmente en pacientes con genotipos homocigotos. Bajo esta presunción, la sobrerrepresentación del genotipo homocigoto [TT] en la población no respondedora en la población PP y FAS provocaría un efecto desventajoso.
Sin embargo, esto es inesperado, ya que el genotipo rs1801274 de FCGR2A[TT] se ha descrito en una serie de estudios clínicos como un factor que tiene un efecto de prolongación sobre la PFS. En nuestro ensayo clínico de fase IIa, una inspección más estrecha de la asociación entre el genotipo y la PFS en pacientes no respondedores FAS indica que los pacientes con PD de FAS con el genotipo [TT] muestran durante los primeros 60 días de tratamiento una tendencia hacia tiempos de PFS más altos en oposición a pacientes con PD de FAS con el genotipo [CT] (comparar la Tabla 7 y la Figura 4). Una interpretación para alinear esta observación con la subrepresentación de [TT] en respondedores con PFS prolongada podría ser una superposición de dos mecanismos moleculares diferentes: Primero, el genotipo rs1801274 [CT] podría ser un marcador para pacientes respondedores. Esta es una nueva observación no descrita en la literatura hasta ahora y puede sugerir que este genotipo es un marcador predictivo para el tratamiento con IMAB362. El mecanismo molecular que subyace en esta nueva observación aún no se ha resuelto.
La segunda observación, ya descrita en la literatura para otros anticuerpos terapéuticos contra el cáncer, sería la PFS prolongada de pacientes que albergan el genotipo FCGR2A [TT]. En nuestro estudio de fase IIa, este efecto se debe a la superposición del primer mecanismo postulado que solo se observa como una tendencia en pacientes no respondedores. Mecanísticamente, la segunda observación podría explicarse por el aumento de la afinidad de unión del anticuerpo IgG1 al alelo del receptor FCGR2A 131 His/His (codificado por el genotipo [TT]) en oposición a la afinidad de unión más débil al alelo homocigoto del receptor FCGR2A 131 Arg/Arg (codificado por el genotipo [CC]): En estudios que investigan el impacto de los polimorfismos del receptor Fcy sistemáticamente, se ha demostrado recientemente que los anticuerpos del isotipo IgG1 se unen de hecho con diferentes afinidades a las dos formas alélicas del receptor Fcy IIA, a H131 con una afinidad más alta que a R131. En general, se supone que la afinidad diferencial de los anticuerpos IgG por los alelos del receptor FCGR2A afecta la tasa de activación de los mecanismos efectores y, en consecuencia, la PFS prolongada en pacientes que albergan el alelo del receptor de alta afinidad. Los datos que respaldan esta hipótesis se han proporcionado por informes que muestran que los polimorfismos del receptor de Fcy FCGR2A H131R y FCGR3A F176V (Phe > Val, rs396991) pueden tener un impacto en la eficacia clínica de la terapia con anticuerpos IgG1 basados en Trastuzumab en pacientes con cáncer de mama metastásico. Los pacientes con los genotipos FCGR3A 176 Val/Val y FCGR2A 131 His/His mostraron una tasa de respuesta y una supervivencia libre de progresión significativamente mejor. Los mismos polimorfismos también se han asociado con la tasa de respuesta de pacientes tratados con rituximab (IgG1) con linfomas de células B. En otro estudio, la PFS prolongada después de la terapia con Cetuximab (IgG1) podría asociarse con el genotipo FCGR3A 176 Val/Val. De manera controvertida, existen estudios recientes bien informados que informan que no hay asociación entre los polimorfismos del receptor Fcy y la supervivencia, la tasa de respuesta o la supervivencia libre de progresión para los anticuerpos analizados. En el ensayo BCIRG-006 del Breast Cancer International Research Group (BCIRG), 1218 pacientes se trataron en un estudio aleatorizado con dos grupos experimentales que contienen Trastuzumab y un grupo experimental de control que no es Trastuzumab. Las asociaciones informadas anteriormente entre los polimorfismos del receptor Fcy y la eficacia de Trastuzumab no pudieron confirmarse. Un estudio a largo plazo con 460 pacientes que emplearon rituximab combinado con quimioterapia en linfoma folicular no informó asociación de polimorfismos del receptor Fcy con la supervivencia libre de progresión. En el ensayo REACH con 419 pacientes, donde los pacientes recibieron fludarabina y ciclofosfamida (FC) o rituximab más FC, los polimorfismos FCGR2Ay FCGR3A no influyeron significativamente en el resultado. Ensayos recientes con Cetuximab también arrojaron resultados inconsistentes, los que no recomendaron los polimorfismos del receptor Fcy como biomarcadores útiles. Esto puede reflejar diferencias en factores de la población intrínsecos o regímenes de quimioterapia concurrentes.
rs4072037 de MUC1:
MUC1 es una glucoproteína transmembrana de la familia de las mucinas. Las mucinas son proteínas de alto peso molecular que se O-glicosilan en el dominio extracelular N-terminal ampliamente con oligosacáridos y cadenas de nglicanos. Las mucinas se expresan en la superficie apical de los epitelios que revisten los tractos y conductos respiratorios y gastrointestinales en el hígado, el páncreas y los riñones. Las mucinas transmembrana atraviesan la membrana con una hélice a y proporcionan con sus cadenas de azúcar un revestimiento protector al espacio extracelular. Las mucinas secretadas hacia el espacio extracelular acumulan una capa de gel mucoso que sirve como protección física adicional para el epitelio. La MUC1 transmembrana y las mucinas secretadas MUC5C y MUC6 son las principales mucinas expresadas en el estómago. MUC1 se traduce como una cadena polipeptídica única sujeta a autoescisión. El dominio extracelular N-terminal (MUC1-N) permanece inicialmente no conectado covalentemente al dominio transmembrana/intracitoplasmático (MUC1-C). Este dominio intracitoplasmático sirve como un dominio de señalización que puede ingresar al núcleo y asociarse con varios factores de transcripción para activar la expresión génica directamente. El estrés celular puede conducir a la escisión proteolítica del dominio MUC1-N y MUC1-C mediante un segundo sitio proteolítico. Esto puede observarse, además, en las células cancerosas, donde MUC1 ya no se expresa de manera ordenada en la membrana apical de la célula, pero puede encontrarse sobreexpresada y localizada por toda la célula. La proyección del dominio extracelular (también conocido como CA15-3) hacia el espacio extracelular y la localización intracelular de MUC1-C es la consecuencia. El dominio de señalización intracitoplasmática actúa como un oncogén, por ejemplo, mediante la activación de la señalización de Wnt/p-catenina y el bloqueo de las vías apoptóticas.
Sin embargo, el dominio extracelular de MUC1 no es solo un componente estructural estático, sino que juega papeles importantes durante los eventos de señalización en la membrana celular. Se ha demostrado que el estado de glicosilación y expresión del dominio extracelular de MUC1 regula las interacciones de las moléculas de señalización de membrana y la matriz extracelular. Se ha informado que la MUC1-N subglicosilada en las células tumorales aumenta la señalización entre las moléculas de membrana como ICAM-1 o E-selectina y la nucleoproteína de MUC1. Además, la expresión de la mucina y el estado de glicosilación parecen enmascarar las moléculas asociadas a la membrana. En las células cancerosas, el enmascaramiento de las proteínas HER2 por expresión de mucina se ha descrito como un posible mecanismo de resistencia a la terapia con Trastuzumab.
El alelo rs4072037 'A' de polimorfismo de MUC1 se ha descrito como un factor de riesgo para la susceptibilidad al cáncer gástrico. Este polimorfismo es un intercambio G->A en el Exón 2, lo que resulta en un corte y empalme alternativo de MUC1 exactamente en el sitio de escisión del péptido señal predicho de MUC1. La escisión deficiente del péptido señal podría conducir a un patrón de localización o glucosilación de proteína MUC1 aberrante y, en consecuencia, a una función proteica deficiente.
En este ensayo clínico de fase IIa, se ha encontrado que el genotipo rs4072037 [AA] se asocia estadísticamente con la población de respondedores. Podría especularse que la forma alélica [AA] subglicosilada o subexpresada de MUC1 permite un mejor acceso de IMAB362 a la molécula objetivo de membrana CLDN18.2 expresada en las células cancerosas, lo que promueve en consecuencia la eficacia del tratamiento. Esto haría de rs4072037 un biomarcador predictivo.
rs1800896 de IL-10:
IL-10 es un regulador clave del sistema inmunitario con funciones pleiotrópicas. Se conoce que IL-10 actúa como una citocina inmunosupresora e antiinflamatoria al inhibir la proliferación de células T específicas de antígeno dependiente de macrófagos y la producción de citocinas dependiente de macrófagos por parte de las células T. Sin embargo, también se ha descrito la IL-10 como una citocina inmunoestimuladora, que potencia la diferenciación y el crecimiento de células B, granulocitos y mastocitos, así como también la activación de células NKy células T CD8+. El potencial pleiotrópico de IL-10 se refleja, además, en la expresión generalizada de IL-10 en muchos tipos de células inmunitarias, lo que incluye células Th2, células Treg, células Th3, células T NK, células B, macrófagos y células dendríticas. Esta doble función de IL-10 se refleja en el potencial de promoción tumoral así como también en el potencial de inhibición tumoral: La IL-10 secretada por las células tumorales o las células inmunitarias infiltrantes de tumores como macrófagos permite que las células tumorales escapen de la vigilancia inmunitaria mediante mecanismos que se han aclarado solo en parte. Un mecanismo descrito involucra células Treg que contribuyen a la inducción de tolerancia periférica a través de la expresión de citocinas inmunorreguladoras como IL-10. Otro mecanismo informado es la inhibición de la presentación cruzada de antígenos asociados a tumores por las células dendríticas y, por lo tanto, impide que las células T comiencen una respuesta inmunitaria eficaz contra las células tumorales. Por otro lado, la exposición de células tumorales malignas a la IL-10 conduce a una regulación negativa de las proteínas HLA clase I, lo que resulta en una mayor sensibilidad a la citotoxicidad de las células NK.
El polimorfismo del promotor de rs1800896 de IL-10 en la posición (-1082) es de interés ya que el alelo 'G' se ha informado como factor de riesgo de cáncer gástrico y factor de riesgo de cáncer renal. Se ha informado que el alelo 'G' de este polimorfismo se asocia in vitro con la expresión disminuida de IL-10 en comparación con el alelo 'A'. En pacientes respondedores de este ensayo clínico de fase IIa, el genotipo [GG] de rs1800896 se sobrerrepresenta, lo que indica posiblemente un nivel de expresión relativa más baja de IL-10. Puede especularse que los pacientes que albergan el genotipo [GG] tienen una menor expresión de IL-10, lo que a su vez puede dificultar que las células tumorales escapen de la vigilancia inmunitaria por uno de los mecanismos descritos anteriormente. De hecho, ninguno de los 12 pacientes respondedores FAS muestra un nivel sérico elevado de IL-10 en comparación con el 22 % de los pacientes no respondedores FAS (6 de 27 medidos). Sin embargo, otros autores afirman que el alelo 'A' se asocia con una disminución de la expresión de la IL-10.
Debe tenerse en cuenta, además, que las señales de IL-10 a través del mediador intracelular Stat3 y que la activación de Stat3 depende de MUC1-C. Por lo tanto, la interacción funcional de MUC1 e IL-10 podría ser la razón por la cual ambas moléculas demostraron ser candidatos a biomarcadores estadísticamente significativos en este ensayo clínico de fase IIa. Finalmente, FCGR2A se expresa en macrófagos, que a menudo son una fuente importante de IL-10 en el microambiente tumoral. Si estos presuntos candidatos a biomarcadores prevalecen en estudios en curso y futuros, una investigación de la interacción funcional de estos factores puede ser de considerable interés.
rs1550117 (DNMT3A):
rs1550117 es un SNP en el gen DNMT3A que codifica la enzima ADN (citosina-5)-metiltransferasa 3A que cataliza la transferencia de grupos metilo a estructuras CpG específicas en el ADN lo que induce modificación epigenética. Se ha demostrado que el genotipo [AA] confiere un riesgo aumentado de cáncer gástrico en comparación con [GG] o [GA]. En este estudio [AA] pudo encontrarse solo en un paciente de la población FAS y en ningún paciente de la población PP. Esto puede indicar que [AA] confiere, además, un riesgo de supervivencia, ya que previene el tratamiento de tercera y cuarta línea de los portadores de [AA] en este ensayo clínico de fase IIa. El hallazgo de que [GA] se correlaciona significativamente con el resultado clínico en PP sugiere que este marcador mantiene potencial como biomarcador predictivo para el tratamiento con IMAB362.
rs12456284 (SMAD4):
rs12456284 es un SNP en el gen SMAD4 que codifica el cotransductor intracelular de señalización de TGFp/BMP "Madres contra el homólogo decapentapléjico 4". Se ha publicado que el genotipo [GG] disminuyó significativamente el riesgo de cáncer gástrico. La sobrerrepresentación estadísticamente significativa del genotipo heterocigoto [GA] sobre el genotipo [AA] en la población de respondedores FAS sugiere que este genotipo puede servir como biomarcador predictivo. La p Fs prolongada de pacientes de la población PP portadora de [GA] es un hecho de respaldo.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para evaluar
(i) si un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo a un antígeno tumoral es un respondedor al tratamiento con un anticuerpo contra el antígeno tumoral, y/o
(ii) si un paciente con cáncer que tiene un tumor positivo aun antígeno tumoral, experimentará una supervivencia libre de progresión,
en donde el antígeno tumoral es la proteína CLDN18.2;
dicho método que comprende determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en rs4072037 de MUC1, rs1800896 de IL-10, rs1550117 de DNMT3A, rs12456284 de SMAD4, rs4444903 de EGF, rs16260 de CDH1, y rs11615 de ERCC1 en una muestra obtenida de un paciente, en donde
(a) la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 [AA] de MUC1 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión;
(b) la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 [GG] de MUC1 indica un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo aumentado de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión;
(c) la presencia del genotipo homocigoto rs1800896 [GG] de IL-10 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión;
(d) la presencia del genotipo heterocigoto rs1550117 [GA] de DNMT3A indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión;
(e) la presencia del genotipo heterocigoto rs12456284 [GA] de SMAD4 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión;
(f) la presencia del genotipo homocigoto rs4444903 [AA] de EGF indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión;
(g) la presencia del genotipo homocigoto rs16260 [AA] de CDH1 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión; y
(h) la presencia del genotipo homocigoto rs11615 [TT] de ERCC1 indica un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no sea un respondedor al tratamiento con el anticuerpo y/o un riesgo reducido de que un paciente con cáncer no experimente una supervivencia libre de progresión.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo actúa al reclutar el sistema inmunitario del paciente para destruir las células tumorales, preferentemente, a través de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 17 o 51 o un fragmento de estas y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de esta.
4. Un anticuerpo que se une a CLDN18.2 para su uso en un método de tratamiento de un paciente con cáncer que tiene un tumor que es positivo para CLDN18.2, en donde el paciente se caracteriza por tener un riesgo reducido de no ser un respondedor al tratamiento con el anticuerpo,
en donde el riesgo reducido se evalúa al determinar el genotipo para uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en rs4072037 de Mu C1, rs1800896 de IL-10, rs1550117 de DNMT3A, rs12456284 de SMAD4, rs4444903 de EGF, rs16260 de CDH1 y rs11615 de ERCC1 en una muestra obtenida del paciente,
en donde el riesgo reducido se indica en una muestra tumoral obtenida del paciente por
(a la presencia del genotipo homocigoto rs4072037 [AA] de MUC1;
(b) la presencia del genotipo homocigoto rs1800896 [GG] de IL-10;
(c) la presencia del genotipo heterocigoto rs1550117 [GA] de DNMT3A;
(d) la presencia del genotipo heterocigoto rs12456284 [g A] de SMAD4;
(e) la presencia del genotipo homocigoto rs4444903 [AA] de EGF;
(f) la presencia del genotipo homocigoto rs16260 [AA] de CDH1; y
(g) la presencia del genotipo homocigoto rs11615 [TT] de ERCC1.
5. El anticuerpo para su uso de conformidad con la reivindicación 4, dicho método que comprende evaluar si el paciente con cáncer es un respondedor al tratamiento con un anticuerpo mediante el método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y tratar al paciente con cáncer con el anticuerpo si el paciente tiene un riesgo reducido de no ser un respondedor al tratamiento con el anticuerpo.
6. El anticuerpo para su uso de conformidad con la reivindicación 4 o 5, en donde el régimen de tratamiento comprende un tratamiento con un conjugado anticuerpo-fármaco y en donde el anticuerpo se dirige contra el antígeno tumoral, el conjugado anticuerpo-fármaco es, preferentemente, un anticuerpo acoplado a un resto radioactivo, quimioterapéutico o de toxina o en donde el conjugado anticuerpo-fármaco es un anticuerpo acoplado a un compuesto citostático o citotóxico.
7. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el anticuerpo para su uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el tumor es un tumor sólido.
8. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7 o el anticuerpo para su uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el tumor es un tumor gastroesofágico.
9. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 7 y 8 o el anticuerpo para su uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el tumor es un adenocarcinoma avanzado del estómago o el esófago inferior.
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