KR20220073224A - 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 본 발명에 따른 대황, 황금 및 황련을 포함하여 구성된 복합 추출물은 활막세포주의 증식 및 이동 억제, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, CCL2 및 CXCL2의 발현 또는 생성 억제, 관절부위로의 면역세포들의 침윤억제, 판누스(pannus) 형성억제 및 연골파괴 억제와 뼈 침식 억제 활성을 모두 가지고 있으며, 천연생약재 유래의 복합 추출물로서 부작용이 없기에 류마티스 관절염을 효과적으로 예방, 개선 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 대황(Rhei Rhizoma), 황금(Scutellariae Radix) 및 황련(Coptidis Rhizoma)의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis; RA)은 유전자 요인, 환경적 요인, 면역학적인 요인 등이 서로 연관되어 다양한 임상 양상을 일으키는 자가면역질환이다. 특히 한 가지가 아닌 여러 유전자가 관여하는 복잡한 유전자 질환이라 할 수 있다.
류마티스 관절염은 관절을 침범하는 만성 전신성 염증성 질환으로 병리학적으로 활막(synovium)의 비후 및 염증세포 침윤과 이로 인한 관절의 파괴를 특징으로 한다. 초기에는 면역반응에 의해 T 세포가 활성화되고 이로 인해 염증반응이 시작되는 것으로 알려졌지만 질환이 진행되어 말기로 갈수록 T 세포의 영향력은 감소하고 활막세포(synoviocyte)의 비정상적 증식 및 활성화로 인해 나타나는 연골파괴 분해효소 및 골 파괴인자의 활성화로 인해 관절 파괴가 지속적으로 나타나게 된다. 활막에 존재하는 세포는 림프구를 비롯하여, 대식세포, 단핵구, 섬유모세포, 중성구, NK세포, 비만세포 등 매우 다양하다. 류마티스 관절염의 발생은 이런 다양한 세포와 염증 유발 사이토카인(TNF-α, IL-1, IL-6, IL-17 등)의 상호 작용에 의해 복잡하게 일어나고 이것이 류마티스 관절염의 다양한 증상과 관련이 있다고 알려져 있다.
류마티스 관절염의 증상은 손가락, 발가락, 손목 등 말초 관절의 활막에 염증 및 면역세포의 침윤, 신생혈관의 생성 등 활막염(synovitis)이 발생하고, 관절 연골의 파괴 및 뼈 손상이 진행되어 관절의 기능 손상과 변형이 나타난다. 관절 증상 외에도 장기 침범(폐, 신장, 심장), 골다공증, 혈관염 등을 동반하기도 하며 전형적으로 여러 관절에 통증, 강직, 종창 등의 증상이 수 주에 걸쳐 서서히 나타난다. 약 2/3의 환자에서는 피로감, 식욕 부진, 전신 쇠약감, 모호한 근골격계 증상이 선행하며 이어 활막염이 발생한다.
한편, 류마티스 관절염의 치료제로는 항염증 스테로이드제(예컨대 프레드니솔론)나 비스테로이드계 항염증제(예컨대 인도메타신, 아스피린), 면역 억제제 [예컨대 사이클로스포린 A, 타크롤리무스(FK506), 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 아자티오프린], 질환 수식성 항류마티즘제(예컨대 금 염 제제)가 사용되고 있다.
그러나 항염증제는 염증을 조절하고, 증상을 일부 완화시킬 수 있지만, 진행자체를 저지하는 것은 어려우며, 비스테로이드계 항염증제도 관절부위 연골 손실이나 질병의 진행을 막을 수 없을 뿐만 아니라, 장기간 사용 시 위십이지장 궤양 등의 소화기 부작용이 문제가 될 수 있다. 스테로이드 호르몬제도 염증을 조절해 주는 약제이나 얼굴이 둥그렇게 되고, 체중이 늘며, 당뇨병, 고혈압 등이 발병될 수 있는 부작용이 있다.
따라서 현재까지 개발된 류마티스 관절염의 약물치료는 대부분 통증을 감소시키는 목적으로만 사용되고 있을 뿐 근본적인 치료효과를 주는 약물이나 수술법은 현재까지 없는 실정이다. 그러므로 부작용을 유발하지 않으면서 예방 및 치료 효과가 우수한 새로운 류마티스 관절염의 치료제 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 천연 생약재들을 이용하여 부작용 없이 효과적으로 류마티스 관절염을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 대황, 황금 및 황련의 생약재들을 이용한 복합 추출물이 류마티스 관절염을 효과적으로 개선 및 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복합 추출물은 대황, 황금 및 황련을 1:1:1~2:1:1의 중량비로 첨가한 복합물에 대한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복합 추출물은 정제수를 이용하여 수득한 물 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복합 추출물은 건조시킨 대황, 황금 및 황련의 복합물에 상기 복합물 중량 대비 10~12배의 정제수를 첨가하고 100~120℃의 온도에서 2~4시간 동안 가열하여 수득한 추출물을 여과한 후, 50~60℃에서 감압 농축하여 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복합 추출물은, 활막세포주의 증식 및 이동억제; 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, CCL2 및 CXCL2의 발현 또는 생성 억제; 관절 부위로의 면역세포들의 침윤억제; 판누스(pannus) 형성억제; 및 연골파괴 및 뼈 침식 억제; 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 대황, 황금 및 황련을 포함하여 구성된 복합 추출물은 활막세포주의 증식 및 이동억제, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, CCL2 및 CXCL2의 발현 또는 생성 억제, 관절 부위로의 면역세포들의 침윤억제, 판누스(pannus) 형성억제 및 연골파괴 억제와 뼈 침식 억제 활성을 모두 가지고 있으며, 천연 생약재 유래의 복합 추출물로서 체내 부작용이 없으므로 류마티스 관절염을 효과적으로 예방, 개선 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 류마티스 관절염 환자에서 분리된 활막세포주(FLS)에 본 발명의 복합 추출물 및 류마티스 관절염 치료제인 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX)를 각각 처리한 후, 배양 3일 후 세포 밀집도(confluence) 및 세포증식 억제(proliferation inhibition)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물에 대한 각 농도별 구간을 설정하고 형광염색한 활막세포주를 배양하면서 3시간 마다 배양 플레이트를 촬영하여 배양 72시간까지 세포 밀집도 및 형광 강도 분석을 통해 세포 증식억제 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 상처 치유 분석(wound healing assay) 전용 플레이트에서 형광염색한 활막세포주를 confluent layer가 될 때까지 배양 후, 스크래치를 형성시킨 다음, 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물을 각각 농도별로 처리하고 3시간 마다 스크래치 형성 구역에서의 세포 밀집도를 측정하여 활막세포의 이동억제를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 96-well 플레이트에 활막세포주를 분주한 후, 본 발명의 복합 추출물을 1시간 전처리한 후, LPS 및 PMA를 추가 처리하여 배양한 다음, 세포 배양물을 대상으로 염증매개 인자들인 IL-6, IL-1β, CCL2 및 CXCL2 유전자의 RNA 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 류마티스 관절염이 유도된 마우스에 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물을 각각 투여한 후, 시간에 따른 류마티스 관절염 활성도에 대한 임상지표(CAI) 및 발생빈도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 류마티스 관절염이 유도된 마우스에 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물을 각각 투여한 후, 각 마우스 뒷발에서의 관절염 증상 개선정도를 육안으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 뒷발(hind paws) 조직에 대하여 헤마토크실렌 및 에오신 염색을 통해 활액 증식(synovial hyperplasia), 판 누스 형성(pannus formation), 연골파괴(cartilage destruction) 및 뼈 침식(bone erosion)의 조직형태학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 뒷발(hind paws) 조직에 대하여 톨루엔 블루 염색을 통해 매트릭스 염색(matrix staining), 표면 규칙성(surface regularity) 및 연골두께(cartilage thickness)의 조직형태학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 뒷발(hind paws) 조직에 대하여, CD3, F4/80 및 ICAM-1 항체를 이용한 면역조직화학 염색으로 염증세포의 침윤 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 관절조직에 대하여 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 전사체 수준을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물에 대한 각 농도별 구간을 설정하고 형광염색한 활막세포주를 배양하면서 3시간 마다 배양 플레이트를 촬영하여 배양 72시간까지 세포 밀집도 및 형광 강도 분석을 통해 세포 증식억제 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 상처 치유 분석(wound healing assay) 전용 플레이트에서 형광염색한 활막세포주를 confluent layer가 될 때까지 배양 후, 스크래치를 형성시킨 다음, 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물을 각각 농도별로 처리하고 3시간 마다 스크래치 형성 구역에서의 세포 밀집도를 측정하여 활막세포의 이동억제를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 96-well 플레이트에 활막세포주를 분주한 후, 본 발명의 복합 추출물을 1시간 전처리한 후, LPS 및 PMA를 추가 처리하여 배양한 다음, 세포 배양물을 대상으로 염증매개 인자들인 IL-6, IL-1β, CCL2 및 CXCL2 유전자의 RNA 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 류마티스 관절염이 유도된 마우스에 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물을 각각 투여한 후, 시간에 따른 류마티스 관절염 활성도에 대한 임상지표(CAI) 및 발생빈도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 류마티스 관절염이 유도된 마우스에 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물을 각각 투여한 후, 각 마우스 뒷발에서의 관절염 증상 개선정도를 육안으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 뒷발(hind paws) 조직에 대하여 헤마토크실렌 및 에오신 염색을 통해 활액 증식(synovial hyperplasia), 판 누스 형성(pannus formation), 연골파괴(cartilage destruction) 및 뼈 침식(bone erosion)의 조직형태학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 뒷발(hind paws) 조직에 대하여 톨루엔 블루 염색을 통해 매트릭스 염색(matrix staining), 표면 규칙성(surface regularity) 및 연골두께(cartilage thickness)의 조직형태학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 뒷발(hind paws) 조직에 대하여, CD3, F4/80 및 ICAM-1 항체를 이용한 면역조직화학 염색으로 염증세포의 침윤 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX) 및 본 발명의 복합 추출물이 각각 투여된 류마티스 관절염 마우스의 관절조직에 대하여 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 전사체 수준을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 천연 생약재들인 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 부작용을 유발하지 않고 효과적으로 류마티스 관절염을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 특징이 있다.
대황, 황금 및 황련은 삼황사심탕의 구성 약재로서, 열이 심하고 머리가 아프며 혈압이 높고 불면 증상이 있을때에 사용하는 처방 약재로 알려져 있다. 우리나라에서는 『동의보감』 잡병편(雜病篇) 권3 상한비기증을 치료하는 처방으로 응용되었고, 처방내용으로는 대황(大黃)·황련(黃連) 각 7.5g, 황금(黃芩) 3.75g으로 구성되었고, 물에 달여 복용한다.
임상응용에 있어서 삼황사심탕의 처방은 비교적 체력이 있고 어지러우며, 안면이 홍조(紅潮)하고, 정신이 불안하며, 변비의 경향이 있는 고혈압증과, 현운(眩暈: 어지럼증)·견갑통·이명(耳鳴)·두중(頭重)·불면(不眠)·불안 등의 증상과, 비출혈(鼻出血)·치출혈(痔出血)·갱년기장애 등의 증상에 응용된다고 알려져 있다.
그러나 아직까지 삼황사심탕이 류마티스 관절염의 치료 효과가 있다는 연구는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 삼황사심탕의 구성 약재인 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물이 류마티스 관절염에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 in vitro에서 세포주를 이용한 실험 및 마우스 동물을 이용한 in vivo 실험을 통해 확인하였다.
상기 대황(Rhei Rhizoma)은 원산지는 중국 서장·청해 지방이다. 산골짜기의 습지에서 자란다. 굵은 황색 뿌리가 있고, 곧게 자란 원줄기의 높이는 1m에 달한다. 속이 비어 있으며, 잎 모양은 넓은 달걀 모양의 원형이며 잎몸 길이는 25∼30cm이다. 뒷면의 잎맥이 뚜렷하고 가장자리에 무딘 톱니가 드물게 있고 끝도 둔한 편이다. 꽃은 7∼8월에 피고, 복총상꽃차례[複總狀花序]가 가지와 원줄기 끝에서 원추꽃차례[圓錐花序]를 형성하며, 꽃자루[花梗]가 있는 황백색 꽃이 꽃이삭에서 돌려난다.
꽃잎은 없고 수술은 9개, 암술대는 3개이다. 지하부는 수직으로 내린 원뿌리에 우엉 모양의 뿌리가 많이 붙어있다. 열매는 삭과로 삼각형 모양이며 날개가 있고 8월에 익는다. 약제로 쓰이는 것은 원뿌리인데 재배하여 4년째가 되면 뿌리의 무게가 3∼5kg이 된다. 6∼7년 경과한 원뿌리의 껍질과 우엉 모양을 한 잔뿌리들을 제거하여 그대로 또는 통째로 썰어서 말린 것을 대황이라 하는데, 이를 약용한다.
한방에서는 기원전부터 소염성의 하제(下劑)로 쓰고 있으며, 여러 가지 처방에 배합하여 사용하고 있다. 주성분은 안트라키논 유도체와 그 배당체 및 타닌 등이다. 소량을 섭취하면 건위작용(健胃作用)을 나타내고, 다량의 경우는 완하제(緩下劑)로 상습 변비나 소화불량에 좋으며, 민간약으로는 화상에 쓰기도 한다. 약용할 때 달여서 복용하는데 생것을 쓰며 효력이 강하고, 익은 것을 쓰면 효력이 완만하며 숯으로 마른 것은 지혈력이 강하다.
상기 황금(Scutellariae Radix)은 산지의 풀밭에서 자라며, 높이는 20~60cm이고, 여러 대가 나와 포기로 자라고 털이 있으며 가지가 갈라진다. 잎은 마주나고 바소꼴이며 가장자리가 밋밋하다. 꽃은 7~8월에 피고 자줏빛이 돌며 총상꽃차례로 한쪽으로 치우쳐서 달린다. 화관(花冠)은 밑 부분에서 꼬부라져 곧게 서고 통형이며 길이 1.5~2.5cm이고 입술 모양이다. 꽃받침은 종 모양이다. 4개의 수술 중 2개는 길고 암술은 1개이며 씨방은 4개로 깊게 갈라진다. 열매는 9월에 결실하며 둥근 모양으로 꽃받침 안에 들어 있다. 원뿌리는 원뿔형이고 살이 황색이다. 황금은 바이칼레인(baicalein), 바이칼린(baicalin), 우고닌(wogonin) 및 바이칼레노사이드(baicalenoside)를 포함한 프리-비-링 플라보노이드를 상당량 함유하고 있으며, 항바이러스, 항산화 및 항암효과가 보고되었고, 특히 진정작용, 항경련작용 등 중추신경계 작용도 가지고 있는 것으로 보고되었다.
상기 황련(Coptidis Rhizoma)은 중국이 원산지이며 생약용으로 한국·일본·중국 등지에서 재배하기도 한다. 산지의 수림 그늘의 습진 땅에서 자란다. 땅속줄기는 굵고 옆으로 뻗으며 많은 수염뿌리가 나고 줄기 끝에 뿌리잎 4~5개가 나며 길이 10∼27cm이다. 잎은 세 장의 작은잎이 나온 겹잎으로 작은 잎은 약간 굳고 톱니가 날카로우며 광택이 난다. 잎자루 밑동은 잎 집으로 되고 잎 가장자리에 톱니가 있다. 3∼4월에 지름 약 10cm로 자란 꽃줄기에 흰색 꽃이 2∼3개 핀다. 꽃에는 양성화와 수꽃이 있다. 흰색의 꽃받침조각은 5∼6개로 길게 자라 마치 꽃잎처럼 보인다. 꽃잎은 8∼15개로 작은 선형(線形)이다. 수술이 많고 암술은 9~16개이다. 씨방자루가 자라서 그 위에 대과(袋果)가 고리 모양으로 줄지어 있다. 줄기와 땅속줄기의 단면이 짙은 황색인데서 붙여진 이름이다.
한방에서는 11월경에, 재식 5∼6년 된 황련·왜황련의 뿌리를 채취하여 햇볕에 말린 것을 황련(黃連)이라 하며, 건위·진정·항균 등의 효능이 있어 소화불량·위염·장염·복통·구토·이질·심계(心悸)·번열(煩熱)·정신불안·인후종통(咽喉腫痛)·토혈·코피·하혈·화상 등의 치료에 처방한다.
본 발명은 상기 대황, 황금 및 황련을 함께 혼합하고 추출한 복합 추출물에 대한 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
한편, 약리활성을 갖는 생약재들은 무수히 많이 있으나, 복합 생약재들을 사용할 경우, 목적하는 약리활성의 확인은 반드시 실험을 통해서만 확인할 수 있다. 이는 단일 식물 또는 단일 약용작물의 추출물에도 수많은 성분이 포함되어 있으며, 아직도 규명되지 않은 성분이 많이 있는데, 서로 다른 생약재를 혼합할 경우, 복합물 내에 존재하는 서로 다른 식물 유래의 유용성분들이 예기치 못한 화학적 반응 등에 의해 오히려 약리활성이 저해되는 결과가 발생할 수 있고, 체내 유해한 부작용이 발생할 수도 있다.
이러한 점에서 본 발명자들은 다양한 생약재들의 조합에 따른 약리활성을 스크리닝한 결과, 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물이 다른 한약재들로 구성된 복합 추출물에 비해 세포 독성은 유발하지 않으면서 류마티스 관절염에 대한 치료 활성이 가장 우수함을 확인하였고, 따라서 새로운 류마티스 관절염 치료제로서 대황, 황금 및 황련의 생약재를 선택하였다.
또한, 본 발명에서는 대황, 황금 및 황련을 이용한 복합 추출물이 활막세포의 증식억제 및 이동억제 활성을 통해 류마티스 관절염을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
류마티스 관절염은 활막세포의 염증과 증식을 특징으로 하는데, 활막세포는 류마티스 관절염을 앓는 환자에서 암 세포와 같이 비정상적으로 증식하는 특징이 있고, 비정상적으로 증식된 활막세포는 주변 연골과 뼈를 파괴하여 류마티스 관절염을 더욱 악화시킨다. 또한, 염증성 사이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine)은 TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 IL-1β(Interleukin-1 beta)와 관련되어 있으며, 이런 염증성 사이토카인에 대한 반응으로 활막세포는 급증하게 되면서 판누스(Pannus)라는 조직들을 형성하게 되고 이는 연골과 관절뼈를 파괴시킨다.
따라서 본 발명의 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물은 활막세포의 증식 및 이동억제 활성이 있고, 염증 매개인자들의 발현 및 생성을 억제하여 류마티스 관절염을 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 활막세포에 본 발명의 복합 추출물을 처리한 후, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, CCL2 및 CXCL2의 발현수준을 측정하였는데, LPS로 염증이 유도된 활막세포에서 본 발명의 복합 추출물 처리에 의해 상기 염증성 사이토카인들의 발현수준이 모두가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물이 실제적으로 류마티스 관절염을 치료할 수 있는지를 동물실험을 통해 확인하고자, 콜라겐으로 유도된 류마티스 관절염 마우스에 본 발명의 복합 추출물을 투여한 후, 류마티스 관절염 활성도에 대한 임상평가를 수행하였고, 또한 관절조직 내에서의 면역세포의 침윤 여부를 분석하였으며, 판누스 및 연골파괴와 뼈 침식에 미치는 영향을 분석하였는데 그 결과, 본 발명의 복합 추출물 처리에 의해 류마티스 관절염의 활성지표가 감소한 것을 확인하였고, 면역세포의 침윤도 억제되며, 판누스 형성억제, 연골파괴 및 뼈 침식이 모두 억제되고, 염증성 사이토카인의 발현도 관절 조직 내에서 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 복합 추출물이 갖는 이러한 치료 효과는 류마티스 관절염 치료제로 사용되는 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX)와 거의 유사한 수준인 것으로 나타났다.
따라서 본 발명자들은 다양한 실험을 통해 본 발명에서 제공하는 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 새로운 류마티스 관절염 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.
한편, 상기 본 발명의 조성물의 유효성분인 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물은 상기 대황, 황금 및 황련을 1:1:1~2:1:1의 중량비로 첨가한 복합물을 용매를 이용하여 추출한 복합 추출물이다. 여기서 본 발명의 복합 추출물이 류마티스 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료 효과를 나타내기 위해서는 대황, 황금 및 황련을 1:1:1~2:1:1의 중량비로 사용하여야 한다.
만일 상기 복합 중량비의 범위를 벗어난 비율로 사용할 경우, 오히려 류마티스 관절염의 치료 효과가 낮아지는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 복합 추출물을 제조하는 공정은 당업계에 공지된 천연물로부터 추출물을 수득하는 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있는데, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 정제수를 사용할 수 있다.
또한, 용매를 이용하여 추출물을 추출하는 방법은 열수추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 건조시킨 대황, 황금 및 황련의 복합물에 상기 복합물 중량 대비 10~12배의 정제수를 첨가하고 100~120℃의 온도에서 2~4시간 동안 가열하여 수득한 추출물을 여과한 후, 50~60℃에서 감압 농축하여 수득한 것을 본원발명의 복합 추출물로 사용하였다.
더 바람직하게는 건조시킨 대황, 황금 및 황련을 각각 0.67:0.5:0.5의 중량비로 혼합하고 이들 복합물 중량 대비 10배의 정제수를 첨가한 후, 100℃에서 3시간 동안 가열하여 수득한 추출물을 여과한 후, 60℃에서 감압 농축한 다음, 진공건조하여 대황, 황금 및 황련 생약재의 복합 건조엑스(본 발명의 복합 추출물)를 제조하였다.
한편, 본 발명에서 상기 약학적 조성물은 본 발명의 유효성분 이외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 30중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 유효성분은 하나 이상의 치료제와 조합하여 치료 유효량으로 투여될 수 있다(제약 조합물). 예를 들어, 본 발명의 유효성분을 화학요법제와 조합하여 사용하는 경우 상승작용 효과가 발생할 수 있다. 본 발명의 유효성분을 다른 요법과 함께 투여하는 경우, 공동-투여된 화합물의 투여량은 물론 사용된 공동-약물의 유형, 사용된 구체적인 약물, 치료할 병태 등에 따라 달라질 것이다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 상기 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 유효성분을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001㎎/kg~1000㎎/kg의 용량으로 투여할 수 있으나, 특별히 그 범위를 한정하는 것은 아니다.
나아가 본 발명에 따른 복합 추출물은 한방에서 처방되고 있는 천연 생약재들로 구성된 것으로 체내 부작용 및 독성을 유발시키지 않아 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으므로, 본 발명에 따른 상기 복합 추출물은 류마티스 관절염의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물로도 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 류마티스 관절염의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강기능식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 식품 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 식품 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 유효성분의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
대황, 황금 및 황련 생약재를 이용한 복합 추출물 제조
시중에서 구입한 생약재인 대황, 황금 및 황련을 깨끗이 세척하고 건조시킨 후, 대황, 황금 및 황련을 각각 0.67: 0.5: 0.5의 중량비로 섞은 후, 3가지 생약재의 복합물 중량대비 10배의 정제수를 첨가하고 100℃에서 3시간 동안 추출하여 복합 추출물을 수득하였고, 이를 여과시켜 여액을 수득한 다음, 60℃에서 감압농축 후, 진공건조하여 본 발명에 따른 대황, 황금 및 황련 생약재의 복합 건조엑스(복합 추출물)를 제조하였다.
<실시예 2>
세포실험을 통한 대황, 황금 및 황련 생약재의 복합 추출물에 대한 류마티스 관절염 개선 및 치료효과 분석
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 대황, 황금 및 황련 생약재의 복합물로부터 수득한 복합 추출물에 대한 류마티스 관절염 개선 및 치료효과를 확인하기 위해, 류마티스 관절염 환자(1987 미국 류마티스 학회 분류기준을 만족하는 환자)로부터 분리된 활막세포주(Fibroblast like synovium, 이하 FLS)를 대상으로, 본 발명의 복합 추출물 처리에 따른 활막세포의 증식 및 이동에 미치는 영향과 염증 매개인자들의 발현에 미치는 영향을 다음과 같은 실험들을 통해 확인하였다.
<2-1> 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물에 대한 활막세포 증식(proliferation) 억제 활성 분석
류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활막세포주(Fibroblast like synovium, 이하 FLS)를 6회 계대배양하여 실험에 사용하였고, 이때 배양액으로는 10% 소태아혈청 및 2% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하였으며, 세포 배양은 5% CO2 및 37℃의 온도가 유지되는 배양기에서 배양하였다.
본 발명의 복합 추출물 처리에 따른 활막세포의 증식 변화 분석은 IncuCyte® S3 System(Essen bioscience)을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 활막세포주(5 x 103개/200μl)에 본 발명의 복합 추출물(500μg/ml)을 첨가하여 혼합한 후, 본 발명의 복합 추출물과 활막세포주의 복합물을 96-well 플레이트에 well당 200μl씩 분주하였다. 이후 배양 시작과 동시에 3시간 마다 플레이트를 촬영하면서 세포 밀집도(confluence)를 관찰하였고, 배양 3일 후 세포 밀집도(confluence)를 분석하였다. 여기서 상기 본 발명의 복합 추출물은 100% DMEM 용액에 녹여 사용하였고, 음성대조군으로는 상기 세포 배양배지에 2% DMEM이 첨가된 용액 처리군을 사용하였으며, 양성 대조군으로는 류마티스 관절염 치료제로 사용되는 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX)를 처리한 군을 사용하였다.
본 발명의 복합 추출물 처리에 따른 활막세포의 증식억제 분석은, 형광염색된 활막세포주를 사용하여 수행하였으며, 세포 증식은 세포 밀집도(confluence) 및 형광 강도(fluorescence intensity)를 통해 분석하였다.
활막세포의 증식 정도(%)는, 음성 대조군(Control)에서 배양 72시간에 정상적으로 증식한 세포 밀집도를 100%로 하였을 때, 시험물질 처리군의 상대적 세포 밀집도를 계산한 값으로 나타내었다.
또한, 활막세포의 증식 억제정도(%)는 음성 대조군(Control)의 72시간 후의 세포 밀집도를 세포증식 100%로 하고, 억제를 0%로 하였을 때, 시험물질 처리군의 상대적 억제(%)를 계산한 값으로 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 활막세포주에 대한 세포 밀집도 분석 결과, 음성 대조군은 72시간째에 세포 플레이트에 세포가 거의 100%에 가깝게 증식하여 높은 세포 밀집도를 보였고, 양성 대조군인 MTX를 처리한 군은 음성 대조군에 비해 세포 밀집도가 조금 감소하여 약 90%의 값을 보인 반면, 본 발명의 복합 추출물을 처리한 군은 음성 대조군 및 양성 대조군과 달리 세포 밀집도가 현저하게 감소한 것으로 나타났고 오히려 세포 증식이 억제된 것으로 나타났다. 이를 세포 증식 억제율로 다시 계산한 결과, 본 발명의 복합 추출물 처리군은 약 120%의 활막세포에 대한 억제 활성이 있는 것으로 나타났고, MTX 처리군은 약 10% 정도에 미치는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 복합 추출물 및 MTX에 대한 각 농도별 구간을 설정하고, 활막세포주를 함께 배양하면서 3시간 마다 배양 플레이트를 촬영하면서 배양 72시간까지 세포 밀집도 및 형광 강도 분석을 수행하였고, 세포증식 억제에 대한 IC50값을 분석하였다. 세포증식 억제에 대한 IC50값은 분석 프로그램(Softmax pro v5.4, Molecular Devices)을 이용하여 분석하였는데, IC50값은 음성 대조군에서의 세포 밀집도를 100%로 하였을 때, 세포 밀집도가 50%가 되는 시험물질의 처리 농도 값을 말한다.
세포증식 억제에 대한 IC50값 분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, MTX 처리군은 3mg/ml의 농도로 처리해도 세포 밀집도가 75%인 것으로 나타난 반면, 본 발명의 복합 추출물은 0.45±0.01 mg/ml의 농도에서 세포 밀집도가 50%로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물이 류마티스 관절염의 원인이 되는 활막세포의 비정상적인 증식 및 활성을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었고, 류마티스 관절염 치료제인 MTX에 비해 그 효과도 월등히 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<2-2> 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물에 대한 활막세포 이동(migration) 억제 활성 분석
본 발명의 복합 추출물이 활막세포의 이동을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 형광 염색한 활막세포를 상처 치유 분석(wound healing assay) 전용 플레이트(Incucyte cell migration kit, essen bioscience)에서 confluent layer가 될 때까지 배양하였다. 이후 Wound maker(Incucyte cell migration kit, essen bioscicence)를 이용하여 스크래치를 형성시켰고, 본 발명의 복합 추출물을 농도별로 처리한 후, 3시간 마다 배양 플레이트를 사진 촬영하면서 세포 밀집도를 분석하였다. 분석은 72시간 동안 수행하였고, 총 4회 반복 수행하였다.
상기 세포 이동의 분석은 스크래치된 영역 내로 세포가 이동된 세포수의 측정으로 분석하였고, 음성 대조군에서의 정상적인 증식이 진행된 세포 밀집도를 100%로 하였을 때, 시험물질 처리군의 상대적인 세포 밀집도를 계산하였고, 세포이동 억제에 대한 IC50값을 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, MTX를 처리한 군은 약 0.75mg/ml 농도처리까지는 세포이동 억제가 없고 오히려 세포 이동이 증가한 것으로 나타난 반면, 본 발명의 복합 추출물은 활막 세포의 세포 이동을 매우 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났는데, 이는 IC50 값이 약 0.06±0.01mg/ml로 매우 적은 농도의 복합 추출물 처리만으로도 활막세포의 이동을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
<2-3> 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물에 대한 염증 매개 인자들의 발현억제 활성 분석
본 발명자들은 본 발명의 복합 추출물에 대한 염증 매개 인자들의 발현 억제 활성이 있는지를 분석하였다. 이를 위해 96-well 플레이트에 활막세포를 1x105 세포/well로 분주하고, 밤새도록 배양하였다. 이후 24시간 동안 기아(starvation) 상태를 유지하였으며, 이후 본 발명의 복합 추출물(0.5mg/mL)을 1시간 전처리한 다음, LPS(300 mg/mL) 및 PMA(Propidium Monoazide; 50ng/mL)을 추가 처리한 다음, 4시간 배양 후 세포를 수집하고 세포 용해물을 수득하였다.
그런 뒤, 세포용해물로부터 RNA를 추출 후, cDNA를 합성하여 IL-1β, IL-6, CCL-2 및 CXCL-2의 4가지 타겟 활성인자들의 발현정도를 ABI 7500(Applied Biosystems) 기기를 이용하여 상기 4가지 염증매개 인자들의 전사체(transcript) 수준을 측정하였다.
또한, 염증성 사이토카인인 IL-6 단백질의 수준을 ELISA 키트를 이용하여 분석하였는데, 상기 활막세포 처리 과정에서 LPS(300mg/mL) 및 PMA(50ng/mL)을 추가 처리한 다음, 48시간 배양 후 세포배양액을 얻고, human IL-6 ELISA kit(cat. KAC1261) 및 iMarkTM plate reader(Bio-Rad)를 이용하여 배양액에 함유된 IL-6 단백질의 함량을 측정하였다. 상기 실험에서 음성 대조군은 본 발명의 복합 추출물 대신 2% DMSO를 처리한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, LPS 처리에 의해 현저하게 증가된 염증매개인자들인 IL-1β, IL-6, CCL-2 및 CXCL-2의 전사체의 수준이 본 발명의 복합 추출물 처리 시, 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 또한, ELISA 분석에서도 IL-6의 생성이 현저하게 억제된 것으로 나타났다.
이상, 활막세포주를 대상으로 시험관 내에서 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물 처리에 따른 류마티스 관절염 억제 활성을 분석한 결과, 본 발명의 복합 추출물이 활막세포주의 증식 및 이동을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라 염증매개 인자들의 전사체 수준 및 단백질 수준을 모두 효과적으로 억제할 수 있어, 류마티스 관절염을 예방, 개선 및 치료하는데 사용 가능함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
류마티스 관절염 마우스 모델에서 대황, 황금 및 황련 생약재의 복합 추출물투여에 따른 류마티스 관절염 개선 및 치료 효과 분석
나아가 본 발명자들은 본 발명의 복합 추출물이 류마티스 관절염을 치료할 수 있는지 확인하기 위해, 콜라겐으로 유도된 류마티스 관절염 마우스를 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
콜라겐-유도 류마티스 관절염 마우스 모델에 사용한 DBA/1J 마우스는 6주령의 수컷 마우스이며, 무병원성(Specific pathogen free; SPF) 실험 동물실에서 온도 21~23°C, 상대습도 40~45%가 유지되는 상태로 사육하였다. 케이지별 실험동물 개체수는 6 이하로 수용하였고, 주 2회 케이지 교환 및 사료를 급여하였다. 류마티스 관절염의 유도는 10mM 아세트산에 2mg/ml의 농도가 되도록 bovine type II 콜라겐을 용해하고, 이를 CFA(Complete Freund’s adjuvant) 2mg/ml 과 1:1(v/v)로 섞어 에멀전화 한 후, DBA/1J 마우스 꼬리에 100μl/마우스로 피내 주사하여 1차 면역화를 유도하였다. 21일 후 IFA(incomplete Freund’s adjuvant)와 bovine type II collagen 을 1:1(v/v)로 섞어 에멀전화 한 후, 마우스 꼬리에 100μl/마우스로 피내 주사하여 2차 면역화를 유도하여, 류마티스 관절염이 유도된 마우스 동물모델을 제조하여 하기 실험에 사용하였다. 또한 본 발명에서 수행한 모든 동물실험은 동물실험 윤리위원회(IACUC)의 승인하에 수행하였다.
<3-1> 류마티스 관절염 임상지표 및 발생빈도 분석
류마티스 관절염이 유도된 마우스에 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 복합 추출물을 PBS 용액에 녹인 후, 사육 22±2일째부터 매일 1일 1회 경구 투여하였다. 이때 음성 대조군은 PBS 용액을 22±2일째부터 매일 1일 1회 경구 투여하였고, 양성 대조군은 MTX를 주 2회 복강 주사하였다. 실험에 사용된 각 마우스군의 처치 사항은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
실험군 구분 | 처리 물질 | 투여경로 | 약물 투여량 | 약물 부피(ul) |
음성대조군(vehicle) | PBS | 경구 | N/A | 200 |
양성대조군(control) | MTX(methotrexate) | 복강주사 | 1 mg/kg | 100 |
시험군 | 본 발명의 복합 추출물 | 경구 | 166.5 mg/kg/회 | 200 |
상기 각 실험군들에 대한 류마티스 관절염 임상지표(Clinical arthritis index, CAI)는 실험종료일까지 정기적으로 마우스의 발을 대상으로 염증발생 및 그 정도를 관찰하여 아래의 기준에 따라 0-4점의 점수를 부여하였고, 그 합계를 임상 활성 지수로 사용하였다.
점수 | 기준 |
0 | No arthritis |
1 | One inflamed digit |
2 | Two inflamed digits |
3 | More than two digits and foot pad inflammation |
4 | All digits and foot pad inflammation |
또한, 질병 발생빈도는 임상지표가 2점 이상일 경우 류마티스 관절염이 발생하였다고 판단하며, 마우스의 4개 발 모두 관절염이 발생하였을 때 100% 발생빈도로 정의하였다.
분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군 마우스는 시간이 경과함에 따라 류마티스 관절염의 증상이 악화되어 임상지표 값이 증가하는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 복합 추출물 및 MTX를 투여한 양성 대조군은 음성 대조군에 비해 임상지표 값이 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 또한 발생빈도 분석 결과, 음성 대조군은 시간이 경과함에 따라 류마티스 관절염의 발생빈도가 34일째까지 급격히 증가하는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 복합 추출물 처리 군은 발생빈도가 음성 대조군에 비해 현저하게 억제된 것으로 나타났을 뿐만 아니라 MTX를 투여한 양성 대조군에 비해서도 발생빈도가 낮은 것으로 나타났다(도 5).
각 실험군들의 마우스 발(병변부위)의 상태를 눈으로 관찰한 사진 결과에서도 대조군은 발이 심하게 부어있는 것으로 나타난 반면, MTX 투여군은 대조군에 비해 붓기가 감소한 것으로 나타났고, 본 발명의 복합 추출물 처리군은 MTX 투여군과 유사한 수준으로 류마티스 관절염 증상이 개선되는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
이러한 결과는 동물 실험모델을 통해서도 본 발명의 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물이 MTX 약물에 비해 더 효과적으로 류마티스 관절염을 치료할 수 있다는 가능성을 제시한다.
<3-2> 조직형태학적 분석을 통한 류마티스 관절염의 치료효과 분석
<3-1>에서 실험한 각 마우스 군으로부터 뒷발(hind paws) 부위의 조직을 채취한 후, 각 조직을 파라핀으로 고정화한 후, 절편으로 제조하고 헤마토크실렌 및 에오신 염색을 수행하여 각 조직의 형태학적 평가를 수행하였다. 형태학적 평가는 하기 표 3의 기준으로 평가하였고, 각 조직별 4개 부위를 100배율로 촬영하였고, 평가자들의 암맹평가 자료를 평균한 값을 scoring value로 하고 각 부위의 scoring value 평균을 각 조직의 score로 계산하였다.
조직형태학적 평가 항목 및 평가 기준
분석결과, 활액 증식(synovial hyperplasia), 판누스 형성(pannus formation), 연골파괴(cartilage destruction), 뼈 침식(bone erosion) 증상에 대하여, 음성대조군(vehicle)에서는 활막 세포의 과증식(활액 증식)과 함께 판누스 조직의 증가로 연골파괴 및 뼈 미란이 뚜렷하게 나타났으며, 양성 대조군인 MTX 투여군에서는 활막세포의 증식소견이 미약하게 관찰되나 음성 대조군에 비해 뚜렷하게 감소된 양상을 보였고, 연골과 뼈의 파괴 정도도 감소한 것으로 나타났다. 본 발명의 복합 추출물 처리군의 경우, 4가지 평가 항목 모두 통계적으로 유의한 감소 소견을 보였으며, 이러한 치료 효과는 MTX 처리군과 거의 유사한 수준인 것으로 나타났다(도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 실험에 사용한 마우스 군의 조직에 대하여 톨루엔 블루 염색을 수행하였고, 매트릭스 염색(matrix staining), 표면 규칙성(surface regularity) 및 연골두께(cartilage thickness) 분석을 수행하였으며, 각 항목별 평가 기준은 하기 표 4의 기준에 의해 분석하였다.
조직형태학적 평가 항목 및 평가 기준
분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군을 포함한 본 발명의 복합 추출물 투여군은 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의한 증상의 감소 소견을 보였다. 이러한 결과를 통해서도 본 발명자들은 본 발명의 대황, 황금 및 황련의 생약재 복합 추출물이 효과적으로 류마티스 관절염 치료 용도로 사용 가능함을 알 수 있었다.
<3-3> 면역염색을 통한 류마티스 관절염 조직의 염증세포 침윤 억제 활성 분석
상기 실시예 <3-2>에서 사용한 각 실험군 마우스의 발 조직에 대하여 본 발명의 복합 추출물 처리에 따른 CD3, F4/80 및 ICAM-1에 미치는 영향을 분석하여 염증세포 침윤 및 류마티스 관절염 중증도를 개선할 수 있는지를 분석하였다. CD3, F4/80 및 ICAM-1 분석을 위해 이들의 항체들을 사용하여 면역조직화학 염색법을 수행하였는데, 실험에 사용한 항체들은 1차 항체로서 Rabbit anti-CD3(DAKO, A0452), Rat anti-F4/80(Bio-Rad, MCA497GA) 및 Goat anti-ICAM-1(R&D, AF796)을 사용하였고, 2차 항체로서 Goat anti-rabbit IgG-biotinylated(Vector Lab, BA-1000), Rabbit anti-rat IgG-biotinylate(Vector Lab, BA-4001), Rabbit anti-goat IgG-biotinylated(DAKO, E0466)를 사용하였다. 각 조직별 3부위 이상의 슬라이드를 제작하여 실험에 사용하였고 현미경 관찰하였으며, CD3 또는 F4/80 항체에 의해 염색된 세포수 및 ICAM-1 염색된 면적을 정량평가 하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 복합 추출물 처리에 의해 염증세포 침윤이 억제된 것으로 나타났는데, 즉, T 세포(CD3 양성 세포) 및 대식세포(F4/80 양성 세포) 및 ICAM-1 발현 세포들이 음성 대조군에 비해 MTX 처리군과 본 발명의 복합 추출물 처리 군에서 현저하게 감소된 것으로 나타났다.
이러한 결과는 본 발명의 복합 추출물이 염증세포의 침윤 억제 활성을 통해 류마티스 관절염을 예방 또는 치료할 수 있음을 의미한다.
<3-4> RT-PCR을 통한 염증매개 인자들의 발현 억제 활성 분석
상기 실시예 <3-3>에서 실험한 각 마우스군의 관절조직을 세라믹 비드를 이용하여 분쇄하고 조직 용해물을 수득한 후, 상기 용해물로부터 RNA를 추출하였다. 각 실험군 유래 RNA 3μg를 이용하여 cDNA 합성 kit(TAKARA, #6110A)를 사용하여 cDNA를 제조하였고, cDNA를 TaqMan Gene Expression Master Mix(ThermoFisher, #4369016)와 반응시켰으며, ABI 7500(Applied Biosystems)를 이용하여 타겟 유전자인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 전사체 수준을 실시간으로 분석하였다. 또한 상기 실험에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 전사체 수준 측정을 위한 RT-PCR에 사용된 프로브는 각각 Mm00446190_m1(IL-6), Mm00434228_m1(IL-1β) 및 Mm00443258_m1(TNF-α)을 사용하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군에 비해 MTX 처리군 및 본 발명의 복합 추출물 처리군은 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 전사체 수준이 월등하게 감소된 것으로 나타났고, IL-6 및 IL-1β의 수준은 MTX 처리군에 비해 본 발명의 복합 추출물 처리군에서 더 감소한 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 복합 추출물은 염증 매개인자인 염증성 사이토카인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 유전자 발현을 억제하여 염증 유발을 억제함을 통해 류마티스 관절염을 개선 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 상기 기술된 바와 같이, 세포 실험 및 동물 실험을 통해 본 발명자들은 대황, 황금 및 황련 생약재의 복합 추출물이 활막세포주의 증식 및 이동을 억제하고, 염증 매개인자들의 발현을 억제하며, 염증세포의 침윤 및 관절염의 증상을 개선 및 치료할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명의 대황, 황금 및 황련 복합 추출물을 류마티스 관절염의 예방, 개선 및 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품으로 사용 가능함을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 복합 추출물은 대황, 황금 및 황련을 1:1:1~2:1:1의 중량비로 첨가한 복합물에 대한 추출물인 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 복합 추출물은 정제수를 이용하여 수득한 물 추출물인 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 복합 추출물은 건조시킨 대황, 황금 및 황련의 복합물에 상기 복합물 중량 대비 10~12배의 정제수를 첨가하고 100~120℃의 온도에서 2~4시간 동안 가열하여 수득한 추출물을 여과한 후, 50~60℃에서 감압 농축하여 수득한 것임을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 복합 추출물은,
활막세포주의 증식 및 이동 억제;
염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, CCL2 및 CXCL2의 발현 또는 생성 억제;
관절부위로의 면역세포들의 침윤억제;
판누스(pannus) 형성억제; 및
연골파괴 및 뼈 침식 억제; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 대황, 황금 및 황련의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제6항에 있어서,
상기 복합 추출물은 대황, 황금 및 황련을 1:1:1~2:1:1의 중량비로 첨가한 복합물에 대한 추출물인 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제7항에 있어서,
상기 복합 추출물은 정제수를 이용하여 수득한 물 추출물인 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제8항에 있어서,
상기 복합 추출물은 건조시킨 대황, 황금 및 황련의 복합물에 상기 복합물 중량 대비 10~12배의 정제수를 첨가하고 100~120℃의 온도에서 2~4시간 동안 가열하여 수득한 추출물을 여과한 후, 50~60℃에서 감압 농축하여 수득한 것임을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제6항에 있어서,
상기 복합 추출물은,
활막세포주의 증식 및 이동 억제;
염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, CCL2 및 CXCL2의 발현 또는 생성 억제;
관절부위로의 면역세포들의 침윤억제;
판누스(pannus) 형성억제; 및
연골파괴 및 뼈 침식 억제; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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