KR20220072180A - 잔대 추출물 및 희첨 추출물이 포집된 멀티라멜라 리포좀을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

잔대 추출물, 희첨의 초임계유체 추출물 및 희첨의 이산화탄소 초임계유체의 추출시 발생한 추출물 박을 물로 재추출한 물 추출물로 포집된 멀티라말라 리포좀을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 여드름 발생균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes)을 적절하게 관리함으로써, 여드름 병변에 대한 개선 효과를 기대할 수 있다.

Description

잔대 추출물 및 희첨 추출물이 포집된 멀티라멜라 리포좀을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition with multi lamellar liposome encapsulated with the extract of Adenophora triphylla var. japonica HARA. and the extract of Siegesbeckiae Herba for improvement of acne}

본 발명은 잔대 추출물 및 희첨 추출물이 포집된 멀티라멜라 리포좀을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 잔대 추출물, 희첨의 초임계유체 추출물 및 희첨의 이산화탄소 초임계유체의 추출시 발생한 추출물 박을 물로 재추출한 물 추출물이 포집된 멀티라말라 리포좀을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 피부 미용에 대한 관심이 증가하고 있는데, 여드름의 발생은 피부 질환을 넘어 심리적 부담, 자신감 상실 및 우울증 등의 다양한 정신적인 질환까지 초래할 수 있다. 여드름은 주로 이마 등의 얼굴에 발생하나, 가슴, 등, 어깨 등에도 발생한다. 여드름은 면포, 구진, 농포 등의 형성을 특징으로 하는 모낭피지선의 만성 염증성 질환인데, 과거에는 주로 사춘기 남녀에 발생하였다. 하지만, 공기 오염, 약물 남용 등으로 근래에는 나이와 상관없이 발생하고 있다.

여드름의 원인은 아직까지 확실하게 밝혀진 바 없으나, 호르몬 작용, 과도한 피지 분비 및 세균의 감염을 원인으로 판단하고 있다. 결국 여드름은 상기한 원인에 의해, 모피지선, 모낭 및 주변조직에서 발생하는 복합적인 염증성 피부질환으로 정의할 수 있는데, 면포라는 발진을 특징적 증상으로 한다. 면포는 얼굴, 이마, 콧등에 주로 나타나는 나사 모양의 굳어진 피지 덩어리를 의미한다. 면포 내부에는 여드름 원인균으로 알려진 혐기성의 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes)가 생장하고, 면포 표면에는 호기성균인 스타필로코커스 에피더마스 (Staphylococcus epidermidis), 피티로스포룸 오발레 (Pityrosporum ovale) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 등이 생장하며, 이들 균이 생산하는 여러 성분들이 모낭 및 주위피부에 안착하여 염증을 일으키게 되는 것이다.

종래에는 여드름을 치료하기 위하여 경구제 또는 외용제 형태의 약제를 사용하였다. 살리실산이나 비타민A 유도체인 레티노산 제제를 이용한 모공의 각질 제거 및 트리클로산 등의 항생제를 사용한 여드름균에 대한 살균력 증강 등이 주 타겟이었다. 그러나, 살리실산은 국내에서는 방부제로 분류되어 제형 내 0.5% 이상을 함유할 수 없고, 트리클로산은 피부에 접촉되면 피부자극을 유발하는 부작용이 있어, 이들의 사용은 제한적일 수 밖에 없는 상황이다.

따라서, 부작용이 적으면서도 여드름 치료에 효과적인 기술의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 특허공개번호 제1020130131508호 (공개일자 2013.12.04)에는 소목(Caesalpinia sappan L.) 물 추출물 잔사의 유효성분인 brazilein의 여드름 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제1020190130340호 (공개일자 2019.11.22)에는, 택란(Lycopus lucidus) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명에서는 천연물 유래의 항균작용소재와 항염효능소재를 적절하게 사용하여, 여드름 발생균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes)을 적절하게 관리함으로써, 여드름 병변에 대한 개선 효과를 기대할 수 있는 화장품을 개발하고자 하였다. 또한, 여드름 병변의 초기 단계와 면포(comedone) 형성 단계에서, 피부의 각질 및 이물질에 대한 필링효과를 극대화시킬 수 있는 소재로 화장품을 구성하고자 하였다.

본 발명은 소재A 및 소재C를 혼합하여 수상층에 포집하고, 소재 B를 유상층에 포함하여 형성된 멀티라멜라 리포좀을 포함하되, 상기 소재A는 잔대 잎의 에탄올 추출물이고, 상기 소재B는 희첨의 이산화탄소 초임계유체 추출물이며, 상기 소재C는 희첨의 이산화탄소 초임계유체의 추출시 발생한 추출물 박을 물로 재추출한 물 추출물인 것을 특징으로 여드름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 여드름 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 소재A와 소재C는, 바람직하게 서로 혼합하여 소재D로 제조하고, 이것을 수상층에 포집하는 것이 좋다.

본 발명의 여드름 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기A 또는 소재C는, 바람직하게 각각의 추출물을 부틸렌 글라이콜 (Butylene Glycol) 또는 프로판다이올(Propanediol)에 용해하여, 수상층에 포집하는 것이 좋다.

본 발명의 여드름 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 소재C는, 바람직하게 재추출시, 질소를 퍼지(purge) 하면서 추출하는 것이 좋다.

본 발명은 여드름 발생균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes)을 적절하게 관리함으로써, 여드름 병변에 대한 개선 효과를 기대할 수 있다. 또한, 여드름 병변의 초기 단계와 면포(comedone) 형성 단계에서, 피부의 각질 및 이물질에 대한 필링효과를 극대화시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용된 추출물의 제조과정 및 리포좀에 포집하는 과정을 보여준다.
도 2는 잔대잎 추출 공정과 희첨 추출 공정을 보다 구체적으로 보여준다.
도 3은 본 발명에서 사용한 뱅함법에 따른 리포좀 제조 과정을 보여준다.
도 4는 에탄올 농도별 잔대잎 추출물의 폴리페놀 함량 측정 결과이다.
도 5는 에탄올 농도별 잔대잎 추출물의 플라보노이드 함량 측정 결과이다.
도 6은 잔대 추출물과 희첨 추출물의 DPPH 소거능을 보여준다.
도 7은 일반 리포좀 제형(좌)과 본 발명에서 제조한 멀티라멜라 리포좀 제형(우) TEM 사진이다.
도 8은 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀의 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 9는 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀 제형 처리시, HS68 세포가 분비한 collagen 함량(%)을 측정한 결과이다.
도 10은 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀 제형 처리시, HS68 세포가 분비한 MMP-1 함량(%)을 측정한 결과이다.
도 11은 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀 제형의 항 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 실험 결과이다.
도 12는 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀 제형의 항 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes) 실험 결과이다.
도 13은 잔대 추출물과 희첨 추출물이 포집된 리포좀을 함유하는 완제품의 패널 테스트 결과이다.

본 발명자는 여드름 개선용 소재를 발굴하기 위해 365종의 한약재에 대한 항균효능을 분석하였으며, 이들 중 항균력이 뛰어난 희첨, 단삼, 관중, 파고지, 측백엽, 오수유 등으로 소재를 압축하여 스크린을 수행하였다.

그 결과, 희첨과 잔대잎의 조합을 최종적으로 선정하였고, 특히 이들이 개별 소재로 있을 때 보다 복합 사용하였을 때, 여드름의 원인으로 알려진 P.acnes 균에 대한 항균작용이 특이적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

그런데, 희첨의 항균성분은 지용성성분과 수용성성분에 골고루 분포하고 있어 일반적인 추출법으로는 그 유효성분을 완전하게 이용할 수 없으며, 새로운 추출물 제조방법이 필요한 것 역시 확인할 수 있었고 본 발명에서 이를 개발 완성할 수 있었다.

이를 토대로 본 발명에서는 수용성의 잔대잎추출물과 희첨의 수용성 및 지용성 추출물을 리포좀 제형의 내외곽에 포집하여 피부투과도를 극대화시킨 화장품 중간 소재를 개발할 수 있었다.

잔대는 초롱꽃과에 속하는 다년생 초본식물로서, 딱주라고도 하며 한자어로는 사삼(沙蔘)이라 한다. 학명은 Adenophora triphylla var. japonica HARA. 이다. 산야에서 흔히 자라는 식물로 높이가 40∼120㎝이며, 뿌리가 굵고 전체에 털이 있다. 우리나라의 전국 각지에서 나고, 그 밖에 일본·만주·중국에도 분포한다. 봄에 새싹을 나물로 먹고, 뿌리는 이른 봄 또는 가을에 채취하여 구워먹거나 약재로 사용한다. 유효성분으로는 사포닌(saponin)의 일종을 함유한다. 본 발명에서는 잔대의 잎을 사용한다.

희첨(Siegesbeckiae Herba)은 국화과(Compositae)에 속하는 일년생 초본으로, 털진득찰(Siegebeckia pubescens Makino), 진득찰(Siegebeckia glabrescens Makino) 및 동속 근연식물의 지상부이다. 희첨은 항염증작용, 혈압강하작용, 항염 및 항암 작 용 등의 약리 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 이미 한방에서는 관절통, 근육통, 고혈압 등 치료 목적으로 사용되어 왔음. 지금까지 알려진 주요성분으로는 다루틴(darutin), 알칼로이드(alkaloid), 키레놀 등 디테르펜 류로 알려져 있다.

본 발명의 개요에 대해서는 도 1에 간단히 모식화해서 나타냈고, 도 2에는 잔대잎 추출공정과 희첨 추출 공정을 보다 구체적으로 나타냈다. 도 1은 본 발명에서 사용된 추출물의 제조과정 및 리포좀에 포집하는 과정을 보여준다. 도 2는 잔대잎 추출공정과 희첨 추출 공정을 보다 구체적으로 보여준다. 도 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 잔대잎 추출물은 잔대잎을 바람직하게 70% 주정으로 추출하여 동결건조한 추출물 분말(소재A)이다. 상기에서 용매로 선정된 70% 주정은 잔대추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량측정을 통하여 가장 바람직한 것으로 선발된 것이다.

희첨은 지용성 성분을 선택적으로 수득하기 위하여 CO2 초임계유체 추출방법을 사용하여 지용성성분(소재B)을 우선 수득한다. 희첨추출물의 추출 공정별 키레놀 성분의 함량 분석 비교한 결과, 초임계추출물의 키레놀 추출 수율이 제일 좋음을 확인할 수 있었기 때문이다. 아울러, CO2 초임계유체 추출물 박을 정제수를 이용하여 추출한 후 동결건조하여 추출물분말(소재C)을 수득한다. 이때, 바람직하게는 질소를 퍼지(purge) 하면서 추출하는 것이 좋다. 질소를 퍼지하면서 추출하는 것은 추출기 내로 질소를 퍼지 (기포가 발생하게 주입) 하면서 추출하는 것을 의미한다.

상기에서 수득한 소재A와 소재C를 부틸렌 글라이콜 (Butylene Glycol) 또는 프로판디올(Propanediol)에 용해하여 소재D를 수득한다. 이후, 뱅함법을 응용하여 소재D를 수상층에 소재B를 유상층에 포집하여 다중층 리포좀 제형을 형성한다. 리포좀 제형으로의 제조를 구체적으로 설명하자면, 리포좀 제형으로 개발은 뱅함법 (Bangham method)을 기준으로 하여, 이를 변형하여 바람직하게 하기의 방법으로 제조할 수 있다 (도 3 참조 요망). 도 3은 뱅함법에 따른 리포좀 제조 과정을 보여준다.

· 1단계: 소재B, 인지질을 프로판디올에 용해.

· 2단계: 감압 농축기로 건조하여 지질막 형성.

· 3단계: 소재D가 포함된 수용액으로 지질막을 수화.

· 4단계: 수화된 리포좀액의 균질화를 위해 호모지나이저 또는 초음파 균질기 사용.

상기와 같은 과정을 통해 개발된 본 발명의 리포좀 제형은 안정성이 우수하여, 포집되는 잔대추출물과 희첨추출물의 효능 안정도를 확보할 수 있었다.

잔대추출물과 희첨추출물을 함유하는 리포좀의 세포독성 확인 결과, 1%까지 독성의 영향이 미비함을 보여주어 안전도를 확인할 수 있었다.

또한, 잔대추출물과 희첨추출물 리포좀의 콜라겐 생성 및 MMP-1 저해 효능을 측정하였는데, 농도 의존적으로 콜라겐 함량을 증가하는 경향을 확인하고, 농도 의존적으로 MMP-1의 함량은 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.

또한, 잔대추출물과 희첨추출물을 포집한 리포좀 추출물의 항균력 시험 결과, 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)와 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes) 2가지 균주에 대하여는 잔대추출물과 희첨추출물을 함유하는 리포좀과 이 리포좀 포함된 토너에서 공히 항균력이 있음을 확인할 수 있었다.

아울러 잔대추출물과 희첨추출물을 포집한 리포좀을 함유하는 완제품의 패널테스트 결과, 사용감이 좋고, 여드름에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 잔대 잎 추출물의 최적 추출 공정 확립]

(1) 샘플 제조

잔대 잎 원물에 에탄올 0%, 50%, 70% 농도별로 제조한 용매를 10배수로 가하여 상온에서 3시간 동안 추출하고, 추출액을 3,500rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 실린지 필터(0.45 um)로 여과하였다.

(2) Total polyphenol 및 flavonoid 함량 측정

① 총 페놀 함량은 Folin-Denis법에 따라 추출물 5 μL에 Folin-Ciocalteau phenol reagent 10 μL 와 증류수 100 μL을 가한 후 3분간 실온에서 혼합하였다다. 혼합액에 20% Na2CO3용액을 100 μL 가한 다음 실온에서 1시간 동안 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다다. Gallic acid를 25~800 μg/mL 농도 범위로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로 부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였다.

② 총 플라보노이드는 Moreno 등의 방법에 따라 추출물 25 μL에 에탄올 75 μL, 증류수 140 μL, 1M 초산칼륨 5 μL 및 10% aluminum nitrate 5 μL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 반응 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin(Sigma Co., USA)를 표준물질로 하여 1~500 μg/mL의 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로 부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

(3) 실험 결과

실험 결과는 도 4 및 5와 같았다. 도 4는 에탄올 농도별 추출물의 폴리페놀 함량 측정 결과이고, 도 5는 에탄올 농도별 추출물의 플라보노이드 함량 측정 결과이다.

추출 용매의 에탄올 농도 70%일때, 폴리페놀과 플라보노이드의 함량이 증가하는 경향을 확인하였다. 이를 바탕으로 추출 용매를 70% 에탄올로 결정하고 추출을 진행하였다.

[실시예 2: 희첨의 최적 추출 공정 확립]

(1) 실험 개요

희첨의 알려진 주요 성분으로는 다루틴(darutin)과 같은 알칼로이드(alkaloid), 키레놀, 17-하이드록시-16알파(-)-카우란-19-카르복실릭 산과 같은 에스터 류와 디테르펜 류가 있다. 이중 키레놀(Kirenol)은 주로 희첨에서 발견되는 디테르페노이드(diterpenoid)로서 항염, 진통, 항균효과가 있으며, 실제로 관절염 치료 효과, 항비만 효과 등이 있는 것으로 보고되어 있다. 그래서 키레놀 표준물질과 희첨 추출물에서 추출되는 키레놀의 함량을 측정하고자 HPLC로 분석을 시행하였다.

(2) 샘플 제조

① 희첨 초임계추출물 제조

초임계유체 추출은 희첨 100 g을 400bar, 50℃ 조건의 CO2 초임계 유체인 용매를 사용하여 2시간 동안 추출하였다. 추출물을 상압에서 용매인 CO2 유체를 제거하여 지용성 성분을 추출하였다.

② 희첨 열수추출물 제조

희첨 100 g에 10배수의 증류수를 첨가하여 90℃로 가온하여 4시간 동안 교반 추출하였다. 추출액을 3500 rpm, 10min 원심분리 후 상층액을 최종 0.45 um 필터로 여과하여 추출물을 제조하였다.

③ 희첨 질소퍼지 추출물 제조

희첨의 초임계 추출 후, 남은 추출박 100 g에 10배수의 증류수를 첨가하여 질소 가스를 주입하고 밀봉하여 산소와의 접촉을 차단하고 상온에서 4시간 동안 교반 추출하였다. 추출액을 3500 rpm, 10min 원심분리 후 상층액을 최종 0.45 um 필터로 여과하여 추출물을 제조하였다.

(3) 실험 방법

희첨 초임계추출물과 질소퍼지 추출물의 키레놀 함량을 High performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 분석하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 A: 0.2% phosphoric acid in water, B: 0.2% phosphoric acid in acetonitrile을 사용하여 gradient 조건에서 1 mL/min 유속으로 분리하였다. Luna C18 (250 x 4.6 mm, 5 μm) 컬럼을 사용하였으며, 키레놀 검출을 위해 사용한 파장은 215 nm이었다. 표준물질로 키레놀을 20~200 μg/mL 농도로 제조하여 검량선 작성에 사용하였다.

(4) 실험 결과

희첨 열수 추출물, 초임계추출물과 질소퍼지 추출물의 키레놀 함량을 HPLC를 사용하여 분석한 결과, 열수 추출물에서는 같은 retention time에 피크를 확인할 수 없었고, 초임계추출물은 96.31μg/mL, 질소퍼지 추출물은 44.47μg/mL의 농도를 확인할수 있었다. 최종적으로 추출물 대비 키레놀의 함량은 초임계추출물은 1.93%로 가장 좋은 수율로 추출되었고, 질소퍼지추출물일때는 0.89%로 추출되었음을 확인하였다.

추출물 별 키레놀 분석 결과

	추출물 농도	Peak Area	Kirenol (ug/ml)	추출물 대비 Kirenol의 추출 비율
희첨 열수추출물	5mg/ml	0	0	0%
희첨 질소퍼지추출물	5mg/ml	497.6923	44.47	0.89%
희첨 초임계추출물	5mg/ml	1077.9053	96.31	1.93%

이상의 결과로부터, 희첨 초임계추출물과 희첨 질소퍼지추출물을 사용하기로 하였다.

[실험예 1: 잔대잎 추출물과 희첨 추출물의 항산화 효능 측정]

(1) 실험 방법

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical(DPPH)는 free radical에 대한 시료의 항산화 효능을 확인하기 위하여 사용한다. 전자공여능 측정은 공지의 방법을 변형하여 측정하였다. 에탄올에 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8 ㎖에 시료 0.2 ㎖을 첨가하여 vortex mixer로 5초간 진탕하고, 암소에서 10분 동안 방치 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음 식에 의하여 DPPH free radical 소거능을 나타내었다.

[수학식 1]

(2) 실험 결과

잔대잎 추출물과 희첨 추출물의 항산화 효능 측정을 DPPH 소거능으로 측정하였다. 잔대 추출물은 70%에탄올 추출물에서 가장 높은 75.98%의 DPPH 소거능을 확인하였고, 희첨 추출물은 초임계 추출물과 질소퍼지 추출물에서 각 82.23%, 72.44%의 DPPH 소거능을 확인하였다 (도 6). 도 6은 잔대 추출물과 희첨 추출물의 DPPH 소거능을 보여준다.

[실시예 3: 잔대잎 추출물과 희첨 추출물의 안정성을 확보할 수 있는 최적 추출 제형 개발]

상기 수득한 추출물 각각을 부틸렌 글라이콜 (Butylene Glycol) 또는 프로판다이올(Propanediol)에 용해하여 안정성이 우수한 최종 추출물 제형으로 확립하였다.

[실시예 4: 잔대잎 추출물과 희첨 추출물을 함유하는 리포좀 제형 개발]

(1) 인지질 종류에 따른 리포좀 제형 시험

인지질 6종(Lecico F-580 IPM, Lecico P900 IPM, Lecico Sun FM-580, Lipamin H100, Emulmetik 950, Emulmetik 930) 중, 육안관찰 결과, Emulmetik 950는 거품이 형성되었지만, 침전 및 층이 분리되지 않고, 제형이 가장 안정적이었다 (표 2).

6종의 인지질에 따른 리포좀 제형 평가

인지질	색	제형	거품	침전 여부	층분리	안정성
F 580	불투명	액체	X	X	X
P 900	불투명	액체	O	O	X
Sun FM 580	불투명	액체	X	O	X
H 100	불투명	액체	O	O	X
EM 950	불투명	액체	O	X	X	1순위
EM 930	불투명	액체	O	X	X	2순위

(2) 리포좀 제조

인지질 6종 중에서 최종적으로 Emulmetik 950을 인지질로 사용하여 뱅함법을 응용하여 리포좀 제형을 제조하였다. 인지질 상에 희첨의 유상층 추출물을 첨가하고, 수상층에 수용성 잔대잎 추출물, 수용성 희첨 추출물을 각각 100ug/ml의 농도가 되게 첨가하여 리포좀을 제조하였다.

리포좀 제조에 사용된 인지질은 대두(soybean)에서 추출한 지질을 수소 첨가시켜 불포화 성분을 제거한 레시틴으로 phosphatidyl choline 성분이 95% 이상인 Emulmetik 950 (Lucas Meyer사)을 사용하였다. 인지질과 sodium deoxycholate를 9:1 비율로 혼합한 후 동량의 에탄올과 지용성 추출물(희첨의 유상층 추출물)을 첨가하여 60℃ 항온조에서 완전히 용해시켜 투명한 졸 용액을 만들었다. 이를 상온에 굳힌 후 다시 60℃ 항온조에 가져가 투명한 졸 용액이 되면 증류수를 넣고 10 min 이상 자석 교반시켰다. 감압농축기로 50℃에서 감압 조건으로 플라스크 내부에 지질막(lipid film)이 형성되도록 완전히 건조하였다. 지질막에 수용성 추출물(수용성 잔대잎 추출물, 수용성 희첨 추출물)과 증류수를 첨가하여 수화한 후 homogenizing 2000 rpm, 10 min 동안 균질화하여 최종 인지질 함량 2%의 리포좀을 완성하였다.

이를 통해 수상층(흑색)과 유상층(백색)의 멀티라멜라 구조의 리포좀이 여러겹으로 구성되어 있어서 안정성이 높은 최적의 리포좀 제형 조건 확립할 수 있었다 (도 7). 도 7은 일반 리포좀 제형(좌)과 본 발명에서 제조한 멀티라멜라 리포좀 제형(우) TEM 사진이다.

[실험예 2: 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀의 세포 독성]

(1) 실험 방법

① HS68 세포 배양

인간에서 유래한 피부 섬유아세포인 HS68 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. HS68 세포는 DMEM 배지(Welgene)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포 배양액(complete DMEM 배양액)을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline(PBS, pH7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.

② HS68 세포의 cell viability 측정

HS68 세포를 1 × 104 cells/well 이 되도록 48-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도로 함유한 serum-free 세포 배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 MTT assay (Denizot F and Lang R. J Immunological Method 89:271-277, 1986)을 실시하여 살아있는 세포수를 측정하였다. MTT assay 방법은 미토콘드리아의 dehydrogenase가 MTT (Amresco)를 환원시켜 푸른색 물질인 formazan을 만드는 원리에 기초한 것으로 본 시험에서는 formazan을 isopropanol에 용해시킨 다음 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험 결과

HS68 세포에서 리포좀의 세포독성을 조사하기 위해 리포좀 제형을 다양한 농도로 세포 배양액에 처리하여 24시간 배양한 후 MTT assay를 실시하였다. 리포좀 제형을 0.1 ~ 1% 농도로 처리한 경우 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았다. 2% 리포좀 제형을 처리하였을 때 세포 생존률이 67.6%로 현저히 감소하는 결과를 확인하였다. 도 8은 잔대추출물과 희첨추출물 포집 리포좀의 세포 독성을 측정한 결과이다.

[실험예 3: 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀의 collagen 생성 및 MMP-1 저해 효능]

(1) 실험 방법

HS68 세포를 1 × 105 cells/well 이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 아세로라 추출물, 마누카 오일, 리포좀 제형을 다양한 농도로 함유한 serum-free 세포 배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 세포 배양액을 수거하여 각각 Procollagen Type I C-Peptide (PIP) EIA Kit (Takara)와 Human MMP-1 ELISA Kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 collagen 및 MMP-1 함량을 측정하였다.

(2) 실험 결과

① Collagen은 모든 결합조직에 분포하는 주된 단백질로서, 피부, 골 및 인대에 풍부하게 존재한다. 리포좀 제형이 피부 섬유아세포인 HS68 세포의 collagen 생성 분비에 미치는 영향을 조사하기 위해 시험물질을 다양한 농도로 처리하여 세포를 배양한 후 세포가 분비한 collagen 함량을 측정하였다. 본 발명 리포좀 제형의 농도 의존적으로 collagen 함량이 증가하는 경향을 확인하였다. 도 9는 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀 제형 처리시 HS68 세포가 분비한 collagen 함량(%)을 측정한 결과이다.

② MMP-1은 콜라겐 분해 효소로, 리포좀 제형이 피부 섬유아세포인 HS68 세포의 MMP-1 생성 분비에 미치는 영향을 조사하기 위해 시험물질을 다양한 농도로 처리하여 세포를 배양한 후 세포가 분비한 MMP-1 단백질의 함량을 측정하였다. 본 발명 리포좀 제형을 100, 500 및 1000 μg/mL 농도로 처리한 경우, HS68 세포에서 생성 분비된 MMP-1의 함량은 농도 의존적으로 감소하는 경향을 확인하였다. 도 10은 잔대 추출물과 희첨 추출물 포집 리포좀 제형 처리시 HS68 세포가 분비한 MMP-1 함량(%)을 측정한 결과이다.

[실험예 4: 잔대 추출물과 희첨 추출물을 포집한 리포좀 추출물의 항균력 (항 여드름균 억제능) 실험]

(1) 실험 개요

잔대와 희첨추출물의 리포좀 제형이 항균력을 갖는지 확인하고, 토너에 적용하였을 때에도 항균력을 유지하는지 알아보기 위해 실험을 진행하였다. 호기성균인 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)와, 여드름 유발균주인 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes) 2가지를 사용하여 항균력 테스트를 진행하였다. 추출물의 항균력을 측정하기 위한 방법으로 DISC 실험을 진행하였다.

(2) 실험방법

① P. acnes는 RC 아가 배지, S. aureus는 TSB 아가 배지에 steaking 후, 37℃에서 24h 배양하였다. P. acnes은 혐기성균이므로 혐기상황에서 배양하였다.

② SPL Round-Bottom polystyrene 5ml tube에 멸균된 0.85% NaCl용액을 한 개 튜브에는 2ml, 나머지 3개 튜브에는 1ml 씩 담았다.

③ 각각 자란 균의 colony를 10개 정도 NaCl용액에 풀어 접종 한 후, vortexing 하고 630nm에서 흡광도를 측정하여 균액의 농도를 맞추었다.

④ Muller-Hinton 아가 (90mm plate에 17ml씩 분주, 높이는 4mm)를 90°씩 회전하며 8번 골고루 streaking 한다. 이때, 면봉에 물기는 최대한 제거 후 streaking을 하였다.

⑤ 멸균된 DISC 4개를 균일한 간격으로 놓고 DISC에 시료 20㎕씩 접종하였다 (시료는 동결건조한 상태에서 50% 에탄올 용매에 녹여서 100ug/ml 농도로 준비함).

⑥ 디스크가 잘 놓였는지 확인 한 다음에 37℃에서 24h 배양하였다.

⑦ 각 시료에 따른 균 성장 억제 영역의 지름을 측정하였다.

시료 번호	시료	기타
1	잔재, 희첨 열수 추출물 (100㎍/1ml)	대조군
2	잔대 추출물, 희첨 추출물 포집 리포좀 (100㎍/1ml)	실험군1
3	토너	대조군
4	토너 (잔대 추출물, 희첨 추출물 포집 리포좀 포함)	실험군2

(3) 시료 준비

① 잔대, 희첨 열수추출물

잔대와 희첨을 정제수를 각각 10배수로 칭량하여 90℃에서 4시간 추출 후, 0.45㎛ 필터를 사용하여 필터하였다. 추출물을 동결건조한 후에 파우더 상태로 수득하였다. 수득한 파우더를 50%에탄올 용매에 녹여서 100ug/ml 농도로 녹여서 준비하였다.

② 잔대 추출물 및 희첨 추출물 포집 리포좀

상기 실시예 4에서 제조한 잔대 추출물 및 희첨 추출물 포집 리포좀을 동결건조 파우더 상태에서 50%에탄올 용매에 녹여서 100ug/ml 농도로 녹여서 준비하였다.

③ 토너(잔대 추출물 및 희첨 추출물 포집 리포좀 포함)

상기 실시예 4에서 제조한 잔대 추출물 및 희첨 추출물 포집 리포좀을 100ug/ml 농도로 자사 개발 토너에 녹여서 준비하였다.

(4) 실험 결과

스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 실험 결과는 도 11과 같았다. 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes) 실험 결과는 도 12와 같았다. 실험 결과, 잔대 추출물과 희첨 추출물이 포집된 리포좀이 항균력을 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 토너에 적용 하였을 때에도 항균력을 잃지 않고 유지하는 것을 확인하였다.

[실시예 5: 잔대 추출물과 희첨 추출물이 포집된 리포좀을 함유하는 완제품의 제조]

잔대 추출물과 희첨 추출물이 포집된 리포좀이 첨가된 닥터더마치 마누카 스팟겔은 다음과 같은 공정과정을 거쳐 시제품으로 제조하였다. A상을 비커에 칭량하여 70℃로 약 30분정도 가열하여 완전히 녹이고, 50℃ 까지 냉각하면 B상을 첨가하여 아지믹서로 혼합한다. 젤 제형을 상온까지 냉각하면 C상을 첨가하여 아지믹서로 10분간 혼합한다. 사용감 테스트 결과 샘플 1은 점성이 너무 강하고, 샘플 2는 점성이 너무 약해서 샘플 3의 경도가 적당하고 부드럽게 발렸다.

	원료명	함량(%)
A	정제수	80.87	81.07	80.97
	카보머	0.25	0.15	0.20
	소듐 카보머	0.25	0.15	0.20
	알란토인	0.10	0.10	0.10
	베타인	0.50	0.50	0.50
	나이아신아마이드	2.00	2.00	2.00
	글리세린	3.00	2.50	2.00
	부틸렌글라이콜	3.00	3.50	4.00
	NS-3000	1.00	1.00	1.00
	D-판테놀	0.50	0.50	0.50
	히알루로닉애씨드	0.10	0.10	0.10
	카바솔	0.50	0.50	0.50
	EDTA	0.05	0.05	0.05
B	HCO-40	0.50	0.50	0.50
	1,2-헥산다이올	1.00	1.00	1.00
	Ethylhexylglycerin	0.03	0.03	0.03
	티트리오일	0.30	0.30	0.30
	타임오일	0.05	0.05	0.05
	마누카오일	1.00	1.00	1.00
	에탄올	4.00	4.00	4.00
C	본 발명의 잔대 추출물과 희첨 추출물이 포집된 리포좀 원료	1.00	1.00	1.00
합계		100.00	100.00	100.00
		샘플1	샘플2	샘플3

[실험예 5: 잔대 추출물과 희첨 추출물이 포집된 리포좀을 함유하는 완제품의 패널 테스트]

상기 실시예 5에서 제조한 닥터더마치 마누카 스팟겔을 여드름으로 고민하는 20대 체험단을 모집하여 약 2주간 트러블 부위에 고루 펴 발라 흡수시킴으로써 전, 후 사진과 총평에 대한 의견을 수렴하였다. 그 결과는 도 13과 같았다.

Claims (4)

1. 소재A 및 소재C를 혼합하여 수상층에 포집하고, 소재 B를 유상층에 포함하여 형성된 멀티라멜라 리포좀을 포함하되,
   상기 소재A는 잔대 잎의 에탄올 추출물이고,
   상기 소재B는 희첨의 이산화탄소 초임계유체 추출물이며,
   상기 소재C는 희첨의 이산화탄소 초임계유체의 추출시 발생한 추출물 박을 물로 재추출한 물 추출물인 것을 특징으로 여드름 개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 소재A와 소재C는,
   서로 혼합하여 소재D로 제조하고, 이것을 수상층에 포집하는 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기A 또는 소재C는,
   각각의 추출물을 부틸렌 글라이콜 (Butylene Glycol) 또는 프로판다이올(Propanediol)에 용해하여, 수상층에 포집하는 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 소재C는,
   재추출시, 질소를 퍼지(purge) 하면서 추출한 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
   

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