KR102255993B1

KR102255993B1 - 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물을 포함하는 피부장벽강화용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102255993B1
Application number: KR1020210012854A
Authority: KR
Inventors: 권성필; 김홍유; 김지원
Original assignee: 청담씨디씨제이앤팜 유한책임회사
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-05-25

Abstract

본 발명은 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물을 포함하는 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부장벽강화효능을 발휘한다.

Description

포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물을 포함하는 피부장벽강화용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for enhancement of skin barrier with the extract of grape skin, the extract of fiwa fruit and the extract of Sigesbeckia Orientalis}

본 발명은 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물을 포함하는 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관이다. 그 중 피부의 최외곽에 위치하는 각질층은 보습작용, 유수분 밸런스 유지 등을 통해 몸을 외부 환경으로부터 보호하는 일종의 피부장벽으로서 중요한 역할을 한다.

건강한 사람의 각질세포에는 고농도의 자연보습인자 (Natural Moisturizing Factor, NMF)가 존재하는데, 이는 피부의 수분함유를 돕는 기능을 한다. 하지만, 난방, 오염된 대기 및 자외선 등의 외인성 노화, 내인성 노화 및 마찰, 면도 및 세안 등의 물리화학적 자극은 피부의 수분 불균형을 유발하고 피부 건조가 발생한다. 이를 방지하기 위해 피부 보습제의 사용 필요성이 증가하고 있다.

피부에서 각질세포층의 수분함량을 적절하게 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분, 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용된다.

대한민국 특허공개번호 제1020160091166호 (2016.08.02)에는 조성물 전체 100중량%를 기준으로, 셀룰로오스 5 내지 15 중량%; 뽕잎 분말 및 모링가 분말을 1: 1로 혼합한 복합 분말 1 내지 10 중량%; 복합 오일 1 내지 5 중량%; 히아루론산 1 내지 30 중량%; 비타민류 1.5 내지 3.5 중량%; 복합 천연 추출물 0.1 내지 5 중량%; 및 나머지는 에탄올과 정제수의 혼합용액을 포함하고, 상기 복합 천연 추출물로는 파파야 추출물, 천년초 추출물, 화이트윌로우껍질 추출물, 병풀 추출물, 라벤더 추출물 및 뽕잎 추출물 혼합한 것을 특징으로 하는, 각질제거 및 피부 장벽 기능 개선용 천연 성분 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명에서는 천연물을 이용하여 피부장벽강화 효능을 발휘하는 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물이 수상층에 포집된 멀티라멜라 리포좀을 포함하되, 상기 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물은, 각각 진공 저온 추출법에 의해 추출된 추출물인 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부장벽강화용 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부염증 개선 또는 항균능이 있다

본 발명의 피부장벽강화용 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부보습력 증가를 통해 피부장벽강화능이 발휘된다.

본 발명의 피부장벽강화용 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 스핑고지질 함량이 증가를 통해 피부장벽강화능이 발휘된다.

본 발명에 의할 경우, 본 발명의 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부장벽강화효능을 발휘한다. 특히, 본 발명은 피부보습력 증가 및 스핑고지질 함량이 증가를 통해 피부장벽강화능이 발휘된다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부염증 개선 또는 항균능이 발휘되기도 한다.

도 1은 추출방법에 따른 포도 과피 추출물의 레스베라트롤 함량 비교 결과이다.
도 2는 포도과피 추출물의 세포 생존률 측정 결과이다.
도 3은 까마귀나무열매 추출물의 세포 생존률 측정 결과이다.
도 4는 희첨 추출물의 세포 생존률 측정 결과이다.
도 5는 포도과피 추출물의 NO 생성 억제능 측정 결과이다.
도 6은 까마귀나무열매 추출물의 NO 생성 억제능 측정 결과이다.
도 7은 희첨 추출물의 NO 생성 억제능 측정 결과이다.
도 8은 포도 과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물과 희첨 추출물의 항균력을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명 멀티라멜라리포좀 제형의 TEM 이미지 사진이다.
도 10은 본 발명 멀티라멜라리포좀의 제형 안정성 시험 결과이다.
도 11은 본 발명 멀티라멜라리포좀 처리시 세포내 세라마이드 함량이 증가하는 것을 보여준다.
도 12는 본 발명 멀티라멜라리포좀 처리시 세포내 DHceramide 함량 증대를 보여준다.
도 13은 본 발명 멀티라멜라리포좀 처리시 세포내 Sphingoid bases and 1-phosphate 함량 증대를 보여준다.
도 14는 포도과피 분획물의 항산화 효능 실험 결과이다.
도 15는 까마귀쪽나무열매 분획물의 항산화 효능 실험 결과이다.

본 발명의 멀티라멜라리포좀은 다중층라멜라리포좀으로, 지용성 성분과 수용성 성분이 다중층으로 존재하는 라멜라 소포체를 말하는데, 기본적으로 뱅함법(Bangham method, BM)을 이용하여 제조하였다.

뱅함법(Bangham method, BM)은 레시틴을 지용성 성분을 함유한 유기용매에 녹여 교반하고 감압농축기로 감압 조건으로 건조하여 플라스크의 내부에 지질 막(lipid film)이 형성되도록 한 후, 수용성 성분을 녹인 증류수 또는 버퍼(buffer) 용액으로 수화하고 균질화하여 멀티라멜라리포좀을 제조하는 방법을 의미한다. 본 발명에서는 수용성 추출물 3종을 사용하였기 때문에 상기 지질막 형성시 지용성 성분이 별도로 첨가되지는 않는다.

본 발명에서 리포좀 제조에 사용된 인지질은, 바람직하게 soybean에서 추출한 지질을 수소 첨가시켜 불포화 성분을 제거한 레시틴으로, phosphatidyl choline 성분이 95% 이상인 Emulmetik 950 (Lucas Meyer사)을 사용하는 것이 좋다.

인지질과 sodium deoxycholate를 8.5~9.5:1 비율로 혼합한 후 동량의 에탄올을 첨가하여 50~70 ℃ 항온조에서 완전히 용해시켜 투명한 졸 용액을 만들었다. 이를 상온에 굳힌 후 다시 50~70℃ 항온조에 가져가 투명한 졸 용액이 되면 증류수를 넣고 10~20분 동안 (바람직하게 10분) 자석 교반시켰다. 이후, 감압농축기로 40~60℃에서 감압 조건으로 플라스크 내부에 지질막(lipid film)이 형성되도록 완전히 건조하였다. 이후, 지질막에 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물 3종과 증류수를 첨가하여 수화한 후 homogenizing 2000 rpm, 10 min 동안 균질화하여 최종 인지질 함량 2%의 리포좀을 완성하였다

본 발명에서 상기 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물은 진공 저온 추출법에 의해 추출된 추출물이다.

한편, 본 발명의 피부장벽강화용 화장료 조성물은 피부보습력 증가를 통해 피부장벽강화능이 발휘되고,스핑고지질 함량이 증가를 통해 피부장벽강화능이 발휘된다. 또한, 본 발명의 피부장벽강화용 화장료 조성물은 바람직하게 피부염증 개선 또는 항균능이 발휘된다.

이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 제조예, 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[제조예 1: 진공 저온 추출법에 의한 포도 과피 추출물 제조]

국산 캠벨 포도에 자외선을 4일간 조사하여 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 과피를 분리하여 레스베라트롤을 추출하였다. 추출방법은 90℃ 2시간 10배수의 열수 추출과 50℃ 2시간 10배수의 70% 에탄올을 용매로 한 에탄올 교반 추출과 50℃에서 2시간 동안 10배수의 증류수를 용매로 첨가한 후 감압 진공하여 추출하는 진공저온추출을 사용하여 추출물을 제조하였다. 각 방법으로 제조된 포도 과피 추출물은 4,000 rpm, 10 분간 원심분리하여 상층액을 0.45 um 실린지 필터로 여과하여 분석하였다.

각 방법으로 제조된 포도 과피 추출물의 레스베라트롤 함량을 High performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 분석하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 A: 0.1 % acetic acid in DI, B: 0.1 % acetic acid in acetonitrile을 사용하여 gradient 조건에서 1 mL/min 유속으로 분리하였다. Luna C18 (250 x 4.6 mm, 5 μm) 컬럼을 사용하였으며 레스베라트롤 검출을 위해 사용한 파장은 306 nm이다. 표준용액으로 레스베라트롤을 6.25~50 μg/mL 농도로 제조하여 검량선 작성에 사용하였다.

각 추출물의 레스베라트롤의 함량을 측정한 결과 열수추출물의 레스베라트롤의 함량은 113.45 μg/mL으로 가장 낮은 결과를 보였다. 70%에탄올 추출물과 진공저온 추출물의 레스베라트롤의 함량은 각 249.54 μg/mL 와 279.63 μg/mL 으로 증가하는 결과를 보였다. 특히, 진공저온 추출물은 기존의 70%에탄올 추출물과 비교하여 11% 증가하는 결과를 보였다 (도 1). 도 1은 추출방법에 따른 포도 과피 추출물의 레스베라트롤 함량 비교 결과이다.

이상의 결과로부터, 3가지 추출법 중 진공 저온 추출법을 추출방법으로 선택하여 포도과피 추출물을 수득한 후 하기에서 사용하였다.

[제조예 2: 진공 저온 추출법에 의한 까마귀쪽나무열매 추출물 제조]

까마귀쪽나무열매에 10배수의 증류수를 첨가하고 감압 진공하였다. 감압 진공으로 끓는점이 낮아져 저온인 50℃에서 물이 끓게 되므로 열 영향을 받기 쉬운 물질의 손상없이 2시간 동안 추출할 수 있었다. 추출후, 4,000 rpm, 10 분간 원심분리하고 상층액을 0.45 um 실린지 필터로 여과하여 추출물을 제조하였다.

[제조예 3: 진공 저온 추출법에 의한 희첨 추출물의 제조}

희첨에 10배수의 증류수를 첨가하고 감압 진공하였다. 감압 진공으로 끓는점이 낮아져 저온인 50℃에서 물이 끓게 되므로 열 영향을 받기 쉬운 물질의 손상없이 2시간 동안 추출할 수 있었다. 추출후, 4,000 rpm, 10 분간 원심분리하고 상층액을 0.45 um 실린지 필터로 여과하여 추출물을 제조하였다.

[실험예 1: 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물의 세포 생존률 측정을 통한 세포독성 검증]

포도과피 추출물, 까마귀나무열매 추출물, 희첨 추출물 처리시 RAW 264.7 세포의 생존율은 MTT Assay를 실시하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 1 × 10⁵ cells/well이 되도록 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 추출물을 다양한 농도로 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환하여 세포를 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 1 mg/mL MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5 diphenyl tetrazolium bromide, Amresco) 용액을 첨가하여 2시간 추가 배양하였다. MTT 용액을 제거한 후 MTT가 미토콘드리아 dehydrogenase에 의해 환원되어 생성된 푸른색의 formazan을 isopropanol을 첨가하여 용해한 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 마우스대식세포인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다.

실험결과는 도 2, 도 3 및 도 4와 같았다. 도 2, 도 3 및 도 4는 각각 포도과피 추출물, 까마귀나무열매 추출물, 희첨 추출물의 세포 생존률 측정 결과이다. 처리 농도에서 모두 세포 생존률이 우수한 것으로 나타났다. 포도과피 추출물은 500 μg/mL, 까마귀쪽나무열매 추출물은 50 μg/mL, 희첨 추출물은 50 μg/mL 농도에서 세포 독성을 보이지 않아, 하기에서는 이 농도로 실험을 진행하였다.

[실험예 2: 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물의 NO 생성 억제능 측정을 통한 항염 효능 검증]

포도 과피 추출물, 까마귀나무열매 추출물, 희첨 추출물의 항염 효능을 평가하기 위하여 NO 생성 억제능 측정하였다. NO의 농도는 배양액 내의 NO농도를 griess reagent system을 이용하여 측정하였으며, RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×10⁵ cells/well로 분주하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체한 후 리포좀 제형을 다양한 농도로 처리하였고 LPS 1 μg/ml의 농도를 처리하여 다시 24 h 동안 배양하였다. 배양액 100 μl에 N1 buffer 50 μl를 각 well에 처리하여 10 min간 상온에서 반응 한 후, N2 buffer 50 μl를 각 well에 처리하고 10 min간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

실험결과는 도 5, 도 6 및 도 7과 같았다. 도 5, 도 6 및 도 7은 각각 포도과피 추출물, 까마귀나무열매 추출물, 희첨 추출물의 NO 생성 억제능 측정 결과이다. 포도과피 추출물은 500 μg/mL 처리시, NO 생성능이 84.6% (LPS 처리시 대비)로, NO 생성 억제능이 15.4% (LPS 처리시와의 대비)를 보였다. 까마귀쪽나무열매 추출물은 50 μg/mL 처리시, NO 생성능이 63.4% (LPS 처리시 대비)로, NO 생성 억제능이 33.5% (LPS 처리시 대비)을 보였다. 희첨 추출물은 50 μg/mL 처리시, NO 생성능이 82.5% (LPS 처리시 대비), NO 생성 억제능이 17.5% (LPS 처리시 대비)를 보였다. 처리 농도가 증가할수록 선형적으로 NO 생성능이 억제되어, 처리 샘플이 실질적으로 NO 생성을 억제하는 것으로 결론내릴 수 있었다.

[실험예 3: 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물의 항균 활성 검증]

포도 과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물과 희첨 추출물의 항균력을 한천 배지 확산법(paper disk diffusion method)으로 측정하였고 사용한 균주는 S. aureus이다. 균주 S. aureus를 Tryptic soy agar plate 배지에 배양된 1 colony를 취하여 Tryptic soy broth 배지에서 배양하였다. 이 배양액의 600nm에서의 흡광도가 0.15가 되도록 희석하여 균 농도를 10⁶ CFU/ml가 되도록 희석하여 균액을 제조하였다. 균액를 균주에 맞는 agar plate 배지에 100ul씩 고르게 도말한 후 멸균된 paper disk를 적당한 간격으로 올려놓고 준비된 시료를 50ul씩 처리한다. 각 균주의 조건으로 배양한 후 시료가 처리된 paper disk의 clear zone의 크기로 확인하여 항균 활성 측정을 측정하였다.

그 결과는 도 8과 같이 나타났다. 도 8은 포도 과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물과 희첨 추출물의 항균력을 측정한 결과이다. 포도 과피 추출물은 clear zone이 형성되지 않아 항균력이 없는 것으로 나타났다. 까마귀쪽나무열매 추출물은 10 mg/mL 에서 clear zone이 형성되었으나 그 효능이 약한 것으로 판단되었다. 하지만, 희첨 추출물의 clear zone 형성이 뚜렷하게 확인되었다.

[실시예 1: 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물을 함유하는 멀티라멜라리포좀의 제조]

1) 개요

상기에서 항염 기능이 우수하게 나타난 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물과 항균 활성이 우수하게 나타난 희첨 추출물을 사용하여 멀티라멜라리포좀 제형을 개발하였다.

2) 멀티라멜라리포좀 제조방법 (뱅함법)

리포좀 제조에 사용된 인지질은 soybean에서 추출한 지질을 수소 첨가시켜 불포화 성분을 제거한 레시틴으로 phosphatidyl choline 성분이 95%이상인 Emulmetik 950 (Lucas Meyer사)을 사용하였다. 인지질과 sodium deoxycholate를 9:1 비율로 혼합한 후 동량의 에탄올을 첨가하여 60 ℃ 항온조에서 완전히 용해시켜 투명한 졸 용액을 만들었다.

이를 상온에 굳힌 후 다시 60℃ 항온조에 가져가 투명한 졸 용액이 되면 증류수를 넣고 10 min 이상 자석 교반시켰다. 감압농축기로 50℃에서 감압 조건으로 플라스크 내부에 지질막(lipid film)이 형성되도록 완전히 건조하였다. 지질막에 추출물 3종 (포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물)과 증류수를 첨가하여 수화한 후 homogenizing 2000 rpm, 10 min 동안 균질화하여 최종 인지질 함량 2%의 리포좀을 완성하였다.

3) 멀티라멜라리포좀 제형 안정성 시험

상기에서 제조한 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물을 함유하는 리포좀 제형이 안정적으로 유지하는지 확인하기 위해 리포좀 제형을 제조 후 보관 튜브를 차광하여 상온에서 보관하여 4주 동안 매주 리포좀 제형 안정성을 분석하였다. 리포좀 제형을 0.1 μm 시린지 필터를 사용하여 리포좀을 제거 후 여과액에 존재하는 레스베라트롤 함량을 측정하여 리포좀 제조에 사용한 포도 과피 추출물의 레스베라트롤 함량과 비교하여 리포좀 포집율과 리포좀 제형의 안정성을 측정하였다. 리포좀에 포집되어진 resveratrol의 함량과 초기 추출물의 resveratrol의 함량을 HPLC로 분석하여 정량하였다. 포집효율은 HPLC를 이용해 나온 값을 다음에 나타난 수학식 1에 대입하여 리포좀의 포집 효율을 계산하였다.

[수학식 1]

초기 추출물의 resveratrol 농도 272.89 μg/mL에서 리포좀에 포집되어진 resveratrol 농도는 219.84 μg/mL로 리포좀 제형의 포집효율은 80.56%으로 나타났다.

4) 멀티라멜라리포좀 제형의 TEM 촬영

리포좀 제형을 전계방출 투과전자현미경(FE-TEM)으로 입자의 크기와 형태를 관찰하였다. 완성된 리포좀 제형의 입자를 TEM으로 확인한 결과, 도 9와 같이 수십 나노 크기의 구형 입자를 확인하였다. 도 9는 멀티라멜라리포좀 제형의 TEM 이미지 사진이다.

5) 멀티라멜라리포좀 제형 안정성 시험

제조한, 리포좀의 안정성을 확인하기 위해 3달 동안 안정성 시험을 실시하였고, 그 결과 초기 포집율이 80.56%로 나타났으며, 3달 경과후 포집율이 82.28%로 나타났다. 초기 포집 농도 대비 포집율 유지능이 102.1% (100+(82.28-80.56)/80.56*100)로 리포좀 제형이 큰 변화 없이 초기 포집율과 유사하게 유지하고 있었다. 도 10은 멀티라멜라리포좀의 제형 안정성 시험 결과로서 초기 포집 농도 대비 포집율 유지능을 나타낸다.

[실험예 4: 실시예 1에서 제조한 멀티라멜라리포좀 제형의 피부투과도 평가]

실시예 1에서 제조한 멀티라멜라리포좀 제형의 피부투과도를 확인하기 위하여 skin pampa system을 이용하였다. 투과 전 포도과피 추출물의 레스베라트롤 함량과 투과 후 포도과피 추출물의 레스베라트롤 함량을 측정해 그 차이를 계산하고, 투과 전 리포좀 제형의 레스베라트롤 함량과 투과 후 레스베라트롤 함량을 측정해 그 차이를 계산하여 투과률(%)을 나타내었다 (표 1: 포도 과피 추출물과 리포좀 (실시예 1) 제형의 투과도).

	레스베라트롤 함량(ug/ml)
	투과전	투과후	투과률
포도 과피 추출물	272.89	8.89	3.26%
리포좀 (실시예 1)	253.96	16.02	6.31%

[실험예 5: 실시예 1에서 제조한 멀티라멜라리포좀 제형의 세포 내 스핑고지질 대사체 함량 증대능 확인]

1) 스핑고지질 대사체 분석

HaCaT 세포를 배양하여 다양한 농도의 멀티라멜라리포좀 제형을 처리하여 24시간동안 배양하였다. 배양한 세포를 모아 lysis 시킨 후 단백질 정량하여 100 μg에 해당하는 lysate에 400 μL 메탄올, 0.1 M 염산 300 μL 그리고 800 μL 클로로포름을 넣고 30분 동안 추출 후 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 클로로포름층을 새로운 튜브로 회수하여 진공원심분리 농축기를 사용하여 건조 후 100 μL 메탄올에 재용해하여 LC-MS/MS 분석을 하였다. LC-MS/MS 분석 조건은 이동상 A: 2 mM ammonium formate in DI (1% formic acid), B: 1 mM ammonium formate in methanol (1% formic acid)을 사용하여 gradient 조건에서 0.3 mL/min 유속으로 분리하였다. Kintex C18 (100 x 2.1 mm, 2.6 μm) 컬럼을 사용하였으며 스핑고지질은 selected reaction monitoring (SRM) 모드를 사용하여 스핑고지질을 검출하였다. 이온화 조건은 ESI voltage 3.5 kV, Capillary 온도는 300 ℃이다. 표준용액으로는 N-acyl chain length에 따른 각각의 스핑고지질 표준품을 0.00781 ~ 1 μM 농도로 제조하여 검정곡선 작성에 사용하였다. 각 시료와 표준품에 100 pmol의 d18:1/C18:0-d7 첨가하여 내부표준물질로 사용하였다.

2) Ceramide 분석결과

HaCaT 세포에서 멀티라멜라리포좀 제형을 다양한 농도로 세포 배양액에 처리하여 24시간 배양하여 세포내 세라마이드 함량을 분석하였다. 멀티라멜라리포좀 제형의 농도 의존적으로 세라마이드 함량이 증가하는 결과를 보였다 (도 11). 도 11은 멀티라멜라리포좀 처리시 세포내 세라마이드 함량이 증가하는 것을 보여준다.

3) DHceramide 분석 결과

HaCaT 세포에서 멀티라멜라리포좀 제형을 다양한 농도로 세포 배양액에 처리하여 24시간 배양하여 세포내 DHceramide 함량을 분석하였다. 멀티라멜라리포좀 제형의 농도 의존적으로 DHceramide 함량이 증가하는 결과를 보였다 (도 12). 도 12는 멀티라멜라리포좀 처리시 세포내 DHceramide 함량 증대를 보여준다.

4) Sphingoid bases and 1-phosphate 분석 결과

HaCaT 세포에서 멀티라멜라리포좀 제형을 다양한 농도로 세포 배양액에 처리하여 24시간 배양하여 세포내 Sphingoid bases and 1-phosphate 함량을 분석하였다. 멀티라멜라리포좀 제형의 농도 의존적으로 Sphingoid bases and 1-phosphate 함량이 증가하는 결과를 보였다 (도 13). 도 13은 멀티라멜라리포좀 처리시 세포내 Sphingoid bases and 1-phosphate 함량 증대를 보여준다.

[실시예 2~3: 본 발명의 멀티라멜라리포좀을 함유하는 시제품 2종 제조]

1) 크림 제형 (실시예 2)

포도 과피 추출물과 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물을 함유하는 멀티라멜라 리포좀을 사용하여 다음과 같은 공정과정을 거쳐 시제품 제조하였다. B상을 비커에 칭량하여 아지믹서로 20분간 녹였다. 20분간 녹이는 과정에 A상을 칭량한 후, A상, B상 각각 80도씨로 약 30분정도 가열하여 완전히 녹이고, A상을 B상 비커에 서서히 넣으면서 호모믹서로 약 10분간 균질화시켰다. 완전히 균질화된 크림상을 상온까지 냉각하면 C상을 첨가하여 아지믹서로 10분간 혼합하였다 (표 2: 포도 과피 추출물과 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물 함유 멀티라멜라 리포좀의 크림 제형).

	원료명	함량(%)
A	호호바오일	5.00	3.00	1.00
	포도씨오일	3.00	3.00	3.00
	아르간오일	1.00	1.00	3.00
	달맞이꽃오일	2.00	2.00	2.00
	Caprylic/capric triglyceride	3.00	3.50	5.00
	Isoamyl Laurate	2.00	2.00	2.00
	Symbio Muls GC	5.00	5.00	5.00
	세테아릴알콜	1.50	3.00	1.50
	Dermofeel Toco 50	0.50	0.50	0.50
	쉐어버터	2.00	2.00	1.00
	사이클로메치콘	0.50	0.50	0.50
B	잔탄검	0.20	0.20	0.20
	소듐카보머	0.30	0.30	0.30
	LMW	0.05	0.05	0.05
	히아루론산	0.20	0.20	0.20
	정제수	60.09	60.09	61.09
	알로에베라겔파우더	0.10	0.10	0.10
	D-판테놀	0.50	0.50	0.50
	Glycerin	3.00	3.00	3.00
	Butylene Glycol	5.00	5.00	5.00
	Propanediol	3.00	3.00	3.00
C	리포좀 원료 (실시예 1)	1.00	1.00	1.00
	1,2-헥산다이올	1.00	1.00	1.00
	에칠헥실글리세린	0.02	0.02	0.02
	시트릭애씨드	0.04	0.04	0.04
합계		100.00	100.00	100.00
합계		샘플1	샘플2	샘플3

사용감 테스트 결과 샘플 1이 사용감이 부드럽고 촉촉한 느낌과 보습력이 제일 좋았고, 경도도 적당하여 부드럽게 발렸다. 샘플 2는 경도가 높아서 발림성이 떨어졌고, 샘플 3은 보습감이 떨어졌다.

2) 밤 제형 (실시예 3)

포도 과피 추출물과 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물을 함유하는 멀티라멜라 리포좀을 사용하여 다음과 같은 공정과정을 거쳐 시제품 제조하였다. A상을 비커에 칭량하여 80도씨로 약 30분정도 가열하여 완전히 녹이고, 약 60도씨 까지 냉각하면 C상을 첨가하여 아지믹서로 재빨리 혼합하였다. 바로 용기에 담아서 그대로 상온에서 굳혔다 (표 3: 포도 과피 추출물과 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물 함유 멀티라멜라 리포좀의 밤 제형).

	원료명	함량(%)
A	해바라기씨오일	72.990	73.990	76.990
	Floraester70	4.000	9.000	7.000
	murumuru butter	4.000	3.000	4.000
	비즈왁스	6.000	9.000	7.000
	토코페롤	1.000	1.000	1.000
	수딩인퓨즈드오일	1.000	1.000	1.000
	티트리오일	2.000	2.000	2.000
	Manuka Oil	0.010	0.010	0.010
B	리포좀 원료 (실시예 1)	1.00	1.00	1.00
합계		100.00	100.00	100.00
합계		샘플1	샘플2	샘플3

사용감 테스트 결과 샘플 1은 경도가 무르고, 샘플 2는 경도가 너무 높아서 샘플 3의 경도가 적당하고 부드럽게 발렸다.

[실험예 6: 피부 장벽강화 평가 시험]

위의 시제품 중 크림 샘플 1의 제형으로 ‘드리마 모이스처 크림’으로 칭하였고, 제품을 사용하여 피부건조에 기인한 가려움 완화 및 피부 장벽강화 평가시험을 임상기관에서 실시하였다.

1) 연구 기간 : 2020. 05. 20 ~ 2020. 06. 19

2) 연구 방법 :

① 연구 대상: 24~53 세(평균 41.5±9.0)의 여성 지원자 22 명

② 측정 방법: 본 연구 목적에 적합한 연구대상자들을 대상으로 시험제품을 전박 부위에 4 주간 사용하도록 하였다. 평가는 제품 사용 전 및 4 주 사용 후에 피부 겉 수분량, 속수분량, 수분 분포도, 경피수분손실량 및 피부 결을 측정하였으며 피부 건조에 기인한 가려움과 그로 인한 수면 장애에 대한 VAS 평가를 하였다. 또한, 연구대상자들을 대상으로 제품의 효능 및 사용성 설문평가와 안전성 평가를 실시하였다.

3) 연구 결과 :

① 피부 겉 수분량 분석

제품 사용 전과 비교 시 4주 사용 후 전박 부위의 피부 겉 수분량이 31.76% 유의하게 증가하였다(p<0.05) (표 4: 제품 사용에 따른 피부 겉 수분량 측정 결과에 대한 통계 분석 (평균값이 증가(▲)할수록 피부 겉 수분량이 개선됨을 의미함) (n=22)).

② 피부 속 수분량 분석

제품 사용 전과 비교 시 4 주 사용 후 전박 부위의 피부 속 수분량이 9.73% 유의하게 증가하였다(p<0.05) (표 5: 제품 사용에 따른 피부 속 수분량 측정 결과에 대한 통계 분석 (평균값이 증가(▲)할수록 피부 속 수분량이 개선됨을 의미함) (n=22)).

③ 피부 수분 분포도 분석

제품 사용 전과 비교 시 4 주 사용 후 전박 부위의 피부 수분 분포도가 38.90% 유의하게 증가 하였다(p<0.05) (표 6: 제품 사용에 따른 수분 분포도 분석 결과에 대한 통계 분석 (평균값이 증가(▲)할수록 피부 수분 분포도가 개선됨을 의미함) (n=22)).

④ 경피수분손실량 분석

제품 사용 전과 비교 시 4 주 사용 후 전박 부위의 경피수분손실량이 22.49% 유의하게 감소하였다(p<0.05) (표 7: 제품 사용에 따른 경피수분손실량 측정 결과에 대한 통계 분석 (평균값이 증가(▲)할수록 경피수분손실량이 개선됨을 의미함) (n=22)).

⑤ 피부 결 분석

제품 사용 전과 비교 시 4 주 사용 후 전박 부위 피부 거칠기가 4.50% 유의하게 감소하였다(p<0.05) (표 8: 제품 사용에 따른 피부 결 분석 결과에 대한 통계 분석 (평균값이 증가(▲)할수록 피부 결이 개선됨을 의미함) (n=22)).

⑥ 피부 건조에 기인한 가려움과 그로 인한 수면장애에 대한 VAS 평가 분석

제품 사용 전과 비교 시 4 주 사용 후에 피부 건조로 인한 가려움 점수가 50.43%, 가려움으로 인한 수면장애 점수가 61.86% 유의하게 감소하였다(p<0.05) (표 9: 제품 사용에 따른 VAS 평가 결과에 대한 통계 분석 (점수가 낮아(▼)질수록 개선됨을 의미함) (n=22)).

⑦ 연구대상자에 의한 설문평가 분석

제품의 효능 및 사용성에 관한 설문평가 결과, ‘피부 촉촉해짐’, ‘피부 깊숙이 수분 차오름’, ‘피부 건조함 개선’, ‘피부 가려움증 개선’, ‘전반적인 피부 개선’ 및 ‘전체적인 만족도’ 항목에 대해 각각 100.00%, ‘피부 결 개선’, ‘흡수성 좋음’ 및 ‘발림성 좋음’ 항목에 대해 각각 95.45%의 연구대상자가 긍정적으로 답변하였다 (표 10: 제품의 효능 및 사용성에 관한 설문평가 결과 (n=22)).

⑧ 피부 안전성 평가

본 연구기간 동안 모든 연구대상자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다 (표 11: 피부 안전성(이상반응) 평가 결과 (n=22)).

4) 결론 :

위 결과를 근거로 크림 샘플 1의‘드리마 모이스처 크림’은 4 주 사용 후 피부 겉 수분량, 속 수분량, 수분 분포도, 피부 결 및 경피수분손실량이 개선되어 피부 건조에 기인한 가려움 완화 및 피부 장벽강화에 도움을 주는 것으로 판단되었다.

[실험예 7: 용매 분획에 의한 용매 분획물의 효능 평가]

1) 용매분획 추출 방법

상기에서 진공 저온 추출법에 의해 추출된 추출물 (포도 과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물) 분말을 용매분획하였다. 우선, 10배수의 증류수와 동량의 헥산을 상온에서 3시간 교반 추출한 후 증류수 층과 헥산층을 분리하였다. 회수된 증류수 분획물에 클로로포름을 동량 첨가하여 상온에서 3시간 교반 추출한 후 증류수층과 클로로포름 층을 분리하였다. 회수된 증류수층에 에틸아세테이트와 부탄올 순서로 동일하게 교반 추출하여 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물, 증류수 분획물을 분리하였다.

2) 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

포도 과피 분획물과 까마귀쪽나무열매 분획물의 폴리페놀과 플라보노이드의 함량을 측정하였다. 총 페놀 함량은 Velioglu 등의 방법에 따라 추출물 1 mL에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10% Na2CO3용액을 각 1 mL씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치한 후 spectrophotometer (UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Caffeic acid(Sigma Co., USA)를 0 ~ 100 ug/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였다.

총 플라보노이드는 Moreno 등의 방법에 따라 추출물 0.5 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL 및 1 M potassium acetate 0.1 mL, ethanol 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 정치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin(Sigma Co., USA)를 표준물질로 하여 0~100 ug/mL의 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

Grape Skin Fraction	Polyphenol content	Flavonoids content
Grape Skin Fraction	(mg GAE/g)	(mg QE/g)
70% ethanol fraction	331.6 ± 8.7	73.7 ± 5.48
n-hexane fraction	22.34 ± 17.3	5.13 ± 36.6
Chloroform fraction	79.43 ± 13.0	6.79 ± 11.9
Ethyl acetate fraction	247.93 ± 13.0	33.81 ± 14.7
Butanol fraction	125.86 ± 10.9	10.62 ± 1.4
Aqueous fraction	26.24 ± 11.7	1.68 ± 11.1

Litsea japonica Fraction	Polyphenol content	Flavonoids content
Litsea japonica Fraction	(mg GAE/g)	(mg QE/g)
70% ethanol fraction	404.01 ± 8.7	81.46 ± 5.48
n-hexane fraction	1.31 ± 8.7	3.47 ± 36.6
Chloroform fraction	4.41 ± 17.3	8.37 ± 11.9
Ethyl acetate fraction	293.77 ± 13.0	27.63 ± 14.7
Butanol fraction	62.86 ± 10.9	3.08 ± 1.4
Aqueous fraction	1.57 ± 11.7	0.43 ± 11.1

포도과피 분획물과 까마귀쪽나무열매 분획물의 폴리페놀 함량을 분석한 결과(표 12: 포도과피 용매 분획물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, 표 13: 까마귀쪽나무열매 용매 분획물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량), 에틸아세트분획물에서 각 247.93 mg GAE/g 과 293.77 mg GAE/g으로 가장 높은 함량을 보였다. 포도과피 분획물과 까마귀쪽나무열매 분획물의 플라보노이드 함량은 33.81 mg/g 과 27.63 mg/g으로 에틸아세트 분획물에서 가장 높은 결과를 확인하였다.

3) 추출물의 항산화 효능 측정

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical(DPPH)는 free radical에 대한 시료의 항산화 효능을 확인하기 위하여 사용한다. 전자공여능 측정은 공지의 방법을 이용하여 측정하였다. Ethanol에 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8 ㎖에 시료 0.2 ㎖을 첨가하여 vortex mixer로 5초간 진탕하고, 암소에서 10분 동안 방치 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음 식에 의하여 DPPH free radical 소거능을 나타내었다.

[수학식 2]

실험 결과는 도 14 및 도 15와 같이 나타났다. 포도 과피와 까마귀쪽나무열매 모두 에틸아세테이트 분획물에서 82.23%와 84.06%로 가장 높은 DPPH 소거능을 보였고 70% 에탄올 추출물에서도 70%이상의 DPPH 소거능을 확인하였다. 도 14는 포도과피 분획물의 항산화 효능 실험 결과이고, 도 15는 까마귀쪽나무열매 분획물의 항산화 효능 실험 결과이다.

Claims

포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물, 희첨 추출물이 수상층에 포집된 멀티라멜라 리포좀을 포함하되,
상기 포도과피 추출물, 까마귀쪽나무열매 추출물 및 희첨 추출물은, 각각 진공 저온 추출법에 의해 추출된 추출물인 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부염증 개선 또는 항균능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부보습력 증가를 통해 피부장벽강화능이 발휘되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
스핑고지질 함량이 증가를 통해 피부장벽강화능이 발휘되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.