KR20220015504A - 단백질-폴리머-약물 접합체 - Google Patents

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니틴 케이. 담레
알렉산드르 브이. 유르코베스키
마오 인
티모시 비. 로윙거
조슈아 디. 토마스
셰리 에이. 스티븐슨
베누 알. 구리잘라
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아사나 바이오사이언시스 엘엘씨
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Abstract

PBRM-폴리머-약물 접합체를 형성하기 위해 단백질 기반의 인식-분자(PBRM)와 접합하기에 유용한 폴리머성 스캐폴드가 본 명세서에 개시된다. 상기 스캐폴드는 하나 이상의 말단 말레이미도기를 포함하다. 또한, 상기 스캐폴드로부터 제조된 PBRM-폴리머-약물 접합체가 개시된다. 또한, 상기 접합체를 포함하는 조성물, 그의 제조 방법, 및 상기 접합체 또는 그의 조성물을 이용해 다양한 질병을 치료하는 방법이 개시된다.

Description

단백질-폴리머-약물 접합체{PROTEIN-POLYMER-DRUG CONJUGATES}
본 발명은 발명의 명칭이 '단백질-폴리머-약물 접합체(conjugate)'이고 2013년 10월 11일자로 출원된 미국 가출원 제61/890,065호 및 발명의 명칭이 '단백질-폴리머-약물 접합체'이고 2014년 4월 4일자로 출원된 제61/975,290호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용들은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전통적으로, 약들은 1차적으로 경구용(예컨대, 고체 알약 및 액체) 또는 주사용으로 조제된 소분자들로 이루어져 있다. 지난 30년에 걸쳐서, 제형(즉, 약물 운반의 경로 및/또는 속도를 조절하고 필요로 하는 위치에 치료제를 운반하도록 하는 조성물)은 점점 더 일반화 및 복잡화되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 새로운 치료법의 개발뿐만 아니라 이들을 투여하기 위한 메커니즘에 관한 많은 의문점 및 시도들이 미해결로 남아 있다. 예를 들면, 많은 약물들은 제한되거나 달리 감소된 효능 및 치료 효과를 나타내는데, 그 이유는 이들은 일반적으로 신체의 원하는 표적에 도달하기 전에 부분적으로 분해되거나, 표적 이외의 조직에 축적되거나, 이들 모두이기 때문이다.
따라서, 약물 운반 시스템 분야의 한 목표는 생리학적 또는 화학적 메커니즘 또는 이들 모두를 이용함으로써 약물을 안정화시키고 치료제의 생체내(in vivo) 전달을 조절할 수 있는 시스템을 통해 신체의 구체적인 표적 영역으로 약물을 온전하게 운반하는 것이다.
항체-약물 접합체는 표적-특이적 치료제로서 개발되었다. 다양한 암 세포-표면 항원에 대한 항체는 마이크로튜불(메이탄시노이드, 오리스타틴, 탁산: 미국 특허 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제6,333,410호; 제6,441,163호; 제6,340,701호; 제6,372,738호; 제6,436,931호; 제6,596,757호; 및 제7,276,497호); DNA(칼리키아마이신, 독소루비신, CC-1065 유사체(analog); 미국 특허 제5,475,092호; 제5,585,499호; 제5,846,545호; 제6,534,660호; 제6,756,397호; 및 제6,630,579호)와 같은 다양한 필수적 세포 표적을 억제하는 상이한 세포독성제와 접합되었다. 이들 세포독성 약물 중 일부와의 항체 접합체는 암 치료를 위한 임상에서 활발히 연구되고 있다(Ricart, A.D., and Tolcher, A.W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-255; Krop et al., 2010, J. Clin. Oncol., 28, 2698-2704). 그러나, 현존하는 항체-약물 접합체는 몇 가지 한계를 나타내었다. 주된 한계는 제한된 수의 표적 항원과 메토트렉세이트, 다우노루비신, 메이탄시노이드, 탁산 및 빈크리스틴과 같은 항암 약물의 상대적으로 보통인 세포독성으로 인해 충분한 농도의 약물을 표적 위치에 운반할 수 없다는 것이다. 현저한 세포독성을 달성하기 위한 한 접근법은 다수의 약물 분자를 직접 또는 간접적으로 항체와 결합시키는 것이다. 그러나, 이러한 무겁게 변형된 항체는 종종 표적 항원에 대한 손상된 결합과 혈류로부터의 빠른 생체내 제거(clearance)를 나타낸다. 따라서, 약물에 대한 최대의 세포독성을 달성하기 위하여 충분한 농도의 약물을 표적으로 운반하는 능력을 향상시킬 필요가 있다.
본 발명은 생체분해성이고, 생체호환성이며, 높은 약물 부하뿐만 아니라 표적 항원에 대한 강한 결합을 보여주는 단백질-폴리머-약물 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질-폴리머-약물 접합체를 형성하기 위하여 단백질 기반의 인식-분자(protein based recognition-molecule, PBRM)와 접합하기에 유용한 폴리머성 스캐폴드(scaffold)에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 단백질 기반의 인식-분자(PBRM)와 접합하기에 유용한 식 (Id)의 폴리머성 스캐폴드에 관한 것이다:
Figure pat00001
상기에서, 상기 스캐폴드는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하고;
각각의 D의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이며, D 및 카르보닐기 사이의
Figure pat00002
는 상기 카르보닐기에 대한 D의 직접 또는 간접 부착을 나타내고,
X는 CH2, O 또는 NH이고,
m은 1 내지 약 300개의 정수이고,
m1은 1 내지 약 140의 정수이고,
m7은 1 내지 약 40의 정수이고,
m3은 1 내지 약 18의 정수이고, 및
m, m1, m3 및 m7의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이다.
상기 식 (Id)의 스캐폴드는 하나 이상의 다음의 특성들을 포함할 수 있다:
식 (Id)에서 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m7은 1 내지 약 20의 정수이고, m3은 1 내지 약 10의 정수이며, m1은 1 내지 약 70의 정수이고, m, m1, m3 및 m7의 합은 약 15 내지 약 150의 범위이다.
식 (Id)에서 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m7은 2 내지 약 15의 정수이고, m3은 1 내지 약 8의 정수이며, m1은 2 내지 약 50의 정수이고, m, m1, m3 및 m7의 합은 약 20 내지 약 110의 범위이다.
식 (Id)에서 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m7은 약 3 내지 약 10의 정수이고, m3은 1 내지 약 5의 정수이며, m1은 약 5 내지 약 35의 정수이고, m, m1, m3 및 m7의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이다.
식 (Id)의 "m3" 단위에서 상기 말레이미도 모이어티(moiety)의 각각의 존재는 상기 PBRM의 작용기와 공유 결합을 형성하기 위한 것이다.
한 구현예에서, m1 및 m7의 합은 2 내지 약 180의 정수이다.
상기 식 (Id)의 스캐폴드는 상기 D-함유 스캐폴드의 하나 이상의 말레이미도기를 통해 상기 D-함유 스케폴드에 접합된 PBRM을 추가로 포함하여 단백질-폴리머-약물 접합체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 상기 식 (Id)의 스캐폴드는 상기 스캐폴드의 2 이상(예컨대, 5 까지)의 말레이미도기를 통해 상기 D-함유 스캐폴드에 접합된 하나의 PBRM을 추가로 포함한다. 예를 들면, 하나의 PBRM은 식 (Id)의 하나 이상의 D-함유 폴리머성 스캐폴드에 연결된다.
어떤 구현예에서, PBRM에 접합될 때 상기 폴리머 약물 접합체(Id)는 식 (Ie)를 갖는다:
Figure pat00003
상기에서, Xa 및 Xb 중 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이거나, Xa 및 Xb는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
m3a는 0 내지 약 17의 정수이고, m3b는 1 내지 약 8의 정수이며, m3a 및 m3b의 합은 m3이고,
m, m1, m7, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이고, 및
m5는 1 내지 약 10의 정수이다.
상기 식 (Id)의 단백질-폴리머-약물 접합체에서, 각각의 D는 동일하거나 상이한 모이어티일 수 있고, 각각의 PBRM은 동일하거나 상이한 모이어티일 수 있다.
한 구현예에서, 상기 D 및 PBRM 사이의 비는 약 30:1 , 29:1 , 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 또는 6:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 D 및 PBRM 사이의 비는 약 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 또는 10:1이다.
다른 구현예에서, 상기 D 및 PBRM 사이의 비는 약 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 또는 12:1이다.
어떤 구현예에서, 상기 PHF 및 PBRM 사이의 비는 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
일부 구현예에서, 상기 PHF 및 PBRM 사이의 비는 약 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
다른 구현예에서, 상기 PHF 및 PBRM 사이의 비는 약 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
한 구현예에서, D는 (a)는 오리스타틴 화합물; (b) 칼리키아마이신 화합물; (c) 두오카르마이신 화합물; (d) 토포아이소머라아제 억제제; (e) 피롤로벤조디아제핀 화합물; (f) 빈카 화합물; (g) 단백질 합성 억제제; (h) RNA 중합효소 억제제; (i) 튜불린 결합 화합물; 또는 이들의 유사체이다.
어떤 구현예에서, D는 (a) 오리스타틴 화합물; (b) 칼리키아마이신 화합물; (c) 두오카르마이신 화합물; (d) 캄프토테신 화합물; (e) 피롤로벤조디아제핀 화합물; (f) 빈카 화합물; 또는 이들의 유사체이다.
한 구현예에서, 상기 오리스타틴 화합물은 오리스타틴, 돌라스타틴, 모노메틸오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸오리스타틴 F(MMAF), 오리스타틴 F 히드록시프로필 아미드(AF HPA), 또는 오리스타틴 F 페닐렌디아민(AFP)이다.
한 구현예에서, 상기 두오카르마이신 또는 그의 유사체는 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 B1, 두오카르마이신 B2, 두오카르마이신 C1, 두오카르마이신 C2, 두오카르마이신 D, 두오카르마이신 SA, CC-1065, 아도젤레신, 비젤레신 또는 카르젤레신이다.
한 구현예에서, 캄프토테신 화합물은 캄프토테신, CPT-11(이리노테칸), SN-38 또는 토포테칸이다.
한 구현예에서, 상기 피롤로벤조디아제핀 화합물은 피롤로벤조디아제핀 모노머, 대칭적 피롤로벤조디아제핀 다이머 또는 비대칭적 피롤로벤조디아제핀 다이머이다.
한 구현예에서, D는 AF HPA이고, 상기 AF HPA 및 PBRM 사이의 비는 약 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 또는 6:1일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 AF HPA 및 PBRM 사이의 비는 약 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 또는 10:1일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 AF HPA 및 PBRM 사이의 비는 약 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 또는 12:1일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 단백질 기반의 인식-분자(PBRM)와 접합하기에 유용한 식 (Ia)의 폴리머성 스캐폴드에 관한 것이다:
Figure pat00004
상기에서, 상기 스캐폴드는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하고;
X는 CH2, O 또는 NH이고;
m은 1 내지 약 300의 정수이고,
m1은 1 내지 약 140의 정수이고,
m2는 1 내지 약 40의 정수이고,
m3은 1 내지 약 18의 정수이고, 및
m, m1, m2 및 m3의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이다.
상기 식 (Ia)의 스캐폴드는 하나 이상의 다음의 특성들을 포함할 수 있다:
식 (Ia)에서 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m2는 1 내지 약 20의 정수이고, m3은 1 내지 약 10의 정수이며, m1은 1 내지 약 70의 정수이고, m, m1, m2 및 m3의 합은 약 15 내지 약 150의 범위이다.
식 (Ia)에서 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m2는 2 내지 약 15의 정수이고, m3은 1 내지 약 8의 정수이며, m1은 2 내지 약 50의 정수이고, m, m1, m2 및 m3의 합은 약 20 내지 약 110의 범위이다.
식 (Ia)에서 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m2는 약 3 내지 약 10의 정수이고, m3은 1 내지 약 5의 정수이며, m1은 약 5 내지 약 35의 정수이고, m, m1, m2 및 m3의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이다.
식 (Ia)의 "m3" 단위에서 상기 말레이미도 모이어티의 각각의 존재는 상기 PBRM의 작용기와 공유 결합을 형성하기 위한 것이다.
한 구현예에서, 상기 식 (Ia)의 스캐폴드는 식 (A) 또는 (A1)을 갖는다:
Figure pat00005
Figure pat00006
상기에서, 상기 PHF는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 갖고;
m은 1 내지 약 75의 정수이고,
m1은 약 5 내지 약 35의 정수이고,
m2는 약 3 내지 약 10의 정수이고,
m3은 1 내지 약 5의 정수이며, 및
m, m1, m2 및 m3의 합은 40 내지 약 75의 범위이다.
예를 들면, 식 (A) 또는 (A1)의 "m3" 단위에서 상기 말레이미도 모이어티의 각각의 존재는 상기 PBRM의 작용기와 공유 결합을 형성하기 위한 것이다.
상기 식 (Ia)의 스캐폴드는 상기 폴리머 스캐폴드의 하나 이상의 말레이미도기를 통해 상기 스캐폴드에 접합된 PBRM을 추가로 포함한다. 예를 들면, 상기 식 (Ia)의 스캐폴드는 상기 스캐폴드의 2 이상의 말레이미도기(예컨대, 5 까지)를 통해 상기 스캐폴드에 접합된 하나의 PBRM을 추가로 포함한다.
상기 PBRM은 약 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상; 180 kDa 이상; 또는 200 kDa 이상, 또는 약 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa 또는 100-140 kDa)의 분자량을 갖는다.
상기 PBRM은 약 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상; 180 kDa 이상; 또는 200 kDa 이상, or about 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa 또는 0-140 kDa)의 분자량을 갖고, 설프히드릴(즉, -SH 또는 티올) 기를 갖는다.
상기 PBRM은 약물-운반 폴리머성 접합체의 말레이미도기에 결합된 상기 PBRM의 설프히드릴기를 통해 상기 약물-운반 폴리머성 접합체에 접합되며, 예컨대 본 명세서에 개시된 임의의 화학식, 예를 들면 식 (Ib), (B), (B1) 또는 (Ie)의 괄호 안의 "m3b" 단위 내의 황 원자(-S-)를 참조. 구현예에서, 상기 황 원자는 상기 PBRM의 일부이고, 상기 PBRM 내의 설프히드릴(티올) 기로부터 유래되며, 말레이미도기와 반응하여 상기 약물-운반 폴리머성 접합체에 대한 부착(설파이드 결합)을 형성한다.
하나의 PBRM은 식 (Ia)의 하나 이상의 약물-운반 폴리머성 스캐폴드에 결합된다.
상기 PBRM을 포함하는 스캐폴드는 식 (Ib)를 갖는다:
Figure pat00007
상기에서, Xa 및 Xb 중 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이거나, Xa 및 Xb는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
m3a는 0 내지 약 17의 정수이고, m3b는 1 내지 약 8의 정수이며, 상기 m3a 및 m3b의 합은 m3(예컨대, 1 내지 약 18의 정수)이고,
m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이고, 및
m5는 1 내지 약 10의 정수이다.
상기 식 (Ib)의 스캐폴드는 하나 이상의 다음의 특성들을 포함할 수 있다:
상기 PBRM은 약 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상; 180 kDa 이상; 또는 200 kDa 이상, 또는 약 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa 또는 100-140 kDa)의 분자량을 갖는다.
상기 PBRM은 설프히드릴(즉, -SH 또는 티올) 기를 갖는다.
상기 PHF 및 PBRM 사이에 형성된 공유 결합(예컨대, 설파이드 결합)의 총 수(또는 부착점의 총 수)는 10 이하이다.
식 (Ib)에서 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 150의 범위이고, m1은 1 내지 약 70의 정수이며, m2는 1 내지 약 20의 정수이고, m3a는 0 내지 약 9의 정수이며, m3b는 1 내지 약 8의 정수이고, m5는 2 내지 약 8의 정수이다.
식 (Ib)에서 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 20 내지 약 110의 범위이고, m1은 2 내지 약 50의 정수이며, m2는 2 내지 약 15의 정수이고, m3a는 0 내지 약 7의 정수이며, m3b는 1 내지 약 8의 정수이고, m5는 2 내지 약 4의 정수이다.
식 (Ib)에서 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이고, m1은 약 5 내지 약 35의 정수이며, m2는 약 3 내지 약 10의 정수이고, m3a는 0 내지 약 4의 정수이며, m3b는 1 내지 약 5의 정수이고, m5는 2 내지 약 4의 정수이다.
어떤 구현예에서, 상기 오리스타틴 F 히드록실프로필 아미드("AF HPA") 및 PBRM 사이의 비는 약 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 또는 6:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 AF HPA 및 PBRM 사이의 비는 약 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 또는 10:1일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 AF HPA 및 PBRM 사이의 비는 약 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 또는 12:1일 수 있다.
어떤 구현예에서, 상기 PHF 및 PBRM 사이의 비는 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 PHF 및 PBRM 사이의 비는 약 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 PHF 및 PBRM 사이의 비는 약 4:1, 3:1 또는 2:1일 수 있다.
상기 말레이미도 차단 모이어티(예컨대, Xa 또는 Xb)는 말레이미도기와 식 (II)의 티올-함유 화합물의 반응시에 2개의 올레핀 탄소 원자 중 하나에 공유적으로 부착될 수 있는 모이어티이다:
Figure pat00008
상기에서, R90은 NHR91, OH, COOR93, CH(NHR91)COOR93 또는 치환된 페닐기이고;
R93은 수소 또는 C1-4의 알킬이고;
R91은 수소, CH3 또는 CH3CO이고; 및
d는 1 내지 3의 정수이다.
한 구현예에서, 상기 식 (II)의 말레이미도 차단 화합물은 시스테인, N-아세틸 시스테인, 시스테인 메틸 에스테르, N-메틸 시스테인, 2-머캅토에탄올, 3-머캅토프로판산, 2-머캅토아세트산, 머캅토메탄올(즉, HOCH2SH), 페닐이 하나 이상의 친수성 치환체로 치환된 벤질 티올, 또는 3-아미노프로판-1-티올일 수 있다. 상기 페닐 상의 하나 이상의 친수성 치환체는 OH, SH, 메톡시, 에톡시, COOH, CHO, COC1-4 알킬, NH2, F, 시아노, SO3H, PO3H 등을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 말레이미도 차단기는 -S-(CH2)d-R90이고, 이때
R90은 OH, COOH 또는 CH(NHR91)COOR93이고;
R93은 수소 또는 CH3이고;
R91은 수소 또는 CH3CO이고; 및
d는 1 또는 2이다.
다른 구현예에서, 상기 말레이미도 차단기는 -S-CH2-CH(NH2)COOH이다.
일부 구현예에서, 상기 말레이미도 차단기는 수용성이다.
상기 식 (Ib)의 스캐폴드는 식 (B) 또는 (B1)을 갖는다:
Figure pat00009
Figure pat00010
상기에서, 상기 PHF는 5 kDa 내지 10 kDa 범위의 분자량을 갖고;
m은 1 내지 75의 정수이고,
m1은 약 5 내지 약 35의 정수이고,
m2는 약 3 내지 약 10의 정수이고,
m3a는 0 내지 약 4의 정수이고,
m3b는 1 내지 약 5의 정수이고,
m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이고, 및
m5는 2 내지 약 4의 정수이다.
어떤 구현예에서, 식 (B) 또는 (B1)에서, 부착점의 총 수는 10 이하이다.
본 발명은 또한 식 (Ic)의 폴리머성 스캐폴드를 제공한다:
Figure pat00011
상기에서, 상기 스캐폴드는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 PHF를 포함하고;
X는 CH2, O 또는 NH이고;
m은 1 내지 약 300의 정수이고,
m6은 2 내지 약 180의 정수이고,
m3은 1 내지 약 18의 정수이고, 및
m, m6 및 m3의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이다.
상기 식 (Ic)의 스캐폴드는 하나 이상의 다음의 특성들을 포함할 수 있다:
식 (Ic)에서 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m6 및 m3의 합은 약 15 내지 약 150의 범위이고, m6은 2 내지 약 90의 정수이며, m3은 1 내지 약 10의 정수이다.
식 (Ic)에서 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m6 및 m3의 합은 약 20 내지 약 110의 범위이고, m6은 약 4 내지 약 65의 정수이며, m3은 1 내지 약 8의 정수이다.
식 (Ic)에서 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m6 및 m3의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이고, m6은 약 8 내지 약 45의 정수이며, m3은 1 내지 약 5의 정수이다.
식 (Ic)의 "m3" 단위에서 상기 말레이미도 모이어티의 각각의 존재는 상기 PBRM의 작용기와 공유 결합을 형성하기 위한 것이다.
상기 식 (Ic)의 스캐폴드는 식 (C) 또는 (C1)을 갖는다:
Figure pat00012
Figure pat00013
상기에서, 상기 PHF는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 갖고;
m은 1 내지 약 75의 정수이고,
m6은 약 8 내지 약 45의 정수이고,
m3은 1 내지 약 5의 정수이고, 및
m, m6 및 m3의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이다.
식 (C) 또는 (C1)의 "m3" 단위에서 상기 말레이미도 모이어티의 각각의 존재는 상기 PBRM의 작용기와 공유 결합을 형성하기 위한 것이다.
상기 식 (Ic)의 스캐폴드는 상기 PHF에 결합된 하나 이상의 약물 분자("D")를 추가로 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 상기 식 (Ic)의 D-함유 스캐폴드는 식 (Id)를 갖는다.
식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (A), (A1), (B), (B1), (C), (C1) 또는 (E)와 같은 본 명세서에 개시된 식들에서, 폴리아세탈 단위들 사이의 비결합 또는 갭은 상기 단위가 임의의 순서로 각각에 결합될 수 있음을 나타낸다. 또한, 본 명세서에 개시된 어떤 식들(예컨대, 표 D에 개시된 것들)에서, 괄호친 구조, 즉 폴리아세탈 모노머 단위는 설명을 간략화하기 위한 목적으로 반복 단위의 수(예컨대, m1, m2, m3 등)를 수반하지 않지만, 각각 하나의 반복 단위만을 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.
PBRM의 예는 IgG 및 IgM과 같은 전장(full length) 항체, Fab, scFv, scFvFc, 카멜리드(camelid), Fab2 등과 같은 항체 절편, 작은 단백질 및 펩티드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 PBRM은 전장 항체 또는 인간화 항-5T4 scFvFc 항체이다. 예를 들면, 상기 PBRM은 인간 암태아(oncofetal) 단백질 5T4를 표적화하는 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포함하는 리간드(LG)이다.
추가 구현예에서, 항-신생물 치료에 유용한 치료 약물 및 표적화 접합체가 제공된다. 상기 치료 약물 및 표적화 접합체는 다음을 포함한다:
(a) 인간 암태아 단백질 5T4를 표적화하는 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포함하는 리간드(LG)로서, 상기 리간드(예컨대, 일부 구현예에서 약 40 kDa 이상의 분자량을 가짐)는 (b)의 폴리머성 스캐폴드의 m5에 결합되고, 상기 m5는 1 내지 약 10인 리간드; 및
(b) 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하는 폴리머성 스캐폴드로서, 다음과 같이 정의된 무작위로 배열된 모노머성 단위 m, m1, m2, m3a 및 m3b를 포함하는 폴리머성 스캐폴드:
(ⅰ) m3a:
Figure pat00014
상기에서, m3a는 없거나, 1 내지 약 17의 모노머성 m3a 단위가 상기 폴리머 스캐폴드에 존재하고, 각각의 단위에서, Xa 및 Xb는 독립적으로 (A) 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이거나, 또는 (B) Xa 및 Xb는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하는 것으로부터 선택되며;
(ⅱ) m3b:
Figure pat00015
상기에서, 상기 설파이드 결합(-S-)은 LG에 부착하는 점을 형성하고, 1 내지 약 8의 모노머 m3b 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하며, m3a 및 m3b의 합은 1 내지 18이고, 상기 황 원자는 상기 리간드(LG)의 일부이며;
(ⅲ) m:
Figure pat00016
상기에서, 1 내지 약 300의 모노머 m 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하고;
(ⅳ) m1:
Figure pat00017
상기에서, 1 내지 약 140의 모노머성 m1 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하고; 및
(ⅴ) m2:
Figure pat00018
상기에서, 1 내지 약 40의 모노머성 m2 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하고;
상기 각각의 모노머성 단위 m, m1, m2, m3a 및 m3b에서, X는 CH2, O 또는 NH이고, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이며, 각각의 D의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이고, D 및 카르보닐기 사이의
Figure pat00019
는 상기 카르보닐기에 대한 D의 직접 또는 간접 부착을 나타낸다.
한 구현예에서, 상기 치료 약물 및 표적화 접합체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pat00020
상기에서, 상기 PHF는 5 kDa 내지 10 kDa 범위의 분자량을 갖고; m은 1 내지 75이며, m1은 약 5 내지 약 35이고, m2는 약 3 내지 약 10이며, m3a는 0 내지 약 4이고, m3b는 1 내지 약 5이며, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75이고, m5는 2 내지 약 4이다.
추가 구현예에서, 항-신생물 치료에 유용한 치료용 항-5T4 약물 표적화 접합체가 제공된다. 상기 접합체는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하는 폴리머성 스캐폴드를 포함하며, 상기 접합체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pat00021
상기에서, m5는 1 내지 10이고; m은 1 내지 약 300의 정수이며; m1은 1 내지 약 140의 정수이고; m2는 1 내지 약 40의 정수이며; m3a는 0 내지 약 17의 정수이고; m3b는 1 내지 약 8의 정수이며; m3a 및 m3b의 합은 1 내지 약 18의 정수이고; 및 m, m1, m2 및 m3의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이며; X는 NH이고; Xa 또는 Xb 중 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이며; 및 각각의 D의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이고, D 및 카르보닐기 사이의
Figure pat00022
는 상기 카르보닐기에 대한 D의 직접 또는 간접 부착을 나타내며; 상기 ANTI-5T4는 인간 암태아 항원 5T4에 선택적인 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포함하는 항-5T4 리간드이다. 예를 들면, 상기 항-5T4의 분자량은 적어도 약 40 kDa이다.
다른 추가 구현예에서, 항-신생물 치료에 유용한 치료 약물 및 표적화 접합체가 제공되며, 항-5T4 및 서로 무작위로 결합될 수 있는 아래에 나타낸 단위를 포함하는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF) 폴리머성 스캐폴드를 포함한다:
Figure pat00023
상기에서, ANTI-5T4는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체 구조체(construct)이고; 상기 PHF는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 가지며; 평균 폴리머성 스캐폴드 대 항-5T4 항체의 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이고, 상기 AF HPA 대 항-5T4 항체의 비는 약 12:1 내지 약 18:1이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리머성 스캐폴드는 무작위로 배열된 모노머성 단위 m, m1, m2, m3a 및 m3b를 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리머성 스캐폴드는 무작위로 배열된 모노머성 단위 m, m1, m2 및 m3b를 함유한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리머성 스캐폴드는 무작위로 배열된 모노머성 단위 m, m1, m7, m3a 및 m3b를 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리머성 스캐폴드는 무작위로 배열된 모노머성 단위 m, m1, m7 및 m3b를 함유한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 접합체를 포함하는 조성물, 그의 제조 방법 및 이를 암을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 질병의 치료에 이용하는 방법을 제공한다. 표적 암은 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 입의 암, 중피종, 피부암, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 결장암, 췌장암, 신장암 또는 위암일 수 있다.
추가로, 본 발명은 본 명세서에 개시된 폴리머성 스캐폴드 또는 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 질병을 갖는 것으로 의심되는 개체에서 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 명세서에 개시된 유효량의 접합체를 상기 질병을 갖는 것으로 의심되는 개체에 투여하거나, 상기 개체가 표적 항원 또는 수용체를 발현하는지 여부를 결정하기 위하여 상기 개체 유래의 샘플에서 표적 항원/수용체를 검출하기 위한 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서, 단수 형태는 또한 해당 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서에 개시된 것들과 유사하거나 동등한 방법들 및 물질들이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법들 및 물질들이 이하에 개시된다. 본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 인용에 의해 포함된다. 본 명세서에 인용된 참고문헌들은 청구항의 발명에 대한 종래 기술로서 인정되지 않는다. 분쟁의 경우에 있어서, 정의들을 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다. 또한, 상기 물질들, 방법들 및 예들은 설명만을 위한 것이며, 제한하기 위한 의도는 아니다.
본 발명의 이점들 중 하나는 본 발명에 개시된 단백질-폴리머-약물 접합체 또는 폴리머성 스캐폴드가 운반되는 약물의 생체이용성을 대폭 향상시키거나, 및/또는 상기 폴리머성 담체에 부착된 단백질의 생체이용성을 증가시킨다는 것이다. 본 발명의 다른 이점은 본 명세서에 개시된 단백질-폴리머-약물 접합체의 효능이 증가하거나, 적어도 상기 접합체의 약물 부하에서의 증가와 실질적으로 동일하게 유지된다는 것이다. 본 발명의 또 다른 이점은 상기 단백질의 시스테인 모이어티에 대한 티올 접합을 통해 상기 단백질-폴리머 접합체가 실질적으로 향상된 안정성을 나타낸다는 것이다. 본 발명의 다른 특성들 및 이점들은 다음의 상세한 설명 및 청구항들로부터 명확할 것이다.
도 1은 1일에 단일 용량(dose)으로 비히클(vehicle); 10 ㎎/㎏의 PBRM(trastuzumab); 2.5 ㎎/㎏ 및 5 ㎎/㎏의 실시예 4 또는 실시예 13에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 투여한 후 BT474 종양(각 군당 n=10)으로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 2는 1일에 단일 용량으로 비히클; 10 ㎎/㎏의 PBRM(trastuzumab); 2.5 ㎎/㎏의 실시예 4 또는 실시예 7에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 투여한 후 JIMT-1 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 3은 1일에 단일 용량으로 비히클; 20 ㎎/㎏의 PBRM(lintuzumab); 또는 20 ㎎/㎏의 실시예 8에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 투여한 후 HL-60 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 4는 1일에 단일 용량으로 비히클; 20 ㎎/㎏의 PBRM(trastuzumab); 20 ㎎/㎏의 Kadcyla®; 또는 2 ㎎/㎏, 0.67 ㎎/㎏ 또는 0.3 ㎎/㎏의 실시예 14에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 투여한 후 HL-60 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 5는 1일에 단일 용량으로 비히클, 또는 3 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 0.3 ㎎/㎏의 실시예 15에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 투여한 후 NCI-N87 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 6은 1일에 단일 용량으로 비히클, 0.67 ㎎/㎏의 실시예 14 또는 3 ㎎/㎏의 실시예 16에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 투여한 후 NCI-N87 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 7은 1일에 단일 용량으로 비히클, 0.67 ㎎/㎏의 실시예 33, 1 ㎎/㎏의 실시예 43A 또는 0.67 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏의 실시예 43C에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 투여한 후 NCI-N87 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 8은 1일에 단일 용량으로 비히클, 0.22 ㎎/㎏의 실시예 5A에 개시된 폴리머-약물 접합체; 또는 각각 2 ㎎/㎏의 실시예 30B 또는 실시예 30C; 0.67 ㎎/㎏의 실시예 40, 또는 1 ㎎/㎏의 실시예 43B; 또는 10 ㎎/㎏의 실시예 38; 또는 10 ㎎/㎏의 실시예 39에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 각각 3주 동안 매주 1회 IV 투여한 후 NCI-N87 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 9는 1일에 단일 용량으로 비히클, 1 ㎎/㎏의 실시예 40 및 2 ㎎/㎏의 실시예 43C를 IV 투여한 후 JIMT-1 세포(각 군당 n=10)로 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응을 보여준다.
도 10은 3 마리 마우스/시점으로 5 ㎎/㎏의 실시예 4에 개시된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 IV 볼루스(bolus) 투여한 후 BT474 종양으로 피하 접종된 마우스에서 접합된 AF HPA(총), 비접합된 AF HPA 및 AF("자유 AF-HPA"로 나타냄) 및 트라스투즈맙에 대한 혈장 PK를 보여준다.
도 11은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 인간 5T4 세포외 도메인에 대한 5T4-특이적 scADC의 친화도 및 동역학을 도시한다. 결합 친화도(30 pM 미만의 KD)는 비-접합 항-5T4 scFvFc의 경우와 유사하다.
도 12는 A431 종양 이종이식편(xenograft) 모델에서 측정될 때 5T4-특이적 scADC의 항-종양 효능을 도시한다. 종양 부피는 특정된 날에 결정되었다. 값들은 평균±SEM으로 표현된다. 통계적 분석은 2원(two-way) ANOVA와, 후속하는 그래프 패드 프리즘(Version.5)을 이용한 본페로니 포스트 테스트에 의해 수행되었다.
도 13은 MDA-MB-231 5T4를 과발현하는 감염체인 종양 이종이식편을 갖는 누드 마우스에서 5T4-특이적 scADC의 항종양 효능을 도시한다. 값들은 평균±SEM으로 표현된다. 통계적 분석은 2원 ANOVA와, 후속하는 그래프 패드 프리즘(Version.5)을 이용한 본페로니 포스트 테스트에 의해 수행되었다.
본 발명은 신규한 단백질-폴리머-접합체, 상기 접합체 제조용 폴리머성 스캐폴드, 상기 접합체 또는 폴리머성 스캐폴드 제조용 합성 방법, 이들을 함유하는 약학적 조성물 및 상기 접합체의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 신규한 폴리머-약물 접합체, 상기 접합체의 합성 방법, 이들을 함유하는 약학적 조성물 및 상기 접합체의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 신규한 약물 유도체, 상기 유도체 제조용 합성 방법, 이들을 함유하는 약학적 조성물 및 상기 약물 유도체의 다양한 용도를 제공한다.
정의/용어
또한, 본 발명의 어떤 화합물 및 구체적 작용기의 정의가 본 명세서에 보다 상세히 개시된다. 본 발명의 목적을 위하여, 화학적 원소들은 원소들의 주기율표(CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed., 커버 내)에 따라 확인되고, 구체적인 작용기는 일반적으로 그 안에 개시되어 있는 것과 같이 정의된다. 추가적으로, 유기 화학의 일반 원리뿐만 아니라 구체적인 작용 모이어티 및 반응성은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 "유기 화학"(Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999)에 개시되어 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 것과 같은 합성 방법이 다양한 보호기를 이용하고 있음은 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다.
다음의 상세한 설명 및 청구항 모두에서 관사 "한", "하나" 및 "상기"가 사용되면, 본 명세서에서 달리 표시하거나 문맥에 의해 명확하게 반박되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. "포함하는(comprising)", "갖는", "화학식인"에서와 같은 "∼인", "포함하는(including)" 및 "함유하는"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 열린 용어(open term)로서 이해되어야 한다. 예를 들면, 어떤 식의 폴리머성 스캐폴드는 상기 식에 나타낸 모든 모노머 단위를 포함하고, 또한 상기 식에 나타내지 않은 추가적인 모노머 단위도 포함할 수 있다. 추가적으로, 구현예에서 "포함하는" 또는 다른 열린-말단(open-ended) 용어가 사용되면, 동일한 구현예는 중간형 용어인 "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)" 또는 닫힌 용어(closed term)인 "이루어지는"을 이용해 보다 좁은 범위로 청구될 수 있음이 이해되어야 한다.
"약", "대략적인" 또는 "대략"이란 용어는 수치값과 관련되어 사용될 때 값들의 수집 또는 범위가 포함되는 것임을 의미한다. 예를 들면, "약 X"는 X의 ±20%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, ±0.5%, ±0.2% 또는 ±0.1%인 값의 범위를 포함하며, 이때 X는 수치값이다. 한 구현예에서, "약"이란 용어는 해당 값보다 5% 많거나 적은 값의 범위를 나타낸다. 다른 구현예에서, "약"이란 용어는 해당 값보다 2% 많거나 적은 값의 범위를 나타낸다. 다른 구현예에서, "약"이란 용어는 해당 값보다 1% 많거나 적은 값의 범위를 나타낸다.
값의 범위를 인용하는 것은 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한 단순히 각각의 별개의 값이 상기 범위 내에 속함을 개별적으로 참조하는 간편법(shorthand method)으로 나타내기 위한 의도이며, 각각의 별개의 값은 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서 내에 포함된다. 본 명세서에서 사용된 범위는 달리 특정하지 않는 한 상기 범위의 양 말단을 포함한다. 예를 들면, "x는 1 및 6 사이의 정수임" 및 "x는 1 내지 6의 정수임"이란 표현은 모두 "x는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6임"을 의미하며, 즉 "X 및 Y 사이" 및 "X 내지 Y의 범위"라는 용어는 X 및 Y 및 그 사이의 정수들을 포함한다.
본 명세서에 개시된 모든 방법들은 본 명세서에 달리 표시하거나 문맥에 의해 명확하게 반박되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 임의의 및 모든 예들 또는 예시적인 표현(예컨대, "∼와 같은")를 사용하는 것은 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 의도이며, 달리 명확하게 나타내지 않는 한 청구항의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 명세서 내의 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 청구된 것에 필수적임을 나타내는 것으로 이해되어서는 안된다.
"항체"는 전장 항체 또는 면역글로불린을 포함하는 항체의 기능성 절편을 나타낸다. "기능성 절편"은 면역글로불린 또는 항체의 충분한 부분이 제공되어서 상기 모이어티가 그 표적 세포 군집(population)에 대하여 세포 표면 분자, 예컨대 인간 암태아 항원과 효과적으로 결합하거나 복합체를 형성함을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 인간 암태아 항원은, 예컨대 알파 페토단백질, 암배아성 항원, 전립선 특이적 항원 및 암태아 항원 단백질(미성숙 라미닌 수용체 단백질로도 알려져 있으며, 예컨대 장 및 신장 암종과 연관됨)과 같은 종양 연관 단백질을 포함한다.
면역글로불린은 본 기술분야의 기술자에게 알려진 기술들을 이용하여 정제되거나, 재조합적으로 생성되거나, 합성적으로 생성되거나, 또는 이들이 조합될 수 있다. IgG 항체 내이거나 이로부터 유래된 면역글루불린은 본 발명에서 사용하기에 특히 적절하지만, IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE와 같은 임의의 클래스 또는 서브클래스 유래의 면역글로불린이 선택될 수 있다. 적합하게는, 상기 면역글로불린은 항원 상의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 IgG 서브클래스(IgG1, 2, 3 및 4)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 IgG의 클래스 또는 IgM의 클래스이다. 항체는 자연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있으며, 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는, 예를 들면, 폴리클론(polyclonal) 항체, 모노클론(monoclonal) 항체, 카멜화(camelized) 단일 도메인 항체, 세포내 항체("인트라바디(intrabody)"), 재조합 항체, 항-이디오타입 항체, 도메인 항체, 선형 항체, 다중특이성(multispecific) 항체, Fv, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fab', Fab'-SH, F(ab')2와 같은 항체 절편, 단일 사슬 가변 절편 항체(scFv), 탠덤(tandem)/비스(bis)-scFv, Fc, pFc', scFvFc(또는 scFv-Fc), 디설파이드(disulfide) Fv(dsFv), BiTe 항체와 같은 양특이성(bispecific) 항체(bc-scFv), 카멜리드 항체, 재표면화(resurfaced) 항체, 인간화 항체, 완전한 인간 한체, 단일-도메인 항체(sdAb, NANOBODY®로도 알려져 있음), 키메라 항체, 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체, 이중-친화성 재표적화 단백질(DART™)과 같은 이중-친화성 항체, 미니바디, 디아바디, 트리아바디 또는 트리바디, 테트라바디 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 2가의(divalent 또는 bivalent) 단일-사슬 가변 절편(di-scFv, bi-scFv) 및 다가의(multivalent) 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다. "항체 절편"은 그 표적에 결합하는 면역글로불린 분자의 가변 영역, 즉 항원-결합 영역의 적어도 일부를 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "항체"라는 용어는 달리 특정하지 않는 한 전장 항체 및 항체 절편 모두를 나타낸다.
"단백질 기반의 인식-분자" 또는 "PBRM"은 막통과(transmembrane) 단백질, 표면 고정화(immobilized) 단백질 또는 프로토글리칸과 같은 세포 표면 마커 또는 수용체를 인식하거나 결합하는 분자를 나타낸다. PBRM의 예는 항체(예컨대, Trastuzumab, Cetuximab, Rituximab, Bevacizumab, Epratuzumab, Veltuzumab, Labetuzumab, B7-H4, B7-H3, CA125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFRl, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, c-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, c-Kit, MUC1 및 항-5T4) 또는 펩티드(LHRH 수용체 표적화 펩티드, EC-1 펩티드), 예를 들면 안티칼린과 같은 리포칼린, 예를 들면 인터페론, 림포카인, 성장 인자, 콜로니 자극 인자 등과 같은 단백질, 펩티드 또는 펩티드 모방체(mimics) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 단백질 기반의 인식 분자는 상기 변형된 폴리머 접합체를 특정 세포, 조직 또는 위치로 표적화하는 것 이외에도 표적 세포 또는 경로에 대한 항증식성(세포분열억제(cytostatic) 및/또는 세포독성) 활성과 같은 어떤 치료 효과를 가질 수도 있다. 상기 단백질 기반의 인식 분자는 -COOH, 1차 아민, 2차 아민 -NHR, -SH와 같은 화학적으로 반응성인 기, 또는 화학적으로 반응성인 아미노산 모이어티, 또는 예를 들면 티로신, 히스티딘, 시스테인 또는 리신과 같은 측쇄 중 적어도 하나를 포함하거나 포함하도록 가공될 수 있다. 한 구현예에서, PBRM은 해당 표적 세포 군집에 대한 세포 표면 수용체 또는 항원과 같은 세포 표면 분자와 특이적으로 결합하거나 복합체를 형성하는 리간드(LG) 또는 표적화 모이어티일 수 있다. 상기 리간드가 그 수용체와 특이적으로 결합하거나 복합체를 형성하면, 세포는 상기 리간드 또는 리간드-약물-접합체의 흡수에 대해 수용적이 되며, 이후 세포 내로 내재화된다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 세포 표면 분자와 "특이적으로 결합하거나 복합체를 형성하는" 또는 "표적화하는" 리간드는 분자간 힘을 통해 세포 표면 분자와 우선적으로 연관된다. 예를 들면, 상기 리간드는 약 50 nM 이하, 약 5 nM 이하, 또는 500 pM 이하의 Kd로 세포 표면 분자와 우선적으로 연관될 수 있다. 세포 표면 분자에 대한 리간드의 결합 친화도를 측정하기 위한 기술들은 잘 알려져 있다; 예를 들면, 한 적합한 기술은 세포 플라즈몬 공명(SPR)으로 명명된다. 한 구현예에서, 상기 리간드는 표적화하기 위해 사용되며, 리간드가 운반하는 약물과 분리되면 검출가능한 치료 효과를 갖지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 리간드는 표적화 모이어티 및 (예컨대, 활성 약물 또는 전구약물의 활성을 향상시키기 위한) 치료제 또는 면역조절제 양쪽 모두로서 기능한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "생체호환성인"은 체액 또는 살아있는 세포 또는 조직과 접촉하는 동안 최소의 파괴적 또는 숙주 반응 효과를 발휘하는 화합물을 묘사하기 위한 의도이다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 것과 같은 '생체호환성 기'는 지방족, 시클로알킬, 헤테로지방족, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 나타내며, 상기에서 및 본 명세서에서 정의된 것과 같은 '생체호환성'이란 용어의 정의 내에 속한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "생체호환성"이란 용어는, 이러한 상호작용이 구체적으로 필요하지 않는 한, 상기 화합물이 생물학적 시스템의 자연적으로 발생하는 항체, 세포 단백질, 세포 및 다른 성분들과 같은 인식 단백질과 최소의 상호작용을 함을 의미하는 것이다. 따라서, 상기 최소의 상호작용을 일으키도록 구체적으로 의도된 물질 및 작용기, 예컨대 약물 및 전구약물은 생체호환성인 것으로 간주된다. 바람직하게는(예컨대, 항신생물 제제와 같은 세포독성을 의도하는 화합물은 예외임), 생체내에서 화합물의 반감기(예컨대, 생체내에 투여된 화합물의 50%가 없어지거나 제거되는데 필요한 기간)와 동등한 시간 동안 의도된 전신 생체내 농도와 유사한 농도로 시험관내(in vitro)에서 정상 세포에 첨가될 때 1% 이하의 세포 죽음이 일어나고, 생체내 투여시 최소의 의학적으로 허용가능한 염증, 이물질 반응, 면역독성, 화학적 독성 및/또는 이러한 다른 부작용을 유도하게 되면, 상기 화합물은 "생체호환성"이다. 상기 문장에서, "정상 세포"란 용어는 테스트되는 화합물에 의해 파괴되거나 달리 현저하게 영향을 받는 것이 의도되지 않는 세포를 나타낸다.
"생체분해성": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "생체분해성" 폴리머는 생체내에서 생물학적 가공에 민감한 폴리머이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "생체분해성" 화합물 또는 모이어티는 세포에 의해 섭취될 때 리소좀 또는 다른 화학적 공장 또는 가수분해에 의해 성분들로 분해될 수 있어서, 세포에 대한 현저한 독성 효과 없이 상기 세포가 재사용하거나 처리할 수 있는 것들이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "생체절단성"이란 용어는 "생체분해성"과 동일한 의미를 갖는다. 분해된 절편은 바람직하게는 생체내에서 기관 또는 세포 과부하 또는 이러한 과부하에 의해 일어나는 병리학적 공정 또는 다른 부작용을 거의 또는 전혀 유도하지 않는다. 생체분해성 공정의 예는 효소적 및 비-효소적 가수분해, 산화 및 환원을 포함한다. 본 명세서에서 개시된 생체분해성 단백질-폴리머-약물 접합체(또는, 그 성분들, 예컨대 생체분해성 폴리머성 담체 및 상기 담체와 항체 또는 약물 분자 사이의 링커(linker))의 비-효소적 가수분해를 위한 적합한 조건은, 예를 들면, 리소좀의 세포내 구획(compartment)의 온도 및 pH에서 상기 생체분해성 접합체를 물에 노출하는 것을 포함한다. 또한, 일부 단백질-폴리머-약물 접합체(또는, 그 성분들, 예컨대 생체분해성 폴리머성 담체 및 상기 담체와 항체 또는 약물 분자 사이의 링커)의 생체분해는, 예컨대 활성화된 대식세포 또는 분해 촉진 인자를 방출하는 다른 세포와 인접한 염증 구역과 같은 동물 신체의 낮은 pH 영역에서 세포외적으로 향상될 수 있다. 어떤 바람직한 구현예에서, pH∼7.5에서 상기 폴리머 담체의 효과적인 크기는 1 내지 7일에 걸쳐 검출가능하게 변하지 않으며, 적어도 7주 동안 원래의 폴리머 크기의 50% 이내로 남아있다. 반면, pH∼5에서, 상기 폴리머 담체는 바람직하게는 1 내지 5일에 걸쳐 검출가능하게 분해되며, 2주 내지 7개월의 시간 프레임 내에 저분자량의 절편으로 완전히 변환된다. 이러한 테스트에서의 폴리머 본성(integrity)은, 예를 들면, 크기 배제 HPLC에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에는 더 빠른 분해가 바람직할 수 있지만, 일반적으로는 상기 폴리머가 세포에 의한 폴리머의 대사 또는 배출 속도를 상회하지 않는 속도로 세포내에서 분해되는 것이 보다 바람직할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리머 및 폴리머 생체분해 부산물은 생체호환성이다.
"생체이용성": "생체이용성"이란 용어는 개체에 투여된 주어진 양의 약물 또는 화합물의 전신 이용성(즉, 혈액/혈장 레벨)을 나타낸다. 생체이용성은 투여된 제형으로부터 일반적인 순환에 도달하는 약물 또는 화합물의 시간(속도) 및 총량(정도) 모두의 측정을 나타내는 절대적인 용어이다.
"말레이미도 차단 화합물": 본 발명에서 사용된 것과 같이, 말레이미도와 반응하여 이를 숙신이미드로 전환시킬 수 있는 화합물을 나타내며, "말레이미도 차단 모이어티"는 전환시 상기 숙신이미드에 부착된 화학적 모이어티를 나타낸다. 어떤 구현예에서, 상기 말레이미도 차단 화합물은 말레이미드와 반응하기 위한 말단 티올기를 갖는 화합물이다. 어떤 구현예에서, 상기 말레이미도 차단 화합물은 수용성이어서, 말레이미드와의 반응은 수용액에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결과물인 말레이미도 차단 모이어티는 수용성 또는 친수성이다. 한 구현예에서, 상기 말레이미도 차단 화합물은 시스테인, N-아세틸 시스테인, 시스테인 메틸 에스테르, N-메틸 시스테인, 2-머캅토에탄올, 3-머캅토프로판산, 2-머캅토아세트산, 머캅토메탄올(즉, HOCH2SH), 페닐이 하나 이상의 친수성 치환체로 치환된 벤질 티올, 또는 3-아미노프로판-1-티올이다.
"친수성": "친수성"이란 용어는, 예컨대 친수성 또는 수용성이 되게 하는 폴리머 모노머성 단위 또는 말레이미도 차단 모이어티 상의 치환체와 연관된 것과 같이, 본 기술분야에서의 상기 용어의 일반적인 의미와 근본적으로 다르지 않으며, 이온화가능한, 극성 또는 극성가능 원자를 함유하거나, 달리 물 분자에 의해 용매화될 수 있는 화학적 모이어티를 나타낸다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 것과 같이, '친수성 기'는 상기에서 정의한 것과 같은 '친수성'이란 용어의 정의 내에 속하는 지방족, 시클로알킬, 헤테로지방족, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 나타낸다. 적합한 특정 친수성 유기 모이어티의 예는 약 1 내지 12개 원자 사이의 범위에서 원자의 사슬을 포함하는 지방족 또는 헤테로지방족 기, 히드록실, 히드록시알킬, 아민, 카르복실, 아미드, 카르복실 에스테르, 티오에스테르, 알데히드, 니트릴, 이소니트릴, 니트로소, 히드록시아민, 머캅토알킬, 헤테로사이클, 카바메이트, 카르복실산 및 그의 염, 설폰산 및 그의 염, 설폰산 에스테르, 인산 및 그의 염, 포스페이트 에스테르, 폴리글리콜 에테르, 폴리아민, 폴리카르복실레이트, 폴리에스테르 및 폴리티오에스테르를 제한없이 포함한다. 어떤 구현예에서, 친수성 치환체는 카르복실기(COOH), 알데히드기(CHO), 케톤기(COC1-4 알킬), 메틸올(CH2OH) 또는 글리콜(예를 들면, CHOH-CH2OH 또는 CH-(CH2OH)2), NH2, F, 시아노, SO3H, PO3H 등을 포함한다.
"친수성"이란 용어는, 본 발명의 폴리머와 연관된 것과 같이, 일반적으로 본 기술분야에서의 상기 용어의 용법과 다르지 않으며, 상기에서 정의된 것과 같은 친수성 작용기를 포함하는 폴리머를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 친수성 폴리머는 수용성 폴리머이다. 상기 폴리머의 친수성도는 수화 에너지를 결정함으로써 직접 측정되거나, 2가지 액체 상(phase) 사이를 조사하거나, 예를 들면 C4 또는 C18과 같은 알려진 소수성도를 갖는 고체 상에서의 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다.
"폴리머성 담체": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, '폴리머성 담체'란 용어는 지정된 링커를 이용해 하나 이상의 약물 분자 및/또는 지정된 링커를 이용해 하나 이상의 PBRM에 공유적으로 부착시키기에 적합하거나 공유적으로 부착될 수 있는 폴리머 또는 변형된 폴리머를 나타낸다.
"생리학적 조건": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "생리학적 조건"이란 구(phrase)는 살아있는 조직의 세포외 유체에서 접할 것 같은 화학적(예컨대, pH, 이온 강도) 및 생화학적(예컨대, 효소 농도) 조건의 범위에 관한 것이다. 대부분의 정상 조직의 경우, 생리학적 pH는 약 7.0 내지 7.4의 범위이다. 순환하는 혈액 혈장 및 정상 세포간(interstitial) 액체는 정상 생리학적 조건의 전형적인 예를 나타낸다.
"폴리사카라이드", "탄수화물" 또는 "올리고사카라이드": "폴리사카라이드", "탄수화물" 또는 "올리고사카라이드"란 용어는 본 기술분야에 알려져 있으며, 일반적으로 화학식 (CH2O)n을 갖는 물질(일반적으로, n>2) 및 그의 유도체를 나타낸다. 탄수화물은 폴리히드록시알데히드 또는 폴리히드록시케톤, 또는 가수분해, 산화 또는 환원과 같은 단순한 화학적 변형에 의해 이러한 물질들로 변한다. 전형적으로, 탄수화물은 고리형 아세탈 또는 케탈(예컨대, 글루코오스 또는 프럭토오스)의 형태로 존재한다. 상기 고리형 단위(모노사카라이드)는 서로 연결되어 몇 개(올리고사카라이드) 또는 여러 개(폴리사카라이드)의 모노사카라이드 단위를 갖는 분자를 형성할 수 있다. 종종, 잘 정의된 수, 형태 및 위치의 모노사카라이드 단위를 갖는 탄수화물은 올리고사카라이드라고 불리며, 다양한 수 및/또는 위치의 모노사카라이드 단위의 분자들의 혼합물로 이루어지는 탄수화물은 폴리사카라이드라고 불린다. "폴리사카라이드", "탄수화물" 및 "올리고사카라이드"란 용어들은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 폴리사카라이드는 자연형의 당들(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 만노오스, 아라비노오스, 리보오스 및 자일로오스) 및/또는 자연적으로 발생하는 당들의 유도체(예컨대, 2'-플루오로리보오스, 2'-데옥시리보오스 및 헥소오스)를 포함할 수 있다.
"약물": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "약물"이란 용어는 생물학적으로 활성이고 이를 필요로 하는 개체에게 투여된 후 원하는 생리학적 효과를 제공하는 화합물(예컨대, 활성 약학적 성분)을 나타낸다.
"전구약물": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "전구약물"은 활성 약물의 전구체, 즉 활성 약물로 변형될 수 있는 화합물을 나타낸다. 전형적으로, 이러한 전구약물은 상기 약물을 생리학적으로 활성인 형태로 전환시키는 생체내 가공을 거친다. 일부 경우에 있어서, 전구약물은 그 자체가 원하는 생리학적 효과를 가질 수 있다. 바람직한 생리학적 효과는, 예컨대 치료, 세포독성, 면역조절 등일 수 있다.
"세포독성": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "세포독성"이란 용어는 세포 또는 선택된 세포 군집(예컨대, 암 세포)에 독성임을 의미한다. 상기 독성 효과는 세포 죽음 및/또는 용해의 결과일 수 있다. 어떤 경우에 있어서, 상기 독성 효과는, 예컨대 세포 성장을 늦추거나 막는 세포에 대한 아치사의(sublethal) 파괴적 효과일 수 있다. 세포독성 효과를 달성하기 위하여, 상기 약물 또는 전구약물은 다른 것들 중에서도 DNA 손상제, 마이크로튜불 파괴제, 또는 세포독성 단백질 또는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
"세포분열억제": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "세포분열억제"란 용어는 세포 성장 및/또는 증식을 억제 또는 중단시키는 약물 또는 다른 화합물을 나타낸다.
"소분자": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "소분자"란 용어는 상대적으로 작은 분자량을 갖는 자연적으로 발생하거나 (예컨대, 화학적 합성을 통해) 인공적으로 생성된 분자를 나타낸다. 바람직한 소분자는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 국소 또는 전신 효과를 생성한다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 어떤 바람직한 구현예에서, 상기 소분자는 약물이고, 상기 소분자는 "약물 분자" 또는 "약물" 또는 "치료제"로 불린다. 어떤 구현예에서, 상기 약물 분자는 약 5 kDa 이하의 MW를 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 약물 분자는 약 1.5 kDa 이하의 MW를 갖는다. 구현예에서, 상기 약물 분자는 빈카 알칼로이드, 오리스타틴, 두오카르마이신, 키나아제 억제제, MEK 억제제, KSP 억제제, PI3 키나아제 억제제, 칼리키아마이신, SN38, 캄프토테신, 토포아이소머라아제 억제제, 비-자연형 캄프토테신, 단백질 합성 억제제, RNA 중합효소 억제제, 피롤로벤조디아제핀, 메이탄시노이드, DNA-결합 약물, DNA 삽입(intercalation) 약물 및 이들의 유사체로부터 선택된다. 바람직하게는, 필수적인 것은 아니지만, 상기 약물은 적절한 정부 기관 또는 기구, 예컨대 FDA에 의해 이미 안전하고 사용하기에 효과적인 것으로 여겨지는 약물이다. 예를 들면, 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 21 C.F.R. §§330.5, 331 내지 361 및 440 내지 460 하에 FDA에 의해 나열되어 있는 인간에 사용하기 위한 약물들; 21 C.F.R. §§500 내지 589 하에 FDA에 의해 나열되어 있는 수의과용으로 사용하기 위한 약물들은 모두 본 발명의 친수성 폴리머와 함께 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 본 발명의 실행시에 사용될 수 있는 클래스의 약물 분자는 항암 물질, 방사성핵종, 비타민, 항-AIDS 물질, 항생제, 면역억제제, 항-바이러스 물질, 효소 억제제, 신경독소, 오피오이드(opioid), 최면제, 항-히스타민제, 윤활제, 진정제, 항-경련제, 근육 이완제 및 항-파킨슨 물질, 채널 차단제를 포함하는 진경제 및 근육 수축제, 축동제(miotics) 및 항-콜린제, 항-녹내장 화합물, 항-기생충 및/또는 항-프로토조아 화합물, 세포 성장 억제제 및 항-부착 분자를 포함하는 세포-세포외 매트릭스 상호작용 조절제, 혈관확장제, DNA, RNA 또는 단백질 합성 억제제, 항-고혈압제, 진통제, 해열제, 스테로이드 및 비-스테로이드성 항염증제, 항-혈관형성 인자, 항-분비 인자, 항응혈제 및/또는 항혈전증제, 국소 마취제, 안과제, 프로스타글란딘, 항-우울제, 항-정신과 물질, 항-구토제, 이미지화 제제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 많은 큰 분자들도 또한 약물이며, 이러한 큰 분자들은 본 명세서에 개시된 접합체 및 다른 구조체에서 사용될 수 있다. 적합한 큰 분자들의 예는, 예컨대 아미노산 기반의 분자를 포함한다. 아미노산 기반의 분자는 다른 것들 중에서도, 예컨대 펩티드, 폴리펩티드, 효소, 항생제, 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포괄할 수 있다.
비-제한적이지만, 본 발명에서 사용하기에 적합한 클래스 및 구체적인 약물의 보다 완전한 목록은 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 하기 문헌들(Axel Kleemann and Jurgen Engel, "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications", Thieme Medical Publishing, 1999 및 "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", Edited by Susan Budavari et al., CRC Press, 1996)에서 발견될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 약물은 표적 세포 또는 경로에 대한 항증식성(세포분열억제 및/또는 세포독성) 활성을 갖는 치료제이다. 상기 약물은, 예를 들면, -COOH, 1차 아민, 2차 아민 -NHR, -OH, -SH, -C(O)H, -C(O)R, -C(O)NHR2b, C(S)OH, -S(O)2OR2b, -P(O)2OR2b, -CN, -NC 또는 -ONO와 같은 화학적으로 활성인 기를 가질 수 있으며, 상기에서 R은 지방족, 헤테로지방족, 카르복실 또는 헤테로시클로알킬 모이어티이고, R2b는 수소, 지방족, 헤테로지방족, 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 모이어티이다.
*본 명세서에서 사용된 것과 같이, "약물 유도체" 또는 "변형된 약물" 등은 약물 분자를 폴리머성 담체에 부착시킬 수 있는 본 발명의 접합체 및 작용기에 의해 운반되기 위한 의도의 약물 분자를 포함하는 화합물을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "활성 형태"는 생체내 또는 시험관내에서 의도하는 약학적 효능을 보여주는 화합물의 형태를 나타낸다. 특히, 본 발명의 접합체에 의해 운반되기 위한 의도의 약물 분자가 상기 접합체로부터 방출될 때, 상기 활성 형태는 상기 의도된 치료 특성을 나타내는 약물 자체 또는 그의 유도체일 수 있다. 상기 접합체로부터의 약물의 방출은 상기 약물을 폴리머성 담체에 부착시키는 링커의 생체분해성 결합을 절단함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 상기 활성 약물 유도체는 상기 링커의 일부를 포함할 수 있다.
"진단 라벨": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, '진단 라벨(diagnostic label)'이란 용어는 본 기술분야에 알려진 분석 방법을 이용하여 생체내 또는 생체외(ex vivo)에서 검출될 수 있는 원자, 원자들의 군, 모이어티 또는 작용기, 나노크리스탈 또는 관련 조성물의 다른 별개의 요소를 나타낸다. 본 발명의 접합체와 연관될 때, 이러한 진단 라벨은 상기 접합체를 생체내에서 모니터링하도록 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 진단 라벨을 포함하는 구조체 및 조성물은 생물학적 기능 또는 구조를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 진단 라벨의 예는 감마 신티그래피(scintigraphy) 및 양전자 방출 단층촬영(Positron Emission Tomography, PET)용 방사성 동위원소(방사성핵종), 자기 공명 영상(MRI)용 조영제(예를 들면, 상자성 원자 및 초상자성 나노크리스탈), 컴퓨터 단층촬영 및 다른 X-선 기반의 이미지화 방법용 조영제, 초음파-기반의 진단 방법(소노그래피(sonography))용 제제, 중성자 활성화용 제제(예컨대, 붕소, 가돌리늄), 다양한 광학 절차용 형광단(fluorophore) 및 일반적으로 전자기장 또는 파동(예컨대, 감마-선, X-선, 전파, 마이크로파, 빛), 입자(예컨대, 알파 입자, 전자, 양전자, 중성자, 광자) 또는 다른 형태의 복사(예컨대, 초음파)를 방출, 반사, 흡수, 산란 또는 달리 영향을 미칠 수 있는 모이어티와 같이 의료용 진단 절차에서 사용될 수 있는 라벨들을 제한없이 포함한다.
다음은 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 보다 일반적인 용어들이다:
*"동물": 본 명세서에서 사용된 것과 같이, '동물'이란 용어는 임의의 발달 단계에 있는 인간뿐만 아니라 비-인간 동물을 나타내며, 예를 들면, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 벌레 및 단일 세포를 포함한다. 세포 배양물 및 살아있는 조직 샘플은 복수의 동물인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 상기 비-인간 동물은 포유동물(예컨대, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 영장류 또는 돼지)이다. 동물은 유전자이식(transgenic) 동물 또는 인간 클론일 수 있다. "개체"란 용어는 동물들을 포괄한다.
"효과량": 일반적으로, 활성 제제 또는 약물 운반 장치를 나타내는 것이므로, "효과량(efficient amount)"이란 용어는 원하는 생물학적 반응을 일으키기 위해 필요한 양을 나타낸다. 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 것과 같이, 제제 또는 장치의 효과량은 원하는 생물학적 종말점(endpoint), 운반되는 제제, 캡슐화 매트릭스의 조성물, 표적 조직 등과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 개인을 면역시키기 위해 운반되는 항원을 함유하는 미세입자의 효과량은 투여된 항원을 갖는 유기체의 감염을 방지하기에 충분한 면역 반응이 일어나게 되는 양이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "자연형 아미노산"은 자연적으로 발생하는 단백질에서 발견되는 보통의 자연적으로 발생하는 L-아미노산들: 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 발린(Val), 루이신(Leu), 이소루이신(Ile), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 프롤린(Pro), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(T게), 아스파라트산(Asp), 글루탐산(Glu), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 시스테인(Cys) 및 메티오닌(Met) 중 임의의 하나를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "비자연형 아미노산"은 자연형 아미노산이 아닌 임의의 아미노산을 나타낸다. 이것은, 예를 들면, -, -, -, D-, L-아미노 아실 잔기를 포함하는 아미노산을 포함한다. 보다 일반적으로, 상기 비자연형 아미노산은 일반식
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의 잔기를 포함하며, 상기 측쇄 R은 자연에서 발생하는 아미노산 측쇄 이외의 것이다. 예시적인 비자연형 아미노산은 사르코신(N-메틸글리신), 시트룰린(cit), 호모시트룰린, -우레이도알라닌, 티오시트룰린, 히드록시프롤린, 알로트레오닌, 피페콜산(호모프롤린), α-아미노이소부티르산, tert-부틸글리신, tert-부틸알라닌, 알로-이소루이신, 노르루이신, α-메틸루이신, 시클로헥실글리신, -시클로헥실알라닌, -시클로펜틸알라닌, α-메틸프롤린, 페닐글리신, α-메틸페닐알라닌 및 호모페닐알라닌을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
"아미노 아실": 보다 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 것과 같이, '아미노 아실'이란 용어는 자연형 아미노산 및 비자연형 아미노산을 포괄한다.
"폴리아미드": 자연형 아미노산 및 비자연형 아미노산의 호모- 또는 헤테로-폴리머를 나타낸다. 예시적인 호모-폴리머는 폴리-리신, 폴리-아르기닌, 폴리글루탐산 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 헤테로-폴리머는 펩티다아제, 리소자임, 메탈로프로티나아제 등으로부터 선택되는 펩티드 절편을 포함하는 폴리머를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
"PHF"는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "폴리머 단위", "모노머성 단위", "모노머", "모노머 단위", "단위"란 용어는 모두 폴리머 내의 반복가능한 구조 단위를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 폴리머 또는 폴리머성 담체/스캐폴드 또는 폴리머 접합체의 "분자량" 또는 "MW"는 달리 특정하지 않는 한 중량 평균 분자량을 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 화합물에서 존재하는 원자들의 모든 동위원소를 포함하는 의도이다. 동위원소는 동일한 원자 번호를 갖지만 질량수는 상이한 원자들을 포함한다. 제한이 없는 일반적인 예로서, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함한다. 탄소의 동위원소는 C-13 및 C-14를 포함한다.
본 발명은 화합물의 모든 이성질체를 포함하는 의도로서, 이성질체는 광학 이성질체 및 토토머성(tautomeric) 이성질체를 나타내고 포함하며, 광학 이성질체는 거울상이성질체 및 부분입체이성질체, 키랄 이성질체 및 비-키랄 이성질체를 포함하고, 상기 광학 이성질체는 단리된 광학 이성질체뿐만 아니라 라세미 및 비-라세미 혼합물을 포함하는 광학 이성질체들의 혼합물을 포함한다; 상기 이성질체는 단리된 형태 또는 하나 이상의 다른 이성질체와의 혼합물일 수 있다.
폴리머성 담체
어떤 예시적인 구현예에서, 본 발명의 접합체는 약물 운반 및 조직 공학과 같은 생물의학 적용분야에서의 용도를 발견하며, 상기 담체는 생체호환성 및 생체분해성이다. 어떤 구현예에서, 상기 담체는 용해성 폴리머, 나노입자, 겔, 리포좀, 미셀(micelle), 봉합, 이식물(implant) 등이다. 어떤 구현예에서, "용해성 폴리머"란 용어는 폴리알(예컨대, 친수성 폴리아세탈 또는 폴리케탈)과 같은 생체분해성 생체호환성 폴리머를 포괄한다. 어떤 다른 구현예에서, 상기 담체는 완전한 합성, 반-합성 또는 자연적으로-발생하는 폴리머이다. 어떤 다른 구현예에서, 상기 담체는 친수성이다.
어떤 예시적인 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 담체는 주쇄 내에 위치하는 각각의 모노머 단위에 적어도 하나의 가수분해성 결합을 포함하는 생체분해성 생체호환성 폴리알이다. 이것은 (모노머 단위의 가수분해/절단을 통한) 분해 공정이 상기 폴리머 접합체가 모노머성 성분들로 절편화될 것(즉, 분해)임을 보장하며, 본 발명의 폴리머 접합체에 생체분해성 특성을 부여한다. 상기 생체분해성 생체호환성 폴리머 접합체의 특성(예컨대, 용해도, 생체접착성 및 친수성도)은 추가적인 친수성 및 소수성 기의 후속하는 치환에 의해 변형될 수 있다. 본 발명을 실행하기에 적합한 생체분해성 생체호환성 폴리머의 예는 다른 것들 중에서도 미국 특허 제5,811,510호; 제5,863,990호; 제5,958,398호; 제7,838,619호 및 제7,790,150호; 및 미국 공개 제2006/0058512호에서 발견될 수 있다; 상기 나열된 특허 문헌들 각각은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 유형의 폴리머의 중요성, 제조 및 적용에 대한 안내는 상기 인용된 문헌들에서 발견될 수 있다. 어떤 구현예에서, 본 발명은 상기 인용된 특허 문헌들뿐만 아니라 미국 특허 제5,582,172호 및 제6,822,086호와 조합시 특히 유용할 것임이 예측되며, 상기 나열된 특허 문헌들 각각은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 접합체는 친수성, 가수분해성이며, 하나 이상의 생체분해성 결합을 함유하는 결합을 통해 상기 폴리머 담체에 공유적으로 부착된 약물 분자(예컨대, 빈카 알칼로이드 또는 유도체, 예를 들면, SN38, 캄프토테신, 토포테칸, 엑사테칸, 비-자연형 캄프토테신 화합물 또는 유도체와 같은 토포아이소머라아제 억제제; 오리스타틴, 돌라스타틴, 네모루비신 및 그의 유도체, PNU-159682, 안트라사이클린, 두오카르마이신, 키나아제 억제제(예컨대, PI3 키나아제 억제제 또는 MEK 억제제), KSP 억제제, 칼리키아마이신, 피롤로벤조디아제핀, 메이탄시노이드, 엘리나파이드, DNA-결합 약물, DNA 삽입 약물 및 그의 입체이성질체, 등배전자체(isostere), 유사체 및 유도체) 및 항체(예컨대, 트라스투주맙, 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 에프라투주맙, 벨투주맙, 라베투주맙, B7-H4, B7-H3, CA125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, c-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, NaPi2b, c-Kit, MUC1 및 항-5T4) 또는 펩티드(LHRH 수용체 표적화 펩티드, EC-1 펩티드)를 포함한다. 따라서, 어떤 예시적인 구현예에서, 본 발명을 실행하기에 적합한 담체는 주쇄 내에 위치된 각각의 모노머 단위에 적어도 하나의 아세탈/케탈 산소 원자를 갖는 폴리알이다. 상기에서 논의한 것과 같이, 이것은 (상기 폴리머 아세탈/케탈 기의 가수분해/절단을 통한) 분해 공정이 상기 폴리알 접합체가 저분자량 성분들로 절편화될 것(즉, 분해)임을 보장한다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 폴리머 접합체의 제조에 사용되는 생체분해성 생체호환성 폴리머 담체는 자연적으로 발생하는 폴리사카라이드, 글리코폴리사카라이드, 및 폴리글리코시드, 폴리아세탈, 폴리아미드, 폴리에테르 및 폴리에스테르 기원의 합성 폴리머 및 그의 산화, 소설화, 변형, 가교 및 접합 생성물이다.
어떤 다른 구현예에서, 상기 담체는 탄수화물, 글리코폴리사카라이드, 당지질, 당접합체, 폴리아세탈, 폴리케탈 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 생체분해성 폴리머이다.
어떤 예시적인 구현예에서, 상기 담체는 셀룰로오스, 아밀로오스, 덱스트란, 레반, 푸코이단, 카라기난, 이눌린, 펙틴, 아밀로펙틴, 글리코겐 및 릭세난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 선형 및/또는 분지형 생체분해성 생체호환성 호모폴리사카라이드이다.
어떤 다른 예시적인 구현예에서, 상기 담체는 아가로오스, 힐루로난, 콘드로이틴설페이트, 더마탄설페이트, 케라탄설페이트, 알긴산 및 헤파린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 선형 및 분지형 생체분해성 생체호환성 헤테로폴리사카라이드이다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 상기 폴리머성 담체는 폴리아세탈/폴리케탈의 코폴리머 및 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 폴리머, 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리아미드, 폴리펩티드 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 폴리머를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 폴리머성 담체는, 예를 들면, 밀, 쌀, 옥수수 및 타피오카와 같은 다양한 자연 공급원으로부터 입수된 전분의 가수분해에 의해 생성되는 덱스트린이다. 전분 출발 물질의 구조에 따라, 각각의 덱스트린은 α-1,4 결합 및 α-1,6 결합의 특유의 분포를 포함한다. α-1,6 결합의 생체분해 속도는 전형적으로 α-1,4 결합의 경우보다 낮기 때문에, 바람직하게는 α-1,6 결합의 백분율은 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하이다. 한 구현예에서, 상기 덱스트린의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 40 kDa, 보다 바람직하게는 약 2 kDa 내지 약 20 kDa, 또는 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa의 범위이다.
어떤 구현예에서, 상기 담체는 약물 분자 또는 PBRM과 접합하기 전에 1,2-, 1,4-, 1,6- 및 2,6-피라노사이드 및 1,2-, 1,5-, 1,6-푸라노사이드의 고리형 인접(vicinal) 디올의 선택적 산화에 의해, 또는 폴리사카라이드를 함유하는 측면(lateral) 6-히드록시 및 5,6-디올의 산화에 의해 활성화된 폴리사카라이드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 폴리머성 담체는 생체분해성 생체호환성 폴리아세탈을 포함하며, 상기 폴리아세탈 반복 구조 단위의 적어도 서브세트(subset)는 다음의 화학 구조를 갖는다:
Figure pat00025
상기에서, n 괄호 구조의 각각의 존재에 대하여, R1 및 R2 중 하나는 수소이고 다른 하나는 생체호환성 기이며, C1에 공유적으로 부착된 탄소 원자를 포함하고; Rx는 C2에 공유적으로 부착된 탄소 원자이며; n"은 정수이고; R3, R4, R5 및 R6 각각의 존재는 생체호환성 기이며, 독립적으로 수소 또는 유기 모이어티이고; 및 괄호 구조의 각각의 존재에 대하여, 적어도 하나의 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 커플링에 적합한 작용기를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 작용기는 히드록실 모이어티이다.
한 구현예에서, 상기 폴리머성 담체는 그 백본(backbone)이 다음의 화학 구조로 표시되는 0.1% 내지 100% 폴리아세탈 모이어티를 포함하는 활성화된 친수성 생체분해성 생체호환성 폴리머를 포함한다:
(-CH2-CHR7-O-CHR8-O-)o
상기에서, R7 및 R8은 독립적으로 수소, 히드록실, 히드록실 알킬(예컨대, -CH2OH, -CH(OH)-CH2OH), -CHO, -CH(OH)-CHO 또는 -카르보닐이고; 및
o는 20 내지 2,000의 정수이다.
또 다른 구현예에서, 상기 폴리머성 담체는 생체분해성 생체호환성 폴리케탈을 포함하며, 상기 폴리케탈 반복 구조 단위의 적어도 서브세트는 다음의 화학 구조를 갖는다:
Figure pat00026
상기에서, R1 및 R2의 각각의 존재는 생체호환성 기이고, Rx, R3, R4, R5, R6은 본 명세서에서 정의된 것과 같다.
어떤 구현예에서, 상기 케탈 단위는 식 (IIa) 또는 (IIb)의 모노머이다:
Figure pat00027
생체분해성, 생체호환성 폴리케탈 폴리머 및 그의 제조 방법은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,811,510호, 제7,790,150호 및 제7,838,619호에 개시되어 있다.
한 구현예에서, 상기 폴리머성 담체는 부분적으로 산화된 덱스트란( 1→6)-D-글루코오스)을 환원시킴으로써 입수될 수 있다. 본 구현예에서, 상기 폴리머는 다음 구조의 비변형 덱스트란(A), 부분적으로 산화된 덱스트란 아세탈 단위(B) 및 철저한(exhaustively) 덱스트란 아세탈 단위(C)의 무작위 혼합물을 포함한다:
Figure pat00028
다른 구현예에서, 상기 폴리머성 담체는 비변형 아세탈 단위, 즉 폴리아세탈 세그먼트(segment)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리아세탈은 철저하게 산화된 덱스트란을 환원시킴으로써 유래될 수 있다. 상기 폴리머는 참고문헌, 예컨대 미국 특허 제5,811,510호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 컬럼 2, 65줄 내지 컬럼 8, 55줄의 폴리아세탈 및 컬럼 10, 45줄 내지 컬럼 11, 14줄의 그의 합성에 대한 기재에 대하여 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 한 구현예에서, 상기 비변형 폴리아세탈 폴리머는 폴리(히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸 포르말) 폴리머(PHF)이다.
폴리(히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸 포르말) 폴리머 이외에, 상기 폴리머성 담체의 백본은 또한 폴리(히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸 포르말) 블록 및 다른 아세탈 또는 비-아세탈 모노머 또는 폴리머의 코-폴리머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머는 부속된 작용기들의 폴리머 측쇄들 사이의 상호작용을 감소시킬 수 있기 때문에 상기 폴리머 백본에서 스텔스 제제(stealth agent)로서 유용하다. 이러한 기들은 또한 혈청 인자 및 변형된 폴리머 사이와 같은 상호작용을 제한하는데 있어서 유용할 수 있다. 상기 폴리머 백본에 포함시키기 위한 다른 스텔스 제제 모노머는, 예를 들면, 에틸렌이민, 메타크릴산, 아크릴아미드, 글루탐산 및 이들의 조합을 포함한다.
상기 아세탈 또는 케탈 단위는 생체호환성을 촉진하기 위한 효과량으로 상기 변형된 폴리머 내에 존재한다. 상기 미변형 아세탈 또는 케탈 단위는 상기 변형된 폴리머에 생체호환성 및 용해성을 제공하는 "스텔스 제제"로 나타낼 수 있다. 또한, 폴리아세탈 또는 폴리케탈 폴리머에 대한 접합은 대사에 대한 민감성 및 여기에 부착된 모이어티의 분해를 변형시키고, 생체분포, 제거 및 분해에 영향을 미칠 수 있다.
상기 비변형 아세탈 단위는 식 (III)의 모노머이다:
Figure pat00029
상기 비변형 폴리아세탈 단위의 몰(molar) 분획 n은 상기 변형된 폴리머 내의 폴리머 단위의 총 수에 기초하여 생체호환성, 용해도를 촉진하고, 반감기를 증가시키기 위해 이용가능한 몰 분획이다. 상기 몰 분획 n은 생체호환성, 용해도, 안정성, 또는 특정 반감기를 제공하기 위해 필요한 비변형 모노머 아세탈 단위의 최소 분획일 수 있거나, 더 큰 어떤 분획일 수 있다. 가장 바람직한 세포독성 정도는 실질적으로 없는 것이며, 즉 상기 변형된 폴리머는 실질적으로 개체에 불활성(inert)이다. 그러나, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 것과 같이, 어느 정도의 세포독성은 치료되는 질환 또는 징후의 증세, 치료의 효능, 면역 반응의 유형 및 정도 등의 고려사항들에 따라 용인될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 변형된 폴리머 백본은 식 (IV)의 단위를 포함한다:
Figure pat00030
상기에서, X'는 폴리머 백본의 히드록실기에 대한 치환체를 나타낸다. 식 (IV) 및 본 명세서에 개시된 다른 식들에 나타낸 것과 같이, 각각의 폴리아세탈 단위는 상기 단위의 글리세롤 모이어티 및 상기 단위의 글리콜알데히드 모이어티에 부착된 X' 기(또는 -LD-D와 같은 다른 치환체)에 부착된 단일 히드록실기를 갖는다. 이것은 단지 편의를 위한 것으로서, 상기 식 (IV) 및 본 명세서에 개시된 다른 식들의 단위를 갖는 폴리머는 상기 단위의 글리콜알데히드 모이어티에 부착된 X' 기(또는 말레이미드 말단을 포함하는 링커와 같은 다른 치환체) 및 상기 단위의 글리세롤 모이어티에 부착된 단일 X' 기(또는 말레이미드 말단을 포함하는 링커와 같은 다른 치환체) 뿐만 아니라 하나는 상기 단위의 글리콜알데히드 모이어티에 부착되고 다른 하나는 글리세롤 모이어티에 부착된 2개의 X' 기(또는 말레이미드 말단을 포함하는 링커와 같은 다른 치환체)를 갖는 단위의 무작위 분포를 함유할 수 있음이 이해되어야 한다.
한 구현예에서, 본 발명을 실행하기에 적합한 생체분해성 생체호환성 폴리알은 약 0.5 내지 약 300 kDa 사이의 분자량을 갖는다. 예를 들면, 상기 생체분해성 생체호환성 폴리알은 약 1 내지 약 300 kDa 사이(예컨대, 약 1 및 약 200 kDa 사이, 약 2 및 약 300 kDa 사이, 약 2 및 약 200 kDa 사이, 약 5 및 약 100 kDa 사이, 약 10 및 약 70 kDa 사이, 약 20 내지 약 50 kDa 사이, 약 20 및 약 300 kDa 사이, 약 40 및 약 150 kDa 사이, 약 50 및 약 100 kDa 사이, 약 2 및 약 40 kDa 사이, 약 6 및 약 20 kDa 사이, 또는 약 8 및 약 15 kDa 사이)의 분자량을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 폴리머 스캐폴드 또는 접합체용으로 사용되는 생체분해성 생체호환성 폴리알은 약 2 및 약 40 kDa 사이(예컨대, 약 2-20 kDa, 3-15 kDa 또는 5-10 kDa)의 분자량을 갖는 PHF이다.
한 구현예에서, 본 발명을 실행하기에 적합한 생체분해성 생체호환성 폴리알은 약물 또는 PBRM과 접합시키기 전에 변형된다. 예를 들면, 상기 폴리알은 -C(=O)-X-(CH2)v-C(=O)-를 함유하며, 상기 X는 CH2, O 또는 NH이고, v는 1 내지 6의 정수이다. 하기 표 A는 약물 또는 PBRM 또는 그의 유도체와 접합시키기에 적합한 변형된 폴리알의 일부 예를 제공한다. 달리 특정하지 않는 한, 표 A의 참고번호는 본 명세서에 개시된 실시예 번호에 해당하고; "ND"란 용어는 결정되지 않았음을 의미하며; 및 X는 CH2, O 또는 NH이다.
[표 A]
Figure pat00031
치료제
어떤 구현예에서, 상기 치료제는 바람직하게는 약 5 kDa 이하, 보다 바람직하게는 약 4 kDa 이하, 보다 바람직하게는 약 3 kDa 이하, 가장 바람직하게는 약 1.5 kDa 이하, 또는 약 1 kDa 이하의 분자량을 갖는 소분자이다.
어떤 구현예에서, 상기 치료제는 약 1 nM 이하의 IC50을 갖는다.
다른 구현예에서, 상기 치료제는 약 1 nM 이하의 IC50을 가지며, 예를 들면, 상기 치료제는 약 1 내지 50 nM의 IC50을 갖는다.
약 1 nM 이상의 IC50을 갖는 일부 치료제(예컨대, "덜 강력한 약물")는 본 기술분야에서 인식된 접합 기술을 이용하여 PBRM과 접합시키기에 적합하지 않다. 이론에 고착되지 않으면서, 이러한 치료제는 상기 접합체가 감소된 약동학적 및 물리화학적 특성을 나타내지 않고서는 본 기술분야에서 인식된 기술을 이용하여 충분한 카피(즉, 8 이상)의 약물이 접합될 수 없기 때문에 종래 기술을 이용하여 표적화 PBRM-약물 접합체에서 사용하기에 불충분한 효능을 갖는다. 그러나, 이러한 덜 강력한 약물을 충분히 높게 부하하는 것은 본 명세서에 개시된 접합 전략을 이용하여 달성될 수 있으며, 이로 인해 원하는 약동학적 및 물리화학적 특성을 유지하면서 치료제를 높게 부하할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명은 또한 PBRM, PHF 및 적어도 8개의 치료제 모이어티를 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체에 관한 것으로서, 상기 치료제는 약 1 nM 이상의 IC50을 갖는다.
어떤 구현예에서, 약 0.3 내지 약 15%, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 12%, 보다 더 바람직하게는 약 5 내지 약 10%의 모노머가 치료제를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 소분자 치료제(예컨대, 폴리머 담체에 결합될 수 있는 항증식성(세포독성 및 세포분열억제) 제제)는 세포독성 화합물(예컨대, 넓은 스펙트럼), 혈관형성 억제제, 세포 사이클 진행 억제제, PI3K/m-TOR/AKT 경로 억제제, MAPK 신호전달 경로 억제제, 키나아제 억제제, 단백질 샤페론(chaperone) 억제제, HDAC 억제제, PARP 억제제, Wnt/Hedgehog 신호전달 경로 억제제 및 RNA 중합효소 억제제를 포함한다.
넓은 스펙트럼의 세포독소는 DNA-결합, 삽입 또는 알킬화 약물, 마이크로튜불 안정화 및 탈안정화제, 백금 화합물, 토포아이소머라아제 I 억제제 및 단백질 합성 억제제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 DNA-결합, 삽입 또는 알킬화 약물은 CC-1065 및 그의 유사체, 안트라사이클린(독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 네모루비신 및 그의 유도체, PNU-159682), 엘리나파이드(LU79553) 및 그의 유사체와 같은 비스나프탈이미드 화합물, 칼리키아마이신, 다크티노마이신, 미트로마이신, 피롤로벤조디아제핀 등과 같은 알킬화제를 포함한다. 예시적인 CC-1065 유사체는 두오카르마이신 SA, 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 C1, 두오카르마이신 C2, 두오카르마이신 B1, 두오카르마이신 B2, 두오카르마이신 D, DU-86, KW-2189, 아도젤레신, 비젤레신, 카르젤레신, 세코-아도젤레신 및 관련 유사체 및 전구약물 형태를 포함하며, 이들의 예는 미국 특허 제5,475,092호; 제5,595,499호; 제5,846,545호; 제6,534,660호; 제6,586,618호; 제6,756,397호 및 제7,049,316호에 개시되어 있다. 독소루비신 및 그의 유사체는 미국 특허 제6,630,579호에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 칼리키아마이신은, 예컨대 에네디인, 예컨대 에스페라마이신 및 미국 특허 제5,714,586호 및 제5,739,116호에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 두오카르마이신은 미국 특허 제5,070,092호; 제5,101,038호; 제5,187,186호; 제6,548,530호; 제6,660,742호; 및 제7,553,816 B2호; 및 Li et al., Tet Letts., 50:2932-2935 (2009)에 개시되어 있는 것들을 포함한다.
피롤로벤조디아제핀(PBD) 및 그의 유사체는 Denny, Exp. Opin. Ther. Patents., 10(4):459-474 (2000) 및 Antonow and Thurston, Chem Rev., 2815-2864 (2010)에 개시되어 있는 것들을 포함한다.
예시적인 마이크로튜불 안정화 및 탈안정화제는 파클리탁셀, 도세탁셀, 테세탁셀 및 카르바지탁셀과 같은 탁산 화합물; 메이타시노이드, 오리스타틴 및 그의 유사체, 빈카 알칼로이드 유도체, 에포틸론 및 크립토피신을 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체, 메이탄신 또는 DM-1 및 DM-4를 포함하고, 미국 특허 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제6,333.410호; 제6,441,163호; 제6,716,821호; 제RE39,151호 및 제7,276,497호에 개시되어 있는 것들이다. 어떤 구현예에서, 상기 세포독성제는 메이탄시노이드, 다른 군의 항-튜불린 제제(ImmunoGen, Inc.; 및 Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131 참조), 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체이다. 적합한 메이탄시노이드의 예는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체를 포함한다. 적합한 메이탄시노이드는 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제6,333,410호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 및 제5,846,545호에 개시되어 있다.
예시적인 오리스타틴은 오리스타틴 F(또한 돌라스타틴-10의 유도체로 알려져 있음), 오리스타틴 EB(AEB), 오리스타틴 EFP(AEFP), 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF), 오리스타틴 F, 오리스타틴 F 페닐렌디아민(AFP), 오리스타틴 F HPA 및 돌라스타틴을 포함한다. 적합한 오리스타틴은 또한 그 개시된 내용 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 공개공보 제2003/0083263호, 제2011/0020343호 및 제2011/0070248호; PCT 출원 공개공보 WO09/117531, WO2005/081711, WO04/010957; WO02/088172 및 WO01/24763, 및 미국 특허 제7,498,298호; 제6,884,869호; 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,124,431호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,767,237호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 개시되어 있다.
예시적인 빈카 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 나벨빈(비노렐빈)을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 빈카 알칼로이드는 또한 개시된 내용 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 공개공보 제2002/0103136호 및 제2010/0305149호, 미국 특허 제7,303,749B1호에 개시되어 있다.
예시적인 에포틸론 화합물은 에포틸론 A, B, C, D, E 및 F 및 그의 유도체를 포함한다. 적합한 에포틸론 화합물 및 그의 유도체는, 예를 들면, 개시된 내용 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,956,036호; 제6,989,450호; 제6,121,029호; 제6,117,659호; 제6,096,757호; 제6,043,372호; 제5,969,145호; 및 제5,886,026호; 및 WO97/19086; WO98/08849; WO98/22461; WO98/25929; 제WO98/38192; WO99/01124; WO99/02514; WO99/03848; WO99/07692; WO99/27890; 및 WO99/28324에 개시되어 있다.
예시적인 크립토파이신 화합물은 미국 특허 제6,680,311호 및 제6,747,021호에 개시되어 있다.
예시적인 백금 화합물은 시스플라틴(PLATINOL), 카르보플라틴(PARAPLATIN), 옥살리플라틴(FLOXATINE), 이프로플라틴, 오르마플라틴 및 테트라플라틴을 포함한다.
또 다른 클래스의 화합물 또는 이들 또는 다른 세포독성 작용 방식을 갖는 화합물은, 예컨대 마이토마이신 C, 마이토마이신 A, 다우노루비신, 독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 아미노프테린, 블레오마이신, 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-올, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 폴리아미드 및 그의 다이머를 포함하여 선택될 수 있다. 다른 적합한 세포독성제는, 예를 들면, 푸로마이신, 토포테칸, 리족신, 에치노마이신, 콤브레타스타틴, 네트롭신, 에스트라무스틴, 크립토피아신, 세마고틴, 디스코데르몰리드, 엘레우테로빈 및 마이톡산트론을 포함한다.
예시적인 토포아이소머라아제 I 억제제는 캄프토테신, 캄프토테신 유도체, 캄프토테신 유사체 및 예를 들면 CPT-11(이리노테칸), SN-38, GI-147211C, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, 7-히드록시메틸 캄프토테신, 7-아미노메틸 캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, (20S)-캄프토테신, 루비테칸, 기마테칸, 카레니테신, 실라테칸, 루르토테칸, 엑사테칸, 디플로모테칸, 벨로테칸, 루르토테칸 및 S39625와 같은 비-자연형 캄프토테신을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 캄프토테신 화합물은, 예를 들면, J. Med. Chem., 29:2358-2363 (1986); J. Med. Chem., 23:554 (1980); J. Med. Chem., 30:1774 (1987)에 개시되어 있는 것들을 포함한다.
혈관형성 억제제는 MetAP2 억제제, VEGF 억제제, PIGF 억제제, VGFR 억제제, PDGFR 억제제, MetAP2 억제제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 VGFR 및 PDGFR 억제제는 소라페닙(Nexavar), 수니티닙(Sutent) 및 바탈라닙을 포함한다. 예시적인 MetAP2 억제제는, Rodeschini et al., J. Org. Chem., 69, 357-373, 2004 및 Liu, et al., Science 282, 1324-1327, 1998에 개시되어 있는 것과 같이, MetAP-2가 단백질로부터 NH2-말단 메티오닌을 제거하는 능력을 억제하는 푸마길라민을 포함하는 푸마길린 코어 구조를 포함하는 임의의 화합물을 의미하는 푸마길롤 유사체를 포함한다. "푸마길롤 유사체"의 비제한적인 예는 J. Org. Chem., 69, 357, 2004; J.Org. Chem., 70, 6870, 2005; 유럽 특허 출원 0 354 787; J. Med. Chem., 49, 5645, 2006; Bioorg. Med. Chem., 11, 5051, 2003; Bioorg. Med. Chem., 14, 91, 2004; Tet. Lett. 40, 4797, 1999; WO99/61432; 미국 특허 제6,603,812호; 제5,789,405호; 제5,767,293호; 제6,566,541호; 및 제6,207,704호에 개시되어 있다.
예시적인 세포 사이클 진행 억제제는, 예를 들면, BMS-387032 및 PD0332991와 같은 CDK 억제제; 예를 들면 GSK429286과 같은 Rho-키나아제 억제제; 예를 들면 AZD7762와 같은 체크포인트 키나아제 억제제; 예를 들면 AZD1152, MLN8054 및 MLN8237과 같은 오로라 키나아제 억제제; 예를 들면 BI 2536, BI6727(Volasertib), GSK461364, ON-01910(Estybon)과 같은 PLK 억제제; 및 예를 들면 SB 743921, SB 715992(ispinesib), MK-0731, AZD8477, AZ3146 및 ARRY-520과 같은 KSP 억제제를 포함한다.
예시적인 PI3K/m-TOR/AKT 신호전달 경로 억제제는 포스포이노시타이드 3-키나아제(PI3K) 억제제, GSK-3 억제제, ATM 억제제, DNA-PK 억제제 및 PDK-1 억제제를 포함한다.
예시적인 PI3 키나아제 억제제는 미국 특허 제6,608,053호에 개시되어 있으며, BEZ235, BGT226, BKM120, CAL101, CAL263, 데메톡시비리딘, GDC-0941, GSK615, IC87114, LY294002, 팔로미드 529, 페리포신, PI-103, PF-04691502, PX-866, SAR245408, SAR245409, SF1126, 워트만닌, XL147 및 XL765를 포함한다.
예시적인 AKT 억제제는 AT7867을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 MAPK 신호전달 경로는 MEK, Ras, JNK, B-Raf 및 p38 MAPK 억제제를 포함한다.
예시적인 MEK 억제제는 미국 특허 제7,517,994호에 개시되어 있으며, GDC-0973, GSK1120212, MSC1936369B, AS703026, RO5126766 및 RO4987655, PD0325901, AZD6244, AZD 8330 및 GDC-0973을 포함한다.
예시적인 B-raf 억제제는 CDC-0879, PLX-4032 및 SB590885을 포함한다.
예시적인 B p38 MAPK 억제제는 BIRB 796, LY2228820 및 SB 202190을 포함한다.
수용체 티로신 키나아제(RTK)는 종종 암 세포 및 혈관신생의 비조절된 증식을 자극하는 신호전달 경로와 연관되는 세포 표면 수용체이다. 상기 수용체의 구성적(constitutive) 활성화를 유도하는 과발현 또는 돌연변이를 갖는 많은 RTK가 동정되어 있으며, VEGFR, EGFR, FGFR, PDGFR, EphR 및 RET 수용체 패밀리 수용체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 구체적인 RTK 표적은 ErbB2, FLT-3, c-Kit 및 c-Met를 포함한다.
예시적인 ErbB2 수용체(EGFR 패밀리)의 억제제는 AEE788(NVP-AEE 788), BIBW2992, (Afatinib), 라파티닙, 에를로티닙(Tarceva) 및 게피티닙(Iressa)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
하나 이상의 신호전달 경로(다중표적화 키나아제 억제제)를 표적화하는 예시적인 RTK 억제제는 FGFR, FLT-3, VEGFR-PDGFR 및 Bcr-Abl 수용체를 표적화하는 AP24534(Ponatinib); FLT-3 및 VEGFR-PDGFR 수용체를 표적화하는 ABT-869(Linifanib); VEGFR-PDGFR, Flt-1 및 VEGF 수용체를 표적화하는 AZD2171; VEGFR-PDGFR, FGFR, Flt-3 및 c-Kit 수용체를 표적화하는 CHR-258(Dovitinib); VEGFR, PDGFR, KIT, FLT-3 및 CSF-IR을 표적화하는 수니티닙(Sutent); VEGFR, PDGFR 뿐만 아니라 Raf/Mek/E가 경로에서의 세포내 세린/트레오닌 키나아제를 표적화하는 소라페닙(Nexavar)을 포함한다.
예시적인 단백질 샤페론 억제제는 HSP90 억제제를 포함한다. 예시적인 HSP90 억제제는 17AAG 유도체, BIIB021, BIIB028, SNX-5422, NVP-AUY-922 및 KW-2478을 포함한다.
예시적인 HDAC 억제제는 벨리노스탯(PXD101), CUDC-101, 드록시노스탯, ITF2357(Givinostat, Gavinostat), JNJ-26481585, LAQ824(NVP-LAQ824, Dacinostat), LBH-589(Panobinostat), MC1568, MGCD0103(Mocetinostat), MS-275(Entinostat), PCI-24781, 피록사마이드(NSC 696085), SB939, 트리코스타틴 A 및 보리노스탯(SAHA)을 포함한다.
예시적인 PARP 억제제는 이니파립(BSI 201), 올라파립(AZD-2281), ABT-888(Veliparib), AG014699, CEP 9722, MK 4827, KU-0059436(AZD2281), LT-673, 3-아미노벤즈아미드, A-966492 및 AZD2461을 포함한다.
예시적인 Wnt/Hedgehog 신호전달 경로 억제제는 비스모데깁(RG3616/GDC-0449), 시클로파민(11-데옥소제르빈)(Hedgehog 경로 억제제) 및 XAV-939(Wnt 경로 억제제)를 포함한다.
예시적인 RNA 중합효소 억제제는 아마톡신을 포함한다. 예시적인 아마톡신은 -아마니틴, -아마니틴, -아마니틴, -아마니틴, 아마눌린, 아마눌산, 아마니나마이드, 아마닌 및 프로아마눌린을 포함한다.
예시적인 단백질 합성 억제제는 트리코테센 화합물을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 약물은 토포아이소머라아제 억제제(예컨대, 예를 들면, 비-자연형 캄프토테신 화합물), 빈카 알칼로이드, 키나아제 억제제(예컨대, PI3 키나아제 억제제(GDC-0941 및 PI-103)), MEK 억제제, KSP 억제제, RNA 중합효소 억제제, 단백질 합성 억제제, PARP 억제제, 도세탁셀, 파클리탁셀, 독소루비신, 두오카마이신, 오리스타틴, 돌라스타틴, 칼리키아마이신, 토포테칸, SN38, 캄프토테신, 엑사테칸, 네모루비신 및 그의 유도체, PNU-159682, CC1065, 엘리나파이드, 트리코테센, 피롤로벤조디아제핀, 메이탄시노이드, DNA-결합 약물 또는 백금 화합물 및 그의 유사체이다. 구체적인 구현예에서, 상기 약물은 SN-38의 유도체, 캄프토테신, 토포테칸, 엑사테칸, 칼리키아마이신, 엑사테칸, 네모루비신, PNU-159682, 안트라사이클린, 메이탄시노이드, 탁산, 트리코테센, CC1065, 엘리나파이드, 빈데신, 빈블라스틴, PI-103, AZD 8330, 돌라스타틴, 오리스타틴 E, 오리스타틴 F, 두오카르마이신 화합물, 이스피네십, 피롤로벤조디아제핀, ARRY-520 및 그의 입체이성질체, 등배전자체 및 유사체이다.
다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 약물은, 예를 들면, PI3 키나아제 억제제 및 MEK 억제제; 넓은 스펙트럼의 세포독성 화합물 및 백금 화합물; PARP 억제제 및 백금 화합물; 넓은 스펙트럼의 세포독성 화합물 및 PARP 억제제와 같은 2 이상 약물의 조합이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 약물은 오리스타틴 F-히드록시프로필아미드-L-알라닌이다.
한 구현예에서, 상기 빈카 알칼로이드는 식 (V)의 화합물이다:
Figure pat00032
상기에서, R14는 수소, -C(O)-C1-3 알킬 또는 -C(O)-클로로 치환된 C1-3 알킬이고;
R15는 수소, -CH3 또는 -CHO이고;
R17 및 R18이 독립적으로 취해질 때, R18은 수소이고, R16 또는 R17 중 하나는 에틸이고 다른 하나는 히드록실이며,
R17 및 R18이 이들이 부착된 탄소와 함께 취해져서 옥시란 고리를 형성할 때, R16은 에틸이고;
R19는 수소, OH, 아미노기, 알킬 아미노 또는 -[C(R20R21)]a-R22이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록실화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의(membered) 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 헤테로시클릭 모이어티를 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
빈카 알칼로이드의 추가적인 예는 US8524214B2 및 US2002/0103136에 개시되어 있다.
한 구현예에서, 식 (V)의 빈카 알칼로이드는 식 (VI)의 화합물이다:
Figure pat00033
상기에서, R40은 수소, -OH, -NH2, 또는 다음의 구조들 중 임의의 하나이고:
Figure pat00034
Figure pat00035
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
g는 2 내지 6의 정수이고; 및
c는 0 내지 3의 정수이다.
한 구현예에서, 식 (VI)에서, R40은
Figure pat00036
이다.
다른 구현예에서, R40은
Figure pat00037
이다.
다른 구현예에서, 식 (VI)의 화합물은 식 (VIa), (VIb), (VIc) 또는 (VId)의 화합물이다:
Figure pat00038
Figure pat00039
Figure pat00040
Figure pat00041
다른 구현예에서, 상기 토포아이소머라아제 억제제는 식 (VII)의 캄프토테신 화합물이다:
Figure pat00042
상기에서, R24는 -H, -Cl, -F, -OH 또는 알킬이고; 또는 R24 및 R25는 함께 취해져서 선택적으로 치환된 5- 또는 6-원의 고리를 형성할 수 있고;
R25는 -H, -F, -OH, -CH3, -CH=N-O-t-부틸, -CH2CH2Si(CH3)3, -Si((CH3)2)-t-부틸, -O-C(O)-R29;
R29는 -NH2, -R28-C1-6 알킬-R22, 5 내지 12-원의 헤테로시클로알킬, R28-C5-12 헤테로시클로알킬-C1-6 알킬-R22 또는 -R28-C1-6 알킬-C6-12 아릴-C1-6 알킬-R22; 또는 R29는 본 명세서에 정의된 것과 같은 R47이고;
R26은 -H, -CH2-N(CH3)2, NH2 또는 NO2이고;
R27은 -H, 에틸, N-메틸피페리딘, 시클로알킬, -CH2OH, -CH2CH2NHCH(CH3)2 또는 -N-4-메틸시클로헥실아민이고
R79는 -H 또는 -C(O)-R28-[C(R20R21)]a-R22이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록실화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
또는 R26 및 R27은 이들이 부착되는 2개의 탄소 원자 및 상기 2개의 탄소 원자를 결합시키는 3번째 탄소 원자와 함께 취해져서 선택적으로 치환된 6-원의 고리를 형성하고;
R28은 없거나, NH 또는 산소이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고;
f는 1 내지 12의 정수이고;
u는 0 또는 1의 정수이고;
w는 0 또는 1의 정수이고; 및
식 (VII)의 화합물은 적어도 하나의 R29 및 R79를 함유해야 한다.
한 구현예에서, 식 (VII)의 캄프토테신 화합물은 식 (VIII), (VIIIa)또는 (VIIIb), 또는 식 (XXV) 또는 (XXVa)의 화합물이다:
Figure pat00043
Figure pat00044
Figure pat00045
상기에서, R30은 -NH2, -R28-[C(R20R21)]a-R22, -R28-C1-6 알킬-R22, 5 내지 12-원의 헤테로시클로알킬; R28-C5-12 헤테로시클로알킬-C1-6 알킬-R22 또는 -R28-C1-6 알킬-C6-12 아릴-C1-6 알킬-R22이고;
R28은 없거나, NH 또는 산소이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록실화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O-CH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
일부 구현예에서, R30은 다음 구조의 임의의 하나이다:
Figure pat00046
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고; 및
g는 2 내지 6의 정수이다.
한 구현예에서, 식 (VII)에서, R30은
Figure pat00047
이다.
다른 구현예에서, 식 (VII)의 화합물은 식 (VIIa), (VIIb), (VIIc), (VIId), (VIIe) 또는 (VIIf)의 화합물이다:
Figure pat00048
Figure pat00049
다른 구현예에서, 상기 PI3 키나아제 억제제는 식 (IX)의 화합물이다:
Figure pat00050
상기에서, R47은 아미노기, -R9-[C(R20R21)]a-R10, -R9-C5-12 헤테로시클로알킬-C1-6 알킬-R10, 5 내지 12-원의 헤테로시클로알킬 또는 -R9-C6-10 아릴이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록실화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R10은 -OH, -NHR83, -N-(R83)R11, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23), -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77 또는 -R82-C(O)-[C(R20R21)]a-R82-R83이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
R9는 없거나, N-(R83) 또는 산소이고;
R83은 수소 또는 CH3이고;
R11은
Figure pat00051
이고,
각각의 R12는 독립적으로 수소, 클로라이드, -CH3 또는 -OCH3이고;
R13은 수소 또는 -C(O)-(CH2)d-(O-CH2-CH2)f-NH2이고;
R82는 -NH 또는 산소이고;
X4는 리신, 아르기닌, 시트룰린, 알라닌 또는 글리신의 측쇄이고;
X5는 페닐알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신 또는 트립토판의 측쇄이고;
각각의 X6 및 X7은 독립적으로 글리신, 알라닌, 세린, 발린 또는 프롤린의 측쇄이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고;
f는 1 내지 12의 정수이고; 및
각각의 u는 독립적으로 0 또는 1의 정수이고;
또는 R11은 -Yu-Wq-R88이고;
상기에서, Y는 다음 구조 중 임의의 하나이고:
Figure pat00052
이들 각각에서 Y의 말단 NR83 기는 R88에 인접하고;
R83은 수소 또는 CH3이고;
각각의 W는 아미노산 단위이고;
각각의 R12'는 독립적으로 할로겐, -C1-8 알킬, -O-C1-8 알킬, 니트로 또는 시아노이고;
R88은 수소 또는 -C(O)-(CH2)ff-(NH-C(O))aa-Ej-(CH2)bb-R85이고;
R85는 NH2 또는 OH이고;
E는 -CH2- 또는 -CH2CH2O-이고;
u는 0 또는 1의 정수이고;
*q는 0 내지 12의 정수이고;
aa는 0 또는 1의 정수이고;
bb는 0 또는 2의 정수이고;
ff는 0 내지 10의 정수이고;
h는 0 내지 4의 정수이고;
j는 0 내지 12의 정수이고; 및
E가 -CH2-일 때, bb는 0이고, j는 0 내지 10의 정수이며; 및 E가 -CH2CH2-O-일 때, bb는 2이고, j는 1 내지 12의 정수이며;
또는 R11은
Figure pat00053
이다;
상기에서, R83은 수소 또는 CH3이고;
R84는 C1-6 알킬 또는 C6-10 아릴이고;
각각의 R12'는 독립적으로 할로겐, -C1-8 알킬, -O-C1-8 알킬, 니트로 또는 시아노이고;
h는 0 내지 4의 정수이고; 및
u는 0 또는 1의 정수이다.
일부 구현예에서, R11은
Figure pat00054
이다:
상기에서, 각각의 R12'는 독립적으로 클로라이드, -CH3 또는 -OCH3이고;
R88은 수소 또는 -C(O)-(CH2)ff-(CH2-CH2O)j-CH2-CH2-NH2이고;
R82는 -NH 또는 산소이고;
X4는 리신, 아르기닌, 시트룰린, 알라닌 또는 글리신의 측쇄이고;
X5는 페닐알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신 또는 트립토판의 측쇄이고;
각각의 X6 및 X7은 독립적으로 글리신, 알라닌, 세린, 발린 또는 프롤린의 측쇄이고;
ff는 1 내지 3의 정수이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
h는 0 내지 4의 정수이고; 및
각각의 u는 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.
일부 구현예에서,
Figure pat00055
는 시트룰린-발린; 리신-페닐알라닌; 시트룰린-페닐알라닌; 시트룰린-루이신; 시트룰린-발린-글리신-글리신; 글리신-페닐알라닌-글리신-글리신; 발린; 프롤린; 루이신 또는 이소루이신이다.
다른 구현예에서, R11은 다음 구조의 임의의 하나이다:
Figure pat00056
Figure pat00057
Figure pat00058
일부 구현예에서, R47은 다음 구조의 임의의 하나이다:
Figure pat00059
Figure pat00060
Figure pat00061
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고; 및
g는 2 내지 6의 정수이다.
다른 구현예에서, 상기 오리스타틴은 식 (X)의 화합물이다:
Figure pat00062
상기에서, 각각의 R31 및 R32는 독립적으로 수소 또는 C1-8 알킬이고, R31 및 R32 중 최대 하나는 수소이며;
R33은 수소, C1-8 알킬, C3-8 카르보사이클, C6-10 아릴, C1-8 알킬-C6-10 아릴, X1-(C3-8 카르보사이클), C3-8 헤테로사이클 또는 X1-(C3-8 헤테로사이클)이고;
R34는 수소, C1-8 알킬, C3-8 카르보사이클, C6-10 아릴, X1-C6-10 아릴, X1-(C3-8 카르보사이클), C3-8 헤테로사이클 또는 X1-(C3-8 헤테로사이클)이고;
R35는 수소 또는 메틸이고;
또는 R34 및 R35는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 식 -(CR55R41)b-를 갖는 카르보사이클릭 고리를 형성하며, 이때 각각의 R55 및 R41은 독립적으로 수소 또는 C1-8 알킬이고, b는 3 내지 7의 정수이며;
R36은 수소 또는 C1-8 알킬이고;
R37은 수소, C1-8 알킬, C3-8 카르보사이클, C6-10 아릴, -X1-C6-10 아릴, -X1-(C3-8 카르보사이클), C3-8 헤테로사이클 또는 -X1-(C3-8 헤테로사이클)이고;
각각의 R38은 독립적으로 수소, OH, C1-8 알킬, C3-8 카르보사이클 또는 O-(C1-8 알킬)이고;
R53은
Figure pat00063
또는 R54이고;
R39는 H, C1-8 알킬, C6-10 아릴, -X1-C6-10 아릴, C3-8 카르보사이클, C3-8 헤테로사이클, -X1-C3-8 헤테로사이클, -C1-8 알킬렌-NH2 또는 (CH2)2SCH3이고;
각각의 X1은 독립적으로 C1-10 알킬렌 또는 C3-10 시클로알킬렌이고;
R44는 수소 또는 C1-8 알킬이고;
R45는 X3-R42 또는 NH-R19이고;
X3은 O 또는 S이고;
R19는 수소, OH, 아미노기, 알킬 아미노 또는 -[C(R20R21)]a-R22이고;
R42는 아미노기, C1-6 알킬 아미노 또는 -[C(R20R21)]a-R22이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록실화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
R54는 -C(R56)2--C(R56)2-C6-10 아릴, -C(R56)2--C(R56)2-C3-8 헤테로사이클 또는 -C(R56)2--C(R56)2-C3-8 카르보사이클이고;
R56은 독립적으로 H, OH, C1-8 알킬, C3-8 카르보사이클, -O-C1-8 알킬, -O-C(O)-R29 및 -O-R23-O-C1-6 알킬-NH2로부터 선택되고;
R29는 아미노기, 5 내지 12-원의 헤테로시클로알킬, -R28-C1-6 알킬-R22, R28-C5-12 헤테로시클로알킬-C1-6 알킬-R22, -[C(R20R21)]a-R22 또는 -R28-C1-6 알킬-C6-12 아릴-C1-6 알킬-R22이고; 또는 R29는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 R47이고;
R28은 없거나, NH 또는 산소이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
일부 구현예에서, 식 (X)의 오리스타틴 화합물에서,
R39는 벤질 또는
Figure pat00064
이고; 및
R44는 수소이다.
다른 구현예에서, 상기 오리스타틴은 식 (Xa)의 화합물이다:
Figure pat00065
상기에서, R33 내지 R38 및 R44는 본 명세서에서 정의된 것과 같고;
R31 및 R32 중 하나는 수소 또는 C1-8 알킬이고 다른 하나는
Figure pat00066
이며;
상기에서, R83은 수소 또는 CH3이고;
R84는 C1-6 알킬 또는 C6-10 아릴이고;
각각의 R12'는 독립적으로 할로겐, -C1-8 알킬, -O-C1-8 알킬, 니트로 또는 시아노이고;
h는 0 내지 4의 정수이고; 및
u는 0 또는 1의 정수이고;
R53은
Figure pat00067
또는 R54이고;
R39는 H, C1-8 알킬, C6-10 아릴, -X1-C6-10 아릴, C3-8 카르보사이클, C3-8 헤테로사이클, -X1-C3-8 헤테로사이클, -C1-8 알킬렌-NH2 또는 (CH2)2SCH3이고;
각각의 X1은 독립적으로 C1-10 알킬렌 또는 C3-10 시클로알킬렌이고;
R45는 X3-R42 또는 NH-R19이고;
X3은 O 또는 S이고;
R19는 수소, OH, 아미노기, 알킬 아미노 또는 -[C(R20R21)]a-R22이고;
R42는 H, 아미노기, C1-6 알킬 아미노 또는 -[C(R20R21)]a-R22이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록시화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
R54는 -C(R56)2--C(R56)2-C6-10 아릴, -C(R56)2--C(R56)2-C3-8 헤테로사이클 또는 -C(R56)2--C(R56)2-C3-8 카르보사이클이고;
R56은 독립적으로 H, OH, C1-8 알킬, C3-8 카르보사이클, -O-C1-8 알킬, -O-C(O)-R29 및 -O-R23-O-C16 알킬-NH2로부터 선택되고;
R29는 아미노기, 5 내지 12-원의 헤테로시클로알킬, -R28-C1-6 알킬-R22, R28-C5-12 헤테로시클로알킬-C1-6 알킬-R22, -[C(R20R21)]a-R22 또는 -R28-C1-6 알킬-C6-12 아릴-C1-6 알킬-R22이고; 또는 R29는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 R47이며;
R28은 없거나, H 또는 산소이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
한 구현예에서, 식 (Xa)의 오리스타틴 화합물은 식 (XIa) 또는 식 (XIb)의 화합물이다:
Figure pat00068
상기에서, R92는
Figure pat00069
이고;
R83은 수소 또는 CH3이다.
한 구현예에서, 식 (X)의 오리스타틴은 식 (XI), 식 (XII) 또는 식 (XIII)의 화합물이다:
상기에서, 식 (XI)의 화합물은
Figure pat00070
이다:
상기에서, R42는 -CH3 또는 다음 구조의 임의의 하나이다:
Figure pat00071
Figure pat00072
Figure pat00073
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고; 및
g는 2 내지 6의 정수이다;
상기에서, 식 (XII)의 화합물은
Figure pat00074
이다:
상기에서, R40은 수소, -OH, -NH2 또는 임의의 다음 구조이다:
Figure pat00075
Figure pat00076
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
g는 2 내지 6의 정수이고; 및
c는 0 내지 3의 정수이다;
상기에서, 식 (XIII)의 화합물은
Figure pat00077
이다:
상기에서, R29는 아미노기, 5 내지 12-원의 헤테로시클로알킬, -R28-C1-6 알킬-R22, R28-C5-12 헤테로시클로알킬-C1-6 알킬-R22, -R28-[C(R20R21)]a-R22 또는 -R28-C1-6 알킬-C6-12 아릴-C1-6 알킬-R22이고; 또는 R29는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 R47이며;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록실화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
R28은 없거나, NH 또는 산소이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
한 구현예에서, 식 (XII)에서, R40은
Figure pat00078
이다.
다른 구현예에서, 식 (XII)의 화합물은 식 (XIIb) 또는 (XIIc)의 화합물이다:
Figure pat00079
한 구현예에서, 식 (XIII)의 화합물에서, R29는 -NH2, 5-원의 헤테로시클로알킬, -R28-C1-6 알킬-R22, R28-C5-12 헤테로시클로알킬-C1-6 알킬-R22 또는 -R28-C1-6 알킬-C6-12 아릴-C1-6 알킬-R22이고; 또는 R29는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 R47이며;
R28은 없거나, NH 또는 산소이고;
R22는 -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬; -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
또 다른 구현예에서, R29는 다음 구조의 적어도 하나이다:
Figure pat00080
Figure pat00081
Figure pat00082
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고; 및
g는 2 내지 6의 정수이다.
한 구현예에서, 한 구현예에서, 상기 MEK 억제제는 식 (XIV)의 화합물이다:
Figure pat00083
상기에서, R43은 H 또는 -R46-R47이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록실화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
R46은 -C(O)-; -C(O)-O-, -C(O)-NH이거나, 없고;
R47은 본 명세서에서 정의된 것과 같고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
MEK 억제제의 추가적인 예는 US7,517,994B2에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, R43은 -C(O)-(CH2)a-NH2 또는 -C(O)-C(H)(CH3)-(CH2)c-NH2이다: 상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고; 및 c는 0 내지 3의 정수이다.
다른 구현예에서, 상기 두오카르마이신 화합물은 식 (XV)의 화합물이다:
Figure pat00084
상기에서, R47은 본 명세서에서 정의된 것과 같고;
R48은 수소, -COOC1-6 알킬, -COOH, -NH2 또는 -CH3이고;
R49는 Cl, Br 또는 -OH이고;
R50은 수소, -OCH3,
Figure pat00085
이고;
각각의 R51 및 R52는 독립적으로 수소 또는 -OCH3이고; 및
고리 AA는 페닐 또는 피롤릴 고리 중 하나이다.
두오카르마이신 화합물의 추가적인 예는 US7,553,816에 개시되어 있다.
한 구현예에서, 식 (XV)의 두오카르마이신 화합물은 식 (XVI), (XVII), (XVIII) 또는 (XIX)의 화합물이다:
Figure pat00086
Figure pat00087
Figure pat00088
상기에서, R49는 Cl, Br 또는 -OH이고; 및
R47은 본 명세서에서 정의된 것과 같다.
한 구현예에서, 상기 두오카르마이신 화합물은 식 (XX) 또는 (XXI)의 두오카르마이신 SA 화합물이다: US5,101,038;
Figure pat00089
상기에서, R42는 C1-6 알킬 아미노 또는 -[C(R20R21)]a-R22이고;
각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 히드록실화 C6-10 아릴, 폴리히드록시화 C6-10 아릴, 5 내지 12-원의 헤테로사이클, C3-8 시클로알킬, 히드록실화 C3-8 시클로알킬, 폴리히드록실화 C3-8 시클로알킬 또는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R22는 -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) 또는 -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77이고;
각각의 R23은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C3-8 시클로알킬, -COOH 또는 -COO-C1-6 알킬이고;
X2는 자연형 또는 비자연형 아미노산의 측쇄이고;
R77은 수소 또는 X2이고, NR77은 질소 함유 고리 화합물을 형성하며;
R82는 -NH 또는 산소이고;
a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고;
d는 1 내지 3의 정수이고; 및
f는 1 내지 12의 정수이다.
일부 구현예에서, R42는 다음 구조의 임의의 하나이다:
Figure pat00090
Figure pat00091
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
g는 2 내지 6의 정수이고; 및
c는 0 내지 3의 정수이다.
다른 구현예에서, 상기 KSP 억제제 화합물은 식 (XXVI)의 화합물이다:
Figure pat00092
상기에서, R30은 본 명세서에서 정의된 것과 같다.
일부 구현예에서, R30은
Figure pat00093
상기에서, a는 1 내지 6의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이고; 및
g는 2 내지 6의 정수이다.
다른 구현예에서, 상기 두오카르마이신 화합물은 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 B1, 두오카르마이신 B2, 두오카르마이신 C1, 두오카르마이신 C2, 두오카르마이신 D, CC-1065, 아도젤레신, 비젤레신 또는 카르젤레신이다.
다른 구현예에서, 상기 KSP 억제제 화합물은 식 (XXVII), (XXVIII) 또는 (XXIX)의 화합물이다:
Figure pat00094
상기에서, R11은 본 명세서에서 정의된 것과 같다.
치료제 기술분야의 기술자는 본 명세서에 개시된 각각의 치료제는 결과물인 화합물이 원래 화합물의 특이성 및/또는 활성을 여전히 유지하는 방식으로 변형될 수 있음이 즉시 이해할 것이다. 숙련된 기술자는 또한 많은 상기 화합물들이 본 명세서에 개시된 치료제 대신에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 치료제는 본 명세서에 개시된 화합물의 유사체 및 유도체를 포함한다.
하기 표 B는 본 발명의 폴리머-약물-단백질 접합체 또는 폴리머-약물-스캐폴드를 형성하기 위한 접합에 적합한 치료제 및 그의 유도체의 더 많은 예를 제공한다. 어떤 화합물의 스펙트럼 데이터가 또한 제공된다(표 내의 ND는 "결정되지 않았음"을 의미한다). 상기 예들은 또한 시험관내 또는 생체내에서 상기 접합체로부터 방출될 때 약물의 활성 형태일 수 있다.
[표 B]
Figure pat00095
Figure pat00096
Figure pat00097
Figure pat00098
Figure pat00099
Figure pat00100
Figure pat00101
단백질-기반의 인식 분자(PBRM)
단백질-기반의 인식 분자는 상기 약물-폴리머 담체 접합체를 세포 내에서 특정 조직, 세포 또는 위치로 향하게 한다. 상기 단백질-기반의 인식 분자는 배양물 또는 전체 유기체 또는 이들 모두에서 변형된 폴리머를 지향할 수 있다. 각각의 경우에 있어서, 상기 단백질-기반의 인식 분자는 효과적인 특이성, 친화도 및 결합활성(avidity)으로 결합하는 표적 세포(들)의 세포 표면에 존재하는 리간드를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 단백질-기반의 인식 분자는 상기 변형된 폴리머를 간 이외의 조직으로 표적화한다. 다른 구현예에서, 상기 단백질-기반의 인식 분자는 상기 변형된 폴리머를 간, 신장, 폐 또는 췌장과 같은 특정 조직으로 표적화한다. 상기 단백질-기반의 인식 분자는 상기 변형된 폴리머를 암 세포, 매트릭스 조직, 또는 종양 항원과 같이 암과 연관된 단백질과 같은 세포에 발현되는 수용체와 같은 암 세포와 같은 표적 세포로 표적화한다. 다른 한편으로, 종양 맥관구조(vasculature)를 포함하는 세포가 표적화될 수 있다. 단백질-기반의 인식 분자는 쿠퍼(Kupffer) 세포가 아니라 간에서 간세포로 특이적으로 표적화하는 것과 같이 상기 폴리머를 특정 유형의 세포로 인도할 수 있다. 다른 경우에 있어서, 단백질-기반의 인식 분자는 상기 폴리머를 세망 내피 또는 림프 시스템의 세포, 또는 대식세포 또는 호산구와 같은 전문화된 식세포로 인도할 수 있다(이 경우, 상기 폴리머는 특정 표적화에 대한 필요 없이 그 자체가 효과적인 운반 시스템일 수 있다).
또 다른 구현예에서, 상기 단백질 기반의 인식 분자는 상기 변형된 폴리머를 , 예를 들면, 핵, 세포질 또는 엔도좀과 같은 세포 내의 위치로 표적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 단백질 기반의 인식 분자는 수용체에 대한 세포 결합, 또는 핵으로의 세포질 운송 및 엔도좀 또는 다른 세포내 소포(vesicle)로부터 핵으로의 진입 또는 방출을 향상시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 단백질 기반의 인식 분자는 항체, 단백질 및 펩티드 또는 펩티드 모방체를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 단백질 기반의 인식 분자는 설프히드릴기를 포함하고, 상기 단백질 기반의 인식 분자는 상기 설프히드릴기와 폴리머의 작용기를 통한 공유 결합을 형성함으로써 상기 폴리머-약물 접합체에 접합된다.
예시적인 항체 또는 상기 세포 표면 마커에 특이적인 Fab, Fab2, scFv 또는 카멜 항체 중쇄 절편 유래의 항체는 5T4, AOC3, ALK, AXL, C242, CA-125, CCL11, CCR 5, CD2, CD3, CD4, CD5, CD15, CA15-3, CD18, CD19, CA19-9, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD30, CD31, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD74, CD79-B, CD80, CD125, CD138, CD141, CD147, CD152, CD 154, CD326, CEA, 응집 인자(clumping factor), CTLA-4, CXCR2, EGFR(HER1), ErbB2, ErbB3, EpCAM, EPHA2, EPHB2, EPHB4, FGFR(즉, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4), FLT3, 폴레이트 수용체, FAP, GD2, GD3, GPNMB, HGF, HER2, HER3, HMI.24, ICAM, ICOS-L, IGF-1 수용체, VEGFR1, EphA2, TRPV1, CFTR, gpNMB, CA9, Cripto, c-KIT, c-MET, ACE, APP, 아드레날린 수용체-베타2, 클라우딘 3, 메소텔린, MUC1, NaPi2b, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, RON, ROR1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-B4, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-13 수용체, 인테그린(α4,αv 3,αv 5,αv 6,α1 4,α4 1,α4 7,α5 1,α6 4,αIIb 3 인테그린을 포함함), IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE, IGF-1 수용체, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-22, IL-4, IL-5, IL-6, 인터페론 수용체, ITGB2(CD18), LFA-1(CD11a), L-셀렉틴(CD62L), 뮤신, MUC1, 마이오스타틴, NCA-90, NGF, PDGFRα, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, 슈도모나스 아데루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 광견병, RANKL, 호흡기 세포융합 바이러스, 레서스(Rhesus) 인자, SLAMF7, 스핑고신-1-포스페이트, TAG-72, T-세포 수용체, 테나신 C, TGF-1, TGF-2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR2, 비멘틴 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 항체 또는 세포 표면 마커에 특이적인 Fab, Fab2, scFv 또는 카멜 항체 중쇄 절편 유래의 항체는 CA-125, C242, CD3, CD19, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD37, CD40, CD44, CD51, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD138, CD141, CD326, CEA, CTLA-4, EGFR(HER1), ErbB2, ErbB3, FAP, 폴레이트 수용체, IGF-1 수용체, GD3, GPNMB, HGF, HER2, VEGF-A, VEGFR2, VEGFR1, EphA2, EpCAM, 5T4, TAG-72, 테나신 C, TRPV1, CFTR, gpNMB, CA9, Cripto, ACE, APP, PDGFRα, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, 아드레날린 수용체-베타2, 클라우딘 3, 뮤신, MUC1, 메소텔린, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-13 수용체 및 인테그린(v 3, v 5, v 6, 1 4, 4 1, 5 1, 6 4 인테그린을 포함함), 테나신 C, TRAIL-R2 및 비멘틴을 포함한다.
예시적인 항체는 3F8, 아바고보맙, 아브식시맙(REOPRO), 아달리무맙(HUMIRA), 아데카투무맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙, ALD518, 알렘투주맙(CAMPATH), 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아르시투모맙(CEA-SCAN), 아셀리주맙, 아틀리주맙(tocilizumab, Actemra, RoActemra), 아토롤리무맙, 바피네우주맙, 바실릭시맙(Simulect), 바비툭시맙, 벡투모맙(LYMPHOSCAN), 벨리무맙(BENLYSTA), 벤랄리주맙, 버틸리무맙, 베실레소맙(SCINITIMUN), 베카시주맙(AVASTIN), 비시로맙(FIBRISCINT), 비바투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 브리아키누맙, 카나키누맙(ILARIS), 칸투주맙, 카프로맙, 카투막소맙(REMOVAB), CC49, 세델리주맙, 세르톨리주맙, 세툭시맙(ERBITUX), 시타투주맙, 식수투주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙, 코나투무맙, CR6261, 데세투주맙, 다클리주맙(ZENAPAX), 다라투무맙, 데노수맙(PROLIA), 데투모맙, 도를리모맙, 도를릭시주맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙(SOLIRIS), 에도바코맙, 에드레콜로맙(PANOREX), 에팔리주맙(RAPTIVA), 에풍구맙(MYCOGRAB), 엘로투주맙, 엘실리모맙, 엔리모맙, 에피투모맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙(REXOMUN), 에타라시주맙(ABEGRIN), 엑스비비루맙, 파놀레소맙(NEUTROSPEC), 파랄리모맙, 파를레투주맙, 펠비주맙, 페자키누맙, 피기투무맙, 폰톨리주맙(HuZAF), 포라비루맙, 프레솔리무맙, 갈릭시맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 골리무맙(SIMPONI), 고밀릭시맙, 이발리주맙, 이브리투모맙, 이고보맙(INDIMACIS-125), 임시로맙(MYOSCINT), 인플릭시맙(REMICADE), 인테루무맙, 이놀리모맙, 이노투주맙, 이필리무맙, 이라투무맙, 켈릭시맙, 라베투주맙(CEA-CIDE), 레브리키주맙, 레말레소맙, 레르델리무맙, 렉사투무뭅, 리비비루맙, 린투주맙, 루카투무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙, 마슬리모맙, 마투주맙, 메폴리주맙(BOSATRIA), 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모롤리무맙, 모타비주맙(NUMAX), 무로모납-CD3(ORTHOCLONE OKT3), 나콜로맙, 납투모맙, 나탈리주맙(TYSABRI), 네바쿠맙, 네시투무맙, 네렐리모맙, 니모투주맙(THERACIM), 노페투모맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙(ARZERRA), 올라라투맙, 오말리주맙(XOLAIR), 온테시주맙, 오포르투주맙, 오레고보맙(OVAREX), 오텔릭시주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙(SYNAGIS), 파니투무맙(VECTIBIX), 파노바쿠맙, 파스콜리주맙, 펨투모맙(THERAGYN), 페르투주맙(OMNITARG), 펙셀리주맙, 핀투모맙, 프릴릭시맙, 프리투무맙, PRO 140, 라피비루맙, 라무시루맙, 라니비주맙(LUCENTIS), 락시바쿠맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙(RITUXAN), 로바투무맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙(LEUKARREST), 루플리주맙(ANTOVA), 사투모맙 펜데타이드, 세비루맙, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 시플리주맙, 솔라네주맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술래소맙(LEUKOSCAN), 타카투주맙(AFP-CIDE), 테트라세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 파프톡스, 테피바주맙(AUREXIS), 텔리모맙, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, TGN1412, 티실리무맙(트레멜리무맙), 티가투주맙, TNX-650, 토실리주맙(아틀리주맙, ACTEMRA), 토랄리주맙, 토시투모맙(BEXXAR), 트라스투주맙(HERCEPTIN), 트레멜리무맙, 투코투주맙, 투비루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙(STELERA), 바팔릭시맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 비실리주맙(NUVION), 볼로식시맙(HUMASPECT), 보투무맙, 잘루투무맙(HuMEX-EGFr), 자놀리무맙(HuMAX-CD4), 지랄리무맙 및 졸리모맙을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체는 5T4, CA-125, CEA, CD3, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD44, CD51, CTLA-4, EpCAM, HER2, EGFR (HER1), FAP, 폴레이트 수용체, HGF, 인테그린 αvβ3, 인테그린 α5β1, IGF-1 수용체, GD3, GPNMB, 뮤신, MUC1, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, PDGFRα, TAG-72, 테나신 C, TRAIL-R2, VEGF-A 및 VEGFR2에 대한 세포 표면 마커를 지향한다. 본 구현예에서, 상기 항체는 아바고보맙, 아데카투무맙, 알라시주맙, 알투모맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 베바시주맙(AVASTIN), 비바투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투주맙, 카투막소맙, 카프로맙, 세툭시맙, 시타투주맙, 클리바투주맙, 코나투무맙, 다세투주맙, 에드레콜로맙, 에프라투주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 파를레투주맙, 피기투무맙, 겜투주맙, 글렘바투무맙, 이비리투모맙, 이고보맙, 인테투무맙, 이노투주맙, 라베투주맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 루카투무맙, 마투주맙, 미투모맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 네시투무맙, 오포르투주맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 프리투무맙, 리툭시맙(RITUXAN), 릴로투무맙, 로바투무맙, 사투모맙, 시브로투주맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테나투모맙, 티실리무맙(트레멜리무맙), 티가투주맙, 트라스투주맙(HERCEPTIN), 토시투모맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀모레우킨, 볼로식시맙 및 잘루투무맙이다.
특정 구현예에서, HER2에 대한 세포 표면 마커를 지향하는 항체는 페르투주맙 또는 트라스투주맙이고, EGFR(HER1)의 경우에 상기 항체는 세툭시맙 또는 파니투무맙이며; 및 CD20의 경우에 상기 항체는 리툭시맙이고, VEGF-A의 경우에는 베바시주맙이며, CD-22의 경우에 상기 항체는 에프라투주맙 또는 벨투주맙이고, CEA의 경우에 상기 항체는 라베투주맙이다.
예시적인 펩티드 또는 펩티드 모방체는 인테그린 표적화 펩티드(RGD 펩티드), LHRH 수용체 표적화 펩티드, ErbB2(HER2) 수용체 표적화 펩티드, 전립선 특이적 막 결합 항원(prostate specific membrane bound antigen, PSMA) 표적화 펩티드, 리포단백질 수용체 LRP1 표적화, ApoE 단백질 유래 펩티드, ApoA 단백질 펩티드, 소마토스타틴 수용체 표적화 펩티드, 클로로톡신 유래 펩티드 및 봄베신을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 펩티드 또는 펩티드 모방체는 LHRH 수용체 표적화 펩티드 및 ErbB2(HER2) 수용체 표적화 펩티드이다.
예시적인 단백질은 인슐린, 트랜스페린, 피브리노겐-감마 절편, 트롬보스폰딘, 클라우딘, 아포리포단백질 E, 예를 들면, ABY-025, 안키린(ankyrin) 반복 단백질, 안키린-유사 반복 단백질 및 합성 펩티드와 같은 아피바디(Affibody) 분자를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 단백질-폴리머-약물 접합체는 퍼투주맙 또는 트라스투주맙과 같은 HER2에 대한 세포 표면 마커; 세툭시맙 및 파니투무맙과 같은 EGFR에 대한 세포 표면 마커; 라베투주맙과 같은 CEA에 대한 세포 표면 마커; 리툭시맙과 같은 CD20에 대한 세포 표면 마커; 베바시주맙과 같은 VEGF-A에 대한 세포표면 마커; 또는 에프라투주맙 또는 벨투주맙과 같은 CD-22에 대한 세포 표면 마커와 조합된 넓은 스펙트럼의 세포독소를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 단백질-폴리머-약물 접합체 또는 단백질-폴리머 접합체는, 예를 들면, 종양 세포 상의 EGF 수용체(EGFR) 및 T 세포 상의 CD3 및 CD28을 지향하는 양특이성 항체의 조합; 항체 또는 Fab, Fab2, scFv 또는 카멜 항체 중쇄 절편 유래의 항체 및 펩티드 또는 펩티드 모방체의 조합; 항체 또는 Fab, Fab2, scFv 또는 카멜 항체 중쇄 절편 및 단백질 유래의 항체의 조합; CD3 × CD19 및 CD28 × CD22 양특이성 항체와 같은 2가지 양특이성 항체의 조합과 같은 2 이상의 단백질 기반의 인식 분자의 조합을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 단백질-약물-폴리머 접합체 또는 단백질-폴리머 접합체는, 예를 들면, 트라스투주맙, 세툭시맙, 리툭시맙, 베카시주맙, 에프라투주맙, 벨투주맙, 라베투주맙, B7-H4, B7-H3, CA125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, c-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, c-Kit, MUC1 및 5T4와 같은 항원에 대한 항체인 단백질 기반의 인식 분자를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 단백질-약물-폴리머 접합체 또는 단백질-폴리머 접합체는, 예를 들면, 인간화 항-5T4 scFvFc 항체와 같은 5T4에 대한 항체인 단백질 기반의 인식 분자를 포함한다.
적합한 5T4 표적화 리간드 또는 면역글로불린의 예는 상업적으로 구입가능한 것들을 포함하며, 또는 US8,044,178, US8,309,094, US7,514,546, EP1036091(TroVax™으로 상업적으로 구입가능함, Oxford Biomedica), EP2368914A1, WO2013041687A1(Amgen), US2010/0173382 및 P. Sapra, et al., Mol. Cancer Ther. 2013, 12:38-47와 같은 특허 또는 비특허 문헌에 개시되어 있다. 항-5T4 항체는 2013년 9월 13일자로 출원된 미국 가출원 제61/877,439호 및 2013년 6월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,858호에 개시되어 있다. 각각의 특허 문헌 및 과학적 공개문헌의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "5T4 항원-결합 부분"이란 용어는 5T4 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 서열을 나타낸다. 예시적인 접합체에서, 상기 5T4 항원-결합 부분은 일반적으로 항-5T4 항체로부터 가공된 단일 사슬 scFv-Fc 형태를 포함한다. 단일-사슬 가변 절편(scFv-Fc)은 링커 펩티드로 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역과, 추가로 항체의 힌지(hinge) 영역 및 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역에 연결된 융합 단백질이다(서로 또는 다른 펩티드 서열과의 항체 부분들의 이러한 임의의 조합은 본 명세서에서 종종 "면역융합" 분자로 나타냄). 이러한 scFvFc 분자 내에서, 상기 scFv 섹션(section)은 링커 펩티드에 의해 상기 Fc 섹션의 N-말단에 C-말단이 연결될 수 있다.
상기 면역융합 분자의 5T4 항원-결합 부분의 적어도 일부는 뮤린(murine) 공급원으로부터 기원될 수 있다. 예를 들면, 적어도 서열번호 1에 따른 폴리펩티드 서열을 갖는 뮤린 항-5T4 scFv 영역을 암호화하도록 가공된 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 면역융합 분자를 입수할 수 있다(예컨대, 2013년 6월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,858호 참조). 추가적으로, 상기 5T4-항원 결합 부분의 적어도 일부는 잘 알려진 방법에 따라 키메라 또는 인간화로 생성될 수 있다. Borras et al., J. Biol. Chem. 2010 Mar 19;285(12)9054-66 참조. 따라서, 적어도 서열번호 2에 따른 폴리펩티드 서열을 암호화하도록 가공된 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 인간화 scFv 부분과 5T4-항원 결합 부분을 갖는 면역융합 분자를 입수할 수 있다(예컨대, 2013년 6월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,858호 참조).
일부 예에서, 상기 5T4 항원-결합 부분의 Fv 부분은 VH 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하기 위하여 잘 알려진 분자생물학 기술에 의해 가공될 수 있다. 상기 5T4 항원 결합 부분의 Fc 부분은 바람직하게는 항-5T4 항체의 인간 힌지, CH2 및 CH3 영역으로부터 가공된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 적어도 서열번호 3에 따른 폴리펩티드 서열을 갖는 Fc 부분을 암호화하도록 폴리뉴클레오티드를 가공하는 것이 가능하다(예컨대, 2013년 6월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,858호 참조).
단일 사슬 Fv 및 Fc 영역이 서로 결합된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4에 따른 폴리펩티드 서열을 갖는 접합체의 적어도 키메라 5T4 항원-결합 부분을 암호화할 수 있거나, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 따른 폴리펩티드 서열을 갖는 인간화 5T4 항원-결합 부분을 암호화할 수 있다.
폴리펩티드 서열 ASTC(서열번호 7) 또는 ASTX(서열번호 8)("X"는 임의의 아미노산 또는 인접한 아미노산들 사이의 직접적인 펩티드 결합을 나타냄)를 갖는 것과 같은 폴리펩티드 링커는 scFv 부분의 C-말단을 5T4 항원-결합 부분의 Fc 부분의 N-말단에 융합시킬 수 있다. 따라서, 적어도 서열번호 7 또는 서열번호 8에 따른 폴리펩티드 서열을 갖는 링커를 암호화하도록 폴리뉴클레오티드를 가공하는 것이 가능하다. 서열번호 7 또는 서열번호 8 중 하나가 링커로 사용될 수 있지만, 서열번호 7에 따른 펩티드 링커를 갖는 면역융합 분자가 시스테인 잔기의 존재로 인한 위치-특이적 접합으로부터 이점이 있다.
바람직하게는, 임의의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실 또는 펩티드모방체의 사용은 상기 5T4 항원-결합 부분의 친화도 및 특이성을 실질적으로 감소시키지 않는다. 상기 5T4 항원-결합 부분 내에 아미노산 치환, 삽입 또는 결실 또는 펩티드모방체를 갖는 면역융합 분자는 비변형된 5T4-항원 결합 부분과의 접합체와 비교하여 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 또는 바람직하게는 95% 이상의 5T4 항원의 결합에 대한 친화도 및 특이성을 유지한다.
항-5T4 단일 사슬 항체-Fc 융합 단백질("항-5T4 scFv-Fc")은 2013년 6월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,858호에 개시된 것과 같이 CHO DG44 세포에서 제조되었다.
서열번호 1: 5T4-특이적 뮤린 scFv:
EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
서열번호 2: 5Y4-특이적 인간화 scFv:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
서열번호 3: 인간 힌지-CH2-CH3(Fc감마1)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 7: 위치-특이적 접합-1: ASTC
서열번호 8: 위치-특이적 접합-1 없음: ASTX
서열번호 4: 키메라 항-5T4 scFv-Fc:
EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTCEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 5: 인간화 항-5T4 scFv-Fc(ASTC)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTCEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 6: 인간화 항-5T4 scFv-Fc(ASTX)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTXEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
상기 항체는 재조합적으로, 합성적으로, 또는 본 기술분야에 알려진 다른 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법 및 구조체는 본 명세서에서 확인된 폴리펩티드 및 펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열을 이용한다. 다른 한편으로, 항체 생산을 위한 이러한 방법 및 구조체는 자연적으로 또는 인공적으로 변형된 서열, 예컨대 본 명세서에서 제공된 서열번호(예컨대, 서열번호 1)의 자연적 변형체 또는 코돈 최적화된 변형체를 이용한다. 다양한 코돈 최적화 시키마(schema)는 본 기술분야에 알려져 있다. 예컨대, 웹-기반의 최적화 방법인 UpGene™ 및 Optimizer™ 참조. 추가적으로, 다수의 상업적 기관들이 사유적 시크마, 예컨대, 다른 것들 중에서도 SignGen Laboratories, DNA2.0, OpenX를 이용한 코돈 최적화를 수행한다.
본 명세서에 개시된 상기 표적화 리간드, 링커 및 약물 또는 전구약물 절편은, 예를 들면, 상기 개시된 기술 및 방법에 따라 본 발명의 치료용 약물 및 표적화 접합체 내로 조립될 수 있다. 본 발명의 치료용 및 표적화 접합체 및 그의 제조 방법은 비-제한적인 예로서 아래에 개시된다.
접합체 또는 폴리머성 스캐폴드
본 발명의 접합체는 하나 이상의 D의 존재를 포함하며, 상기 D는 치료제, 예컨대 약물이고, 상기 하나 이상의 D의 존재는 동일하거나 상이할 수 있다.
어떤 다른 구현예에서, 하나 이상의 PBRMN의 존재는 상기 폴리머성 담체에 부착되며, 상기 하나 이상의 PBRM의 존재는 동일하거나 상이할 수 있다. 어떤 다른 구현예에서, 하나 이상의 D의 존재를 함유하는 하나 이상의 폴리머 담체는 PBRM(예컨대, 항체)에 결합된다.
상기에서 보다 일반적으로 논의된 것과 같이, 어떤 구현예에서, 각각의 폴리머성 담체는 독립적으로 약 0.1% 내지 약 25%, 보다 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 20%, 보다 바람직하게는 약 1% 내지 약 15%, 보다 더 바람직하게는 약 2% 내지 약 10%의 D를 포함하는 모노머를 갖는다. 예를 들면, 상기 폴리머성 담체는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa의 분자량을 갖는 PHF이고, 약 0.3% 내지 약 15%, 보다 바람직하게는 2%-12%, 보다 바람직하게는 약 5%-10%의 오리스타틴 F를 포함하는 모노머를 갖는다.
어떤 구현예에서, D가 다양한 범위의 세포주에서 항증식성 활성에 대해 IC50<10 pM을 가질 때, 상기 폴리머성 담체는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa의 분자량을 갖는 PHF이고, 약 0.1% 내지 약 25%, 보다 바람직하게는 약 2%-10%, 보다 바람직하게는 약 2%-5%의 D를 포함하는 모노머를 갖는다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 식 (Id)를 갖는다:
Figure pat00102
상기에서, 각각의 D의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이고, D 및 카르보닐기 사이의
Figure pat00103
는 D가 상기 카르보닐기에 직접 또는 간접적으로 부착됨을 나타내며,
m1은 1 내지 약 140의 정수이고, 및
m7은 1 내지 약 40의 정수이며, m1 및 m7의 합은 m6(즉, 2 내지 약 180)이다.
한 구현예에서, D는 (a)는 오리스타틴 화합물; (b) 칼리키아마이신 화합물; (c) 두오카르마이신 화합물; (d) 토포아이소머라아제 억제제; (e) 피롤로벤조디아제핀 화합물; (f) 빈카 화합물; (g) 단백질 합성 억제제; (h) RNA 중합효소 억제제; (i) 튜불린 결합 화합물; 또는 그의 유사체이다.
어떤 구현예에서, D는 (a) 오리스타틴 화합물; (b) 칼리키아마이신 화합물; (c) 두오카르마이신 화합물; (d) 캄프토테신 화합물; (e) 피롤로벤조디아제핀 화합물; (f) 빈카 화합물; 또는 그의 유사체이다.
예를 들면, 상기 오리스타틴 화합물은 오리스타틴, 돌라스타틴, 모노메틸오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸오리스타틴 F(MMAF), 오리스타틴 F, AF HPA, 페닐렌디아민(AFP)이다.
예를 들면, 상기 두오카르마이신 또는 그의 유사체는 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 B1, 두오카르마이신 B2, 두오카르마이신 C1, 두오카르마이신 C2, 두오카르마이신 D, 두오카르마이신 SA, CC-1065, 아도젤레신, 비젤레신, 또는 카르젤레신이다.
예를 들면, 상기 캄프토테신 화합물은 캄프토테신, CPT-11(이리노테칸), SN-38, 또는 토포테칸이다.
예를 들면, 상기 피롤로벤조디아제핀 화합물은 피롤로벤조디아제핀 모노머, 대칭적 피롤로벤조디아제핀 다이머 또는 비대칭적 피롤로벤조디아제핀 다이머이다.
식 (Id)의 폴리머-약물 접합체는 약 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상; 180 kDa 이상; 또는 200 kDa 이상, 또는 약 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 또는 100-140 kDa)의 분자량을 갖는 PBRM과의 접합에 유용하다.
예를 들면, 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상, 80 kDa 이상, 100 kDa 이상, 120 kDa 이상, 140 kDa 이상, 160 kDa 이상 또는 180 kDa 이상)의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스케폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량(즉, 비변형된 PHF의 MW)을 갖는 PHF이다.
예를 들면, 40 kDa 내지 200 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량(즉, 비변형된 PHF의 MW)을 갖는 PHF이다.
예를 들면, 40 kDa 내지 80 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량(즉, 비변형된 PHF의 MW)을 갖는 PHF이다. 예를 들면, 상기 PHF는 약 5 kDa, 10 kDa 또는 15 kDa의 분자량을 갖는다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, 예컨대 Fab와 같은 항체 절편을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 60 kDa 내지 120 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량(즉, 비변형된 PHF의 MW)을 갖는 PHF이다. 예를 들면, 상기 PHF는 약 5 kDa, 10 kDa 또는 15 kDa의 분자량을 갖는다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, 카멜리드, Fab2, scFvFc 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 140 kDa 내지 180 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량(즉, 비변형된 PHF의 MW)을 갖는 PHF이다. 예를 들면, 상기 PHF는 약 5 kDa, 10 kDa 또는 15 kDa의 분자량을 갖는다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, 예컨대 IgG, IgM과 같은 전장 항체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 구현예에서, PBRM에 접합될 때의 폴리머 약물 접합체(Id)는 식 (Ie)를 갖는다:
Figure pat00104
상기에서, Xa 및 Xb 중 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이며, 또는 Xa 및 Xb는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
m3a는 0 내지 약 17의 정수이고,
m3b는 1 내지 약 8의 정수이며, m3a 및 m3b의 합은 m3이고,
m, m1, m7, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이고, 및
m5는 1 내지 약 10의 정수이다.
상기 PBRM은 약 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상; 180 kDa 이상; 또는 200 kDa 이상, 또는 약 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 또는 100-140 kDa)의 분자량을 갖는다.
예를 들면, 상기 PBRM은 약 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상; 180 kDa 이상; 또는 200 kDa 이상, 또는 약 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 또는 100-140 kDa)의 분자량을 갖고, 설프히드릴(즉, -SH 또는 티올) 기를 갖는다.
예를 들면, 상기 PHF 및 PBRM 사이에 형성되는 설파이드 결합의 총 수(또는, 부착점의 총 수)는 10 이하이다.
예를 들면, m7 및 m3b 사이의 비는 1:1 이상 10:1 이하이다.
예를 들면, m7 및 m3b 사이의 비는 약 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
예를 들면, m7 및 m3b 사이의 비는 2:1 및 8:1 사이이다.
예를 들면, m7 및 m3b 사이의 비는 약 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
예를 들면, m7 및 m3b 사이의 비는 2:1 및 4:1 사이이다.
예를 들면, m7 및 m3b 사이의 비는 약 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
예를 들면, 식 (Ie) 내의 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m7, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 150의 범위이고, m1은 1 내지 약 70의 정수이며, m7은 1 내지 약 20의 정수이고, m3a는 0 내지 약 9의 정수이며, m3b는 1 내지 약 8의 정수이고, m5는 2 내지 약 8의 정수이다.
예를 들면, 식 (Ie) 내의 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m7, m3a 및 m3b의 합은 약 20 내지 약 110의 범위이고, m1은 2 내지 약 50의 정수이며, m7은 2 내지 약 15의 정수이고, m3a는 0 내지 약 7의 정수이며, m3b는 1 내지 약 8의 정수이고, m5는 2 내지 약 4의 정수이다.
예를 들면, 식 (Ie) 내의 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m7, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이고, m1은 약 5 내지 약 35의 정수이며, m7은 약 3 내지 약 10의 정수이고, m3a는 0 내지 약 4의 정수이며, m3b는 1 내지 약 5의 정수이고, m5는 2 내지 약 4의 정수이다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 단백질-폴리머 약물 접합체는 본 명세서에 개시된 것과 같은 식 (Ib)를 갖는다:
Figure pat00105
상기에서, Xa 및 Xb 중 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이며, 또는 Xa 및 Xb는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
m3a는 0 내지 약 17의 정수이고,
m3b는 1 내지 약 8의 정수이며, m3a 및 m3b의 합은 m3이고,
m, m1, m7, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이고, 및
m5는 1 내지 약 10의 정수이다.
예를 들면, 상기 PBRM은 약 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상; 180 kDa 이상; 또는 200 kDa 이상, 또는 약 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 또는 100-140 kDa)의 분자량을 갖는다.
예를 들면, 상기 PHF 및 PBRM 사이에 형성되는 설파이드 결합의 총 수(또는, 부착점의 총 수)는 10 이하이다.
예를 들면, m2 및 m3b 사이의 비는 1:1 이상 10:1 이하이다.
예를 들면, m2 및 m3b 사이의 비는 약 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
예를 들면, m2 및 m3b 사이의 비는 2:1 및 8:1 사이이다.
예를 들면, m2 및 m3b 사이의 비는 약 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
예를 들면, m2 및 m3b 사이의 비는 2:1 및 4:1 사이이다.
예를 들면, m2 및 m3b 사이의 비는 약 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
예를 들면, 식 (Ib) 내의 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 150의 범위이고, m1은 1 내지 약 70의 정수이며, m2는 1 내지 약 20의 정수이고, m3a는 0 내지 약 9의 정수이며, m3b는 1 내지 약 8의 정수이고, m5는 2 내지 약 8의 정수이다.
예를 들면, 식 (Ib) 내의 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 20 내지 약 110의 범위이고, m1은 2 내지 약 50의 정수이며, m2는 2 내지 약 15의 정수이고, m3a는 0 내지 약 7의 정수이며, m3b는 1 내지 약 8의 정수이고, m5는 2 내지 약 4의 정수이다.
예를 들면, 식 (Ib) 내의 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이고, m1은 약 5 내지 약 35의 정수이며, m2는 약 3 내지 약 10의 정수이고, m3a는 0 내지 약 4의 정수이며, m3b는 1 내지 약 5의 정수이고, m5는 2 내지 약 4의 정수이다.
예를 들면, 상기 말레이미도 차단 모이어티는 말레이미도기와 식 (II)의 티올-함유 화합물의 반응시 2개의 올레핀 탄소 원자 중 하나에 공유적으로 부착될 수 있는 모이어티이다:
Figure pat00106
상기에서, R90은 NHR91, OH, COOR93, CH(NHR91)COOR93 또는 치환된 페닐기이고,
R93은 수소 또는 C1-4 알킬이고;
R91은 수소, CH3 또는 CH3CO이고; 및
d는 1 내지 3의 정수이다.
예를 들면, 식 (II)의 말레이미도 차단 화합물은 시스테인, N-아세틸 시스테인, 시스테인 메틸 에스테르, N-메틸 시스테인, 2-머캅토에탄올, 3-머캅토프로판산, 2-머캅토아세트산, 머캅토메탄올(즉, HOCH2SH), 페닐이 하나 이상의 친수성 치환체로 치환된 벤질 티올 또는 3-아미노프로판-1-티올일 수 있다. 페닐 상의 하나 이상의 친수성 치환체는 OH, SH, 메톡시, 에톡시, COOH, CHO, COC1-4 알킬, NH2, F, 시아노, SO3H, PO3H 등을 포함한다.
예를 들면, 상기 말레이미도 차단기는 -S-(CH2)d-R90이며, 이때
R90은 OH, COOH 또는 CH(NHR91)COOR93이고;
R93은 수소 또는 CH3이고;
R91은 수소 또는 CH3CO이고; 및
d는 1 또는 2이다.
예를 들면, 상기 말레이미도 차단기는 -S-CH2-CH(NH2)COOH이다.
예를 들면, 상기 PHF가 2 kDa 내지 40 kDa 범위(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa)의 분자량을 가질 때, PHF 당 약물의 수(예컨대, m2)는 1 내지 약 40의 정수(예컨대, 약 1-20 또는 약 2-15 또는 약 3-10)이다. 상기 스캐폴드는, 예를 들면, 40 kDa 이상(예컨대, 60 kDa 이상; 80 kDa 이상; 또는 100 kDa 이상; 120 kDa 이상; 140 kDa 이상; 160 kDa 이상 또는 180 kDa 이상)의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 본 구현예에서, PHF 당 PBRM의 비는 약 1:1 및 약 1:10 사이, 약 1:1 및 약 1:9 사이, 약 1:1 및 약 1:8 사이, 약 1:1 및 약 1:7 사이, 약 1:1 및 약 1:6 사이, 약 1:1 및 약 1:5 사이, 약 1:1 및 약 1:4 사이, 약 1:1 및 약 1:3 사이, 약 1:1 및 약 1:2 사이, 약 1:2 및 약 1:6 사이, 약 1:2 및 약 1:5 사이, 약 1:2 및 약 1:4 사이 또는 약 1:2 및 약 1:3 사이이다.
예를 들면, 상기 PHF가 2 kDa 내지 40 kDa 범위(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa)의 분자량을 가질 때, PHF 당 약물의 수(예컨대, m2)는 1 내지 약 40의 정수(예컨대, 약 1:20 또는 약 2-15 또는 약 3:10)이다. 상기 스캐폴드는, 예를 들면, 140 kDa 내지 180 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 본 구현예에서, PHF 당 PBRM의 비는 약 1:1 및 약 1:10 사이, 약 1:1 및 약 1:9 사이, 약 1:1 및 약 1:8 사이, 약 1:1 및 약 1:7 사이, 약 1:1 및 약 1:6 사이, 약 1:1 및 약 1:5 사이, 약 1:1 및 약 1:4 사이, 약 1:1 및 약 1:3 사이, 약 1:1 및 약 1:2 사이, 약 1:2 및 약 1:6 사이, 약 1:2 및 약 1:5 사이, 약 1:2 및 약 1:4 사이 또는 약 1:2 및 약 1:3 사이이다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, 예컨대 IgG, IgM과 같은 전장 항체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 상기 PHF가 2 kDa 내지 40 kDa 범위(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa)의 분자량을 가질 때, PHF 당 약물의 수(예컨대, m2)는 1 내지 약 40의 정수(예컨대, 약 1:20 또는 약 2:15 또는 약 3:10)이다. 상기 스캐폴드는, 예를 들면, 60 kDa 내지 120 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 본 구현예에서, PHF 당 PBRM의 비는 약 1:1 및 약 1:10 사이, 약 1:1 및 약 1:9 사이, 약 1:1 및 약 1:8 사이, 약 1:1 및 약 1:7 사이, 약 1:1 및 약 1:6 사이, 약 1:1 및 약 1:5 사이, 약 1:1 및 약 1:4 사이, 약 1:1 및 약 1:3 사이, 약 1:1 및 약 1:2 사이, 약 1:2 및 약 1:6 사이, 약 1:2 및 약 1:5 사이, 약 1:2 및 약 1:4 사이 또는 약 1:2 및 약 1:3 사이이다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, 예컨대 Fab2, scFcFv 및 카멜리드와 같은 항체 절편을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 상기 PHF가 2 kDa 내지 40 kDa 범위(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa)의 분자량을 가질 때, PHF 당 약물의 수(예컨대, m2)는 1 내지 약 40의 정수(예컨대, 약 1:20 또는 약 2-15 또는 약 3:10)이다. 상기 스캐폴드는, 예를 들면, 40 kDa 내지 80 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 본 구현예에서, PHF 당 PBRM의 비는 약 1:1 및 약 1:10 사이, 약 1:1 및 약 1:9 사이, 약 1:1 및 약 1:8 사이, 약 1:1 및 약 1:7 사이, 약 1:1 및 약 1:6 사이, 약 1:1 및 약 1:5 사이, 약 1:1 및 약 1:4 사이, 약 1:1 및 약 1:3 사이, 약 1:1 및 약 1:2 사이, 약 1:2 및 약 1:6 사이, 약 1:2 및 약 1:5 사이, 약 1:2 및 약 1:4 사이 또는 약 1:2 및 약 1:3 사이이다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, Fab와 같은 항체 절편을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 측면에서, 본 발명은 단백질 기반의 인식 분자(PBRM) 및 치료제(D) 모두를 갖는 접합체에 유용한 폴리머성 스캐폴드를 특징으로 한다. 상기 D-부재(free) 스캐폴드는 폴리머성 담체, PBRM을 상기 폴리머성 담체에 결합시키기에 적합한 상기 폴리머성 담체에 결합된 하나 이상의 링커, 및 약물(D)을 상기 폴리머성 담체에 결합시키기에 적합한 하나 이상의 링커를 포함한다.
어떤 구현예에서, 상기 접합체는 몇 가지 단계들에 의해 형성된다. 상기 단계들은 (1) 약물 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 폴리머를 변형시키는 단계; (2) 상기 변형된 폴리머를 상기 약물 또는 그의 유도체와 반응시켜 상기 약물을 상기 폴리머에 결합시키는 단계; (3) 상기 폴리머가 상기 PBRM 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 상기 폴리머-약물 접합체를 변형시키는 단계; 및 (4) 상기 변형된 폴리머-약물 접합체를 상기 PBRM 또는 그의 유도체와 반응시켜 본 발명의 접합체를 형성하는 단계를 포함한다. 단계 (1)에 의해 제조된 변형된 폴리머가 상기 PBRM 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유한다면, 단계 (3)은 생략될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 접합체는 몇 가지 단계들에 의해 형성된다: (1) 제1 약물 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 폴리머를 변형시키는 단계; (2) 상기 변형된 폴리머를 제1 약물 또는 그의 유도체와 반응시켜 상기 제1 약물을 상기 폴리머에 결합시키는 단계; (3) 상기 폴리머가 제2 약물 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 상이한 작용기를 함유하도록 상기 폴리머-약물 접합체를 변형시키는 단계; (4) 상기 제2 약물이 상기 폴리머-약물 접합체와 결합되도록 상기 변형된 폴리머-약물 접합체를 상기 제2 약물 또는 그의 유도체와 반응시키는 단계; (5) 상기 폴리머가 상기 PBRM 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 2개의 상이한 약물을 함유하는 상기 폴리머-약물 접합체를 변형시키는 단계; 및 (6) 단계 (5)의 변형된 폴리머-약물 접합체를 상기 PBRM 또는 그의 유도체와 반응시켜 본 발명의 접합체를 형성하는 단계. 2개의 상이한 약물 및 2개의 상이한 PBRM을 포함하는 폴리머-약물 접합체를 형성하기 위해 2개의 상이한 PBRM 또는 그의 유도체가 접합되어야 한다면, 단계 (5) 및 (6)은 반복될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 접합체는 몇 가지 단계들에 의해 형성된다. 상기 단계들은 (1) 약물 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 폴리머를 변형시키는 단계; (2) PBRM 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 또한 함유하도록 상기 폴리머를 추가로 변형시키는 단계; (3) 상기 변형된 폴리머를 상기 약물 또는 그의 유도체와 반응시켜 상기 약물을 상기 폴리머에 결합시키는 단계; 및 (4) 상기 변형된 폴리머-약물 접합체를 상기 PBRM 또는 그의 유도체와 반응시켜 본 발명의 접합체를 형성하는 단계를 포함한다. 단계 (1) 및 (2) 또는 단계 (3) 및 (4)의 순서는 뒤바뀔 수 있다. 또한, 상기 변형된 폴리머가 상기 약물 또는 그의 유도체의 작용기 및 상기 PBRM 또는 그의 유도체의 작용기 모두와 반응할 수 있는 작용기를 함유한다면, 단계 (1) 또는 (2) 중 하나는 생략될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 접합체는 몇 가지 단계들에 의해 형성된다: (1) 제1 약물 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 폴리머를 변형시키는 단계; (2) PBRM 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 폴리머를 추가로 변형시키는 단계; (3) 상기 변형된 폴리머를 제1 약물 또는 그의 유도체와 반응시켜 상기 제1 약물을 상기 폴리머에 결합시키는 단계; (4) 상기 폴리머가 제2 약물 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 상이한 작용기를 함유하도록 상기 폴리머-약물 접합체를 변형시키는 단계; (5) 상기 제2 약물이 상기 폴리머-약물 접합체와 결합되도록 상기 변형된 폴리머-약물 접합체를 상기 제2 약물 또는 그의 유도체와 반응시키는 단계; 및 (6) 2개의 상이한 약물을 함유하는 상기 변형된 폴리머-약물 접합체를 상기 PBRM 또는 그의 유도체를 갖는 폴리머와 반응시켜 본 발명의 접합체를 형성하는 단계. 2개의 상이한 약물 및 2개의 상이한 PBRM을 포함하는 폴리머-약물 접합체를 형성하기 위해 2개의 상이한 PBRM 또는 그의 유도체가 접합되어야 한다면, 단계 (6)은 반복될 수 있다. 단계 (4)는 단계 (1) 이후에 수행되어서, 상기 변형된 폴리머가 2개의 상이한 약물 또는 그의 유도체와 반응할 수 있는 2개의 상이한 작용기를 함유하도록 할 수 있다. 본 구현예에서, 2개의 상이한 약물 또는 그의 유도체와 반응할 수 있는 2개의 상이한 작용기를 함유하는 상기 변형된 폴리머는 상기 변형된 폴리머와 상기 2개의 상이한 약물과의 반응 이전에(단계 (3) 및 단계 (5) 또는 PBRM (단계 (6)) 상기 PBRM 또는 그의 유도체의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다.
본 발명의 생체분해성 생체호환성 접합체는 생체분해성 및 친수성도의 바람직한 요구사항을 충족하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 생리학적 조건 하에, 생체분해성 및 안정성 사이의 균형이 도달될 수 있다. 예를 들면, 특정 역치 이상의 분자량(일반적으로, 분자의 물리적인 형태에 따라 40-100 kDa 이상)을 갖는 분자들은 소분자들과 달리 신장을 통해 배출되지 않고, 세포에 의한 섭취 및 세포내 소기관, 대부분 특히 리소좀에서 분해되는 것을 통해서만 신체로부터 제거될 수 있음이 알려져 있다. 상기 관찰은 기능적으로 안정하지만 생체분해성인 물질이 일반적인 생리학적 조건(pH=7.5±0.5) 및 리소좀의 pH(5 근처의 pH) 하에 그 안정성을 조절함으로써 디자인될 수 있는 방법을 예시한다. 예를 들면, 아세탈 및 케탈기의 가수분해는 산에 의해 촉매되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 폴리알은 일반적으로, 예를 들면, 혈액 혈장에서보다 산성인 리소좀 환경에서 덜 안정할 것이다. 기술자는, 예를 들면, 수성 매체 내에서 37℃, pH=5 및 pH=7.5에서 폴리머 분해 프로필(profile)을 비교하고, 따라서 정상 생리학적 환경 및 세포에 의한 섭취 후의 "소화성" 리소좀 소기관에서 폴리머 안정성의 예측되는 균형을 결정하도록 테스트를 디자인할 수 있다. 이러한 테스트에서의 폴리머 본성은, 예를 들면, 크기 배제 HPLC에 의해 측정될 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 분해된 접합체의 다양한 절편을 연구하기 위한 다른 적합한 방법을 선택할 수 있다.
많은 경우에 있어서, pH=7.5에서 상기 폴리머의 효과적인 크기가 1 내지 7일에 걸쳐 검출가능하게 변하지 않고, 적어도 7주 동안 원래의 50% 이내로 유지되는 것이 바람직할 것이다. 반면에, pH=5에서, 상기 폴리머는 바람직하게는 1 내지 5일에 걸쳐 검출가능하게 분해되고, 2주 내지 7개월의 시간 프레임 내에 낮은 분자량의 절편으로 완전히 변환되어야 한다. 일부 경우에 있어서는 더 빠른 분해가 바람직할 수 있지만, 일반적으로 상기 폴리머는 세포에 의해 폴리머 절편이 대사 또는 방출되는 속도를 넘어서지 않는 속도로 세포 내에서 분해되는 것이 보다 바람직할 것이다. 따라서, 어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 특히 세포에 의한 섭취시 생체분해성이고, 생물학적 시스템에 관해서는 상대적으로 "불활성"인 것으로 예상된다. 담체 분해의 생성물은 바람직하게는 전하를 갖기 않으며, 환경의 pH를 현저하게 변경시키지 않는다. 풍부한 알코올기는, 특히 식세포의 세포 수용체에 의한 폴리머 인식 속도를 낮게 제공할 수 있음이 제시된다. 본 발명의 폴리머 백본은 일반적으로 (예를 들면, 일부 폴리사카라이드 및 폴리펩티드에 특징적인) 항원 결정기를, 있더라도, 소량 함유하며, 일반적으로 이를 필요로 하는 경우가 아나리면 생체내에서 "열쇄- 및-자물쇄" 유형의 상호작용이 관여될 수 있는 뻣뻣한(rigid) 구조를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 용해성의 가교된 고형 접합체는 낮은 독성 및 생체부착성을 가질 것으로 예상되며, 이것은 이들이 몇 가지 생물의학 적용분야에 적합하도록 한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 생체분해성 생체호환성 접합체는 선형 또는 분지형 구조를 형성할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 생체분해성 생체호환성 폴리알 접합체는 키랄(광학적으로 활성)일 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 생체분해성 생체호환성 폴리알 접합체는 스칼레믹(scalemic)일 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 수용성이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 수-불용성이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 고체 형태이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 콜로이드이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 입자 형태이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 접합체는 겔 형태이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 폴리머-약물-PBRM 접합체를 형성하기 위해 PBRM과 접합시키기에 유용한 폴리머성 스캐폴드를 특징으로 한다. 상기 스캐폴드는 폴리머 기반의 인식 분자(PBRM), 예컨대 약 40 kDa 이상의 분자량을 갖는 PBRM와 접합시키기에 유용한 식 (Ia)의 폴리머성 담체를 포함한다:
Figure pat00107
상기 스캐폴드는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하고;
X는 CH2, O 또는 NH이고;
m은 1 내지 약 300의 정수이고,
m1은 1 내지 약 140의 정수이고,
*m2는 1 내지 약 40의 정수이고,
m3은 1 내지 약 18의 정수이고, 및
m, m1, m2 및 m3의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이다.
예를 들면, 식 (Ia)의 "m3" 단위에서 상기 말레이미도 모이어티의 각각의 존재는 상기 PBRM의 작용기와 공유 결합을 형성하기 위한 것이다.
예를 들면, 40 kDa 이상의 분자량(예컨대, 60 kDa 이상, 80 kDa 이상, 100 kDa 이상, 120 kDa 이상, 140 kDa 이상, 160 kDa 이상, 180 kDa 이상, 또는 200 kDa 이상, 또는 약 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 또는 100-140 kDa)을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량을 갖는 PHF(즉, 비변형된 PHF의 MW)이다.
예를 들면, 40 kDa 내지 200 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량을 갖는 PHF(즉, 비변형된 PHF의 MW)이다.
예를 들면, 40 kDa 내지 80 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량을 갖는 PHF(즉, 비변형된 PHF의 MW)(즉, 비변형된 PHF의 MW)이다. 예를 들면, 상기 PHF는 약 5 kDa, 8 kDa, 10 kDa, 13 kDa 또는 15 kDa의 분자량을 갖는다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, 예컨대 Fab와 같은 항체 절편을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 60 kDa 내지 120 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 5 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 5-30 kDa 또는 약 5-20 kDa 또는 약 5-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량을 갖는 PHF(즉, 비변형된 PHF의 MW)이다. 예를 들면, 상기 PHF는 약 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa의 분자량을 갖는다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, 카멜리드, Fab2, scFcFv 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 140 kDa 내지 180 kDa의 분자량을 갖는 PBRM을 접합시키기 위하여, 본 발명의 스캐폴드의 폴리머성 담체는 폴리아세탈, 예컨대 약 2 kDa 내지 약 40 kDa(예컨대, 약 2-20 kDa 또는 약 3-15 kDa 또는 약 5-10 kDa) 범위의 분자량을 갖는 PHF(즉, 비변형된 PHF의 MW)이다. 예를 들면, 상기 PHF는 약 5 kDa, 8 kDa, 10 kDa, 13 kDa 또는 15 kDa의 분자량을 갖는다.
상기 분자량 범위의 PBRM은, 예를 들면, IgG, IgM과 같은 전장 항체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 식 (Ia)에서 상기 PHF가 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량(즉, m, m1, m2 및 m3의 합이 약 1 내지 약 300의 범위)을 가질 때, m2는 1 내지 약 40의 정수이고, m3은 1 내지 약 18의 정수이며, 및/또는 m1은 1 내지 약 140의 정수(예컨대, m1은 약 1-90)이다.
예를 들면, 식 (Ia)에서 상기 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량(즉, m, m1, m2 및 m3의 합이 약 1 내지 약 150의 범위)을 가질 때, m2는 1 내지 약 20의 정수이고, m3은 1 내지 약 10의 정수이며, 및/또는 m1은 1 내지 약 70의 정수(예컨대, m1은 약 4-45)이다.
예를 들면, 식 (Ia)에서 상기 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량(즉, m, m1, m2 및 m3의 합이 약 1 내지 약 110의 범위)을 가질 때, m2는 2 내지 약 15의 정수이고, m3은 1 내지 약 8의 정수이며, 및/또는 m1은 2 내지 약 50의 정수(예컨대, m1은 약 4-30)이다.
예를 들면, 식 (Ia)에서 상기 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량(즉, m, m1, m2 및 m3의 합이 약 1 내지 약 75의 범위)을 가질 때, m2는 3 내지 약 10의 정수이고, m3은 1 내지 약 5의 정수이며, 및/또는 m1은 5 내지 약 35의 정수(예컨대, m1은 약 10-25)이다.
예를 들면, 하나 이상의 약물-운반 폴리머성 담체가 하나의 PBRM에 결합된다. 예를 들면, 상기 스캐폴드(예컨대, PBRM-폴리머-약물 접합체)는 약 40 kDa 이상의 분자량을 갖는 PBRM 및 상기 PBRM에 결합된 하나 이상의 D-운반 폴리머성 담체를 포함한다.
예를 들면, 상기 스캐폴드는 말레이미도기를 통해 상기 폴리머성 담체에 결합된 PBRM을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량의 식 (Ic)의 폴리머성 스캐폴드를 제공한다:
Figure pat00108
상기에서, X는 CH2, O 또는 NH이고;
m은 1 내지 약 300의 정수이고,
m6은 2 내지 약 180의 정수이고,
m3은 1 내지 약 18의 정수이고, 및
m, m6 및 m3의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이다.
예를 들면, 식 (Ic)의 "m3" 단위에서 상기 말레이미도 모이어티의 각각의 존재는 상기 PBRM의 작용기와 공유 결합을 형성하기 위한 것이다.
예를 들면, 식 (Ic)에서 상기 PHF가 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량(즉, m, m6 및 m3의 합이 약 15 내지 약 150의 범위)을 가질 때, m3은 1 내지 약 9의 정수이고, 및/또는 m6은 2 내지 약 90의 정수(예컨대, m6은 약 6-60)이다.
예를 들면, 식 (Ic)에서 상기 PHF가 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량(즉, m, m6 및 m3의 합이 약 20 내지 약 110의 범위)을 가질 때, m3은 1 내지 약 8의 정수이고, 및/또는 m6은 4 내지 약 65의 정수(예컨대, m6은 약 6-45)이다.
예를 들면, 식 (Ic)에서 상기 PHF가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가질 때, m, m6 및 m3의 합은 약 40 내지 약 75의 범위이고, m6은 약 8 내지 약 45의 정수이며, 및 m3은 1 내지 약 5의 정수이다.
일부 구현예에서, 상기 폴리머성 스캐폴드(예컨대, PHF와 같은 폴리아세탈 폴리머)는 시스테인-기반의 생체접합 전략을 이용함으로써 PBRM과 접합된다. 예컨대, 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 WO2010/100430 및 US7,595,292 참조. 한 구현예에서, 상기 폴리머성 스캐폴드(예컨대, PHF와 같은 폴리아세탈 폴리머)는 항체 힌지 영역의 시스테인을 통해 PBRM(예컨대, 항체)와 접합한다. 이론에 고착되기를 원하지 않으면서, 결과물인 접합체는 사슬간 가교(bridge) 구조를 형성함으로써 안정화된다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머성 스캐폴드에 결합된 적어도 2개의 모이어티를 포함하는 폴리머성 스캐폴드(예컨대, 폴리알 폴리머)에 관한 것으로서, 각각의 모이어티는 PBRM 내의 아미노산(예컨대, 시스테인) 유래의 티올기와 접합하여 단백질-폴리머 접합체를 형성할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 폴리머성 스캐폴드에 결합된 적어도 2개의 모이어티는 말레이미드기이다.
구현예에서, PBRM의 하나 이상의 자유 티올기는 단백질을 환원시킴으로써 제조된다. 이후, 상기 PBRM의 하나 이상의 자유 티올기는 아미노산 유래의 티올기와 접합할 수 있는 상기 폴리머 스캐폴드에 함유되는 적어도 2개의 모이어티와 반응하여 상기 PBRM을 상기 폴리머 스캐폴더와 접합시킨다. 한 구현예에서, 상기 폴리머성 스캐폴드에 결합된 적어도 2개의 모이어티는 말레이미드기이다.
구현예에서, 접합을 위해 사용되는 상기 PBRM의 자유 티올기는 자연형 단백질의 디설파이드 브릿지(가교 또는 디설파이드 가교에 의해 결합된 2 이상의 단백질 사슬로 이루어지는 단백질 복합체의 디설파이드 가교로부터 유래된다. 디설파이드 가교는 사슬내 또는 사슬간 가교일 수 있다. 다른 한편으로, 상기 PBRM의 자유 티올기는 사슬내 또는 사슬간 디설파이드 가교 형성에 관여되지 않는 자연형 단백질의 시스테인 또는 짝이 없는(unpaired) 티올기로부터 유래된다.
디설파이드 결합은, 예를 들면, 종래의 방법을 이용하여 디티오트레이톨, 머캅토에탄올, 트리스-카르복시에틸포스핀, 데하이드로아스코르브산, 구리 설페이트을이용해 환원될 수 있다. 단백질은 하나 이상의 디설파이드 가교를 함유할 수 있다. 자유 티올기를 제공하는 환원은 단백질 내의 하나 이상의 특정 디설파이드 가교를 환원하기 위해 조절될 수 있다. 디설파이드 환원 및 폴리머성 스캐폴드 폴리머 상의 모이어티의 화학양론의 정도에 따라, 하나 이상의 폴리머 스캐폴드를 단백질에 접합시키는 것이 가능하다. 디설파이드의 총 수 이하를 환원시키는 것이 바람직하다면, 상이한 반응 조건 또는 변성제의 첨가를 이용해 부분적으로 환원시킬 수 있으므로, 고정된 환원제가 사용될 수 있다.
티올을 통해 폴리머를 단백질에 접합시키는 것의 이점은 효능의 최적화, 용량 대 용량의 일관성 및 균일성(단백질 당 접합된 폴리머 분자의 수는 각각의 단백질 분자에 대해 실질적으로 동일하기 때문임), 각각의 단백질 상의 구체적인 잔기 또는 잔기들을 지향한 특이적 접합, 및 더 쉬운 정제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 티올 접합을 통한 단백질-폴리머 접합체는 비접합된 단백질과 비교할 때 실질적으로 개선된 반감기, 평균 유지 시간, 및/또는 순환에서의 제거 속도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시되어 있는 약물-폴리머-PBRM 접합체, 약물-폴리머 접합체, 약물 운반-폴리머성 스캐폴드, 또는 PBRM-운반 폴리머 스캐폴드는 각각 전형적으로 ≤1.5, 예컨대 <1.2의 다분산 지수(polydispersity index, PDI)를 갖는다.
PBRM-폴리머-약물 접합체, 약물 운반-폴리머성 스캐폴드, 또는 PBRM-운반 폴리머 스캐폴드는 대규모 투석여과(diafiltration)에 의해 정제(즉, 잔류 미반응 약물, PBRM 또는 폴리머성 출발 물질의 제거)될 수 있다. 필요시, 임의의 응집된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 제거하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의한 추가적인 정제가 수행될 수 있다. 일반적으로, 정제시 상기 PBRM-폴리머-약물 접합체는 전형적으로 SEC에 의해 결정될 때 5% 이하(예컨대, <2% w/w)의 응집된 PBRM-폴리머-약물 접합체; RP-HPLC에 의해 결정될 때 0.5% 이하(예컨대, <0.1% w/w)의 자유(비접합) 약물; SEC에 의해 결정될 때 1% 이하의 폴리머-약물 접합체 및 HIC-HPLC에 의해 결정될 때 2% 이하(예컨대, <1% w/w)의 비접합 PBRM을 함유한다.
하기 표 C 및 표 D는 각각 본 발명의 약물-운반 폴리머성 스캐폴드 및 폴리머-약물-단백질 접합체의 예를 제공한다. 표 D에서, 화학 구조식 내의 m5는 본 명세서에서 개시된 식 (Ib)에서와 같이 정의된다.
[표 C]
Figure pat00109
Figure pat00110
Figure pat00111
Figure pat00112
Figure pat00113
Figure pat00114
[표 D]
Figure pat00115
Figure pat00116
Figure pat00117
Figure pat00118
Figure pat00119
Figure pat00120
Figure pat00121
Figure pat00122
Figure pat00123
Figure pat00124
Figure pat00125
추가적인 예에서, 항-5T4 치료 약물 및 표적화 접합체가 제공된다. 상기 접합체는 (a) 인간 암태아 단백질 5T4를 표적화하는 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편인 리간드(LG) 및 (b) 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하는 폴리머성 스캐폴드를 포함하며, 상기 리간드는 약 40 kDa 이상의 분자량을 갖고, 여기에 (b)의 폴리머성 스캐폴드의 m5가 결합되며, 상기 m5는 1 내지 약 10이고, 및 상기 폴리머성 스캐폴드는 다음과 같이 정의된 무작위로 배열된 모노머성 단위 m, m1, m2, m3a 및 m3b를 포함한다:
(ⅰ) m3a:
Figure pat00126
상기에서, m3a는 없거나, 상기 폴리머 스캐폴더 내에 1 내지 약 17개의 모노머성 m3a가 존재하고, 각각의 단위에서, Xa 및 Xb는 독립적으로 (A) 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이거나, 또는 (B) Xa 및 Xb는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하는 것으로부터 선택되고;
(ⅱ) m3b:
Figure pat00127
상기에서, 설파이드 결합은 LG에 대한 부착점을 형성하고, 1 내지 약 8개의 모노머 m3b가 상기 폴리머성 스패폴드 내에 존재하며, m3a 및 m3b의 합은 1 내지 18이고, 상기 황 원자는 LG의 일부이며;
(ⅲ) m:
Figure pat00128
상기에서, 1 내지 약 300개의 모노머 m 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드 내에 존재하고;
(ⅳ) m1:
Figure pat00129
상기에서, 1 내지 약 140개의 모노머성 m1 단위가 상기 폴리머 스캐폴드 내에 존재하고; 및
(ⅴ) m2:
Figure pat00130
상기에서, 1 내지 약 40개의 모노머성 m2 단위가 상기 폴리머 스캐폴드 내에 존재하고, 각각의 모노머성 단위 m, m1, m2, m3a 및 m3b에서, X는 CH2, O 또는 NH이고, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이며, D의 각각의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이고, D 및 카르보닐기 사이의
Figure pat00131
는 상기 카르보닐기에 대한 D의 직접 또는 간접 부착을 나타낸다. 적합하게는, 상기 항-5T4 리간드는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 면역글로불린 또는 거의 기능성 절편이다. 예를 들면, 상기 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편은 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이뮤노어드헤신(immunoadhesin), F(Ab)2, 미니바디, Fab', 단일-도메인 항체, 나노바디, 단일 사슬 Fv, 탠덤/비스-scFv, F(ab)3, scFv-Fc(또는 scFvFc), dsFv, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 예에서, 상기 치료 약물 및 표적화 접합체는 식 (E)에 도시된 구조에 의해 특정된다:
Figure pat00132
상기에서, 상기 PHF는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 갖고, m은 1 내지 75이며, m1은 약 5 내지 약 35이며, m2는 약 3 내지 약 10이고, m3a는 0 내지 약 4이며, m3b는 1 내지 약 5이고, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75이며, 및 m5는 2 내지 약 4이다.
추가 구현예에서, 항-신생물 치료에 유용한 치료용 항-5T4 약물 표적화 접합체가 제공되며, 약 2 kDa 내지 약 40 kDa의 분자량을 갖는 PHF를 포함하는 폴리머성 스캐폴드를 포함하고, 상기 접합체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pat00133
상기에서, m5는 1 내지 10이고; m은 1 내지 약 300의 정수이며; m1은 1 내지 약 140의 정수이고; m2는 1 내지 약 40의 정수이며; m3a는 0 내지 약 17의 정수이고; m3b는 1 내지 약 8의 정수이며; m3a 및 m3b의 합은 1 내지 약 18의 정수이고; m, m1, m2 및 m3의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이며; X는 NH이고; Xa 또는 Xb 중 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이며; 및 D의 각각의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이고, D 및 카르보닐기 사이의
Figure pat00134
는 상기 카르보닐기에 대한 D의 직접 또는 간접 부착을 나타내며; 상기 ANTI-5T4는 인간 암태아 항원 5T4에 선택적인 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포함하는 항-5T4 리간드이다. 예를 들면, 상기 항-T4의 분자량은 적어도 약 40 kDa이다. 한 구현예에서, D는 히드록시프로필아미드-L-알라닌 모이어티를 통해 m2의 카르보닐 모이어티에 부착된 오리스타틴 또는 그의 유사체이다. 한 구현예에서, 상기 약물 대 항-5T4의 비는 약 5:1 내지 약 30:1, 또는 약 12:1 내지 약 18:1이다. 다른 구현예에서, 상기 PHF 약물 접합체 대 항-5T4 항체의 평균 비는 약 2:1 내지 약 4:1이다.
상기 접합체는 상기 접합체를 형성하는 다양한 단위들의 몰 백분율 또는 몰 분획에 의해 추가로 정의될 수 있다. 예를 들면, 상기 리간드에 결합된 디에틸렌 글리콜 말레이미드(EG2-MI) 모이어티를 포함하는 모노머 단위는 약 2 몰% 내지 약 5 몰%의 몰 분획을 갖는다. 다른 추가적인 예에서, 상기 약물을 운반하는 모노머 단위는 약 5 몰% 내지 약 10 몰%의 몰 분획을 갖는다. 예를 들면, 상기 약물 대 항-5T4의 비는 약 5:1 내지 약 30:1, 또는 약 12:1 내지 약 18:1이다. 추가적인 예에서, 상기 약물을 포함하는 PHF 스캐폴드 대 항-5T4 항체의 평균 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이다. 한 구현예에서, 상기 접합체는 항-5T4-((EG2-MI (3%)-(10 kDa PHF-BA (30%)-(AF-HPA-Ala (8%))이다. 상기 접합체는 실시예 10, 보다 일반적으로는 계획(Scheme) 5에 개시되어 있는 것과 같이 제조될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항-신생물 치료에 유용한 치료용 약물 및 표적화 접합체가 제공되며, 항-5T4 및 서로 무작위로 결합될 수 있는 하기 나타낸 단위들을 포함하는 PHF 폴리머성 스캐폴드를 포함한다:
Figure pat00135
상기에서, 항-5T4는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체 구조체이고; 상기 PHF는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖고; 평균 폴리머성 스캐폴드 대 항-5T4 항체 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이고; 및 상기 AF-HPA 대 항-5T4 항체 비는 약 12:1 내지 약 18:1이다.
상기 접합체는 본 명세서에 개시된 것과 같이 제조될 수 있으며, 적합한 담체를 이용해 개체에 운반하기에 적합한 조성물로 조합될 수 있다. 상기 조성물은 상기 항-5T4 약물 표적화 접합체들의 블렌드(blend)를 함유할 수 있으며, 즉 단일 조성물은 상이한 약물 및/또는 상이한 폴리머성 스캐폴드를 갖는 항-5T4 약물 표적화 접합체들을 함유할 수 있다.
합성 방법
본 발명에 따르면, 임의의 이용가능한 기술이 본 발명의 접합체 또는 이를 포함하는 조성물, 및 이를 제조하기에 유용한 중간체 및 성분(예컨대, 담체 및 변형제)을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 반(semi)-합성 및 완전한 합성 방법이 사용될 수 있다.
담체
변형제에 대한 접합용으로 적합한 폴리머 담체(예컨대, 생체호환성, 생체분해성 폴리머 담체)의 제조 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 합성 안내는 각각의 내용 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,811,510호; 제5,863,990호; 제5,958,398호; 제7,838,619호; 제7,790,150호; 제8,685,383호; 및 제8,815,226호에서 발견될 수 있다. 숙련된 기술자는 본 발명을 실행하기 위해 사용되는 폴리머 담체의 제조 방법을 채용하는 방법을 알 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 생체분해성 생체호환성 폴리알 접합체를 형성하는 방법은 적합한 폴리사카라이드가 효과량의 글리콜-특이적 산화제와 조합되어 알데히드 중간체를 형성하는 공정을 포함한다. 이후, 폴리알 그 자체인 상기 알데히드 중간체는 대응하는 폴리올로 환원되고, 숙시눌레이트화되며, 하나 이상의 적합한 변형제와 커플링되어 숙신아미드-함유 결합을 포함하는 생체분해성 생체호환성 폴리알 접합체를 형성할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 완전한 합성 생체분해성 생체호환성 폴리알은 적합한 개시제를 적합한 전구 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
예를 들면, 완전한 합성 폴리알은 비닐 에테르를 보호된 치환된 디올과 축합함으로써 제조될 수 있다. 사이클 개환 중합과 같은 다른 방법이 사용될 수 있으며, 그 제조 효능은 보호기의 치환 및 벌키성(bulkiness)의 정도에 의존할 수 있다.
Figure pat00136
본 기술분야의 통상의 기술자는 고분자량의 생성물을 얻기 위하여 용매 시스템, 촉매 및 다른 인자들이 최적화될 수 있음을 인식할 것이다.
어떤 구현예에서, 상기 담체는 PHF이다.
구현예에서, 상기 폴리머 담체는 1.5 이하, 예컨대 <1.2의 다분산 지수를 갖는 PHF이다.
약물 및 약물 유도체
어떤 구현예에서, 상기 약물은 폴리머성 담체에 접합시키기 전에 변형될 수 있다. 계획 1 및 계획 2는 빈카 알칼로이드를 변형시키기 위한 예시적인 방법이다. 계획 3은 비-자연형 캄프토테신 유도체를 변형시키기 위한 방법을 보여준다. 계획 4는 오리스타틴 F를 변형시키기 위한 방법을 보여준다. 더 많은 변형 방법은 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 US2010/0305149에 개시되어 있다.
Figure pat00137
빈카 알칼로이드의 C23 에스테르와 히드라진의 반응 후 NaNO2의 처리가 이어지며, 활성 아지도 에스테르가 생성된다. 상기 아지도 에스테르와 프로판올아민 또는 1-아미노프로판-2-올과 같은 아미노 화합물의 반응 결과 기능화된 히드록실을 갖는 빈카 알칼로이드 유도체가 생성되며, 폴리머와의 접합을 위하여, 예를 들면, 알라닌 또는 메틸 알라닌 유도체와 같은 아미노 함유 화합물로 추가로 유도체화될 수 있다(계획 1 참조).
Figure pat00138
빈카 알칼로이드의 히드록실 유도체를 t-부톡시 에스테르화 아미노산과 같은 보호된 아미노 함유 테터(tether)로 처리한 후 상기 에스테르를 TFA 가수분해하면 상기 빈카 알칼로이드의 트리플레이트 염이 생성된다(계획 2). 상기 빈카 알칼로이드를 기능화된 폴리머와 접합시키면 약물-폴리머 접합체가 생성되며, PBRM 또는 그의 유도체와 추가로 접합시켜 단백질-폴리머-약물 접합체를 생성할 수 있다.
Figure pat00139
비-자연형 캄프토테신 유도체, 예를 들면, SN38의 10-히드록시기는 트리에틸아민의 존재 하에 상기 유도체를 tert-부틸디페닐실릴 클로라이드(TBDPSiCl)와 반응시킴으로써 선택적으로 보호된다. 상기 20-히드록시기는 상기 P. et al., Clin. Cancer Res., 14:1888-1896 (2008)에 개시되어 있는 절차를 이용하여 t-부틸카르보닐-알라닌과 반응시킴으로써 알라닌 유도체를 형성할 수 있다. 다른 한편으로, 다른 아미노산, 예컨대 글리신이 도입될 수 있다. 1차 아민은 트리플루오로아세트산을 처리한 후 테트라부틸암모늄 플루오라이드로 TBDPS 보호기를 제거함으로써 탈마스크된다(계획 3 참조). 결과물인 아미노 유도체화 SN38 화합물은 기능화된 폴리머와 접합되어 약물-폴리머-접합체를 형성할 수 있다.
Figure pat00140
오리스타틴 F를 t-부톡시 에스테르화 2-히드록시프로필 아민과 같은 보호된 아미노 함유 테더로 처리한 후, 상기 에스테르를 HCl 가수분해하여 오리스타틴 F의 2-히드록시플필 아미노 유도체를 생성한다(계획 4 참조). 상기 오리스타틴 F 유도체를 기능화된 폴리머와 접합시키면 약물-폴리머 접합체가 생성되며, PBRM 또는 그의 유도체와 추가로 접합되어 단백질-폴리머-약물 접합체가 생성될 수 있다.
접합체 또는 폴리머성 스캐폴드
하기 계획 5는 본 발명의 폴리머성 약물 스캐폴드를 제조하는 합성 계획을 보여준다. 한 구현예에서, 상기 접합체는 몇 가지 단계에 의해 형성된다: (1) 폴리머인 PHF는 COOH 모이어티(예컨대, -C(O)-X-(CH2)2-COOH)를 함유하도록 변형된다; (2) 이후, 상기 폴리머는 PBRM의 작용기와 반응할 수 있는 말레이미도 모이어티(예컨대, EG2-MI)를 함유하도록 추가로 변형된다; (3) 2개의 상이한 작용기를 함유하는 상기 변형된 폴리머는 약물 또는 그의 유도체(예컨대, AF-HPA-Ala)의 작용기와 반응하여 폴리머-약물 접합체를 형성한다; (4) PBRM의 디설파이드 결합이 환원된다; (5) 이후, 상기 환원된 PBRM은 상기 폴리머-약물 접합체와 반응하여 단백질-폴리머-약물 접합체를 형성한다; 및 (6) 남아있는 말레이미도 모이어티는 선택적으로 말레이미도 차단 화합물(예컨대, 시스테인)과 반응한다.
다른 구현예에서, 하기 계획 5의 오른쪽 경로에서 묘사된 것과 같이 단계 (2) 및 (3)의 순서는 뒤바뀔 수 있다.
Figure pat00141
Figure pat00142
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (2) 및 (3)은 하기 계획 6에 묘사된 것과 같이 동시에 수행된다.
Figure pat00143
약학적 조성물
또한, 안정화제, 버퍼(buffer) 등과 같은 허용가능한 담체 내에 본 명세서에 개시되어 있는 것과 같은 하나 이상의 단백질-폴리머-약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물이 포함된다. 상기 접합체는 안정화제, 버퍼 등이 있거나 없이 표준 수단에 의해 개체에 투여 및 도입되어 약학적 조성물을 형성할 수 있다. 투여는 국소(눈 및 질 및 직장 운반을 포함하는 점막을 포함함), 예컨대 네불라이저(nebulizer)에 의한 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해 폐; 기관지내, 비강내, 상피, 경피, 경구 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입(infusion) 또는 두개내, 예컨대 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함하는 비경구 투여될 수 있다. 상기 접합체는 주사 투여용 멸균 용액 및/또는 현탁액; 주사/주입 전에 재구성하기 위한 동결건조 분말; 국소 조성물; 경구 투여용 정제, 캡슐 또는 엘릭시르(melixir); 또는 직장 투여용 좌약 및 본 기술분야에 알려진 다른 조성물로 제형화 및 사용될 수 있다.
약물학적 조성물 또는 제형은 투여, 예컨대 세포 또는 예를 들면 인간을 포함하는 개체 내로의 전신 투여에 적합한 형태의 조성물 또는 제형을 나타낸다. 부분적으로, 적합한 형태는 용도 또는 진입 경로, 예를 들면, 경구, 흡입, 경피 또는 주사/주입에 의존한다. 이러한 형태는 상기 조성물 또는 제형이 표적 세포(즉, 상기 약물이 운반되기 원하는 세포)에 도달하는 것을 막지 않아야 한다. 예를 들면, 혈류 내로 주사된 약물학적 조성물은 용해성이어야 한다. 다른 인자들이 본 기술분야에 알려져 있으며, 독성 및 상기 조성물 또는 제형이 그 효과를 발휘하는 것을 막는 형태와 같은 고려사항들을 포함한다.
"전신 투여"는 혈류 내에서 상기 변형된 폴리머가 생체내 전신 흡수 또는 축적된 후 전신에 분포되는 것을 의미한다. 전신 흡수를 유도하는 투여 경로는 정맥내, 피하, 복강내, 흡입, 경구, 폐내 및 근육내를 제한없이 포함한다. 상기 투여 경로 각각은 상기 변형된 폴리머를 접근가능한 질환 조직에 노출한다. 순환으로의 활성 제제의 진입 속도는 분자량 또는 크기의 함수인 것으로 나타나 있다. 본 발명의 접합체를 사용하면 PBRM의 특이성을 통해 암 세포와 같은 특정 세포 내로 약물의 운반을 국소화할 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 제형"는 원하는 활성을 위해 가장 적합한 물리적 위치에 상기 접합체를 효과적으로 분포시키도록 하는 조성물 또는 제형을 의미한다. 한 구현예에서, 효과적인 운반은 세망내피계에 의한 제거 또는 감소된 효능 또는 독성이 일어나게 될 수 있는 오프(off)-표적 결합의 생성 전에 일어난다. 상기 접합체와 제형화하기에 적합한 제제의 비제한적인 예는 CNS로의 활성 제제의 진입을 향상시킬 수 있는 P-당단백질 억제제(예컨대, Pluronic P85); 두개내 이식 후 지속적인 방출 운반을 위한 폴리(DL-락타이드-코글리콜라이드) 미세구와 같은 생체분해성 폴리머; 및 혈액 뇌 장벽을 가로질러 활성 제제를 운반할 수 있고 신경 섭취 메커니즘을 변경시킬 수 있는 폴리부틸시아노아크릴레이트로 만들어진 것들과 같은 부하된 나노입자를 포함한다.
또한, 보관 또는 투여용으로 제조된 약학적 조성물이 본 명세서에 포함되며, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 내에 원하는 접합체를 약학적 유효량으로 포함한다. 치료용으로 사용하기 위해 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제는 제약 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 버퍼, 보존제, 벌크화제, 분산제, 안정화제, 염료가 제공될 수 있다. 또한, 항산화제 및 현탁화제가 사용될 수 있다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 (1) 약 1 ㎎/㎖ 내지 25 ㎎/㎖의 인간 혈청 알부민을 함유하고 있는 둘베코 포스페이트 버퍼화 식염수(pH는 약 6.5), (2) 0.9% 식염수(0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로오스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "약학적 유효량"이란 용어는 확인된 질환 또는 증상을 치료, 개선 또는 방지하거나, 검출가능한 치료 또는 억제 효과를 나타내기 위한 약학적 제제의 양을 나타낸다. 상기 효과는 본 기술분야에 알려진 임의의 분석 방법에 의해 검출될 수 있다. 개체에 대한 정확한 유효량은 개체의 체중, 크기 및 건강; 증상의 본성 및 정도; 및 투여를 위해 선택되는 치료제 또는 치료제들의 조합에 의존할 것이다. 주어진 상황에 대한 약학적 유효량은 임상의의 기술 및 판단 내에 있는 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 측면에서, 상기 질환 및 증상은 유전자 사일런싱(silencing)을 통해 치료될 수 있다.
임의의 접합체에 대하여, 상기 약학적 유효량은 먼저 예컨대 신생물 세포의 세포 배양 분석, 또는 대개 래트, 마우스, 토끼, 개 또는 돼지의 동물 모델에서 추정될 수 있다. 상기 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이후, 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 ED50(군집의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량) 및 LD50(군집의 50%에서 치사적인 용량)와 같은 치료/예방 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, LD50/ED50의 비로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약학적 조성물이 바람직하다. 상기 복용량(dosage)은 도입되는 제형, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변할 수 있다.
예를 들면, 약물 또는 그의 유도체, 약물-폴리머 접합체 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체는 Cell titer Glo를 이용하여 몇 가지 세포주에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 용량 반응 커브는 SoftMax Pro 소프트웨어를 이용해 생성될 수 있고, IC50 값은 4가지 파라미터의 커브 피팅(fitting)으로부터 결정될 수 있다. 도입되는 세포주는 PBRM의 표적인 것들과 상기 테스트 접합체 내에 함유되는 PBRM의 표적이 아닌 대조군 세포주를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 상기 접합체는 종래의 카테터화 기술 또는 주입을 이용하는 것을 포함하는 주사에 의한 비경구 투여용으로 제형화된다. 주사용 제형은, 예컨대 보존제의 첨가와 함께 앰풀(ampule) 또는 다중-용량 용기 내에 단위 제형으로 존재할 수 있다. 상기 접합체는 멸균 매체 내에서 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 접합체는 비히클 및 사용되는 농도에 따라 상기 비히클 내에 현탁되거나 분산될 수 있다. 유리하게는, 국소 마취제, 보존제 및 버퍼화제와 같은 어주번트(adjuvant)가 상기 비히클 내에 용해될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "비경구"라는 용어는 경피, 피하, 혈관내(예컨대, 정맥내), 근육내, 기관지내 주사 또는 주입 기술 등을 포함한다. 또한, 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제형이 제공된다. 다른 활성 성분들이 필요하다면, 하나 이상의 접합체가 하나 이상의 비-독성 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 어주번트와 함께 존재할 수 있다.
상기 멸균 주사가능 제제는 또한 비-독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매, 예를 들면 1,3-부탄디올 내의 용액으로서 멸균 주사가능 용액 또는 현탁액일 수 있다. 도입될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균, 고정된 오일이 전통적으로 용매 또는 현탁화 매체로 도입될 수 있다. 상기 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 블랜드 고정된 오일이 도입될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제조물에서의 용도가 발견된다.
본 명세서에 개시된 접합체 및 조성물은 적절한 형태, 바람직하게는 비경구, 보다 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위하여, 상기 접합체 또는 조성물은 수성 또는 비수성 멸균 용액, 현탁액 또는 에멀전일 수 있다. 프로필렌 글리콜, 식물성 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 상기 용매 또는 비히클로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 어주번트, 에멀전화제 또는 분산제를 함유할 수 있다.
하루 당 체중의 약 0.001 ㎎/㎏ 및 약 140 ㎎/㎏ 사이 등급의 복용량 레벨(하루 당 개체 당 약 0.05 ㎎ 및 7 g 사이)이 전술한 증상들의 치료에 유용하다. 일부 구현예에서, 환자에 투여되는 복용량은 개체의 체중의 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 사이이다. 일부 구현예에서, 환자에 투여되는 복용량은 개체의 체중의 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏ 사이이다. 일부 구현예에서, 환자에 투여되는 복용량은 상기 개체의 체중의 약 0.1 ㎎/㎏ 및 약 15 ㎎/㎏ 사이이다. 일부 구현예에서, 환자에 투여되는 복용량은 개체의 체중의 약 0.1 ㎎/㎏ 및 약 20 ㎎/㎏ 사이이다. 일부 구현예에서, 투여되는 복용량은 개체의 체중의 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏ 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 사이이다. 일부 구현예에서, 투여되는 복용량은 개체의 체중의 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏ 사이이다. 일부 구현예에서, 투여되는 복용량은 개체의 체중의 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 사이이다. 단일 제형을 제조하기 위해 상기 담체 물질과 조합될 수 있는 접합체의 양은 치료되는 숙주 및 특정한 투여 방식에 따라 변한다. 투여 단위 형태는 일반적으로 접합체의 약 0.001 ㎎ 및 약 100 ㎎ 사이; 약 0.01 및 약 75 ㎎ 사이; 또는 약 0.01 ㎎ 및 약 50 ㎎ 사이; 또는 약 0.01 ㎎ 및 약 25 ㎎ 사이를 함유할 수 있다.
정맥내 투여를 위하여, 상기 복용량 레벨은 앞선 문단에서 개시된 범위, 또는 동물의 체중의 ㎏ 당 접합체의 약 0.01 내지 약 200 ㎎을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 조성물은 동물의 체중의 ㎏ 당 접합체의 약 1 내지 약 100 ㎎을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 투여되는 양은 화합물의 체중의 약 0.1 내지 약 25 ㎎/㎏의 범위일 것이다.
일부 구현예에서, 상기 접합체는 다음과 같이 투여될 수 있다. 상기 접합체는 약 5일 동안 매일 정맥내 볼루스로 약 5일 동안 매일 또는 연속적 주입으로 약 5일 동안 매일 주어질 수 있다.
다른 한편으로, 상기 접합체는 6주 또는 더 오랫동안 매주 1회 투여될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 접합체는 2주 또는 3주에 1회 투여될 수 있다. 볼루스 용량은 보통 식염수의 약 50 내지 약 400 ㎖로 주어지며, 여기에 약 5 내지 약 10 ㎖의 인간 혈청 알부민이 첨가될 수 있다. 연속적 주입은 24시간의 기간 당 보통 식염수의 약 250 내지 약 500 ㎖로 주어지며, 여기에 약 25 내지 약 50 ㎖의 인간 혈청 알부민이 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 후 약 1 내지 약 4주에 환자는 제2 치료 코스를 받을 수 있다. 투여 경로, 부형제, 희석제, 복용량 및 시간에 관한 구체적인 임상 프로토콜은 임상적 상황이 보장될 때 숙련된 기술자에 의해 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 치료적 유효량은 다른 규칙적인 스케줄, 즉 매일, 매주, 매달 또는 연간 기준으로, 또는 변하는 투여 일, 주, 월 등의 불규칙적인 스케줄로 제공될 수 있다. 다른 한편으로, 투여되는 치료적 효과량은 변할 수 있다. 한 구현예에서, 제1 용량에 대한 치료적 효과량은 하나 이상의 후속하는 용량에 대한 치료적 효과량보다 더 높다. 다른 구현예에서, 제1 용량에 대한 치료적 효과량은 하나 이상의 후속하는 용량에 대한 치료적 효과량보다 더 낯다. 동등한 복용량이 약 매 2시간, 약 매 6시간, 약 매 8시간, 약 매 12시간, 약 매 24시간, 약 매 36시간, 약 매 48시간, 약 매 72시간, 약 매주, 약 매 2주, 약 매 3주, 약 매월, 약 매 2월을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 완전한 치료 코스에 상응하는 복용량의 수 및 빈도는 해당 규제 바디 및 보건 의사의 판단의 권고사항에 따라 결정될 것이다. 본 명세서에서 개시된 치료적 효과량은 주어진 기간 동안 투여되는 총량을 나타낸다; 즉, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 상이한 접합체가 투여된다면, 치료적 효과량은 투여되는 총량에 상응한다. 특정 개체에 대한 구체적인 용량 레벨은 구체적인 접합체의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도, 다른 활성 제제와의 조합 및 치료받는 특정 질환의 증세 포함하는 다양한 인자들에 의존함이 이해되어야 한다.
비-인간 동물에 대한 투여를 위하여, 상기 접합체는 또한 동물의 사료 또는 음용수에 첨가될 수 있다. 동물의 사료 및 음용수를 제형화하여 동물이 식이와 함께 치료적으로 적절한 양의 접합체를 섭취하도록 하는 것이 편리할 수 있다. 또한, 사료 또는 음용수에 첨가하기 위한 프리믹스로 상기 접합체를 제공하는 것이 편리할 수 있다.
상기 접합체는 또한 종합적인 치료 효과를 증가시키기 위하여 다른 치료 화합물과의 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 징후를 치료하기 위해 복수의 화합물을 사용하면 부작용의 존재를 줄여주면서 유익한 효과를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 접합체는 미국 특허 제7,303,749호에 개시되어 있는 것과 같은 화학치료제와의 조합으로 사용된다. 다른 구현예에서, 상기 화학치료제는 레트로졸, 옥살리플라틴, 도세탁셀, 5-FU, 라파티닙, 카페시타빈, 루코보린, 에를로티닙, 페르투주맙, 베바시주맙 및 젬시타빈을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 하나 이상의 화학치료제를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 접합체 및/또는 조성물로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 키트를 제공한다. 이러한 키트는 또한, 예를 들면, 다른 화합물 및/또는 조성물, 상기 화합물 및/또는 조성물을 투여하기 위한 장치(들), 및 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 및 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 기록된 설명서를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 조성물은 단일 용량으로서, 또는 연속된 또는 주기적으로 불연속된 투여용으로 포장될 수 있다. 연속적 투여를 위하여, 포장 또는 키트는 각각의 복용량 단위(예컨대, 전술한 또는 약물 운반에서 이용되는 용액 또는 다른 단위)의 상기 접합체 및 선택적으로는 소정 길이의 기간 동안 또는 규정된 것과 같이 상기 용량을 매일, 매주 또는 매달 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 시간에 따라 다양한 농도의 조성물, 상기 조성물의 성분, 또는 조성물 내의 상기 접합체 또는 제제의 상대적인 비가 요구된다면, 패키지 또는 키트는 원하는 다양성을 제공하는 복용량 단위의 순서를 함유할 수 있다.
주기적인 경구적 사용을 위해 약학적 제제를 조제하기 위한 다수의 포장 또는 키트가 본 기술분야에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 상기 포장은 각각의 기간에 대한 설명서를 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 포장은 라벨링된 블리스터 포장, 다이얼 디스펜서 포장 또는 병이다. 키트의 포장 수단은 주사기, 피펫, 점안기, 또는 신체의 발병 부위에 상기 제형이 적용되거나, 개체 내로 주사되거나, 심지어 키트의 다른 상분들과 함께 적용 및 혼합될 수 있는 다른 이러한 장치와 같이 그 자체가 투여용으로 구성될 수 있다.
사용 방법
치료 방법
본 발명의 어떤 바람직한 구현예에서, 본 발명의 단백질-폴리머-약물 접합체는 동물(바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이며, 남성, 여성, 유아, 어린이 및 성인을 포함함)의 치료 방법에 사용된다. 한 구현예에서, 본 발명의 접합체는 동물에게 본 발명의 생체분해성 생체호환성 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 동물의 치료 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 접합체는 용해성 선형 폴리머, 코폴리머, 접합체, 콜로이드, 입자, 겔, 고체 아이템, 섬유, 필름 등의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 생체분해성 생체호환성 접합체는 조절된 약물 방출의 시스템, 낮은-침입성의 수술 절차용 제조물 등에서 약물 담체 및 약물 담체 성분으로서 사용될 수 있다. 약학적 제형은 주사가능하거나, 이식가능하거나, 등일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에 본 발명의 적어도 한 접합체를 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 접합체는 생체분해시 하나 이상의 치료제를 방출한다.
다른 구현예에서, 상기 접합체는 환자를 치료하거나, 및/또는 예를 들면 암을 포함하는 선택된 세포 군집의 성장을 조절하기 위하여 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 접합체로 치료될 수 있는 특정한 유형의 암은 다음을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: (1) 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 결장직장암, 신장암, 췌장암, 뼈암, 유방암, 난소암, 전립선암, 식도암, 위암, 구강암, 코의 암, 인후암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 우두 암종, 유두 선암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지성 암종, 신장세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 경부암, 자궁암, 고환암, 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 방광 암종, 폐암, 상피 암종, 신경교종, 교모세포종, 다형성 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 피부암, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아세포종을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 고형 암; (2) 급성 림프구성 백혈병("ALL"), 급성 림프구성 B-세포 백혈병, 급성 림프구성 T-세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병("AML"), 급성 전골수성 백혈병("APL"), 급성 단핵구성 백혈병, 급성 적백혈병성 백혈병, 급성 거핵아구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 급성 미분화 백혈병, 만성 골수성 백혈병("CML"), 만성 림프구성 백혈병("CLL"), 모양세포 백혈병, 다발성 골수종, 예컨대 림프아구성 골수성 및 림프구성 골수성 백혈병과 같은 급성 및 만성 백혈병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 혈액 유래의 암; 및 (3) 호지킨 질병과 같은 림프종, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환 및 진성적혈구 증가증.
다른 구현예에서, 상기 접합체는 환자를 치료하거나, 및/또는 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 입의 암, 중피종, 피부암, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 결장암, 췌장암, 신장암 또는 위암을 앓는 환자에서 선택된 세포 군집의 성장을 조절하기 위하여 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 암은 유방암, 위암, 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 상기 접합체는 특정 병리학, 예를 들면, 암의 발생 위험을 치료, 예방, 감소시키거나, 및/또는 개시를 지연시키기 위하여 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 접합체는 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 입의 암, 중피종, 피부암, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 비-소세포 폐암(NSCLC), 결장암, 췌장암, 신장암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 진행을 치료, 예방 또는 지연시키거나 그 징후를 달리 개선하는데 있어서 유용하다.
다른 구현예에서, 상기 접합체는 전신성 루푸스, 류마티스 관절염, 건선 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환; 신장 이식 거부, 간 이식 거부, 폐 이식 거부, 심장 이식 거부 및 골수 이식 거부와 같은 이식 거부; 이식편대숙주 질환; CMV 감염, HIV 감염 및 AIDS와 같은 바이러스 감염; 및 편모충증, 아메바증, 주혈흡충증 등과 같은 기생충 감염을 치료하기 위하여 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 투여될 수 있다.
어떤 구현예에서, 상기 접합체는 또한 세포의 비정상적 성장(예컨대, 암)에 의해 특정되는 것과 같은 질병의 증세를 치료 또는 경감시키기에 유용한 약물의 제조용으로 사용될 수 있다.
어떤 구현예에서, 상기 치료제는 특정 표적 세포, 조직 또는 기관으로 국소 운반된다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 방법의 실행시, 상기 접합체는 진단 라벨을 추가로 포함하거나, 이와 연관된다. 어떤 예시적인 구현예에서, 상기 진단 라벨은 감마 신티그래피(scintigraphy) 및 PET용 방사성약물 또는 방사성 동위원소, 자기 공명 영상(MRI)용 조영제, 컴퓨터 단층촬영용 조영제, X-선 이미지 방법용 조영제, 초음파 진단 방법용 제제, 중성자 활성화용 제제, X-선, 초음파, 라디오파 및 마이크로파를 반사, 산란하거나 영향을 미칠 수 있는 모이어티 및 형광단으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 어떤 예시적인 구현예에서, 상기 접합체는 생체내에서 추가로 모니터링된다.
진단 라벨의 예는 감마 신티그래피 및 PET용 방사성약물 또는 방사성 동위원소, 자기 공명 영상(MRI)용 조영제(예를 들면, 상자성 원자 및 초상자성 나노크리스탈), 컴퓨터 단층촬영용 조영제, X-선 이미지 방법용 조영제, 초음파 진단 방법용 제제, 중성자 활성화용 제제, X-선, 초음파, 라디오파 및 마이크로파를 반사, 산란하거나 영향을 미칠 수 있는 모이어티, 다양한 광학 절차에서의 형광단 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 진단용 방사성약물은 -발산 방사성핵종, 예컨대 인듐-111, 테크네슘-99m 및 아이오딘-131 등을 포함한다. MRI(자기 공명 영상)용 조영제는, 예컨대 산화철 콜로이드, 페라이트 콜로이드 등과 같은 예컨대 상자성 이온, 철, 망간, 가돌리늄, 란타나이드, 유기 상자성 모이어티 및 초상자성, 강자성 및 반강자성 화합물과 같은 자성 화합물을 포함한다. 컴퓨터 단층촬영 및 다른 X-선 기반의 이미징 방법용 조영제는, 예컨대 요오드, 바륨 등과 같은 X-선을 흡수하는 화합물을 포함한다. 초음파 기반의 방법용 조영제는, 예컨대 에멀전, 결정, 기체 방울 등과 같이 초음파를 흡수, 반사 및 산란시킬 수 있는 화합물을 포함한다. 또 다른 예는 붕소 및 가돌리늄과 같은 중성자를 활성화시키는데 유용한 물질을 포함한다. 또한, X-선, 초음파 라디오파, 마이크로파 및 진단 절차에서 유용한 다른 선들을 반사, 굴절, 산란시키거나, 달리 영향을 미칠 수 있는 라벨들이 도입될 수 있다. 형광 라벨은 광이미징용으로 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 변형제는 상자성 이온 또는 기를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 접합체의 수성 제형을 제조하는 단계 및 상기 제형을 개체에게 비경구적으로 주사하는 단계를 포함하는 개체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 접합체를 포함하는 이식물을 제조하는 단계 및 상기 이식물을 개체에 이식하는 단계를 포함하는 개체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 예시적인 구현예에서, 상기 이식물은 생체분해성 겔 매트릭스이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 개시된 방법에 따른 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 동물을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 개시된 방법에서와 같은 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 개시된 방법에서와 같은 검출가능한 분자를 포함하는 접합체를 투여하는 단계; 및
상기 검출가능한 분자를 검출하는 단계를 포함하는 동물에서 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
어떤 예시적인 구현예에서, 상기 검출가능한 분자를 검출하는 단계는 비-침입적으로 수행된다. 어떤 예시적인 구현예에서, 상기 검출가능한 분자를 검출하는 단계는 적합한 이미징 장치를 이용하여 수행된다.
한 구현예에서, 동물을 치료하는 방법은 종양 또는 성장이 제거된 외과적 상처에 대한 패킹(packing)으로서 상기 동물에게 본 발명의 생체분해성 생체호환성 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 생체분해성 생체호환성 접합체 패킹은 상기 상처가 치유될 때 회복, 분해 및 소멸되는 동안에 상기 종양 부위를 대체할 것이다.
어떤 구현예에서, 상기 접합체는 생체내 모니터링을 위한 진단 라벨과 연관된다.
전술한 접합체는 동물의 치료, 예방 및 분석적(진단적) 치료를 위해 사용될 수 있다. 상기 접합체는 일반적으로 비경구 투여를 의도하는 것이지만, 일부 경우에 있어서는 다른 경로에 의해 투여될 수 있다.
한 구현예에서, 용해성 또는 콜로이드성 접합체는 국소(예컨대, 피하, 근육내) 주사를 통해 투여된다. 다른 구현예에서, 고형 접합체(예컨대, 입자, 이식물, 약물 운반 시스템)는 이식 또는 주사를 통해 투여된다.
다른 구현예에서, 검출가능한 라벨을 포함하는 접합체는 동물 체내에서 라벨 분포의 패턴 및 역학을 연구하기 위해 투여된다.
어떤 구현예에서, 본 명세서에 개시된 임의의 하나 이상의 접합체는 전술한 임의의 방법의 실행시에 사용될 수 있다. 어떤 예시적인 구현예에서, 상기 접합체는 트라스투주맙-PHF-, 리툭시맙-PHF-, 린투주맙-PHF 또는 항-5T4-PHF-약물 접합체이다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 조성물들은 특정 성분들을 갖거나, 포함하거나, 또는 함유하는 것으로 개시되어 있지만, 조성물들은 또한 인용된 성분들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 것임이 이해되어야 한다. 유사하게, 방법 또는 공정들은 특정 공정 단계들을 갖거나, 포함하거나, 또는 함유하는 것으로 기재되어 있지만, 상기 공정들은 또한 인용된 공정 단계들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다. 또한, 단계들의 순서 또는 특정 활동들을 수행하는 순서는 본 발명이 조작가능하게 남아 있는 한 중요하지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 2 이상의 단계 또는 활동이 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 합성 공정은 넓은 범위의 작용기를 용인할 수 있다; 따라서, 다양한 치환된 출발 물질이 사용될 수 있다. 상기 공정은, 어떤 경우에 있어서는 상기 화합물을 약학적으로 허용가능한 그의 염, 에스테르 또는 전구약물로 추가로 전환시키는 것이 바람직할 수도 있지만, 일반적으로 전체 공정의 끝 또는 그 근처에서 원하는 최종 화합물을 제공한다.
본 발명의 접합체용으로 사용되는 약물 화합물은 상업적으로 구입가능한 출발 물질, 문헌에 공지된 화합물, 또는 즉시 제조된 중간체를 이용하거나, 본 기술분야의 기술자에게 알려지거나 본 명세서에 개시된 내용에 비추어 숙련된 기술자에게 자명한 표준 합성 방법 및 절차를 도입함으로써 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 유기 분자의 제조 및 작용기 변환 및 취급을 위한 표준 합성 방법 및 절차는 본 기술분야의 해당 과학 문헌 또는 표준 교과서로부터 입수될 수 있다. 임의의 하나 또는 몇 가지 공급원으로 한정되는 것은 아니지만, 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 스미스 등의 문헌(Smith, M.B., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001) 및 그린 등의 문헌(Greene, T.W., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999)와 같은 고전적인 교과서가 본 기술분야의 기술자에게 알려진 유기 합성의 참고 교과서로 인식되고 유용하다. 다음의 합성 방법에 대한 개시는 본 발명의 화합물의 제조를 위한 일반적인 절차를 예시하기 위해 디자인되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 접합체 및 본 명세서에 포함되는 약물 화합물은 본 기술분야의 기술자에게 친숙한 다양한 방법에 의해 전통적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 접합체 또는 화합물은 본 명세서에 개시된 각각의 제형과 함께 상업적으로 구입가능한 출발 물질 또는 문헌의 절차를 이용하여 제조될 수 있는 출발 물질로부터 다음의 절차에 따라 제조될 수 있다. 상기 절차는 본 발명의 대표적인 접합체의 제조를 보여준다.
상기 개시된 방법에 의해 디자인, 선택 및/또는 최적화된 접합체는, 일단 제조되면, 상기 접합체가 생물학적 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위하여 본 기술분야의 기술자에게 알려진 다양한 분석을 이용해 특성분석될 수 있다. 예를 들면, 상기 접합체는 예측된 활성, 결합 활성 및/또는 결합 특이성을 갖는지 여부를 결정하기 위하여 하기 개시된 분석들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 종래의 분석에 의해 특성분석될 수 있다.
또한, 이러한 분석을 이용한 분석의 속도를 높이기 위해 고속대량(high-throughput) 스크리닝이 사용될 수 있다. 그 결과, 본 기술분야에 알려진 기술을 이용해 본 명세서에 개시된 상기 접합체 분자의 활성을 신속하게 스크리닝하는 것이 가능할 수 있다. 고속대량 스크리닝을 수행하기 위한 일반적인 방법론은, 예를 들면, 델빈의 문헌(Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker); 및 미국 특허 제5,763,263호에 개시되어 있다. 고속대량 분석은 아래에 개시된 것들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 하나 이상의 상이한 분석 기술을 이용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 모든 공개문헌 및 특허 문헌들은 이러한 각각의 공개문헌 또는 문헌이 인용에 의해 구체적이고 개별적으로 본 명세서에 포함되는 것을 나타내는 것처럼 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 공개문헌 및 특허 문헌을 인용하는 것은 이들이 적절한 종래기술임을 인정하거나, 그 내용물 및 날짜에 대해 이와 동일한 인정을 구성하는 것을 의도하는 것은 아니다. 본 발명은 지금까지 기록된 설명에 의해 개시되었지만, 본 기술분야의 기술자는 본 발명이 다양한 구현예로 수행될 수 있고, 전술한 개시 및 하기 실시예는 설명을 위한 것으로서 후속하는 청구항을 제한하는 것이 아님을 인식할 것이다.
실시예
하기 작용 실시예는 링커, 약물 분자 및 PBRM, 그리고 그의 제조 방법의 예시이다. 이들은 제한하려는 것이 아니며, 본 기술분야의 기술자에 의해 다른 시약 또는 방법이 이용될 수 있음이 쉽게 이해될 것이다.
본 명세서에 기재된 접합체는 상기 일반적으로 개요된 반응식에 의해 그리고 아래 실시예에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 아래의 특정 실시예에서 사용되는 용어 "함량"은 달리 명시되지 않는 한, 의도된 모이어티, 예컨대 링커, 약물 분자, 또는 PBRM으로 치환되는 폴리머 구조 단위의 몰 분율 또는 몰 백분율을 의미한다. 따라서, 아래 실시예에서 이용되는 폴리머-약물 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체에서의 다양한 폴리머 단위에 대해 보고된 백분율은 달리 명시되지 않는 한 몰 백분율이다.
약어
하기 약어가 후술되는 반응식 및 합성 실시예에서 이용된다. 이 목록은 추가적인 표준 약어로서 본 명세서에서 이용되는 약어의 모든 포괄적 목록을 의미하는 것이 아니며, 이는 유기 합성 분야의 기술자에 의해 쉽게 이해되고, 또한 합성 반응식 및 실시예에서 이용될 수 있다.
ACN 아세토니트릴
AF-HPA 오리스타틴 F-히드록시프로필아미드
Ala 알라닌
BA β-알라닌
BOC tert-부틸옥시카르보닐
DCC N,N'-디시클로헥실카르보디이미드
DCM 디클로로메탄
DIEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMA 디메틸아세트아미드
DMAP N,N-디메틸피리딘-4-아민
DMF 디메틸포름아미드
DMSO 디메틸설폭시드
EDAC N1-((에틸이미노)메틸렌)-N3,N3-디메틸프로판-1,3-디아민 히드로클로라이드
EDC.HCl 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드
GA 글루타르산
HIC-HPLC 소수성 상호작용 고압 액체 크로마토그래피
HOAt 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt 1-히드록시벤조트리아졸 수화물
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
HPSEC 고성능 크기 배제 크로마토그래피
HPV 히드록시프로필빈데신
2HPV 2-히드록시프로필빈데신
MWCO 분자량 컷오프
NHS 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온(즉, N-히드록시-숙신이미드)
NMP N-메틸-2-피롤리돈
PBS 포스페이트 버퍼화 식염수, 0.9% NaCl
EG 에틸렌 글리콜
EG2 디에틸렌 글리콜
MI 말레이미드 또는 말레이미도
HPA-Ala 히드록시프로필아미드-L-알라닌
PHF 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸포르말), 또는 FLEXIMER®
RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피
SEC 크기 배제 크로마토그래피
TBSCl tert-부틸디메틸실릴 에테르 클로라이드
TCEP 트리스[2-카복시에틸]포스핀
TEA 트리에틸아민
TEAA 트리에틸암모늄 아세테이트
TFA 트리플루오로아세트산
*WCX 약 양이온 교환 크로마토그래피
일반 정보
말레이미도-EG2-NHS 에스테르는 Biomatrik, China에서 구입하였다.
Boc-디아미노에탄 HCl은 Chem-Impex International Inc., Wood Dale, IL.에서 구입하였다.
Genentech에서 제조된 주입용 Kadcyla®(아도-트라스투주맙 엠탄신)을 구입하였다.
HPLC 정제는 Phenomenex Gemini 5 ㎛ 110 Å, 250 × 10 ㎜, 5 마이크론, 반제조용 칼럼 상에서 수행하였다.
SEC은 Tosoh Biosciences TSK 겔 G5000 칼럼(7.8 ㎜ × 30 ㎝, 10 ㎛) 또는 Superose 12 칼럼(GE Healthcare) 상에서 수행하였다.
WCX를 ProPac WCX-10(94 ㎜ × 250 ㎜) 칼럼(ThermoFisher) 상에서 수행하였다.
가능한 경우에는 항상 접합체의 약물 함량을 분광측정으로 결정하였고 다르게는 약물 함량의 정량적 결정을 위해 LC/MS 또는 1H-NMR을 수행하였다.
단백질-폴리머-약물 접합체의 단백질 함량은 280 ㎚에서 분광측정으로 또는 ELISA에 의해 결정하였다.
폴리머 접합체의 분자량(겉보기 중량 평균 분자량 또는 피크 분자량으로 보고됨)은 다당류 또는 단백질 분자량 표준으로 SEC에 의해 결정하였다. 보다 구체적으로, 폴리머 또는 폴리머-약물 접합체에 대해 다당류 분자량 표준을 이용하였고, 단백질-약물-폴리머 접합체에 대해 단백질 표준을 이용한다. 구체적으로 나타내지 않는 한, 보고된 폴리머 담체 분자량은 PHF의 중량 평균 분자량이고; 폴리머-약물 접합체 분자량 및 단백질-폴리머-약물 접합체는 피크 분자량이다. PBRM-폴리머-약물 접합체는 약 160 kDa 내지 약 260 kDa의 피크 분자량을 갖는다. 합성된/측정된 폴리머 및 폴리머 접합체는 전형적으로 1.5 이하의 다분산성을 갖는다.
PBRM-폴리머-약물 접합체를 광범위 여과작용에 의해 잔여 미반응 약물-폴리머 접합체로부터 분리하였다. 필요한 경우, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 WCX 크로마토그래피에 의한 추가 정제를 수행하여 임의의 응집된 PBRM-폴리머-약물 접합체를 제거하였다. 일반적으로, PBRM-폴리머-약물 접합체는 전형적으로 SEC에 의해 결정되는 5% 미만(w/w, 예로 2% w/w 미만)의 응집 분획; RP-HPLC 또는 LC-MS/MS에 의해 결정되는 0.5% 미만(w/w, 예로, 0.1% w/w 미만)의 자유(접합되지 않은) 약물; SEC 및/또는 RP-HPLC에 의해 결정되는 1%(w/w) 미만의 자유 폴리머-약물 접합체 및 HIC-HPLC 및/또는 WCX HPLC에 의해 결정되는 2% 미만(w/w, 예로, 1% w/w 미만)의 접합되지 않은 PBRM을 함유하였다. 환원되거나 부분적으로 환원된 항체는 문헌에 기재된 절차를 이용하여 제조하였으며, 예를 들어 [Francisco et al., Blood 102(4):1458-1465(2003)]을 참조. 총 약물(접합된 및 접합되지 않은) 농도는 LC-MS/MS에 의해 결정하였다.
약동학적 특성, 즉 PBRM-폴리머-약물 접합체 흡수, 분포, 대사, 및 배출의 시간 경과를 연구하기 위해, 예를 들면 혈장, 종양 및 조직 샘플 중 PBRM-PHF-AF-HPA 접합체(즉 접합된 AF-HPA)의 농도 및 방출된, 접합되지 않은 AF-HPA 및 AF(자유 약물)의 농도를 측정하기 위한 분석을 개발하였다. 샘플 중 자유 약물의 농도를 결정하기 위해, 산성화된 샘플을 아세토니트릴로 처리하였다. 자유 약물을 상등액으로부터 추출하고 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 접합된 AF-HPA의 농도를 결정하기 위해, 산성화된 혈장, 종양 또는 조직 균질화물을 염기성 가수분해를 거친 뒤 산성화하고 아세토니트릴로 단백질을 침전시켰다. 방출된 AF-HPA 및 AF를 함유하는 아세토니트릴 상등액을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 혈장 및 종양 그리고 조직 균질화물 중 자유 약물 및 접합된 AF-HPA에 대한 표준 곡선은 각각 0.3 내지 3,000 ng/㎖ 및 10 내지 20,000 ng/㎖의 농도 범위에 걸쳐 선형이었다. 총 트라스투주맙 농도는 ELISA에 의해 결정하였다.
본 명세서에 기재된 모든 시험관내 또는 생체내 실험에서, 달리 명시되지 않는 한 이용된 용량은 모두 PBRM-폴리머-약물 접합체의 PBRM(예로, 항체)을 기준으로 하였다.
RP-HPLC, SDS-PAGE 또는 모세관 전기영동을 이용하여 PBRM-폴리머-약물 접합체에서 시스테인 생체접합 부위의 특이성 및 분포를 특성규명하였다. 결과는 PBRM의 중쇄(H) 및 경쇄(L) 상 약물-폴리머 접합체의 위치 분포를 제공하였고, PBRM에 대한 접합이 중쇄 사슬간 시스테인 힌지 영역에서 주로 일어남을 나타내었다. 유사한 결과가 LC-MS PBRM 펩타이드 맵으로 수득되었다.
일반 절차
일반 절차 A. 링커 또는 약물을 이용한 폴리머 접합
일반적으로, 폴리머(PHF-BA 또는 PHF-GA)와 아민-함유 링커, 예를 들면 EG2-말레이미드 또는 아민-함유 링커 약물, 예를 들면 AF-HPA-Ala, HPV-Ala의 접합은 수성 또는 10-90% 유기/수성 용매 혼합물 중 활성화제, 예를 들면 EDC.HCl의 존재 하에 수행한다. 전형적인 유기 용매에는 비제한적으로 수 혼화성 용매, 예를 들면 DMSO, DMF, DMA, NMP 및 ACN이 포함된다. 커플링을 가속화하기 위해, 공동-활성화제, 예를 들면 NHS를 첨가한다. 폴리머를 먼저 아미노-함유 화합물과 혼합한 후 공동-활성화제(NHS)를 첨가하고 이어서 활성화제(EDC.HCl)를 첨가한다. 반응은 0-10℃, pH 4.5 내지 7.5에서 1시간 내지 24시간 동안 상온에서 수행한다. 생성 폴리머 접합된 산물을 여과작용에 의해 또는 SEC에 의해 정제한다. 산물을 2-50 ㎎/㎖로 농축하고, pH를 4.5 내지 6.5로 조정하여 약물-폴리머 링커 안정성을 확보하고, 접합체를 추가 사용 시까지 -20 내지 -80℃에서 냉동 보관한다.
폴리머와 아민-함유 링커 또는 약물의 접합은 순차적으로, 임의 순서로, 또는 동시에 수행할 수 있다.
일반 절차 B. 단백질(PBRM)의 부분적인 선택적 환원
폴리머-약물 접합체와의 접합 전에 관련 PBRM에서 사슬간 디설파이드기 또는 페어링하지 않은 디설파이드의 부분적인 선택적 환원을 환원제, 예를 들어, TCEP, DTT 또는 β-머캅토에탄올을 이용해서 달성한다. 환원이 과량 환원제로 수행되는 경우, 환원제를 SEC에 의한 접합 전에 제거한다. PBRM 디설파이드기의 반응성 설프하이드릴기로의 전환도는 PBRM의 화학양론, 환원제, pH, 온도 및/또는 반응 기간에 의존한다. PBRM에서 전부가 아닌 일부 디설파이드기가 환원되는 경우, 환원된 PBRM은 부분적으로 환원된 PBRM이다.
일반 절차 C. 부분적으로 환원된 PBRM과 폴리머 약물 접합체의 접합
부분적으로 환원된 PBRM의 폴리머-약물 접합체로의 접합을 중성 또는 약염기성 조건 하에(pH 6.5-8.5) PBRM 농도 1-10 ㎎/㎖ 및 폴리머-약물 접합체 농도 0.5-10 ㎎/㎖에서 수행한다. 폴리머-약물 접합체는 전형적으로 원하는 단백질-폴리머-약물 접합체 화학양론에 대해 1-5.0배 과량으로 사용한다. PBRM이 폴리머-약물 접합체의 말레이미도기에 접합되는 경우, 접합은 선택적으로 수용성 말레이미도 차단 화합물, 예를 들어 N-아세틸 시스테인, 시스테인 메틸 에스테르, N-메틸 시스테인, 2-머캅토에탄올, 3-머캅토프로판산, 2-머캅토아세트산, 머캅토메탄올(즉, HOCH2SH), 벤질 티올 등의 첨가에 의해 종료시킨다.
생성 PBRM-폴리머-약물 접합체를 전형적으로 여과작용에 의해 정제하여 임의의 접합되지 않은 폴리머-약물 접합체, 접합되지 않은 약물 및 소분자 불순물을 제거한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 적절한 크로마토그래피 분리 절차, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 예를 들어 WCX 크로마토그래피; 역상 크로마토그래피, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 또는 이들의 조합을 이용하여 PBRM-폴리머-약물 접합체를 정제할 수 있다. 정제된 생성 PBRM-폴리머-약물 접합체는 전형적으로 pH 5.0-6.5의 버퍼 중에 제형화한다.
실시예 1. EG2-말레이미드: (O-[N-(3-말레이미도프로피오닐)아미노에틸]-O'-[3-(N-(2-아미노에틸)아미노)-3-옥소프로필]에틸렌 글리콜)의 합성
Figure pat00144
ACN(15 ㎖) 중 말레이미도-EG2-NHS 에스테르(O-[N-(3-말레이미도프로피오닐)아미노에틸]-O'-[3-(N-숙신이미딜옥시)-3-옥소프로필]에틸렌 글리콜(1.2 g, 2.82 m㏖) 및 Boc-디아미노에탄 히드로클로라이드(560 ㎎, 2.82 m㏖)의 빙냉 현탁액에 TEA(0.571 g, 5.64 m㏖)를 교반하면서 적가하였다. 생성 혼합물을 실온으로 가져가고 실온에서 하룻밤 동안 교반을 계속하였다. 추가적인 BOC-디아미노에탄 히드로클로라이드를 첨가하여(110 ㎎) 반응이 완료하도록 유도하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축하고 잔류물을 RP-HPLC(수중 0-100% ACN) 상에 정제하여 Boc-디아미노에탄-EG2-말레이미드를 무색 고체로 얻었다(1.18 g, 89% 수율). ESI MS: C21H35N4O8 [M+H+] 산출값 471.3; 실측값 471.2.
Boc-디아미노에탄-EG2-말레이미드(1.18 g, 2.508 m㏖)를 0℃에서 DCM(20 ㎖) 중 30% TFA 용액에 용해시키고, 생성 용액을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 조정제 반응 혼합물을 진공 하에 농축한 뒤 RP-HPLC(0.1% TFA 함유 수중 0-10% ACN) 상에서 정제하여 표제 화합물(EG2-말레이미드)을 무색 오일로 산출하였다(1.04 g, 86%).
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6+D2O): δ 6.95(s, 2 H), 3.66-3.54(m, 10 H), 3.34(t, 2 H, J = 5.6 Hz), 3.27(t, 2 H, J = 6.7 Hz), 3.18-3.10(m, 2 H), 2.84(t, 2 H, J = 6.2 Hz), 2.33(q, 4 H, J = 6.7 Hz); ESI MS: C16H27N4O6 [M+H+]에 대한 산출값 371.2; 실측값 371.2.
실시예 2. 10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(3%)의 합성
Figure pat00145
물(10 ㎖) 중 10K PHF-BA(30%) 용액(588 ㎎, 3.46 m㏖, US13/493,899, 현재 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 물(5 ㎖) 중 EG2-말레이미드 용액(102 ㎎, 0.211 m㏖, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)을 첨가한 뒤 N-히드록시-숙신이미드(NHS, 25 ㎎, 0.211 m㏖)를 첨가하였다. 생성 혼합물을 5-10℃로 냉각하고, 0.1N NaOH 용액을 이용해서 pH를 5.8로(5.3에서부터) 조정하였다. 이어서 물(2 ㎖) 중 EDC.HCl(94 ㎎, 0.486 m㏖)을 40분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가져가고 교반을 실온에서 18시간 동안 계속하였다. 생성 산물을 3K MWCO 멤브레인 상에서 여과작용에 의해 정제하고 동결건조하여 표제 화합물을 회백색 고체 산물(0.460 g, 71% 수율)로 얻었다.
1H-NMR(400 MHz, D2O): 6.9 ppm(넓은 단선, MI), 5.0-4.7 ppm(m, 1H, O-CH-O-, 아세탈- 양성자 폴리머), 4.3-3.6 ppm(m, O-CH2- 폴리머 골격 및 링커 양성자), 3.4-3.3 ppm(m, CH2-NH-, 베타-알라닌 및 링커 양성자), 2.7-2.4 ppm(m, CH2-COOH-, 베타-알라닌 및 링커 양성자). 1H-NMR에 의해 결정된 EG2-MI 링커 로딩(즉, EG2-MI 링커 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 3 ㏖%였다.
실시예 3. 10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(3%)-AF-HPA-Ala(8%)의 합성
Figure pat00146
물(4.2 g) 중 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(3%)의 균질한 용액(144 ㎎, 11.08 μ㏖, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)을 5-10℃로 냉각하였다. 용액의 pH를 1N HCl을 이용해서 5.8로 조정한 뒤 NMP(1.4 ㎖) 및 NHS(0.5 ㎖ 수중 16 ㎎) 중에 용해된 오리스타틴 F-히드록시프로필아미드-L-알라닌.2TFA(AF-HPA-Ala.2TFA)(85 ㎎, 77.52 μ㏖, US13/493,899, 현재 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 50에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)를 첨가하였다. 혼합물을 5-10℃에서 강력 교반하고 용액의 pH를 0.1N NaOH로 5.8로 조정하였다. 생성 혼합물에 EDC.HCl의 새로 제조된 수용액(0.5 ㎖ 수중 30 ㎎)을 첨가하였다. 45분 후, 추가적인 EDC.HCl(0.5 ㎖ 수중 30 ㎎)을 첨가하고, pH를 5.8에서 유지하면서 생성 혼합물을 18-24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 RP-HPLC 분석은 원료 오리스타틴 화합물의 95% 초과 소비를 시사하였다. 산물을 3K MWCO 멤브레인 상의 여과작용에 의해 정제하고, 이어서 HPLC 및 동결건조에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(143 ㎎, 78% 수율).
1H-NMR(400 MHz, D2O): 7.15 ppm(넓은 단선, AF-HPA 방향족 양성자), 6.9 ppm(넓은 단선, MI), 5.0-4.8 ppm(m, 1H, O-CH-O-아세탈- 양성자 폴리머), 4.4-3.6 ppm(m, O-CH2- 폴리머 골격 및 약물/링커 양성자), 3.4-2.8 ppm(m, CH 2 -NH-, 베타-알라닌 및 약물/링커 양성자), 2.2-1.8 ppm(m, CH 2 -COOH-, 베타-알라닌 및 약물/링커 양성자) 및 1.6-0.9 ppm(m, 약물/링커 양성자).
1H-NMR에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 8 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 6 개의 AF-HPA 분자)였다. 표제 접합체의 분자량은 약 17 kDa이었다.
실시예 4. 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%))의 합성
Figure pat00147
TEAA 버퍼 중 트라스투주맙의 용액(6.19 ㎖, 100 ㎎, 0.676 μ㏖)에 TCEP 용액(0.6 ㎖, 2.36 μ㏖, 0.678 ㎎)을 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 뒤, ∼0℃로 냉각하였다. 이어서 부분적으로 환원된 트라스투주맙을 0℃에서 TEAA 버퍼, pH 7.4(26.5 ㎖) 중 10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(3%)-AF-HPA-Ala(8%)의 강력 교반된 용액(76 ㎎, 실시예 3에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 첨가하였다. 교반을 30분 동안 0℃에서 계속하였다. 반응을 시스테인 히드로클로라이드의 수용액(65 ㎎, 371 μ㏖, 1.9 ㎖)으로 켄칭하였다. 1시간 동안 상온에서 pH 7.0에서 교반 후, 반응 혼합물을 pH 5.0으로 산성화하였다. 조정제 산물을 크로마토그래피에 이어 SEC 정제에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(61 ㎎, 61% 수율).
AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 12:1 내지 약 17:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 180 kDa, PDI 1.15였다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이었다.
PBRM-폴리머-약물 접합체, 트라스투주맙-((PEG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%))(2.5 ㎍, 상술된 것과 유사한 방식으로 제조)를 비환원성 및 환원성 조건 하에 SDS-PAGE, 즉 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 거치고 Odyssey IRDye® Blue 단백질 염색 버퍼로 가시화하였다. 비환원성 조건 하에서는 접합체를 70℃에서 10분 동안 가열하거나 SDS-PAGE 분석 전에 가열하지 않았다.
SDS-PAGE 겔은 접합체가 비환원성 조건, 예를 들면 70℃에서 10분 하에 안정하며 해리되지 않았음을 나타내었다. 환원성 조건 하에서는 접합체가 중쇄 및 경쇄 단편으로 해리되었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 갖는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 5. 10K PHF-BA(30%)-AF-HPA-Ala(9%)의 합성
Figure pat00148
물(20 ㎖) 중 10K PHF-BA(30%)의 균질한 용액(700 ㎎, US13/493,899, 현재 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 NMP(6.7 g) 중에 용해된 오리스타틴 F-히드록시프로필아미드-L-알라닌.2TFA(AF-HPA-Ala.2TFA)(460 ㎎, 417 μ㏖, US13/493,899, 현재 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 50에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)를 첨가하였다. 생성 혼합물을 5-10℃로 냉각하면서 강력히 교반하였다. 용액의 pH를 5.8로 조정한 뒤, NHS(1 ㎖ 수중 129 ㎎)를 첨가하였다. 생성 혼합물에 EDC.HCl의 새로 제조된 수용액(1 ㎖ 수중 223 ㎎)을 첨가하였다. 30분 후, 추가적인 EDC.HCl(1 ㎖ 수중 220 ㎎)을 첨가하고, pH를 5.8에서 유지하면서 생성 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. RP-HPLC 분석은 원료 오리스타틴 화합물의 95% 초과 소비를 시사하였다. 산물을 HPLC 및 동결건조에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(859 ㎎, 83% 수율).
1H-NMR(400 MHz, D2O): 7.7-7.2 ppm(넓은 단선, AF-HPA 방향족 양성자), 5.0-4.8 ppm(m, 1H, O-CH-O-아세탈- 양성자 폴리머, 부분적으로 물 신호 하에 은폐됨), 4.4-3.6 ppm(m, O-CH2- 폴리머 골격 및 약물/링커 양성자), 3.5-2.8 ppm(m, CH 2 -NH-, 베타-알라닌 및 약물/링커 양성자), 2.2-1.6 ppm(m, CH 2 -COOH-, 베타-알라닌 및 약물/링커 양성자) 및 1.6-0.8 ppm(m, 약물/링커 양성자).
1H-NMR에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩은 폴리머 구조 단위의 8.7 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 6 개의 AF-HPA 분자)였다. 접합체 A:10K PHF-BA(30%)-AF-HPA-Ala(9.5%)를 상술된 절차를 이용해서 10K PHF-BA(30%)(100 ㎎)로부터 제조하였다.
실시예 6. 10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(2%)-AF-HPA-Ala(9%)의 합성
Figure pat00149
물(13.7 ㎖) 중 10K PHF-BA(30%)-AF-HPA-Ala(9%)의 용액(500 ㎎, 35 μ㏖. 실시예 5에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 EG2-말레이미드 용액(83 ㎎, 0.139 m㏖, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 이어 N-히드록시-숙신이미드(NHS, 40 ㎎, 0.348 m㏖)를 첨가하였다. 생성 혼합물을 5-10℃로 냉각하고, 0.1N NaOH 용액을 이용해서 pH를 5.8로(4.6에서) 조정한다. 이어서 물(2 ㎖) 중 EDC.HCl(174 ㎎, 0.91 m㏖)을 2 개의 동일 부분으로 40분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물의 RP-HPLC 분석은 EG2-말레이미드의 95%를 초과하는 소비를 시사하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가져가고 실온에서 18시간 동안 교반을 계속하였다. 생성 산물을 3K MWCO 멤브레인 상에 여과작용에 의해 정제하고 동결건조하여 표제 화합물을 회백색 고체 산물로 얻었다(0.57 g, 100% 수율).
1H-NMR(400 MHz, D2O): 7.4-7.2 ppm(넓은 단선, AF-HPA 방향족 양성자), 6.9 ppm(넓은 단선, MI), 5.0-4.8 ppm(m, 1H, O-CH-O-아세탈- 양성자 폴리머, 부분적으로 물 피크 아래에 은폐됨), 4.4-3.6 ppm(m, O-CH2- 폴리머 골격 및 약물/링커 양성자), 3.5-2.8 ppm(m, CH 2 -NH-, 베타-알라닌 및 약물/링커 양성자), 2.2-1.6 ppm(m, CH 2 -COOH-, 베타-알라닌 및 약물/링커 양성자) 및 1.6-0.8 ppm(m, 약물/링커 양성자).
1H-NMR에 의해 결정된 EG2-MI 링커 로딩은 폴리머 구조 단위의 ∼2 ㏖%였다. 표제 화합물의 분자량은 약 20 kDa이었다. 평균, 폴리머 사슬 당 6 개의 AF-HPA 분자가 존재하였다.
실시예 7. 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(9%))의 합성
Figure pat00150
TEAA 버퍼 중 트라스투주맙 용액(6.4 ㎖, 100 ㎎, 0.68 μ㏖)에 TCEP 용액(0.993 ㎎, 3.4 μ㏖)을 교반하면서 첨가했다. 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 부분적으로 환원된 트라스투주맙을 TEAA 버퍼, pH 7.4(26.5 ㎖) 중 10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(2%)-AF-HPA-Ala(9%)의 강력 교반된 용액(86 ㎎, 4.7 μ㏖, 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 0℃에서 첨가하였다. 교반을 45분 동안 실온에서 계속하였다. 반응을 TEAA 버퍼, pH 6.8(65 ㎎, 371 μ㏖, 1.9 ㎖) 중 시스테인 수용액으로 켄칭하였다. 1시간 동안 상온에서 pH 7.0에서 교반 후, 반응 혼합물을 pH 5.8로 산성화하였다. 조정제 산물을 SEC 정제에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(35 ㎎, 35% 수율).
AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 16:1 내지 약 21:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 210 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 8. 린투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(9%))의 합성
Figure pat00151
10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(2%)-AF-HPA-Ala(9%)(실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 린투주맙 및 TCEP:린투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 표제 화합물을 제조하였다.
AF-HPA 대 린투주맙의 비는 약 10:1 내지 약 15:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 184 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 린투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 9. 리툭시맙-((EG2-MI(3%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%))의 합성
Figure pat00152
10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(3%)-AF-HPA-Ala(8%)(실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 리툭시맙 및 TCEP:리툭시맙 3.5:1이 이용된 것을 제외하고, 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 표제 화합물을 제조하였다.
AF-HPA 대 리툭시맙의 비는 약 13:1 내지 약 18:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 163 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 리툭시맙의 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 10. 항-5T4-((EG2-MI(3%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%))의 합성
Figure pat00153
10K PHF-BA(30%)-EG2-MI(3%)-AF-HPA-Ala(8%)(실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 및 항-5T4 scFvFc 항체 및 TCEP:항-5T4 scFvFc 항체 3:1이 이용된 것을 제외하고 표제 화합물("항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체", 또는 "항-5T4 scADC")을 실시예 7에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 항-5T4 scFvFc 항체(항-5T4 단일 사슬 항체-Fc 융합 단백질)를 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 2013년 6월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,858호에 개시된 바와 같이 CHO DG44 세포에서 재조합적으로 제조하였다.
AF-HPA 대 항-5T4 항체의 비는 약 12:1 내지 약 18:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 200 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 항-5T4 항체의 비는 약 2:1 내지 약 3:1 또는 약 3:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 11. 10K PHF-GA(29%)-EG2-MI(1%)의 합성
Figure pat00154
물(35 ㎖) 중 10K PHF-GA(29%)의 용액(1.7 g, 10.1 m㏖, US13/493,899, 현재 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 DMA(3 ㎖) 중 EG2-말레이미드 용액(204 ㎎, 0.42 m㏖, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 이어 N-히드록시-숙신이미드(NHS, 70.3 ㎎, 0.611 m㏖)를 첨가하였다. 생성 혼합물을 5-10℃로 냉각하였다. 이어서 물(2 ㎖) 중 EDC.HCl(269 ㎎, 1.402 m㏖)을 40분에 걸쳐 2 개의 동일 부분으로 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가져가고 실온에서 18시간 동안 계속 교반하였다. 생성 산물을 3K MWCO 멤브레인 상의 여과작용에 의해 정제하고 동결건조하여 표제 화합물을 회백색 고체 산물로 얻었다(1.7 g, 91% 수율).
1H-NMR(400 MHz, D2O): 6.9 ppm(넓은 단선, MI), 5.0-4.7 ppm(m, 1H, O-CH-O-, 아세탈- 양성자 폴리머, 부분적으로 물 피크 아래에 은폐됨), 4.4-3.6 ppm(m, O-CH2-폴리머 골격 및 링커 양성자), 3.3-2.6 ppm(m, 링커 양성자), 2.5 ppm(m, CH 2 -CO-, 글루타르산 양성자), 2.3 ppm(넓은 단선, CH 2 -COO-, 글루타르산 양성자), 1.9 ppm(넓은 단선, -CH2-CH 2 -CH2-CO-, 글루타르산 양성자).
1H-NMR에 의해 결정된 EG2-MI 링커 로딩은 폴리머 구조 단위의 1 ㏖%였다.
실시예 12. 10K PHF-GA(29%)-EG2-MI(1%)-AF-HPA-Ala(6%)의 합성
Figure pat00155
물(5.4 g) 중 10K PHF-BA(29%)-EG2-MI(1%)의 균질한 용액(214 ㎎, 15 μ㏖, 실시예 11에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 NMP(1.85 ㎖) 및 NHS(0.5 ㎖ 수중 25 ㎎) 중에 용해된 AF-HPA-Ala.2TFA)(98 ㎎, 90 μ㏖, US13/493,899, 현재 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 50에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)를 첨가하였다. 혼합물을 5-10℃에서 강력 교반하였다. 생성 혼합물에 EDC.HCl의 새로 제조된 수용액(0.8 ㎖ 수중 40 ㎎)을 첨가하였다. 30분 후, 추가적인 EDC.HCl(0.8 ㎖ 수중 44 ㎎)을 첨가하고, pH를 5.8에서 유지하면서 생성 혼합물을 18-24시간 동안 교반하였다. RP-HPLC 분석은 원료 오리스타틴 화합물의 95% 초과 소비를 시사하였다. 산물을 3K MWCO 멤브레인 상에 여과작용에 의해 정제하고 10 ㎖로 농축하여 표제 화합물을 얻었다(177 ㎎, 63% 수율).
1H-NMR(400 MHz, D2O): 7.4-7.2 ppm(넓은 단선, AF-HPA 방향족 양성자), 6.9 ppm(넓은 단선, MI), 5.0-4.8 ppm(m, 1H, 0-CH-O-, 아세탈- 양성자 폴리머), 4.4-3.6 ppm(m, O-CH2- 폴리머 골격 및 링커 양성자), 3.4-2.9 ppm(m, 약물 링커 양성자), 2.5 ppm(넓은 3 중선, CO-CH 2 -, 글루타르산 양성자), 24-2.2 ppm(m, CH 2 -COO-, 글루타르산 양성자 및 약물/링커 양성자), 2.0-1.8 ppm(m, -CH2-CH 2 -CH2-CO-, 글루타르산 양성자), 1.5-0.8(m, 약물/링커 양성자).
1H-NMR에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩은 폴리머 구조 단위의 5.9 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 4.5 개의 AF-HPA 분자)였다. 표제 접합체의 분자량은 약 17 kDa이었다.
실시예 13. 트라스투주맙-((EG2-MI(1%))-(10 kDa PHF-GA(29%)-(AF-HPA-Ala(6%))의 합성
Figure pat00156
10K PHF-GA(29%)-EG2-MI(1%)-AF-HPA- Ala(6%)(78 ㎎, 실시예 12에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조) 및 트라스투주맙(25 ㎎) 및 TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 18:1 내지 약 23:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 200 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 4:1 내지 약 5:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 14. 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%))의 합성
Figure pat00157
10K PHF-BA(28%)-EG2-MI(2%)-AF-HPA-Ala(9%)(11 ㎎, 실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 절차를 이용해서 제조됨, 트라스투주맙(620 ㎎) 및 TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다.
AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 10:1 내지 약 15:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 183 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 15. 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%))의 합성
Figure pat00158
10K PHF-BA(28%)-EG2-MI(2%)-AF-HPA-Ala(9%)(243 ㎎, 실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 절차를 이용해서 제조됨), 트라스투주맙(435 ㎎) 및 TCEP:트라스투주맙 3:1을 이용한 것을 제외하고 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다.
AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 11:1 내지 약 16:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 197 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 16. 리툭시맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%))의 합성
Figure pat00159
10K PHF-BA(28%)-EG2-MI(2%)-AF-HPA-Ala(9%)(170 ㎎, 실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 절차를 이용해서 제조됨) 300 ㎎ 리툭시맙 및 TCEP:리툭시맙 3:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다.
AF-HPA 대 리툭시맙의 비는 약 13:1 내지 약 18:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 180 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 리툭시맙의 비는 약 3:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 17. 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%))의 합성
Figure pat00160
10K PHF-BA(28%)-EG2-MI(2%)-AF-HPA-Ala(9%)(8.4 ㎎, 실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 절차를 이용해서 제조됨, 트라스투주맙(15 ㎎) 및 (TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 5:1 내지 약 10:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 183 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 18. 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%))의 합성
Figure pat00161
표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다.
접합체 A - AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 19:1 내지 약 24:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 201 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
접합체 B - AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 20:1 내지 약 25:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 224 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
접합체 C - AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 23:1 내지 약 28:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 259 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 19 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(2.7%)-(HPV-Ala(14%)의 합성
Figure pat00162
물(0.612 ㎖ 및 NMP(0.14 ㎖) 중 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(2.7%)의 균질한 용액(25.00 ㎎, 2.80 μ㏖, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)을 0℃로 냉각하였다. NMP(0.14 ㎖) 중 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온(8.06 ㎎, 0.07 m㏖)에 이어 물(0.250 ㎖) 중 HPV-알라닌(15.56 ㎎, 0.018 m㏖, 미국 특허 제8,524,214호, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)을 첨가하였다. 혼합물을 모든 물질이 용해될 때까지 강력히 교반한 뒤 EDC.HCl의 새로 제조된 수용액(0.125 ㎖ 수중 6.71 ㎎)을 첨가하였다. 45분 후, 추가적인 EDC.HCl(0.125 ㎖ 수중 6.71 ㎎)을 첨가하고 생성 혼합물을 pH 5.8에서 유지하면서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 RP-HPLC 분석은 반응이 불완전함을 시사하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 EDC.HCl(0.250 ㎖ 중 12 ㎎)을 첨가하였다. 용액의 pH를 0.1N NaOH로 5.9로 조정하고, 혼합물을 추가 2시간 동안 교반하고, 이 때 반응 혼합물의 RP-HPLC 분석은 원료의 완전 소비를 시사하였다. 산물을 칼럼 크로마토그래피(Sephadex G25 겔)에 이어 HPLC 및 동결건조에 의한 정제에 의해 표제 화합물을 얻었다(10.18 ㎎, 24% 수율).
접합체 A: 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(2.7%)-(HPV-Ala(14%)를 상술된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 1H-NMR에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 14 ㏖%(즉 폴리머 사슬 당 평균 2.4 개의 HPV-Ala 분자)였다.
접합체 B: 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(2.7%)-(HPV-Ala(7.7%)를 상술된 절차를 이용해서 제조하였다. 1H-NMR에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 28.3 ㏖%(즉 폴리머 사슬 당 평균 4.6 개의 HPV-Ala 분자)였다.
접합체 C: 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(3.5%)-(HPV-Ala(4.3%)를 상술된 절차를 이용해서 제조하였다. HPLC에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 4.3 ㏖%(즉 폴리머 사슬 당 평균 2.6 개의 HPV-Ala 분자)였다.
실시예 20 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(HPV-Ala 14%))의 합성
Figure pat00163
10K PHF-BA(30%) EG2-MI(2.7%)-(HPV-Ala(14%)(1.5 ㎎, 실시예 19에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 4:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다.
접합체 A: 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(HPV-Ala(14%)). HPV-Ala 대 트라스투주맙의 비는 약 13:1 내지 약 18:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 168 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
접합체 B: 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(2.7%)-(HPV-Ala(7.7%)(5.7 ㎎, 실시예 19, 접합체 B), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 4:1을 이용한 것을 제외하고는 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(HPV-Ala(7.7%))를 제조하였다. HPV-Ala 대 트라스투주맙의 비는 약 10:1 내지 약 14:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 180 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
접합체 C: 10K PHF-BA(30%) EG2-MI(2.7%)-(HPV-Ala(4.3%)(4.2 ㎎, 실시예 19 접합체 C에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 4:1을 이용한 것을 제외하고 트라스투주맙-((EG2-MI(3.5%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(HPV-Ala(4.3%))을 상기 실시예에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. HPV-Ala 대 트라스투주맙의 비는 약 8.5:1 내지 약 12:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 181 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 21 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(이스피네십-PABA-Val-Cit(3.5%)의 합성
Figure pat00164
5 ㎖ NMP 중 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)(60.8 ㎎, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)의 용액에 NMP(0.5 ㎖) 중 이스피네십-PABA-Val-Cit-NH2(TFA 염, 10.0 ㎎, 미국 특허 제8,815,226호, 실시예 84에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 NMP(0.5 ㎖) 중 HATU(5.5 ㎎)에 이어 DIEA(4.4 ㎎)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5-10분 동안 실온에서 교반하였다. 조정제 혼합물을 초여과에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(수율: 64%, 이스피네십 기준).
UV에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 3.5 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 2.5 개의 이스피네십-PABA-Val-Cit 분자).
실시예 22. 트라스투주맙-((EG2-MI(28%)-(10 kDa PHF-BA(2.7%)-(이스피네십-PABA-Val-Cit-(3.5%))의 합성
Figure pat00165
10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(이스피네십-PABA-Val-Cit(3.5%)(5.6 ㎎, 실시예 21에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 이스피네십 대 트라스투주맙의 비는 약 7.5:1 내지 약 10:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
전술된 바와 같이 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 23. 리툭시맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(이스피네십-PABA-Val-Cit-(3.5%))의 합성
Figure pat00166
리툭시맙 및 TCEP:리툭시맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 22에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 이스피네십 대 리툭시맙의 비는 약 6.5:1 내지 약 10:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
전술된 바와 같이 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 24. THP-2-메틸-이스피네십의 합성
Figure pat00167
화합물 1: 25 ㎖ DMA 중 4-(히드록시메틸)-2,6-디메톡시페놀(2.77 g)의 용액에 이미다졸(1.13 g)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 하에 0℃로 냉각한 뒤 TBSCl(2.49 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 빛으로부터 보호된 아르곤 하에 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(300 ㎖)으로 희석하고 포화 NH4Cl(100 ㎖)에 이어 염수(100 ㎖)로 세정하였다. 유기상을 Na2SO4에 걸쳐 건조하고 농축하여 조정제 산물을 얻고 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여(Hex/EtOAc, 0% B-30% B) 무색 오일을 얻었다(2.24 g, 50% 수율). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.17(s, 1H), 6.54(s, 2 H), 4.59(s, 2 H), 3.72(s, 6 H), 0.89(s, 9 H), 0.05(s, 6 H).
화합물 2: 5 ㎖ 건조 THF 중 화합물 1(0.508 g), TEA(0.603 g) 및 DMAP(0.021 g)의 빙냉 용액에 ∼3 ㎖ THF 중 4-니트로페닐 클로로포르메이트(0.68 g) 용액을 첨가하였다. 얼음조를 제거하고 교반을 실온에서 계속하였다. 반응을 NH4Cl(20 ㎖)로 켄칭한 뒤 에틸 아세테이트(60 ㎖)로 추출하였다. 유기물을 염수(20 ㎖)로 세정하고, Na2SO4에 걸쳐 건조한 뒤 농축하여 조정제 산물을 얻고 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여(Hex:에틸 아세테이트, 0% B - 20% B) 화합물 2를 무색 고체로 산출하였다(0.724 g, 92% 수율). 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 8.32-8.28(m, 2 H), 7.51-7.48(m, 2 H), 7.12(s, 1 H), 6.64(s, 1 H), 4.75(d, 2 H, J = 12.9 Hz), 3.93(d, 3 H, J = 13.5 Hz), 3.88(s, 3 H), 1.0-0.94(m, 9 H), 0.15(s, 3 H), 0.12(s, 3 H).
화합물 3: 5 ㎖ 건조 THF 중 화합물 2(0.5 g)의 용액에 HOBt(0.291 g)를 첨가하고 생성 혼합물을 ∼5분 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 2-아미노프로판올(0.324 g) 및 TEA(0.546 g)를 첨가하였다. 생성 혼합물을 0℃에서 ∼1시간 동안 교반하고, 이 때 TLC는 반응이 완료됨을 시사하였다. 혼합물을 DCM(60 ㎖)으로 희석하고 포화 NH4Cl(20 ㎖)에 이어 염수(20 ㎖)로 세정하였다. 유기물을 건조하고(Na2SO4) 농축하여 노란색 오일을 얻었다. 조정제 산물을 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여(Hex:에틸 아세테이트, 0% B-80% B) 화합물 3을 노란색 고체로 얻었다(0.356 g, 83% 수율). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 7.50(t, 1 H, J = 5.8 Hz), 6.64(s, 2 H), 4.68(s, 2 H), 4.64(d, 1 H, J = 4.8 Hz), 3.71(s, 6 H), 3.70-3.61(m, 1 H), 3.04-2.96(m, 1 H), 2.96-2.86(m, 1 H), 1.05(d, 3 H, J = 6.1 Hz), 0.10(s, 6 H); ESI MS: C19H33NO6Si(M + H)의 이론값 400.2, 실측값 400.2.
화합물 4: 5 ㎖ 건조 DCM 중 화합물 3(0.358 g) 및 DMAP(0.219 g)의 빙냉 용액에 아르곤 하에 ∼5 ㎖ DCM 중 DCC(0.369 g) 용액을 첨가하였다. 얼음조를 제거하고 혼합물을 하룻밤 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, DCM(∼60 ㎖)으로 희석하고, 포화 NH4Cl(2 × 20 ㎖)에 이어 염수(∼20 ㎖)로 세정하였다. 유기상을 Na2SO4에 걸쳐 건조하고 농축하여 조정제 산물을 얻고 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 4를 무색 오일로 산출하였다(0.422 g, 75% 수율). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 7.65(s, 1 H), 7.39(s, 1 H), 6.64(s, 2 H), 4.93-4.84(m, 1 H), 4.68(s, 2 H), 3.71(s, 6 H), 3.68-3.62(m, 1 H), 3.62-3.47(m, 4 H) 3.16(t, 2 H, J = 5.9 Hz), 2.88(s, 4 H), 2.01-1.93(m, 2 H), 1.91-1.77(m, 3 H), 1.75-1.66(m, 1 H), 1.57-1.47(m, 1 H), 1.39(s, 9 H), 1.35-1.29(m, 1 H), 1.28-1.22(m, 1 H), 1.15-1.10(m, 3 H), 0.92(s, 9 H); ESI MS: C30H50N2O10Si(M + H) 이론값 627.3, 실측값 527.2(M - Boc + H).
화합물 5: EtOH/물(7.25 ㎖, 9:1) 중 화합물 4(0.400 g) 및 SnCl2 2수화물(0.144 g) 용액을 아르곤 하에 실온에서 ∼3시간 교반하였다. 반응 종료 시(TLC), 반응 혼합물을 60 ㎖ EtOAc로 희석한 뒤 포화 NH4Cl(20 ㎖) 및 염수(20 ㎖)로 세정하였다. 유기상을 Na2SO4에 걸쳐 건조하고 농축하여 조정제 산물을 얻고 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피(Hex:에틸 아세테이트, 0% B-100% B)에 의해 정제하여 화합물 5를 무색 오일로 산출하였다(0.220 g, 67% 수율). 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 6.61(s, 2 H), 5.82(brs, 1 H), 5.16(brs, 1 H), 4.87(m, 1 H), 4.64(s, 2 H), 3.90-3.75(m, 8 H), 3.75-3.62(m, 2 H), 3.62-3.51(m, 1 H), 3.41-3.18(m, 1 H), 2.31-2.13(m, 2 H), 1.93-1.81(m, 2 H), 1.44(s, 9 H), 1.29(d, 3 H, J = 6.6 Hz); ESI MS: C24H36N2O10(M + H) 이론값 513.2, 실측값 413.2(M - Boc + H).
화합물 6: 2 ㎖ 건조 THF 중 화합물 5(0.220 g) 용액에 TEA(0.152 g)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 p-니트로페닐 클로로포르메이트(0.087 g)를 고체로 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 ∼4시간 교반하였다. 추가적인 클로로포르메이트(∼1 ㎖ THF 중 ∼0.05 g)를 첨가하고 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 30 ㎖ EtOAc로 희석한 뒤 포화 NH4Cl(10 ㎖)에 이어 염수(10 ㎖)로 세정하였다. 유기상을 Na2SO4에 걸쳐 건조하고 농축하여 조정제 산물을 오일로 산출하였다. 조정제 산물을 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여(헥산:EtOAc 0% B 내지 90% B) 화합물 6을 무색 고체로 산출하였다(0.257 g, 88% 수율). 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 8.28(d, 2 H, J = 9.3 Hz), 7.39(d, 2 H, J = 9.8 Hz), 6.67(s, 2 H), 5.90(brs, 1 H), 5.23(s, 2 H), 5.21-5.13(m, 1 H), 4.87(brs, 1 H), 3.89-3.76(m, 8 H), 3.75-3.64(m, 2 H), 3.63-3.53(m, 1 H), 2.30-2.19(m, 1 H)1.95-1.83(m, 2 H), 1.44(s, 9 H), 1.29(d, 3 H, J = 6.7 Hz); ESI MS: C31H39N3O14(M + H) 이론값 678.2, 실측값 578.2(M - Boc + H).
화합물 7: 0.5 ㎖ 건조 DMA 중 화합물 6(53.5 ㎎) 용액에 이스피네십(37.1 ㎎), DIEA(9.27 ㎎), 및 HOAt(2.93 ㎎)를 연속 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 질소 하에 교반하였다. 조정제 반응 혼합물을 제조용 RP-HPLC에 의해 정제하여(Hex:에틸 아세테이트 50% B-90% B, 25분에 걸쳐, 두 이동상 모두에 0.1% TFA) 화합물 7을 무색 고체로 산출하였다(64 ㎎, 84% 수율). ESI MS: C55H67ClN6O13(M + H) 이론값 1055.5, 실측값 1055.4.
화합물 8: 2 ㎖ 건조 DCM 중 화합물 7(64 ㎎)의 빙냉 용액에 1 ㎖ TFA를 질소 하에 첨가하였다. 얼음조를 제거하고 혼합물을 1시간 실온에서 교반하고, 이 때 LC/MS는 반응이 종료됨을 시사하였다. 용매를 회전 증발을 통해 제거하고 잔류물을 동결건조하여 화합물 8을 무색 고체로 산출하였다(64 ㎎, 99%). ESI MS: C50H59ClN6O11(M + H) 이론값 955.4, 실측값 955.3.
실시예 25 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(THP-2-메틸-이스피네십)(2.4%)의 합성
Figure pat00168
표제 화합물을 실시예 21에 기재된 것과 유사한 방식으로 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)(58.9 ㎎, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조) 및 THP-2-메틸-이스피네십(10.0 ㎎, 실시예 24에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조; 46% 수율(이스피네십 기준)을 이용해서 제조하였다.
UV에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 2.4 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 1.7 개의 THP-2-메틸-이스피네십 분자)였다.
실시예 26. 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(THP-2-메틸-이스피네십)(2.4%))의 합성
Figure pat00169
10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(THP-2-메틸-이스피네십)(2.4% ㎎, 실시예 25에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 이스피네십 대 트라스투주맙의 비는 약 5:1 내지 약 8:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 3:1 내지 약 4:1이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 27. 리툭시맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(THP-2-메틸-이스피네십)(2.4%))의 합성
Figure pat00170
리툭시맙 및 TCEP:리툭시맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고 표제 화합물을 실시예 26에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 평균 이스피네십 대 리툭시맙의 비는 약 4.5:1 내지 약 7:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 28. 발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE의 합성
Figure pat00171
화합물 1: (S)-2-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄산(4.76 g, 18.93 m㏖), 1-클로로-2-메틸프로필 4-(메틸티오)페닐 카보네이트(2.6 g, 9.46 m㏖) 및 모노실버(I) 모노실버(III) 모노옥사이드(2.193 g, 9.46 m㏖)를 90℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 잔류물을 에틸 에테르로 분쇄하고, 고체를 에테르로 세정하였다. 유기물을 물(4X), 수성 NaHCO3로 세정하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고 담황색 오일로 농축하였다. DCM 중 조정제 오일을 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피(헥산:EtOAc 0% B 내지 20% B), 이어서 0.1% TFA로 완충된 20-95% 아세토니트릴로부터 아세토니트릴/물 구배를 이용하여 C-18 역상 HPLC에 의해 정제하여 무색 오일을 얻었다(2.78 g, 60% 수율). 화합물을 1H, 13C NMR 및 질량 분광측정으로 특성규명하였다, M/z = 490.3.
화합물 2: DCM(20 ㎖) 중 화합물 1의 빙냉 용액(2.5 g, 5.11 m㏖)에 아세트산 중 퍼아세트산 용액(12.14 g, 51.1 m㏖)을 적가하고 첨가가 종료된 후 2시간 동안 교반하였다. 반응을 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 2시간 후, 반응 혼합물에 25 ㎖의 물을 첨가하고 30분 동안 저온 교반하고, 유기물을 100 ㎖의 DCM으로 희석하고, 빙냉수(5x), 수성 NaHCO3로 세정하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고 농축하였다. 조정제 산물을 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다(헥산:EtOAc 0% B 내지 50% B).
화합물 3: MMAE,(300 ㎎, 0.418 m㏖), 화합물 2,(436 ㎎, 0.836 m㏖), 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 수화물(129 ㎎, 0.836 m㏖) 및 THF(25 ㎖)를 조합하고 얼음조에서 교반하였다. 생성 혼합물에 트리에틸아민(0.291 ㎖, 2.089 m㏖)을 첨가하고, 15분 동안 저온에서, 이후 LC/MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 종료할 때까지 40℃에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 수성 NaHCO3, 5% 수성 시트르산으로 세정하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 농축하고, 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 3을 TFA 염으로서 흰색 무정형 고체로 얻었다. LC/MS, M/z = 1067.6.
화합물 4: THF(10 ㎖) 및 EtOH(10.00 ㎖) 중 화합물 3(150 ㎎, 0.141 m㏖)에 아르곤을 버블링하였다. 상기 혼합물에 탄소상 10% 팔라듐(29.9 ㎎, 0.028 m㏖)을 첨가한 뒤 수소 풍선(0.283 ㎎, 0.141 m㏖)을 부착하고, 반응을 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 반응이 완료되면 이동상으로 0.1% TFA로 완충된 수중 아세토니트릴 구배를 이용해서 역상 크로마토그래피에 의해 혼합물을 정제하여 표제 화합물을 TFA 염으로서 흰색 무정형 고체로 얻었다(56% 수율). M/z = 933.6
실시예 29 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(3%)의 합성
Figure pat00172
1 ㎖ NMP 중 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%) 용액(20 ㎎, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE(9.98 ㎎, 실시예 28에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 HOAt(5.41 ㎎), EDC.HCl(7.62 ㎎), 및 DIEA(3.1 ㎎)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 실온에서 교반한 뒤 NaCl의 교반 수용액(1%, ∼50 ㎖)에 천천히 첨가하였다. 조정제 혼합물을 여과작용에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(21% 수율, MMAE 기준).
LC/MS에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 3.1 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 2.2 개의 MMAE-val-이소프로필-아실옥시이소프로필옥시 분자)였다. 표제 접합체의 분자량은 약 8.3 kDa이었다.
실시예 30. 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(3%))의 합성
Figure pat00173
접합체 A: 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE(3%)(5.6 ㎎, 실시예 29에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 및 TCEP TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고는 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(3%))를 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 평균 MMAE 대 트라스투주맙의 비는 약 11:1 내지 약 15:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 171 kDa이었다.
접합체 B, 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(9%)(31.7 ㎎, 실시예 30에 기재된 절차를 이용해서 제조됨), 트라스투주맙(57 ㎎, TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(9%))를 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 평균 MMAE 대 트라스투주맙의 비는 약 12:1 내지 약 16.5:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 224 kDa이었다.
접합체 C: 접합체 A에 대해 상술된 절차에서 환원된 리툭시맙을 대체하여 리툭시맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(9%))를 제조하였다. MMAE 대 리툭시맙의 비는 약 9.5:1 내지 약 13:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 202 kDa이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 31. t-부틸글리신 AF-HPA 트리플루오로아세테이트의 합성
Figure pat00174
DCM(5 ㎖) 중 (R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3,3-디메틸부탄산의 빙냉 용액(67.6 ㎎, 0.292 m㏖)에 DCC(0.046 ㎖, 0.292 m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 15-20분 동안 저온 교반하였다. 별도로 DCM(5 ㎖) 중 DMAP(53.6 ㎎, 0.438 m㏖) 및 AF-HPA(134 ㎎, 0.146 m㏖, 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 18에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)를 냉각하고, 두 반응 혼합물을 조합하여 20-30분 동안 저온에서, 이어서 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 4시간 후, LC/MS는 반응이 완료되지 않았음을 시사하였다. 제2 분취량의 활성화된 아미노산 활성화된 DCC 에스테르(DCM 중 각각 1 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하며 둔 뒤 0.1% TFA로 완충된 이동상으로 25-90% 아세토니트릴/물의 구배를 이용해서 HPLC 정제를 수행하였다. AF-HPA-Boc-t-부틸 글리신을 TFA 염으로서 흰색 무정형 고체로 수득하였다(85% 수율). M/z = 1016.6.
DCM(5 ㎖) 중 AF-HPA-Boc-t-부틸 글리신의 빙냉 용액(140 ㎎, 0.124 m㏖)에 TFA(0.477 ㎖, 6.19 m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 저온에서, 이어서 LC/MS에 의해 나타난 바와 같이 완료 시까지 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 이동상으로 이용된 0.1% TFA로 완충된 10-90% 아세토니트릴로부터 아세토니트릴/물 구배를 이용해서 HPLC 정제에 의해 생성 잔류물을 정제하였다. 표제 화합물을 TFA 염으로서 흰색 무정형 고체로 수득하였다. M/z = 917.6
실시예 32 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(t-부틸글리신 AF-HPA)(7.5%)의 합성
*
Figure pat00175
물(5.5 ㎖) 및 NMP(1.375 ㎖) 중 10K PHF-BA(28%)-PEG2-MI(2.7%)의 빙냉 용액(137 ㎎, 10.84 μ㏖, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)에 AF-HPA-t-부틸글리신,(67 ㎎, 0.065 m㏖, 실시예 31에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)을 첨가하고, 생성 혼합물을 15분 동안 저온에서 교반한 뒤 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온(15.59 ㎎, 0.135 m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물에 EDAC(51.9 ㎎, 0.271 m㏖)를 첨가하였다. 30분 동안 동량 시약의 두 번째 첨가물을 첨가하였다. 4시간 후, pH를 0.1N NaHCO3로 5.6으로 조정하고, 추가 분취량의 EDAC(50 ㎎)를 첨가하고, 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 산물을 겔 여과 및 역상 HPLC에 의해 정제하였다.
1H-NMR에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 7.5 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 5.7 개의 t-부틸글리신 AF-HPA 분자)였다.
실시예 33. 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(t-부틸글리신 AF-HPA)(7.5%))의 합성
Figure pat00176
10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(t-부틸글리신 AF-HPA)(7.5%)(45.7 ㎎, 실시예 32에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 4:1 내지 약 6:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 215 kDa이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 34. 리툭시맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(t-부틸글리신-AF-HPA)(7.5%))의 합성
Figure pat00177
리툭시맙 및 TCEP:리툭시맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 33에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 평균 AF-HPA 대 리툭시맙의 비는 약 2.5:1 내지 약 3.5:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 202 kDa이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 35. val-AF-HPA 트리플루오로아세테이트의 합성
Figure pat00178
((R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-메틸부탄산(63.5 ㎎, 0.292 m㏖을 이용한 것을 제외하고, AF-HPA-Boc-발린을 실시예 31에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. AF-HPA-Boc-발린을 TFA 염으로서 흰색 무정형 고체로 수득하였다(85% 수율). M/z = 1002.6.
AF-HPA-Boc-발린(128 ㎎, 0.115 m㏖)을 이용한 것을 제외하고 표제 화합물을 실시예 31에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하여 106 ㎎을 91% 수율로 얻었다. M/z = 903.3
실시예 36. 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(val-AF-HPA)(7.2%))의 합성
Figure pat00179
10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(val AF-HPA)(7.2%)(52.3 ㎎, 실시예 32에 기재된 절차를 이용해서 제조됨), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고는 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 14.5:1 내지 약 20:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 235 kDa이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 37. 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520)(2.9%)의 합성
Figure pat00180
23 ㎖ NMP 중 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(252 ㎎, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)의 용액에 NMP(1 ㎖) 중 Arry 520-PABA-Val-Cit-NH2(37.6 ㎎, 미국 특허 제8,815,226호, 실시예 84에 기재된 절차를 이용해서 제조)에 이어 DIEA(20.7 ㎎)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 NMP(1 ㎖) 중 HATU(22.8 ㎎)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 조정제 혼합물을 여과작용에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다(47% 수율, Arry 520 기준).
UV에 의해 결정된 접합된 산물의 약물 로딩(즉, 약물 함유 폴리머 단위의 함량)은 폴리머 구조 단위의 2.9 ㏖%(또는 폴리머 사슬 당 평균 약 2.1 개의 Arry 520-PABA-Val-Cit 분자)였다. 표제 접합체의 분자량은 약 9.0 kDa이었다.
실시예 38. 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520(2.9%))의 합성
Figure pat00181
10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.7%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520)(2.9%)(55.6 ㎎, 실시예 38에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 2.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. Arry 520 대 트라스투주맙의 비는 약 4:1 내지 약 6:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 245 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 39. 리툭시맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520(2.9%))의 합성
Figure pat00182
리툭시맙 및 TCEP:리툭시맙 2.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 38에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. 평균 Arry 520 대 리툭시맙의 비는 약 4:1 내지 약 6:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 231 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 40. sc-FvFc-트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA 28)-(AF-HPA-Ala(8%))의 합성
Figure pat00183
10K PHF-BA(28%)-EG2-MI(2.8%)-AF-HPA-Ala(8%)(2.2 ㎎ 실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조) 및 scFvFc 트라스투주맙 항체 및 TCEP:scFvFc 트라스투주맙 항체 3:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물("scFvFc-트라스투주맙 폴리머 약물 접합체", 또는 "트라스투주맙 scADC")을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. scFvFc 트라스투주맙 항체(트라스투주맙 단일 사슬 항체-Fc 융합 단백질)의 서열은 불변 영역에 3 개의 개질을 갖고: 힌지는 보통 경쇄 불변부와 결합하는 페어링하지 않은 시스테인을 제거하기 위한 하나의 돌연변이(C->S)를 함유하여 [Olafsen et al(Cancer Res. 65(13):5907-16, 2005)]에 공개된 바와 같다(Yang and Rader, Cloning, Expression, and Purification of Monoclonal Antibody in scFv-Fc Format. Antibody Methods and Protocols. Ed. Proetzel and Ebersback, 2012). 다른 2 개의 개질도 IgG1 서열에 있다. Olafsen 등(2005)은 개선된 조영 목적을 위해 항체 단편의 반감기를 단축시키기 위한 트라스투주맙-scFv-Fc(H310A, H435Q) 이중 돌연변이체를 생성하였다. 개질은 정규 IgG1 서열로 다시 되돌려졌다.
AF-HPA 대 scFvFc 트라스투주맙 항체의 비는 약 14:1 내지 약 19:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 182 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 scFvFc 트라스투주맙 항체의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 41. 토포테칸-알라닌
Figure pat00184
토포테칸(0.500 g, 1.19 m㏖), BOC-ala-OH(0.449 g, 2.37 m㏖), 및 N,N-디메틸피리딘-4-아민(0.145 g, 1.19 m㏖)을 무수 CH2Cl2(5.93 ㎖) 중에 용해시켰다. 무수 CH2Cl2(1 ㎖) 중 N,N'-메탄디일리덴디시클로헥산아민(DCC)(0.580 g, 2.81 m㏖)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 추가적인 DCC(300 ㎎, 1.45 m㏖)를 첨가하고 혼합물을 48시간 동안 교반하였다. 고체를 여과를 통해 제거하고, 용액을 0.1N HCl(2 × 5 ㎖), 물(5 ㎖), 및 염수(5 ㎖)로 세정한 뒤, MgSO4에 걸쳐 건조하고, 이어서 0.1% TFA/CH3CN:0.1% TFA/물(콤비플래시, C18, 100 G 칼럼; 5분 0% B, 20분에 걸쳐 100% B까지의 경사)로 용출하며 RP-HPLC에 의해 토포테칸-BOC-알라닌을 고체로 얻었다(186.6 ㎎, 0.315 m㏖, 26.5% 수율).
토포테칸-BOC-알라닌(186.6 ㎎, 0.315 m㏖)을 무수 CH2Cl2(1.5 ㎖) 중에 용해시켰다. 2,2,2-트리플루오로아세트산(1.205 ㎖, 15.74 m㏖)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 뒤 RP-HPLC(C18, 0.1% TFA:AcN/0.1% TFA;물로 용출하며 HPLC)에 의해 표제 화합물을 오렌지색/노란색 고체로 얻었다(93.0 ㎎, 0.189 m㏖, 60.0% 수율).
실시예 42. 트라스투주맙-((EG2-MI(2.4%)-(10 kDa PHF-BA(22.3%)-토포테칸 알라닌)(6.5%))의 합성
Figure pat00185
접합체 A: 10K PHF-BA(22.3%) EG2-MI(2.4%)-(토포테칸 알라닌)(6.5%)(19.3 ㎎, 폴리머 사슬 당 평균 약 4.2 개의 토포테칸 분자를 가짐, 실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 절차를 이용해서 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 3:1을 이용한 것을 제외하고 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 트라스투주맙-((EG2-MI(2.4%)-(10 kDa PHF-BA(22.3%)-(토포테칸 알라닌)(6.5%))을 제조하였다. 표제 접합체의 분자량은 약 256 kDa이었다. 평균 토포테칸 대 트라스투주맙의 비는 약 19:1 내지 약 26:1이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 5:1이었다.
접합체 B: 상술된 절차에서 환원된 리툭시맙을 대체하여 리툭시맙-((EG2-MI(2.4%)-(10 kDa PHF-BA(22.3%)-(토포테칸 알라닌)(13%))을 제조하였다. 표제 접합체의 분자량은 약 212 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 리툭시맙의 비는 약 16:1 내지 약 22:1이었다.
실시예 41에 기재된 절차를 이용해서 제조된 10K PHF-BA EG2-MI-(토포테칸 발린)을 이용하는 것을 제외하고 트라스투주맙-((EG2-MI)-(10 kDa PHF-BA)-(토포테칸 발린)을 상술된 절차를 이용해서 제조한다.
전술된 바와 같이, 다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-약물 접합체를 수득한다.
실시예 43. 트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala 7.3%))의 합성
Figure pat00186
10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.8%)-(HPV-Ala(7.2%)(8.36 ㎎, 실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 2.5:1을 이용한 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 4 또는 실시예 7에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다.
접합체 A: 트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(7.3%)). AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 6:1 내지 약 9:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 183 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
접합체 B: 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.5%)-(HPV-Ala(8.4%)(실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 3.5:1을 이용한 것을 제외하고, 트라스투주맙-((EG2-MI(2.5%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.4%))를 상기 실시예에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 12:1 내지 약 17:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 218 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
접합체 C: 10K PHF-BA(28%) EG2-MI(2.8%)-(HPV-Ala(8.4%)(실시예 3 또는 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조), 트라스투주맙 및 TCEP:트라스투주맙 2.75:1을 이용한 것을 제외하고, 트라스투주맙-((EG2-MI(2.5%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.4%))를 상기 실시예에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. AF-HPA 대 트라스투주맙의 비는 약 12:1 내지 약 16:1이었다. 표제 접합체의 분자량은 약 247 kDa이었다. 평균 PHF-약물 접합체 대 트라스투주맙의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이었다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는, 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 44. 트라스투주맙-((EG2-MI)-(10 kDa PHF-BA)-(SN38 알라닌)의 합성
Figure pat00187
실시예 42 및 41에 기재된 절차를 이용해서 제조된 10K PHF-BA EG2-MI-(SN38 알라닌)을 이용하는 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 42에 기재된 절차를 이용해서 제조한다.
실시예 41 및 42에 기재된 절차를 이용해서 제조된 10K PHF-BA EG2-MI-(SN-38 발린)을 이용하는 것을 제외하고, 트라스투주맙-((EG2-MI)-(10 kDa PHF-BA)-(SN-38 발린)을 제조할 수 있다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 45. 트라스투주맙-((EG2-MI)-(10 kDa PHF-BA)-(캄프토테신-알라닌)의 합성
Figure pat00188
실시예 42 및 41에 기재된 절차를 이용해서 제조된 10K PHF-BA EG2-MI-(캄프토테신 알라닌)을 이용하는 것을 제외하고, 표제 화합물을 실시예 42에 기재된 절차를 이용해서 제조할 수 있다.
실시예 41 및 42에 기재된 절차를 이용해서 제조된 10K PHF-BA EG2-MI-(캄프토테신 발린)을 이용하는 것을 제외하고, 트라스투주맙-((EG2-MI)-(10 kDa PHF-BA)-(캄프토테신 발린)을 상술된 절차를 이용해서 제조한다.
다른 PBRM 유도체, 예를 들어 세툭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 니모투주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 린투주맙, 항-5T4 또는 항-메소텔린 항체의 부분적으로 환원된 형태가 관여되는 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체를 상술된 절차와 유사한 방법으로 합성한다. 또한 PBRM 설프하이드릴기의 수 및 약물-폴리머 접합체 약물 로딩을 변화시켜 다양한 비의 약물 대 PBRM을 포함하는 PBRM-폴리머-약물 접합체를 수득한다.
실시예 46. PBRM-폴리머-약물 접합체에 대한 세포 생활성 분석
PBRM-폴리머-약물 접합체를 Cell Titer-Glo(Promega Corp)를 이용해서 시험관내 종양 세포주에서 이들의 항증식 특성에 대해 평가하였다. 세포를 검은색 벽의 96-웰 플레이트에 접종하고 5% CO2의 37℃ 가습 분위기에서 하룻밤 동안 부착하도록 두었다. SKBR3, BT474, NCI-N87 세포(HER2 발현 세포), MCF7 세포(HER2 저발현 수준 세포) 및 JIMT1 세포(HER2 중간 발현 수준 세포)를 웰 당 5,000 세포의 밀도로 접종하였다. 다음 날 배지를 50 ㎕의 신선 배지로 교체하고 50 ㎕의 2 × 스톡 PBRM-폴리머-약물 접합체, 약물 폴리머 접합체 또는 약물을 적절한 웰로 첨가하고, 혼합하고, 72시간 동안 인큐베이션하였다. Cell Titer-Glo 시약을 실온에서 웰에 첨가하고, SpectraMax M5 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 이용해서 발광 신호를 10분 후 측정하였다. SoftMax Pro 소프트웨어를 이용해서 용량 반응 곡선을 생성하였다. IC50 값을 4-파라미터 곡선 피팅으로부터 결정하였다.
CD33 발현 세포 HL-60을 웰 당 5,000 세포 밀도로 계대하고 같은 날 PBRM-폴리머-약물 접합체로 처리하였다. 72시간 인큐베이션 후, 세포를 상술된 동일한 절차를 이용해서 분석하였다.
OVCAR-3, TF-1α 및 HCT-15 발현 세포를 상술된 동일한 절차를 이용해서 접종하고 분석하였다.
5T4 발현 세포주 A431(A431, ATCC(American Type Culture Collection), Manassas Virginia US에서 접근 번호 ATCC® CRL-1555 하에 입수 가능한 표피모양 암종 세포주); PC3(인간 전립선 세포주, ATCC® CRL-1435), MDAMB231-5T4 OE 및 표적 음성 대조군 세포주 LLC1 발현 세포(5T4 발현에 대해 음성인 폐 세포 암종 세포)를 상술된 동일한 절차를 이용해서 접종하고 분석하였다. "MDAMB231-5T4 OE"는 5T4를 과발현하는 재조합 MDA-MB-231 세포(안정한 전달감염에 의해 생성됨; 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 2013년 6월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,858호에 개시됨)를 의미한다.
표 1 내지 표 3은 HER2 발현 세포(표 1), CD33 발현 세포(표 2) 또는 5T4 발현 세포(표 3)에서 PBRM-폴리머-약물 접합체의 항증식 특성에 대한 예시적 결과이다.
표 4는 OVCAR-3 및 TF-1α 세포주에서 약물, AF-HPA의 항증식 특성에 대한 예시적 결과이다.
표 1은 PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 17:1), 실시예 4; 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 16:1 내지 약 21:1), 실시예 7; 트라스투주맙-((EG2-MI(1%))-(10 kDa PHF-GA(29%)-(AF-HPA-Ala(6%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 18:1 내지 약 23:1), 실시예 13; 트라스투주맙-((EG2-MI(2%))-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 10:1 내지 약 15:1), 실시예 14; 트라스투주맙-((EG2-MI(2%))-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 11:1 내지 약 16:1), 실시예 15; 및 리툭시맙-((EG2-MI(2%))-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 13:1 내지 약 18:1), 실시예 16; 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%), (AF-HPA:트라스투주맙 약 5:1 내지 약 10:1), 실시예 17; 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%), (AF-HPA:트라스투주맙 약 19:1 내지 약 24:1), 실시예 18A; (AF-HPA:트라스투주맙 약 20:1 내지 약 25:1), 실시예 18B; (AF-HPA:트라스투주맙 약 23:1 내지 약 28:1), 실시예 18C; 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(HPV-Ala(14%)), 실시예 20A; 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(HPV-Ala(7.7%)), 실시예 20B; 트라스투주맙-((EG2-MI(3.5%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(HPV-Ala(4.3%)), 실시예 20C; sc-FvFc-트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8%)), 실시예 40; 트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(7.3%) AF-HPA:트라스투주맙 약 6:1 내지 약 9:1), 실시예 43A; 트라스투주맙-((EG2-MI(2.5%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.4%), AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 16:1), 실시예 43C; 자유 약물(AF-HPA); 및 Kadcyla®에 대한 결과를 기재한다.
BT474
IC 50 (m㏖/L) 		SKBR3
IC 50 (m㏖/L) 		N87
IC 50 (m㏖/L) 		MCF7
IC 50 (m㏖/L) 		JIMT1
IC 50 (m㏖/L)
실시예 4 0.05 0.02 0.03 40 0.14
실시예 7 0.03 0.01 0.05 3.6 0.11
실시예 13 0.12 0.03 0.05 7.7 0.28
실시예 14 0.07 0.02 0.11 28.9 0.13
실시예 15 0.05 0.01 0.11 23.5 0.12
실시예 16 3.04 1.44 5.23 27.9 1.88
실시예 17 0.03 0.03 0.43 28.8 0.06
실시예 18A 0.04 0.02 0.06 9.6 0.16
실시예 18B 0.05 0.01 0.04 33 0.12
실시예 18C 0.03 0.02 0.06 3.8 0.18
실시예 20A 0.01 0.07 0.31 2.86 0.67
실시예 20B 0.15 0.79 4.07 100 6.51
실시예 20C 0.76 0.79 4.49 10 9.73
실시예 40 ND 0.02 0.10 > 100 0.90
실시예 43A 0.03 0.03 0.43 28.84 0.60
실시예 43C 0.10 0.02 0.09 > 100 0.64
AF-HPA(독소 균등물) 1.01 0.40 0.42 4.4 0.86
Kadcyla® 2.40 0.23 0.09 38.6 18.0
ND = 결정되지 않음표 1의 결과는 HER2 발현 세포주 SKBR3, BT474, N87 및 JIMT1에 있어서, PBRM-폴리머-약물 접합체(실시예 4, 실시예 7, 실시예 13 내지 15, 실시예 l7, 실시예 18A 내지 18C, 실시예 20A, 실시예 43A 및 실시예 43C)가 HER2 저발현 세포주 MCF7에 비해 그리고 대조군 PBRM-폴리머-약물 접합체(실시예 16) 또는 Kadcyla®에 비해 더 높은 항증식 활성을 나타내었음을 보여준다.
표 2는 린투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:린투주맙 약 10:1 내지 약 15:1), 실시예 8; 및 리툭시맙-((EG2-MI(3%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%))(AF-HPA:리툭시맙 약 13:1 내지 약 18:1), 실시예 9; 및 자유 약물(AF-HPA)에 대한 결과를 기재한다.
HL-60
IC 50 (n㏖/L)
실시예 8 0.77
실시예 9 6.74
AF-HPA 4.8
표 2의 결과는 CD33 발현 세포주 HL-60에 있어서 PBRM-폴리머-약물 접합체(실시예 8)가 대조군 PBRM-폴리머-약물 접합체(실시예 9)에 비해 더 높은 항증식 활성을 나타내었음을 보여준다.표 3은 PBRM-폴리머-약물 접합체 항-5T4-((EG2-MI(3%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:항-5T4 약 12:1 내지 약 18:1), 실시예 10; 및 리툭시맙-((EG2-MI(3%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%))), (AF-HPA:리툭시맙 약 13:1 내지 약 18:1), 실시예 9; 및 자유 약물(AF-HPA)에 대한 결과를 기재한다.
A431
IC 50 (n㏖/L) 		PC3
IC 50 (n㏖/L) 		LLC1
IC 50 (n㏖/L) 		MDAMB231OE
IC 50 (n㏖/L)
실시예 10 0.3, 0.3* 0.6 16.9, > 100* 0.04
실시예 9 1.8, 0.9* 9.3 5.3, 33* ND
AF-HPA 0.7, 0.9* 2.5 1.6, > 100* ND
ND: 결정되지 않음.
* 2 개의 상이한 실험으로부터의 결과.
표 3에서의 결과는 5T4 발현 세포주 A431, PC3 및 MDAMB231OE에 있어서, PBRM-폴리머-약물 접합체(실시예 10)가 대조군 PBRM-약물 접합체(실시예 9) 및 비-발현 표적 세포 LLC1에 비해 더 높은 항증식 활성을 나타내었음을 보여준다.
표 4는 자유 약물(AF-HPA)에 대한 결과를 기재한다.
OVCAR3
IC 50 (n㏖/L) 		TF-1α
IC 50 (n㏖/L)
AF-HPA 0.8 13.8
실시예 47. BIAcore 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 리간드 결합 연구
고정화된 수용체에 대한 PBRM-폴리머-약물 접합체의 동적 결합을 BIAcore SPR에 의해 결정한다. PBRM-폴리머-약물 접합체 중 PBRM 및 PBRM 단독에 대한 결합 상수를 표준 BIAcore 절차를 이용해서 결정할 수 있다.
표준 아민 커플링 화학을 이용해서, hErbB2를 3 개의 유사한 밀도로 표면 플라즈몬 공명 센서 칩 표면으로 3 개 플로우 채널에 고정하였다. 트라스투주맙은 고정화된 hErbB2에 쉽게 결합함으로써 두 결합 파트너가 모두 활성임을 나타내었다. 결합 파라미터 ka(연합 또는 친화도 속도 상수) 및 KD(해리 상수)를 GLC 센서 칩이 장착되고 수행 버퍼로 평형화된 BioRad ProteOn XPR36 광학 바이오센서를 이용해서 PBRM-폴리머-약물 접합체 및 PBRM에 대해 25℃에서 측정한다.
결과는 PBRM-폴리머-약물 접합체 중 PBRM이 PBRM 수용체에 의해 인식되고 PBRM-폴리머-약물 접합체 중 PBRM의 결합이 접합되지 않은 PBRM에 비해 크게 영향받지 않음을 보여준다.
실시예 48. FACS 결합 분석
PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 17:1), 실시예 4의 세포 표면 결합을 상이한 인간 암 세포주에서 MACSQuant® Analyzer 10 디지털 벤치 탑 유세포 측정기를 이용해서 평가하였다. 100,000 개의 세포를 얼음 상에서 6% 염소 혈청 중에 인큐베이션하였다. PBRM 폴리머 약물 접합체 또는 접합되지 않은 PBRM을 세포에 첨가하고, 3시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 뒤 세포를 빙냉 PBS로 세정하고, 1시간 동안 얼음에서 이차 형광 표지 항체로 인큐베이션하였다. 완료 후, 세포를 PBS로 세정하고, 1% 파라포름알데히드로 고정하고, 유세포 측정기에 의해 분석하였다. PBRM 폴리머 약물 접합체의 세포 표면 결합을 적정에 의해 결정하고, 접합되지 않은 PBRM에서와 비교하였다.
표 5는 JIMT-1 세포에 대한 PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 17:1), 실시예 4, 및 트라스투주맙 단독의 결합 상수(Kd)를 제공한다.
Kd(nM)
실시예 4 2.16
트라스투주맙 0.92
결과는 PBRM-폴리머-약물 접합체 중 PBRM의 세포 표면 결합이 접합되지 않은 PBRM에 필적하였음을 보여준다.다른 인간 암 세포에 대한 다른 PBRM-폴리머-약물 접합체 중 PBRM의 세포 표면 결합을 결정할 수 있고, 접합되지 않은 PBRM에서와 필적해야 한다.
실시예 49. BIAcore 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 리간드 결합 연구
고정화된 수용체에 대한 PBRM-폴리머-약물 접합체의 동적 결합을 BIAcore SPR에 의해 결정하였다. PBRM-폴리머-약물 접합체, 예를 들면 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 17:1), 실시예 4; 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 16:1 내지 약 21:1), 실시예 7, 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 5:1 내지 10:1), 실시예 17; 및 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 19:1 내지 24:1), 실시예 18A; (AF-HPA:트라스투주맙 약 20:1 내지 25:1), 실시예 18B; (AF-HPA:트라스투주맙 약 23:1 내지 28:1), 실시예 18C; PBRM-약물 접합체(즉, Kadcyla®) 중 PBRM 및 PBRM(즉, 트라스투주맙) 단독에 대한 결합 상수를 표준 BIAcore 절차를 이용해서 결정하였다.
표준 아민 커플링 화학을 이용해서, hErbB2를 3 개의 유사한 밀도로 표면 플라즈몬 공명 센서 칩 표면으로 3 개 플로우 채널에서 고정하였다. 트라스투주맙은 고정화된 hErbB2에 쉽게 결합함으로써 두 결합 파트너가 모두 활성임을 나타내었다. 표 6은 GLC 센서 칩이 장착되고 수행 버퍼로 평형화된 BioRad ProteOn XPR36 광학 바이오센서를 이용해서 실시예 4 및 실시예 7의 접합체 및 트라스투주맙에 대해 25℃에서 측정된 결합 파라미터 ka(연합 또는 친화도 속도 상수), kd(해리 속도 상수) 및 KD(해리 상수)를 제공한다.
k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (pM)
트라스투주맙 9.90±0.1x105 2.60±0.1x10-5 26.2±0.1
Kadcyla® 4.61±0.2x105 3.17±0.9x10-5 68.7±0.3
실시예 4 4.61±0.3x105 2.60±0.9x10-5 56.3±0.3
실시예 7 5.3±0.3x105 2.43±0.1x10-5 45.9±0.3
실시예 14 3.91±0.3x105 2.56±0.1x10-5 65.5±0.5
실시예 17 8.30±0.2x105 2.32±0.2x10-5 28.0±0.1
실시예 18A 4.67±0.7x105 2.07±0.2x10-5 44.4±0.6
실시예 18B 3.05±0.2x105 2.46±0.1x10-5 80.7±0.6
실시예 18C 4.25±0.5x105 2.03±0.1x10-5 47.7±0.5
결과는 PBRM-폴리머-약물 접합체 중 PBRM이 PBRM 수용체에 의해 인식되었음을 보여준다.실시예 50. 생체내 유효성, 약동학 및 생체분포 연구
단백질 약물 접합체의 유효성 및 약동학을 평가하기 위해, 마우스 및 래트 피하 및 동소 이종이식편 모델을 이용한다.
적절한 대조군과 함께 평가 물품을 꼬리-정맥 주사를 통해 정맥내(IV) 또는 복강내 투여한다. 평가 물품의 순환 수준을 평가하기 위해, 혈액 샘플을 말단 심장-천자를 통해 명시된 시간에 수집한다. 샘플을 실온에서 30분 동안 응고하도록 유지한 뒤 10분 동안 4℃, 1,000 × g에서 원심분리한 직후 -80℃에서 냉동한다. 혈청 샘플 중 총 PBRM 농도를 ELISA를 이용해서 측정한다. 순환 약물 농도(접합물 및 자유)를 LC/MS/MS 방법에 의해 결정한다.
PBRM-폴리머-약물 접합체의 유효성을 평가하기 위해, 종양 크기를 디지털 칼리퍼를 이용해서 측정한다. 종양 부피를 계산하고, 종양 성장 지연을 결정하기 위해 이용한다.
약물 생체분포를 결정하기 위해, 종양 및 주요 기관, 예를 들어 간, 신장, 비장, 폐, 심장, 근육 및 뇌를 수확한 직후 액체 질소 중에 냉동하고, -80℃에서 보관한다. PBRM 및/또는 약물 수준을 표준 방법, 예를 들어 ELISA 또는 LC/MS/MS 방법 각각에 의해 조직 균질화물에서 결정한다.
실시예 51. PBRM-폴리머-약물 접합체의 투여 후 마우스 조직 분포
자성 CB-17 SCID 마우스에 BT474 종양을 피하 접종하였다(각 군에 대해 n=4). 비히클 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체:트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 17:1), 실시예 4, 5 ㎎/㎏; 및 트라스투주맙-((EG2-MI(1%))-(10 kDa PHF-GA(29%)-(AF-HPA-Ala(6%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 18:1 내지 약 23:1), 실시예 13, 5 ㎎/㎏을 1일째에 단회 용량으로 IV 투여하였다.
투여 48시간 후, 마우스를 희생시키고, 말단 심장에 의해 혈액을 수집하였다. 기관: 신장 좌측, 간, 폐, 골격근, 비장 및 종양을 수확한 직후 액체 질소 중에 냉동하고, 접합물, 자유 AF-HPA 및 AF에 대해 분석 시까지 -80℃에서 보관하였다.
표 7, 표 8 및 표 9는 상이한 조직에서 접합된 약물(접합된 AF-HPA, 즉, PBRM-PHF-AF-HPA); 접합되지 않은(자유) 약물(즉, AF-HPA 및 AF); 자유AF-HPA 및 자유 AF의 농도를 제공한다. 농도를 평균값±표준 편차로 AF-HPA(및/또는 AF) 균등물 ng/조직 g으로 보고한다.
접합된 AF-HPA 농도
조직 실시예 4 실시예 13
종양 476±52 371±16
간 200±57 100±17
비장 127±97 77±18
신장 190±15 137±4
근육 39±22 16±86
혈장 2218±182 1720±501
접합되지 않은 AF-HPA 및 AF의 총 농도
조직 실시예 4 실시예 13
종양 93.6±25.5 82.9±23.9
간 11.0±2.3 3.4±1.1
비장 9.9±2.2 6.6±1.3
신장 9.0±2.1 0.7±0.0
근육 0.2±0.0 ND
혈장 0.4±0.02 0.3±0.02
접합되지 않은 AF-HPA 및 접합되지 않은 AF 농도
실시예 4 실시예 13
조직 AF AF-HPA AF AF-HPA
종양 67.3±17.5 21.6±6.8 56.3±16.2 22.3±6.8
간 8.4±1.5 2.0±0.7 5.0±1.3 1.6±1.2
폐 2.4±0.7 1.2±0.1 1.5±0.4 0.9±0.2
비장 7.9±1.9 1.4±0.2 5.5±1.0 0.9±0.1
신장 7.9±1.9 0.5±0.1 0.7±0.0 ND
근육 0.5±0.1 0.1±0.03 ND ND
혈장 ND 0.4±0.02 ND 0.3±0.02
ND = 결정되지 않음
결과는 조직 중에서 방출된 접합되지 않은 AF-HPA는 AF로 추가 대사되는 반면, 혈장 중에서 접합되지 않은 AF-HPA는 AF로 전환되지 않음을 보여준다.
실시예 52. PBRM-폴리머-약물 접합체의 투여에 대한 종양 성장 반응
자성 CB-17 SCID 마우스에 BT474 종양(각 군에 대해 n=10) 또는 JIMT-1 세포(각 군에 대해 n=10) 또는 NCI-N87 세포(각 군에 대해 n=10)를 피하 접종하였다. 자성 NCr nu/nu 마우스에 HL-60 세포(각 군에 대해 n=10)를 피하 접종하였다. 평가 화합물 또는 비히클을 1일째에 단회 용량으로 IV 투여하였다. 종양 크기를 디지털 칼리퍼를 이용해서 도 1 내지 9에 나타낸 시간에 측정하였다. 종양 부피를 계산하고, 종양 성장 지연을 결정하기 위해 이용하였다. 종양이 1000 ㎣ 크기에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 종양 부피를 각각의 군에 대해 평균±SEM으로 보고한다.
도 1은 1일째 단회 용량의 비히클; PBRM(트라스투주맙), 10 ㎎/㎏; PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 17:1), 실시예 4, 2.5 ㎎/㎏ 및 5 ㎎/㎏; 또는 트라스투주맙-((EG2-MI(1%))-(10 kDa PHF-GA(29%)-(AF-HPA-Ala(6%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 18:1 내지 약 23:1), 실시예 13, 2.5 ㎎/㎏ 및 5 ㎎/㎏의 IV 투여 후 BT474 종양(각 군에 대해 n=10)이 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 결과는 5 ㎎/㎏ 용량으로 100% 감소 그리고 100% 및 80% 무종양 생존을 각각 포함하는 실시예 4 및 13에 대한 종양 부피의 감소를 나타낸다. 비히클 및 트라스투주맙 단독은 종양 부피의 증가를 보여주었다. PBRM 단독이 종양 부피 감소를 나타내지 않았으므로, 종양 부피의 감소를 위해 약물 폴리머 접합체로의 HER2(트라스투주맙)에 대해 특이적인 PBRM의 접합이 필요했다.
도 2는 비히클; PBRM(트라스투주맙), 10 ㎎/㎏; PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 17:1), 실시예 4, 2.5 ㎎/㎏; 또는 트라스투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 16:1 내지 약 21:1), 실시예 7, 2.5 ㎎/㎏의 IV 투여 후 JIMT-1 세포(각 군에 대해 n=10)가 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 결과는 실시예 4 및 7 모두에 대해 종양 부피 감소를 나타낸다. 구체적으로, 실시예 4에 기재된 접합체가 투여된 평가군에서, 9마리의 완전 퇴행(1마리 동물은 치료-관련되지 않은 사망으로 인해 사망함) 및 3마리의 무-종양 생존 동물로 구성되는 2.5회 용량에서 100% 퇴행이 있었다. 실시예 7에 기재된 접합체가 투여된 평가군에서, 완전 퇴행으로 구성되는 100% 퇴행이 있었고, 모두 무종양으로 유지되었다(2마리 동물은 연구 말기에 치료-관련되지 않은 사망으로 인해 무종양으로 사망함). 비히클, 및 트라스투주맙 단독은 종양 부피의 증가를 나타내었다. PBRM 단독이 종양 부피의 감소를 나타내지 않았으므로, 종양 부피 감소를 위해 약물 폴리머 접합체로의 HER2(트라스투주맙)에 대해 특이적인 PBRM의 접합이 필요하였다.
자성 NCr nu/nu 마우스에 HL-60 세포를 피하 접종하였다(각 군에 대해 n=10). 평가 화합물 또는 비히클을 1일째에 단회 용량으로 IV 투여하였다. 종양 크기를 디지털 칼리퍼를 이용해서 도 3에 나타낸 시간에 측정하였다. 종양 부피를 계산하고, 종양 성장의 지연을 결정하기 위해 이용하였다. 종양이 2000 ㎣ 크기에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 종양 부피를 각 군에 대해 평균±SEM으로 보고한다.
도 3은 1일째에 단회 용량으로 비히클; PBRM(린투주맙), 20 ㎎/㎏; 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체 린투주맙-((EG2-MI(2%)-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:린투주맙 약 10:1 내지 약 15:1), 실시예 8, 20 ㎎/㎏의 IV 투여 후 HL-60 세포(각 군에 대해 n=10)가 피하 접종된 마우스에서의 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 결과는 실시예 8에 대한 종양 부피의 감소를 44일째에 100% 퇴행 및 70% 무종양 생존으로 나타낸다. 비히클, 및 린투주맙 단독은 종양 부피의 증가를 나타내었다. PBRM 단독이 종양 부피 감소를 나타내지 않았으므로 종양 부피의 감소를 위해 약물 폴리머 접합체로의 CD33(린투주맙)에 대해 특이적인 PBRM의 접합이 필요하였다.
도 4는 1일째에 단회 용량으로 비히클; PBRM(트라스투주맙), 20 ㎎/㎏; Kadcyla®(PBRM-약물 접합체), 20 ㎎/㎏; 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(2%))-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 10:1 내지 약 15:1), 실시예 14, 2 ㎎/㎏, 0.67 ㎎/㎏ 또는 0.3 ㎎/㎏의 IV 투여 후 JIMT-1 세포(각 군에 있어서 n=10)가 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 결과는, 실시예 14에 대해 종양 부피의 감소를 나타내며, 2.0 용량에서 100% 퇴행 및 100% 무종양 생존을 포함한다. 비히클, Kadcyla® 및 트라스투주맙 단독은 종양 부피의 증가를 나타내었다. PBRM 단독이 종양 부피 감소를 나타내지 않았으므로 종양 부피의 감소를 위해 약물 폴리머 접합체로의 HER2(트라스투주맙)에 대해 특이적인 PBRM의 접합이 필요하였다.
도 5는 1일째에 단회 용량으로 비히클, 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(2%))-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 11:1 내지 약 16:1), 실시예 15, 3 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 0.3 ㎎/㎏의 IV 투여 후 NCI-N87 세포(각 군에 대해 n=10)가 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 결과는 PBRM-폴리머-약물 접합체에 대한 약물 반응을 나타내며(실시예 15) 3 ㎎/㎏의 최고 용량은 100% 완전 반응으로 종양 부피의 완전 퇴행을 나타내었다. 중간 용량 1 ㎎/㎏에서는 10마리 동물 중 7마리의 부분 및 1마리의 완전 퇴행이 있었다.
도 6은 1일째에 단회 용량으로 비히클, PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(2%))-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 11:1 내지 약 16:1), 실시예 14, 0.67 ㎎/㎏ 또는 리툭시맙-((EG2-MI(2%))-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(9%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 13.7 내지 약 18.7), 실시예 16, 3 ㎎/㎏의 IV 투여 후 NCI-N87 세포(각 군에 대해 n=10)가 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 결과는 PBRM-폴리머-약물 접합체에 대한 종양 성장 지연 반응을 나타낸다(실시예 14). 3 ㎎/㎏ 용량의 비히클 또는 리툭시맙-약물 폴리머 접합체(실시예 16)는 종양 성장에 효과가 없다.
도 7은 1일째에 단회 용량으로 비히클, PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(t-부틸글리신 AF-HPA)(7.5%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 4:1 내지 약 6:1) 실시예 33, 0.67 ㎎/㎏; 트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(7.3%))(AF-HPA:트라스투주맙 약 6:1 내지 약 9:1), 실시예 43A, 1 ㎎/㎏; 또는 트라스투주맙-((EG2-MI(2.5%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.4%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 16:1), 실시예 43C, 0.67 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏의 IV 투여 후 NCI-N87 세포(각 군에 대해 n=10)가 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 결과는 실시예 43C의 PBRM-폴리머-약물 접합체에 대한 종양 성장 지연 반응을 나타내며, 0.67 ㎎/㎏ 용량 및 3 ㎎/㎏ 용량에서 115일째에 90% 무종양 생존을 나타내었다.
도 8은 1일째에 단회 용량으로 비히클, 폴리머-약물 접합체 10K PHF-BA(30%)-AF-HPA-Ala(9.5%), 실시예 5A, 0.22 ㎎/㎏; 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체 트라스투주맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(9%)), (MMAE:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 16.5:1) 실시예 30B, 2 ㎎/㎏; 리툭시맙-((EG2-MI(2.7%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(발린-아실옥시이소프로필옥시-MMAE)(9%))(MMAE:리툭시맙 약 9.5:1 내지 약 13:1), 실시예 30C, 2 ㎎/㎏; sc-FvFc-트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.1%)), (AF-HPA:scFvFc 트라스투주맙 항체 약 14:1 내지 약 19:1), 실시예 40, 0.67 ㎎/㎏; 또는 트라스투주맙-((EG2-MI(2.5%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.4%), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 17:1), 실시예 43B, 1 ㎎/㎏의 IV 투여; 또는 트라스투주맙-((EG2-MI(2.65%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520(2.9%)), (Arry 520:트라스투주맙 약 4:1 내지 약 6:1), 실시예 38, 10 ㎎/㎏으로 3 주 동안 매주 투여; 또는 리툭시맙-((EG2-MI(2.65%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520(2.9%)), (Arry 520:트라스투주맙 약 4:1 내지 약 6:1), 실시예 39, 10 ㎎/㎏으로 3 주 동안 매주 투여 후 NCI-N87 세포(각 군에 대해 n=10)가 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다; 결과는 PBRM-폴리머-약물 접합체(실시예 40 및 실시예 43B)에 대한 종양 성장 지연 반응을 나타낸다.
도 9는 1일째에 단회 용량으로 비히클, 또는 sc-FvFc-트라스투주맙-((EG2-MI(2.8%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.1%)), (AF-HPA:scFvFc 트라스투주맙 항체 약 14:1 내지 약 19:1), 실시예 40, 1 ㎎/㎏; 또는 트라스투주맙-((EG2-MI(2.5%)-(10 kDa PHF-BA(28%)-(AF-HPA-Ala(8.4%)), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 16:1), 실시예 43C, 2 ㎎/㎏의 IV 투여 후 JIMT-1 세포(각 군에 대해 n=10)가 피하 접종된 마우스에서 종양 반응에 대한 결과를 제공한다.
실시예 53. PBRM-폴리머-약물 접합체의 투여 후 마우스 혈장 PK
자성 CD-1 마우스를 최초 투여 후 적어도 4일 동안 순응하도록 두었다. 모든 마우스에 사료와 물을 규칙적으로 자유롭게 제공하였고, 화합물 투여 전에 절식시키지 않았다. 평가 화합물 또는 비히클을 1일째에 단회 용량으로 IV 투여하였다.
마우스에 비히클(n=3) 또는 PBRM-폴리머-약물 접합체, 트라스투주맙-((EG2-MI(3%))-(10 kDa PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%))), (AF-HPA:트라스투주맙 약 12:1 내지 약 17:1), 실시예 4, 5 ㎎/㎏, 각 군에 있어서 n=3)을 정맥내 주사하였다. 혈장을 투여 후 5분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일에 수집하였다. 체중을 투여 1일 전, 및 1, 7 및 14일에 측정하였다. 모든 동물을 사망률 또는 유병률에 대해 14일 기간에 걸쳐 관찰하였다.
접합된 AF-HPA 및 접합되지 않은(자유) 약물(예를 들면 AF-HPA 및 AF) 농도를 LC/MS 분석에 의해 결정하였다. 총 트라스투주맙 농도를 ELISA에 의해 결정하였다.
도 10의 결과는 트라스투주맙이 혈장 농도 ∼100 ㎍/㎖ 및 반감기 ∼12일을 갖는 반면, 접합되지 않은 AF-HPA 및 AF가 총 혈장 농도 < 1 ng/㎖을 가짐을 나타내었다. PBRM-폴리머-약물 접합체는 AUC0 내지 무한 ∼ 300 ㎍·일/㎖로, 5일 초과의 반감기를 가졌다.
실시예 54. PBRM-폴리머-약물 접합체 투여 후 마우스 혈장 PK
자성 CD-1 마우스를 최초 투여 후 적어도 4일 동안 순응하도록 두었다. 모든 마우스에 사료와 물을 규칙적으로 자유롭게 제공하였고, 화합물 투여 전에 절식시키지 않았다. 평가 화합물 또는 비히클을 1일째에 단회 용량으로 IV 투여하였다.
마우스에 비히클(n=3) 또는 실시예 4, 7, 18A, 18B 및 18C에 기재된 바와 같이 PBRM-폴리머-약물 접합체를 정맥내 주사하였다. 혈장을 투여 후 5분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일에 수집하였다. 체중을 투여 1일 전, 및 1, 7 및 14일에 측정하였다. 모든 동물을 사망률 또는 유병률에 대해 14일 기간에 걸쳐 관찰하였다.
총 AF-HPA(접합된 AF-HPA 및 접합되지 않은(자유) 약물(예를 들면 AF-HPA 및 AF) 농도를 LC-MS/MS 분석에 의해 결정하였다.
혈장 PK
평가 샘플 AF-HPA 대 트라스투주맙의 비 T 1/2 (hr) AUC 0 내지 336 (㎍·hr/㎖)
실시예 4 약 12:1 내지 약 17:1 125 20.1
실시예 7 약 16:1 내지 약 21:1 136 22.9
실시예 18A 약 19:1 내지 약 24:1 154 19.4
실시예 18B 약 20:1 내지 약 25:1 139 22.7
실시예 18C 약 23:1 내지 약 28:1 119 25.1
표 10의 결과는 PBRM-폴리머-약물 접합체가 AUC0 내지 336 ∼ 19 내지 25 ㎍·hr/㎖로, ∼120 - 154시간(∼5 - 6.4일)의 반감기를 가졌으며, PBRM-폴리머-약물 접합체의 AF-HPA 대 트라스투주맙의 비와 무관하였음을 보여주었다.실시예 55: PBRM-폴리머 약물 접합체의 관용성(MTD 연구)
PBRM-폴리머 약물 접합체의 관용성을 CD-1 자성 마우스에서 산정하였다. PBRM-폴리머-약물 접합체, 실시예 4를 20 ㎎/㎏, 40 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏(각 군에 대해 n=6) 용량에서 단회 IV 용량으로 투여하였다. 비히클 대조군에는 생리 식염수를 수여하였다. 동물을 21일의 기간에 걸쳐 임상적 징후에 대해 모니터링하였다. 모든 연구 동물의 개체 중량을 0일(기준선), 최초 5일 동안 매일 및 이후 대략 2일마다 기록하였다. 결과를 표 11에 요약한다.
군 용량(㎎/㎏) 7일째에 자체 기준선 대비 변화% 21일째에 자체 기준선 대비 변화% 사망률 또는 유병률
1 비히클 -1% +7.3% 없음
2 20 +3.7% +14.8% 없음
3 40 -20% +10.8% 7일째에 1마리 동물이 12% 체중 감소로 사망함
4 60 -28% NA 9일째에 4마리 동물이 빈사상태였고 희생시킴
20 ㎎/㎏ 용량은 잘 관용되었고, 이 군에서는 어느 마우스에서도 체중 감소가 관찰되지 않았다. 40 ㎎/㎏ 용량에서, ∼20%의 최대 체중 감소가 7일째에 관찰되었다. 상기 군에서의 1마리 동물이 7일째에 사망한 것으로 나타났고, 전 날에 ∼12% 체중 감소를 가졌다. 연구 말기에(21일), 상기 연구군의 모든 생존 동물(6마리 중 5마리)은 대조군 대비 체중이 증가하였다. 60 ㎎/㎏ 용량은 상기 군에서의 모든 동물이 7일째에 유의미한 체중 감소를 가졌으며 9일째에 빈사 상태였고 희생시켰으므로, 확실히 최대 관용 용량을 초과하였다.
결과는 마우스에 대한 최대 관용 용량이 20 내지 40 ㎎/㎏였음을 나타낸다.
실시예 56: 오리스타틴 F-히드록시프로필아미드의 관용성(MTD 연구)
오리스타틴 F-히드록시프로필아미드(AF-HPA)의 관용성을 CD-1 자성 마우스에서 산정하였다. AF-HPA,(US13/493,899, 현재 미국 특허 제8,685,383호, 실시예 48에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조)를 1.6 ㎎/㎏, 3.2 ㎎/㎏, 4.7 ㎎/㎏(각 군에 대해 n=6) 용량에서 단회 IV 용량으로 투여하였다. 비히클 대조군에는 생리 식염수를 수여하였다. 동물을 21일의 기간에 걸쳐 임상적 징후에 대해 모니터링하였다. 모든 연구 동물의 개체 중량을 0일(기준선), 최초 5일 동안 매일 및 이후 대략 2일마다 기록하였다. 결과를 표 12에 요약한다.
군 용량(㎎/㎏) 7일째에 자체 기준선 대비 변화% 21일째에 자체 기준선 대비 변화% 사망률 또는 유병률
1 비히클 -1% +7.3% 없음
2 1.6 11.6% +5.5% 없음
3 3.2 -20% +10.8% 7일째에 1마리 동물이 사망했고, 7일째에 3마리 동물이 빈사 상태였고 희생시킴. 2마리 생존.
4 4.7 -28% NA 3일째에 1마리 동물이 사망했고, 3일째에 1마리 동물이 빈사 상태였고 희생시켰으며 4일째에 3마리 동물 및 5일째에 1마리 동물이 빈사상태였고 희생시킴. 생존 마우스 없음.
1.6 ㎎/㎏ 용량은 허용 가능하게 관용되었고, 7일째에 11.6% 체중 감소가 관찰되었다. 동물들은 21일째에 완전 회복되어, 그 군 기준선에 비해 5.5% 체중 증가를 가졌다. 3.2 ㎎/㎏ 용량에서, 1마리 동물이 7일째에 사망하였고, 3마리 동물이 7일에 빈사 상태였고 희생시켰다. 연구 말기에(21일), 6마리 중 2마리 동물이 생존하였다. 4.7 ㎎/㎏ 용량은 상기 군에서의 모든 동물이 죽었거나 빈사 상태였고 희생시켰으므로, 최대 관용 용량을 확실히 초과하였다.
실시예 57. 표면 플라즈몬 공명에 의한 인간 5T4(세포외 도메인)으로의 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체 결합의 친화도 및 동력학 산정
5T4 항원에 대해 실시예 10에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조된 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체의 결합에 대한 친화도 및 동력학 파라미터를 GE Healthcare의 BIAcore T200 기기를 이용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다. 5T4-ECD-Fc 항원(인간 IgG1 서브타입의 Fc 도메인에 융합된 인간 5T4 세포외 도메인)을 키트(GE Healthcare)로 제공되는 시약을 이용하여 아민 커플링 방법에 의해 BIAcore CM5 센서 칩 상에 공유 고정하였다. 결합 연구에서, 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체 또는 대조군 단백질을 BIAcore 수행 버퍼 HBS-EP+(EDTA 및 P20이 보충된 HEPES 완충 식염수) 중 농도 시리즈로 연속 희석하고, 고정 시기 동안 고정된 항원에 걸쳐 흘려 결합하도록 두고, 항원만 해리시키기 위해 수행 버퍼를 흘린 뒤 저 pH 용액(10 mM 글리신-HCl, pH 2)을 이용해서 표면을 재생시켰다. 모든 BIAcore 시약은 GE Healthcare에서 구입하였다. 생성 데이터 곡선을 센소그램으로 부르며, 미가공 결합 데이터를 포함한다. 데이터를 BIAevaluation 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용해서 1:1 Langmuir 결합 모델에 피팅하고, 친화도/동력학 파라미터, 예를 들면 연합 속도, 해리 속도 및 친화도를 산정하였다. 친화도 산정치는 다회 측정의 평균이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체(실시예 10)는 높은 친화도(KD < 30 pM)로 인간 5T4 세포외 도메인에 결합하였다. 상기 값은 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc에 대해 결정된 것과 유사하다.
실시예 58. 세포 표면 5T4 항원에 대한 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체의 결합
항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체(항-5T4 scADC)의 세포 표면 결합(실시예 10)을 다양한 인간 암 세포주에서 FACS Calibre 유세포 측정기(Beckton Dickinson)를 이용해서 평가하였다. 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체의 세포 표면 결합을 적정에 의해 결정하고, 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc 항체에 대해 측정된 세포 표면 결합과 비교하였다.
5T4 과발현 재조합 MDA-MB-231(MDA-MB-231-5T4 OE), MDA-MB-231(5T4에 대해 음성; the American Type Culture Collection, Manassas Virginia US에서 접근 번호 HTB-26 하에 입수 가능) 및 A431(천연 발현 5T4) 세포(A431, the American Type Culture Collection, Manassas Virginia US에서 접근 번호 CRL-1555 하에 입수 가능)를 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체 및 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc의 적정을 위해 이용하였다. 지수 성장하는 세포를 0.5 mM PBS/EDTA 버퍼를 이용해서 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 세포를 PBS로 2회 세정하고 1% BSA-PBS 중 항-5T4 scFvFc, 항-5T4 scADC, 또는 비결합 scFvFc 융합 단백질(0.01 내지 10 ㎍/㎖)과 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3회 세정하고, 45분 동안 4℃에서 항-Fc 특이적-FITC 항체와 인큐베이션하였다. 항-Fc 특이적 FITC 항체의 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 3회 세정하고 유세포 측정(FACS Calibre, Becton Dickinson)을 이용해서 분석하였다. 중앙값 형광 강도(MFI)를 샘플에 대해 결정하였다.
항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체에 대해 특이적인 용량-의존적 세포 표면 결합(실시예 10)은 A431 및 5T4 과발현 MDA-MB-231 세포 모두에서 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc에 필적하였다. 관련되지 않은 scFvFc 융합 단백질의 결합은 5 ㎍/㎖에서 200-배 더 작았다. 또한, 5T4 발현에 대해 음성인 MDA-MB-231 세포는 항-5T4 scFvFc 또는 접합된 항-5T4 scFvFc ADC에 대해 임의의 세포 표면 결합을 나타내지 않았다.
실시예 59. 항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체의 생체내 유효성
물질: BD 1 ㎖ 주사기(271/2 게이지), 멸균 배양 배지, 멸균 포스페이트 버퍼화 식염수, 매트리겔-BD Biosciences(카탈로그 번호 354248), 멸균 면 플러그, 멸균 에펜도르프 튜브(1.5 ㎖, 2 ㎖), 피펫, 여과지, 70% 알코올/이소프로필 알코올, 베니어 칼리퍼(Mitutoyo). 이용된 모든 다른 필수 항목은 분석 등급이었다.
동물: 20-22 g 체중의 5-6 주령 무흉선 자성 누드 마우스(Hsd: 무흉선 Nude-Foxn1 nu )를 Harlan, Netherlands에서 입수하였다. 동물은 동물 실험 제어 및 감독 목적의 위원회(CPCSEA), 인도 정부의 규제 그리고 실험실 동물 관리 평가 및 승인 협회(AAALAC) 준수에 따라 관리하였다. 동물 실험을 수행하기 위한 'B 양식'을 기관 동물 윤리 위원회에서 검토하고, 허가하였다.
수용 및 급식: 동물을 22±3℃ 온도, 50±20% 습도, 각각 12시간의 명/암 주기 및 시간 당 15-20회 신선 공기 교체로 제어되는 환경에서 유지하였다. 동물을 군 별로 수용하고, 오토클레이브한 옥수수속대를 침구재로 이용하였다. 동물은 연구 기간 동안 인증된 방사선조사된 실험실 설치류 식이를 자유롭게 공급하였다.
동물 준비 & 동물 확인: 동물을 적어도 5일의 기간 동안 실험실에서 순응 하에 유지하였다. 동물을 개별적으로 넘버링하고, 실험, 연구 번호, 종양 이식 날짜, 무작위화 날짜, 종양 유형, 마우스 계통, 성별 및 개별 마우스 번호를 나타내는 우리 카드를 해당 우리에 디스플레이하였다. 무작위화 후, 군 정체, 평가 화합물, 투여량, 일정 및 투여 경로를 추가하였다.
종양 세포의 제조: 모든 절차를 멸균 기법에 따라 층판류 후드에서 수행하였다. 70-80% 융합성이고 90% 초과 생활성의 암 세포 (a) A431(표피모양), (b) 재조합 MDA-MB-231(유방) 과발현 5T4(MDA-MB-231 5T4++)(5T4 OE), 및 (c) H1975(비-소세포 폐암종)를 연구를 위해 선택하였다. 5 × 106 개 세포를 PBS 또는 얼음에서 유지된 50% 매트리겔을 함유하는 무혈청 배지 200 ㎕ 중에 재현탁하였다.
세포의 피하 주사: 개별 통기 우리(IVC)에 수용된 누드 마우스(Hsd: 무흉선 Nude-Foxn1 nu )를 이용하였다. 암 세포주를 동물의 넙적다리 또는 등에 피하 주사하여 동물에서 증식시켰다. 이식된 부위를 종양 성장에 대해 모니터링하였다. 종양이 촉진 가능해지고 요구되는 부피(TV ∼ 150 ㎣)가 되면, 동물을 종양 부피를 기준으로 무작위화하고, 투여를 개시하였다. 종양 부피를 무작위화 날짜(0일)에 칼리퍼로 2 차원 측정에 의해 결정한 뒤 3일 마다 한 번씩 결정하였다(즉, 마우스를 측량하는 것과 동일한 날짜에). 베니어 칼리퍼를 이용해서, 종양의 길이(L) 및 폭(W)을 측정하였다. 종양 부피(TV)를 하기 식을 용해서 계산하였다:
종양 부피(㎣) = L × W2 / 2,
식 중, L = 길이(㎜); W = 폭(㎜).
항-5T4 scFvFc 폴리머 약물 접합체(실시예 10)를 모든 제조 농도에서 투명 용액이 되는 멸균 1xPBS 중에 용해시키고, 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였다. 평가 항목을 투여 날짜에 새로 제조하였고, 투여 부피를 5 ㎖/체중 ㎏으로 유지하였다. 각 군에 있어서, 별도의 새로운 주사기 및 바늘을 이용하였다.
체중: 우리 쪽 관찰, 체중을 연구 기간 동안 3일에 1 번씩 측정하였다. 개별 마우스의 체중 변화%를 계산하였다.
항종양 활성: 항종양 활성을 비히클 대조군 대비 최대 종양 부피 저해로 평가하였다. 데이터 평가를 통계 소프트웨어 그래프 패드 버전 5를 이용해서 수행하였다.
평가/대조군% 값(T/C%): 특정 날짜의 종양 저해(T/C%)를 다음과 같이 대조군 대비 평가군의 평균 TV 값의 비에 100%를 곱해서 계산하였다: T/C(X일) = (X일째에 평가군의 평균 TV - 0일째에 평가군의 평균 TV)/(X일째에 대조군의 평균 TV - 0일째에 대조군의 평균 TV) × 100%
실험 동안 특정 평가군에 대해 기록된 최소(또는 최적) T/C% 값은 해당 치료에 대한 최대 항종양 활성을 나타낸다.
TV = 종양 부피(㎣)
종양 성장 저해(TGI): TGI를 하기 식을 이용해서 계산하였다:
TGI = (1 - T/C) × 100
식 중, T = (X일째에 평가군의 평균 TV - 0일째에 평가군의 평균 TV) 및 C = (X일째에 대조군의 평균 TV - 0일째에 대조군의 평균 TV)
임상 징후: 유병률 & 사망률: 동물을 연구 기간 동안 3일에 한 번씩 가시적인 일반 임상 징후에 대해 개별적으로 관찰하였다. 모든 동물을 유병률 및 사망률에 대해 확인하였다.
통계 분석: 종양 저해의 통계적 유의성 평가를 위해, 투 웨이 ANOVA에 이어 Bonferroni 포스트-테스트를 그래프패드 프리즘 버전 5를 이용해서 수행하였다. 0.05 미만의 p 값이 군 간 통계적 유의차를 나타낸다.
결과:
A431- 피하 이종이식편 항종양 활성:
A431 세포주를 이용한 이종이식편 실험에서["Characterization of the A431 tumor xenograft as an in vivo model for testing epidermal growth factor-receptor antagonists", S. Robinson et al., Int. J. Oncol. 1992, 1(3):293-8], 실시예 10에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조된 항-5T4 scADC를 하기 용량으로 종양-보유 마우스에 IV 투여하였다: 10 ㎎/㎏, 단회 용량; 1 ㎎/㎏, Q4D × 4; 3 ㎎/㎏, Q4D × 4; 및 6 ㎎/㎏, Q4D × 4. "Q4D × 4"는 총 4 개 용량에 대해 4일 1회의 투여를 의미한다. 별도 군의 종양-보유 마우스에 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc를 투여하였다(10 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4). 상기 연구에서, 항-5T4 scADC 치료법은 상기 언급된 용량 수준에서 단회 용량 또는 반복 용량으로 투여되는 경우 A431 암종 이종이식편에 대해 강력한 항종양 활성을 나타내었다(도 12). 단회 용량(10 ㎎/㎏ IV)에서 항-5T4 scADC를 이용한 치료는 24일째에 -4%의 최적 T/C 값을 생성했다. 10 ㎎/㎏ IV 단회 용량군에 대한 종양 성장 저해(TGI)%는 104%로 나타났다(24일, p < 0.001). 반복 용량군(1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 및 6 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4)에서의 최적 T/C 값은 24일째에 각각 -2%, -4% & -3%로 나타났다. 또한 반복 용량군(1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 및 6 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4)에 대한 종양 성장 저해(TGI)%는 각각 102%(24일, p < 0.001), 104%(24일, p < 0.001) 및 103%(24일, p < 0.001)로 나타났다. 단회 용량 및 반복 용량 항-5T4 scADC 치료군 간에는 유의차가 없었다. 10 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4 용량에서 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc의 투여는 A431 이종이식편의 종양 부피에서 임의의 유의미한 감소%를 유도하지 않았다. 24일째에 T/C% 값은 87%로 나타났다. 비히클-치료군 및 항-5T4 ScFvFc-치료군 간 종양 크기 차이는 통계적으로 유의미하지 않았고, 상기 용량에서의 종양 성장 저해(TGI)%는 13%로 나타났다(24일). 치료 후 방식으로, 항-5T4 scADC 평가군의 동물을 90일까지 관찰하고, 이 때 연구를 종료하였다. 6 mpk, i.v, Q4D × 4로 치료된 항-5T4 scADC 반복-용량군에서, 24일째까지 치료-관련 중증 체중 감소 및 사망률이 있었다(7/10마리 동물); 상기 용량군에서의 생존 동물을 90일까지 관찰하였다. 완전 종양 성장 퇴행을 모든 항-5T4 scADC 치료군에서 관찰하였고, 연구 기간 말기까지 종양 재성장 징후는 없었다(6 mpk, i.v., Q4D × 4 용량군에서 3/10마리 포함).
MDA-MB-231 5T4++ - 피하 이종이식편 항종양 활성:
MDA-MB-231-5T4 OE 이종이식편을 이용한 실험에서, 실시예 10에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조된 항-5T4 scADC를 하기 용량에서 종양 보유 마우스에 투여하였다: 10 ㎎/㎏ IV, 단회 용량; 1 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4; 3 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4; 및 6 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4. 별도 군에 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc(10 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4)를 투여하였다. 상기 연구에서, 항-5T4 scADC 치료법은 상기 언급된 용량 수준에서 단회 용량 또는 반복 용량으로 투여되는 경우 MDA-MB-231-5T4 OE 이종이식편에 대해 강력한 항종양 활성을 나타내었다(도 13). 단회 용량(10 ㎎/㎏ IV)에서 항-5T4 scADC를 이용한 치료는 18일째에 -25%의 최적 T/C 값을 생성하였다. 10 ㎎/㎏ IV 단회 용량군에 대한 종양 성장 저해(TGI)%는 125%로 나타났다(18일, p < 0.001). 반복 용량군(1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 및 6 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4)에서의 최적 T/C 값은 18일째에 각각 -26%, -32% & -38%로 나타났다. 추가로 반복 용량군(1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 및 6 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4)에 대한 종양 성장 저해(TGI)%는 각각 126%(18일, p < 0.001), 132%(18일, p < 0.001) 및 138%(18일, p < 0.001)로 나타났다. 단회 용량 및 반복 용량 항-5T4 scADC 치료군 간에는 유의차가 없었다. 10 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4 용량에서 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc 치료법은 MDA-MB-231 5T4 OE 이종이식편에 대해 온건한 항종양 활성을 나타내었다. 18일째에 T/C% 값은 45%로 나타났고, 상기 용량에서의 종양 성장 저해(TGI)%는 55%였다(18일, p < 0.001). 또한, 비히클 대조군에 대해 66일째의 평균 종양 부피는 1763 ㎣로 나타났다. 항-5T4 scADC 반복 용량군(1 mpk, 3 mpk, i.v; Q4D × 4) 및 단회 용량군(10 mpk, i.v)에서, 45일째부터 90일째까지 완전 종양 성장 퇴행이 있었고, 이 때 연구를 종료하였다. 연구 기간 말기까지 상기 언급된 항-5T4 scADC 치료군에서 종양 재성장 징후는 없었다. 그러나 6 mpk, i.v., Q4D × 4로 치료한 항-5T4 scADC 반복 용량군에서, 21일째까지 치료 관련된 중증 체중 손실 및 사망률(10/10)이 있었다. 72일째에 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc 항체 치료군에 대한 평균 종양 부피는 1502 ㎣로 나타났다. 상기 항체 치료군에 대해 66일째에 T/C% 값은 60%로 나타났고, 상기 용량에서의 종양 성장 저해(TGI)는 40%였다(66일, p < 0.001).
H1975-피하 이종이식편 항종양 활성:
H1975 폐 암종 세포주와 유사한 방식으로 수행된 이종이식편 실험에서, 실시예 10에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조된 항-5T4 scADC를 하기 용량에서 종양 보유 마우스(군 당 n=5 마우스, 초기 종양 부피 ∼150 ㎣)로 IV 투여하였다: 0.3 ㎎/㎏, Q4D × 4; 1 ㎎/㎏, Q4D × 4; 및 3 ㎎/㎏, Q4D × 4. 별도 군에 3 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4로 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc 항체를 투여하였다. 항-5T4 scADC(0.3 & 1 ㎎/㎏, i.v; Q4D × 4)를 이용한 치료는 상기 언급된 용량 수준에서 반복 용량으로 투여되는 경우, H1975 종양 이종이식편의 부분적 완화를 일으켰다(39일). 3 ㎎/㎏, i.v; Q4D × 4에서 항-5T4 scADC를 이용한 치료는 H1975 종양 이종이식편의 완전 완화를 일으켰다(39일). 0.3, 1 & 3 mpk, i.v; Q4D × 4에서 항-5T4 scADC를 이용한 치료는 39일째에 각각 -0.7%, -4% & -5%의 최적 T/C 값을 생성하였고, 종양 성장 저해(TGI)%는 101%, 104% & 완전 완화(CR)로 나타났다(39일, p < 0.001). 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc 항체를 이용한 치료는 39일째에 T/C% 값 88%, TGI% 12%로 불량한 항종양 활성을 일으켰다. 치료 후 요법으로, 치료군의 동물을 81일째까지 관찰하였고, 이 때 연구가 종료되었다. 60일째에, 항-5T4 scADC 치료법(0.3 ㎎/㎏, i.v; Q4D × 4)은 H1975 이종이식편 보유 누드 마우스에서 완전 완화(3/5)를 나타낸 반면, 39일부터 60일까지 2마리 동물에서는 종양 재성장이 관찰되었고, 이 때 상기 군의 동물은 희생시켰다. 그러나 81일째에, 항-5T4 scADC(1 & 3 ㎎/㎏, i.v; Q4D × 4)를 이용한 치료법은 H1975 이종이식편 보유 누드 마우스에서 완전 완화를 일으켰다(5/5; 81일).
NCI-N87-피하 이종이식편 항종양 활성:
상술된 종양 이종이식편 연구와 유사한 방식으로, NCI-N87(위 암종) 세포주로 이종이식편 실험을 수행하였다. 실시예 10에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조된 항-5T4 scADC를 하기 용량에서 종양 보유 SCID 마우스(군 당 n=10 마우스, 초기 종양 부피 ∼135 ㎣)에 IV 투여하였다: 3 ㎎/㎏, 단회 용량; 및 3 ㎎/㎏, Q4D × 3. 별도 군에 3 ㎎/㎏ IV, Q4D × 4로 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc 항체를 투여하였다. 하나의 치료-관련되지 않은 사망이 항-5T4 scADC 3 ㎎/㎏ 단회 용량군에서 평가되었고, 상기 동물에 대한 데이터는 분석에서 배제하였다. 19일째에, 항-5T4 scADC 치료군은 각각 3 ㎎/㎏, 단회 용량; 및 3 ㎎/㎏, Q4D × 3에서 92 및 87%의 종양 성장 저해를 나타내었다. 두 항-5T4 scADC 치료군 모두 100% 완전 퇴행을 가졌고, 75일의 연구 말기까지 지속 가능하였다. 접합되지 않은 항-5T4 scFvFc 항체를 이용한 치료는 19일째에 종양 성장 저해 값 14%로 불량한 항종양 활성을 일으켰다; 상기 치료군의 모든 동물은 56일째에 종양 부피 종말점 800 ㎣에 도달하였다.
예로, 상기 명세서에 언급된 모든 비특허 문헌, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 공보는 본 명세서에 참조로 모든 목적을 위해 포함된다. 본 발명은 이들의 정신 또는 본질적 특징에서 벗어나지 않고 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서 하기 구현예는 본 명세서에 기재된 발명을 제한하기보다 모든 측면에서 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 기재에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 시사되며, 청구범위의 균등 의미 및 범위 내의 모든 변화가 여기에서 포괄된다.
<110> ASANA BIOSCIENCES, LLC <120> PROTEIN-POLYMER-DRUG CONJUGATES <130> 2022-FPA-1249D <150> US 61/891,065 <151> 2013-10-11 <150> US 61/975,290 <151> 2014-04-04 <160> 8 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T4-specific murine scFv <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr 130 135 140 Ser Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala 145 150 155 160 Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly 180 185 190 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys Gln 210 215 220 Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 2 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T4-specific humanized scFv <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 165 170 175 Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 180 185 190 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val 195 200 205 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 225 230 235 240 Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 245 250 255 Lys <210> 3 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Hinge-CH2-CH3 (Fcgamma1) <400> 3 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 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Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys Gln 210 215 220 Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 Ile Lys Ala Ser Thr Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 245 250 255 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 5 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized anti-5T4 scFv-Fc (ASTC) <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 165 170 175 Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 180 185 190 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val 195 200 205 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 225 230 235 240 Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 245 250 255 Lys Ala Ser Thr Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 275 280 285 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 290 295 300 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 305 310 315 320 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 325 330 335 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 340 345 350 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 355 360 365 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 370 375 380 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 385 390 395 400 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 405 410 415 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 420 425 430 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 435 440 445 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 450 455 460 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 465 470 475 480 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 <210> 6 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized anti-5T4 scFv-Fc (ASTX) <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 165 170 175 Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 180 185 190 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val 195 200 205 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 225 230 235 240 Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 245 250 255 Lys Ala Ser Thr Xaa Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 275 280 285 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 290 295 300 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 305 310 315 320 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 325 330 335 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 340 345 350 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 355 360 365 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 370 375 380 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 385 390 395 400 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 405 410 415 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 420 425 430 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 435 440 445 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 450 455 460 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 465 470 475 480 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site-specific conjugation-1 <400> 7 Ala Ser Thr Cys 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> No site-specific conjugation-1 <400> 8 Ala Ser Thr Xaa 1

Claims (32)

  1. 다음을 포함하는 항-신생물 치료에 유용한 치료 약물 및 표적화 접합체:
    (a) 인간 암태아 단백질 5T4를 표적화하는 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포함하는 리간드(LG)로서, 다음의 (b)의 폴리머성 스캐폴드의 m5에 결합되고, 상기 m5는 1 내지 약 10인 리간드; 및
    (b) 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하는 폴리머성 스캐폴드로서, 다음과 같이 정의된 무작위로 배열된 모노머성 단위 m, m1, m2, m3a 및 m3b를 포함하는 폴리머성 스캐폴드:
    (ⅰ) m3a:
    Figure pat00189

    상기에서, m3a는 없거나, 1 내지 약 17의 모노머성 m3a 단위가 상기 폴리머 스캐폴드에 존재하고, 각각의 단위에서, Xa 및 Xb는 독립적으로 (A) 하나는 H이고 다른 하나는 말레이미도 차단 모이어티이거나, 또는 (B) Xa 및 Xb는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하는 것으로부터 선택되고;
    (ⅱ) m3b:
    Figure pat00190

    상기에서, 상기 설파이드 결합은 상기 리간드에 부착하는 점을 형성하고, 1 내지 약 8의 모노머 m3b 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하며, m3a 및 m3b의 합은 1 내지 18이고, 상기 황 원자는 상기 리간드의 일부이며;
    (ⅲ) m:
    Figure pat00191

    상기에서, 1 내지 약 300의 모노머 m 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하고;
    (ⅳ) m1:
    Figure pat00192

    상기에서, 1 내지 약 140의 모노머성 m1 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하고; 및
    (ⅴ) m2:
    Figure pat00193

    상기에서, 1 내지 약 40의 모노머성 m2 단위가 상기 폴리머성 스캐폴드에 존재하고;
    상기 각각의 모노머성 단위 m, m1, m2, m3a 및 m3b에서, X는 CH2, O 또는 NH이며,
    m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이고, 및
    각각의 D의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이고, D 및 카르보닐기 사이의
    Figure pat00194
    는 상기 카르보닐기에 대한 D의 직접 또는 간접 부착을 나타낸다.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 리간드는 약 40 kDa 이상의 분자량을 갖고, 상기 PHF는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 치료 약물 및 표적화 접합체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 리간드는 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포함하는 치료 약물 및 표적화 접합체.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편은 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이뮤노어드헤신, F(Ab)2, 미니바디, Fab', 단일-도메인 항체, 나노바디, 단일 사슬 Fv, 탠덤/비스-scFv, F(ab)3, scFv-Fc(또는 scFvFc), dsFv, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 약물 및 표적화 접합체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편은 항-5T4 scFvFc이고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 치료 약물 및 표적화 접합체.
  6. 청구항 1에 있어서,
    m5는 2 내지 8인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    m5는 2 내지 4인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    D는 독립적으로 (a) 오리스타틴 및 그의 유사체; (b) 칼리키아마이신 및 그의 유사체; (c) 두오카르마이신 및 그의 유사체; (d) SN38 및 (e) 피롤로벤조디아제핀 및 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 약물 및 표적화 접합체.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 오리스타틴 및 그의 유사체는 오리스타틴, 돌라스타틴, 모노메틸오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸오리스타틴 F(MMAF), 오리스타틴 F 페닐렌디아민(AFP) 및 오리스타틴 F 히드록시프로필 아미드(AF HPA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 약물 및 표적화 접합체.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 두오카르마이신 또는 그의 유사체는 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 B1, 두오카르마이신 B2, 두오카르마이신 C1, 두오카르마이신 C2, 두오카르마이신 D, 두오카르마이신 SA, CC-1065, 아도젤레신, 비젤레신 및 카르젤레신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 약물 및 표적화 접합체.
  11. 청구항 1에 있어서,
    X는 NH인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 PHF는 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 갖고; m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 150이며; m1은 1 내지 약 70이고; m2는 1 내지 약 20이며; m3a는 0 내지 약 9이고; m3b는 1 내지 약 8이며, m5는 2 내지 약 8이고, 및 m3a 및 m3b의 합은 1 내지 10인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 PHF는 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 갖고; m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 20 내지 약 110이며; m1은 2 내지 약 50이고; m2는 2 내지 약 15이며; m3a는 0 내지 약 7이고; m3b는 1 내지 약 8이며, m5는 2 내지 약 4이고, 및 m3a 및 m3b의 합은 1 내지 8인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 PHF는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 갖고; m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75이며; m1은 약 5 내지 약 35이고; m2는 약 3 내지 약 10이며; m3a는 0 내지 약 4이고; m3b는 1 내지 약 5이며, m5는 2 내지 약 4이고, 및 m3a 및 m3b의 합은 1 내지 5인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  15. 청구항 1에 있어서,
    m5는 2 내지 4인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  16. 청구항 1에 있어서,
    식 (B)를 갖는 치료 약물 및 표적화 접합체:
    Figure pat00195

    상기에서, 상기 PHF는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 갖고;
    상기 황 원자는 상기 리간드의 일부이며;
    m은 1 내지 75이고;
    m1은 약 5 내지 약 35이며;
    m2는 약 3 내지 약 10이고;
    m3a는 0 내지 약 4이며;
    m3b는 1 내지 약 5이고;
    m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75이며; 및
    m5는 2 내지 약 4이다.
  17. 청구항 1에 있어서,
    상기 m1 및 m2의 합은 약 8 내지 약 45인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  18. 청구항 1에 있어서,
    상기 PHF는 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 갖고; m2는 1 내지 약 20이며; m3a 및 m3b의 합은 1 내지 약 10이고; m1은 1 내지 약 70의 정수이며, 및 m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 15 내지 약 150인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  19. 청구항 1에 있어서,
    상기 PHF는 약 3 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 갖고; m2는 2 내지 약 15의 정수이며; m3a 및 m3b의 합은 1 내지 약 8이고; m1은 2 내지 약 50의 정수이며, 및 m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 20 내지 약 110인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  20. 청구항 1에 있어서,
    상기 PHF는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 갖고; m2는 약 3 내지 약 10의 정수이며; m3a 및 m3b의 합은 1 내지 약 5이고; m1은 약 5 내지 약 35의 정수이며, 및 m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 약 40 내지 약 75인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  21. 청구항 1에 있어서,
    폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)은 약 2 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 분자량을 갖고, m, m1, m2, m3a 및 m3b의 합은 15 내지 약 150인 치료 약물 및 표적화 접합체.
  22. 항-5T4 리간드 및 약 2 kDa 내지 약 40의 분자량을 갖는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF)을 포함하는 폴리머성 스캐폴드를 포함하는 항-신생물 치료에 유용한 치료용 항-5T4 약물 표적화 접합체로서, 상기 접합체는 다음의 구조를 갖는 접합체:
    Figure pat00196

    상기에서, m5는 1 내지 10이고;
    m은 1 내지 약 300의 정수이며;
    m1은 1 내지 약 140의 정수이고;
    m2는 1 내지 약 40의 정수이며;
    m3a는 0 내지 약 17의 정수이고;
    m3b는 1 내지 약 8의 정수이며; m3a 및 m3b의 합은 1 내지 약 18의 정수이고; 및 m, m1, m2 및 m3의 합은 약 15 내지 약 300의 범위이며;
    X는 NH이고;
    Xa 또는 Xb 중 하나는 H이고 다른 하나는 수용성 말레이미도 차단 모이어티이며; 및
    각각의 D의 존재는 독립적으로 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 치료제이고, D 및 카르보닐기 사이의
    Figure pat00197
    는 상기 카르보닐기에 대한 D의 직접 또는 간접 부착을 나타내며;
    상기 ANTI-5T4는 인간 암태아 항원 5T4에 선택적인 면역글로불린 또는 그의 기능성 절편을 포함하는 항-5T4 리간드이고; 및
    상기 황 원자는 상기 리간드의 일부이다.
  23. 청구항 22에 있어서,
    D는 (a) 오리스타틴 및 그의 유사체; (b) 칼리키아마이신 및 그의 유사체; (c) 두오카르마이신 및 그의 유사체; (d) SN38 및 (e) 피롤로벤조디아제핀 및 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 접합체.
  24. 청구항 23에 있어서,
    D는 오리스타틴, 돌라스타틴, 모노메틸오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸오리스타틴 F(MMAF), 오리스타틴 F 페닐렌디아민(AFP) 및 오리스타틴 F 히드록시프로필 아미드(AF HPA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 오리스타틴 또는 그의 유사체인 접합체.
  25. 청구항 22에 있어서,
    D는 히드록시프로필아미드-L-알라닌 모이어티를 통해 m2의 카르보닐 모이어티에 부착된 오리스타틴 또는 그의 유사체인 접합체.
  26. 청구항 22에 있어서,
    상기 치료제 대 항-5T4 리간드의 비는 약 5:1 내지 약 30:1인 접합체.
  27. 청구항 22에 있어서,
    상기 치료제 대 항-5T4 리간드의 비는 약 12:1 내지 약 18:1인 접합체.
  28. 청구항 22에 있어서,
    상기 치료제를 포함하는 폴리머성 스캐폴드 대 항-5T3 리간드의 평균 비는 약 2:1 내지 약 4:1인 접합체.
  29. 항-5T4 리간드 및 서로 무작위로 결합될 수 있는 아래에 나타낸 단위를 포함하는 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸-포르말)(PHF) 폴리머성 스캐폴드를 포함하는 항-신생물 치료에 유용한 치료 약물 및 표적화 접합체:
    Figure pat00198

    상기에서, ANTI-5T4는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체 구조체이고;
    상기 황 원자는 상기 단일 사슬 항체 구조체의 일부이며;
    상기 PHF는 약 2 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 갖고;
    평균 폴리머성 스캐폴드 대 항-5T4 단일 사슬 항체의 비는 약 2:1 내지 약 4:1이며; 및
    상기 오리스타틴 F HPA 대 항-5T4 항체의 비는 약 12:1 내지 약 18:1이다.
  30. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항의 치료 약물 및 표적화 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  31. 청구항 30의 약학적 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 질병을 치료하는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 질병은 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 입의 암, 중피종, 피부암, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 결장암, 췌장암, 신장암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 방법.
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