KR20210155197A - 골 유착능이 우수한 피크 임플란트 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피크 임플란트 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 이에 의하면, 콜라겐을 고정화한 피크 임플란트는 골 유착능이 우수하고, 이식물과의 해리가 발생하지 않으며, 금속이나 세균에 의한 염증 반응을 최소화할 수 있고, 골 생성을 가속화할 수 있는 동시에 무기질화 된 골 형성성이 우수한 효과를 모두 발현할 수 있다. 이에, 치과, 정형외과 등 임상에 널리 사용될 수 있다.

Description

골 유착능이 우수한 피크 임플란트 및 이의 제조방법{PEEK implant with excellent osseointegration and method for manufacturing thereof}

본 발명은 피크 임플란트에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 염 침전 압축 농축된 액상 콜라겐을 이용함으로써 초산을 사용하지 않고 중성의 수용액에서 피크 표면의 도파민과 반응시킴으로써 다량의 콜라겐을 고정화 할 수 있게 되어 골 유착능이 우수한 피크 임플란트에 관한 것이다.

일반적으로 의료용으로 사용되는 생체 임플란트는 척추 고정 보형재, 종간 보정 보형재, 인공관절 등을 영구적으로 이식시키기 위해 사용하는 것으로서, 인간의 생체조직에 대하여 매우 안정적인 생체 친화적인 재료를 사용하여야 한다. 또한, 부작용이나 기타 화학, 생화학적 반응성이 없어야 하고, 반복적인 하중 및 순간적인 압력의 부과에도 변형 및 파괴되지 않도록 기계적 강도가 매우 높아야 하며, 생체조직 특히, 뼈 조직과의 결합력이 매우 높아야 하는 의료용 기구이다.

이러한 임플란트는 뼈 조직에 식립된 후 영구적으로 기능을 발휘하도록 하거나 또는 목적하는 기능을 수행하는 기간 동안만 식립 된 후 뼈 조직에서 제거되며, 식립된 동안 뼈 조직과의 결합력을 높이기 위해서 임플란트 표면에 여러 가공을 수행하는 것이 일반적이다. 이러한 가공의 예로서 뼈 조직과의 비표면적을 높이기 위한 거칠기 가공이나, 뼈 조직과 유사한 성분, 예를 들어 수산화아파타이트와 같은 성분을 임플란트 표면에 코팅하는 가공이 그것이다.

그러나 이러한 골조직과의 결합력이 높도록 임플란트 표면을 가공한 경우에도 임플란트가 식립된 후 주변 조직에서 발생하는 염증 등의 부작용에 대한 해결은 현재까지 미흡한 실정에 있다. 특히 치아 교정용 마이크로 임플란트와 같이 식립된 후 교정을 위해서 임플란트를 지지대로 교정용 철선을 당기는 등의 교정력을 발생시키는 행위는 임플란트와 치조골이나 주변 조직 간 틈을 형성시키고, 이러한 틈으로 세균 등의 염증 유발 원인이 침투하여 염증을 발생시키고, 이로 인해 임플란트 식립 시술의 실패를 야기할 수 있다.

또한, 종래의 임플란트 재질은 일반적으로 티타늄과 같은 생체 친화적인 재료로 구현하여 생체 내 부작용을 최소화하는데, 상용화된 티타늄 임플란트의 경우 조직염증을 유발시키며, 이러한 조직염증은 임플란트와 식립된 골 및/또는 잇몸 사이 틈을 생성시키고, 틈을 더욱 이격되게 함으로써 추가적인 세균 침투에 의한 염증을 유발시키는 원인이 되는 문제가 발생하였다. 아울러, 종래의 임플란트의 경우 골 유착능이 저하됨에 따라 시술 후 환부에서 이탈되는 현상이 발생하거나, 표면 처리한 임플란트의 경우 이식물과의 해리 등으로 인해 영구이식 측면에서 안전성이 저하되는 문제가 있었다.

이에, 골 유착능이 우수하고, 이식물과의 해리가 발생하지 않으며, 금속이나 세균에 의한 염증 반응을 최소화할 수 있고, 골 생성을 가속화할 수 있는 동시에 무기질화 된 골 형성성이 우수한 효과를 모두 발현할 수 있는 임플란트에 대한 연구가 시급한 실정이다.

공개특허공보 제10-2014-0146512호

본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 피크 임플란트 표면에 많은 양의 콜라겐을 고정화시킬 수 있음에 따라 골 유착능이 우수하고, 이식물과의 해리가 발생하지 않으며, 금속이나 세균에 의한 염증 반응을 최소화할 수 있고, 골 생성을 가속화할 수 있는 동시에 무기질화 된 골 형성성이 우수한 효과를 모두 발현할 수 있는 피크 임플란트 및 이의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 피크(폴리 에테르 에테르 케톤, PEEK) 임플란트 표면 적어도 일부 상에 홍합 접착제로 잘 알려진 폴리도파민(poly-dopamine)을 통해 고정된 콜라겐 층을 포함하는 골 유착능이 우수한 피크 임플란트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 하기 측정방법에 따라 측정한 표면의 원소 조성에서 질소(N)가 12% 이상일 수 있다.

[측정방법]

피크 임플란트의 표면에 대하여 X선 광전자분광기(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)로 분석하여 형성된 피크의 면적을 통해 표면 원소 조성을 측정함.

또한, 상기 콜라겐층은 돼지껍데기 유래의 염 침전 압축 농축된 액상 콜라겐을 통해 형성될 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 피크(폴리 에테르 에테르 케톤, PEEK) 임플란트를 준비하는 단계, (2) 상기 피크 임플란트 표면에 도파민을 중합 코팅하는 단계, 및 (3) 도파민을 중합 코팅한 피크 임플란트의 표면 적어도 일부 상에, 액상 콜라겐 조성물을 반응시키는 단계를 포함하는 골 유착능이 우수한 피크 임플란트 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 액상 콜라겐 조성물은 콜라겐을 0.1 ~ 3.0 mg/ml의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피크 임플란트 및 이의 제조방법은, 골 유착능이 우수하고, 이식물과의 해리가 발생하지 않으며, 금속이나 세균에 의한 염증 반응을 최소화할 수 있고, 골 생성을 가속화할 수 있는 동시에 무기질화 된 골 형성성이 우수한 효과를 모두 발현할 수 있다.

이에, 치과, 정형외과 등 임상에 널리 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 골 유착능이 우수한 피크 임플란트를 제조하는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1에 따른 피크 임플란트의 표면 형광이미지이다.
도 3 내지 도 6은 각각 본 발명의 비교예 1, 비교예 2, 실시예 2 및 실시예 1에 따른 피크 임플란트 표면을 X선 광전자분광기(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)로 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 비교예1, 비교예 2 및 실시예 1에서 2일간 배양한 골세포(Osteoblasts)의 광학 이미지이다.
도 8은 본 발명의 비교예1, 비교예 2 및 실시예 1에서 3일간 배양한 골세포의 활성 그래프이다.
도 9는 본 발명의 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1에 따른 피크 임플란트에 대하여 실험한 총 골 볼륨 중 새로이 생성된 골 볼륨을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1에 따른 피크 임플란트에 대하여 실험한 골 밀도 볼륨을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 비교예 1에 따른 피크 임플란트(PEEK)에 대하여 실험한 Villanueva 염색된 골조직 사진이다.
도 12은 본 발명의 실시예 2에 따른 고상콜라겐을 적용한 피크 임플란트(PEEK-D-SCol)에 대하여 실험한 Villanueva 염색된 골조직 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예 1에 따른 액상콜라겐을 적용한 피크 임플란트(PEEK-D-LCol)에 대하여 실험한 Villanueva 염색된 골조직 사진이다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 골 유착능이 우수한 피크 임플란트는, 피크(폴리 에테르 에테르 케톤, PEEK) 임플란트 표면 적어도 일부 상에, 도파민을 통해 고정된 콜라겐층을 포함하여 구현된다.

먼저, 상기 피크 임플란트에 대하여 설명한다.

상기 피크 임플란트는 골절 고정용, 인공척추, 인공 의수, 치아 교정용 등 생체 내 식립되는 임플란트의 경우 제한 없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 임플란트는 폴리 에테르 에테르 케톤으로 형성됨에 따라, 종래의 금속계(예를 들어, 티타늄 등) 임플란트의 문제점을 해결할 수 있으면서도, 골 유착능이 우수하고, 골 생성을 가속화할 수 있는 동시에 무기질화 된 골 형성성이 우수한 효과를 모두 발현할 수 있다.

상기 폴리 에테르 에테르 케톤은 열가소성 플라스틱으로, 약 3.6 GPa의 영스모듈러스 및 90 ~ 100 MPa의 인장강도를 나타내는 우수한 기계적 성질과 화학적 안정성 및 생체적합성이 우수함에 따라, 티타늄과 같은 금속 임플란트를 대체할 수 있다.

상기 폴리 에테르 에테르 케톤은 분자 내에 화학반응을 수행하는 -NH₂, -OH 및 -COOH 구조가 없기 때문에 화학적으로 매우 안정하여 표면에 다른 기능성 화합물을 결합시키기 어렵다. 이에 따라, 후술하는 도파민을 통해 후술하는 콜라겐이 피크 표면에 고정될 수 있다.

한편, 상기 피크 임플란트의 크기는 일예로 직경이 약 1 ~ 2㎜, 길이는 약 6 ~ 10㎜일 수 있다.

또한, 후술하는 콜라겐층은 상기 피크 임플란트 표면 적어도 일부 상에 고정되고, 바람직하게는 후술하는 콜라겐층은 상기 피크 임플란트 표면 전부 상에 고정될 수 있다.

이때, 상술한 바와 같이 콜라겐층은 도파민을 통해 상기 피크 임플란트에 고정될 수 있고, 바람직하게는 도파민을 매개로 피크 임플란트와 콜라겐층의 상호 결합을 유도하여 고정될 수 있으며, 보다 바람직하게는 도 1에 도시된 바와 같이 상기 콜라겐층은 상기 도파민의 아민기와 화학결합 됨으로써 피크 임플란트에 고정될 수 있다.

한편, 아무 처리되지 않은 상태의 피크 임플란트에 콜라겐층을 결합하여 사용하게 되면 고정되는 콜라겐 층의 양이 크게 제한됨에 따라, 골 유착능이 저하되고 골 생성을 가속화할 수 없으며 무기질화 된 골 형성성이 저하될 수 있고, 이식물과의 해리가 발생할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 피크 임플란트는 도파민을 매개로 하여 후술하는 콜라겐분자를 공유결합 할 수 있게 되며, 이를 통해 골 유착능이 우수하고 골 생성을 가속화할 수 있으며 무기질화 된 골 형성성이 우수하고, 이식물과의 해리가 발생하지 않는 효과를 모두 동시에 발현할 수 있다.

다음, 상기 콜라겐층에 대하여 설명한다.

상기 콜라겐층은 골 유착능이 우수하고 골 생성을 가속화할 수 있으며 무기질화 된 골 형성성이 우수한 효과를 발현하는 기능을 수행한다. 콜라겐은 glycine, proline, hydroxyproline이 중심이 되어 삼중나사선 구조를 하고 있는 긴 섬유상으로 수용액에 거의 용해하지 않는다. 종래의 고상 콜라겐의 경우, 물에 대한 용해도가 현격히 낮음에 따라 초산 수용액에 용해를 시켜야 하였으며, 이에 따라 피처리재의 표면에 목적하는 수준으로 도입할 수 없는 문제가 있었다. 특히, 이 경우 수용액에 녹아 있는 초산의 카르복시기와 콜라겐 분자내의 카르복시기는 후술하는 EDC/NHS 촉매에 의해 동시에 활성화될 수 있다. 이렇게 되면 PEEK에 코팅되어 있는 도파민의 아미노기는 활성화된 콜라겐의 카르복시기와 반응할 수 있지만 동시에 초산의 카르복시기와도 반응하므로 도파민과의 반응에 방해요인으로 작용할 수 있음에 따라, 매우 적합하지 않다.

이에 따라, 본 발명에서는 돼지껍데기 유래의 염 침전 압축 농축된 액상콜라겐(LCol)을 반응에 이용함으로써 초산을 사용하지 않고 수용액에 녹여 고농도로 피크 임플란트의 표면에 콜라겐을 도입할 수 있다.

다음, 상기 도파민에 대하여 설명한다.

상기 도파민은 카테콜과 아민 작용기를 가지는 단분자 물질이다.

이때, 후술하는 바와 같이 바다속 환경과 동일한 염기성 pH 조건(pH 8.5)의 도파민 수용액을 통해 피크 임플란트의 표면에 카테콜 산화에 의해 폴리도파민(polydopamine, PDA) 코팅 층을 형성시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 피크 임플란트는, 하기 측정방법에 따라 측정한 표면의 원소 조성에서 질소(N)가 12% 이상일 수 있고, 바람직하게는 13% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 14% 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 14.5% 이상일 수 있다.

[측정방법]

피크 임플란트의 표면에 대하여 X선 광전자분광기(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)로 분석하여 형성된 피크의 면적을 통해 표면 원소 조성을 측정함.

만일 상기 표면의 원소 조성에서 질소(N)가 12% 미만이면 목적하는 수준의 무기질화된 골 형성성을 발현하기 어려운 문제가 발생할 수 있다.

상술한 본 발명에 따른 피크 임플란트는 (1) 피크(폴리 에테르 에테르 케톤, PEEK) 임플란트를 준비하는 단계, (2) 상기 피크 임플란트 표면에 도파민을 중합 코팅하는 단계 및 (3) 도파민을 중합 코팅한 피크 임플란트의 표면 적어도 일부 상에, 액상 콜라겐 조성물을 반응시키는 단계를 포함하여 제조된다.

먼저, 본 발명의 (1) 단계로써, 피크(폴리 에테르 에테르 케톤, PEEK) 임플란트를 준비하는 단계를 수행한다.

상기 피크 임플란트를 준비하는 (1) 단계는, 피크를 통해 목적하는 형상으로 임플란트를 성형하는 것으로, 당 업계에서 통상적으로 고분자수지를 통해 성형체를 성형하는데 사용할 수 있는 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 일 예로, 사출 등을 통해 피크 임플란트를 준비할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 (2) 단계는 상기 피크 임플란트를 도파민을 포함하는 용액에 침지하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 용액은 당 업계에서 통상적으로 사용할 수 있는 도파민을 용해시킬 수 있는 공지된 용매라면 제한 없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 용매로 트리스 용액(Tris(hydroxymethyl) aminomethane buffer solution)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때 상기 용액은, 용액 전체 중량에 대하여 도파민(Dopamine hydrochloride)을 0.0005 중량% 이상 포함할 수 있고, 바람직하게는 도파민(Dopamine hydrochloride)을 0.001 중량% 이상 포함할 수 있다.

만일 상기 용액 전체 중량에 대하여 도파민을 0.0005 중량% 미만으로 포함하면 도파민을 매개로 후술하는 콜라겐층이 피크 임플란트에 목적하는 수준으로 고정될 수 없음에 따라 골 유착능이 저하되고 골 생성을 가속화할 수 없으며 무기질화 된 골 형성성이 저하될 수 있고, 이식물과의 해리가 발생할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 피크 임플란트의 제조방법은, 상기 (1) 단계와 (2) 단계 사이에, 피크 임플란트를 피라나(Piranha) 용액 및 탈이온수 중 어느 하나 이상을 통해 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이때, 상기와 같이 피크 임플란트를 피라나(Piranha) 용액 및 탈이온수 중 어느 하나 이상을 통해 세척할 수 있고, 바람직하게는 피크 임플란트를 피라나(Piranha) 용액으로 세척한 후 탈이온수로 더 세척할 수 있다. 이 경우, 피크 임플란트를 피라나(Piranha) 용액으로 1 ~ 3회, 바람직하게는 1 ~ 2회 세척할 수 있고, 이후에 탈이온수로 2 ~ 4회, 바람직하게는 3 ~ 4회 세척할 수 있다.

한편, 상기 피라나 용액은 황산과 과산화수소수를 4 : 1 ~ 8 : 1로 포함할 수 있고, 바람직하게는 황산과 과산화수소수를 5 : 1 ~ 7 : 1로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다음, 본 발명의 (3) 단계로써, 도파민을 중합 코팅한 피크 임플란트의 표면 적어도 일부 상에, 액상 콜라겐 조성물을 반응시키는 단계를 수행한다.

상기 (3) 단계는 상기 피크 임플란트를 액상 콜라겐을 포함하는 액상 콜라겐 조성물에 침지하여 수행할 수 있다. 이에 따라, 상기 피크 임플란트의 표면 적어도 일부 상에, 바람직하게는 피크 임플란트의 표면 전부 상에 고농도의 콜라겐 층을 고정시킬 수 있다.

상기 액상 콜라겐 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용할 수 있는 용매라면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide, EDC] 및 N-하이드록시숙신이미드[N-hydroxysuccinimide, NHS]를 포함하는 수용액을 용매로 사용할 수 있다. 이때, 종래의 경우 고상 콜라겐의 용해를 위하여 산 성분을 통해 pH를 조절하였으나, 본 발명에 따른 액상 콜라겐 조성물은 별도의 산 성분을 사용하지 않고 EDC/NHS를 포함하는 수용액에 직접 용해시켜 반응시킴으로써 산 성분, 예를 들어 아세트산(acetic acid)으로 부터의 방해요인을 제거하였다.

한편, 상기 액상 콜라겐 조성물은 콜라겐을 0.1 ~ 3 ㎎/㎖의 농도로, 바람직하게는 0.7 ~ 1.5㎎/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 만일 상기 콜라겐의 농도가 0.1 ㎎/㎖ 미만이면 고정화되는 콜라겐의 양이 현저히 낮음에 따라 목적하는 수준의 효과를 발현할 수 없고, 농도가 3 ㎎/㎖를 초과하면 용해되지 않은 콜라겐이 발생됨에 따라 화학반응을 방해하게 되어 도입되는 콜라겐의 양이 감소할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

[실시예]

<실시예 1: PEEK-D-LCol>

피크 임플란트 중에서, 추간체 유합보형을 위한 척추 케이지를 준비했다. 이후 피크 임플란트를 피라나(Piranha, 황산 : 과산화수소수 = 6:1 중량비) 용액을 이용하여 1회 세척 후 탈이온수로 3회 더 세척하였다. 그리고, 도파민 용액으로 0.002중량%로 도파민(Dopamine hydrochlororide)이 용해된 트리스 용액(Tris(hydroxymethyl) aminomethane buffer solution, pH 8.5)에 세척한 피크 임플란트를 용액에 넣은 후 24시간 상온 방치하였다. 그 후, 액상 콜라겐 조성물로 pH 5.6인 EDC 및 NHS 수용액에 돼지껍데기 유래의 염 침전 압축 농축된 액상 콜라겐을 농도 1mg/ml로 녹여 여기에 도파민 용액에 침지 및 방치하여 얻은 피크 임플란트를 투입하여 48시간 동안 교반하였다. 그리고, 탈이온수로 세척하고 건조시켜서 도 1과 같이 콜라겐층이 고정된 피크 임플란트를 제조하였다.

<실시예 2: PEEK-D-SCol>

실시예 1과 동일하게 실시하되, 액상 콜라겐 조성물을 사용하지 않고, 고상의 콜라겐(collagen type 1, Sigma)을 0.1% 초산 수용액에 1mg/ml로 녹인 고상 콜라겐 조성물을 사용하여여 콜라겐층이 고정화된 피크 임플란트를 제조하였다.

<비교예 1: PEEK>

피크 임플란트 중에서, 추간체 유합보형을 위한 척추 케이지를 준비했다.

<비교예 2: PEEK-D>

실시예 1과 동일하게 실시하되, 액상 콜라겐 조성물에 투입 및 교반하는 단계를 수행하지 않고, 표면에 도파민 만 코팅된 피크 임플란트를 제조하였다.

<실험예 1>

실시예 1(PEEK-D-LCol), 실시예 2(PEEK-D-SCol) 및 비교예 1(PEEK)에 따른 피크 임플란트에 대하여, 도파민과 콜라겐의 아미노기와 반응하는 FITC 염색시약을 각각의 피크 임플란트에 반응시켜서 공초점 형광 현미경을 통해 관찰하여 도 2에 나타내었다.

그 결과, 실시예 1에 따른 피크 임플란트에서 현격히 많은 초록색 반점들이 관찰되는 것으로부터, 염 침전 압축 농축된 액상 콜라겐을 사용하여 제조한 실시예 1은, 현격히 많은 콜라겐이 도입된 것을 알 수 있었다.

<실험예 2>

비교예 1(PEEK), 비교예 2(PEEK-D), 실시예 2(PEEK-D-SCol) 및 실시예 1(PEEK-D-LCol)에 따른 피크 임플란트의 표면에 대하여, X선 광전자분광기(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)로 분석하였다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 비교예 1(PEEK)은 284.6 eV에서 C1s 피크가 나오고, 536.1 eV에서 O1s 피크가 나타났으며, 도파민 및 콜라겐을 포함하지 않음에 따라 N1s 피크는 나타나지 않은 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이 비교예 2(PEEK-D)는 397.7 eV에서 N1s 피크가 추가로 나타남으로써 도파민이 도입되었다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 5에 도시된 바와 같이 실시예 2(PEEK-D-SCol)은 N1s 피크의 크기가 증가하는 것을 통해 적은 양이지만 콜라겐이 도입된 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 6에 도시된 바와 같이 실시예 1(PEEK-D-LCol)은 N1s 피크의 크기가 현격히 증가함에 따라 콜라겐이 현격히 많이 도입된 것을 확인할 수 있다.

그리고, 도 3 내지 도 6의 피크 면적으로부터 피크 임플란트 표면의 원소 조성을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

구분	원소 조성(%)
	C	O	N	S
비교예1	84.8	15.2	< 0.1	< 0.1
비교예2	74.7	18.6	6.7	< 0.1
실시예2	70.2	19.6	10.2	< 0.1
실시예1	66.0	18.5	15.5	< 0.1

상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 고체 콜라겐을 사용한 실시예 2의 경우 질소(N)가 10.2%로, 액상 콜라겐을 사용한 실시예 1의 15.5%에 비하여 상대적으로 질소가 51.9% 현격히 적은 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 실시예 1은 현격히 많은 콜라겐이 도입되었다는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 3>

비교예 1(PEEK), 비교예 2(PEEK-D) 및 실시예 1(PEEK-D-LCol)에 따른 피크 임플란트에 대하여, 각각의 피크 임플란트에 골세포를 2일간 배양한 뒤 하기의 항목을 평가하였다.

1. 표면 분석

골세포를 2일간 배양한 각각의 피크 임플란트의 표면을 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 액상 콜라겐을 사용한 실시예 1은 표면에서 세포가 잘 부착하여 증식하고 있다는 것을 확인할 수 있다.

2. 골세포의 활성 평가

골세포를 2일간 배양한 각각의 피크 임플란트에 대하여, 세포활성화를 평가하였다.

그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이 액상 콜라겐을 사용한 실시예 1은, 비교예 1에 비하여 세포활성이 31.8% 이상 현격히 우수하고, 비교예 2에 비하여 세포활성이 16% 이상 현격히 우수한 것을 확인할 수 있다.

<실험예 4>

실시예 1 ~ 2 및 비교예 1에 따른 임플란트에 대하여, 임상시험으로 8개월 된 수컷 Beagle dog를 이용하여 임플란트 후 5주 후 및 10주 후 각각에 대해 마이크로 CT촬영을 하여 골생성 관련 결과를 평가하였다. 동물실험 절차를 좀더 상세히 설명하면 아래와 같다.

먼저 염산케타민(Ketamine hydrochloride)(Ketamine, Yuhan Corporation, Korea, 5mg/kg) 및 염산메데토미딘(Medetomidine hydrochloride)(Domitor, zoetis, USA, 40ug/kg)을 근육 내 주사하여 마취 후, 아이소플루레인(isoflurane, 1.5 ~ 2%)으로 마취를 유지했다. 마취된 시험동물은 양와자세로 보정한 후, 양측 뒷다리를 제모하고 알코올과 포비돈 용액으로 수술부위를 소독하였다. 시험동물의 경골 내측부위 피부 및 근육을 절개한 후, 골막을 제거하여 경골을 노출시키고 수술용 전동드릴을 이용하여 양측에 각각 2개씩 2 cm 간격으로 총 4개의 결손부를 만들었으며, 결손부의 크기는 지름 4mm로 하였다. 그 후 각각의 피크 임플란트 시료를 결손부에 맞게 넣은 후, 근육과 피부를 차례로 봉합하고 포비돈 용액으로 소독 및 드레싱 해주었다.

수술 후 3일간 세파졸린소듐(Cefazolin sodium)(Cefazolin, Chong Kun Dang Pharm, Korea, 20mg/kg) 및 멜록시캄(Meloxicam)(Metacam, Boehringer Ingelheim, Germany, 0.2mg/kg) 을 투여하였다. 수술 후 7일간 봉합부위를 확인하고, 이상이 없음이 확인되었으므로 봉합사를 제거하였다. 수술 후 5주와 10주 째에 각 3 마리씩 염산케타민(Ketamine hydrochloride)(Ketamine, Yuhan Corporation, Korea, 7mg/kg) 및 염산메데토미딘(Medetomidine hydrochloride)(Domitor, zoetis, USA, 40ug/kg) 을 근육 내 주사하여 마취 후, 염화칼륨(KCl)을 정맥으로 주사하여 안락사를 진행하였다. 안락사 된 시험동물은 수술용 전동드릴을 이용하여 시험물질이 적용된 시험동물의 경골부위를 적출하여 micro-CT를 촬영 및 평가한 후, 10% 중성포르말린에 고정한 뒤, 조직학적 평가를 진행하였다. Micro-CT(Quantum FX uCT, Perkin Elmer, USA) 평가는 90kV, 160uA, FOV 20mm, scan time 2min 조건으로 촬영하였으며, Analyze 12.0 (Analyze Direct, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다.

시험물질 주변을 ROI(Region of Interest)로 설정하여 BV/TV(Bone Volume/Total Bone Volume) 및 vBMD(Volume Bone Mineral Density)를 측정하였다. 조직학적 평가를 위한 조직염색은 레진(resin)으로 포매 후 10㎛ 두께의 슬라이드를 제작하여 Villanueva 염색을 진행하였다. 염색이 완료된 시료는 현미경 (Axio Imager A2, Carl Zeiss) 으로 X100 배율사진을 획득하고, Image J 프로그램을 이용하여 골형성 정도를 분석하였다.

1. 총 골 볼륨 중 생성된 골 볼륨(BV/TV, Bone Volume/Total Volume) 측정

먼저, 실시예 1 ~ 2 및 비교예 1에 따른 피크 임플란트에 대하여, 총 골 볼륨 중 생성된 골 볼륨(BV/TV, Bone Volume/Total Volume)을 측정하였는데, 그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이 비교예 1에 따른 피크 임플란트에 비하여 콜라겐이 도입된 실시예 1 및 실시예 2에 따른 피크 임플란트가 총 골 볼륨 중 생성된 골 볼륨이 크게 나타났다. 이는 콜라겐이 고정화 됨에 따라 골세포에 대한 친화성이 증대되어 골 볼륨이 증가한 것으로 볼 수 있다. 또한, 고상 콜라겐을 사용한 실시예 2와 액상 콜라겐을 사용한 실시예 1은 5주차에서는 유의미한 차이가 나지 않았으나, 10주차에서는 실시예 1에 따른 피크 임플란트에서 골 볼륨이 현격히 많이 증가한 것을 확인할 수 있다. 이는 상술한 표 1과 같이 실시예 1이 실시예 2에 비하여 현격히 많은 콜라겐을 도입할 수 있었기 때문이다.

2. 골 밀도 볼륨(vBMD, Volume Bone Mineral Density) 측정

다음으로, 먼저, 실시예 1 ~ 2 및 비교예 1에 따른 피크 임플란트에 대하여 골 밀도 볼륨(vBMD, Volume Bone Mineral Density)을 측정하였는데, 그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이 비교예 1에 따른 임플란트에 비하여 콜라겐이 도입된 실시예 1 및 실시예 2에 따른 피크 임플란트가 골 밀도 볼륨이 높게 나타났다. 또한, 고상 콜라겐을 사용한 실시예 2와 액상 콜라겐을 사용한 실시예 1은 5주차에서는 유의미한 차이가 나지 않았으나, 10주차에서는 실시예 1에 따른 피크 임플란트에서 골 밀도 볼륨이 매우 현격히 높은 것을 확인할 수 있다.

3. Villanueva 염색된 골조직 사진 평가

그리고, 실시예 1 ~ 2 및 비교예 1에 따른 임플란트에 대하여 Villanueva 염색된 골조직 사진을 촬영하였다. 그 결과를 도 11(비교예 1), 도 12(실시예 2) 및 도 13(실시예 1)에 각각 나타내었고, 각 도에 표기된 B와 D는 A와 C의 빨간사각형 영역을 20배 확대한 사진이다.

Villanueva 염색을 통한 골조직 분석방법은 신생골이 생성되고 무기질화 됨에 따라 분홍색에서 남색, 보라색을 지나 살구색과 회색 그리고 흰색으로 나타나게된다.

이때, 도 11, 12 그리고 13에서 표기된 파란 화살표 머리(Blue arrow head)는 무기질화 되기 전 골(Osteoid)을 나타내고, 빨간 화살표 머리(Red arrow head)는 무기질화 된 골(조골세포, Osteoblast cell)을 나타내며, 빨간 별(Red star)은 미성숙 골(Woven bone)를 나타내고, 파란 별(Blue star)은 성숙 골(Lamellar bone)을 나타낸다.

실험 결과, 비교예 1(PEEK)을 이용한 도 11의 피크 임플란트 이식부위의 5주 및 10주 염색결과는 신생골의 무기질화 되기 전 현상과 일정수준 이상의 무기질화가 진행되었으나, 성숙되지 않은 골(Woven bone)의 형태가 확인됨을 알 수 있다.

실시예 2(고상 콜라겐 사용)를 이용한 도 12의 피크 임플란트 이식부위의 5주 및 10주 염색결과는 무기질화가 충분히 진행된 성숙 골(Lamellar bone)의 형태를 확인할 수 있었고, 비교예 1(PEEK)의 염색결과와 비교하여 골재생이 가속화됨을 알 수 있다.

실시예 1(액상 콜라겐 사용)를 이용한 도 13의 피크 임플란트 이식부위의 5주 및 10주 염색결과는 실시예 2의 도 12와 유사하게 이식부위의 무기질화가 충분히 이루어져 성숙 골(Lamellar bone)의 형태가 나타남을 확인할 수 있다.

또한, 10주차 D 그림에서는 실시예 2(고상 콜라겐 사용)의 도 12, 10주차 D 그림과 비교하여 무기질화 된 성숙 골의 밀집도가 현격히 더 높음을 알 수 있으며, 이는 더 많은 무기질화가 진행되었음을 나타내고 있다.

이 같은 결과를 통해 실시예 1(액상 콜라겐 사용)는 실시예 2(고상 콜라겐 사용) 및 비교예 1(피크 임플란트 단독) 보다, 무기질화 된 골 형성성이 현격히 우수하여 무기질화 된 골이 다량 확인되는 것을 알 수 있다. 이것은 액상콜라겐을 이용하여 PEEK 표면에 고정화 했을 경우가 고상콜라겐을 이용한 경우보다도 훨씬 많은 양의 콜라겐이 고정화되었기 때문이다.

<실시예 3 ~ 실시예 6>

실시예 1과 동일하게 실시하되, 액상 콜라겐 조성물 내 액상 콜라겐의 농도를 변경하여 하기 표 2와 같은 피크 임플란트를 제조하였다.

<실험예 5>

실시예 1 및 실시예 3 ~ 6에 따른 피크 임플란트의 표면에 대하여, X선 광전자분광기(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)로 분석하였다.

그 결과, 측정되는 피크 면적으로부터 피크 임플란트 표면의 원소 조성을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.

구분	액상 콜라겐 조성물	원소 조성(%)
	액상 콜라겐 농도(㎎/㎖)	C	O	N	S
실시예1	1	66.0	18.5	15.5	< 0.1
실시예3	0.05	69.7	19.6	10.7	< 0.1
실시예4	0.7	66.3	18.6	15.1	< 0.1
실시예5	1.5	65.9	18.5	15.6	< 0.1
실시예6	3.5	68.2	19.0	12.8	< 0.1

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 액상 콜라겐의 농도 범위를 만족하는 실시예 1, 실시예 4 및 실시예 5는, 이를 만족하지 못하는 실시예 3 및 실시예 6에 비하여 질소(N)가 현격히 많을 것을 알 수 있으며, 이에 따라 실시예 1, 실시예 4 및 실시예 5는 실시예 3 및 실시예 6에 비하여 무기질화 된 골 형성성이 현격히 우수하다는 것을 간접적으로 확인할 수 있다.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 피크(폴리 에테르 에테르 케톤, PEEK) 임플란트 표면 적어도 일부 상에,
   도파민을 통해 고정된 콜라겐 층을 포함하는 골 유착능이 우수한 피크 임플란트.
2. 제1항에 있어서,
   하기 측정방법에 따라 측정한 표면의 원소 조성에서 질소(N)가 12% 이상인 골 유착능이 우수한 피크 임플란트:
   [측정방법]
   피크 임플란트의 표면에 대하여 X선 광전자분광기(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)로 분석하여 형성된 피크의 면적을 통해 표면 원소 조성을 측정함.
3. 제1항에 있어서,
   상기 콜라겐층은 돼지껍데기 유래의 염 침전 압축 농축된 액상 콜라겐을 통해 형성된 골 유착능이 우수한 피크 임플란트.
4. (1) 피크(폴리 에테르 에테르 케톤, PEEK) 임플란트를 준비하는 단계;
   (2) 상기 피크 임플란트 표면에 도파민을 중합 코팅하는 단계; 및
   (3) 도파민을 중합 코팅한 피크 임플란트의 표면 적어도 일부 상에, 액상 콜라겐 조성물을 반응시키는 단계;를 포함하는 골 유착능이 우수한 피크 임플란트 제조방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 액상 콜라겐 조성물은 콜라겐을 0.1 ~ 3 ㎎/㎖의 농도로 포함하는 골 유착능이 우수한 피크 임플란트 제조방법.

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