CN114870077B - 一种聚醚醚酮支架及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚醚醚酮支架及其制备方法、应用,聚醚醚酮支架,包括:具有微孔结构的本体,所述本体的材质为聚醚醚酮;功能层,包括包裹所述本体的聚多巴胺层和复合在所述聚多巴胺层表面的碱性成纤维细胞生长因子。通过在具有微孔结构的本体上涂覆聚多巴胺层,在聚多巴胺层的表面引入碱性成纤维细胞生长因子,使得该聚醚醚酮支架作为植入物时,能够和软组织间形成有效的整合和密封,避免出现感染、松动和移位等并发症。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,具体涉及一种聚醚醚酮支架及其制备方法、应用。
背景技术
聚醚醚酮(PEEK)作为一种替代金属植入物的候选材料被引入骨科植入物中。与具有超过100GPa的高弹性模量的典型金属材料不同,聚醚醚酮(PEEK)具有接近皮质骨(~20GPa)的弹性模量,这可以减轻植入物与人体骨骼之间的弹性失配导致的应力屏蔽引起的骨质疏松和骨吸收的风险。PEEK还具有无毒性,良好的耐化学性,良好的生物相容性,天然射线可透性,甚至MRI(磁共振成像)兼容性。
但是,PEEK表面的生物惰性不利于细胞黏附和增殖,将其加工成植入物时,植入物和软组织间难以形成有效的整合和密封,继而引发感染、松动和移位等并发症。
因此,现有技术还有待于进一步的提升和改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于,针对现有聚醚醚酮材质的植入物,因聚醚醚酮表面的生物惰性不利于细胞黏附和增殖,导致植入物和软组织间难以形成有效的整合和密封的问题。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案如下:
一种聚醚醚酮支架,其中,包括:
具有微孔结构的本体,所述本体的材质为聚醚醚酮;
功能层,包括包裹所述本体的聚多巴胺层和结合在所述聚多巴胺层表面的碱性成纤维细胞生长因子。
可选地,所述聚醚醚酮支架,其中,所述微孔结构包括:一级孔结构和二级孔结构,所述一级孔结构为毫米级微孔结构,所述二级孔结构为微米级微孔结构。
可选地,所述聚醚醚酮支架,其中,所述一级孔结构贯穿所述本体,所述二级孔结构分布在所述本体的表面。
一种上述所述的聚醚醚酮支架的制备方法,其中,所述方法包括:
采用3D打印,加工出具有微孔结构的本体;
将所述本体浸入多巴胺溶液中,形成包裹所述本体的聚多巴胺层;
将被聚多巴胺层包裹的本体浸入含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,得到所述聚醚醚酮支架。
可选地,所述的聚醚醚酮支架的制备方法,其中,所述将所述本体浸入多巴胺溶液中,形成包裹所述本体的聚多巴胺层的步骤,具体包括:
将多巴胺冻干粉末加入到盛有Tris-HCl缓冲溶液的反应容器中,得到多巴胺溶液;
将所述本体浸入所述多巴胺溶液中,并将所述反应容器置于摇床上,遮光反应8-12小时;
遮光反应后,将所述反应容器转移至黑暗环境中,在静置状态下反应10-12小时,多巴胺沉积在所述本体上,形成包裹所述本体的聚多巴胺层。
可选地,所述聚醚醚酮支架的制备方法,其中,所述将被聚多巴胺层包裹的本体浸入含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,得到所述聚醚醚酮支架的步骤,具体包括:
将碱性成纤维细胞生长因子冻干粉末溶解在磷酸盐缓冲溶液中,得到含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液;
将被聚多巴胺层包裹的本体浸入所述含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,置于4℃冰箱静置反应18-24小时,得到所述聚醚醚酮支架。
可选地,所述的聚醚醚酮支架的制备方法,其中,所述采用3D 打印,加工出具有微孔结构的本体的步骤之后还包括:
将所述本体置于玻璃注射器中,从所述玻璃注射器的底部注入浓硫酸,使所述本体侵入浓硫酸中,得到表面具有二级微孔结构的本体;所述浓硫酸的质量分数为95-98%。
可选地,所述聚醚醚酮支架的制备方法,其中,所述含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,碱性成纤维细胞生长因子的质量浓度为 0.5-1.0μg/ml。
可选地,所述聚醚醚酮支架的制备方法,其中,所述采用3D打印,加工出具有微孔结构的本体的步骤,具体包括:
设计具有微孔结构的本体模型,并导出为STL格式文件;
将所述STL格式文件导入3D打印机,采用医用级聚醚醚酮材料,加工出具有微孔结构的本体。
一种用上述所述的聚醚醚酮支架作为植入物。
有益效果:与现有技术相比,本发明提供的聚醚醚酮支架,通过在具有微孔结构的本体上涂覆聚多巴胺层,在聚多巴胺层的表面引入碱性成纤维细胞生长因子,使得该聚醚醚酮支架作为植入物时,能够和软组织间形成有效的整合和密封,避免出现感染、松动和移位等并发症。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的一种聚醚醚酮支架的制备流程示意图;
图2为本发明实施例所提供的一种聚醚醚酮支架的结构示意图;
图3为不同组PEEK支架样本的表面化学元素组成分布图;其中, A为对照组P0.8样本主要包含C和O元素;B为磺化处理使SP0.8样本的S元素含量由3.32±0.16%显著增加到9.5±1.11%;C为多巴胺经过螯合作用成功到CP0.8样本上;D为bFGF这种功能化生物大分子的成功引入;
图4为不同组PEEK样本形貌;其中,A为对照组PEEK支架P0.8 的表面形貌;B为SP0.8样本放大20k倍后的形貌图;C为CP0.8样本的高倍图形;D为SCP0.8样本的形貌图;
图5为AFM测试的不同组PEEK样本的表面形态;其中,A为P0.8 样本的表面形态;B为SP0.8样本的表面形态;C为CP0.8样本的表面形态;D为SCP0.8样本的表面形态;
图6为AFM测试的不同组PEEK样本的粗糙度;
图7为不同PEEK样本(实心)支架表面水接触角;
图8为压汞法测试不同PEEK样本孔隙结构特征参数;
图9为不同组PEEK样本对BSA的吸附能力;
图10为原代胎兔皮肤成纤维细胞提取细胞图;
图11为新西兰大白兔PEEK植入实验和样本宏观表面分析图;
图12为不同组PEEK样本2W时间点组织H&E染色图像;
图13为不同组PEEK植入物典型SEM图像;
图14为PEEK样本Micro-CT扫描图像。SCP0.8植入前Top视图 (A)、Middle视图(B)、纵截面视图带完整细丝(C)和纵截面视图带一半细丝(D);SCP0.8植入2W后上(E)、中(F)、下(G) 截面视图。
具体实施方式
本发明提供的一种聚醚醚酮支架及其制备方法、应用,为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
如图1所示,图1为本发明实施例所提供的一种聚醚醚酮支架的制备流程示意图,即采用3D打印技术加工出具有微孔结构的聚醚醚酮支架本体,采用浓硫酸对所述支架本体进行磺化,使得支架具有多级微孔结构,通过制备出具有多级微孔结构的支架,可以使得作为植入物时,使软组织细胞向内部生长,提升其与软组织之间的牢固度;在具有多级微孔结构的支架表面涂覆聚多巴胺(Polydopamine,PDA),在聚多巴胺层表面引入碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),利用生长因子促进软组织与聚醚醚酮支架之间进行快速的诱导融合,从而使得聚醚醚酮支架和软组织之间形成有效的整合和密封,避免出现感染、松动和移位等并发症。
示例性地,具体的制备可以包括如下步骤:
多级微孔结构设计和制造,采用通用CAD设计软件ANSYS SpaceClaim 2021R2(Ansys Workbench,USA)来进行设计多级微孔结构。支架直径为15mm,高度为10mm和5mm,分别用来进行表面表征实验、细胞以及动物在体实验。将设计好的模型导出为STL格式文件,之后导入通用3D打印切片软件Simplified 3D,设置线宽、层厚、打印速度、填充方式、喷嘴温度分别为0.4mm、0.2mm、40mm/s、Solid/Rectilinear、430℃,用医用级PEEK材料和PEEK专用3D打印机,加工毫米级微孔PEEK植入物。对所得到的毫米级微孔PEEK植入物在高温下进行热处理(如在250℃热处理2h,然后在300℃热处理1.5h),通过采用热处理可以改善PEEK植入物的力学性能。
通过浓硫酸蚀刻方法来制备表面二级微孔结构。将3D打印的 PEEK植入物完全没入浓硫酸(95.0%-98.0%)来实现。具体地,将样本分别在乙酸乙酯、乙醇和超纯水中清洗20分钟。为了确保硫酸溶液快速进入孔隙结构而不产生气泡,将样品插入玻璃注射器(内径: 20mm)中,并从底部将浓硫酸溶液迅速引入孔隙结构中,以完全浸没样本。通过将浓硫酸溶液泵入和迸出注射器35s来制备具有均匀交联结构的表面微孔样品。取出样本,依次用去离子水、丙酮和无水乙醇清洗,放置于120℃通风干燥箱中4h,然后用高压釜在121℃和0.12Mpa下蒸汽灭菌60m,以去除表面残留的浓硫酸,用于后续测试。
需要说明的是,为了后续的实验,将PEEK样品分成两类并标记为P0.0(实心结构,即微孔间距为0mm)、P0.8(微孔间距为0.8mm);将浓硫酸蚀刻后的样本标记为SP0.0、SP0.8;将未磺化并涂层后的样本分别标记为CP0.0、CP0.8,将磺化并涂层后的样本分别标记为SCP0.0、SCP0.8。
聚多巴胺复合bFGF涂层制备,对照组和硫化组PEEK样本均在 37℃真空下干燥24h。取1g多巴胺粉末,采用10mM Tris/HCl(PH=8.5) 溶液调制成2mg/ml的盐酸多巴胺溶液500ml。将真空干燥后的对照组和硫化组PEEK样本浸泡在上述盐酸多巴胺溶液中,之后置于50rpm 摇床上,锡纸包裹遮光条件下反应12h,以消除介孔结构液体表面张力促使多巴胺和PEEK细丝充分接触。将PEEK样本和多巴胺溶液移至生物安全柜,黑暗静态条件下继续反应12h。弱碱性条件下多巴胺进行缓慢自聚合反应,沉积在PEEK细丝表面,形成聚多巴胺涂层。取出PEEK样本,无菌条件下超声清洗20min,之后用无菌三蒸水冲洗3 次,去除未粘附的多巴胺。37℃真空条件下干燥12h。精确称取100 μg bFGF冻干粉末,采用无菌PBS溶液配制成的质量浓度为0.5μ g/ml的bFGF溶液200ml。将PDA涂层的PEEK样本放置于上述浓度的bFGF溶液,室温下磁力搅拌5min,之后于4℃冰箱静置反应24h,以使PDA与bFGF充分螯合,实现牢固的化学结合。然后用无菌PBS溶液清洗PEEK样本3次,以去除未固定的bFGF生长因子,并在4℃的无菌环境中真空干燥。得到聚醚醚酮支架10,其结构如图2所示, 100表示聚醚醚酮支架上的一级微孔结构上孔,二级微孔结构未示出。容易理解的是,所述聚醚醚酮支架10所示意的结构可以视为,由多层十字网格层叠而成,当然,还可以是其他结构。
对上述制备得到的聚醚醚酮进行如下表征和测试,分组按照表1 进行:
表1
表面表征测试:
用场发射扫描电子显微镜SEM(FEI-F50,ZEISS,Germany)及能谱仪EDS观察不同样本表面微观形貌及元素分布,电子束直径为 0.8nm,工作室真空压力为4.45×10-4Pa。在表征微孔结构和涂层之前,所有样本均进行真空干燥并溅射薄层镀金。用原子力显微镜AFM(Dimension Edge,Bruker,USA)测试不同样本的微孔结构以及粗糙度的变化。室温下采用液滴成像分析系统和水接触角测试仪(JY-82B Kruss DSA,Germany)分析表面亲疏水性和接触角,选用去离子水,每组样本设置6个平行样,每个样品表面滴定3个不同位置,最后结果取平均值。通过压汞法MIP,采用高性能全自动压汞仪(AutoPore Iv 9510,Micromeritics Instrument Corporation,USA) 对多孔PEEK样本(0.8mm)进行微观孔隙结构特征进行表征。
采用点扫描方式对不同组PEEK样本进行EDS分析,采样深度大约为1μm,以检测某一位置微区元素。不同组PEEK支架样本的表面化学元素组成分布如图3所示。对照组P0.8样本主要包含C和O元素(图3中A),合计达到96.56±0.79%。磺化处理使SP0.8样本的 S元素含量由3.32±0.16%显著增加到9.5±1.11%(图3中B),说明当多孔PEEK支架浸没于浓硫酸中时,磺酸基团(-SO3H)被引入到 PEEK表面苯二酚片段的邻位。这将导致经过磺化处理的SP0.8的S 元素含量显著提高。Cl元素的出现说明多巴胺经过螯合作用成功到 CP0.8样本上(图3中C),这为bFGF的涂层制备提供了媒介。SCP0.8 样本的C元素显著升高和Cl元素显著下降也表明bFGF这种功能化生物大分子的成功引入(图3中D)。
如图4所示,图4显示了不同组PEEK支架的表面形态。对照组 PEEK支架P0.8呈现出相对光滑的表面形貌(图4中A),可以看出 0.4mm宽度的细丝(Filament)和0.8mm的一级多孔结构。35s磺化处理后,SP0.8样本宏观上看和P0.8样本没有太大差别,但是放大 20k倍后,可以发现表面出现平均尺寸为0.26±0.07μm的相对均匀的小微孔(图4中B)。宏观上看,CP0.8样本的表面出现少许褶皱,但是高倍图像下未出现微孔结构(图4中C),并且没有发现bFGF 大分子的存在。在SCP0.8组中,经磺化处理生成的二级微孔部分被 PDA覆盖,并且粘附有bFGF分子(图4中D)。上述结果说明,成功制备了二级微孔PEEK支架,并借由PDA的粘附作用完成bFGF涂层。
如图5所示,图5显示了AFM测试的不同组PEEK样本的表面形态以及粗糙度。相对于表面光滑的P0.8样本(图5中A),SP0.8样本则出现不规则的均一的多孔结构(图5中B),和SEM的图像一致。 SCP0.8样本因为有大分子物质bFGF覆盖在上面导致孔隙结构减少(图5中D)。相对于P0.8样本,其余所有三组样本表面粗糙度都有显著增加(图6)。其中SP0.8组样本的粗糙度值最大,达到36.67 ±1.45Ra。虽然基于PDA粘附辅助的bFGF涂层减小了磺化处理后样本的粗糙度,但是没有统计学差异。上述多孔结构的生成和粗糙度的变化为细胞和周围组织的有效附着提供了空间位点。
静态水接触角测试结果如图7所示。SP0.0 PEEK样本的水接触角相较于P0.0样本有小幅度升高,但是无统计学差异。CP0.0样本和SCP0.0样本相较于P0.0样本的接触角显著降低,并且SCP0.0组样本具有所有组中最小的接触角,其值为43.19±1.90°。这说明,基于PDA的bFGF涂层策略显著降低了PEEK样本的水接触角,从而改善PEEK表面吸附蛋白质和粘附细胞的能力。
不同组PEEK样本(0.8mm多孔样本)孔隙结构特征参数如图8 所示。SP0.8组、CP0.8组和SCP0.8组PEEK样本的平均孔隙直径没有统计学差异,但是都显著低于P0.8组样本。SP0.8组、CP0.8组和 SCP0.8组PEEK样本的孔隙率没有统计学差异,但是都显著高于P0.8组样本。SCP0.8组样本具有最低的渗透性,并且和其他组相比,显著降低。低的渗透性能够增加体液等流体物质在支架内部的滞留时间。磺化制备的微孔使P0.8组样本的特征长度相助降低,同时显著增加了样本的迂曲度。相较于P0.8组样本,磺化和涂层策略都显著增加了多孔支架的总比表面积,这为相关蛋白质和细胞的粘附提供了充足的空间。
蛋白吸附能力测试:
选用胎牛血清蛋白BSA作为模型蛋白,用以研究多孔PEEK结构以及表面改性对蛋白质的吸附能力。所有8种PEEK样本浸没于盛装 0.5ml BSA溶液(PH=7.35,0.5mg/ml)的12孔板中,放置于37℃60 rpm的摇床上进行90min。之后取出样本,通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit),采用酶标仪以波长562nm来测试剩余溶液的浓度,根据BSA溶液浓度与原来浓度的差值,以计算PEEK 对BSA蛋白吸附动力学性质。
不同组PEEK样本对BSA的吸附能力如图9所示。在BSA溶液中浸泡90min后,不论是多孔PEEK样本(0.8mm)还是实心PEEK样本 (0mm),磺化和涂层策略均能提高其对BSA的吸附能力,两种策略的结合能够实现蛋白吸附能力更多的提升。同时,多孔样本SCP0.8 的吸附量显著高于实心样本SCP0.0的吸附量(127.8±3.90vs. 67.42±9.33μg/ml)。增强的蛋白质吸附能力,为后续细胞粘附和软组织整合提供了潜能。
力学性能测试:
用万能材料试验机(20kN Allround table top,ZwickRoell, Germany)测定基础组、磺化组、涂层组和复合组PEEK样本的抗压强度。将样品垂直放置于两块平行夹具之间,通过20kN的测压元件以 1mm/min的加载速度进行,直至样品裂开失效。记录破裂时所受的最大压力值大小,样本N=6。
测量PEEK植入物与新的再生软组织之间的结合力。术后1W,实心PEEK样本组组内之间的分离力没有显著差异,这和0.8孔隙PEEK 样本组一样。SCP0.8的分离力显著高于SCP0.0样本(4.16±0.88N vs.15.50±6.19N,p<0.01)。随着植入时间增加到2W,0.8孔隙PEEK样本的分离力均显著高于对应的实心PEEK样本,除了作为对照的as-printed 3D打印的P样本。这说明,相对于实心表面,多孔结构具有较大的接触面积,测试晶格结构和新再生软组织之间的结合力时,结构锁定和界面结合同时起作用。同时,亚组分析结果显示,SCP0.8的分离力也显著高于P0.8样本(21.05±6.26vs.11.18± 3.27,p<0.01)。虽然SP0.8和CP0.8的平均分离力大小也高于P0.8,但是由于测量数据的偏差较大,这些结果见没有发现显著差异。
细胞学实验测试:
选择自然交配后15d(交配当日记为0d)的新西兰大白兔,购自广州市白云区龙归兴科动物养殖场。取出胎儿后用PBS清洗2遍,去除头、四肢、尾和内脏,获得胎兔皮肤,用眼科剪剪碎至组织呈流动状,0.25%胰酶,置于37℃培养箱内消化10分钟,之后加入含10%胎牛血清的500μl细胞培养液终止消化。用100μm细胞筛过滤细胞悬液,滤除未消化的组织块;用15ml离心管收集滤液,1000RPM离心3min,弃上清;1ml细胞培养液重悬沉淀,铺于10cm培养皿上,补加7ml培养液,摇匀,置于5%CO2、37℃培养箱内培养。依据成纤维细胞贴壁较快的特点,采用差速贴壁法纯化细胞。培养3-7h后,观察细胞贴壁生长状况,贴壁成纤维样细胞达到60%左右汇合度时即可换液,除去未贴壁的杂细胞;细胞生长至80%汇合度时进行传代或冻存。
将所有组PEEK样本在高压釜中于121℃灭菌60min,然后在PBS 中洗涤3次,并在培养基中浸泡12h。为了评价细胞在不同PEEK支架上的增殖,将上述胎兔皮肤成纤维细胞(REF)以2.0×109的密度接种到网格结构中。培养1、3、5、7天后,用细胞计数试剂盒CCK-8测量细胞数量。
将基础组、磺化组、涂层组和复合组PEEK样本置于12孔板中,然后以1×109细胞/孔的密度将REF接种到PEEK表面,将含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的高糖DMEM加入到孔中,并在37℃下置于含有5%CO2的培养箱中。3天后,吸取培养基,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞三次,并用2.5%戊二醛固定标本。进行细胞粘附成像。
为了验证bFGF促进软组织整合效能,在PubMed基因库里筛选和软组织生成相关的Type I collagen、Type III collagen、VEGF、 Fibronectin、Integrinβ、ICAM-1基因,并进行引物设计。以1 ×109细胞/孔的密度将REF接种到PEEK表面,培养5天后,以TRlzol 试剂提取RNA,RT-PCR进行测序,所有测序以GAPDH为内参基因,以 P组样本为对照组。
提取的原代胎兔皮肤成纤维细胞如图10所示。细胞呈梭形,胞体细长,边缘清晰。原代细胞数量充足,活力旺盛,可以用于后续细胞相关实验。
每组PEEK样本细胞的数量都随着培养时间显著增长,并且每一个测试时间点各组之间都有相同的分布规律。在第7天进行亚组分析的时候,SP0.0组和CP0.0组的细胞数量基本一样,但是显著高于P0.0 组的细胞数量。SCP0.0组的细胞数量显著高于其他三个实心组。对于所有4个0.8mm孔隙的PEEK样本组,SCP0.8组细胞数量最多,并且和其他三个组都有统计学差异。上述结果表明,磺化+涂层策略可以显著提高PEEK材料生物相容性,并且多孔样本比实心样本具有更强的促细胞增殖能力。
在不同组PEEK样本上培养REF 5d后,软组织生成相关的qRT-PCR 基因表达情况。所有测试以GAPDH为内参基因(house-keeping gene),每个亚组均已P样本为对照。在实心样本PEEK中,除了VEGF和 Fibronectin基因外,SCP0.0组Type III Collagen、Type ICollagen、 ICAM-1、Integrinβ基因的相对表达水平均较P0.0显著提高。在 0.8mm孔隙样本组中,SCP0.8组样本所有的目标基因的相对表达量均较P0.8组显著提高。
动物学实验与组织学特征检查实验:
通过动物植入实验进一步测试负载bFGF的多级微孔结构PEEK植入物与软组织的结合能力。12只新西兰大白兔(2.5kg),实验前1 周在干净的环境中喂养。在背部皮肤上做18mm的切口,将皮下组织和皮肤分开,形成一个囊腔。将制备好的PEEK样品放入囊腔并缝合。每只兔共移植8个标本。直到植入1W和2W后取出植入物。4%多聚甲醛固定48h,然后切成两部分用于进一步的扫描电镜和组织学表征。为了进行病理学观察,将构建体包埋在树脂中,并用硬组织切片机切成厚度约为30μm的薄片。切片用苏木精和伊红染色(HE),最后用倒置显微镜观察,以评估PEEK样品和软组织整合状态。其他样品用于进行分离实验。使用单列电子万能试验机测试标本和软组织分离需要的力的大小。将样本固定在测试机的下端,夹紧部分的上端夹紧软组织部分,然后进行分离测试程序,直到与样本结合的软组织被分离。记录载荷-位移曲线,并将失效载荷定义为结合力。每组样本N=5。
同时,我们成功将PEEK样本植入新西兰大白兔,培养1W和2W 后取材,进行了宏观表面分析、H&E染色、SEM扫描以及分离力测试。
图11所示为新西兰大白兔PEEK样本植入部位以及植入2W后样本宏观表面分析大体观。所有实验动物均成功存活至实验终止。2只动物现轻度感染,连续补注青霉素3天后,感染消失。所有样本皮侧粘连紧密,有软组织包裹,肌侧现白色膜装组织,较光滑。多孔组PEEK样本周围软组织增生和血管生成显著多余对应实心组。
不同组PEEK样本2W时间点组织H&E染色结果如图12所示。实心样本亚组中,对照组和硫化组PEEK样本和皮侧软组织界面现明显缝隙,涂层组缝隙减少,复合组缝隙基本消失。多孔组样本亚组中,对照组和硫化组PEEK样本的细丝和软组织界面未完全融合,涂层组缝隙减少,复合组缝隙基本消失。2W复合组实心PEEK样本皮侧分离下的软组织H&E染色结果显示,胶原纤维和结缔组织相对较少,结构松散,无新生血管生成。对应的多孔组样本,成纤维细胞数量多,胶原纤维和结缔组织丰富,结构紧密,并出现新生血管。
不同组PEEK样本SEM图像如图13所示。实心样本亚组中,2W 时,对照组样本皮侧PEEK材料和软组织界面紧密连接,无缝隙(图 13中A,上部三角),而肌侧PEEK材料和软组织界面未完全整合,呈现贴合和缝隙共存状态(图13中A,下部三角);复合组样本皮侧PEEK材料和软组织界面紧密连接,完全贴合,缝隙(图13中B,上部三角),而肌侧PEEK材料和软组织界面未完全整合,呈现贴合和缝隙共存状态(图13中B,下部三角)。多孔样本亚组分析中,对照组P0.8在1W时,PEEK支架细丝周围均有缝隙,未贴合(图13 中C,三角),而在2W时,仅有个别细丝周围存在缝隙(图13中C,三角);相应的复合组SCP0.8在1W时,无缝隙存在,软组织和PEEK 材料紧密结合,而在2W时,依然完全紧密结合。上述SEM结果直接显示,在2W时,多孔复合组样本的软组织结合情况显著优于实心复合组样本,表明所制备多级微孔结合bFGF涂层具有优良的生物相容性。
PEEK样本Micro-CT成像实验:
将不同组样本植入前和植入后2W进行高分辨率Micro-CT (SkyScan 1172,Bruker,USA)扫描分析,扫描电压为49kV,电流为100μA,曝光时间500ms。获取原始图像后,导入系统自带影像分析系统CTvox,进行三维重建和自动化测量,评估不同组PEEK样本支架的三维结构和软组织结合形态。
不同PEEK样本典型Micro-CT图像如图14所示。结果显示, Micro-CT技术能够获取亚毫米级PEEK结构,相对于切片染色和SEM,具有可以随意调整图层和角度优势。从不同截面可以发现PEEK细丝具有空洞存在(图14中B、图14中D,箭头),这可能会对力学性能造成一定影响。虽然不能细化分析磺化处理形成的二级微孔,但是发现的结构缺陷可以用于PEEK多孔结构设计和3D打印成型的反馈。 SCP0.8样本植入后2W的图像显示,PEEK细丝边缘清晰,软组织填充其中,PEEK和软组织界面无缝隙,紧密结合。上述结果表明,高分辨率CT可以用于PEEK显像,并能显示软组织长入PEEK样本孔隙结构中,此结果为硬组织不脱钙切片分析提供了另一个思路。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种聚醚醚酮支架的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
采用3D打印,加工出具有微孔结构的本体;所述本体的材质为聚醚醚酮;
将所述本体浸入多巴胺溶液中,形成包裹所述本体的聚多巴胺层;
将被聚多巴胺层包裹的本体浸入含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,得到所述聚醚醚酮支架;
所述采用3D打印,加工出具有微孔结构的本体的步骤之后还包括:
将所述本体在250℃热处理2h,然后在300℃热处理1.5h;
将所述本体置于玻璃注射器中,从所述玻璃注射器的底部注入浓硫酸,使所述本体浸入浓硫酸中,得到表面具有二级微孔结构的本体;所述浓硫酸的质量分数为95-98%。
2.根据权利要求1所述的聚醚醚酮支架的制备方法,其特征在于,所述将所述本体浸入多巴胺溶液中,形成包裹所述本体的聚多巴胺层的步骤,具体包括:
将多巴胺冻干粉末加入到盛有Tris-HCl缓冲溶液的反应容器中,得到多巴胺溶液;
将所述本体浸入所述多巴胺溶液中,并将所述反应容器置于摇床上,遮光反应8-12小时;
遮光反应后,将所述反应容器转移至黑暗环境中,在静置状态下反应10-12小时,形成包裹所述本体的聚多巴胺层。
3.根据权利要求1所述聚醚醚酮支架的制备方法,其特征在于,所述将被聚多巴胺层包裹的本体浸入含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,得到所述聚醚醚酮支架的步骤,具体包括:
将碱性成纤维细胞生长因子冻干粉末溶解在磷酸盐缓冲溶液中,得到含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液;
将被聚多巴胺层包裹的本体浸入所述含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,置于4℃冰箱静置反应18-24小时,得到所述聚醚醚酮支架。
4.根据权利要求3所述聚醚醚酮支架的制备方法,其特征在于,所述含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液中,碱性成纤维细胞生长因子的质量浓度为0.5-1.0μg/ml。
5.根据权利要求1所述聚醚醚酮支架的制备方法,其特征在于,所述采用3D打印,加工出具有微孔结构的本体的步骤,具体包括:
设计具有微孔结构的本体模型,并导出为STL格式文件;
将所述STL格式文件导入3D打印机,采用医用级聚醚醚酮材料,加工出具有微孔结构的本体。
6.一种采用权利要求1-5任一所述的制备方法制备得到的聚醚醚酮支架在制备植入物中的应用。
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