CN115887784A

CN115887784A - 一种表面改性复合多孔支架材料及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115887784A
Application number: CN202211734013.2A
Authority: CN
Inventors: 吴钊英; 赵蒙恩; 张超
Original assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Shenzhen Campus
Current assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Shenzhen Campus
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115887784B

Abstract

本发明公开了一种表面改性复合多孔支架材料及其制备方法与应用。本发明的表面改性复合多孔支架材料的制备方法包括以下步骤：步骤S1、获取多孔支架并进行磺化处理，得到磺化支架；步骤S2、将所述磺化支架置于多巴胺溶液或聚多巴胺溶液中处理，得到多巴胺涂覆支架或聚多巴胺涂覆支架；步骤S3、将所述多巴胺涂覆支架或聚多巴胺涂覆支架置于载药的锶掺杂生物玻璃微球分散液中进行改性处理，即得表面改性复合多孔支架材料；所述多孔支架为多孔聚醚醚酮支架或多孔聚醚酮酮支架。采用本发明方法制得的支架材料具有仿骨小梁结构，且能够促进颅骨缺损修复并降低促炎因子分泌，在医用材料技术领域具有很好的应用前景。

Description

一种表面改性复合多孔支架材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及材料技术领域，尤其是涉及一种表面改性复合多孔支架材料及其制备方法与应用。

背景技术

生物材料植入体内后，免疫细胞与材料表面相互作用，引发一系列炎症反应。在各种免疫细胞中，巨噬细胞可以释放一系列细胞因子和生长因子，在宿主免疫应答中发挥重要作用。巨噬细胞分为促炎性M1表型和抗炎M2表型。一般情况下，巨噬细胞在PEEK表面上持续存在促炎M1表型，导致巨噬细胞融合成多核巨细胞，并增加了纤维化增强细胞因子的释放，促进纤维包裹的形成。相反，短暂和适当的炎症反应(M1极化)，然后及时切换到M2表型，释放细胞因子和趋化因子来调节炎症，将有助于种植体的骨修复作用。

相关技术中，为了调节植入生物材料引起的炎症反应，通常在植入物表面修饰白介素-4(IL-4)细胞因子，促进巨噬细胞向M2表型极化；或将CD47蛋白(自身标记物)共价固定在材料表面，以保护植入物不被宿主免疫系统识别，虽然这在一定程度上降低了炎症反应，但这些方法存在工艺复杂、成本高、保质期短等缺点。

因此，需要寻求一种有效降低炎症反应，且具有修复骨缺损功能的复合材料。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种表面改性复合多孔支架材料及其制备方法与应用，该表面改性复合多孔支架材料不仅可以促进rBMSCs的黏附和增殖、上调rBMSCs的碱性磷酸酶活性和成骨相关基因的表达，还可以抑制表面巨噬细胞向M1型极化、降低促炎因子的分泌，并诱导巨噬细胞向M2型极化、上调抗炎因子的分泌。

本发明提出了一种表面改性复合多孔支架材料。

本发明提出了一种表面改性复合多孔支架材料在修复骨缺损的材料中的应用。

本发明提出了一种表面改性复合多孔支架材料在制备抗炎材料中的应用。

本发明的第一方面，提供了一种表面改性复合多孔支架材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1、获取多孔支架并进行磺化处理，得到磺化支架；

步骤S2、将所述磺化支架置于多巴胺溶液或聚多巴胺溶液中处理，得到多巴胺涂覆支架或聚多巴胺涂覆支架；

步骤S3、将所述多巴胺涂覆支架或聚多巴胺涂覆支架置于载药的锶掺杂生物玻璃微球分散液中进行改性处理，即得表面改性复合多孔支架材料；

所述多孔支架为多孔聚醚醚酮支架或多孔聚醚酮酮支架。

根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：

(1)本发明通过浓硫酸的磺化作用对多孔支架进行表面改性，构建三维多孔微纳米结构，然后再利用多巴胺或聚多巴胺的粘接性能以及载药的锶掺杂生物玻璃微球(A-SrBG)的改性处理，制备了A-SrBG涂层改性的多孔ADSP支架。该支架具有相互贯通的大孔结构和表面三维多孔结构，且亲水性和体外矿化能力显著提高。

(2)本发明的磺化处理步骤简单，不需要专门的容器和设备，成本节约，且采用本发明磺化处理得到的三维多孔结构磺化支架具有类骨小梁结构。

(3)在本发明中，A-SrBG涂层中的Sr²⁺除了具有良好的生物诱导活性外，还能够通过拮抗M1型巨噬细胞的促炎作用，发挥抗炎作用。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述多孔支架采用熔融沉积法制备得到。

在本发明的一些实施方式中，所述熔融沉积法制备的参数为：喷头温度400～500℃，热床温度120～180℃，腔体温度80～100℃，喷嘴直径350～450μm，线间距350～450μm，打印速率15～25mm/min。

优选地，所述熔融沉积法制备的参数为：喷头温度450℃，热床温度150℃，腔体温度90℃，喷嘴直径400μm，线间距400μm，打印速率20mm/s。

本发明熔融沉积法制得的多孔支架相对于传统粒子浸出法制得的多孔支架力学性能更好，且制备过程中不需要提前制造模具；其次，本发明熔融沉积法制得的多孔支架的外表和内部结构均可任意塑形，能够针对病人患者的个体差异，定制不同形状、不同孔隙率、不同孔型的骨修复支架，从而达到个性化治疗的目的。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述多孔支架的孔隙率为48～55％；

优选地，步骤S1中，所述多孔支架的孔隙率为52％；

在本发明的一些实施方式中，采用熔融沉积法制备得到多孔支架后，还需进行清洗；

优选地，所述清洗包括依次使用丙酮、乙醇和蒸馏水对多孔支架进行超声清洗；

优选地，所述清洗的时间为20～40min。

在本发明的一些实施方式中，所述磺化处理的具体方法为：将所述多孔支架置于浓硫酸中处理，清洗后再进行水热处理，干燥即可；

优选地，所述浓硫酸的质量分数为95～98％；

优选地，所述浓硫酸的质量分数为98％。

优选地，所述处理的时间为4～8min；

优选地，所述水热处理的温度为95～110℃；

优选地，所述水热处理的时间为3～5h；

优选地，所述干燥的温度为55～60℃。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述多巴胺溶液或聚多巴胺溶液的质量浓度为1～5mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述载药的锶掺杂生物玻璃微球分散液的质量浓度为8～12mg/mL；

优选地，所述载药的锶掺杂生物玻璃微球分散液的质量浓度为10mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述载药的锶掺杂生物玻璃微球的直径为150～250nm；

优选地，所述载药的锶掺杂生物玻璃微球的直径为180～220nm。

将载药的锶掺杂生物玻璃微球负载于复合材料表面，更有利于调控免疫细胞的功能、提高材料与骨组织的骨整合性。

本发明的第二方面，提供了一种表面改性复合多孔支架材料，由上述的制备方法制得。

根据本发明实施例的表面改性复合多孔支架材料，至少具有如下有益效果：

(1)本发明的表面改性复合多孔支架材料不仅能可以促进rBMSCs的黏附、增殖，上调rBMSCs的ALP活性和成骨相关基因的表达，还可以抑制表面巨噬细胞向M1型极化、降低促炎因子的分泌，并诱导巨噬细胞向M2型极化、上调抗炎因子的分泌。

(2)本发明的表面改性复合多孔支架材料既能够诱导巨噬细胞的分泌产物，还可以促进成骨细胞分化，此外，该支架材料可以通过MAPK和NF-κB信号通路抑制LPS激活的炎症反应。体内实验表明，表面改性复合多孔支架材料能够减轻周围组织的炎症反应，并具有明显促进颅骨缺损修复的功效。

本发明的第三方面，提供了一种上述表面改性复合多孔支架材料在修复骨缺损的材料中的应用。

根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：将本发明的表面改性复合多孔支架材料应用于修复骨缺损材料中，能够诱导类骨羟基磷灰石沉积在支架表面，可以促进支架与周围的骨组织产生化学键合作用，从而诱导新骨生成；此外，其还能够促进支架表面rBMSCs细胞的粘附、增殖和分化，进而促进种植体周围骨组织的生成。

本发明的第四方面，提供一种表面改性复合多孔支架材料在制备抗炎材料中的应用。

根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：采用本发明表面改性复合多孔支架材料制得的抗炎材料亲水性和体外矿化能力，不仅能够促进rBMSCs的黏附、增殖，上调rBMSCs的ALP活性和成骨相关基因的表达，还可以抑制表面巨噬细胞向M1型极化、降低促炎因子的分泌，并诱导巨噬细胞向M2型极化、上调抗炎因子的分泌；此外，还可以通过MAPK和NF-κB信号通路抑制LPS激活的炎症反应，是一种很有前景的免疫调节骨修复材料。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例PEEK、SP、DSP和ADSP支架的表面形貌图，其中(a)为35倍放大图，(b)为10000倍放大图；

图2为本发明实施例PEEK、SP、DSP和ADSP支架的EDS图谱；

图3为本发明实施例PEEK、SP、DSP和ADSP支架的FTIR(a)和XRD图谱(b)；

图4为本发明实施例PEEK、SP、DSP和ADSP支架的水接触角(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图5为本发明实施例PEEK、SP、DSP和ADSP支架在SBF溶液中浸泡7d后的SEM(a)和EDS图(b)；

图6为本发明实施例PEEK、SP、DSP和ADSP支架在SBF溶液中浸泡不同时间点的离子释放曲线；

图7为本发明实施例ADSP支架在PBS溶液中浸泡不同时间点的ALN释放曲线(*p<0.05)；

图8为本发明实施例rBMSCs在PEEK、SP、DSP和ADSP支架表面培养不同时间点的黏附和增殖情况；

图9为本发明实施例rBMSCs在PEEK、SP、DSP和ADSP支架表面培养5天的CLSM图(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图10为本发明实施例rBMSCs在PEEK、SP、DSP和ADSP支架表面培养不同时间点的ALP活性；

图11为本发明实施例rBMSCs在PEEK、SP、DSP和ADSP支架表面培养不同时间点的成骨相关基因的表达(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图12为本发明实施例支架表面培养3天的巨噬细胞表面标志物(CD86和CD206)的免疫荧光染色图；

图13为本发明实施例流式细胞术检测CD86和CD206阳性巨噬细胞的百分比图；

图14为本发明实施例支架表面培养3d和5d的RAW264巨噬细胞上清液的TNF-α和IL10水平检测结果；

图15为本发明实施例支架表面培养3d和5d的RAW264.7巨噬细胞的相对mRNA表达(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图16为本发明实施例支架RAW264.7巨噬细胞条件培养基与rBMSCs共培养14d后的ALP染色和茜素红染色，及ALP活性和定量统计图；

图17为本发明实施例支架RAW264.7巨噬细胞条件培养基与rBMSCs共培养14d后的成骨相关基因的表达(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图18为本发明实施例RAW264.7巨噬细胞在不同支架表面的蛋白表达情况；

图19为本发明实施例支架植入动物皮下14、28天后周围组织HE染色；

图20为本发明实施例支架植入动物皮下14、28天后纤维层厚度统计图(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图21为本发明实施例支架植入动物皮下14、28天后免疫荧光染色图；

图22为本发明实施例支架植入动物皮下14、28天后iNOS阳性百分率(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图23为本发明实施例支架植入动物皮下14、28天后CD206阳性百分率(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图24为本发明实施例支架植入后体内4、8和12w后骨缺损的μ-CT图像(a)及各组新生骨的BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N的定量分析统计图；

图25为本发明实施例支架植入8w和12w后，骨缺损的H&E染色和Masson染色图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

在本发明的具体实施方式中，主要使用试剂和材料及其购买来源如表1所示：

表1：主要试剂和材料

在本发明的具体实施方式中，主要仪器设备及其购买来源如表2所示：

表2：实验所用仪器设备

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明实施方式中，所述载药的掺锶生物玻璃微球(A-SrBG)的制备方法包括：

(1)采用溶胶-凝胶法合成锶掺杂生物玻璃微球(SrBG)，具体为：选取十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)作为制孔剂。将2g CTAC溶解在10mL去离子水中，该溶液作为溶液A；将3mL正硅酸乙酯(TEOS)溶解于15mL的无水乙醇中，该溶液作为溶液B；10mL去离子水，4.5mL氨水和15mL酒精混合作为溶液C；溶液A、B和C处于快速搅拌状态，维持该搅拌状态，将溶液B加入溶液C中，反应15分钟后，将溶液A加入上述溶液中；反应30分钟后加入0.25g硝酸锶(Sr(NO₃)₂)和0.28g四水硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)；继续反应2小时后，得到浑浊液。将上述浑浊液进行离心，转速为8000rpm；离心后得到白色粉末产物；再使用相同转速，分别使用无水乙醇清洗2次，去离子水清洗3次，得到白色粉末产物；将上述白色粉末产物在100℃烘箱过夜烘干；使用马弗炉对上述白色粉末产物进行烧结，温度条件为：升温速度为1℃/min，升至200℃，保温2h，再次升温至650℃，升温速度为1℃/min，保温时间为2小时，最后可得到锶掺杂生物玻璃微球(SrBG)，锶掺杂量为17％。

(2)将步骤(1)中制备的5g锶掺杂生物玻璃微球(SrBG)浸泡在100ml阿仑膦酸钠的饱和溶液中，搅拌24小时，去离子水洗涤、烘干，可得到载药的锶掺杂生物玻璃微球(A-SrBG)，载药量为4.7％，直径为200nm左右。

实施例1一种表面改性复合多孔支架材料的制备方法

本实施例提供了一种表面改性复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、采用熔融沉积法制备孔隙率为52％的多孔聚醚醚酮(PEEK)支架，其中打印使用的PEEK丝材直径为1.75mm，打印喷头温度为450℃，热床温度为150℃，腔体温度为90℃，喷嘴直径为400μm，线间距为400μm，打印速率为20mm/min。

步骤S2、依次用丙酮、无水乙醇和去离子水对上述多孔聚醚醚酮(PEEK)支架进行超声清洗，每次30min，然后将清洗好的多孔PEEK支架放置真空干燥箱内烘干；

步骤S3、将上述清洗、干燥后的多孔PEEK支架放入质量分数为98％的浓硫酸中，在500rpm转速下搅拌6min，取出，然后将浓硫酸处理过后的多孔PEEK支架浸没于去离子水中5min，自然晾干，再将其加入50mL去离子水中，在100℃条件下水热4h，用去离子水清洗3遍，自然晾干，得到磺化PEEK支架(记为SP支架)；

步骤S4、称取200mg聚多巴胺粉末，溶解在10mM的Tris-HCl缓冲液中(pH＝8.5)，配制终浓度为2mg/mL的聚多巴胺溶液，然后将磺化PEEK支架浸泡在聚多巴胺溶液中，在500rpm转速下搅拌1h，用去离子水清洗3遍，60℃下烘干，得到聚多巴胺涂覆的SPK支架(记为DSP支架)；

步骤S5、将上述制得的多巴胺涂覆的SPK支架浸泡于10mg/mL载药的掺锶生物玻璃微球(A-SrBG)混悬液中，在500rpm转速下搅拌24h，60℃下烘干，得A-SrBG改性的PEEK支架(记为ADSP支架)。

实施例2一种表面改性复合多孔支架材料的制备方法

步骤S3、将上述清洗、干燥后的多孔PEEK支架放入质量分数为98％的浓硫酸中，在500rpm转速下搅拌6min，取出，然后将浓硫酸处理过后的多孔PEEK支架浸没于去离子水中5min，自然晾干，再将其加入50mL去离子水中，在100℃条件下水热4h，用去离子水清洗3遍，自然晾干，得到磺化PEEK支架；

步骤S4、称取200mg多巴胺粉末，溶解在10mM的Tris-HCl缓冲液中(pH＝8.5)，配制终浓度为2mg/mL的多巴胺溶液，然后将磺化PEEK支架浸泡在多巴胺溶液中，在500rpm转速下搅拌1h，用去离子水清洗3遍，60℃下烘干，得到多巴胺涂覆的SPK支架；

步骤S5、将上述制得的多巴胺涂覆的SPK支架浸泡于A-SrBG混悬液中，在500rpm转速下搅拌24h，60℃下烘干，得A-SrBG改性的PEEK支架。

实施例3一种表面改性复合多孔支架材料的制备方法

步骤S1、采用熔融沉积法制备孔隙率为52％的多孔聚醚酮酮(PEKK)支架，其中打印使用的PEKK丝材直径为1.75mm，打印喷头温度为450℃，热床温度为150℃，腔体温度为90℃，喷嘴直径为400μm，线间距为400μm，打印速率为20mm/min。

步骤S2、依次用丙酮、无水乙醇和去离子水对上述多孔聚醚酮酮(PEKK)支架进行超声清洗，每次30min，然后将清洗好的多孔PEKK支架放置真空干燥箱内烘干；

步骤S3、将上述清洗、干燥后的多孔PEKK支架放入质量分数为98％的浓硫酸中，在500rpm转速下搅拌6min，取出，然后将浓硫酸处理过后的多孔PEKK支架浸没于去离子水中5min，自然晾干，再将其加入50mL去离子水中，在100℃条件下水热4h，用去离子水清洗3遍，自然晾干，得到磺化PEKK支架；

步骤S4、称取200mg聚多巴胺粉末，溶解在10mM的Tris-HCl缓冲液中(pH＝8.5)，配制终浓度为2mg/mL的聚多巴胺溶液，然后将磺化PEKK支架浸泡在聚多巴胺溶液中，在500rpm转速下搅拌1h，用去离子水清洗3遍，60℃下烘干，得到聚多巴胺涂覆的SPK支架；

步骤S5、将上述制得的聚多巴胺涂覆的SPK支架浸泡于A-SrBG混悬液中，在500rpm转速下搅拌24h，60℃下烘干，得A-SrBG改性的PEKK支架。

实施例4支架的表征

(一)场发射扫描电子显微镜和元素分析

分别对上述实施例1中的多孔聚醚醚酮支架(PEEK)、磺化后PEEK支架(SP)、聚多巴胺涂覆后SPK支架(DSP)和A-SrBG改性PEEK支架(ADSP)进行了场发射扫描电子显微镜和元素分析，其具体操作步骤如下：

用导电胶分别将PEEK、SP、DSP、ADSP粘贴在样品台上，在真空的条件下用场发射扫描电子显微镜观察不同样品的表面形貌并拍照；使用G500高分辨热场发射扫描电镜表征样品表面的元素分布。

支架的场发射扫描电子显微镜结果如图1所示，从图中可以看出，本发明实施例1制得的PEEK支架均匀分布着相互垂直的的方形孔道(大小约为400×400μm)，且表面光滑；SP支架表面具有均匀的海绵状三维结构；在聚多巴胺溶液中搅拌1h后，DSP支架表面的孔被聚多巴胺部分覆盖，但仍保留了三维多孔结构；在A-SrBG纳米颗粒中搅拌24h后，ADSP支架表面的孔中均匀分布着A-SrBG纳米颗粒，表明采用本发明的方法能够获得目标PEEK支架。

进一步地，其元素分析结果如图2所示，从图中可以看出C和O元素分布在所有支架表面，因为PEEK只存在C和O元素；S元素存在SP、DSP和ADSP支架中，因为硫酸磺化后，支架表面有磺酸根生成；而ADSP支架中有Si、Ca和Sr元素的存在，表明A-SrBG纳米颗粒成功地涂层在PEEK支架表面。

(二)傅里叶红外光谱和X射线衍射分析

采用傅里叶变换红外光谱仪在波长为4000-400cm^-1的范围内分别分析PEEK、SP、DSP、ADSP材料的组成；并使用X射线衍射仪(40kV和40mA)在10～80°范围内分析其晶体结构。

不同支架的FTIR光谱如图3中的a所示，在四种支架中，都出现了1644cm^-1、1486cm^-1和924cm^-1的C＝O的伸缩振动峰；其中，对于磺化的SP支架，在1009cm^-1处出现了O＝S＝O的对称伸缩振动峰；而对于ADSP支架，出现了1099cm^-1处的Si-O-Si不对称伸缩振动峰，是生物活性玻璃的特征峰。

不同支架的XRD图谱如图3中的b所示，PEEK支架在20.7°、22.8°和28.8°出现了PEEK的特征峰，表明PEEK支架为半结晶的高分子结构，而涂层改性后的支架(ADSP)在47.6°和54.4°处出现了生物活性玻璃的特征衍射峰。

(三)水接触角测量

将PEEK、SP、DSP、ADSP支架放置在试样台上，采用接触角测量仪测量不同样品的水接触角(悬滴法)，用计算机自带系统调节液体的体积和滴液的速率，并采用动态连续跟踪测量模式观察并拍照，然后利用DSA1A软件对采集的图像进行处理，并测量不同支架的水接触角。

测量结果如图4所示，其中本发明的PEEK的水接触角为79.6°；与PEEK相比，硫酸磺化后支架(SP支架)和聚多巴胺涂覆后支架(DSP支架)的水接触角明显降低，分别为58.2°和61.3°；而生物活性玻璃涂层后的ADSP支架的水接触角明显下降，为40.5°，以上结果表明A-SrBG的引入提高了材料表面的亲水性，有利于细胞的黏附和增殖。

实施例5体外矿化和离子/药物释放检测

(一)体外矿化检测

将实施例1制得的PEEK、SP、DSP和ADSP支架浸泡到SBF溶液中，7天后用SEM观察支架表面的磷灰石生成情况，用EDS检测支架表面的元素组成，并用ICP-OES检测溶液中的离子浓度。

7天后支架表面SEM观察结果如图5中的a所示，其中PEEK和SP表面相对光滑，与浸泡前(图1)相比几乎没有变化；而DSP和ADSP表面被球状沉积物完全覆盖。

EDS检测结果如图5中的b所示，PEEK表面只有C、O元素，SP表面只有C、O、S元素，而DSP和ADSP表面都出现了新的Ca、P元素，综上表明DSP和ADSP表面沉积的物质可能是磷灰石。

(二)离子/药物释放检测

为了研究PEEK、SP、DSP和ADSP支架的在SBF溶液中离子释放过程，分别将实施例1的四种支架浸泡在SBF溶液14天，并检测其Ca²⁺、SiO₃ ^2-和Sr²⁺变化的过程。

检测结果如图6，从图中可以看出，对于PEEK和SP支架，溶液中三种离子没有显著变化；对于DSP支架，溶液中SiO3^2-和Sr²⁺没有显著变化，但Ca²⁺浓度持续下降；而对于ADSP支架，溶液中Ca²⁺浓度先上升后持续下降，是由于表面生成磷灰石的缘故，而SiO₃ ^2-和Sr²⁺持续上升，是因为支架表面涂层的A-SrBG的降解。

进一步地，对ADSP支架的释药情况进行检测，具体方法为：将PEEK、SP、DSP和ADSP支架浸泡在2mL PBS缓冲溶液中，在预先设定的时间点，取出200μL的PBS溶液，在NaOH溶液中与邻苯二醛(OPA)混合，然后加入2ME(巯基乙醇)溶液形成OPA-阿仑膦酸配合物。简单地说，将10.0mg的OPA溶于2.0mL的0.05M NaOH中，制得衍生化试剂的工作溶液，在此溶液中加入50μL的2ME，用0.05M NaOH将溶液定容到10.0mL。每瓶2.0mL释放液中加入100μL OPA/2ME试剂和1.7mL 0.05M NaOH，室温孵育10min，在FS5荧光光谱仪上，测量溶液在360～600nm波长下的发射强度，激发波长为360nm(λmax＝470nm)。通过在470nm处浓度与发射强度的关系图建立校准曲线，计算出累积释放阿仑膦酸钠(ALN)的量。

以上结果表明聚多巴胺涂层对Ca²⁺有很强的吸附力，可以在材料的表面富集大量Ca²⁺，使Ca²⁺的浓度达到一种饱和的状态，为类磷灰石的形成提供位点，从而在表面诱导HA的生成，其次，聚多巴胺涂层可作为中间层固定有机/无机分子，提高材料的生物学性能，引导材料表面矿化物沉积。此外，ADSP支架释药情况检测结果表明，其能够缓慢释放ALN。

实施例6支架对骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的影响

(一)对细胞粘附的影响

为了研究PEEK、SP、DSP和ADSP支架对rBMSCs黏附的影响，本实施例通过将2×10⁵rBMSCs接种在实施例1的支架表面，在37.0℃、5％ CO₂条件下，用DMEM/F12完全培养基培养2、6、12h后，去除完全培养基，用PBS清洗3遍，洗掉未粘附在支架表面的rBMSCs，用CCK8试剂盒测定粘附在支架表面的rBMSCs的吸光度。将rBMSCs接种在支架表面24小时后，去除完全培养基，用PBS清洗3遍，用4％多聚甲醛固定30min，用TRITC-conjugated Phalloidin和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，将样品置于激光共聚焦扫描显微镜下观察并拍照。

其吸光度检测结果如图8中的a所示，结果显示培养3h时，所有支架表面细胞的黏附情况没有明显差异；培养6和12h时，SP和DSP表面的细胞的吸光度明显高于PEEK，ADSP表面的贴壁细胞的吸光度最高，说明本发明制得的ADSP支架更利于细胞的黏附。

(二)对细胞增殖的影响

对细胞在支架表面的增殖情况进行检测，rBMSCs在PEEK、SP、DSP和ADSP支架表面培养1、3、5天后，不同支架表面细胞的增殖率如图8中的b所示，结果显示随着培养时间的延长，各支架表面细胞的增值率均逐渐提高。在1、3、5天时，SP和DSP支架表面细胞的增值率均明显高于PEEK支架，且ADSP支架表面细胞的增值率最高。因此，与PEEK相比，SP、DSP和ADSP支架均可以促进支架表面细胞的增殖，且ADSP的促进作用最明显。

(三)对细胞形态的影响

细胞的形态可以直观反应出细胞的状态，继而反映出材料对于细胞的影响。将细胞接种在支架表面培养5天后，用Confocal观察细胞的形态，结果如图9所示。四种支架表面培养的rBMSCs都呈现梭形，PEEK表面黏附的细胞数量较少，形态没有完全铺展。与PEEK相比，SP和DSP支架表面的细胞形态更好，数量增多。而ADSP支架表面的黏附的细胞数量最多，细胞铺展状态最好，面积最大。

以上结果表明，涂层改性后的PEEK表面有更大的诱导细胞生长的能力，可促进细胞的粘附和增殖。

(四)对细胞活性及相关基因表达的影响

ALP活性通常作为成骨性能高低的参考的重要标志，将rBMSCs细胞分别接种在四种支架表面，用成骨诱导液培养，检测ALP活性的变化。

ALP活性的检测结果如图10所示，结果显示用成骨诱导液培养7天后，四种支架表面细胞ALP活性无明显差异，而第10和14天时，与PEEK支架相比，SP和DSP显著上调了ALP活性，且ADSP支架表面细胞的ALP活性最高。结果表明，SP、DSP和ADSP支架均能促进ALP的表达，从而促进rBMSCs的分化，且ADSP支架效果最佳。

进一步地，为了研究PEEK、SP、DSP和ADSP支架对rBMSCs成骨相关基因表达的影响，将细胞接种在支架表面，用成骨诱导液培养7、10、14天后，检测细胞ALP、RUNX2、OCN和COL I的表达，结果如图11所示。

结果显示与PEEK支架相比，第10、14天时，SP、DSP和ADSP支架表面的rBMSCs的ALP、RUNX2基因的表达明显上调，且ADSP支架的上调的效果最为明显，其中，在10天时，只有ADSP支架上调了OCN基因的表达；在14天时，SP、DSP、ADSP支架均上调了OCN基因的表达，且ADSP支架的上调的效果最为明显。7、10天时，四种支架对于COL I基因表达的影响均无显著性差异；在14天，ADSP支架上上调了COL I基因表达，且与PEEK、SP和DSP支架相比有显著性差异。

综上结果表明，SP、DSP和ADSP支架对rBMSCs的成骨相关基因的表达有一定的促进作用，且ADSP支架的促进作用最为明显。

实施例7支架对RAW264.7巨噬细胞的影响

(一)支架对RAW264.7巨噬细胞极化的影响

为了研究PEEK、SP、DSP和ADSP支架对RAW264.7巨噬细胞极化的影响，将细胞接种在实施例1的支架表面，培养3天后，用免疫荧光染色检测细胞M1标记物(CD86，红色)和M2标记物(CD206，绿色)的表达。

结果如图12所示，显示SP、DSP和ADSP支架表面的CD206阳性表达高于PEEK支架，且ADSP支架表面巨噬细胞的表达最高；然而CD86表达表现出相反的趋势，PEEK支架表面巨噬细胞CD86表达最高，ADSP支架表面巨噬细胞的表达最低。

为了进一步确定M1/M2巨噬细胞的百分比，用流式细胞术同时分析了不同支架表面巨噬细胞标记物CD86和CD206的表达，结果如图13所示，显示PEEK、SP、DSP支架表面CD86阳性细胞的比例分别为90.3％、47.8％、7.88％，几乎没有CD206阳性细胞生成。因此，与PEEK支架相比，SP和DSP支架表面M1型极化的巨噬细胞较少，表明SP和DSP支架可以抑制巨噬细胞向M1型极化。而ADSP支架表面出现了CD206阳性细胞，比例为44.9％，表明ADSP支架可以促进巨噬细胞向M2型极化。

(二)支架对RAW264.7巨噬细胞验证相关因子的影响

为了研究PEEK、SP、DSP和ADSP支架对RAW264.7巨噬细胞验证相关因子的分泌，将细胞接种在支架表面，培养3天后，用ELISA试剂盒检测培养液中促炎因子(TNF-α)和抗炎子(IL 10)的分泌。

检测结果如图14所示，培养1天时，四种支架对TNF-α的释放无明显影响；培养3和5天时，SP、DSP和ADSP支架显著抑制了TNF-α的分泌，且ADSP抑制的程度最为明显。而对于IL10，培养1天时，四种支架对IL 10的释放也无明显影响；培养3和5天时SP、DSP和ADSP支架显著促进了IL 10的分泌，且ADSP促进的效果最为明显。

进一步地，将RAW264.7巨噬细胞接种在支架表面，培养1、3和5天后，用qPCR检测细胞抗炎相关基因(TNF-α、IL6和iNOS)和促炎相关基因(IL-10、CD206和Arg-1)的表达。

检测结果如图15所示，结果显示与ADSP支架表面的巨噬细胞相比，在第3和5天，PEEK、SP、DSP支架表面的巨噬细胞的TNF-α、IL6和iNOS基因的表达更高，且PEEK支架表面细胞的表达水平最高。与之相反，由于A-SrBG涂层的存在，ADSP支架表面巨噬细胞的IL-10、CD206和Arg-1的表达最高；SP、DSP支架表面巨噬细胞的表达高于PEEK支架。这可能只是因为SP、DSP支架表面三维多孔和PDA涂层的影响，但这种影响比A-SrBG涂层作用要弱。

以上结果表明：①与PEEK支架相比，SP支架表面的分级微纳米结构有助于抑制其表面的巨噬细胞向M1型极化，下调巨噬细胞促炎因子的表达，并抑制TNF-α的分泌；②ADSP支架释放的功能性离子能抑制巨噬细胞向M1型极化、下调促炎因子的表达，并促进巨噬细胞向M2型极化、上调抗炎因子的表达。

(三)支架对rBMSCs成骨分化的影响

为了进一步验证支架表面RAW 264.7巨噬细胞分泌的产物/因子对rBMSCs成骨分化的影响，将RAW 264.7细胞接种在支架表面，培养3天后，收集上清液培养rBMSCs细胞14天，观察ALP染色结果。

ALP染色和ALP活性测定结果如图16所示，结果显示，Pure-ADSP组可以显著促进ALP的表达，PEEK+RAW可以显著抑制ALP的表达与PEEK+RAW、SP+RAW和DSP+RAW7组相比，ADSP+RAW显著提高了ALP的表达。茜素红染色和定量结果(图16的c和d)表明，与Pure-PEEK、Pure-SP、Pure-DSP相比，Pure-ADSP组有更多的矿化结节形成，而PEEK+RAW组可以显著地抑制矿化结节的形成，与PEEK+RAW组相比，SP+RAW和DSP+RAW组可以促进矿化结节的形成，但没有显著性差异，而ADSP+RAW显著促进了矿化结节的形成。结果表明，PEEK支架调控的RAW264.7巨噬细胞条件培养基中RAW264.7巨噬细胞的分泌产物可以抑制rBMSCs的成骨分化；而ADSP支架调控的RAW264.7巨噬细胞条件培养基中RAW264.7巨噬细胞的分泌产物可以促进rBMSCs的成骨分化。

进一步地，将支架表面RAW264.7巨噬细胞条件培养基与rBMSCs共培养14天后，检测成骨相关基因(ALP、RUNX2、OCN、COL1)的表达结果。

检测结果如图17所示，结果显示Pure-ADSP支架可以显著上调rBMSCs的ALP和RUNX2基因的表达，PEEK+RAW、SP+RAW和DSP+RAW可以抑制rBMSCs的ALP、RUNX2和OCN基因的表达。相对于PEEK+RAW，ADSP+RAW可以显著上调ALP、RUNX2和OCN基因的表达，而所有组对COL I表达的影响没有显著性差异。表明ADSP表面的巨噬细胞的分泌物有利于rBMSCs成骨相关基因的表达，更能促进rBMSCs的成骨分化，因此，ADSP支架可以诱导免疫微环境促进成骨分化。

(四)支架对RAW 264.7巨噬细胞MAPK和NF-kB信号通路的影响

脂多糖(LPS)通过激活MAPK和NF-kB信号通路诱导RAW264.7的促炎反应。为了验证支架对对LPS诱导的MAPK和NF-kB信号通路影响，在LPS的刺激下，检测了不同支架表面RAW264.7巨噬细胞的p-p65、p65、p-pERK1/2、pERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38和GAPDH蛋白的表达。

检测结果如图18所示，结果显示与对照组组相比，在LPS刺激后，磷酸化的ERK、JNK、P38、和P65的表达都有明显升高。PEEK支架并未降低LPS诱导的磷酸化蛋白的表达，而SP、DSP和ADSP支架可以抑制磷酸化ERK、JNK、P38、和P65的表达，其中ADSP支架的抑制效果更为明显，可能是ADSP支架释放的Si、Ca、Sr离子的作用。以上结果表明：ADSP支架可以抑制MAPK和NF-kB信号通路的激活。

实施例8体内实验

(一)支架在体内的免疫反应检测

为了研究本发明制得的支架在体内的免疫反应，将其植入大鼠背部14和28天后，对材料周围皮下组织进行H&E染色和免疫荧光染色，来分别评价材料周围组织纤维层厚度和巨噬细胞极化。

H&E染色组织切片和纤维层厚度结果如图19和图20所示，其显示了支架周围的纤维层厚度随着时间的延长而减小，在植入14和28天时，与PEEK支架相比，SP、DSP和ADSP支架周围的纤维层厚度明显降低，且ADSP支架周围的纤维层厚度最薄。同样地，免疫荧光染色结果和iNOS、CD206表达统计(图21～23所示)表明，与PEEK支架相比，SP、DSP和ADSP支架降低了植入物周围巨噬细胞iNOS的表达，增加了巨噬细胞CD206的表达，且ADSP支架的效果最为明显，说明ADSP支架可在体内诱导巨噬细胞从M1型向M2型极化。

(二)支架的骨修复作用效果检测

为了评价支架的骨修复作用，将支架植入SD大鼠颅骨缺损中4、8和12周后观察骨缺损部位情况，其具体包括以下方法：

步骤S1、构建颅骨缺损模型：选取18只SD大鼠构建颅骨缺损模型，将灭菌后的PEEK、SP、DSPA、DSP种植体

植入颅骨缺损中，术后4w、8w、12w取样；

步骤S2、微计算机断层扫描：使用Skyscan 1176-CT扫描仪对已固定好的样品进行扫描，在55kV、145μA的电压下，以12μm的分辨率获取每个样本的图像。三维重建后，测定缺损区的骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数(Tb.N)，并利用CT软件分析和量化新骨形成；

步骤S3、组化分析：将样品本经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，进行H&E和Masson染色；

步骤S4、统计分析：数据组间差异统计采用Origin 9.0(OriginLab Corporation,USA)，所有数据均用平均值±标准差(Mean±STD)表示。使用单因素方差分析(One wayANOVA)和事后检验功能进行统计比较。p<0.05(*)、p<0.01(**)和p<0.001(***)为具有显著性差异。

支架植入SD大鼠颅骨缺损中4、8和12周后骨缺损部位的μ-CT图像如图24中的a所示，各组新生骨的BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N的定量分析如图24中的b所示。结果表明，植入4周时，PEEK和SP支架中几乎无新生骨生成，DSP支架中有少量的新生骨生成，而ADSP支架中新生骨的生成最多；植入8周时，PEEK、SP、DSP和ADSP支架中新生骨生成都增多，ADSP支架中新生骨的生成最多；植入12周时，PEEK和SP支架中新生骨生成无明显变化，DSP和ADSP支架中新生骨明显增多，且ADSP支架中的新生骨最多。μ-CT量化结果表明，ADSP支架中的新生骨的BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N最高；且植入颅骨缺损部位12周后，其新生骨量和骨体积分别是PEEK支架的2.3倍和1.9倍，明显促进颅骨缺损修复。

进一步的，在支架植入第8和第12周时，对骨缺损部位进行H&E染色和Masson染色，结果如图25所示，染色结果显示在支架植入第8周时，PEEK、SP和DSP支架中只有极少量的新生骨组织，ADSP支架中有少量新生骨组织；植入12周时，PEEK支架中新生骨组织无明显变化，SP、DSP和ADSP支架中新生骨组织均明显增加，且ADSP支架中出现大量的新生骨组织，表明ADSP支架具有最优异地促进骨修复性能。

以上结果表明：A-SrBG涂层多孔PEEK支架(ADSP支架)可以显著降低PEEK支架的体内免疫反应，促进骨再生，是一种很有前景的免疫调节骨修复材料。

综上所述，本发明通过浓硫酸的磺化作用对多孔支架进行表面改性，构建三维多孔微纳米结构，然后再利用聚多巴胺或多巴胺的粘接性能，制备了A-SrBG涂层改性的多孔ADSP支架，该支架具有相互贯通的大孔结构和表面三维多孔结构，且亲水性和体外矿化能力显著提高。

进一步地，对本发明制得的表面改性复合多孔支架材料进行性能测试，结果表明：

(1)本发明的表面改性复合多孔支架材料不仅能促进rBMSCs的黏附、增殖，上调rBMSCs的ALP活性和成骨相关基因的表达；还可以抑制表面巨噬细胞向M1型极化、降低促炎因子的分泌，并诱导巨噬细胞向M2型极化、上调抗炎因子的分泌。

(2)本发明的表面改性复合多孔支架材料诱导巨噬细胞的分泌产物可以促进成骨细胞分化，此外，本发明的支架材料可以通过MAPK和NF-κB信号通路抑制LPS激活的炎症反应。

(3)体内实验表明，本发明的表面改性复合多孔支架材料具有较好的抗炎作用，并可以明显促进颅骨缺损修复。

由此可见，本发明的表面改性复合多孔支架材料可以调节骨免疫微环境，促进骨修复，是一种很有前景的免疫调节骨修复材料。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种表面改性复合多孔支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1、获取多孔支架并进行磺化处理，得到磺化支架；

所述多孔支架为多孔聚醚醚酮支架或多孔聚醚酮酮支架。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述多孔支架采用熔融沉积法制备得到。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述熔融沉积法制备的参数为：喷头温度400～500℃，热床温度120～180℃，腔体温度80～100℃，喷嘴直径350～450μm，线间距350～450μm，打印速率15～25mm/min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磺化处理的具体方法为：将所述多孔支架置于浓硫酸中处理，清洗后再进行水热处理，干燥即可。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述水热处理的温度为95～110℃；

优选地，所述水热处理的时间为3～5h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述多巴胺溶液或聚多巴胺溶液的质量浓度为1～5mg/mL。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述载药的锶掺杂生物玻璃微球分散液的质量浓度为8～12mg/mL；

优选地，所述载药的锶掺杂生物玻璃微球的直径为150～250nm。

8.一种表面改性复合多孔支架材料，由权利要求1～7任一项所述的制备方法制得。

9.权利要求8所述的表面改性复合多孔支架材料在修复骨缺损的材料中的应用。

10.权利要求8所述的表面改性复合多孔支架材料在制备抗炎材料中的应用。