KR102173456B1

KR102173456B1 - 항균성을 갖는 티타늄 임플란트 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102173456B1
Application number: KR1020200021688A
Authority: KR
Inventors: 김훈; 강인규
Original assignee: 주식회사 제일메디칼코퍼레이션; 강인규
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2020-11-03
Also published as: WO2021167219A1

Abstract

본 발명은 키토산을 이용한 항균성을 갖는 티타늄 임플란트에 관한 것이다. 이에 의하면 티타늄 임플란트는 뼈 조직에 식립된 후 임플란트에서 용출되는 금속이온이나, 임플란트와 뼈 사이 계면으로 침투하여 서식하는 세균에 의해 유발된 염증을 최소화 또는 방지할 수 있다. 또한, 식립된 후 치료 또는 교정이 지속될 때까지 보유한 항균 등의 염증 억제 성능을 지속적으로 유지시킬 수 있어서 임플란트의 치료 성공율을 향상시킬 수 있으므로 치과, 정형외과 등 임상에 널리 사용될 수 있다.

Description

항균성을 갖는 티타늄 임플란트 및 이의 제조방법{Titanium implant having antimicrobial properties and method for manufacturing thereof}

본 발명은 티타늄 임플란트에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트에 관한 것이다.

일반적으로 의료용으로 사용되는 생체 임플란트는 척추 고정 보형재, 종간 보정 보형재, 인공관절 등을 영구적으로 이식시키기 위해 사용하는 것으로서, 인간의 생체조직에 대하여 매우 안정적인 생체 친화적인 재료를 사용하여야 한다. 또한, 부작용이나 기타 화학, 생화학적 반응성이 없어야 하고, 반복적인 하중 및 순간적인 압력의 부과에도 변형 및 파괴되지 않도록 기계적 강도가 매우 높아야 하며, 생체조직 특히, 뼈 조직과의 결합력이 매우 높아야 하는 의료용 기구이다.

이러한 임플란트는 뼈 조직에 식립된 후 영구적으로 기능을 발휘하도록 하거나 또는 목적하는 기능을 수행하는 기간 동안만 식립된 후 뼈 조직에서 제거되며, 식립된 동안 뼈 조직과의 결합력을 높이기 위해서 임플란트 표면에 여러 가공을 수행하는 것이 일반적이다. 이러한 가공의 예로서 뼈 조직과의 비표면적을 높이기 위한 거칠기 가공이나, 뼈 조직과 유사한 성분, 예를 들어 수산화아파타이트와 같은 성분을 임플란트 표면에 코팅하는 가공이 그것이다.

그러나 이러한 골조직과의 결합력이 높도록 임플란트 표면을 가공한 경우에도 임플란트가 식립된 후 주변 조직에서 발생하는 염증 등의 부작용에 대한 해결은 현재까지 미흡한 실정에 있다. 특히 치아 교정용 마이크로 임플란트와 같이 식립된 후 교정을 위해서 임플란트를 지지대로 교정용 철선을 당기는 등의 교정력을 발생시키는 행위는 임플란트와 치조골이나 주변 조직 간 틈을 형성시키고, 이러한 틈으로 세균 등의 염증 유발 원인이 침투하여 염증을 발생시키고, 이로 인해 임플란트 식립 시술의 실패를 야기할 수 있다.

또한, 임플란트 재질은 일반적으로 티타늄과 같은 생체 친화적인 재료로 구현하여 생체 내 부작용을 최소화하는데, 상용화된 티타늄 임플란트의 경우에 티타늄 이외에 어떤 목적에 의해 의도적으로 또는 의도치 않게 제조과정 상의 불순물로 미량의 다른 원소를 포함하며, 이러한 다른 원소로 인해 염증과 같은 부작용이 야기되는 경우가 있다. 구체적으로 임플란트의 일예로 치아교정용 마이크로 임플란트는 바나듐(V⁺⁺)을 미량 함유하는데, 식립 후 임플란트로부터 바나듐 이온이 방출되어 조직염증을 유발시키며, 이러한 조직염증은 임플란트와 식립된 골 및/또는 잇몸 사이 틈을 생성시키고, 틈을 더욱 이격되게 함으로써 추가적인 세균 침투에 의한 염증을 유발시키는 원인이 될 수 있다.

공개특허공보 제10-2014-0146512호

본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 티타늄 임플란트에 항균력을 부여하여 생체 내 조직, 예를 들어 치골조직에 식립 후 임플란트에서 용출되는 금속이온이나 세균에 의한 염증 반응을 최소화할 수 있는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트 및 이의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.

또한, 티타늄 임플란트에 부여된 항균력을 치료 또는 교정 기간 동안 지속시켜 치료성공률을 향상시킬 수 있는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트 및 이의 제조방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 티타늄 임플란트 표면 상에 화학결합을 통해 고정된 키토산을 포함하는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 티타늄 임플란트와 키토산 사이에는 상기 티타늄 임플란트 및 상기 키토산 각각과 공유결합을 형성하는 스페이서를 더 구비할 수 있다.

또한, 상기 티타늄 임플란트는 아민기를 구비하도록 표면이 개질된 것이며, 상기 티타늄 임플란트의 아민기와 키토산의 아민기 각각과 아마이드 결합을 형성하도록 상기 스페이서는 적어도 2개의 카르복시기를 갖는 화합물일 수 있다.

또한, 상기 스페이서는 폴리아크릴산, 술시닉산, 글루탐산 및 아스팔틱산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 이때, 보다 바람직하게는 상기 스페이서는 술시닉산일 수 있다.

또한, 상기 키토산은 75 ~ 85% 탈아세틸화 된 것으로 점도가 20-800 cP인 것을 수 있다. 또한, 상기 키토산은 1% 초산 수용액 또는 pH 6.5 이하의 수용액에 용해되는 것일 수 있다.

또한, 상기 키토산은 상기 티타늄 임플란트 표면적의 30% 이상을 덮도록 구비될 수 있다.

또한, 상기 티타늄 임플란트 표면은 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 화합물을 통해 개질 된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 표면에 아민기를 구비한 티타늄 임플란트를 제조하는 단계, (2) 적어도 2개의 카르복시기를 갖는 스페이서를 구비한 제1용액을 상기 티타늄 임플란트 표면에 처리하여 상기 카르복시기와 임플란트의 아민기 간 화학결합을 유도하는 단계, 및 (3) 키토산을 포함하는 제2용액을 처리하여 키토산의 아민기와 상기 스페이서의 비반응된 카르복시기 간 화학결합을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 티타늄 임플란트 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 티타늄 임플란트는 뼈 조직에 식립된 후 임플란트에서 용출되는 금속이온이나, 임플란트와 뼈 사이 계면으로 침투하여 서식하는 세균에 의해 유발된 염증을 최소화 또는 방지할 수 있다. 또한, 식립된 후 치료 또는 교정이 지속될 때까지 보유한 항균 등의 염증 억제 성능을 지속적으로 유지시킬 수 있어서 임플란트의 치료 성공율을 향상시킬 수 있으므로 치과, 정형외과 등 임상에 널리 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 티타늄 임플란트를 제조하는 공정에 대한 모식도이다.
도 2는 미처리된 티타늄 임플란트 (Ti), APTES 처리된 티타늄 임플란트(Ti-A), 아크릴산에 의해 키토산이 도입된 티타늄 임플란트 (Ti-AA-Ch) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 숙신산을 통해 키토산이 결합된 티타늄 임플란트 (Ti-SA-Ch)에 대해서 수행한 XPS 분석 스펙트럼이다.
도 3은 티타늄 임플란트의 표면 개질 공정에 따른 물 접촉각의 변화를 나타낸 사진이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 서로 다른 실시예에 의한 숙신산을 통해 키토산이 결합된 티타늄 임플란트(도 4, Ti-SA-Ch)와 폴리아크릴산을 통해 키토산이 결합된 티타늄 임플란트 (도 5, Ti-AA-Ch)에 FITC 형광물질을 결합시켜 얻은 이미지 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 키토산이 결합된 티타늄 임플란트(TI-SA-Ch)와 미처리된 티타늄 임플란트(TI)에 대해서 수행한 조골세포의 부착성을 평가한 뒤 촬영한 FE-SEM 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트와, 미처리된 티타늄 임플란트에 대해서 1일, 3일 동안 배양된 조골세포에 대해서 Live/dead staining 염색 평가를 수행한 결과에 대한 사진이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트와 미처리된 티타늄 임플란트 각각에 대해서 E.coli를 배양한 결과에 대한 사진이다.
도 10 및 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트와, 미처리된 티타늄 임플란트 각각에 대해서 S. mutans를 접종 및 배양 뒤 크리스탈 바이올렛 염색시킨 결과에 대한 사진이다.
도 12 및 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트와, 미처리된 티타늄 임플란트 각각에 대해서 S. sobrinus를 접종 및 배양 뒤 크리스탈 바이올렛 염색시킨 결과에 대한 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트와, 미처리된 티타늄 임플란트 각각에 대해서 S. mutans 및 S. sobrinus를 각각 접종 및 배양 뒤 형성된 바이오 필름에 대한 흡광도 평가 결과에 대한 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 티타늄 임플란트는 임플란트 표면 상에 화학결합을 통해 고정된 키토산을 포함한다.

상기 티타늄 임플란트는 골절 고정용, 인공척추, 인공 의수, 치아 교정용 등치료, 교정 등 생체 내 식립되는 임플란트의 경우 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 임플란트는 티타늄을 주제로 하는 생체에 사용되는 통상적인 임플란트의 재질일 수 있으며, 일예로 주성분인 티타늄 이외에 바나듐, 알루미늄, 니켈, 철, 크롬 등의 금속이 미량 포함된 합금일 수 있다. 상기 티타늄 임플란트의 크기는 일예로 직경이 약 1 ~ 2㎜, 길이는 약 6 ~ 10㎜일 수 있다.

또한, 상기 키토산은 티타늄 임플란트가 식립된 골조직에 침투할 수 있는 세균에 대한 항균력을 부여하는 물질이다. 또한, 티타늄 임플란트 표면에 물리적인 배리어를 형성함을 통해서 임플란트로부터 금속이온의 용출을 방지 또는 지연시켜 용출되는 바나듐과 같은 미량의 금속원소에 의한 염증반응을 최소화할 수 있다. 상기 키토산은 75 ~ 85% 탈아세틸화 된 것으로써, 점도 20-800 cP인 것일 수 있으며, 1% 초산 수용액 또는 pH 6.5 이하의 수용액에 녹는 것을 사용할 수 있는데, 이를 통해 티타늄 임플란트 표면에 도입되기에 보다 유리할 수 있고, 키토산을 통해 목적하는 효과를 현저히 발현할 수 있으며, 키토산이 티타늄 임플란트에 도입된 후 탈리되거나 분해되는 것이 최소화 되어 키토산을 통해 목적하는 효과의 지속력을 높일 수 있는 이점이 있다.

상술한 키토산은 티타늄 임플란트 표면에 화학결합을 통해 고정되며, 바람직하게는 상기 화학결합은 공유결합일 수 있으며, 이를 통해 키토산이 티타늄 임플란트 표면으로부터 탈리 되는 것을 최소화할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 키토산과 티타늄 임플란트 표면 사이에는 이 둘과 각각 공유결합을 형성하는 스페이서를 더 구비할 수 있다. 상기 스페이서는 화학결합을 매개하는 매개체로써, 키토산과 티타늄 임플란트 각각과 공유결합을 형성할 수 있는 물질의 경우 제한 없이 사용할 수 있다. 이때, 바람직하게는 상기 스페이서는 키토산에 구비된 아민기와 공유결합을 형성할 수 있는 카르복시기를 구비하는 것일 수 있다.

한편, 티타늄 표면에는 히드록시기가 쉽게 구비될 수 있는데, 히드록시기는 카르복시기나 다른 종류의 작용기와 반응성이 미약해 키토산과 스페이서 간 공유결합이 형성된 경우에도 스페이서와 티타늄 임플란트 표면 간에는 공유결합이 형성되기 어려울 수 있다. 이에 본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 티타늄 임플란트는 카르복시기 또는 아민기를 구비하도록 표면이 개질된 것일 수 있고, 상기 티타늄 임플란트 표면에 구비된 카르복시기 또는 아민기와 공유결합을 형성하도록 스페이서는 아민기 또는 카르복시기를 구비할 수 있다. 결국 상기 스페이서는 키토산의 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 적어도 1개의 카르복시기와 상기 티타늄 임플란트 표면에 구비된 아민기 또는 카르복시기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 적어도 1개의 카르복시기 또는 아민기를 구비한 것일 수 있다.

이때, 상기 티타늄 임플란트 표면에 구비되는 카르복시기 또는 아민기는 공지의 방법과 공지의 물질을 통해 티타늄 임플란트에 도입될 수 있다. 다만 임플란트의 용도를 고려하여 세포독성을 유발하지 않으며, 인체에 무해한 생체 적합한 물질이 바람직하다.

일예로, 상기 티타늄 임플란트 표면에 구비된 작용기가 아민기인 경우를 상정하여 구체적으로 설명하면, 상기 아민기는 임플란트의 표면 개질을 통해서 도입된 것일 수 있다. 상기 아민기를 티타늄 임플란트 표면에 도입시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 도입시킬 수 있어서 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다. 다만, 통상적인 티타늄 임플란트 표면에 존재하는 수산기는 반응성이 매우 낮기 때문에 수산기와 반응기가 높은 실란화합물을 이용해 아민기를 도입시킬 수 있다. 상기 실란화합물은 아미노기를 구비한 아미노실란계 화합물일 수 있으며, 일예로 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 화합물일 수 있다. 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 화합물을 통한 티타늄 임플란트 표면 개질은 아민기를 보다 증가된 함량으로 티타늄 임플란트 표면에 도입시키기에 보다 유리하며, 스페이서에 구비된 카르복시기와의 반응이 용이하다. 또한 이를 통해 고정되는 키토산의 함량을 증가시키는 것에도 더욱 유리할 수 있다.

또한, 상기 티타늄 임플란트 표면에 구비되는 작용기가 아민기일 경우 상기스페이서는 적어도 2개의 카르복시기를 갖는 화합물일 수 있는데, 바람직하게는폴리아크릴산, 술시닉산, 글루탐산 및 아스팔틱산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 스페이서는 술시닉산일 수 있는데, 다른 물질에 대비해 티타늄 임플란트에 도입되는 키토산의 함량을 높이고 키토산이 도입된 후 고정력을 지속시킬 수 있는 측면에서 보다 유리할 수 있다.

한편, 키토산은 티타늄 임플란트 표면을 30% 이상 덮도록 임플란트 표면에 도입될 수 있는데, 이를 통해 세균에 대한 항균력을 향상시킬 수 있고, 티타늄 임플란트로부터 금속이온의 용출을 최소화할 수 있는 이점이 있다.

상술한 본 발명의 일 실시예에 따른 임플란트는 후술하는 제조방법을 통해 구현될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로 티타늄 임플란트는 (1) 표면에 아민기를 구비한 티타늄 임플란트를 제조하는 단계, (2) 적어도 2개의 카르복시기를 갖는 스페이서를 구비한 제1용액을 상기 티타늄 임플란트 표면에 처리하여 상기 카르복시기와 임플란트의 아민기 간 화학결합을 유도하는 단계, 및 (3) 키토산을 포함하는 제2용액을 처리하여 키토산의 아민기와 상기 스페이서의 비반응된 카르복시기 간 화학결합을 유도하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

먼저 본 발명의 (1) 단계로써, 표면에 아민기를 구비한 티타늄 임플란트를 제조하는 단계를 수행한다. 티타늄 임플란트 표면에 아민기를 도입시키는 것은 당업계에 공지된 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 일예로 아미노실란계 화합물, 보다 구체적으로는 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 포함하는 용액으로 티타늄 임플란트 표면을 처리하여 아민기를 도입시킬 수 있다. 또한, 상기 아미노실란계 화합물은 상기 용액 내 0.01~10중량%, 보다 바람직하게는 1 ~ 5중량%로 포함할 수 있다. 만일 상기 용액 내 0.01 중량% 미만으로 포함될 경우 상기 티타늄 임플란트 표면에 결합되는 아민기의 양이 적어서 고정시킬 수 있는 키토산의 함량이 현저히 저하될 수 있으며, 만일 5중량%를 초과할 경우 첨가되는 아미노실란계 화합물의 양 대비 도입되는 아민기의 양 증가가 미미할 수 있다.

상기 아미노실란계 화합물을 포함한 용액에 포함되는 용매로는 상기 아미노실란계 화합물을 용해시킬 수 있는 통상적인 용매라면 제한없이 사용될 수 있으며, 일예로 물 또는 에탄올일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 아미노실란계 화합물을 포함한 용액을 티타늄 임플란트에 표면에 처리하는 방법은 일예로 침지법일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 아미노실란계 화합물을 포함하는 용액을 티타늄 임플란트에 처리한 뒤 60 ~ 90℃ 에서 1 ~ 3시간 동안 반응시킨 뒤, 세척하여 물리적으로 결합된 아미노실란계 화합물을 제거할 수 있다.

다음으로 본 발명에 따른 (2) 단계로서, 적어도 2개의 카르복시기를 갖는 스페이서를 구비한 제1용액을 상기 티타늄 임플란트 표면에 처리하여 상기 스페이서의 카르복시기와 티타늄 임플란트의 아민기 간 화학결합을 유도하는 단계를 수행한다.

상기 제1용액은 적어도 2개의 카르복시기를 갖는 스페이서, 일예로 숙신산을 함유한다. 상기 제1용액은 상기 스페이서를 용해시킬 수 있는 용매를 더 포함하며, 상기 용매는 일예로 물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 스페이서의 구체적 종류에 따라서 적절히 변경될 수 있다. 이때, 상기 제1용액에서 스페이서의 농도는 0.1 ~ 5중량%일 수 있는데 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 스페이서의 카르복시기와 티타늄 임플란트의 아민기 간 화학결합은 공지된 커플링 반응을 통해 수행할 수 있으며, 구체적으로 당업계에서 공지된 WSC(water-soluble carbodiimide)를 이용한 활성화 방법에 사용되는 커플링제를 통한 반응일 수 있고, 일 예로 NHS(Nhydroxysuccinimide) 및 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)를 통해 수행될 수 있다. EDC / NHS를 통한 커플링 반응은 물 100 중량부에 대해서 0.1 ~ 0.5중량부의 EDC(N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), 0.1 ~ 0.5중량부의 NHS(N-hydroxysuccinimide) 및 스페이서를 포함하는 수용액에 티타늄 임플란트를 침지시킨 후 15 ~ 30시간 동안 교반하면서 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 반응이 종결된 후 탈이온수 등을 이용한 1회 이상의 세척과정을 거칠 수 있으며, 이를 통해 비반응 카르복시기를 함유하는 스페이서가 결합된 티타늄 임플란트를 제조할 수 있다.

한편, 후술하는 (3) 단계의 키토산에 스페이서를 먼저 고정시킨 뒤, 이를 티타늄 표면 상에 고정시킬 수도 있으나, (2) 단계를 먼저 수행한 후 (3) 단계를 수행하는 것이 반응성 측면에서 매우 유리하며 키토산을 티타늄 표면에 보다 용이하고 높은 효율로 도입시킬 수 있는 이점이 있다.

다음으로 본 발명에 따른 (3) 단계로서, 키토산을 포함하는 제2용액을 처리하여 키토산의 아민기와 상기 스페이서의 비반응된 카르복시기 간 화학결합을 유도하는 단계를 수행한다.

상기 제2용액은 키토산을 포함하며, 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 용매는 키토산을 용해시킬 수 있는 공지된 생체 적합한 용매의 경우 제한 없이 사용할 수 있고, 일예로, 산성 수용액일 수 있다. 상기 키토산은 제2용액 내 0.1 ~ 5중량%, 바람직하게는 0.5 ~ 2중량%의 농도로 포함할 수 있다. 한편, 상기 제2용액은 pH가 5 ~ 6일 수 있는데, 이를 통해 키토산의 용해에 유리할 수 있다.

스페이서가 결합된 티타늄 임플란트는 제2용액으로 6 ~ 10시간 동안 처리될 수 있고, 일예로 함침 될 수 있다. 이후 0.1 ~ 2 N 농도의 산성용액으로 1 ~ 20분 간 처리될 수 있으며, 상기 산성용액은 일예로 염산일 수 있다. 산성용액 처리 후 티타늄 임플란트는 세척공정을 1회 또는 수회 더 거칠 수 있으며, 이후 건조공정을 더 거쳐서 표면에 키토산이 고정화된 티타늄 임플란트로 구현될 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

<실시예1>

티타늄 임플란트 중에서, 치아교정용 마이크로 임플란트를 준비했다. 상기 마이크로 임플란트는 Ti6Al4V 합금 재질(Al 5.930wt%, Be 0.001wt%, Cd 0.001wt%, Co 0.001wt%, Cr 0.033wt%, Cu 0.001wt%, Fe 0.016wt%, Hf 0.001wt%, Mn 0.004wt%, Mo 0.002wt%, Ni 0.031wt, Pd 0.001wt%, V 3.880wt%, 잔량 Ti)인 것을 준비했다. 이후 95% 에틸알코올에 2중량%가 되도록 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)이 혼합된 용액에 마이크로 임플란트를 함침 후 70℃에서 4시간 동안 방치했다. 이후 마이크로 임플란트를 에탄올로 1회 세척 후 탈이온수로 2회 더 세척하여 표면에 물리적 흡착된 APTES를 제거하여 APTES를 통해 아민기가 표면에 도입된 마이크로 임플란트를 제조하였다.

이후 0.25중량%의 숙신산을 함유한 pH 5.6인 수용액인 제1용액을 준비한 뒤 EDC, NHS를 더 투입하여 교반시켰고, 이후 아민기가 표면에 도입된 마이크로 임플란트를 투입시켜 다시 6시간 동안 교반하여 혼합한 뒤, 이후 3회 탈이온수로 세척 후 건조시켜 숙신산이 결합된 마이크로 임플란트를 제조하였다.

이후, 2중량%의 아세트산이 함유된 pH 5.6인 수용액에 키토산을 0.5중량% 함유하도록 투입하고 4시간 동안 교반하여 제조한 제2용액에 숙신산이 결합된 마이크로 임플란트를 함침시킨 뒤 8시간 동안 반응시켰다. 이후 1N 염산에 10분간 처리한 뒤 탈이온수로 세척하고 건조시켜 최종 키토산이 고정된 마이크로 임플란트(Ti-SA-Ch)를 제조하였다.

<실시예2>

실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 제1용액에 숙신산 대신에 폴리아크릴산을 투입하여 키토산이 고정된 마이크로 임플란트(Ti-AA-Ch)를 제조하였다.

<실험예1>

미처리된 티타늄 임플란트(Ti), APTES 처리된 마이크로 임플란트(Ti-A) 및 실시예1(Ti-SA-Ch) 및 실시예2(Ti-AA-Ch)에 따른 마이크로 임플란트에 대해서 XPS 분석을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 이들 피크의 면적비를 계산한 원소의 조성을 하기 표 1에 나타내었다.

	미처리된 마이크로 임플란트Atom(wt%)	APTES 처리된 마이크로 임플란트Atom(wt%)	실시예1 (Ti-SA-Ch) Atom (wt%)	실시예2 (Ti-AA-Ch) Atom(wt%)
Ti	15.8	4.9	4.1	4.0
Al	1.8	< 0.1	< 0.1	0.8
V	0.4	< 0.1	< 0.1	< 0.1
C	26.9	59.4	60.8	62.5
O	53.7	32.1	30.7	30.7
N	1.4	3.6	5.0	2.0
Si	-	11.4	5.5	7.9

표 1을 통해 알 수 있듯이 APTES 처리된, 즉 아민기가 표면에 도입된 마이크로 임플란트는 Si 함량이 11.4 wt%로 마이크로 임플란트에 아민기를 함유하는 실란커플링제가 잘 도입된 것을 확인할 수 있다. 또한, 실시예1 및 실시예2에서 Si함량이 감소한 것을 통해서 키토산이 마이크로 임플란트에 도입되었음을 확인할 수 있다.

한편, 실시예1, 실시예2에서 질소의 실시예1(5.0%)이 실시예2(2.0%) 보다 훨씬 높아 숙신산을 매개로 하였을 때 키토산이 효율적으로 많이 도입되었음을 알 수 있다.

<실험예2>

티타늄 마이크로 임플란트의 표면개질에 따른 젖음성의 변화를 조사하기 위해 물 접촉각 측정을 하여 도 3에 나타내었다. 미처리 티타늄 임플란트(Neat Ti) 표면의 접촉각은 71^o를 나타내었고, 아미노실란화합물이 도입되면 82^o로 오히려 소수성이 증가하였다. 여기에 숙신산이 반응하면 65^o로 친수성으로 크게 감소했고, 키토산이 결합을 하면 당쇄에 존재하는 -OH 그룹으로 인해 더욱 친수화(57^o) 되었다. 이와 같이 표면개질 공정에 따라 표면의 젖음성이 변화하는 것으로부터 개질반응이 잘 진행되었음을 알 수 있다.

<실험예3>

마이크로 임플란트 표면에 도입된 키토산을 확인하기 위하여 키토산의 아민기에 통상적인 방법을 통해서 FITC 형광물질을 결합시킨 후 형광현미경 검사를 실시하였으며, 그 결과를 각각 도 4(실시예1) 및 도 5(실시예2)에 나타내었다.

도 4 및 도 5에서 확인할 수 있듯이 녹색의 이미지가 관찰되는 것으로부터 키토산이 티타늄 임플란트 표면에 고정된 것을 확인할 수 있다. 한편, 스페이서로써 숙신산을 사용한 실시예1 (도 4)이 폴리아크릴산을 사용한 실시예2 (도 5)에 대비해 더욱 짙은 녹색을 나타내는 것을 확인할 수 있는데, 이를 통해 마이크로 임플란트에 도입된 키토산의 함량에서 실시예1에서와 같이 숙신산을 스페이서로 사용한 경우에 키토산의 함량이 현저히 증가한 것을 알 수 있다.

<실험예 4>

실시예1에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트와 미처리된 임플란트에 대한 생체적합성을 in vitro에서 조골세포의 cell adhesion을 평가하는 것으로 수행했다.

구체적으로 4-Well dish에 이들 각각을 올려 놓은 후, osteoblast cell(MC3T3-E1)의 농도가 3 x 10³ cell/ml인 배양액(DMEM)을 준비하여 1ml씩 cell seeding 하였다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 1일, 3일 동안 각각 배양 후 배양액을 제거하여 PBS로 조심스럽게 세척하고 2.5%(w/v) 글루트알데히드(glutaldehyde)로 고정시킨(fixation) 후 FE-SEM 이미지를 통해 점착 거동을 관찰하였으며 1일, 3일 간 배양된 후 촬영된 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 통해 알 수 있듯이, 미처리된 티타늄 임플란트 (Ti)에 비해 실시예1(Ti-SA-Ch)에 따른 키토산이 도입된 티타늄 임플란트에서 1일, 3일 배양 모두 세포가 잘 퍼져서 부착된 것을 확인할 수 있고, 실시예1의 티타늄 임플란트(TI-SA-Ch)가 조골세포의 초기 접착과 세포 확장(cell spreading)에 좋은 영향을 미치는 것을 확인할 수 있다.

<실험예5>

실험예4에서 1일, 3일 동안 배양된 세포에 대해서 Live staining 염색 평가를 수행했으며, Live/dead staining 염색법을 이용하여 염색한 후 공초점 이미지를 촬영하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

염색법에 사용하는 시약인 Calcein-AM은 비형광물질이었던 것이 세포에 들어가게 되면 세포 내 에스터 가수분해효소(esterase)에 의해 반응하여 형광물질로 전환되어 녹색형광을 띠게 되고, propidium iodide(PI)는 살아있는 세포막을 통과할 수 없어 세포막이 손상된 죽은 세포에만 들어가 음이온을 띄는 세포핵과 이온결합을 하여 붉은 형광을 나타내게 된다.

도 7을 통해 미처리된 마이크로 임플란트(TI)에 대비해 실시예1에 따른 키토산이 고정된 마이크로 임플란트(TI-SA-Ch)에서 녹색 형광을 현저히 많이 띠는 결과를 통해서 실시예1에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트에서 조골세포의 증식이 더욱 큰 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 보다 향상된 치아/잇몸과의 결합력을 발현하여 마이크로 임플란트와 치아/잇몸 사이의 계면을 통한 세균 침투가 방지됨에 따라서 염증발생이 더욱 감소할 것으로 예상된다.

또한, 도 7을 통해 실시예1에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트(TI-SA-Ch)에서 붉은 색의 이미지로 나타나는 사멸된 세포는 없는 것으로 관찰되어 본 연구에서 사용한 키토산이 결합된 티타늄 임플란트는 생체 적합성이 매우 높다는 것을 확인할 수 있다.

<실험예6>

대장균을 이용한 티타늄 임플란트의 항균성 특성을 평가하기 위해 아래와 같이 실험을 실행하였다. 증류수에 영양배지를 넣어 만든 액체배지에 백금 팁으로 대장균 (E. coli)을 조금 넣고 24시간 배양하였다. 그 후 균주 액을 20만분의 1로 희석하여 미처리된 티타늄 임플란트(Ti) 및 키토산이 결합된 티타늄 임플란트 (Ti-SA-Ch)가 들어 있는 바이알에 넣고 24시간 배양시켰다. 바이알의 액을 조금 취해 배양접시의 고체배지 위에 도말 한 후 24시간 정치하여 성장한 대장균의 이미지를 촬영하여 도 8(실시예1)과 도 9(미처리 티타늄 임플란트)에 나타냈다.

도 8 및 도 9를 통해 확인할 수 있듯이 실시예1에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트는 미처리 임플란트에 비해 E. coli의 증식 억제에 대한 효과가 있는 것을 확인할 수 있다.

부식된 치아에 자주 나타나는 대표적인 구강세균인 S. mutans과 S. sobrinus 2종의 균주 각각을 실시예1에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트와 미처리된 티타늄 임플란트에 각각에 2 x 10⁵ 세포수로 접종하고, 37℃, 8시간 동안 배양 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 균주로 인해 형성된 바이오필름 유무 및 정도를 평가했고, 사진을 촬영하여 도 10 내지 도 13에 나타내었다. 또한, 바이오 필름 형성 정도에 대해서 정량적 평가를 위해 바이오 필름을 떼어낸 뒤 595 nm 에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 10 및 도 11은 S. mutans에 대한 항균성 평가 결과로서, 도 10(실시예1, Ti-SA-Ch)의 경우가 도 11(미처리 마이크로 임플란트, Ti)에 대비했을 때, 바이오 필름이 거의 발생하지 않은 것을 확인할 수 있다.

한편, 도 12 및 도 13은 S. sobrinus에 대한 항균성 평가결과로서 도 12(실시예1, Ti-SA-Ch)의 경우가 도 13(미처리 티타늄 임플란트, Ti)에 대비했을 때 바이오 필름이 현저히 적은 양으로 발생한 것을 알 수 있다.

이와 같이 S. mutans와 S. sobrinus를 이용한 항균 실험에서 도 10 ~ 도 13을 통해 알 수 있듯이 실시예1에 따른 키토산이 결합된 티타늄 임플란트(Ti-SA-Ch)는 S. mutans 및 S. sobrinus 균주에 대한 항균효과가 미처리된 티타늄 임플란트(Ti) 보다 현저히 우수한 것을 알 수 있다.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims

아민기를 구비하도록 표면이 개질된 티타늄(Ti) 임플란트 표면 상에 고정된 키토산을 포함하며,
상기 키토산은 상기 티타늄 임플란트와 키토산 각각과 아미드 결합을 형성한 스페이서인 숙신산을 매개하여 고정된 것을 특징으로 하는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 키토산은 75 ~ 85% 탈아세틸화된 것으로서, 점도가 20 ~ 800cP인 것을 특징으로 하는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트.
제1항에 있어서,
상기 키토산은 상기 티타늄 임플란트 표면적의 30% 이상을 덮도록 구비되는 것을 특징으로 하는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트.
삭제
제1항에 있어서,
상기 티타늄 임플란트 표면은 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)으로 개질된 것을 특징으로 하는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트.
(1) 표면에 아민기를 구비한 티타늄 임플란트를 제조하는 단계;
(2) 숙신산인 스페이서를 구비한 제1용액을 상기 티타늄 임플란트 표면에 처리하여 스페이서의 카르복시기와 임플란트의 아민기 간 아미드 결합인 화학결합을 유도하는 단계; 및
(3) 키토산을 포함하는 제2용액을 처리하여 키토산의 아민기와 상기 스페이서의 비반응된 카르복시기 간 아미드 결합인 화학결합을 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성을 갖는 티타늄 임플란트 제조방법.