CN116196481A - 一种双膦酸盐载药镁金属植入物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双膦酸盐载药镁金属植入物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双膦酸盐载药镁金属植入物及其制备方法和应用，该双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，包括步骤：(1)提供基体，所述基体的材质为镁或镁合金；(2)将硝酸锶和磷酸二氢铵混合，然后调节pH值至酸性，得到混合溶液；(3)将所述基体置于所述混合溶液中反应，温度为60‑90℃，取出产品冲洗、烘干，得到半成品；(4)将所述半成品置于唑来膦酸溶液中浸泡，得到双膦酸盐载药镁金属植入物。本发明的双膦酸盐载药镁金属植入物能显著地抑制破骨，同时对成骨未有影响，因此可改善骨质疏松对种植体周围自体骨移植愈合，可应用于牙槽骨增量移植固定。

Description

一种双膦酸盐载药镁金属植入物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及牙槽骨增量移植固定技术领域，更具体地涉及一种双膦酸盐载药镁金属植入物及其制备方法和应用。
背景技术
种植义齿是在牙种植体支持、固位基础上完成的一类缺牙修复体，具有良好的固位和稳定、美观且咀嚼效率高、不损伤临近天然牙等优点，被称为人类的“第三副牙齿”。很多因素会影响到义齿种植，其中种植区域的骨质和骨量是种植术能否成功的两个关键影响因素。牙种植体周围需要充足的骨组织，形成长期稳定的骨结合。种植体与骨组织形成的骨整合界面是确保种植体周围骨组织能长期保持稳定并承担功能负荷的基础。对于种植修复而言，经常面临骨量不足的情况。此外颚骨骨质也被研究认为是影响种植成功与否的因素，需要在手术前进行慎重评估。随着全球尤其是中国逐渐进入老龄化社会，骨质疏松等导致的骨密度降低在高龄患者中十分常见。严重的骨密度降低会增加牙种植治疗的风险。虽然大量的临床研究表明骨质疏松并不是牙种植治疗的绝对禁忌症，但越来越多的实验发现骨质疏松会影响种植体的骨整合。骨密度减低患者的牙种植术和牙槽骨增量术的骨愈合与骨折愈合过程相似，在骨增量部位成骨相关细胞的数量与功能缺陷会带来负面影响。成骨-破骨功能与平衡的紊乱，可导致其种植失败的风险增加。
失牙后牙槽嵴常常很快出现明显吸收，牙种植前就需要对牙槽嵴骨量不足的病例进行不同程度的骨增量手术。针对牙槽骨增量的方法有很多，包括引导骨组织再生(GBR)、Onlay植骨、骨劈开及骨挤压水平向牵张成骨等术式。其中GBR创伤较小，安全有效，但仅适用于牙槽骨量轻度不足的病例；Onlay植骨适用于牙槽骨量严重不足病例，成骨效果好。骨增量材料中自体骨被普遍认为是“金标准”，自体骨填充采用固位钉(钛合金)固定，再包裹生物屏障膜，但在临床应用中还是发现自体骨移植会存在明显的骨块吸收。
新型可降解镁基金属植入材料，近年来是生物材料领域的研究热点，并受到生物材料和医学界的广泛关注和重视。目前临床上应用的医用金属材料包括不锈钢、钛合金，其应用存在缺点：由于腐蚀、磨蚀造成的金属离子或颗粒的释放引发炎症反应；弹性模量太高造成应力遮挡现象；作为临时性植入器件需要进行二次手术取出，对病人造成经济和身体的负担。镁及镁合金有许多优于现有生物医用金属材料的性能：1.镁是人体必需的微量元素，在体内主要存在于骨骼中；2.具有高的比强度、比刚度，弹性模量接近于人体骨骼；3.镁在体内可降解被吸收，其腐蚀产物可安全代谢出体外；4.镁离子对于成骨具有促进作用等。
考虑到骨质疏松老年患者，有研究表明处于骨质疏松状态下的自体骨移植虽然能达到骨性愈合，但其植骨区内种植体骨量减少，骨皮质变薄，将降低种植体的稳定性，如果种植体负重会增加其失败率。因此有必要在种植前改善此种状况。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种双膦酸盐载药镁金属植入物及其制备方法和应用，该双膦酸盐载药镁金属植入物能显著地抑制破骨，同时对成骨未有影响，因此可改善骨质疏松对种植体周围自体骨移植愈合，可应用于牙槽骨增量移植固定。
为了实现上述目的，本发明公开了一种双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，包括步骤：
(1)提供基体，所述基体的材质为镁或镁合金；
(2)将硝酸锶和磷酸二氢铵混合，然后调节pH至酸性，得到混合溶液；
(3)将所述基体置于所述混合溶液中反应，温度为60-90℃，取出产品冲洗、烘干，得到半成品；
(4)将所述半成品置于唑来膦酸溶液中浸泡，得到双膦酸盐载药镁金属植入物。
与现有技术相比，本发明双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，在镁或镁合金基体表面先通过化学转化法制备活性锶磷涂层，最后通过浸泡法载药唑来膦酸，制备了双膦酸盐载药镁金属植入物，锶磷涂层致密厚实，具有很好的耐蚀性能，能够有效的控制镁的降解，同时可以有效调控药物的释放，载药涂层可以有效的提高骨增量移植的骨密度，同时提高义齿种植的骨整合程度，利用镁和双膦酸盐的共同作用，减少骨质疏松患者进行骨增量术后发生骨吸收的情况，提高骨整合能力。因此，该双膦酸盐载药镁金属植入物能显著地抑制破骨，同时对成骨未有影响，因此可改善骨质疏松对种植体周围自体骨移植愈合，可应用于牙槽骨增量移植固定。
在一些实施例中，基体可为但不限于镁钉，优选为纯镁钉。
在一些实施例中，步骤(2)中，调节pH值为2-5，优选地，调节pH值为3。进一步地，采用稀硝酸、稀硫酸、稀盐酸等物质调节pH值。示例地，采用10％的稀硝酸调节pH值至3.0，但不以此为限。
在一些实施例中，步骤(2)中，硝酸锶和磷酸二氢铵的摩尔比为1-2:1，作为示例地，硝酸锶和磷酸二氢铵的摩尔比为1:1、10:6、5:4、2:1等。
在一些实施例中，步骤(3)中，反应时间为5-30分钟，示例地，将所述基体置于所述混合溶液中反应5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟，但不以此为限。
在一些实施例中，步骤(4)中，所述唑来膦酸溶液的浓度为10-5-10-4摩尔/升。
在一些实施例中，步骤(4)中，所述唑来膦酸溶液采用去离子水和唑来膦酸配制，示例地，采用去离子水将唑来膦酸配置成浓度为10-4摩尔/升的唑来膦酸溶液。
在一些实施例中，步骤(4)中，浸泡时间为12-48小时，示例地，将所述半成品置于唑来膦酸溶液中浸泡12小时、24小时、36小时、48小时，但不以此为限。
在一些实施例中，步骤(4)中，浸泡温度为25-50℃，示例地，浸泡温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，但不以此为限。
相应地，本发明还提供一种双膦酸盐载药镁金属植入物，采用上述双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法制得，该双膦酸盐载药镁金属植入物能显著地抑制破骨，同时对成骨未有影响，因此可改善骨质疏松对种植体周围自体骨移植愈合。
本发明还提供一种双膦酸盐载药镁金属植入物在牙槽骨增量移植固定中的应用，利用双膦酸盐载药镁金属植入物进行骨增量移植固定，通过局部释放镁离子和唑来膦酸可改善骨质疏松对种植体周围自体骨移植愈合及植骨区内种植体骨结合率，具有潜在的临床应用价值。
一些实施例中，本发明还提供一种上述双膦酸盐载药镁金属植入物在骨质疏松患者的牙槽骨增量移植固定中的应用。该本发明在镁或镁合金基体表面制得双膦酸盐载药涂层，利用其促进成骨、抑制破骨的作用，提高骨质疏松患者种植牙治疗的临床效果。
本发明的有益效果有：
1、本发明的基体采用镁或镁合金，一方面在达到骨增量的目的后，镁或镁合金基体可被吸收，不会影响到后续义齿种植；另一方面镁降解产物如镁离子的原位释放可以促进牙槽骨修复的过程，同时抑制周围软组织的成纤维细胞，起到类似屏障膜的作用；
2、本发明利用镁和双膦酸盐的共同作用，减少骨质疏松患者进行骨增量术后发生骨吸收的情况，提高骨整合能力；
3、本发明在镁或镁合金基体表面制备了一种生物活性锶磷涂层，锶磷涂层致密厚实，具有很好的耐蚀性能，能够有效的控制镁的降解，同时可以有效调控药物的释放；
4、本发明的载药涂层可以有效的提高骨增量移植的骨密度，同时提高义齿种植的骨整合程度。
附图说明
图1为本发明实施例1得到双膦酸盐载药镁金属植入物的SEM图，图1(a)为涂层表面；图1(b)为截面形貌。
图2为本发明实施例1得到双膦酸盐载药镁金属植入物的XRD图。
图3为本发明实施例1得到双膦酸盐载药镁金属植入物浸泡不同时间累积药物释放量。
图4为载药组(实施例1得到双膦酸盐载药镁金属植入物)、未载药组浸提液与MC3T3-E1细胞共培养1、2、3天后的细胞增殖情况，*p<0.05。
图5为MCT3T-E1细胞表面黏附DAPI染色结果，图5(a)为载药组(实施例1得到双膦酸盐载药镁金属植入物)，图5(b)为空白对照组。
图6为载药组(实施例1得到双膦酸盐载药镁金属植入物)、未载药组浸提液与RAW264.7细胞共培养1、2、3天后的细胞增殖情况，*p<0.05。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，包括步骤：
(1)采用压力铸造制备99.9％的纯镁，以64:1的挤压比在350℃进行热挤压加工，得到直径15mm的棒材，将纯镁棒材线切割加工成直径10mm、厚度3mm的样品，表面用碳化硅砂纸从400#逐级打磨至2000#；
(2)将0.1摩尔/升硝酸锶和0.06摩尔/升磷酸二氢铵的混合溶液用10％的稀硝酸调节pH值至3.0，得到混合溶液；
(3)将纯镁样品置于80℃的混合溶液中反应10分钟，取出冲洗吹干，得到半成品；
(4)用去离子水将唑来膦酸配置成浓度为10-4摩尔/升的唑来膦酸溶液，将半成品置于唑来膦酸溶液中，在37℃恒温水浴中浸泡24小时，最终得到双膦酸盐载药镁金属植入物。
实施例2
一种双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，包括步骤：
(1)采用压力铸造制备99.9％的纯镁，以64:1的挤压比在350℃进行热挤压加工，得到直径15mm的棒材，将纯镁棒材线切割加工成直径10mm、厚度3mm的样品，表面用碳化硅砂纸从400#逐级打磨至2000#；
(2)将0.08摩尔/升硝酸锶和0.06摩尔/升磷酸二氢铵的混合溶液用10％的稀硝酸调节pH值至4.0，得到混合溶液；
(3)将纯镁样品置于80℃的混合溶液中反应20分钟，取出冲洗吹干，得到半成品；
(4)用去离子水将唑来膦酸配置成浓度为10-4摩尔/升的唑来膦酸溶液，将半成品置于唑来膦酸溶液中，在35℃恒温水浴中浸泡24小时，最终得到双膦酸盐载药镁金属植入物。
实施例3
一种双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，包括步骤：
(1)采用压力铸造制备99.9％的纯镁，以64:1的挤压比在350℃进行热挤压加工，得到直径15mm的棒材，将纯镁棒材线切割加工成直径10mm、厚度3mm的样品，表面用碳化硅砂纸从400#逐级打磨至2000#；
(2)将0.12摩尔/升硝酸锶和0.06摩尔/升磷酸二氢铵的混合溶液用10％的稀硝酸调节pH值至3.0，得到混合溶液；
(3)将纯镁样品置于90℃的混合溶液中反应15分钟，取出冲洗吹干，得到半成品；
(4)用去离子水将唑来膦酸配置成浓度为10-4摩尔/升的唑来膦酸溶液，将半成品置于唑来膦酸溶液中，在30℃恒温水浴中浸泡48小时，最终得到双膦酸盐载药镁金属植入物。
测试部分
1涂层形貌、结构表征和药物释放
1.1采用扫描电子显微镜(SEM，S-3400N，日立)表征实施例1的涂层样品的表面和截面形貌，结果如图1所示；
1.2采用X射线衍射仪(X-ray diffractometer，XRD)来测定实施例1的涂层样品的物相组成，结果如图2所示；
1.3采用体外浸泡实验研究实施例1涂层样品的药物释放，具体是将载药涂层样品浸泡在磷酸盐缓冲液(DPBS)中，浸泡比例为1.25cm2/mL(样品表面积/溶液体积)，置于37℃恒温水浴中7天，每天换液，不同时间点浸泡后的溶液保存于4℃冰箱中待测。
唑来膦酸的释放利用紫外分光光度计(UV/VIS，752N，INESA)进行测量。配置0.5毫克/毫升的标准唑来膦酸溶液，然后用去离子水稀释为0、5、10、50、100和500微克/毫升的梯度工作溶液来确定标准曲线。在紫外分光光度计210纳米波长下测量涂层浸泡不同时间释放的药物溶液和标准曲线溶液的吸光度，通过换算即可得到药物释放浓度，结果如图3所示。
从图1可知，纯镁基体表面由大量结晶块状颗粒覆盖，涂层紧实致密，涂层厚度约为15微米。
从图2可知，涂层的主要物相包含磷酸镁、磷酸锶和磷酸二氢锶，图谱中的镁峰则来自于基体。
从图3可知，唑来膦酸药物第一天的释放量约为1.75微克/毫升，随着时间延长，药物释放量逐渐上升，浸泡7天后释放量达到3.8微克/毫升。体外降解的情况显示了涂层具有很好的保护效果以及载药的有效性，药物释放并没有出现初期的暴释，并随着时间延长，呈现均匀缓释的态势，显示了很好的可控缓释效果。
2成骨、破骨细胞实验
2.1细胞培养
实验采用小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)和小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)，来评价实施例1的载药镁植入物在体外与成骨、破骨细胞之间的相互作用。
首先将细胞放入含10％胎牛血清(BI，USA)、100U/ml双抗(青霉素和链霉素)的α-MEM培养基(Hyclone，USA)中，置于37℃、95％湿度、5％二氧化碳培养箱中进行培养。2-3天后待细胞生长至覆盖培养皿80％左右时，进行传代处理。用磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffer Solution,PBS)冲洗2遍，使用含EDTA的胰蛋白酶消化至细胞呈收缩状，轻轻晃动培养皿至观察细胞快要脱落培养瓶时，加入同体积完全培养基终止消化。将细胞轻轻吹打后收集于离心管中，并于1000rmp转速下离心5min，弃上清溶液，再次加入培养基，重悬细胞后加入培养皿中继续培养。进行实验前，细胞悬液浓度通过血球计数器进行计数。
2.2细胞毒性实验
根据ISO10993-5(2009)标准，采用MTT细胞毒性测试方法对样品的细胞毒性进行评价，采用浸提液法进行细胞毒性实验，结果如图4和图6所示。
实验样品在无水乙醇中超声清洗后，用去离子水快速冲洗烘干，紫外灯辐照灭菌，正反面各照射灭菌30分钟。随后按照1.25cm2/mL比例加入α-MEM培养基，于培养箱内浸提24小时得到浸提液。配制5×104/mL细胞悬液，培养24小时使得细胞贴壁后弃去原培养基。PBS冲洗后分别加入无载药和载药组样品浸提液、阳性对照组含有10％二甲基亚砜(DMSO)的完全培养基以及阴性对照组的完全培养基，每孔100微升加入96孔板中，并于二氧化碳培养箱中分别培养1、2、3天，隔天更换新鲜溶液。在每个时间点，先于倒置显微镜下观察细胞形态，而后每孔加入10微升MTT后继续于37℃培养箱中孵育4小时，小心吸除浸提液，每孔加入150微升DMSO，摇床震荡15分钟，使其充分溶解。于490nm测试波长下(参考波长为570nm)，用自动酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。
2.3细胞黏附实验
将样品在75％乙醇中灭菌10分钟。将材料放置24孔板中用PBS快速清洗。材料放置孔板中部。细胞以5×104/孔接种，使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，孵育24小时。细胞孵育24小时后，用PBS震荡清洗两次，3.7％甲醛(PBS中)在室温下固定5分钟，吸出固定液，PBS清洗2次。加入0.1％TritonX-100(PBS中)破膜5分钟，弃去TritonX-100上清液，PBS洗3次。在暗室中，加入浓度为165nM的罗丹明标记的鬼笔环肽(染料覆盖表面即可)，室温避光孵育40分钟，回收染液，用PBS清洗3次。加入DAPI溶液室温下染色3-5分钟，弃去染液，用PBS洗3次，加入PBS，正置荧光显微镜观察，并拍照记录，如图5所示。
2.4统计学分析
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，每种样品测试三个以上以保证实验数据可靠性，结果采用“平均值±标准差”形式表示。采用One-Way ANOVA进行数据整体性差异检验，*p＜0.05表示具有显著性差异。
利用体外细胞实验对载药涂层对成骨和破骨细胞的影响进行了评价，结果如图4所示。图4为MC3T3-E1细胞培养在载药涂层、未载药涂层浸提液中培养1、2、3天后的细胞增殖光密度值。培养1天后，载药和未载药涂层组均与空白对照组无显著性差异。培养2天后，载药涂层组显示了稍低的光密度值，随着时间延长至3天，未载药涂层组显示了最高的光密度值，并有显著性差异，载药组和空白对照组并无显著性差异。随着培养时间延长，各实验组的光密度值均显示了上升的趋势，显示对成骨细胞增殖具有促进作用。
为了更进一步观察实施例1的载药涂层形貌及表面活性对成骨细胞存活的直接影响，将MC3T3-E1细胞直接接种在载药涂层表面。图5是MC3T3-E1细胞在表面黏附的DAPI染色结果。从图5可知，空白对照组细胞骨架完整，细胞形态清晰可见。载药组细胞骨架完整，与对照组无明显区别，但轮廓模糊，可能由于其粗糙表面所造成。载药涂层组和空白对照组相比，相同视野中可观察到的细胞数量无显著差异。
图6为载药涂层组(实施例1)、未载药涂层组浸提液体外与巨噬细胞RAW264.7共培养1、2、3天后的细胞增殖情况。不同于成骨细胞，载药涂层组显示出明显的细胞凋亡的情况，随着时间延长，载药组的光密度值显著下降，并且显著低于未载药组和空白对照组，说明唑来膦酸载药涂层对于巨噬细胞(破骨细胞)具有抑制作用。未载药组和空白对照组随时间延长呈现正常的细胞增殖，但第2、3天未载药组的光密度值显著低于空白对照组，表明其对细胞增殖有一定的抑制作用。
以上实施例包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指本发明的全部实施案例。具体实施中结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供基体，所述基体的材质为镁或镁合金；
(2)将硝酸锶和磷酸二氢铵混合，然后调节pH至酸性，得到混合溶液；
(3)将所述基体置于所述混合溶液中反应，温度为60-90℃，取出产品冲洗、烘干，得到半成品；
(4)将所述半成品置于唑来膦酸溶液中浸泡，得到双膦酸盐载药镁金属植入物。
2.如权利要求1所述的双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，调节pH值为2-5。
3.如权利要求1所述的双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，硝酸锶和磷酸二氢铵的摩尔比为1-2:1。
4.如权利要求1所述的双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，反应时间为5-30分钟。
5.如权利要求1所述的双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述唑来膦酸溶液的浓度为10-5-10-4摩尔/升。
6.如权利要求1所述的双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述唑来膦酸溶液采用去离子水和唑来膦酸配制。
7.如权利要求1所述的双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，浸泡温度为25-50℃。
8.一种双膦酸盐载药镁金属植入物，其特征在于，采用如权利要求1-7任一项所述的双膦酸盐载药镁金属植入物的制备方法制得。
9.一种如权利要求8所述的双膦酸盐载药镁金属植入物在牙槽骨增量移植固定中的应用。
10.一种如权利要求8所述的双膦酸盐载药镁金属植入物在骨质疏松患者的牙槽骨增量移植固定中的应用。
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