KR20140098273A

KR20140098273A - 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물

Info

Publication number: KR20140098273A
Application number: KR1020130010087A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 카필 데브 파텔
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2014-08-08
Also published as: US20140212468A1; KR101461159B1

Abstract

본 발명은 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물에 관한 것으로, 더 자세하게는 키토산-생체활성유리 복합 용액을 제조하는 단계; 상기 키토산-생체활성유리 복합 용액에 약물을 첨가하여 약물 함유 복합 코팅 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 복합 코팅 조성물을 임플란트 표면에 전기영동증착하여 약물 전달층을 제조하는 단계를 포함하는 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물에 관한 것이다. 이에 따른, 임플란트 조성물은 약물을 전달할 수 있어, 이식 수술 후 발생할 수 있는 염증을 방지할 수 있을 뿐 아니라 함유되는 약물의 종류에 따라 회복을 촉진시킬 수 있는 특징이 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물은 골 이식 분야 및 골 이식재로 유용하게 적용할 수 있다.

Description

약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물{Preparation method of implant comprising drug delivery layer and implant compostion for living donor transplantation comprising the same}

본 발명은 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물에 관한 것으로, 더 자세하게는 키토산-생체활성유리 복합 용액을 제조하는 단계; 상기 키토산-생체활성유리 복합 용액에 약물을 첨가하여 약물 함유 복합 코팅 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 복합 코팅 조성물을 임플란트 표면에 전기영동증착하여 약물 전달층을 제조하는 단계를 포함하는 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물에 관한 것이다.

골 이식술은 수혈 다음으로 많이 시행되고 있으며, 정형외과 영역에서 임상적으로 흔히 볼 수 있는 골 결손을 치료하기 위해서 여러 영역에서 시행되고 있다. 보고에 의하면, 미국에서는 연간 50만 건 이상의 골 이식이 행해지고 있으며 전 세계적으로는 연간 220만 건 정도가 시행되고 있다. 골 이식재는 병적 혹은 생리적 원인에 의해 골이 결손된 부위에서 골 성장을 자극하는 역할을 한다.

골 이식재의 작용은 기전에 따라 골전도(osteocondunction), 골유도(osteoinduction), 골형성(osteogenesis)으로 분류할 수 있다. 골전도란 주위 골조직으로부터 골아세포가 이식골 부위로 이주, 무기질 침착에 의해 골이 형성되는 것으로 반드시 주변에 골조직이나 분화된 간엽세포가 있어야만 한다. 만약, 골전도 물질이 피하조직 같은 다른 부위에 이식된다면 골성장을 개시하지 못한다. 골조직 혹은 연조직에 이식되었을 때, 골전도 물질은 흡수되어 잠행성 치환과정(creeping subatitution)과 유사한 과정을 통해 골조직으로 대체된다. 골유도는 골 이식재가 미분화간엽세포를 불러오고 골전구세포로 분화되는데 영향을 미쳐 새로운 골조직을 형성하는 과정으로, 보통 골형성유도단백질(BMP)이 관여하는 것으로 알려지고 있다. 피하조직과 같은 다른 조직에 이식되었을 때에도 골형성이 가능하다. 골유도성 이식재는 또한 골개조(remodeling) 과정에도 큰 영향을 미친다. 한편, 골형성은 이식재 내에 살아있는 세포에 의한 골조직 생성을 의미하여 자가골이 유일한 골형성재료이다.

골 이식술에 사용되는 재료로는 자가골, 동종골, 이종골 등이 있으며, 최근에는 다양한 인공 골 대체물들이 연구, 개발되어 사용되고 있다. 골 이식재료들은 이상적으로 골형성 유도, 숙주와의 생체 적합성, 채취 및 조작의 용이성, 비용의 절감 등의 요구 조건을 충족시킬 수 있어야 하지만, 현재 사용되고 있는 골 이식 재료들은 각각 어느 정도의 제한성을 지니고 있다.

자가골 이식은 골 유합을 위한 골생성, 골유도 및 골전도의 세 가지 특징을 모두 가지고 있는 가장 우수한 재질이며, 다른 모든 골 이식 제재보다 우수한 안정성과 이식율을 보이고 있다. 하지만, 이식골을 채취하는 데 관련된 공여부에 또 다른 결손과 감염 등의 합병증이 생길 수 있고 부가적인 수술시간을 요하며, 종종 충분한 양의 골을 얻지 못할 수 있다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하고자 이를 대체할 골 이식재를 찾기 위한 연구가 광범위하게 이루어져 왔다.

현재, 자가골을 대신하여 가장 흔히 사용되는 동종골은 숙주와 같은 종에서 얻어지는 조직이며, 동결, 동결건조 및 탈회동결건조 등으로 입자, 겔, 퍼티 등의 여러 형태로 제공된다. 동종골은 상대적으로 많은 양을 얻을 수 있고 골격의 특정 부분을 이용하거나 가공 처리함으로써 모양이나 골밀도 등을 조절할 수 있는 장점이 있다. 이식재로서의 동종골은 골전도성은 뛰어나나 골세포가 생존하지 않아 골생성력은 없으며 골유도성도 극히 제한적이다. 또한, 공급이 제한적이고 윤리적인 문제 등의 제한이 있으며 오염 물질, 독소 등의 전파 또는 감염 등의 위험성이 있는 단점이 있다. 또한, 동종골은 공여자에 대한 철저한 조사와 각종 검사에도 불구하고 바이러스에 의한 감염성 질환의 전염 가능성이 존재하며, 이러한 위험성을 줄이기 위해 동종골에 여러 가지 가공 처리를 하면 본래의 생물학적, 역학적 성질을 변화시킬 수 있고 이로 인하여 역학적 강도를 약화시키거나 골 전도성과 골 유도성에 악영향을 끼칠 수 있는 문제점이 있다.

한편, 이종골 이식은 소나 돼지 등의 동물뼈를 가공하여 인체에 이식하는 것으로 제한적으로 사용되고 있으나, 면역 반응과 감염성 질환의 전파 등의 문제가 있어 점차로 사용이 감소되는 추세이다.

따라서, 상기의 자가골, 동종골, 이종골에 관련된 문제 때문에 최근에는 골이식을 위한 생체 적합성 및 안전성을 부여해줄 인공 골 대체물에 대한 관심이 증가하여 많은 연구가 활발히 이루어지고 있다.

인공 골 대체물은 다음과 같은 요건의 충족이 필수적이다.

1) 감염을 일으키지 않으며 항원 반응이 나타나지 않거나 최소화되어야 한다.

2) 시술시 부스러지지 않고 다루기 쉬워야 하며, 생체 내 우수한 흡습성을 가져야 한다.

3) 수술 후 주변 조직의 압력을 견디기 위해 충분한 기계적 강도를 가져야 하며, 지지체 내에 골조직이 충분히 형성되고 성숙될 때까지 일정한 부피를 유지하여야 한다.

4) 기존 조직과 잘 부착하기 위해 적절한 표면 거칠기를 지녀야 하며, 세포들의 접착과 성장 및 분화를 위해 영양분이나 배설물이 잘 확산될 수 있는 다공성을 띠어야 한다.

5) 인공 골 대체물의 분해에 의한 부가적인 생성물이 생체 적합성을 가져야 한다.

현재, 인공 골재료로는 티타늄, 스테인레스 스틸 합금, 코발트-크롬 합금 등과 같은 금속 재료나 알루미나, 지르코니아 등과 같은 생체 불활성 세라믹 재료 또는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)와 같은 생체 활성 세라믹 재료가 널리 사용되고 있다. 이 중 가장 보편적으로 사용되고 있는 하이드록시아파타이트는 인체의 뼈나 치아의 주성분과 구조가 동일하여 의료분야에서 분말형태, 치밀체 또는 금속에 코팅하여 사용되고 있으며, 생체적합성과 생체친화성이 우수하여 주위 골의 골전도를 일으키므로 이를 인공 골 재료로 개발하여 실험 및 임상적으로 적용하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 그러나, 강도가 낮고 쉽게 파괴가 일어나는 세라믹 특유의 약한 취성(brittleness) 때문에 우수한 생체 적합성에도 불구하고 골 대체제로써 한계를 지닌다. 또한, 보편적으로 사용되고 있는 다른 고강도 세라믹 재료나 금속 재료는 높은 기계적 강도를 특징으로 하나 생체적합성이 낮아 골 재생을 유도하는데 한계가 있다. 따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 생체적합성이 우수한 물질을 금속 또는 생체 불활성 세라믹 표면에 코팅하는 방법이 일반적으로 시행되고 있다.

생체적합성 물질 코팅 방법으로는 플라즈마 용사법이 가장 많이 사용되었는데, 이것은 생체적합성 물질을 20,000℃ 내지 30,000℃의 고온 플라즈마 영역에서 용융시킨 후 이를 금속 또는 생체불활성 세라믹 표면에 융착시키는 방법이다. 플라즈마 용사법으로 코팅한 코팅층은 부착 강도가 화학기상증착법, 스퍼터링법 등으로 코팅한 코팅층에 비하여 높으나 여전히 코팅층의 파괴가 금속 표면과 코팅층 표면에서 일어나는 문제점이 있다. 최근에는 금속 이식체를 칼슘과 인산 이온이 들어있는 용액에 침적하여 금속 표면에 생체적합성 물질을 석출시키거나, 표면을 개질하여 인체유사 용액(SBF)에 침적시켜 표면에 생체적합성 물질 층을 생성시키는 방법들이 개발되고 있으나, 인체유사 용액을 이용하여 생체적합성 물질을 코팅하는 경우에는 침적시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다.

한편, 전기영동증착(Electrophoretic deposition, EPD)은 간단하고 저렴한 점으로 인하여 주로 사용되고 있는 유용하고 효과적인 코팅 방법 중 하나이다. 전기영동증착은 고도로 균일하고 0.3 ㎛ 내지 100 ㎛ 범위의 다양한 두께를 갖는 코팅층을 제조할 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 전기영동증착은 증착되는 입자 또는 분자의 하전에 따라 양극 또는 음극 처리 중 하나를 적용할 수 있어, 코팅 조성물 및 상업적 이용도를 용이하게 제어할 수 있다는 장점을 갖는다.

한편, 임플란트(골 대체물) 또는 인공 고관절을 인체에 시술한 후에, 손상된 부위의 회복시간과, 임플란트 또는 인공 고관절과 같은 뼈가 안정적으로 결합하는 시간을 단축시키고, 수술이 끝난 후 초기에 발생할 수 있는 급성 염증을 방지하여 임플란트 또는 인공 고관절과 같은 뼈와의 골유착 기간을 단축시켜 회복을 촉진시키기 위해 항생제와 같은 약물이나, 성장인자나 인슐린과 같은 단백질을 표면에 코팅하는 방안이 연구되고 있다.

현재, 임플란트 표면에 약물을 코팅하는 방법은 크게 세 가지 기술로 나누어질 수 있다.

첫째는, 임플란트 표면에 약물이 혼합된 기능성 고분자를 코팅하는 방법이다. 상기 기능성 고분자 코팅법은 고분자가 쉽게 열화되거나, 변질되는 문제와 생체 적합성이 나쁜 문제가 있다.

둘째는, 임플란트 표면 위에 생체적합성 물질 코팅층을 형성시킨 후 그 위에 약물을 물리적으로 흡착시키는 방법이 있다. 상기 물리적 흡착법은 표면에 흡착된 약물의 방출 속도 제어가 어렵다는 문제가 있다.

셋째는, 생체모방(Biomimetic) 코팅법을 이용하여 수산화아파타이트와 약물을 동시에 복합화시키는 방법으로, 적절한 pH 하에서 Ca와 P 성분을 함유하는 수용액으로부터 Ca² ⁺, PO₄ ² ^- 이온을 석출시켜 생성된 수산화아파타이트 결정을 임플란트 표면에 코팅하는 방법으로, 상기 수용액에 약물을 첨가함으로써 수산화아파타이트와 약물의 동시 코팅을 가능하게 한다. 상기 생체모방 코팅법은 이온의 석출을 이용하기 때문에, 코팅층의 증착 속도가 시간당 0.5 ㎛ 이하로 매우 느리고, 코팅공정이 복잡하며, 코팅층 내의 약물의 농도를 정확하게 제어하기가 어려울 뿐만 아니라 고농도 약물의 첨가가 어렵고, 코팅층과 금속재료 표면 간의 결합력이 낮다는 문제가 있어 산업적으로 적용함에 큰 제한이 있는 문제가 있다.

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 지지체와의 결합력이 높음은 물론 생체적합성 및 골형성 효과가 우수한 생체이식용 조성물을 연구하던 중, 약물을 함유한 키토산-생체활성유리 복합 코팅 조성물을 전기영동증착을 통해 금속 지지체 상에 코팅층을 형성한 결과 상기 코팅층이 균일한 구조를 형성함은 물론 우수한 세포 증식, 아파타이트 형성능 및 약물 전달 효과를 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 우수한 생체적합성 및 골형성능을 갖는 동시에 약물 전달 기능이 있는 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 제조방법으로 제조된 약물 전달층을 포함하는 임플란트를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 키토산 용액을 용매에 분산시키고 표면 아민화 생체활성유리 나노입자를 첨가하여 키토산-생체활성유리 복합 용액을 제조하는 단계(단계 1); 상기 키토산-생체활성유리 복합 용액에 약물을 첨가하여 약물 함유 복합 코팅 조성물을 제조하는 단계(단계 2); 및 상기 복합 코팅 조성물을 임플란트 표면에 전기영동증착하여 약물 전달층을 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "키토산(chitosan)"은, 곤충, 갑각류 및 균류의 외골격으로부터 얻을 수 있는 천연 고분자를 의미한다. 일반적으로, 키토산은 자연 중에 널리 분포하고 있는 다당류인 키틴을 탈아세틸화시켜 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "생체활성유리(bioactive glass)"는, 체내 이식 후 뼈 유사성분인 수산화아파타이트층을 표면에 생성시킴으로써 독성과 염증 및 부정적 면역반응을 동반하지 않고 체내조직과 화학적 결합이 가능한 성질 즉, 우수한 생체활성을 가지는 재료를 의미한다.

상기 단계 1은, 키토산 용액과 표면 아민화 생체활성유리 나노입자를 혼합하여 키토산-표면 아민화 생체활성유리 나노입자 복합 용액을 제조하기 위하여, 키토산 용액을 용매에 분산시킨 후 표면 아민화 생체활성유리 나노입자를 첨가하여 키토산-생체활성유리 복합 용액을 제조하는 단계이다. 상기 키토산 용액은 키토산을 아세트산 또는 염산 용액에 용해시킨 것인 것이 바람직하다. 또한, 상기 용매는 에탄올과 물을 부피비로 1:1 내지 1:9로 혼합한 공-용매일 수 있으며, 바람직하게는 1:4로 혼합한 공-용매이다.

상기 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는 하기 단계를 통하여 제조되는 것이 바람직하다.

1) PEG 템플레이트 용액을 제조하고, 질산칼슘을 첨가하여 질산칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;

2) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 TEOS 용액을 첨가하고 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계;

3) 상기 반응 생성물을 원심분리하고 세척 및 소성하여 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계; 및

4) 상기 제조된 생체활성유리 나노입자를 용매에 첨가하고 분산시킨 후 APTES을 첨가하고 환류시키는 단계.

상기 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는 실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)을 85:15의 몰 비율로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 단계 1)은, 생체활성유리 나노입자를 제조하기 위하여 고분자 템플레이트 용액을 제조하고, 상기 용액에 질산칼슘을 첨가하여 질산칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계이다. 상기 고분자 템플레이트 용액은 고분자 템플레이트를 에탄올에 용해시켜 제조할 수 있다. 상기 고분자 템플레이트는 PEG인 것이 바람직하다. 또한, 상기 고분자 템플레이트 용액은 수산화암모늄을 첨가하여 pH를 조절할 수 있다.

상기 단계 2)는, 목적하는 무기물을 형성시키기 위하여, 상기 질산칼슘-템플레이트 혼합용액에 TEOS 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계이다. 상기 TEOS 용액은 TEOS를 에탄올에 용해시킨 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 초음파 처리는 10 kHz 내지 40 kHz 세기 및 100 W 내지 1000 W 전력으로 10 s on/10 s off 주기로 10분 내지 20분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 3)은, 반응 생성물에서 템플레이트인 PEG를 제거하여 생체활성유리 나노입자를 수득하기 위하여, 상기 반응 생성물을 8,000 rpm 내지 15,000 rpm으로 원심분리하고 증류수와 에탄올로 세척한 후 여과하여 소성하는 단계이다. 상기 소성은 500℃ 내지 800℃ 온도에서 1시간 내지 10시간 동안 수행하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 4)는, 상기 단계 3)에서 제조된 생체활성유리 나노입자 표면을 아민 기능기화하여 표면 아민화 생체활성유리 나노입자를 수득하기 위하여, 상기 생체활성유리 나노입자를 용매에 분산시킨 후 아민계 화합물인 APTES를 첨가하고 환류시키는 단계이다. 상기 환류는 80℃ 내지 90℃ 온도에서 12시간 내지 24시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 환류 후에 세척 및 건조 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 건조는 60℃ 내지 90℃ 온도에서 12시간 내지 72시간 동안 수행하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 2는, 상기 단계 1에서 제조된 키토산-생체활성유리 나노입자 복합 용액에 약물을 첨가함으로써 약물 함유 복합 코팅 조성물을 제조하는 단계이다. 상기 복합 코팅 조성물은 pH 3.1 내지 pH 3.6 범위인 것이 바람직하며, 상기 pH는 아세트산 또는 수산화나트륨으로 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 약물은 항생제, 항염증제, 항암제 또는 골분화 약물인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 3은, 상기 약물 함유 복합 코팅 조성물을 임플란트 표면에 약물 전달층을 형성시키기 위하여 전기영동증착하여 약물 전달층을 제조하는 단계이다. 상기 전기영동증착 처리는 20 V 내지 80 V의 직류전압으로 5분 내지 10분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 상기 약물 전달층의 두께는 2 ㎛ 내지 50 ㎛인 것이 바람직하다. 만약, 약물 전달층의 두께가 2 ㎛ 미만이면, 코팅층의 약물전달 효능 등이 미비할 수 있다. 또한, 50 ㎛를 초과하면 코팅막이 박리되는 문제가 발생할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조된 임플란트를 포함하는 생체 이식용 임플란트 조성물을 제공하다.

본 발명에 따른 전기영동증착을 이용한 임플란트의 제조방법은 액체(과립)상의 조성물을 이용하여 지지체 상에 균일하게 코팅시킬 수 있으며, 코팅층의 두께를 용이하게 조절할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 약물 전달층을 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물은 약물을 전달할 수 있어, 이식 수술 후 발생할 수 있는 염증을 방지할 수 있을 뿐 아니라 함유되는 약물의 종류에 따라 회복을 촉진시킬 수 있는 특징이 있다.

따라서, 본 발명에 따른 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물은 골 이식 분야 및 골 이식재로 유용하게 적용할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기영동증착 공정 동안 (a) 전력, (b) 증착 시간 및 (c) 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 함량 변화에 따른 중량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체활성유리 나노입자 및 표면 아민화 생체활성유리 나노입자의 제타 전위를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 및 (b) 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(대조군 포함)의 XRD 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 생체활성유리 나노입자 및 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 및 (b) 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(대조군 포함)의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 및 (b) 키토산-생체활성유리 복합 코팅 조성물(과립 용액)의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산-생체활성유리 복합 코팅 조성물(과립 용액)의 탁도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산(대조군) 및 키토산-생체활성유리 복합 코팅층의 TGA 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 키토산(CH), (b) 키토산-5 wt%생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn), (c) 키토산-10 wt%생체활성유리 복합 코팅층(CH-10BGn), (d) 키토산-15 wt%생체활성유리 복합 코팅층(CH-15BGn) 및 (e) 키토산-5 wt%생체활성유리 복합 코팅층에서 스크래칭 오프한 코팅층의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산(CH) 및 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-BGn)의 시간에 따른 분해율을 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산(CH) 및 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-BGn)의 시간에 따른 아파타이트 형성능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체액(가속배지) 배양 후 특성 변화에 대한 (a) SEM, (b) XRD 및 (c) FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는, 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산(CH) 또는 키토산-10 wt%생체활성유리 복합 코팅층(CH-10BGn)에 MC3T3-E1 세포 배양 후 (a) SEM(배양 3일째) 및 (b) 세포 증식(성장) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은, 본 발명의 일 실시예에 따른 각 코팅층(Ti(티타늄), CH(키토산) 및 CH-10BGn(키토산-10 wt%생체활성유리 복합 코팅층))에 세포 배양 후 (a) Cod I, (b) ALP, (c) BSP, (d) OPN 및 (e) OCN의 유전자 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 14는, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) Na-ampicillin(모델 약물) 방출 및 (b) 항균 작용 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 약물을 포함하는 임프란트 제조

중분자량의 키토산(MW=200,000 Da, 85% 탈아세틸화), 아세트산(≥99%), 폴리에틸렌글리콜(PEG, Mn:10,000), 질산칼슘(Ca(NO₃)₂ㆍ4H₂O), 수산화암모늄(28% NH₃ in water, ≥99.99% metal basis), TEOS(C₈H₂₀O₄Si, 98%), 무수 메탄올(CH₄O, 99.8%), 무수 톨루엔(C₇H₈, 99.8%) 및 APTES(C₉H₂₃NO₃Si, ≥98%)는 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였으며, 정제 없이 사용하였다. 코팅을 위하여, 사각형 플레이트(10 mm×10 mm×1 mm) 형태의 순수한 티타늄(Ti)(cp Ti, Senulbio Biotech, Korea)을 금속 지지체로 사용하였다.

1) 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 제조

예비 실험을 통하여, Si와 Ca가 85 mol%: 15 mol%의 비율을 갖을 경우 우수한 구형 나노입자 모폴로지를 유지하면서 우수한 생체활성(생체외 실험)을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, Si와 Ca의 비율을 85 mol%: 15 mol%로 조절하여 85SiO₂-15CaO의 이원 생체활성유리 나노입자를 제조하였다.

먼저, 5 g의 PEG를 40℃에서 교반하면서 150 ㎖의 에탄올 중에 용해시킨 다음, 30 ㎖의 수산화암모늄 및 358 g의 질산칼슘(Ca(NO₃)₂·4H₂O)을 첨가하여 투명한 혼합물을 얻었다. 이와 분리하여, 에탄올 20 ㎖에 TEOS 2 ㎖를 용해시켜 용액을 제조한 후, 이를 PEG와 질산칼슘 혼합물에 한 방울씩 첨가한 다음, 초음파 발생기(LH700S ultra-sonic generator; Ulsso Hitech, Korea)로 초음파 처리하여 균질화하였다. 이때, 초음파 처리는 20 kHz 세기 및 700 W 전력조건(10분 동안 35%의 출력, 10s/10s의 온/오프 주기) 처리하고, 이후 20분 동안 10s/10s의 온/오프 주기로 220 W에서 초음파 처리하였다. 그 다음, 상기 혼합물을 상온에서 24 시간 동안 격렬히 교반하여 흰색 겔 침전물을 얻은 뒤, 10,000 rpm으로 원심분리하고 증류수와 에탄올로 세척한 후 여과하였다. 이에 따라 얻은 흰색 분말을 5 시간 동안 600℃에서 열처리하여 생체활성유리 나노입자를 제조하였다.

제조된 생체활성유리 나노입자의 표면을 아민화하기 위하여, APTES와 반응시켰다. 먼저, 0.1 g의 생체활성유리 나노입자를 50 ㎖의 톨루엔에 첨가한 후 30분 동안 초음파 처리하여 균질한 용액을 얻었다. 1 ㎖의 APTES를 상기 용액에 첨가하고 24 시간 동안 80℃에서 환류시킨 다음, 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 톨루엔과 에탄올로 세척하였다. 생성물을 24 시간 동안 80℃ 오븐에서 건조시켜 표면 아민화 생체활성유리 나노입자를 수득하였다.

2) 키토산-표면 아민화 생체활성유리 복합 코팅 조성물(CH-BGn) 및 이를 이용한 코팅층 제조

먼저, 키토산을 1% 아세트산 용액에 용해시킨 후 에탄올/물 공용매(25% v/v 물)에 1 g/ℓ로 분산시켰다. 그 후, 상기 실시예 1)에서 제조한 표면 아민화 생체활성유리 나노입자를 각각 0 wt%(대조군), 5 wt%, 10 wt%, 15 wt% 및 20 wt%의 다양한 농도로 30분 동안 초음파 처리하여 분산시켜 키토산-생체활성유리 복합 코팅 조성물을 제조하였다. 키토산 용액 내 표면 아민화 생체활성유리 나노입자의 균질한 분산은 탁도 테스트(Smart Scientific analysis, Turbiscan, Korea)로 확인하였다. 상기 복합 코팅 조성물의 광학 투과율(%)을 24시간까지 매 1시간 마다 관찰하였으며, TEM으로 모폴로지를 확인하였다.

상기 제조된 각각의 복합 코팅 조성물을 금속 지지체 표면에 전기영동증착하여 코팅층을 형성시켰다. 이때, 상기 복합 코팅 조성물이 양전하이므로, 금속 지지체는 음극으로 사용하였다. 티타늄(Ti) 지지체를 음극 상에 놓고 음극-양극 거리를 11 mm로 유지시켰다. 초음파조(ultrasonic bath)를 탈가스화 처리한 후, 전원 장치(N5771A, 300V/5A; Agilent Technologies)를 이용하여 직류(DC) 전압을 가하였다. 전기영동증착 공정은 코팅 조성물의 pH, 코팅 전압 및 코팅 시간에 따른 코팅층 형성의 최적 조건을 확인하기 위하여, 상기 pH, 코팅 전압 및 코팅 시간을 다양한 조건으로 변화시키며 수행하였다. 그리고, 전기영동증착 공정을 수행하면서 상기 각 파라미터 변화에 따른 코팅층의 증체량(weight gain)을 관찰하였다. 3.6보다 높은 pH에서 전기영동증착 공정을 수행하였을 때 불균일한 코팅 모폴로지를 보였기 때문에, 코팅 조성물의 pH는 3.1-3.6의 범위에서 아세트산과 수산화나트륨 용액을 사용하여 조절하였다. 직류 전압은 20 V-80 V 범위로 변화시켰으며, 증착 시간은 최대 8분까지 하였다. 전기영동증착은 대기 조건에서 수행하였으며, 증착 공정이 완료된 후 각 코팅 샘플(코팅층이 형성된 금속 지지체)를 취하여 부드럽게 세척한 후 이후 테스트를 위하여 건조시켰다. 표면 아민화 생체활성유리 나노입자가 0 wt%(대조군), 5 wt%, 10 wt%, 15 wt% 또는 20 wt%를 포함된 코팅층은 각각 CH(대조군), CH-5BGn, CH-10BGn, CH-15BGn 및 CH-20BGn으로 표기하였으며, 증체량 관찰 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1a에 나타난 바와 같이, CH-10BGn은 전압증가(20V에서 80V로 증가)와 함께 증체량이 증가하였다. 증체량은 pH 3.6보다 더 산성인 pH 3.1에서 더 확연한 증가를 나타내었다. 이는, pH 감소(산성)가 키토산 분자와 생체활성유리 나노입자의 양전위 성질을 증가시켰음을 나타낸다.

도 1b에 나타난 바와 같이, 코팅층의 증체량은 코팅 시간 동안 거의 선형으로 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, 상기 표면 아민화 생체활성유리 나노입자의 함량 증가에 따른 코팅층 중량 증가는 선형은 아니었으나, 기하급수적(exponential)으로 나타났다. 이 결과로, 상기 표면 아민화 생체활성유리 나노입자의 첨가는 조성물의 중량을 증가(일정한 부피에서)시키는 것을 확인하였다.

3) 약물 함유 복합 코팅 조성물 및 약물 전달층 제조

Na-ampicillin을 전기영동증착 코팅에 대한 약물의 로딩 및 방출 테스트를 위한 모델 약물로서 사용하였다. 순수한 키토산 또는 키토산-10 wt% 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 복합 조성물을 1% 아세트산/증류수로 제조하였다. 키토산의 양은 100 mg으로 고정하였으며, Na-ampicillin은 2가지의 다른 양(5 mg; low Amp 및 10 mg; high Amp)으로 용해시킨 다음, 40 kV에서 5분 동안 전기영동증착 공정을 수행하였다. 티타늄(Ti) 지지체를 음극 상에 놓고 음극-양극 거리를 11 mm로 유지시켰다. 초음파조(ultrasonic bath)를 탈가스화 처리한 후, 전원 장치(N5771A, 300V/5A; Agilent Technologies)를 이용하여 직류(DC) 전압을 가하였다. 전기영동증착은 40 V 전압으로 5분 동안 대기 조건에서 수행하였으며, 증착 공정이 완료된 후 각 약물 전달층 샘플(약물을 포함한 코팅층이 형성된 금속 지지체)인 CH(순수한 키토산, high Amp) 및 CH-10BGn(키토산-10 wt% 표면 아민화 생체활성유리 나노입자, low Amp 또는 high Amp)를 취하여 부드럽게 세척한 후 이후 테스트를 위하여 건조시켰다.

실험예 1: 물리화학적 특성 분석

상기 실시예 1)의 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 및 실시예 2)의 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn, CH-15BGn 및 CH-20BGn)의 물리화학적 특성분석을 실시하였다.

1) 제타 전위(Z-potential) 분석

상기 실시예 1)의 생체활성유리 나노입자의 표면 아민화 전후의 표면 전위 변화를 확인하기 위하여, 제타 전위 분석을 실시하였다. 제타 전위는 제타 전위 측정기(Zetasizer Nano, Malvern, UK)를 사용항 pH 7.4 및 25℃ 조건에서 전기 영동 이동도를 측정하였다. 측정된 전기 영동 이동도를 Smoluchowski equation을 사용하여 제타 전위로 전환하였다. 측정 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 상기 생체활성유리 나노입자는 표면 아민화 후 음전위(-24.9 mV)에서 양전위(+21.9 mV)로 바뀌었다. 이는, 상기 생체활성유리 나노입자의 표면이 성공적으로 아민화 되었음을 의미한다.

2) XRD(X-ray diffraction) 분석

상기 실시예 1)의 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 및 실시예 2)의 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)의 결정상을 XRD(Ultima IV, Rigaku)로 분석하였다. 분석은 40 kV 전압 및 40 mA 전류로 회절각 10°에서 50℃까지 1° 간격으로 실시하였으며, 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3a에 나타난 바와 같이, 2θ=22.5°에서 넓은 피크의 통상적인 무정형의 실리카상을 확인하였다.

또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 티타늄 지지체 표면에 형성된 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)은 키토산(CH) 및 BGn(표면 아민화 생체활성유리 나노입자)에 해당하는 피크만을 나타내었으며, 유리의 증가한 세기는 코팅층 내부에 결합하였음을 나타낸다.

3) FT-IR(Fourier transform infrared) 분석

상기 실시예 1)의 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 및 실시예2)의 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)의 화학적 결합 구조를 확인하기 위하여, FT-IR(Varian 640-IR) 분석을 수행하였다. 분석은 2000 cm^-1에서 500 cm^-1까지 해상도 4 cm^-1로 측정하였으며, 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 표면 아민화하지 않은 생체활성유리 나노입자의 스펙트럼이 544 cm^-1 및 1200 cm^-1(Si-O-Si 결합), 1070 cm^-1(Si-O-Si 신축) 및 784 cm^-1(Si-O-Ca 진동)과 같은 실리카 유리와 관련된 밴드만 나타내는 반면, 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는 방향족 아민의 -NH₂ 신축 모드를 나타내는 1365 cm^-1 및 1737 cm^-1에 추가적인 밴드를 보였다.

또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, 생체활성유리 나노입자에 해당하는 밴드(544 cm^-1, 1070 cm^-1, 1200 cm^-1, 1365 cm^-1 및 1373 cm^-1)는 복합 코팅층 내부에 생체활성유리 나노입자 함유량이 증가함에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과는, 전기영동증착을 통하여 쉽게 코팅 조성물(생체활성유리 나노입자 함량)과 코팅층의 두께를 조절할 수 있음을 의미한다.

4) TEM(Transmission Electron Microscopy) 분석

상기 실시예 1)의 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 및 실시예 2)의 키토산-10 wt% 생체활성유리 복합 코팅 조성물의 TEM 분석을 실시하였다. 분석 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5a에 나타난 바와 같이, 실시예 1)의 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는 100 nm(85±15 nm) 보다 작은 균일한 크기의 입자를 형성하였다.

또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 각각의 입자들은 완벽하게 키토산 매트릭스로 둘러쌓여 독립적으로 분리되었음을 확인하였다.

5) 탁도 분석(turbidity test)

상기 실시예 2)의 키토산-10 wt% 생체활성유리 복합 코팅 조성물의 과립 안정도를 확인하기 위하여, 탁도 분석을 실시하였다. 탁도 분석은 24시간까지 매 1시간 마다 광학 투과율(%)을 관찰하여 수행하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 관찰 시간 동안 약간의 변동을 보일 뿐 거의 일정한 광학 투과율을 나타내었다. 이는, 상기 나노입자 복합 코팅 조성물의 과립 안정도가 높은 것을 의미하는 결과이다.

6) TGA(Thermogravimetric analysis)

상기 실시예 2)의 키토산(CH, 대조군) 코팅층 및 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)의 열 중량 분석(TGA, TGA N-1500, Scinco, South Korea)을 수행하였다. 증착물의 열 중량 분석은 티타늄 지지체로부터 스크랩한 코팅층의 일부분을 사용하여 측정하였다. 이때, 열 중량 분석 공정은 10 ℃/min의 가열속도로 900℃까지 조절하였다. 이를 근거로 하여 복합 코팅층 내에 생체활성유리 나노입자의 양을 추측하였다. 열 중량 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 키토산(CH)은 3 단계의 질량손실을 보였다. 1 단계는 200℃까지 흡착된 물의 방출에 해당하는 22% 손실을 나타내었으며, 추후 200℃-350℃ 및 350℃-600℃의 2 단계 및 3 단계는 키토산의 열분해에 해당하는 손실을 보였다. 600℃에서 키토산이 거의 100%의 질량손실을 보이는 반면, 실시예 2)의 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)은 키토산의 열 중량 분석 패턴과 거의 유사한 거동을 보였음에도 불구하고 질량 보존 효과를 나타내었다. 측정된 보존된 질량(잔존 질량)은 CH-5BG, CH-10BGn 및 CH-15BGn이 각각 4.89%, 9.99% 및 14.84%이었다. 이는, 상기 복합 코팅층이 초기 조성물을 상당히 보존하였음을 의미하는 결과이다.

7) SEM(Scanning Electron Microscopy) 분석

상기 실시예 2)의 키토산(CH) 코팅층 및 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)의 미세구조를 확인하기 위하여, SEM(S-3000H microscope, Hitachi, Japan) 분석을 수행하였다. 또한, 각 조성물의 3-5개의 샘플에서 얻은 횡단면 SEM 이미지로 코팅 두께의 근사값을 확인하였다. 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 순수한 키토산(CH) 코팅층이 균질하고 명확한 모폴로지를 보여주는 반면, 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)은 거친 표면을 보였으며 이는 표면 아민화 생체활성유리 나노입자의 함량이 클수록 더 명확하게 나타났다. 상기 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는 마이크로미터(독립적인 표면 아민하 생체활성유리 나노입자 보다 큰)의 국부적인 크기 덩어리의 밝은 영역으로 나타났다. 키토산 용액 내에 상기 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는 비교적 안정하였기 때문에, 상기의 유사 덩어리 형성은 전기영동증착에 의한 것으로 볼 수 있다.

한편, 횡단면의 모폴로지(도 8c)는 티타늄 지지체에서 스크래칭 오프하여 확인하였다. CH는 ~12 ㎛, CH-5BGn은 ~15 ㎛이고, CH-10BGn은 ~30 ㎛ 그리고 CH-15BGn은 ~48 ㎛의 두께를 나타내었다. 이는, 도 1c에 코팅층 증체량 분석 결과에 부합하였다.

실험예 2: 분해 및 아파타이트 형성 분석

상기 실시예 2)에서 제조한 각 코팅층(CH, CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)의 분해 정도를 확인하기 위하여, 각 코팅층 시료(10 mm × 10 mm × 2 m)를 37℃의 인산완충식염수(PBS, pH 7.4) 30 ㎖에 다른 기간(7, 21, 35 및 50일) 동안 침지한 다음 취하여 중량 변화를 측정하였다. 측정 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 모든 시료(CH, CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)에 분해 프로필은 시간에 따라 거의 선형으로 나타났으며, 표면 아민화 생체활성유리 나노입자(BGn)의 첨가로 분해 속도가 증가하였다. 순수한 키토산(CH) 코팅에서 분해는 7일 동안 ~5%, 21일 동안 ~13%, 35일 동안 ~18% 그리고 50일 동안 34%로 나타났다. 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-15BGn)에서는 7일 동안 ~12%, 21일 동안 ~25%, 35일 동안 ~32% 및 50일 동안 ~42%이었다. 이는, 코팅층 내부에서 관찰된 표면 침식 공정과 관련된 코팅 분해를 의미하는 선형 방출 패턴이었으며, 따라서 코팅층 내부에 혼합한 약물의 방출 패턴에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

또한, 아파타이트 형성능을 확인하기 위하여, 유사체액(SBF)보다 2배 높은 이온 농도를 갖는 2×SBF(가속 배지)를 이용하였다. 이때, Na⁺, K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Cl^-, HCO₃ ^-, HPO₄ ² ^- 및 SO₄ ² ^-는 각각 284.0 mM, 10.0 mM, 3.0 mM, 5.0 mM, 295.6 mM, 8.4 mM, 2.0 mM 및 1.0 mM이었다. 각 코팅층 시료(10 mm × 10 mm × 2 m)를 10 ㎖의 2×SBF 내에 침지한 다음 다른 기간(1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28 일) 동안 37℃에서 배양하였다. 각 시간에서, 시료를 취하여 탈이온수로 세척한 다음 건조시켰다. 아파타이트 형성에 따른 시료의 중량 변화를 측정하였다. 또한, 시료의 표면 모폴로지 및 화학적 결합 구조의 변화를 각각 SEM, XRD 및 FT-IR로 분석하였다. 분석 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 순수한 키토산(CH)이 3일째에 증체량을 보이는 반면, 복합 코팅 조성물을 이용한 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-5BGn, CH-10BGn 및 CH-15BGn)은 1일째부터 증체량을 보였다. 이는, 표면 아민화 생체활성유리 나노입자 함량이 클수록 더 확연한 차이를 보였으며, 증체량은 코팅층 상에 아파타이트 미네랄의 증착에 의한 것으로 생각된다.

또한, 도 11a에 나타난 바와 같이, 유사체액에 담지한 동안의 시료의 표면 모폴로지를 관찰하였다. 모폴로지는 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-10BGn)을 대표표본으로 나타내었다. 1일째, 몇몇 미네랄 조각을 확인할 수 있었으며, 3일째에 거의 모든 표면에서 관찰되었다. 그리고 14일째에는 현저히 커진 결정 크기로 미네랄화하였다. 고배율의 미네랄 상은 생체모방성 미네랄화된 아파타이트에서 관찰되는 나노결정의 면체구조를 나타내었다.

도 11b에 나타난 바와 같이, 2θ=32°에 주 아파타이트 피크는 침지 시간 증가와 함께 날카롭고 더 강하게 나타났다.

또한, 도 11c에 나타난 바와 같이, FT-IR 스펙트라도 침지 후 아파타이트와 관련된 피크(596 cm^-1; v ₂ P-O bending, 957 cm^-1; v ₁ P-O 및 1018 cm^-1; v ₃ P-O 신축)를 나타내었으며, 침지 시간에 따라 밴드 세기도 증가하였다. 더 나아가, 874 cm^-1 및 1400 cm^-1 밴드에서 아파타이트 결정 라틱스 내에 카보네이트기의 결합을 의미하는, CO₃ ² ^-의 v ₂ C-O 및 v ₃ C-O 신축 진동 모드를 확인하였다.

상기와 같은 분석 결과, 표면 아민화 생체활성유리 나노입자(BGn)는 용액의 과포화를 가속화하는 이의 이온성 방출 특성 때문에, 칼슘 및 포르페이트 이온의 침전으로 발생하는 유사체액 내에 아파타이트 형성 향상에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 또한, 순수한 키토산(CH) 코팅도 키토산-생체활성유리 복합 코팅(CH-BGn)에 비하여 아파타이트 형성 속도가 낮았으나 시간에 따라 아파타이트 형성을 나타내었다. 이는, 키토산 내에 높은 양전위 아민기가 배지 내에 미네랄 형성으로 이어지는 포스페이트 이온을 수반하는 칼슘이온을 끌어당긴 결과로 볼 수 있다. 따라서, 상기 복합 코팅(CH-BGn) 내에 가속화된 미네랄화는 배지 내에 표면 아민화 생체활성유리 나노입자(BGn)으로부터 방출된 칼슘 이온의 농축 또는 과포화 그리고 이온성 침전의 결과로 볼 수 있다.

실험예 3: 세포 증식 및 골형성 분화 분석

상기 실시예 2)의 키토산 코팅층(CH, 대조군) 및 키토산-생체활성유리 복합 코팅층(CH-10BGn) 그리고 티타늄 기판(Ti, 비교군)의 생체외 세포 성장 및 골형성 분화에 대한 효과를 확인하기 위하여, 세포 테스트를 수행하였다.

먼저, 세포 성장 분석을 위하여, 각각의 상기 시료(CH, CH-10BGn 및 Ti)를 70% 에탄올로 살균하고 24-well plate의 각 well에 넣었다. 전조골 세포(pre-osteoblastic cell)(MC3T3-E1; American Type Culture Collection(ATCC), USA)를 각각의 시료 상에 2 × 10⁴ 세포로 도말한 다음, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 10% 우태아 혈청(FBS; Gibco)으로 보충된 α-최소 필수 배지(α-MEM; Gibco, USA) 내에서 37℃, 5% CO₂/ 95% 대기 하에서 배양하였다. 1, 3 및 7일 배양 후, 세포 증식 수준을 세포 계수 키트(CCK-8, Dojindo, Japan)를 통해 평가하였다. 또한, 2.5% 글루타르알데히드 내에 세포를 고정시키고, 상승 농도(50, 70, 90 및 100%)의 에탄올로 탈수시킨 다음 금으로 코팅한 후 시료 상에서의 세포 모폴로지를 관찰하였다. 실험 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, CH 또는 CH-10BGn에 배양된 Mc3T3-E1 세포는, 세포질 공정 활성으로 상기 CH 및 CH-10BGn에 잘 부착되었으며, 용이하게 분산되었다. 또한, 상기 CH 및 CH-10BGn에 세포 성장은 배양기간 동안 계속적인 증가를 보였으며, 이를 통하여 상기 CH 및 CH-10BGn이 우수한 세포 생존능으로 유용한 세포 성장 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 골형성 분화 확인을 위하여, 콜라겐 타입 I(Col I), 알칼리 포스파타제(ALP), BSP(bone sialoprotein), OPN(osteopontin) 및 OCN(osteocalcin)을 포함하는 골 관련 유전자의 발현 평가를 실시하였다. 7일 및 14일 동안 배양 후, 총 RNA를 RNeasy Mini kit(Qiagen, South Korea)를 이용하여 세포로부터 추출하였다. 2 ㎍의 총 RNA를 역전사 효소(RT) 반응을 수행하기 위하여 사용하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 Rotor-Gene 3000 spectrofluorometric thermal cycler(Corbett Research, Australia) 내에서 SYBR Green PCR kit(Quantace, GCbiotech, Netherlands)를 사용하여 수행하였다. PCR을 수행한 후, 내부 대조물질로서 사용되는 β-액틴 대비 다른 유전자의 능력을 측정하기 위하여 Ct 값을 사용하였다(ΔCt = Ct 유전자 - Ct β-액틴). 그 다음 각 시료 내 mRNA를 상대적인 ΔΔCt(ΔCt 유전자 - ΔCt β-액틴) 값으로 계산하였다. 센스 및 안티센스 프라이머를 GenBank에서 입수 가능한 공개된 cDNA 서열에 따라 설계하였다. 각각의 측정은 3회 반복하여 수행하였다. 분석 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, 유전자 발현이 7일에는 비교적 낮은데 반하여, 14일에는 CH-10BGn에서 높게 조절되었음 을 확인하였다. 콜라겐 타입 I(Col I)를 제외한 모든 다른 유전자(ALP, BSP, OPN 및 OCN)에서는 CH-10BGn이 비교군(Ti) 및 대조군(CH)에 비하여 현저하게 높은 유전자 발현을 나타내었다.

상기의 실험 결과, 표면 아민화 생체활성유리 나노입자(BGn)의 첨가는 빠른 세포 성장(증식)보다는 주로 골형성 분화를 활발하게 하는 효과가 있음을 확인하였다. 몇 주의 배양기간 동안 코팅층은 시간이 지남에 따라 분해되었다(도 9). CH 외에 CH-BGn의 BGn으로부터 녹아서 분리된 칼슘 및 실리콘과 같은 이온성 생성물은 골형성 향상에 기여하였다. BGn의 첨가 또는 BGn으로부터 분리된 이온은 하나의 골아세포 또는 중간엽줄기세포 내의 유전자 발현, 단백질 합성 및 미네랄 형성을 포함하는 골형성 분화를 상당히 촉진시켰다.

실험예 4: 약물 전달층의 약물 전달 및 항균 효과 분석

상기 실시예 3)에서 제조한 약물 전달층 샘플(CH(high Amp), CH-10BGn(low Amp) 및 CH-10BGn(high Amp))의 Na-ampicillin 방출 테스트를 실시하였다. 방출 테스트는 pH 7.4, 37℃의 PBS 중에서 수행하였다. 각각의 샘플을 10-11주까지 다른 시간 동안 PBS 중에서 배양하였다. 각 시점에서, 시료를 취하여 방출된 Na-ampicillin이 포함된 용액을 Libra S22 apparatus(Biochrom, UK)를 사용하여 UV-vis 분광법으로 특징적인 파장인 230 nm에서의 흡광도 변화를 모니터링하여 분석하였다. 일련의 표준 Na-ampicillin 용액이 함유된 탈이온수(10-100 ㎍/ml)을 제조하여 하기 Beer's law 수학식 1을 이용하여 선형 보정 곡선(R² = 0.99)을 얻었다.

[수학식 1]

A = abc

상기 식에서, A는 흡광도, a는 흡광계수로서 알려진 상수, c는 농도, b는 세포 배스 길이(상수)를 나타낸다.

분해 생성물의 임의의 가능한 간섭을 제거하기 위하여, 약물-용출 기간과 동일한 배양 시간에 Na-ampicillin이 없는 코팅으로부터 얻은 용액을 회수하여 UV-분광 분석을 위한 공용액을 제조하였다.

또한, CH-10BGn으로부터 방출된 Na-ampicillin의 항균 효과를 스트렙토코커스 변이주(Streptococcus mutants)(ATCC, USA)에 대하여 한천 확산 테스트를 수행하여 조사하였다. Na-ampicillin을 포함하거나 포함하지 않은 코팅 시료(CH-10BGn(with Amp) 및 CH-10BGn(free Amp))를 사용하였다. 스트렙토코커스 변이주 100 ㎖를 한천 플레이트 상에 직접 도말한 후 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 각 시료를 상기 한천 플레이트 상에 배치한 뒤, 코팅층으로부터 방출된 Na-ampicillin에 의해 형성된 억제 영역을 24시간 간격으로 5일까지의 관찰하였다. 상기 약물 방출 시험 및 항균 효과 분석 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14a에 나타난 바와 같이, 초기 각 약물 전달층 샘플(CH(high Amp), CH-10BGn(low Amp) 및 CH-10BGn(high Amp))로부터 약물 방출 패턴은 완만하였으며, 11주까지 지속적으로 높은 지효성을 나타내었다. 11주가 실험기간 중 최대 수치임에도 불구하고, 11주에 지속적인 방출 패턴은 이 실험기간을 초과하여 방출이 지속적일 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 약물 전달층은 거의 일정한 방출 속도로 장기적인 방출을 위한 약물 전달층으로 유용하게 적용할 수 있다.

한편, 본 발명의 약물 전달층(CH-10BGn(low Amp) 및 CH-10BGn(high Amp))는 대조군인 CH 약물 전달층과 비교하여, 높은 약물 방출 효과를 보였다. 도 14 a의 방출 패턴은 초기 14일까지 선형 단계 그리고 그 이후 포물선 유사 단계인 두 단계의 패턴을 나타내었다. 따라서, 더 정확한 확인을 위하여, 상기 패턴에 따른 파라미터(방출속도 상수 및 방출 지수)를 계산하였다. 첫 번째 선형 단계는 zero-order 모델인 하기 수학식 2를 통하여 계산하였으며, 두 번째 포물선 유사 단계는 Riteger-Peppas empirical equation인 하기 수학식 3을 통하여 계산하였다.

[수학식 2]

[수학식 3]

상기 수학식 2 및 수학식 3에서, M_t 및 M_∞는 각각 시간 t 및 무한 시간(∞)에서의 방출된 약물의 절대량, K₀ 및 K는 각 식에서 약물 전달 장치의 구조적 및 기하학적 특성이 반영된 방출 속도 상수 그리고 n은 약물 방출 매카니즘을 의미하는 방출 지수이다. 도 14a의 방출 패턴 곡선으로부터 계산된 파라미터들은 하기 표 1에 나타내었다.

구분	CH(high Amp)	CH-10BGn(low Amp)	CH-10BGn(high Amp)
K₀	2.82	3.38	4.16
K	17.5	22.6	35.2
n	0.44	0.37	0.38

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 초기 단계는 0.99 보다 낮은 R² 수치로 선형을 나타내었으며, 두 번째 단계 또한 CH(high Amp), CH-10BGn(low Amp) 및 CH-10BGn(high Amp) 각각 0.44, 0.37 및 0.38의 강한 방출 지수를 나타내었다.

또한, 도 14b에 나타난 바와 같이, Na-ampicillin을 함유한 CH-10BGn은 실험 1일이 지난 시점(24시간)에 항균효과가 나타났으며, 5일까지 유지되었다. 그러나, 약물을 함유하지 않은 CH-10BGn에서는 항균 효과를 확인할 수 없었다.

Claims

1) 키토산 용액을 용매에 분산시키고 표면 아민화 생체활성유리 나노입자를 첨가하여 키토산-생체활성유리 복합 용액을 제조하는 단계;
2) 상기 키토산-생체활성유리 복합 용액에 약물을 첨가하여 약물 함유 복합 코팅 조성물을 제조하는 단계; 및
3) 상기 복합 코팅 조성물을 임플란트 표면에 전기영동증착하여 약물 전달층을 제조하는 단계를 포함하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는,
PEG 템플레이트 용액을 제조하고, 질산칼슘을 첨가하여 질산칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 TEOS 용액을 첨가하고 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계;
상기 반응 생성물을 원심분리하고 세척 및 소성하여 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 생체활성유리 나노입자를 용매에 첨가하고 분산시킨 후 APTES을 첨가하고 환류시키는 단계를 통하여 제조되는 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 표면 아민화 생체활성유리 나노입자는 실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)을 85:15의 몰 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 키토산 용액은 키토산을 아세트산 또는 염산 용액에 용해시킨 것인 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 용매는 에탄올과 물을 부피비로 1:1 내지 1:9로 혼합한 공-용매인 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 복합 코팅 조성물은 pH 3.1 내지 pH 3.6 범위인 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제6항에 있어서, 상기 pH는 아세트산 또는 수산화나트륨으로 조절하는 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 전기영동증착 처리는 20 V 내지 80 V의 직류전압으로 5분 내지 10분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 약물은 항생제, 항염증제, 항암제 또는 골분화 약물인 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 약물 전달층의 두께는 2 ㎛ 내지 50 ㎛인 것을 특징으로 하는,
약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법.

제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 임플란트를 포함하는 생체 이식용 임플란트 조성물.