CN114366849B

CN114366849B - 骨修复材料及其制备方法和应用

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Publication number: CN114366849B
Application number: CN202111486317.7A
Authority: CN
Inventors: 吴钊英; 赵蒙恩; 张超
Original assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Shenzhen Campus
Current assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Shenzhen Campus
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN114366849A

Abstract

本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及骨修复材料及其制备方法和应用，所述骨修复材料包括基材、覆盖在所述基材表面的生物玻璃涂层，所述生物玻璃涂层负载有抗菌药物。本发明通过在基材表面覆盖生物玻璃涂层，并负载抗菌药物，使得骨修复材料表面的亲水性、表面能、蛋白质吸附得到了显著的提升，提高骨修复材料表面的抗菌、抗感染性能，显著抑制细菌生长；同时促进rBMSC的粘附、增殖、分化和成骨相关基因表达，在体内显著促进新骨再生，与周围新骨形成良好的骨性结合，并防止感染的发生。涂层表面负载溶菌酶兼具优异的抗菌和成骨双重生物功能，在骨修复材料领域有广泛的应用前景。

Description

骨修复材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及骨修复材料及其制备方法和应用。

背景技术

因多种骨疾病(如骨髓炎、骨肿瘤等)和外界创伤而导致的承重骨缺损，其修复与功能重建需要兼具优异力学性能、促成骨性能的骨修复材料。骨修复材料的表面性质(粗糙度、亲水性、表面能及蛋白质吸附)、化学组成等，明显影响其细胞响应能力、促成骨能力。当骨修复材料植入体内，应当促进新骨再生，并与周围新生骨形成骨整合，实现其早期负载和长期稳固；此外，理想的骨修复材料还应具有良好的抗菌抗感染功能，抑制细菌粘附于其表面，维持骨性结合界面，以实现植入物的长期稳定，植入体内可与新生骨形成骨整合并预防感染的发生。

PEKK(聚醚酮酮)具有良好的力学性能以及生物相容性，其弹性模量与人骨接近，然而其呈生物惰性，很难促进新骨形成，植入体内很难与周围骨组织形成骨整合，植入后易松动甚至失效。PEKK自身无抗菌活性，而许多学者研究发现：骨植入材料植入失败的关键因素之一是其不具备抗菌、抗感染性能。感染的发生将损害植入物与宿主骨的紧密结合界面，会造成植入物的松动，最终导致植入物失效。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种骨修复材料，具有优良的抗菌、抗感染性能，以及优异的成骨能力。

同时，本发明还提供所述骨修复材料的制备方法和应用。

具体地，本发明采取如下的技术方案：

本发明的第一方面是提供一种骨修复材料，包括基材、覆盖在所述基材表面的生物玻璃涂层，所述生物玻璃涂层负载有抗菌药物。

一般的骨修复基材的表面并无抗菌性，可能导致植入体周围感染的发生以及最终失效，同时基材与抗菌药物之间的结合力有限，无法负载高含量的抗菌药物，使得骨修复材料的抗菌效果不佳。本发明通过在基材表面覆盖生物玻璃涂层，并利用生物玻璃涂层来负载抗菌药物，能够提高抗菌药物在骨修复材料中的负载量，并实现对抗菌药物的缓释；同时生物玻璃化学组成与骨相似，自身具有优异的成骨性能，可与宿主骨形成键合，也具有一定的抗菌活性，可提高骨修复材料的成骨能力和抗菌、抗感染能力。

在本发明的一些实施方式中，所述基材包括聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮酮 (PEKK)及其复合材料中的至少一种。聚醚醚酮、聚醚酮酮具有优良的热性能、尺寸稳定性、机械性能和生物相容性，很适合作为骨修复材料的基材。

在本发明的一些实施方式中，所述聚醚醚酮、聚醚酮酮的复合材料包括聚醚醚酮/钽复合材料、聚醚酮酮/钽复合材料。钽是一种促成骨性能良好的亲生物金属，具有良好的耐腐蚀、优异的生物相容性及成骨活性。同时，钽也可以为基材提供导电性，使基材能够通过电泳沉积的方式在表面形成生物玻璃涂层以及负载抗菌药物。

其中聚醚醚酮(或聚醚酮酮)与钽可通过共混、成型的方式制备得到，即，将钽粉与聚醚酮酮(或聚醚酮酮)共混，通过冷压烧结成型制备得到。其中钽粉为微米级钽粉，钽粉在复合材料中的体积比为20％～50％，优选20％～40％。

在本发明的一些实施方式中，所述生物玻璃涂层的化学组成包括CaO-SiO₂、 ZnO-CaO-SiO₂中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述生物玻璃涂层的厚度为200～500nm。

在本发明的一些实施方式中，所述生物玻璃涂层包括纳米生物玻璃颗粒，所述纳米生物玻璃颗粒具有孔道结构。所述纳米生物玻璃颗粒的粒径为200～ 400nm，孔道大小为1～10nm。纳米生物玻璃颗粒存在孔道，且集中在介孔范围，以及纳米生物玻璃颗粒与相邻纳米生物玻璃颗粒之间形成的缝隙均可用于容纳抗菌药物。

在本发明的一些实施方式中，所述抗菌药物包括溶菌酶、抗菌肽中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述抗菌药物可通过电泳沉积的方式负载到生物玻璃涂层的表面。研究发现，相比浸渍吸附法或其他负载方法，在表面通过电泳沉积方法能够提高抗菌药物在生物玻璃表面的搭载量，同时使其表现出缓释行为。

在本发明的一些实施方式中，抗菌药物在生物玻璃涂层的质量含量为2～ 10％。

本发明的第二方面是提高上述骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：

在基材的表面覆盖生物玻璃涂层；使抗菌药物负载于所述生物玻璃涂层，得到骨修复材料。

在本发明的一些实施方式中，所述在基材的表面覆盖生物玻璃涂层的步骤具体为，将基材浸泡在生物玻璃的悬浮液中，通过电泳沉积的方式在基材的表面形成生物玻璃涂层。

在本发明的一些实施方式中，所述生物玻璃的悬浮液的浓度为0.5～5g/mL，优选0.5～2g/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述使抗菌药物负载于所述生物玻璃涂层步骤具体为，将表面覆盖有生物玻璃涂层的基材浸泡在抗菌药物的溶液中，通过电泳沉积的方式在生物玻璃涂层中负载抗菌药物。

在本发明的一些实施方式中，所述抗菌药物的溶液的浓度为5～20g/mL，优选5～15g/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述在基材的表面覆盖生物玻璃涂层，以及使抗菌药物负载于所述生物玻璃涂层步骤中的电泳沉积采用的电压独立为10～30 V，优选15～25V；沉积时间独立为1～5min，优选1～3min。

本发明的第三方面是提供所述骨修复材料在制备骨板、骨钉、额面、颅脑肋骨、人工关节、椎骨植入物等骨科植入物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明通过在基材表面覆盖生物玻璃涂层，并负载抗菌药物，使得骨修复材料表面的亲水性、表面能、蛋白质吸附得到了显著的提升，提高骨修复材料表面的抗菌、抗感染性能，显著抑制细菌生长；同时促进骨髓间充质干细胞rBMSC 的粘附、增殖、分化和成骨相关基因表达，在体内显著促进新骨再生，与周围新骨形成良好的骨性结合，并防止感染的发生。涂层表面负载溶菌酶兼具优异的抗菌和成骨双重生物功能，在骨修复材料领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1为PT40、MBGN和LY的FTIR光谱(a)和XRD图谱(b)，*为PEKK 的特征峰，^为Ta的特征峰，●为生物玻璃的特征峰；LY的负载效率(c)以及释放曲线(d)；

图2为PT40(a，d)，MBGN(b，e)和LY(c，f)在不同放大倍数下的 SEM图像，以及PT40(g)，MBGN(h)和LY(i)的EDS光谱；

图3为PT40、MBGN与LY的水接触角(a)和二碘甲烷接触角(b)；Owens 双液法测定PT40、MBGN和LY的总表面能(c)；5mg/mL BSA和30μg/mL Fn 溶液中PT40、MBGN和LY对蛋白质的吸附(d)；测定PT40、MBGN和LY 在SBF中浸泡0.5、1、3、5、7、10和14天后的pH值(e)(*表示p<0.05，与PT40相比)；

图4为从PT40、MBGN和LY表明分离出来的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落，涂布在琼脂板上的照片(a)；以及PT40、MBGN和LY上大肠杆菌(b) 和金黄色葡萄球菌(c)数量的减少百分比(*表示p<0.05，与PT40相比)；

图5为与rBMSC细胞培养后第1天(a，b，c)和第3天(d，e，f)，PT40 (a，d)，MBGN(b，e)和LY(c，f)上rBMSC的细胞骨架形态和分布的 CLSM照片；

图6为不同时间培养的rBMSC细胞粘附率(a)、OD值(b)和ALP活性 (c)(*代表p<0.05，**代表p<0.01，与PT40比较；#代表p<0.05，与MBGN 比较)；

图7为培养后不同时间样品rBMSC的Runx2(a)、ALP(b)、OPN(c) 和OCN(d)的成骨基因表达(*代表p<0.05，**代表p<0.01，与PT40比较； #代表p<0.05，与MBGN比较)；

图8为植入后14天拍摄的含有植入物(PT40，MBGN，LY)的大鼠股骨的 X射线图像(a)；第14天从PT40，MBGN，LY表面分离出的细菌在琼脂板上的培养照片(b)和大肠杆菌球菌菌落的减少百分比(c)(n＝3，*与PT40相比 p＜0.05；**与PT40相比p＜0.01)；

图9为植入后4周(a，c，e)和12周(b，d，f)的骨植入样品(PT40(a， b)，MBGN(c，d)和LY(e，f))的SRμCT二维重建图像；

图10为体内植入后第4周和第12周(PT40、MBGN和LY)不同放大倍数下的组织学图像，其中NB代表新骨，M代表植入材料；

图11为股骨髁缺损植入PT40、MBGN和LY样品4周和12周后骨-材料接触率(a)以及推出强度(b)的定量分析(*代表p<0.05，**代表p<0.01，与 PT40比较；#代表p<0.05，与MBGN比较)。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中所用的原料，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到；所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。

实施例1

(1)基材制备

将微米级钽粉与聚醚酮酮共混，通过冷压烧结成型，制备出PEKK/Ta复合材料作为骨修复材料的基材，标记为PT40。其中钽粉在PT40中的体积含量为 40％。

(2)电泳沉积生物玻璃涂层

将PEKK/Ta复合材料贴在一个电极片上，浸泡在生物玻璃的悬浮液(生物玻璃的化学组成为ZnO-CaO-SiO₂，由溶胶凝胶法制得，在悬浮液中的浓度约 1g/mL)中，进行电泳沉积(沉积电压：20V，沉积时间：2min)，在PEKK/Ta 复合材料的表面形成生物玻璃涂层。将电泳沉积结束后得到的材料标记为 MBGN。

(3)负载溶菌酶

称量10.0mg溶菌酶溶于少许去离子水中，并转移到10mL的容量瓶中用水定容至10mL，制得1mg/mL的溶菌酶水溶液。用移液枪依次吸取2、20、200、 400、1000、1500、1700μL置于各自的2mL容量瓶中，加水至刻度线，配成1、 10、100、200、500、750、850μg/mL的标准溶液，用酶标仪(Multiskan Spectrum， Thermo Scientific)测试溶液在280nm的光密度，得到溶菌酶在水溶液中的标准曲线。

配置溶菌酶的水溶液(10g/mL)，将MBGN浸泡在溶菌酶的水溶液中，进行电泳沉积(沉积电压：20V，沉积时间：2min)，在MBGN的生物玻璃涂层中负载溶菌酶，将得到的材料标记为LY。通过标准曲线计算出溶菌酶的负载效率。

对比例1

本对比例相较实施例1将步骤(3)中的电泳沉积方法替换为普通的浸泡吸附法。

具体地，本对比例按照如下方法制得骨修复材料：

将按照实施例1的步骤(1)和(2)制备得到的MBGN泡入溶菌酶的水溶液(10g/mL)，浸渍吸附2分钟，得到骨修复材料。

结构和性能测试：

一、理化性能

(1)FTIR谱图及XRD分析

PT40、MBGN和LY的FTIR及XRD分析如图1的a、b所示，图中*为PEKK 的特征峰，^为Ta的特征峰，●为生物玻璃的特征峰。结果显示：相较PT40， MBGN和LY中的PEKK的特征峰基本消失，这是由于表面的生物玻璃涂层的存在导致的，生物玻璃涂层掩盖了基底PEKK，故只显示生物玻璃的红外特征峰。 XRD显示生物玻璃为无定型结构，其结晶程度很低，在体内可以与周围体液快速进行离子的缓释，具有优异的成骨活性。此外，溶菌酶由于含量较低，因此其特征峰并未显示。

图1的c、d为溶菌酶通过不同方法(传统的浸渍吸附以及电泳沉积EPD) 负载至MBGN上的负载效率与释放曲线，可见EPD法的负载效率显著高于传统的浸渍涂覆的负载效率，且EPD法负载的溶菌酶在PBS水溶液的释放表现为缓释，而传统的浸渍涂覆的LY则在最初表现出突释。

(2)SEM及EDS分析

通过SEM观察可知，在制备生物玻璃涂层前，基材PT40中的Ta均匀地分布在PEKK中，提供了良好的导电性。制备生物玻璃涂层后，样品表面为均匀的生物玻璃涂层，涂层均一，而且没有裂纹；而且生物玻璃涂层由规则排列的纳米生物玻璃颗粒组成。通过EDS结果可知制备生物玻璃涂层后，Ta的特征峰消失，生物玻璃覆盖在材料表面。负载了溶菌酶后，材料表面形貌及EDS元素分析相较MBGN没有显著变化。

(3)亲水性，表面能，蛋白质吸附分析，离子释放，pH分析

测试方法：通过接触角测定仪测量样品表面的水接触角和二碘甲烷接触角，按照Owens两液法计得到样品的表面能；用BCA试剂盒(皮尔斯生物技术有限公司，美国)测定材料表面的蛋白质吸附能力；将PT40、MBGN以及LY分别浸泡在10mL SBF溶液(模拟体液)中，分别于不同时间点(0.5天、1天、3 天、7天、10天和14天)测量溶液的pH值。测试结果如图3所示。

图3a、b显示了PT40、MBGN与LY三种样品的水接触角、二碘甲烷接触角，结果显示制备生物玻璃涂层后，材料的亲水性有了显著的提升。负载溶菌酶前后，材料表面水接触角以及二碘甲烷接触角没有发生明显变化。此外，图3c 显示，制备生物玻璃涂层后，材料的表面能也有了显著的提高，而MBGN和LY 两者之间的表面能没有显著差异。图3d显示了蛋白质(牛血清白蛋白BSA和纤维连接蛋白Fn)在三种样品上的吸附，结果显示制备生物玻璃涂层后，材料表面的蛋白吸附有了显著的提升，这对于后续的细胞粘附、锚定有着积极的作用。

图3e显示了将PT40、MBGN和LY浸泡在SBF中，pH值随时间的变化。在PT40中未观察到pH值的显著变化(在pH＝7.4时近似稳定)，而对于MBGN (约pH＝7.7)和LY(约pH＝7.8)，pH值随时间逐渐升高，并在10天后趋于稳定，其中MBGN的稳定pH约为7.7，LY的稳定pH约为7.8，均表现为弱碱性。而已有的研究表明，弱碱性的环境对细胞的粘附、增殖、分化有积极作用。

二、体外抗菌性能

通过细菌平板计数法测定PT40、MBGN或LY的抗菌活性，结果如图4所示。图4a显示细菌在材料表面培养24小时后，从PT40、MBGN和LY分离的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落在琼脂上的数码照片。在PT40上发现大量的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落，表明PT40无抑菌功能。然而，MBGN和LY的菌落数较少，表明它们具有有效的抗菌活性。

图4b、c显示了样品中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的减少百分比。与PT40 相比，MBGN对金黄色葡萄球菌的抑菌率为82.19％，对大肠杆菌的抑菌率为 80.47％。LY对金葡球菌的抑菌率为99.61％，对大肠杆菌的抑菌率为99.12％，证明LY具有优异的体外抗菌性能。

三、体外细胞相容性

测试方法：将rBMSC细胞(密度为10⁵个细胞/孔)与PT40，MBGN或LY 分别共培养不同时间后使用激光共聚焦(CLSM)观察材料表面的细胞形貌固定后的细胞样品，并采用CKK-8法检测PT40，MBGN或LY表面细胞的粘附率。

当PT40、MBGN或LY与rBMSC细胞共培养1、3、7天后，采用CKK-8 试剂盒测定rBMSC的增殖情况。测试PT40、MBGN或LY与rBMSC共培养7 天、10天、14天后，材料表面细胞的成骨向分化情况。为了测定成骨分化标志基因的表达，将rBMSC细胞(密度为10⁵个细胞/孔)在样品表面培养3天、7 天和14天后，采用RT-PCR技术检测成骨标志基因(包括Runx2、ALP、OPN 和OCN)的表达情况，其中RT-PCR测试的引物序列如下表1所示。

(1)细胞粘附

图5的CLSM图像显示了用FITC-Phalloidin和DAPI染色的样品上rBMSC 细胞的细胞核(蓝色)和细胞肌动蛋白(即骨架，绿色)的细胞骨架形态和分布。图5显示，第1天，MBGN和LY上的细胞有丝状突起，而PT40上的细胞无明显丝状突起。在第3天，MBGN和LY上的丝状足细胞和片状足细胞多于PT40，且MBGN和LY表面有大量细胞，而PT40表面的细胞数量则相对较少。

(2)细胞增殖、成骨向分化

图6a显示了培养不同时间后细胞的粘附率，由图可知在12小时三组之间无显著性差异，在24小时及以后，MBGN和LY表面有大量细胞粘附，相比于 PT40，粘附率更高，然而MBGN和LY两者之间无显著性差异。

图6b显示了培养不同时间后样品上rBMSC细胞的增殖情况(以OD值表示)。PT40、MBGN和LY细胞增殖随时间延长而增加。第1天、第3天和第7 天，MBGN和LY的细胞增殖显著高于PT40，不过两者之间无显著性差异。

图6c显示了培养7天、10天以及14天后样品上rBMSC细胞ALP活性的定量分析。PT40、MBGN和LY细胞的ALP活性随时间增加而升高，第10天和第14天，LY的ALP活性高于MBGN，MBGN的ALP活性高于PT40，表明与PT40相比，LY和MBGN能更好地刺激细胞的积极响应(粘附铺展、增殖与成骨向分化)。

图7(a～d)是细胞在PT40、MBGN和LY上的成骨基因(ALP、OPN、OCN和Runx2)表达，其中ALP、OPN、OCN和Runx2进行TRT-PCR测试的引物如表1所示。PT40、MBGN和LY上ALP、OCN和Runx2基因的表达随时间增加而增加。在第3天，所有样品的ALP、OPN、OCN和Runx2表达均无显著差异。在第7天，MBGN和LY的OPN、OCN和Runx2的基因表达高于PT40。第14天，LY的OPN、OCN和Runx2的表达高于MBGN，而MBGN中这些基因的表达高于PT40。因此相比于PT40，涂层MBGN后材可显著促进细胞的成骨向分化，负载LY后成骨分化的趋势进一步提升。

表1 RT-PCR测试的引物

四、体内抗感染性能评价

建立大鼠股骨髓内钉感染预防模型，将不同材料植入大鼠体内，植入后第 14天的大鼠股骨X线照片如图8a所示。从图中可以看出，PT40中显示出骨髓炎迹象，表现为明显的皮质骨破坏和骨膜反应。MBGN和LY的骨髓炎和骨膜反应较轻，表明MBGN和LY具有良好的抗感染作用。进一步取出植入物以评估其抗感染性能(图8b)，从PT40中分离出大量细菌，而MBGN和LY中发现的细菌明显较少。因此，MBGN和LY的抗感染活性明显高于PT40。图8c显示了体内样品中大肠杆菌的减少百分比，其中PT40无抗感染活性，MBGN对大肠杆菌的抑菌率为78.67％，LY对大肠杆菌的抑菌率分别为99.53％。

五、体内促进成骨和骨整合评价

测试方法：创建新西兰大白兔右侧股骨髁缺损模型，将PT40、MBGN和LY 作为植入体植入其中，在指定时间点(术后4周和12周)，用同步辐射显微CT (SRμCT)对骨缺损处的修复情况进行评价；在植入4周和第12周后，对股骨样品进行硬组织切片并进行VG染色，通过倒置显微镜观察新骨再生及骨整合情况，并通过Image Pro软件分析新骨组织-植入物接触率；使用万能材料试验机测试样品的推出强度。

统计学分析采用单因素方差分析(ANOVA)进行评估。本章中的定量数据均为至少三个独立实验测试结果的平均值±标准差。在*p<0.05，**p<0.01或 #p<0.05时，表明数据之间具有统计学上的显著差异。

(1)SRμCT分析

植入体周围新骨组织在植入不同时间后的二维重建图像(SRμCT)如图9 所示，图中NB代表新骨，M代表植入体材料。从图中可以看出，随着植入时间的增加，PT40、MBGN和LY周围新生骨的含量逐渐增加。植入4周和12周后， MBGN和LY植入体周围NB组织数量均高于PT40。LY组和MBGN周围的NB 无显著性差异，PT40组最低。可见相比于PT40，LY和MBGN的促成骨效果更好。

(2)组织学分析，植入体-骨接触率，推出强度评价

图10是植入不同时间后的组织学图像。在第4周和第12周，LY和MBGN 表面可见较多的NB组织，而PT40表面仅可见较相对少量NB组织。第12周时， PT40与NB界面仍有明显间隙，而NB组织与LY和MBGN接触更为紧密，骨整合良好。由此可知，相比于PT40，MBGN和LY促进新生骨再生及骨整合能力更强。

图11a显示了植入不同时间后植入体骨接触率(BIC)的定量分析。植入后 4～12周，PT40、MBGN和LY的BIC显著升高。第4周和第12周，MBGN和 LY的骨接触率显著高于PT40。在12周时，MBGN和LY的骨接触率没有显著性差异。

图11b显示了PT40、MBGN和LY在植入4周、12周后的推出强度。PT40、 MBGN和LY的推出强度从第4周到第12周增加。在植入后第4周和第12周， MBGN和LY的推出强度显著高于PT40。在12周时，MBGN和LY的推出强度没有显著性差异。证明了MBGN和LY具有优异的促进骨再生及骨整合性能。综上，Ta颗粒较均匀地分布PT40表面上，电泳沉积后，MBGN均匀地涂层在 PT40表面，涂层均一无裂纹，生物玻璃纳米颗粒均匀地分布在材料表面，通过电泳沉积进一步负载溶菌酶。

六、讨论

实施例1中，Ta颗粒较均匀地分布PT40表面上，电泳沉积后，MBGN均匀地涂层在PT40表面，涂层均一无裂纹，生物玻璃纳米颗粒均匀地分布在材料表面，通过电泳沉积进一步负载溶菌酶。

骨植入材料的亲水性表面可以促进细胞粘附与增殖的早期阶段。实施例1 中，由于含有MBGN微粒，MBGN的表面亲水性高于PT40。此外，MBGN和LY的亲水性无显著性差异，因为负载药物前后其表面形貌等没有发生显著性变化。

表面能是影响植入材料细胞响应的另一个表面特性，表面能高的表面会吸附更多的蛋白质。在生物微环境中，蛋白吸附有利于进一步吸引周围细胞。在实施例1中，由于纳米生物玻璃微粒的存在，MBGN和LY的表面能高于PT40。此外，与MBGN相比，LY的表面能无显著变化。可植入材料表面的蛋白质吸附有利于细胞的初始粘附/铺展和增殖，因为吸附的蛋白质作为配体发挥作用，与细胞的膜蛋白受体(如整合素)结合。在实施例1中，由于含有生物玻璃纳米颗粒， MBGN和LY的蛋白质吸附明显高于PT40。此外，与MBGN相比，LY的蛋白吸附无显著变化，因为两者的蛋白吸附能力接近。这些结果表明，将生物玻璃涂层覆盖在PT40表面并进一步负载溶菌酶可以改善表面性能(亲水性、表面能和蛋白质吸附)。

对于可植入材料而言，细菌可以很容易地附着在其表面上，定植产生细菌生物膜，从而引起炎症反应，最终导致植入失败。具有抗菌活性的植入材料可以抑制细菌感染，保证植入的长期稳定。在实施例1中，PT40没有抗菌活性，而电泳沉积生物玻璃涂层后，得到的MBGN会造成弱碱性微环境，因此MBGN具有较好的抗菌活性；而LY对金葡球菌和大肠杆菌都表现出卓越的抑菌性能，因为其不断地缓释出溶菌酶，溶菌酶的释放可以有效地抑制细菌的粘附。

细胞在植入物上的粘附和增殖通常取决于表面特征(例如表面形貌、亲水性、表面能和蛋白质吸附)。细胞在植入物表面的粘附和铺展是后续细胞增殖和分化的关键^[174]。实施例1中，间充质干细胞在MBGN和LY上的粘附优于PT40，而MBGN和LY两者无明显差异。rBMSC细胞在MBGN和LY上的增殖高于 PT40，而MBGN和LY两者无明显差异。与PT40相比，细胞在MBGN和LY 上的粘附和增殖的改善是由于表面含有生物玻璃纳米颗粒。

在实施例1中，MBGN和LY的Runx2、ALP、OPN和OCN表达显著高于 PT40，MBGN上rBMSC细胞成骨分化的改善是由于其表面含有生物玻璃颗粒，促进了细胞成骨向分化。

通过建立大鼠股骨髓内钉感染预防模型，评价PT40、MBGN和LY的体内抗感染特性。结果表明，与PT40相比，MBGN和LY的抗感染性能的提高是由于电泳沉积改性引入的生物活性涂层。此外，LY在体内抗感染性能的显著改善归因于溶菌酶的负载。由于LY不断缓释出溶菌酶，对细菌的生长起到了抑制作用，LY的抑菌率高于MBGN，因此LY的体外抗细菌性能与样品的体内感染性能一致。

由于LY纳米颗粒涂层的存在，LY和MBGN的新骨再生高于PT40，而 MBGN和LY两者无明显差异。

组织学图像显示在植入4周后，PT40与骨组织界面有明显的间隙，即无骨整合。相比之下，骨组织与MBGN和LY紧密结合，在第12周没有间隙，显示出良好的骨整合。在不同的植入时间内，用推出强度检测植入体的骨整合。与 PT40相比，MBGN和LY表现出较高的推出强度，表明涂层后形成了更好的促进骨整合。对于骨植入物来说，实现与宿主骨组织的紧密整合是至关重要的，这保证了植入体长期成功的骨整合质量。

材料的表面性质(如形貌、组成、亲水性)显著影响成骨细胞的响应以及植入体周围的骨再生和骨整合。在实施例1中，生物玻璃涂层改善了基材的表面性质，在体外激活rBMSC的反应中起着至关重要的作用，从而促进了体内骨再生和骨整合。此外，与PT40相比，MBGN和LY的存在进一步改善了表面性质，从而进一步促进了体外细胞反应以及体内骨再生和骨整合。LY不仅具有成骨生物活性，而且具有抗菌活性。

简而言之，在PT40表面制备生物玻璃涂层并负载溶菌酶后，形成了一种新型的LY可植入骨修复材料，材料表面的亲水性、表面能、蛋白质吸附得到了显著的提升，且在体外显著抑制细菌生长，其中LY对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率超过99％。MBGN和LY显著促进rBMSC的粘附、增殖、分化和成骨相关基因表达，在体内显著促进新骨再生，与周围新骨形成良好的骨性结合，并防止感染的发生。涂层表面负载溶菌酶兼具优异的抗菌和成骨双重生物功能，在预防感染的同时增强骨整合，在骨修复材料领域有广泛的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

中山大学.深圳

<120> 骨修复材料及其制备方法和应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacaatcgga atgagcccac ac 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtacttatcc cgcgccttca ccac 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacgatgatg acgacgacga tgac 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgtgctggc agtgaaggac tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagacaagtc ccacacagca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccagcagagt gagcagagag 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atccagccac cttcacttac acc 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggaccattg ggaactgata gg 22

Claims

1.骨修复材料，其特征在于：所述骨修复材料包括基材、覆盖在所述基材表面的生物玻璃涂层，所述生物玻璃涂层负载有抗菌药物；所述抗菌药物通过电泳沉积的方式负载到生物玻璃涂层的表面。

2.根据权利要求1所述的骨修复材料，其特征在于：所述生物玻璃涂层的厚度为200～500 nm。

3.根据权利要求1所述的骨修复材料，其特征在于：所述生物玻璃涂层包括纳米生物玻璃颗粒，所述纳米生物玻璃颗粒具有孔道结构。

4.根据权利要求3所述的骨修复材料，其特征在于：所述纳米生物玻璃颗粒的粒径为200～400 nm，孔道大小为1～10 nm。

5.根据权利要求1～4任一项所述的骨修复材料，其特征在于：所述抗菌药物包括溶菌酶、抗菌肽中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的骨修复材料，其特征在于：抗菌药物在生物玻璃涂层中的质量含量为2～10%。

7.权利要求1～6任意一项所述的骨修复材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：在基材的表面覆盖生物玻璃涂层；使抗菌药物负载于所述生物玻璃涂层，得到骨修复材料。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述使抗菌药物负载于所述生物玻璃涂层的表面的步骤具体为，将表面覆盖有生物玻璃涂层的基材浸泡在抗菌药物的溶液中，通过电泳沉积的方式在生物玻璃涂层的表面负载抗菌药物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述电泳沉积中采用的电压为10～30V，沉积时间为1～5 min。

10.权利要求1～6任意一项所述的骨修复材料在制备骨板、骨钉、额面、颅脑肋骨、人工关节或椎骨植入物中的应用。