KR102117080B1

KR102117080B1 - 근적외선 레이저로 원격 제어가 가능한 항균성 임플란트 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102117080B1
Application number: KR1020180167219A
Authority: KR
Inventors: 오승한; 문경숙
Original assignee: 원광대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-06-01

Abstract

본 발명은 근적외선 레이저로 원격 제어가 가능한 약물 방출 임플란트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 근적외선 레이저 조사에 의한 금 나노입자의 광열효과를 나타내는 금이 스퍼터링 된 티타니아 나노튜브를 임플란트 표면에 제조하여 근적외선 레이저를 통해 항균 기능 및 약물 용출의 on-off가 가능한 항균성 임플란트 표면처리 기술에 관한 것으로, 약물의 방출 시간 및 기간을 조절하여 불필요한 투약을 방지하는 동시에 불필요한 투약으로 인한 부작용을 최소화할 수 있다.

Description

근적외선 레이저로 원격 제어가 가능한 항균성 임플란트 및 이의 제조방법{Antibacterial implant remotely controlled by near-infrared laser and preparation method thereof}

본 발명은 근적외선 레이저로 원격 제어가 가능한 항균성 임플란트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 티타늄 소재 표면에 형성된 티타니아 나노튜브 층에 금 나노로드가 스퍼터링 되고, 여기에 약물이 코팅된 형태의 임플란트를 제공함으로써 근적외선 조사에 의해 원격으로 약물의 방출을 제어할 수 있는, 근적외선 레이저 원격 제어가 가능한 항균성 임플란트, 임플란트 표면처리기술, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

치과용 임플란트는 손실된 치아를 대체할 수 있는 치과 재료로서 고정체(fixture), 지대주(abutment) 및 인공치아로 구성된다. 이들 구성성분 중 고정체는 구강 내 골에 직접 고정되어 임플란트에 인가되는 하중을 받아내는 중요한 역할을 한다. 실제 치아를 사용하다가 발생하는 임플란트의 후기 부작용은 임플란트 고정체에 주로 발생하는 임플란트 주위염에 의해 발생되며 임플란트를 다시 제거해야 하는 문제점이 발생한다.

임플란트 주위염의 원인으로는 여러 가지가 있고 이들 중 세균 감염에 의한 임플란트 주위염의 빈도수가 높다. 이러한 세균 감염을 방지하기 위하여 항균 약물, 레이저 및 오존 등의 살균법 등이 있으나 강한 보호막으로 작용하는 치태(dental plaque)내에 존재하는 다양한 세균들을 제거하기는 상당한 어려움이 있다. 세균 감염 방지 및 치료를 위해서는 항균물질 농도의 최적화 및 약물 방출의 지속성 등이 중요하다.

최근 국소적 약물전달 시스템의 개발이 활발한 것은 전신 약물치료에 비하여 항생제의 투여량이 10-100배 정도 적고, 항생제의 내성을 일으킬 가능성이 적으며, 원하는 부위로만 약물을 전달할 수 있다는 장점이 있기 때문이다. 그러나 국소적 약물전달 시스템은 약물 전달의 지속성이 제한적(저장된 약물이 전부 방출되는 시점까지)이고, 시간과 공간이 제어된 약물 전달 시스템 개발은 아직 미비하다.

한편, 한국등록특허 1,461,159호는 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물에 관한 것으로, 더 자세하게는 키토산 및 아민화 생체활성유리 나노입자의 혼합 용액을 제조하는 단계; 상기 키토산 및 표면 아민화 생체활성유리 나노입자의 혼합 용액에 약물을 첨가하여, 약물이 추가로 혼합된 혼합 용액을 제조하는 단계; 및 상기 약물이 추가로 혼합된 혼합 용액을 임플란트 표면에 전기영동증착하여 약물 전달층을 제조하는 단계를 포함하는 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물이 개시되어 있다.

또한, 한국등록특허 1,236,638호는 금속 지지체의 기공 내에 치료 화합물 또는 치료제를 담지시키고 상기 치료 화합물 또는 치료제가 일정한 기간에 걸쳐 외부로 방출되도록 구성되는 약물 전달용 임플란트 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 약물 전달용 임플란트 제조 방법은, (a) 금속 지지체를 치료 화합물 또는 치료제를 포함하는 용액에 침지시키는 단계; 및 (b) 상기 치료 화합물이 기공 내에 담지된 상기 금속 지지체에 압력을 가하여 압축시키는 단계; 를 포함하는 약물 전달용 임플란트 및 그 제조 방법이 개시되어 있다.

그러나 상기 문헌들은 임플란트에 약물을 처리하는 방법에 대해 개시하고 있을 뿐이며, 약물의 방출 시간 및 기간을 조절할 수 있는 기술에 대해서는 구체적으로 개시되어 있지 않다.

한편, 한국등록특허 1,778,698호는 감광성 나노복합체를 포함하는 투과막에 근적외선을 조사시 발생하는 부분적인 열에 의하여 투과막이 팽창되고, 또한 열에 의한 약물분포속도가 빨라져 약물을 환자의 체내에 빠르게 공급할 수 있는 새로운 약물 전달 시스템 개발에 관한 것이며, 또한, 공급시 약물의 양 및 시간 조절이 가능한, 금속 나노막대 및 덴드리머를 포함하는 감광성 나노복합체 및 이를 포함하는 약물 전달용 투과막, 및 이를 이용한 약물 전달 장치에 관한 것이다.

또한, 한국등록특허 1,819,713호는 금 나노로드를 함유하는 패치 조성물에 관한 것으로, 피부온도가 약 10℃ 상승하면 확장된 피부 모공을 통하여 약물 또는 기능성 화장료의 흡수력이 약 3배 이상 증가하는 점에서 패치 조성물을 이용해 근적외선 LED 광원을 이용하여 금 나노막대의 광열효과를 유도함으로써 평균 약 30℃의 피부 온도를 약 40℃까지 상승시켜 피부 내로의 유용성 물질의 전달효율을 증가시키는 효과를 용이하게 유도할 수 있는 금 나노로드를 함유하는 패치 조성물에 관한 것이다.

그러나 상기 문헌들은 금 나노로드에 근적외선을 조사시 발생하는 광열효과로 약물의 흡수량을 증가시키는 방법에 대해 개시하고 있을 뿐, 간단한 이온 플라즈마 코팅 기술을 이용하여 나노튜브 구조에 금 나노로드를 코팅하여 근적외선 레이저를 통해 항균 기능 및 약물 용출의 on-off가 가능한 항균성 임플란트 표면처리 기술에 대해서는 알려져 있지 않다.

이에 본 발명의 발명자는 이온 플라즈마 코팅 기술을 이용하여 나노튜브 구조에 금 나노로드를 코팅하여 근적외선 레이저를 통해 항균 기능 및 약물 용출의 on-off가 가능한 항균성 임플란트 표면처리 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 티타니아 나노튜브 표면에 이온 플라즈마 증착법을 통해 금을 스퍼터링하고 상기 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브 표면에 약물-고분자 물질을 코팅하여 항균성 복합체를 제조한 결과, 상기 복합체는 근적외선 조사시 금 나노입자의 광열효과에 의해 고분자 물질이 분해되면서 약물이 방출되고 약물의 방출 시간 및 기간을 조절할 수 있다는 점을 새로이 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 1,461,159호 한국등록특허 1,236,638호 한국등록특허 1,778,698호 한국등록특허 1,819,713호

본 발명은 이온 플라즈마 코팅기술을 이용하여 나노튜브 구조의 template를 기반으로 금 나노로드를 코팅하는 방법, 및 상기 방법을 통해 제조된 근적외선 레이저에 의해 광역학 및 광열효과를 통해 항균효과를 갖는 항균성 복합체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 약물-고분자 물질이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브를 함유하는 항균성 복합체, 및 상기 복합체를 제조하는 방법, 즉 티타늄 소재의 표면에 티타니아 나노튜브층을 형성시키는 단계; 이온 플라즈마 증착법으로 티타니아 나노튜브층 표면에 금을 스퍼터링하는 단계; 및 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브 표면을 약물-고분자 물질로 코팅하는 단계를 포함하는, 약물-고분자 물질이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브를 제조하는 방법을 제공함으로써, 약물의 방출 시간 및 기간을 조절할 수 있는 약물전달시스템(Drug Delivery System, DDS)을 제공한다.

본 발명에 따른 약물-고분자 물질이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브를 사용하는 경우, 근적외선 레이저를 조사했을 때 발생하는 금 나노로드의 광열효과를 기반으로 약물의 방출 시간 및 기간을 조절하여 불필요한 투약을 방지하는 동시에 불필요한 투약으로 인한 부작용을 최소화할 수 있다.

도 1은 약물-고분자 물질이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브의 제조공정의 모식도이다.
도 2는 (a) 100 ㎚ TiO₂ 나노튜브와 TiO₂ 나노튜브에 (b) 1분, (c) 3분 및 (d) 5분 동안 금 나노입자를 스퍼터링한 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 FE-SEM 이미지이다.
도 3은 금 스퍼터링 5분 후 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 (a) TEM 이미지 및 (b) EDX 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 금 스퍼터링 시간에 따른 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 확산 UV-Vis-NIR 분광광도계 스펙트럼이다.
도 5는 금 스퍼터링 시간에 따른 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 XPS 스펙트럼이다.
도 6은 TC농도가 2, 4 및 5 wt% 인 TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 나노튜브에서 배양된 hMSC의 배양 24시간 및 48시간 후의 FDA 염색 이미지와 생존 가능한 세포 수의 그래프이다.
도 7은 TC농도가 2, 4 및 5 wt% 인 TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 나노튜브에서 배양된 hMSC의 배양 24시간 및 48시간 후의 MTT 세포 독성 시험 결과 그래프이다.
도 8은 2 wt% TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 나노튜브에 NIR 레이저 조사 1분 후의 (a) 항균 한천 배지 확산 시험 결과 사진 및 (b) 사멸한 S. mutans 구역 지름 분석 결과 그래프이다.
도 9는 2 wt% TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 나노튜브를 마우스에 주입한 후 (a) 마우스 혈장의 TC 방출 시험 및 (b) NIR 레이저 조사 1분 여부에 따른 TC 방출량의 차이를 LC-MS/MS로 검사한 결과 그래프이다.

본 발명은 근적외선 레이저로 원격 제어가 가능한 약물 방출 임플란트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 약물-고분자 물질이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브를 함유하는 항균성 복합체, 및 티타늄 소재의 표면에 티타니아 나노튜브층을 형성시키는 단계; 티타니아 나노튜브층에 금을 스퍼터링하는 단계; 및 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브층에 약물-고분자 물질을 코팅하는 단계를 포함하는, 약물-고분자 물질이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 티타늄 소재의 표면에 형성된 티타니아 나노튜브층; 상기 티타니아 나노튜브층에 스퍼터링된 금 나노로드 및 금 나노로드 티타니아 나노튜브층을 코팅한 약물-고분자 물질을 포함하는 항균성 복합체에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 “티타니아”(titania)는 티타늄의 산화물을 말한다.

본 발명의 일 양태에서, 금 나노로드는 흡수 피크 파장이 400 ㎚에서 1,200 ㎚까지의 영역 내에 존재할 수 있으며, 상기 파장 범위의 전자파가 조사되면 플라스몬 흡수라 불리는 광의 흡수현상을 일으켜 자기발열할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 약물-고분자 물질에서 약물은 항생제일 수 있다. 또한, 목적에 따라 항생제 이외에도, 소염제, 진통제, 항암제, 항당뇨약, 심혈관질환 치료제, 고지혈증 치료제, 대사증후군 치료제, 정신신경용제, 중추신경용제, 정장제, 진해거담제, 소화성궤양용제 및 안과용제 등의 약물이 추가로 로딩될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니고, 치료목적에 따라 다양한 약물이 선별적으로 로딩될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 테트라사이클린, 아미노글리코사이드계 항생제, 마크로라이드계 항생제, 베타 락탐계 항생제, 암포테리신, 폴리믹신, 반코마이신, 리팜핀, 퀴놀론계 항생제, 설파계 항생제 및 피리메타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항생제 또는 2종 이상이 혼합된 형태로 로딩될 수 있으며, 특히 치과용 임플란트에 로딩되는 경우 임플란트 수술 후 항생제의 용출이 필요한 시기에 근적외선 등을 조사하여 약물이 방출되도록 함으로써 원하는 치료효과를 얻을 수 있고, 치료 스케쥴에 맞는 맞춤식 약물치료가 가능하다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 약물-고분자 물질은 약물-생분해성 고분자 복합체일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 약물-생분해성 고분자 복합체를 사용하는 경우, 생분해성 고분자가 서서히 생분해되면서 약물을 서서히 방출시킬 수 있어 보다 바람직하다.

본 발명의 일 양태에서, 생분해성 고분자로는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리락타이드 카프로락톤, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 지방족 폴리에스테르, 셀룰로오스, 리그닌, 전분, 알긴산, 바이오 폴리에스테르, 바이오 셀룰로오스, 다당류, 폴리아민산 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 폴리락트산을 사용할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 근적외선 레이저 조사 시 금 나노로드의 광열효과에 의해 표면의 모든 물질들을 떼어낼 경우 한꺼번에 다 용출되어도 생분해성 고분자가 약물을 코팅하고 있기 때문에 용출된 약물이 무작위로 이동하지 않고 원하는 부위에 생분해성 고분자와 함께 지속적으로 존재하게 된다. 그리고 폴리락트산과 같은 생분해성 고분자는 이미 검증된 생분해성 고분자이므로 인체 내에 용출되어도 서서히 분해되며 인체에 무해하다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 약물은 근적외선 조사에 의해 방출될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 금 나노로드의 종횡비에 따라 광열효과를 나타내는 파장이 변화하므로, 사용할 파장에 적합한 종횡비를 가지는 금 나노로드를 합성하여 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 근적외선 레이저의 파장(830 ㎚)에 적합한 금 나노로드의 종횡비는 약 ~3.83으로 상기 값은 적절히 조정하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 복합체는 의료용 임플란트의 형태일 수 있고, 보다 구체적으로 치과용 임플란트의 형태일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 티타늄 소재의 표면에 형성된 티타니아 나노튜브층; 상기 티타니아 나노튜브층에 이온플라즈마 층착법을 통해 스퍼터링된 금 나노로드; 및 상기 금 나노로드가 스퍼터링된 티타니아 나노튜브층에 코팅된 약물-고분자 물질을 포함하는 항균성 복합체를 제조하였다(도 1 내지 도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 복합체에 제조에 있어서, 금 스퍼터링 조건을 확인한 결과, 5분 금 스퍼터링의 조건일 때 830 ㎚ 이상에서 가장 큰 흡수도를 나타내어 근적외선에서의 광열효과가 우수한 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 복합체의 세포증식 및 세포독성을 확인한 결과, 본 발명의 방법으로 제조된 복합체는 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 복합체의 항균효과를 확인한 결과, 근적외선 조사에 따라 유의적인 항균효과를 나타냄을 확인하였다(도 7 내지 도 9 참조).

따라서, 본 발명에 따른 약물-고분자 물질이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브를 사용하는 경우, 근적외선 레이저를 조사했을 때 발생하는 금 나노로드의 광열효과를 기반으로 약물의 방출 시간 및 기간을 조절하여 불필요한 투약을 방지하는 동시에 불필요한 투약으로 인한 부작용을 최소화할 수 있다.

아울러, 본 발명은 (a) 티타늄 소재의 표면에 티타니아 나노튜브층을 형성시키는 단계; (b) 상기 티타니아 나노튜브층 표면에 금을 스퍼터링하는 단계; 및 (c) 상기 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브층에 약물을 코팅하는 단계를 포함하는, 약물이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 (b)의 금을 스퍼터링하는 단계는 3 ~ 7분 동안 이온 플라즈마 증착법을 이용할 수 있고, 구체적으로 3 ~ 7분 동안, 보다 구체적으로 4분 ~ 6분, 보다 더 구체적으로 약 5분 간 스퍼터링하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 5분간 스퍼터링하여 제조한 결과 830 ㎚ 이상에서 가장 큰 흡수도를 나타내어 근적외선에서의 광열효과가 우수하므로, 유의한 약물 방출 효과를 나타내기 위해서는 상귀 범위동안 이온 플라즈마 증착법을 이용하여 금을 스퍼터링하는 것이 바람직하다. 3분 미만 스퍼터링 하는 경우 충분한 증착이 이루어지지 않을 우려가 있고 7분을 초과하여 스퍼터링 하는 경우 과증착이 되어 경제적이지 않은 문제가 있다.

상기 단계 (c)의 약물 코팅 시에는, 전기 방사로 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브층에 약물을 코팅할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 in vivo test를 통해 마우스의 복강 내 본 발명에 따른 임플란트를 삽입하고 근적외선을 조사하였을 때 약물의 방출 제어가 가능함을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 임플란트를 특정 표적부위(target area)에 위치시킨 후 근적외선을 조사함으로써 약물이 표적 부위에서만 방출이 되도록 함으로써 전신 부작용(systemic side effect)를 최소화할 수 있고, 약물의 방출 속도를 제어함으로써 보다 맞춤형 투약이 가능하도록 할 수 있다는 점을 구명(究明)하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 금 스퍼터링 시간에 따른 GNRs-TiO₂의 확산 UV-Vis-NIR 분광광도계 결과를 확인한 결과, 5분 금 스퍼터링의 조건일 때 830 ㎚ 이상에서 가장 큰 흡수도를 나타내어 근적외선에서의 광열효과가 우수한 것을 확인하였다. 따라서 830 ㎚ NIR 레이저를 사용하여 원격 제어 약물 방출을 수행하기 위해서는 5분 금 스퍼터링이 적합함을 확인하였다(도 4 참조).

따라서, 티타니아 나노튜브 표면에 이온 플라즈마 증착법을 통해 금을 스퍼터링하고 상기 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브 표면에 약물-고분자 물질을 코팅하여 항균성 복합체를 제조한 결과, 상기 복합체는 근적외선 조사시 금 나노입자의 광열효과에 의해 고분자 물질이 분해되면서 약물이 방출되고 약물의 방출 시간 및 기간을 조절할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 제조방법은 근적외선 레이저를 통해 항균 기능 및 약물 용출의 on-off가 가능한 항균성 임플란트 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명된다.

다만 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이고, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다.

<실시예 1> TiO ₂ 나노튜브의 제조

티타늄 판(thickness: 250 μm, purity: 99.5 %; Hyundai Titanium Co., South Korea)을 에탄올(purity: 99.5 %; Sigma, USA) 및 재증류수로 세척하였다. 직경이 100 ㎚인 TiO₂ 나노튜브를 0.5 w/v% 플루오린화 수소산(48 w/v%; Merck, USA) 수용액에서 20 V에서 30분 동안 양극 산화 시켰다.

양극 산화 된 티타니아(TiO₂)를 재증류수로 헹구고 60℃에서 밤새 건조한 다음 400℃에서 3시간 동안 열처리를 하여 결정화된 TiO₂ 나노튜브를 제조하였다(공기 중, 가열 및 냉각 속도 = 1℃/분).

<실시예 2> GNRs-TiO ₂ 나노튜브 제작

직류(DC) 플라즈마 스퍼터(Cressington 108; Cressington Scientific Instruments, UK)를 사용하여 다양한 시간 동안(1, 3 및 5분) 0.1 mbar 미만의 진공 조건에서 10 mA의 인가전압으로 이온 플라즈마 증착법을 수행하여 TiO₂ 나노튜브에 금을 스퍼터링하여 금 나노로드(Gold nanorods; GNRs)-TiO₂ 나노튜브를 형성하였다.

그런 다음, 상기 제조된 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 형상, 원소 조성 및 광학적 특성은 FE-SEM(Field-Emission Scanning Electron Microscopy; S4800S; Hitachi & Horiba Co., Japan), TEM(Transmission Electron Microscopy; JEM-2100F; JEOL, Japan), EDX(energy-dispersive X-ray spectroscopy; Oxford Instruments Analytical 7582, UK), UV-Vis 분광광도계(Ultraviolet-Visible spectrophotometry; SolidSpec-3700; Shimadzu Scientific Co., Japan)를 사용하여 확인하였고, 표면 화학 조성은 단색 A1 Kα가 장착된 XPS(X-ray Photoelectron Spectroscopy; K-alpha; Thermo, UK)를 사용하여 확인하였다.

그 결과 이온 플라즈마 증착법을 이용할 경우, 도 2에 나타낸 바와 같이 코팅시간이 증가할수록 증착된 금 나노입자의 양도 증가됨을 확인하였고(도 2), 도 3에 나타낸 바와 같이 TiO₂ 나노튜브 최상층에 금 나노입자가 봉상으로 적층되는 것을 확인하였다(도 3).

구체적으로, 도 2의 (d)의 수직면에서 50개의 금 나노입자를 측정한 결과는 TiO₂ 나노튜브 상에 증착된 금 나노입자의 단축, 장축 및 종횡비는 각각 33.99 ± 3.75 ㎚, 100.40 ± 11.74 ㎚ 및 2.96 ± 0.14로 확인하였다. 도 3의 (a)의 TiO₂ 나노튜브를 확인한 결과는 전체 영역에서 금이 검출되었고 대부분이 최상층에서 관찰되는 것을 확인하였다. 또한 EDX 분석에 기초한 TEM 이미지의 매핑된 영역에서 5.03 중량%의 금이 검출되는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3).

<실시예 3> TC/PCL 복합체를 이용한 GNRs-TiO ₂ 의 코팅

디메틸 술폭시드(Dimethyl sulfoxide)에 용해된 3가지 농도의 TC(tetracycline; 2, 4 및 5 wt%, Sigma), 테트라히드로푸란(Tetrahydrofuran)에 용해된 PCL(polycaprolactone; 2 wt%, Sigma)의 혼합물을 6시간동안 교반하였다.

혼합된 TC/PCL 복합체 100 μL를 전기방사분사 장치(ESR200R2; NanoNC, Korea)를 사용하여 전기방사 속도 20 μL/분으로 GNRs-TiO₂ 나노튜브에 코팅하였다(도 1).

<실험예 1> 다양한 금 스퍼터링 시간에 따른 GNRs-TiO ₂ 의 확산 UV-Vis-NIR 분광광도계 결과확인

상기 <실시예 2>에서 제조한 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 금 스퍼터링 시간에 따른 효과를 확산 UV-Vis-NIR 분광광도계를 통해 확인하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 <실시예 2>에서 제조한 모든 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 흡수 스펙트럼은 4개의 피크(350-400 ㎚, 400-450 ㎚, 500-600 ㎚ 및 800-850 ㎚)를 나타냄을 확인하였다.

구체적으로 5분 금 스퍼터링의 조건일 때 830 ㎚ 이상에서 가장 큰 흡수도를 나타내어 근적외선에서의 광열효과가 우수한 것을 확인하였다. 따라서 830 ㎚ NIR 레이저를 사용하여 원격 제어 약물 방출을 수행하기 위해서는 5분 금 스퍼터링이 적합함을 확인하였다(도 4).

<실험예 2> GNRs-TiO ₂ 표면 화학적 조성 변화 확인

도 5는 금 스퍼터링 시간에 따른 XPS(X-ray Photoelectron Spectroscopy; K-alpha; Thermo, UK) 결과로 금 스퍼터링 시간이 증가할수록 Ti 2p와 O 1s의 주 피크는 더 낮은 결합 에너지로 이동하는 것을 확인하였다. 또한 순수한 TiO₂ 나노튜브와 비교하여 GNRs-TiO₂ 나노튜브의 Ti 피크는 낮은 결합 에너지로의 작은 이동 변화를 나타내었다. 따라서, GNRs-TiO₂는 금 증착이 증가해 티타늄이 감소함을 확인하였다(도 5).

<실험예 3> 세포 증식 시험

TC농도가 2, 4 및 5 wt%인 TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂에서 배양된 hMSCs(Human Mesenchymal Stem Cells)의 생존 세포 확인 실험을 수행하였다.

3.1 세포 증식

생존 hMSCs(Lonza, USA)를 계산하기 위해서 FDA(Fluorescein diacetate; Sigma)로 배양 초기에 염색하였다. 배양하고 24 및 48시간 후에 hMSCs를 PBS(Phosphate-buffered saline; Invitrogen, USA)로 헹구고 10 mL PBS에 용해된 50 μg FDA 작업용액과 함께 30초간 추가 배양하였다.

3.2 결과 판정

FDA로 염색된 hMSCs를 PBS로 2회 세척하고 도립 형광현미경(Inverted Fluorescence Microscope; CKX41; Olympus Co., Japan)으로 관찰하였다. FDA로 염색된 hMSCs는 각 표본의 4개 영역에서 계수되었다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 24시간 배양한 후의 생존 hMSCs의 수는 실험군 간에 유의한 차이가 없었지만, 배양 48시간 후의 생존 hMSCs의 수는 4 wt% 및 5 wt% TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 실험군 보다 2 wt% TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 실험군에서 유의하게 높은 것으로 확인하였다(도 6).

<실험예 4> 세포 독성 시험

TC농도가 2, 4 및 5 wt%인 TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂에서 배양된 hMSCs의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 세포 독성 실험을 수행하였다.

4.1 MTT 독성 시험

hMSCs를 PBS로 세척하고 12-well 판에 옮겼다. 각 well에 MTT를 1 mL씩 첨가한 후 5 % CO₂ 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 상기 각 well에 아이소프로판올(isopropanol)을 1 mL씩 첨가하고 30분 동안 진탕하였다.

4.2 결과 판정

마이크로플레이트 효소 결합 면역 흡착 측정 판독기(Microplate Enzyme-Linked Immunosorbent assay reader; SpectraMax 250; Thermo Electron Co., USA)를 사용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하고 ISO 10993-5, Annex C 방법으로 데이터를 분석하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 24시간 배양한 후 hMSCs의 생존력은 유의한 차이가 없었지만, 배양 48시간 후 hMSCs의 생존력은 4 wt% 및 5 wt% TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 실험군보다 2 wt% TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂ 실험군에서 유의하게 높은 것으로 확인하였다(도 7). 또한 2 wt% TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂에서 성장한 hMSCs의 생존율은 대조군(Blank)의 70% 이상으로 나타나 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

<실험예 5> 항균 한천 배지 확산 시험(Antibacterial agar diffusion test)

스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans; ATCC 25176, ATCC, USA)를 BHIB(Brain Heart Infusion Broth; Difco Co., USA)에서 배양하여 TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂의 항균 한천 배지 확산 시험을 수행하였다.

5.1 한천 배지 형성

S. mutans를 100 mm 조직 배양 접시에 37℃에서 24시간 동안 배양하고 한천 배지를 응고시켜 S. mutans의 한천 배지를 형성하였다.

5.2 NIR 레이저 조사

실험용 시료(1 × 1 cm²)를 S. mutans가 배양된 한천 배지에 넣고 1분간 NIR 레이저(전력: 200 mW, 파장: 830 ㎚, RaeHwa, Korea)를 조사하였다. NIR 레이저 조사 후, 실험용 시료를 한천 배지에서 제거하고 37℃에서 24시간 동안 추가 배양시켰다.

5.3 결과 판정

24시간 이차 배양 후, 시료 주위에 세균이 사멸된 구역의 지름의 오차를 최소화하기 위해 3회 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, NIR 레이저를 조사한 실험군은 대조군과 비교하여 세균이 사멸된 구역의 지름이 유의하게 높았고 이를 통해 실험군의 항균효과가 대조군에 비해 유의하게 높은 것으로 확인하였다(도 8). 또한 NIR 레이저에 의한 원격 제어 약물 방출 기능도 확인하였다.

<실험예 6> 생체 내 NIR 레이저 매개 TC방출

생체 내에서의 NIR 레이저 매개 TC 방출을 분석하기 위해서, 동물실험을 수행하였고, 원광대학교 동물실험 윤리위원회(WKU16-89)의 승인을 얻어 진행하였다.

6.1 ICR 마우스 실험

상기 <제조예 3>에서 제조한 TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂의 TC 방출량을 확인하기 위해 ICR(Institute of Cancer Research) 마우스(body weight: 23-25g; Damool Science, Korea)를 이용하였고, 복강 내 삽입을 위해 가위를 이용하여 1cm² 절개하여 내피 공간을 확보하였다.

6.2 NIR 레이저 조사

상기 마우스의 복강 내에 TC/PCL 복합체가 코팅된 GNRs-TiO₂를 삽입하고 NIR 레이저를 1분간 조사하였다.

상기 NIR 레이저 조사의 30분 후 마우스의 혈액을 수집하였다. 수집한 혈액으로부터 원심분리(5000 r/min, 10 분)를 통해 혈장을 수집하고, -80℃에서 저장하였다.

6.3 결과 판정

마우스 혈액 내에서 TC의 방출량을 정량하기 위해 4가지 농도의 TC(1, 10, 100 및 1000 ng/mL)샘플을 LC-MS/MS(Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry; triple quadrupole tandem mass spectrometer; Agilent 6410 Triple Quadrupole; Agilent, USA)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, NIR 레이저를 조사한 실험군은 NIR레이저를 조사하지 않은 비교군과 비교하여 TC방출량이 유의하게 높은 것으로 확인하였다(도 9).

Claims

(a) 티타늄 소재의 표면에 티타니아 나노튜브층을 형성시키는 단계;
(b) 상기 티타니아 나노튜브층 표면에 금을 스퍼터링하는 단계; 및
(c) 상기 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브층에 약물을 코팅시키는 단계를 포함하고 근적외선 조사에 의해 약물이 방출되는, 약물이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브 항균성 복합체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 금을 스퍼터링하는 단계는 이온 플라즈마 증착법을 이용하는 것을 특징으로 하는 항균성 복합체의 제조방법.
제 2항에 있어서, 단계 (b)의 금을 스퍼터링하는 단계는 3 ~ 7분 동안 이온 플라즈마 증착법을 통해 금을 스퍼터링 하는 것을 특징으로 하는 항균성 복합체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 약물 코팅은 전기 방사로 금이 스퍼터링된 티타니아 나노튜브층에 약물을 코팅하는 것을 특징으로 하는 항균성 복합체의 제조방법.
티타늄 소재의 표면에 형성된 티타니아 나노튜브층;
상기 티타니아 나노튜브층에 스퍼터링된 금 나노로드; 및
상기 금 나노로드가 스퍼터링된 티타니아 나노튜브층에 코팅된 약물을 포함하고 근적외선 조사에 의해 약물이 방출되는, 약물이 코팅된 금 나노로드 티타니아 나노튜브 항균성 복합체.
삭제
제 5항에 있어서, 상기 약물은 약물-생분해성 고분자 복합체인 것을 특징으로 하는 항균성 복합체.
제 7항에 있어서, 상기 약물은 테트라사이클린, 아미노글리코사이드계 항생제, 마크로라이드계 항생제, 베타 락탐계 항생제, 암포테리신, 폴리믹신, 반코마이신, 리팜핀, 퀴놀론계 항생제, 설파계 항생제, 피리메타민 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항균성 복합체.
제 7항에 있어서, 상기 고분자는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리락타이드 카프로락톤, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 지방족 폴리에스테르, 셀룰로오스, 리그닌, 전분, 알긴산, 바이오 폴리에스테르, 바이오 셀룰로오스, 다당류, 폴리아민산 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항균성 복합체.
제 5항에 있어서, 상기 복합체는 의료용 임플란트인 것을 특징으로 하는 항균성 복합체.