KR20210131302A - 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지 - Google Patents

중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 분화 유도 분야에 관한 것이고, 특히 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지에 관한 것이며, 분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 5 ~ 10 μmol, 이카리인 2 ~ 4 μmol, 아스피린 1 ~ 3 nmol, 부갑상샘 호르몬 1 ~ 3 nmol, 히드로코르티손 5 ~ 10 nmol, 라파마이신 1 ~ 3 mg, 테스토스테론 2 ~ 10 μg, EPO 2 ~ 10 μg, LIF 2 ~ 10 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하는 방법에 의해 제조된다. 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지는 한약 성분인 레스베라트롤, 이카리인 연합 아스피린, 부갑상샘 호르몬, 히드로코르티손, 라파마이신, 테스토스테론 및 성장 인자를 사용하여, 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 방향성 분화를 유도하는데 대해 시너지 효과가 있고, 사용된 유도 성분은 모두 무독성이며, 유도 효율이 높고 유도 시간이 짧으며 유도를 통해 얻은 각막 상피세포의 활성이 우수하고 세포 이식 후 거부 반응이 없고 윤리적 문제가 없으며 안전성이 높다.

Description

중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지
본 발명은 줄기세포 분화 유도 분야에 관한 것이고, 특히 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지에 관한 것이다.
각막 상피세포층은 각막의 외부 표면에 있다. 각막 상층 세포는 5 ~ 6 개의 층으로 되어 있고, 각 층은 매우 깔끔하고 단단하게 배열되어 있으며, 가장 깊은 층은 짧은 주상 기저 세포의 단일 층이다. 심층에는 2 ~ 3 개의 다각형 날개 세포가 있고, 최상층은 2 ~ 3 개의 다각형 표층 세포이다. 표층 세포의 가장 얕은 층은 각질화되지 않은 편평한 세포이고, 표피 세포 사이의 간격이 명확하지 않으며, 표층 세포막은 매우 매끄럽고, 세포기질은 깨끗하고 투명하며, 세포기질 돌출부는 서로 결합하여 브릿지 모양을 형성하고, 핵은 여전히 존재한다. 이 세포는 빛 투과율이 매우 강하다. 각막 상피세포는 강한 저항력과 재생 능력을 가지고 있으며 심층 세포는 여전히 유사 분열을 진행할 수 있다. 각막 상피는 일반적으로 외상과 감염 후 빠르게 회복될 수 있다.
안구 외상, 수술 외상, 염증 및 약물 독성과 같은 다양한 병원성 요인은 모두 각막 윤부 손상을 일으키고 윤부 줄기 세포 기능 장애를 일으키며 상피세포의 손실을 초래하여 각막 감염, 천공 및 혈관 신생의 위험을 증가시킬 수 있다. 각막 이식은 현재 각막 실명을 치료하는 유일한 효과적인 방법이다. 통계에 따르면 중국에서 전국적으로 각막 질환으로 인한 실명자가 약 400 만 ~ 500 만 명에 이르며 그중 대부분은 각막 이식 수술을 통해 회복될 수 있다. 그러나 중국에서는 매년 약 1 만 건의 각막 이식 수술만 이루어지고 있는데, 주된 이유는 기증된 각막 수가 심하게 부족하여 수술의 대중화와 적용을 제한하기 때문이다. 대다수 실명자는 각막 이식을 통해 빛을 다시 볼 수 없으므로 체외에서 각막 조직을 재건하는 공학은 현재 기증된 각막 재료의 부족을 해결하기 위한 중요한 돌파구이다.
그러나 각막 조직 공학에는 각막 상피 종자 세포의 공급원과 같은 각막 조직 공학에는 몇 가지 병목 현상이 있다. 각막 상피 연구를 통해 각막의 생리적, 병리학적 특성 및 각막 질환을 더 깊이 이해할 수 있었지만, 분화 후 각막 상피세포의 체외 성장 수명 주기가 매우 짧고 2 ~ 3 계대에 불과하였고, 얻은 세포의 량이 적고 비용이 높았으며, 이로 인해 각막 조직의 연구와 조직 공학화 각막의 재건이 제한을 받았다. 따라서 세포의 지속적인 재생을 보완하기 위해, 강력한 증식 능력과 지속적인 분열 및 성장이 가능한 각막 상피세포를 얻는 방법은 각막 상피 종자 세포를 얻는 주요 과제가 되었다. 각막 상피세포계 구축은 상피 증식 및 분화, 안약 시험, 각막 질환에 대한 새로운 치료법 개발 등 다양한 연구 목적에 필요한 세포를 장기간 안정적으로 제공할 수 있다.
중간엽 줄기세포는 그 래원이 광범위하고 재료를 쉽게 구할 수 있으며 자가 이식이 편리하고 강력한 증식 능력을 구비하며 체외에서 장기 배양 시 항상 다방향 분화 잠재력을 유지할 수 있고, 특정 조건에서 유도 시 성골, 연골, 힘줄, 근육 세포, 지방 세포, 신경 세포 및 간세포 등으로 분화할 수 있어 이상적인 조직 공학 종자 세포이다. 중간엽 줄기세포는 줄기세포 연구 핫스팟이 되었으며, 유도를 거쳐 각막 상피세포로 분화되어 각막 손상을 치료할 수 있다.
줄기 세포의 분화는 세포 발현과 단백질의 특이적 분포를 제어하기 위한 일부 유전자의 선택적 활성화 또는 차별적 발현이다. 중간엽 줄기세포가 특정 세포 유형으로의 분화는 주로 유전자의 활성화에 좌우되며, 세포 외 미세 환경에서 다양한 인자의 유형 및 농도는 유전자 활성화에 영향을 주는 중요한 요소이다. 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지는 한약 성분인 레스베라트롤, 이카리인 연합 아스피린, 부갑상샘 호르몬, 히드로코르티손, 라파마이신, 테스토스테론 및 성장 인자를 사용하여, 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 방향성 분화를 유도하는데 대해 시너지 효과가 있고, 사용된 유도 성분은 모두 무독성이며, 유도 효율이 높고 유도 시간이 짧으며 유도를 통해 얻은 각막 상피세포의 활성이 우수하고 세포 이식 후 거부 반응이 없고 윤리적 문제가 없으며 안전성이 높다.
본 발명의 목적은 종래의 유도 배지 및 유도 방법에 존재하는 문제에 대해 유도 효율이 높고 유도 단계가 적으며 유도 시간이 짧고 유도를 통해 얻은 각막 상피세포의 활성이 우수하고 세포 이식 후 거부 반응이 없고 윤리적 문제가 없으며 안전성이 높은 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명이 사용하는 과제의 해결 수단은 아래와 같다. 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지에서, 분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 5 ~ 10 μmol, 이카리인 2 ~ 4 μmol, 아스피린 1 ~ 3 nmol, 부갑상샘 호르몬 1 ~ 3 nmol, 히드로코르티손 5 ~ 10 nmol, 라파마이신 1 ~ 3 mg, 테스토스테론 2 ~ 10 μg, EPO 2 ~ 10 μg, LIF 2 ~ 10 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하는 방법에 의해 제조된다.
바람직하게, 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지에서, 분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 8 μmol, 이카리인 3 μmol, 아스피린 2 nmol, 부갑상샘 호르몬 2 nmol, 히드로코르티손 7 nmol, 라파마이신 2 mg, 테스토스테론 7 μg, EPO 7 μg, LIF 7 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하는 방법에 의해 제조된다.
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지는 아래와 같은 장점이 있다.
1. 유전자 형질 감염이 필요없어 유전자 변형 및 암 위험이 없다.
2. 유도 단계가 적다.
3. 유도 시간이 짧다.
4. 분화 유도 효율이 높다.
5. 본 발명의 유도제의 각 성분이 모두 안전하고 무독성이다.
6. 중간엽 줄기세포가 유도를 통해 각막 상피세포로 분화된 후, 세포 이식 후 거부 반응이 없고 윤리적 문제가 없으며 안전성이 높고 광범위한 임상 응용 전망이 있다.
도 1은 본 발명의 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포의 분화를 유도한 후 나타난 각막 상피세포의 형태이다(×400).
아래 실시예 중의 실험 방법은 특별한 설명이 없는 한 모두 통상적인 방법이다. 실험에 사용된 기기 및 시약은 상업적 경로로 얻을 수 있다.
실시예 1
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지의 각 성분은 모두 시중 제품이다.
레스베라트롤: 브랜드 Sigma, 제품 번호 R5010;
이카리인: 브랜드 상하이 워이징 바이오(?瞿Ｎ♥㎀歇?), 제품 번호 489-32-7;
아스피린: 브랜드 Sigma, 제품 번호 A2093-100G;
부갑상샘 호르몬: 브랜드 Sigma, 제품 번호 P7036;
히드로코르티손: 브랜드 Sigma, 제품 번호 H3160;
라파마이신: 브랜드 TargetMol, 제품 번호 T1537;
테스토스테론: 브랜드 Sigma, 제품 번호 T1500;
EPO(적혈구생성소): 브랜드 PeproTech, 제품 번호 CYT-201;
LIF(백혈병 억제 인자): 브랜드 PeproTech, 제품 번호 96-300-05-5;
각막 상피세포 무혈청 배지(CEpiCM): 브랜드 ScienCell, 제품 번호 6511.
중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지는 아래 농도 비율에 따라 아래 성분으로 이루어진다. 분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 8 μmol, 이카리인 3 μmol, 아스피린 2 nmol, 부갑상샘 호르몬 2 nmol, 히드로코르티손 7 nmol, 라파마이신 2 mg, 테스토스테론 7 μg, EPO 7 μg, LIF 7 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하여 제조된다.
실시예 2
중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지는 아래 농도 비율에 따라 아래 성분으로 이루어진다. 분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 5 μmol, 이카리인 2 μmol, 아스피린 1 nmol, 부갑상샘 호르몬 1 nmol, 히드로코르티손 5 nmol, 라파마이신 1 mg, 테스토스테론 2 μg, EPO 2 μg, LIF 2 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하여 제조된다.
실시예 3
중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지는 아래 농도 비율에 따라 아래 성분으로 이루어진다. 분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 10 μmol, 이카리인 4 μmol, 아스피린 3 nmol, 부갑상샘 호르몬 3 nmol, 히드로코르티손 10 nmol, 라파마이신 3 mg, 테스토스테론 10 μg, EPO 10 μg, LIF 10 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하여 제조된다.
실시예 4
인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 예로 들어, 실시예 1에서 제조한 유도 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포에 대한 각막 상피세포의 분화 유도 실험을 수행하였고, 단계는 다음과 같다.
지방 유래 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화 유도: 3 계대 배양된 MSC를 폴리라이신으로 처리한 멸균 커버 슬립이 미리 배치된 6 웰 플레이트에 접종하여 세포 슬라이드를 제조한다. 세포가 80 % 융합에 가까워지고 성장이 활발할 때 분화를 유도한다. 실험군은 표 1과 같다.
실험군
조별 유도 조건
본 발명의 유도군 본 발명에 따른 유도 배지로 5 일 동안 유도한다.
조건 배지군 조건 배지 제조: 인간 각막 윤부 줄기세포용 20 % FBS + 10 μg/LEGF가 포함된 DMEM/F12 배지를 37 ℃ 온도의 5 % 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 2 일마다 배지를 교체한다. 매번 교체된 배지를 수집하여 원심분리 튜브에 옮기고, 1000 rpm/min으로 5 분간 원심 분리한 후, 상층액을 멸균 튜브에 수집하며 나중에 사용할 수 있도록 -20 ℃ 온도의 냉장고에 넣는다. 상기 조건 배지로 30 일 동안 유도한다.
공동 배양군 Millipore의 설명에 따라 Transwell 공동 배양 체계를 사용한다. 인간 각막윤부 줄기 세포를 트랜스웰(Transwell) 챔버에 접종한 후 6 웰 플레이트에 넣고 7 일 동안 유도를 통해 중간엽 줄기 세포와 공동 배양한다.
유도 후 세포 감정: CK3, CK12, CK19를 각막 상피세포 마커로 선택하고, 면역 세포 화학법으로 유도 전과 후의 CK3, CK12, CK19의 발현 상황을 검출하였다. 4 개의 슬라이드를 무작위로 선택하고 200 배 시야에서 5 개의 시야를 무작위로 선택하여 각각 양성 세포의 비율을 계산하였다. 전체 세포에서 양성 세포의 비율은 평균 ± 표준 편차(
Figure pct00001
)로 표시하였다. 통계 분석은 SPSS 11.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, 실험 데이터는 (
Figure pct00002
)로 표시하고, 여러 그룹의 비교는 분산 분석으로, 두 그룹 간의 비율 비교는 x2 검증을 통해 수행하였다. P<0.05이면 통계적으로 유의한 것으로 간주한다. 세 그룹의 유도 결과는 표 2와 같다.
세 그룹의 유도 결과(n=20,
Figure pct00003
)
조별 면역 세포 화학법
CK3 CK12 CK19
본 발명의 유도군 (92.4±1.3) % (89.5±1.6) % (93.7±1.1) %
조건 배지군 (32.5±0.9) % (29.6±0.8) % (24.4±0.5) %
공동 배양군 (41.6±1.5) % (37.5±2.0) % (44.2±1.7) %
표 2를 참조하면, 본 발명의 유도군은 분화 유도 후 CK3, CK12, CK19 양성 세포율이 조건 배지군 및 공동 배양군보다 높고(P<0.05), 이는 본 발명의 배지의 유도 효율이 조건 배지군 및 공동 배양군보다 현저히 높으며 90 % 이상에 달함을 설명한다.
종합하면, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지는 유도 효율이 가장 높고 유도 시간이 가장 짧기에 보급 가치가 있다.

Claims (2)

  1. 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지로서,
    분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 5 ~ 10 μmol, 이카리인 2 ~ 4 μmol, 아스피린 1 ~ 3 nmol, 부갑상샘 호르몬 1 ~ 3 nmol, 히드로코르티손 5 ~ 10 nmol, 라파마이신 1 ~ 3 mg, 테스토스테론 2 ~ 10 μg, EPO 2 ~ 10 μg, LIF 2 ~ 10 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하는 방법에 의해 제조되는 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지.
  2. 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지로서,
    분화 유도용 상기 무혈청 완전 배지는 1L 당 레스베라트롤 8 μmol, 이카리인 3 μmol, 아스피린 2 nmol, 부갑상샘 호르몬 2 nmol, 히드로코르티손 7 nmol, 라파마이신 2 mg, 테스토스테론 7 μg, EPO 7 μg, LIF 7 μg을 포함하고, 잔여량은 각막 상피세포 무혈청 배지이며, 균일하게 혼합한 후 여과 및 제균을 진행하는 방법에 의해 제조되는 중간엽 줄기세포가 각막 상피세포로의 분화를 유도하는 무혈청 완전 배지.
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