KR20210053922A - 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자를 치료하기 위한 종양 침윤 림프구의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비-소세포 폐 암종(NSCLC)의 치료를 위해 증가된 치료 효능을 갖는 TIL의 치료 집단을 제조하기 위해 TIL을 제조하는 개선되고/개선되거나 단축된 과정 및 방법을 제공하고, 상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본원은 2018년 8월 31일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/725,976호, 및 2018년 9월 4일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/726,919호의 우선권을 주장하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
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종양 침윤 림프구(TIL)의 입양 전달(adoptive transfer)을 사용하는 부피가 크고 난치성인 암의 치료는 예후가 좋지 않은 환자를 위한 요법에 대한 강력한 접근법을 나타낸다. 문헌[Gattinoni, 등, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393]. 성공적인 면역요법을 위해서는 다수의 TIL이 요구되고, 상업화를 위해서는 강건하고 신뢰할 수 있는 공정이 필요하다. 이는 세포 확장과 관련된 기술적, 물류적, 및 규제적 사안 때문에 달성하는 것이 곤란했었다. IL-2-기반 TIL 확장과 그것에 뒤따르는 "급속 확장 공정(rapid expansion process)"(REP)은 그의 속도 및 효율로 인해 TIL 확장을 위한 바람직한 방법이 되었다. 문헌[Dudley, 등, Science 2002, 298, 850-54]; 문헌[Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57]; 문헌[Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39]; 문헌[Riddell, 등, Science 1992, 257, 238-41]; 문헌[Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. REP는 14일 기간에 걸쳐 TIL의 1,000배 확장을 초래할 수 있지만, 이는 종종 다수의 공여체로부터의, 피더 세포(feeder cell)로서의 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC, 단핵 세포(MNC)로도 공지됨), 뿐만 아니라 항-CD3 항체 (OKT3) 및 고용량의 IL-2를 크게 (예를 들어, 200배) 필요로 한다. 문헌[Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. REP 절차를 거친 TIL은 흑색종 환자에서 숙주 면역억제 후 성공적인 입양 세포 요법을 생성하였다. 현재의 주입 허용 파라미터는 TIL의 조성(예를 들어, CD28, CD8, 또는 CD4 양성)의 판독 및 REP 생성물의 접힘 확장 및 생존력에 의존한다.
현재의 TIL 제조 및 치료 과정은 길이, 비용, 멸균 문제, 및 본원에 기재된 다른 인자에 의해 제한되어, 항-PD1에 대해 불응성인 환자를 치료하는 가능성이 심각하게 제한되었다. 생존가능한 치료 옵션이 거의 없거나 전혀 없는 환자를 치료하는데 사용하기에 적합한 TIL 제조 방법 및 이러한 방법에 기초한 요법을 제공할 긴급한 필요성이 있다. 본 발명은 항-PD-1 치료에 불응성인 비소세포 폐 암종 (NSCLC) 환자의 치료에 사용될 수 있는 TIL의 생성에 사용하기 위한 단축된 제조 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명은 항-PD-1 치료에 불응성인 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 환자의 치료에 사용하기 위해 TIL을 확장시키고 TIL의 치료 집단을 생성하는 개선되고/개선되거나 단축된 방법을 제공한다.
본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 다수의 종양 단편 또는 생검을 비롯하여 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 환자의 NSCLC 종양으로부터의 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 다른 수단으로부터 TIL의 제1 집단을 얻고/얻거나 수용하는 단계;
(c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
(d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는 단계;
(e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 단계;
(f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
(g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 NSCLC 환자에게 투여하는 단계;
상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다.
일부 실시형태에서, "수득하는(obtaining)"은 방법 및/또는 공정에 사용된 TIL이 방법 및/또는 공정 단계의 일부로서 샘플(수술적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 샘플을 포함함)로부터 직접 유래될 수 있음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, '수용하는(receiving)"은 방법 및/또는 공정에 사용된 TIL이 (수술적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 샘플을 포함하는) 샘플로부터 간접적으로 유래될 수 있고, 이어서 상기 방법 또는 공정에서 사용될 수 있음을 나타낸다(예를 들어, 단계 (a)가 시작되는 경우, 부분 (a)에 포함되지 않은 별도의 공정에 의해 샘플로부터 이미 유래된 TIL은 "수용된"으로 지칭될 수 있다).
일부 실시형태에서, TIL의 제1 집단을 수득하는 것은 다병변 샘플링 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 항체로 이전에 치료(treat)되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환(bulky disease)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 20 mm 이상의 단축 직경을 갖는 횡방향 또는 관상 평면 또는 팽윤된 림프절에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타난다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트(neo-adjuvant) 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전(prior) 전신 치료 과정에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14; 및 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 급속 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지에서 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2 레지멘은 허용 범위(tolerance)까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입(bolus intravenous infusion)으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 레지멘이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 환자로부터 하나 이상의 종양을 절제하는 단계로서, 하나 이상의 종양은 TIL의 제1 집단을 포함하는 단계;
(b) 상기 하나 이상의 종양을 종양 단편으로 단편화하는 단계;
(c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
(d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는 단계;
(e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 단계;
(f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
(g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 암 환자에게 투여하는 단계;
상기 암은 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 20 mm 이상의 단축 직경을 갖는 횡방향 또는 관상 평면 또는 팽윤된 림프절에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타난다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14; 및 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 급속 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지에서 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 레지멘이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 비-소세포 폐 암종(NSCLC)을 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 암은 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이고, 상기 방법은 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)을 투여하는 것을 포함하고, 상기의 단계들을 포함한다:
(a) 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 종양을 다수의 종양 단편으로 가공함으로써 대상체에서 절제된 하나 이상의 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하고/수득하거나 수용하는 단계;
(b) 상기 종양 단편을 폐쇄 시스템에 추가하는 단계;
(c) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단을 배양함으로써 상기 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제1 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제1 기체 투과성 표면적을 제공하고, 상기 제1 확장은 약 3-11 
일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 얻고, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 TIL의 제1 집단보다 적어도 50-배 초과이고, 그리고 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 이행(transition)은 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여, TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제2 확장은 약 7-11 
일 동안 수행하여 TIL의 제3 집단을 얻고, 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 제2 집단에 비해 효과기 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 하위집단을 포함하는 TIL의 치료 집단이고, 상기 제2 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제2 기체 투과성 표면적을 제공하고, 그리고 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계; 및
(f) 단계 (e)로부터의 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이동시키는 단계로서, 단계 (e)로부터 (f)로의 이동은 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계;
(g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터의 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서 주입 백으로부터의 TIL의 제3 집단의 치료 효과적인 투여량을 상기 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시형태에서, "수득하는(obtaining)"은 방법 및/또는 공정에 사용된 TIL이 방법 및/또는 공정 단계의 일부로서 샘플(수술적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 샘플을 포함함)로부터 직접 유래될 수 있음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, '수용하는(receiving)"은 방법 및/또는 공정에 사용된 TIL이 (수술적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 샘플을 포함하는) 샘플로부터 간접적으로 유래될 수 있고, 이어서 상기 방법 또는 공정에서 사용될 수 있음을 나타낸다(예를 들어, 단계 (a)가 시작되는 경우, 부분 (a)에 포함되지 않은 별도의 공정에 의해 샘플로부터 이미 유래된 TIL은 "수용된"으로 지칭될 수 있다).
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 20 mm 이상의 단축 직경을 갖는 횡방향 또는 관상 평면 또는 팽윤된 림프절에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타난다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14; 및 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 약 3 내지 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 제2 확장은 약 7 내지 11일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 급속 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지에서 약 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 30 ng/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 레지멘이다.
도 1: 단계 A 내지 F의 개요를 제공하는 예시적인 공정 2A 챠트.
도 2: 공정 2A의 공정 흐름도.
도 3: 동결보존된 TIL의 예시적인 제조 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다(약 22일).
도 4: 공정 2A, TIL 제조를 위한 22-일 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다.
도 5: 공정 1C 및 공정 2A의 예시적인 실시형태로부터의 단계 A 내지 F의 비교 표.
도 6: 공정 1C의 실시형태와 공정 2A의 실시형태의 상세한 비교.
도 7: 조합 코호트에 대한 연구 순서도: 코호트 1A (MM), 코호트 2A (HNSCC), 및 코호트 3A (NSCLC). 약어: Cy=사이클로포스파미드; EOA= 평가의 종료; EOS=연구 종료; EOT=치료 종료; Flu=플루다라빈; IL-2=인터류킨-2; NMA-LD=비골수절제 림프구고갈; Q3W= 3주마다; TIL=종양 침윤 림프구. 코호트 1A, 2A 및 3A의 환자는 TIL 생산을 위한 종양 절제 및 NMA-LD 레지멘의 개시 전에 기준선 스캔의 완료 후에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 받을 것이다. 이러한 특정 연구의 경우, 펨브롤리주맙의 다음 용량은 IL-2의 완료 후보다 더 일찍 투여되지 않았고, 그 후 Q3W ± 3일에 ≤ 2년(24개월) 동안 또는 질환 진행 또는 허용되지 않는 독성까지 계속되었으며, 어느 것이든 먼저 발생하였다.
도 8: 단일-제제 코호트: 코호트 3B (NSCLC)에 대한 연구 순서도. 약어: Cy=사이클로포스파미드; EOA= 평가 종료; EOS=연구 종료; EOT=치료 종료; Flu=플루다라빈; IL-2=인터류킨-2; NMA-LD=비골수절제 림프구고갈; TIL=종양 침윤 림프구.
도 9: 공정 2A, TIL 제조를 위한 22-일 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다.
도 10: 구조 I-A 및 I-B를 제공하고, 실린더는 개별 폴리펩티드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어, 4-1BBL로부터 유래된 3개의 선형-연결된 TNFRSF 결합 도메인, 또는 4-1BB에 결합하는 항체를 포함하고, 이는 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이어서 IgG1-Fc를 통해 제2 3가 단백질 (CH3 및 CH2 도메인을 포함함)에 연결되고, 이어서 디술피드 결합 (작은 긴 계란형)을 통해 3가 단백질의 2개를 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고, 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 합쳐서 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제(agonist)를 제공한다. 실린더로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어, 가요성을 위한 Gly 및 Ser 서열과 친수성 잔기뿐만 아니라 용해도를 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다.
도 2: 공정 2A의 공정 흐름도.
도 3: 동결보존된 TIL의 예시적인 제조 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다(약 22일).
도 4: 공정 2A, TIL 제조를 위한 22-일 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다.
도 5: 공정 1C 및 공정 2A의 예시적인 실시형태로부터의 단계 A 내지 F의 비교 표.
도 6: 공정 1C의 실시형태와 공정 2A의 실시형태의 상세한 비교.
도 7: 조합 코호트에 대한 연구 순서도: 코호트 1A (MM), 코호트 2A (HNSCC), 및 코호트 3A (NSCLC). 약어: Cy=사이클로포스파미드; EOA= 평가의 종료; EOS=연구 종료; EOT=치료 종료; Flu=플루다라빈; IL-2=인터류킨-2; NMA-LD=비골수절제 림프구고갈; Q3W= 3주마다; TIL=종양 침윤 림프구. 코호트 1A, 2A 및 3A의 환자는 TIL 생산을 위한 종양 절제 및 NMA-LD 레지멘의 개시 전에 기준선 스캔의 완료 후에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 받을 것이다. 이러한 특정 연구의 경우, 펨브롤리주맙의 다음 용량은 IL-2의 완료 후보다 더 일찍 투여되지 않았고, 그 후 Q3W ± 3일에 ≤ 2년(24개월) 동안 또는 질환 진행 또는 허용되지 않는 독성까지 계속되었으며, 어느 것이든 먼저 발생하였다.
도 8: 단일-제제 코호트: 코호트 3B (NSCLC)에 대한 연구 순서도. 약어: Cy=사이클로포스파미드; EOA= 평가 종료; EOS=연구 종료; EOT=치료 종료; Flu=플루다라빈; IL-2=인터류킨-2; NMA-LD=비골수절제 림프구고갈; TIL=종양 침윤 림프구.
도 9: 공정 2A, TIL 제조를 위한 22-일 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다.
도 10: 구조 I-A 및 I-B를 제공하고, 실린더는 개별 폴리펩티드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어, 4-1BBL로부터 유래된 3개의 선형-연결된 TNFRSF 결합 도메인, 또는 4-1BB에 결합하는 항체를 포함하고, 이는 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이어서 IgG1-Fc를 통해 제2 3가 단백질 (CH3 및 CH2 도메인을 포함함)에 연결되고, 이어서 디술피드 결합 (작은 긴 계란형)을 통해 3가 단백질의 2개를 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고, 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 합쳐서 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제(agonist)를 제공한다. 실린더로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어, 가요성을 위한 Gly 및 Ser 서열과 친수성 잔기뿐만 아니라 용해도를 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다.
서열 목록의 간단한 설명
서열번호:1은 무로모납의 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호:2은 무로모납의 경쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호:3은 재조합 인간 IL-2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:4은 알데스류킨의 아미노산 서열이다.
서열번호:5은 재조합 인간 IL-4 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:6은 재조합 인간 IL-7 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:7은 재조합 인간 IL-15 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:8은 재조합 인간 IL-21 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:9은 인간 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열번호:10은 쥣과 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열번호:11은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄이다.
서열번호:12은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄이다.
서열번호:13은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:14은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:15은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:16은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:17은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:18은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:19은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:20은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:21은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄이다.
서열번호:22은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄이다.
서열번호:23은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:24은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:25은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호:26은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:27은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:28은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:29은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:30은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:31은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열번호:32은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:33은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:34은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:35은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:36은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:37은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:38은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:39은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:40은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:41은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:42은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열번호:43은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:44은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:45은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:46은 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 아미노산 서열.
서열번호:47은 4-1BBL 폴리펩티드의 가용성 부분이다.
서열번호:48은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:49은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:50은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:51은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:52은 4-1BB 효능제 항체 H39E3-2에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:53은 4-1BB 효능제 항체 H39E3-2에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:54은 인간 OX40의 아미노산 서열이다.
서열번호:55은 쥣과 OX40의 아미노산 서열이다.
서열번호:56은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄이다.
서열번호:57은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄이다.
서열번호:58은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:59은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:60은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:61은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:62은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:63은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:64은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:65은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:66은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄이다.
서열번호:67은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄이다.
서열번호:68은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:69은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:70은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:71은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:72은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:73은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:74은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:75은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:76은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄이다.
서열번호:77은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄이다.
서열번호:78은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:79은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:80은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:81은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:82은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:83은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:84은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:85은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:86은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:87은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:88은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:89은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:90은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:91은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:92은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:93은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:94은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:95은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:96은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:97은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:98은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:99은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:100은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:101은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:102은 OX40 리간드 (OX40L) 아미노산 서열이다.
서열번호:103은 OX40L 폴리펩티드의 가용 부분이다.
서열번호:104은 OX40L 폴리펩티드의 대안적인 가용 부분이다.
서열번호:105은 OX40 효능제 단클론성 항체 008에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:106은 OX40 효능제 단클론성 항체 008에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:107은 OX40 효능제 단클론성 항체 011에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:108은 OX40 효능제 단클론성 항체 011에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:109은 OX40 효능제 단클론성 항체 021에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:110은 OX40 효능제 단클론성 항체 021에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:111은 OX40 효능제 단클론성 항체 023에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:112은 OX40 효능제 단클론성 항체 023에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:113은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:114은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:115은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:116은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:117은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:118은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:119은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:120은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:121은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:122은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:123은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:124은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:125은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:126은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:127은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:128은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:129은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:130은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:131은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:132은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:133은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:134은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:135은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:136은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:137은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:138은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:139은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:140은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:141은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:142은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:143은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:144은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:145은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:146은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:147은 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:148은 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:149은 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:150은 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:151은 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:152은 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:153은 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:154은 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:155은 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:156은 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:157은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:158은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:159은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:160은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:161은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:162은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:163은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:164은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:165은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:166은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:167은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:168은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:169은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:170은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:171은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:172은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:173은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:174은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:175은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:176은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
급속 확장 프로토콜 (Rapid Expansion Protocol; REP)에 의해 생체외에서 배양된 TIL을 이용하는 입양 세포 요법은 흑색종과 같은 암을 갖는 환자에서 숙주 면역억제에 이어서 성공적인 입양 세포 요법을 생성하였다. 현재의 주입 허용 파라미터는 TIL의 조성(예를 들어, CD28, CD8, 또는 CD4 양성)의 판독 및 REP 생성물의 팽창 및 생존력의 수치 폴드에 의존한다.
현재의 REP 프로토콜은 환자에게 주입될 TIL의 건강에 대한 통찰력을 거의 제공하지 않는다. T 세포는 미접촉(naive)에서 효과기 T 세포로의 성숙 과정 동안 상당한 대사 이동을 겪는다(문헌[Chang, 등, Nat. Immunol. 2016, 17, 364]를 참조하고, 이에 의해, 그 전체가, 특히 논의 및 혐기성 및 호기성 대사의 마커를 위해 명시적으로 포함된다). 예를 들어, 미접촉 T 세포는 ATP를 생산하기 위해 미토콘드리아 호흡에 의존하는 반면, TIL과 같은 성숙한 건강한 효과기 T 세포는 증식, 이동, 활성화 및 항-종양 효능을 필요로 하는 생물 에너지 기질을 제공하기 위해 호기성 당분해에 의존하여 고도로 당분해된다.
현재의 TIL 제조 및 치료 공정은 길이, 비용, 멸균 문제, 및 본원에 기재된 다른 인자에 의해 제한되어, 항-PD1에 불응성인 환자를 치료할 가능성이 매우 제한되었다. 생존가능한 치료 옵션이 거의 없거나 전혀 없는 환자를 치료하는데 사용하기에 적합한 TIL 제조 방법 및 이러한 방법에 기초한 요법을 제공할 긴급한 필요성이 있다. 본 발명은 항-PD-1 치료에 불응성인 비소세포 폐 암종 (NSCLC) 환자의 치료에 사용될 수 있는 TIL의 생성에 사용하기 위한 단축된 제조 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 충족시킨다.
II. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 공보는 그 전체 내용이 인용하여 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "공-투여", "공-투여하는", "과 조합하여 투여된", "와 조합하여 투여하는", "동시에" 및 "동반"은 2종 이상의 활성 약제학적 성분 (본 발명의 바람직한 실시형태에서, 예를 들어, 복수의 TIL)을 대상체에게 투여하여 활성 약제학적 성분 및/또는 그의 대사물 둘 다가 대상체에게 동시에 존재하도록 하는 것을 포함한다. 공-투여는 별도의 조성물에서 동시 투여, 별도의 조성물에서 상이한 시간에 투여, 또는 2종 이상의 활성 제약 성분이 존재하는 조성물에서 투여를 포함한다. 별도의 조성물에서의 동시 투여 및 두 제제가 존재하는 조성물에서의 투여가 바람직하다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 대상체의 신체 외부에서 일어나는 사건을 지칭한다. 시험관내 검정은 살아있는 세포 또는 죽은 세포가 사용되는 세포-기반 검정을 포함하고, 또한 무손상 세포가 사용되지 않는 무세포 검정을 포괄할 수 있다.
용어 "생체외"는 대상체의 신체로부터 제거된 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 절차를 치료 또는 수행하는 것을 수반하는 사건을 지칭한다. 바람직하게, 세포, 조직 및/또는 기관은 수술 또는 치료 방법으로 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
용어 "급속 확장"은 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 3-배 (또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 또는 9-배), 더 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 10-배 (또는 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 또는 90-배), 또는 가장 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 100-배의 항원-특이적 TIL의 수의 증가를 의미한다. 수많은 급속 확장 프로토콜은 본원에 기재되어 있다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"이란 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득된 세포의 집단을 의미한다. TIL은, CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 비제한적으로 포함한다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 약술된 바와 같은 환자 조직 샘플로부터 수득된 것들(때때로 "새로운 수확"으로 지칭됨)이고, "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL("REP TIL" 또는 "후-REP-TIL")을 비제한적으로 포함하는, 본원에 논의된 바와 같이 확장 또는 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. TIL 세포 집단은 유전적으로 변형된 TIL을 포함할 수 있다.
본원에서 "세포의 집단" (TIL 포함)은 공통 형질을 공유하는 다수의 세포를 의미한다. 일반적으로, 집단은 일반적으로 그 수가 1 X 106 내지 1 X 1010의 범위이고, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다. 예를 들어, IL-2에서 1차 TIL의 초기 성장은 거의 1 × 108 세포의 벌크 TIL의 집단을 초래한다. REP 확장은 일반적으로 주입을 위해 1.5 × 109 내지 1.5 × 1010개의 세포의 집단을 제공하기 위해 수행된다.
본원에서 "동결보존된 TIL"은 1차, 벌크 또는 확장된 (REP TIL)이 약 -150℃ 내지 -60℃의 범위로 처리 및 저장되는 것을 의미한다. 동결보존을 위한 일반적인 방법은 또한 실시예에 포함되는 본원의 다른 곳에서 기재된다. 명확성을 위해, "동결보존된 TIL"은 1차 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 냉동된 조직 샘플과 구별될 수 있다.
본원에서 "해동된 동결보존된 TIL"이란 이전에 동결보존되고 이어서 세포 배양 온도 또는 TIL이 환자에게 투여될 수 있는 온도를 비제한적으로 포함하는 실온 이상으로 복귀하도록 처리된 TIL의 집단을 의미한다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 기능적으로 종양을 침윤시키고 치료를 수행하는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음의 바이오마커 중 하나 이상을 발현시킴으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, 및 CD25. 추가로 그리고 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입시 고형 종양을 침윤시키는 이들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.
용어 "동결보존 배지" 또는 "동결보존 배지"는 세포의 동결보존을 위해 사용될 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. 그와 같은 배지는 7% 내지 10% DMSO를 포함하는 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 배지는 CryoStor CS10, 하이퍼써마솔 (Hyperthermasol), 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 용어 "CS10"는 Stemcell Technologies 또는 Biolife Solutions로부터 수득되는 동결보존 배지를 지칭한다. CS10 배지는 상표명 "CryoStor® CS10"으로 지칭될 수 있다. CS10 배지는 DMSO를 포함하는 무혈청, 동물 성분 없는 배지이다.
용어 "중앙 기억 T 세포"는 인간에서 CD45R0+이고 CCR7 (CCR7hi) 및 CD62L (CD62hi)을 구성적으로 발현하는 T 세포의 서브세트를 지칭한다. 중앙 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중앙 기억 T 세포를 위한 전사 인자는 BCL-6, BCL-6B, MBD2, 및 BMI1를 포함한다. 중앙 기억 T 세포 주로 TCR 유발 후 효과기 분자로서 IL-2 및 CD40L를 분비한다. 중앙 기억 T 세포는 혈액에서 CD4 구획에서 우세하고, 인간에서 림프절 및 편도에서 비례적으로 풍부하다.
용어 "효과기 기억 T 세포"는 중앙 기억 T 세포와 같이 CD45R0+이지만, CCR7 (CCR7lo)의 구성적 발현을 상실하고 CD62L 발현 (CD62Llo)에 대해 불균질하거나 낮은 인간 또는 포유동물 T 세포의 서브세트를 지칭한다. 중앙 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중앙 기억 T 세포를 위한 전사 인자는 BLIMP1을 포함한다. 효과기 기억 T 세포는 인터페론-γ, IL-4, 및 IL-5를 포함하는, 항원 자극 후 높은 수준의 염증성 사이토카인을 신속하게 분비한다. 효과기 기억 T 세포는 혈액에서 CD8 구획에서 우세하고, 인간에서 폐, 간 및 장에서 비례적으로 풍부하다. CD8+ 효과기 기억 T 세포는 다량의 페르포린을 보유한다.
용어 "폐쇄 시스템"은 외부 환경에 폐쇄되는 시스템을 지칭한다. 세포 배양 방법에 적합한 임의의 폐쇄 시스템이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 폐쇄 시스템은, 예를 들어, 비제한적으로 폐쇄된 G-용기를 포함한다. 일단 종양 분절이 폐쇄 시스템에 추가되면, 시스템은 TIL이 환자에게 투여될 준비가 될 때까지 외부 환경으로 개방되지 않는다.
종양을 파괴하는 과정을 기술하기 위해 본원에 사용된 용어 "단편화하는", "단편", 및 "단편화된"은 종양 조직을 파쇄, 슬라이싱, 분할, 및 모셀레이팅(morcellating)하는 것과 같은 기계적 단편화 방법뿐만 아니라 종양 조직의 물리적 구조를 파괴하는 임의의 다른 방법을 포함한다.
용어들 "말초 혈액 단핵 세포" 및 "PBMC"는 림프구 (T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵구를 포함하는 둥근 핵을 가지고 있는 말초 혈액 세포를 지칭한다. 바람직하게는, 말초 혈액 단핵 세포는 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포이다. PBMC는 항원 제시 세포의 유형이다.
용어 "항-CD3 항체"는 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시되는 인간, 인간화, 키메라 또는 쥣과 항체를 포함한다. 항-CD3 항체는 무로모납으로 알려져 있는 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3ε로 알려져 있는 UHCT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체는, 예를 들어, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 및 비실리주맙을 포함한다.
용어 "OKT-3" (또한 본원에서 "OKT3"로 지칭됨)은 단클론성 항체 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시되는 인간, 인간화, 키메라 또는 쥣과 항체를 포함하고, 상업적으로 입수가능한 형태 예컨대 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수한, 미국 뉴욕주 샌디에고 소재의 Miltenyi Biotech, Inc.) 및 무로모납 또는 그의 변이체, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 무로모납의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 1에 주어진다 (서열번호:1 및 서열번호:2). OKT-3을 생성할 수 있는 하이브리도마는 American Type Culture Collection에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 CRL 8001로 할당된다. OKT-3을 생성할 수 있는 하이브리도마는 또한 European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)에 기탁되고 카탈로그 번호 86022706로 할당된다.
용어 "IL-2" (또한 본원에서 "IL2"로 지칭됨)은 인터류킨-2로 알려진 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유류 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 그의 변이체를 포함하는 모든 형태의 IL-2를 포함한다. IL-2는 예를 들어, 문헌[Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 및 Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.]에 기재되어 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:3). 예를 들어, 용어 IL-2는 인간, 재조합 형태의 IL-2 예컨대 알데스류킨 (일회용 바이알당 2천200백만 IU으로 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능한 프롤류킨), 뿐만 아니라 미국 뉴햄프셔주 포트마우스 소재의 CellGenix, Inc., (CELLGRO GMP) 또는 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급된 재조합 IL-2의 형태 및 다른 판매인으로부터 다른 상업적 등가물을 포괄한다. 알데스류킨 (des-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 비글리코실화된 인간 재조합 형태이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 알데스류킨의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:4). 용어 IL-2 또한 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 Nektar Therapeutics으로부터 입수가능한 페길화된 IL2 전구약물 NKTR-214를 포함하는, 본원에 기재된 IL-2의 페길화된 형태를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 페길화된 IL-2은 미국 특허출원공개 US 2014/0328791 A1호 및 국제 특허출원공개 WO 2012/065086 Al호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 대안적인 형태의 접합된 IL-2는 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4902,502호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제형은 미국 특허 제6,706,289호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
용어 "IL-4" (또한 본원에서 "IL4"로 지칭됨)은 Th2 T 세포에 의해 그리고 호산구, 호염기구, 및 비만 세포에 의해 생성된 인터류킨 4 로서 알려진 사이토카인을 지칭한다. IL-4는 미접촉 헬퍼 T 세포 (Th0 세포)의 Th2 T 세포로의 분화를 조절한다. 문헌[Steinke 및 Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70]. IL-4에 의한 활성화 시, Th2 T 세포는 후속으로 양성 피드백 루프에서 추가의 IL-4를 생성한다. IL-4는 또한 stimulate B 세포 증식 및 클래스 II MHC 발현을 자극하고, B 세포로부터 IgE 및 IgG1 발현의 클래스 전환을 유도한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-211) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. Gibco CTP0043)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:5).
용어 "IL-7" (또한 본원에서 "IL7"로 지칭됨)은 기질 및 상피 세포로부터, 뿐만 아니라 수지상 세포로부터 수득될 수 있는, 인터류킨 7로서 알려진 글리코실화된 조직-유래된 사이토카인을 지칭한다. 문헌[Fry 및 Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904]. IL-7은 T 세포의 발달을 자극할 수 있다. IL-7은 IL-7 수용체 알파 및 공통 감마 사슬 수용체로 이루어진 이종이량체인 IL-7 수용체를 결합하는데, 이는 흉선 내의 T 세포 발달 및 말초 내의 생존에 중요한 일련의 신호이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., (Cat. No. CYT-254) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. Gibco PHC0071)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7의 아미노산 서열 은 표 2에 주어진다 (서열번호:6).
용어 "IL-15" (또한 본원에서 "IL15"로 지칭됨)은 인터류킨-15로서 알려진 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유류 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 그의 변이체를 포함하는 모든 형태의 IL-2를 포함한다. IL-15은 예를 들어, 문헌[Fehniger 및 Caligiuri, 혈액 2001, 97, 14-32]에 기재되어 있고; 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. IL-15는 β 및 γ 신호전달 수용체 서브유닛을 IL-2와 공유한다. 재조합 인간 IL-15은 12.8 kDa의 분자량을 갖는 114개의 아미노산 (및 N-말단 메티오닌)을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 사슬이다. 재조합 인간 IL-15은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-230-b) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. 34-8159-82)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-15의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:7).
용어 "IL-21" (또한 본원에서 "IL21"로 지칭됨)은 인터류킨-21로서 알려진 다면발현성 사이토카인 단백질을 지칭하고, 인간 및 포유류 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 그의 변이체를 포함하는 모든 형태의 IL-21을 포함한다. IL-21은 예를 들어, 문헌[Spolski 및 Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95]에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. IL-21은 자연 살해 T 세포 및 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 의해 주로 생성된다. 재조합 인간 IL-21은 15.4 kDa의 분자량을 갖는 132개의 아미노산을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 사슬이다. 재조합 인간 IL-21은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-408-b) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-21 재조합 단백질, Cat. No. 14-8219-80)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-21의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:8).
"항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 "치료량"이 지시되는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 원에 기재된 종양 침윤 림프구 (예를 들어, 2차 TIL 또는 유전적으로 변형된 세포독성 림프구)를 포함하는 약제학적 조성물이 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여 104 내지 1011 세포/kg 체중 (예를 들어, 105 내지 106, 105 내지 1010, 105 내지 1011, 106 내지 1010, 106 내지 1011,107 내지 1011, 107 내지 1010, 108 내지 1011, 108 내지 1010, 109 내지 1011, 또는 109 내지 1010 세포/kg 체중)의 투여량으로 투여될 수 있음이 일반적으로 언급될 수 있다. 종양 침윤 림프구 (일부 경우에, 유전적으로 변형된 세포독성 림프구 포함) 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 종양 침윤 림프구 (일부 경우에, 유전적으로 포함)는 면역요법에서 통상적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988]를 참조한다). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 레지멘은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의약의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "미세환경"은 고체 또는 혈액 종양 미세환경을 전체적으로 또는 미세환경 내의 세포의 개별 하위세트를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 종양 미세환경은 문헌[Swartz, 등, Cancer Res., 2012, 72, 2473]에 기재된 바와 같이 "세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 매트릭스, 및 신생물성 형질전환을 촉진하고, 종양 성장 및 침윤을 지원하고, 숙주 면역으로부터 종양을 보호하고, 치료 내성을 강화하고, 우세 전이에서 성장에 대한 적소를 제공하는 기계적 단서"의 복합 혼합물을 지칭한다. 종양은 T 세포에 의해 인식되어야 하는 항원을 발현시키지만, 면역계에 의한 종양 청소능은 미세환경에 의한 면역 억제 때문에 드물다.
일 실시형태에서, 본 발명은 TIL 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하고, 여기서 환자는 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 전-치료된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 환자가 비골수절제 화학요법으로 예비치료되는 TIL 집단이 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 시클로포스파미드 60 mg/kg/d (TIL 주입 전 27일째 및 26일째) 및 5일 동안 플루다라빈 25 mg/m2/d (TIL 주입 전 27일째 내지 23일째)이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 비-골수절제 화학요법 및 TIL 주입(0일째) 후, 환자는 생리학적 허용 범위까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 받는다.
실험적 발견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전의 림프구고갈이 조절성 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소("사이토카인 싱크")를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 rTIL의 도입 전에 환자에게 림프구고갈 단계 (때때로 "면역억제성 컨디셔닝"으로도 지칭됨)를 이용한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 질환 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 의도된 적용을 달성하기에 충분한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 화합물의 조합의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 의도된 적용 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료되는 대상체 및 질환 상태 (예를 들어, 대상체의 체중, 연령 및 성별), 질환 상태의 중증도, 또는 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서 특정 반응(예를 들어, 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소)을 유도할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 화합물, 후속되는 투여 레지멘, 화합물이 다른 화합물과 조합하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여되는 조직, 및 화합물이 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다.
용어들 "치료", "치료하는", "치료한다."등은, 원하는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나 질환에 대한 부분적 또는 완전한 치유 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포괄하며, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 그의 발달 또는 진행을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 예를 들어 질환의 퇴행을 유발하는 것 및/또는 하나 이상의 질환 증상을 완화시키는 것을 포함한다. "치료"는 또한 심지어 질환 또는 병태의 부재 하에서도 약리학적 효과를 제공하기 위한 제제의 전달을 포괄하는 것을 의미한다. 예를 들어, "치료"는 예를 들어, 백신의 경우, 질환 상태의 부재 하에 면역 반응을 유발하거나 면역을 부여할 수 있는 조성물의 전달을 포괄한다.
핵산 또는 단백질의 부분과 관련하여 사용될 때 용어 "이종성"은 핵산 또는 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 전형적으로 재조합적으로 생산되고, 새로운 기능성 핵산, 예를 들어, 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 코딩 영역, 또는 상이한 공급원으로부터의 암호화 영역을 제조하기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 갖는다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열 (예를 들어, 융합 단백질)을 포함함을 나타낸다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 동일성" 및 "서열 퍼센트 동일성" (또는 그의 동의어, 예를 들어, "99% 동일")은, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대 대응을 위해 비교 및 정렬 (필요한 경우, 갭을 도입함)될 때, 동일하거나 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 2종 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당업계에 공지되어 있다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기에 적합한 프로그램은 예를 들어, 미국 정부의 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) BLAST 웹 사이트로부터 입수가능한 프로그램의 BLAST 스위트를 포함한다. 2개의 서열 사이의 비교는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하기 위해 사용되지만, BLASTP은 아미노산 서열을 비교하기 위해 사용된다. DNASTAR로부터 입수가능한ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) 또는 MegAlign은, 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 추가의 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 당업자는 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 항체의 아미노산 서열 내 또는 그에 인접한 특정 위치에서 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 참조 항체의 상기 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 비제한적으로 포괄한다. 변이체는 참조 항체의 아미노산 서열과 비교하여 그것의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들어, 유사하게 충전된 또는 미하전된 아미노산의 치환을 수반할 수 있다. 변이체는 참조 항체의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 용어 변이체는 또한 페길화된 항체 또는 단백질을 포함한다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"이란 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득된 세포의 집단을 의미한다. TIL은, CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 비제한적으로 포함한다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 약술된 바와 같은 환자 조직 샘플로부터 수득된 것들(때때로 "새로운 수확"으로 지칭됨)이고, "2차 TIL"은 본원에 논의된 벌크 TIL, 확장된 TIL ("REP TIL")뿐만 아니라 본원에 논의된 바와 같은 "reREP TIL"을 비제한적으로 포함하는, 본원에서 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. reREP TIL은 (예를 들어, reREP TIL로 지칭되는 TIL을 포함하는 도 8의 단계 D에 기재된 것들과 같은) 제2 확장 TIL 또는 제2 추가의 확장 TIL을 포함할 수 있다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 기능적으로 종양을 침윤시키고 치료를 수행하는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음의 바이오마커 중 하나 이상을 발현시킴으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, 및 CD25. 추가로, 및 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입 시 고형 종양을 침윤시키는 이들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 효능에 의해 추가로 특징지어질 수 있으며 - 예를 들어, TIL은, 예를 들어, 인터페론 (IFNγ) 방출이 약 50 pg/mL 초과, 약 100 pg/mL 초과, 약 150 pg/mL, 또는 약 200 pg/mL 초과, 약 300 pg/mL 초과, 약 400 pg/mL 초과, 약 500 pg/mL 초과, 약 600 pg/mL 초과, 약 700 pg/mL 초과, 약 800 pg/mL 초과, 약 900 pg/mL 초과, 약 1000 pg/mL 초과인 경우, 강력한 것으로 간주될 수 있다.
용어 "데옥시리보뉴클레오티드"는 천연 및 합성, 비변형된 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포괄한다. 변형은 당 모이어티, 염기 모이어티 및/또는 올리고뉴클레오티드 내의 데옥시리보뉴클레오티드 사이의 결합에 대한 변화를 포함한다.
용어 "RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 정의한다. 용어 "리보뉴클레오티드"는 b-D-리보푸라노스 모이어티의 2' 위치에 히드록실기를 갖는 뉴클레오티드를 정의한다. 용어 RNA는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 단리된 RNA 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA, 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 포함한다. 본원에 기재된 RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 자연 발생 RNA의 유사체 또는 유사체들로 지칭될 수 있다.
용어들 "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 약제학적 성분에 대한 그와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 약제학적으로 허용가능한 부형제의 용도는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 제약상 허용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 부형제가 활성 제약 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 치료 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 추가의 활성 약제학적 성분, 예컨대 다른 약물은, 또한 기재된 조성물 및 방법에 혼입될 수 있다.
용어들 "약" 및 "대략"은 값의 통계적으로 유의미한 범위 내인 것을 의미한다. 그와 같은 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 50% 이내, 더 바람직하게는 20% 이내, 더욱 더 바람직하게는 10% 이내, 및 더욱 더 바람직하게는 5% 이내일 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포함되는 허용가능한 변형은 연구 중인 특정 시스템에 의존하며, 당업자에 의해 용이하게 이해될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "약" 및 "대략"은 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 및 다른 양 및 특성이 정확하지 않고 정확할 필요는 없지만 대략적인 및/또는 더 큰 또는 더 작은, 원하는 경우, 허용 오차, 변환 인자, 반올림 계수, 측정 오차 등, 및 당업자에게 다른 인자일 수 있음을 의미한다. 일반적으로, 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 또는 다른 양 또는 특성은 그러한 것으로 명시적으로 언급되든 아니든 "약" 또는 "대략적인"이다. 매우 상이한 크기, 형상 및 치수의 실시형태가 설명된 배열들을 이용할 수 있다는 것이 주목된다.
전환 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "구성되는(consisting of)"은, 첨부된 청구범위에서, 원래 및 수정된 형태로 사용될 때, 인용되지 않은 추가적인 청구항 요소 또는 단계가 있다면, 청구항(들)의 범위로부터 배제되는 것에 대한 청구항 범위를 정의한다. 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 개방형인 것으로 의도되며, 임의의 추가의 언급되지 않은 요소, 방법, 단계 또는 물질을 배제하지 않는다. 용어 "로 이루어진"은 청구항에 명시된 것 이외의 임의의 요소, 단계 또는 물질, 및 후자의 경우, 명시된 물질(들)과 통상적으로 관련된 불순물을 배제한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 청구항을 명시된 요소, 단계 또는 물질(들) 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 본 발명을 구현하는 본원에 기재된 모든 조성물, 방법 및 키트는, 대안적인 실시형태에서, 전환 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 임의의 것에 의해 보다 구체적으로 정의될 수 있다.
용어들 "항체" 및 그것의 복수 형태 "항체"는 전체의 면역글로불린 및 임의의 항원-결합 단편 ("항원-결합부") 또는 그의 단일 사슬을 지칭한다. "항체"는 디설파이드 결합, 또는 그의 항원-결합부에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질을 추가로 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH)로 약칭됨 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. 항체의 VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)으로 지칭되고, 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역이 산재될 수 있는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원 에피토프 또는 에피토프와 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항원"는 면역 반응을 유도하는 물질(substance)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 TCR에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 본원에서 사용된 용어 "항원"은, 또한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 추가로 면역계에 의해 인식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 B 림프구 및/또는 T 림프구의 활성화를 유도하는 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 경우에, 이는 항원이 Th 세포 에피토프를 함유하거나 이에 연결되는 것을 필요로 할 수 있다. 항원은 또한 하나 이상의 에피토프 (예를 들어, B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 바람직하게는, 전형적으로 고도로 특이적이고 선택적인 방식으로, 그의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응할 것이고, 다른 항원에 의해 유도될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 반응하지 않을 것이다.
용어들 "단클론성 항체", "mAb", "단클론성 항체 조성물", 또는 그것의 복수 형태는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론성 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 특정 수용체에 특이적인 단클론성 항체는 적합한 항원과 함께 시험 대상체를 주입한 후 원하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 단리하는 분야의 지식 및 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 단클론성 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 그와 같은 DNA의 바람직한 공급원으로 쓰인다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이어서 숙주 세포, 예컨대 E. 콜리 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 수득한다. 항체의 재조합 생성은 아래에 더 상세히 기재될 것이다.
본원에서 사용된 항체의 용어들 "항원-결합부" 또는 "항원-결합 단편" (또는 간단히 "항체부" 또는 "단편")은, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 용어 "항원-결합부" 내에 포괄된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab′)2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 또는 VL 도메인으로 이루어질 수 있는 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward, 등, Nature, 1989, 341, 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 인코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지된 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있고; 예를 들어, 문헌[Bird, 등, Science 1988, 242, 423-426; 및 Huston, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883)]를 참조한다. 그와 같은 scFv 항체는 또한 항체의 용어 "항원-결합부" 또는 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "인간 단클론성 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 인간 단클론성 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환 또는 트랜스염색체인 동물 (예컨대 마우스)로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마 (하기에 추가로 기재됨), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 예를 들어, 트랜스펙토마, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 그와 같은 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 형질전환인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아이소타입"는 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 항체와 또 다른 활성 제약 성분 또는 항체의 접합체를 포함하는, 인간 항체의 임의의 변형된 형태를 지칭한다. 용어들 "접합체", "항체-약물 접합체", "ADC", 또는 "면역접합체"는 당업계에 이용가능한 방법을 사용하여 본원에 기재된 항체에 접합될 수 있는 또 다른 치료 모이어티에 접합된 항체, 또는 그의 단편을 지칭한다.
용어들 "인간화된 항체", "인간화된 항체", 및 "인간화된"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가의 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 행해진다. 인간화된 형태의 비-인간 (예를 들어, 쥣과) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는, 수령체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 수용력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 15개의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 행해진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대해, 문헌[Jones, 등, Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann, 등, Nature 1988, 332, 323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596]를 참조한다. 본원에 기재된 항체는 또한 효과기 기능 및/또는 FcR 결합의 개선 (예를 들어, 감소)을 부여하는 것으로 공지된 임의의 Fc 변이체를 사용하도록 변형될 수 있다. Fc 변이체는 예를 들어, 국제 특허출원공개 WO 1988/07089 A1호, WO 1996/14339 A1호, WO 1998/05787 A1호, WO 1998/23289 A1호, WO 1999/51642 A1호, WO 99/58572 A1호, WO 2000/09560 A2호, WO 2000/32767 A1호, WO 2000/42072 A2호, WO 2002/44215 A2호, WO 2002/060919 A2호, WO 2003/074569 A2호, WO 2004/016750 A2호, WO 2004/029207 A2호, WO 2004/035752 A2호, WO 2004/063351 A2호, WO 2004/074455 A2호, WO 2004/099249 A2호, WO 2005/040217 A2호, WO 2005/070963 A1호, WO 2005/077981 A2호, WO 2005/092925 A2호, WO 2005/123780 A2호, WO 2006/019447 A1호, WO 2006/047350 A2호, 및 WO 2006/085967 A2호; 및 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 및 제7,083,784호에 개시된 아미노산 치환 중 임의의 하나를 포함할 수 있고; 이들의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
용어 "키메라 항체"은 영역 서열은 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열은 또 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
"디아바디"은 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편이다. 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL 또는 VL-VH)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 짝짓고 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는, 예를 들어, 유럽 특허 EP 404,097호, 국제 특허 공개 WO 93/11161호; 및 문헌[Bolliger, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6444-6448]에 충분히 기재되어 있다.
용어 "글리코실화" 항체의 변형된 유도체를 지칭한다. 비-글리코실화된 항체는 글리코실화가 결여된다. 글리코실화는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 그와 같은 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 글리코실화의 하나 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 비-글리코실화(aglycosylation)는 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 기재된 바와 같이, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화 항체 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같은, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 그와 같은 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 그와 같은 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되었고 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포 로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8 (알파 (1,6) 푸코실트랜스퍼라제)결여됨으로써, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 그것의 탄수화물 상의 푸코스가 결여된다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적 파괴에 의해 생성되었다 (예를 들어, 문헌[미국 특허 공보 제2004/0110704호 또는 Yamane-Ohnuki, 등, Biotechnol. Bioeng., 2004, 87, 614-622]를 참조한다). 다른 예로서, 유럽 특허 EP 1,176,195호는 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있어서, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저푸코실화를 나타내고, 또한 항체의 Fc 영역에 결합하거나 효소 활성을 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위한 낮은 효소 활성을 갖는 세포주, 예를 들어, 랫트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)를 기재한다. 국제 특허 공개 WO 03/035835호는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주, Lec 13 세포를 기재한다(또한 문헌[Shields, 등, J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733-26740]를 참조한다). 국제 특허 공개 WO 99/54342호는 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시키도록 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재한다(또한 문헌[Umana, 등, Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180]을 참조한다). 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 문헌[Tarentino, 등, Biochem. 1975, 14, 5516-5523]에 기재된 바와 같은 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다.
"페길화"는 전형적으로 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응하는 변형된 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 페길화 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글라이콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글라이콜 또는 폴리에틸렌 글라이콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 페길화될 항체는 비-글리코실화된 항체일 수 있다. 페길화의 방법은 당해 기술에 알려져 있고 예를 들어, 유럽 특허 EP 0154316호 및 EP 0401384호 및 미국 특허 제5,824,778호에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체에 적용될 수 있고, 상기 특허 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
용어 "바이오시밀러"는 임상적으로 불활성인 성분에서의 사소한 차이에도 불구하고 미국 허가 참조 생물학적 제품과 매우 유사하고, 제품의 안전성, 순도 및 효능의 측면에서 생물학적 제품과 참조 제품 사이에 임상적으로 의미있는 차이가 없는 단클론성 항체 또는 단백질을 포함하는 생물학적 제품을 의미한다. 또한, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약청(European Medicines Agency)에 의해 사용되도록 이미 허가된 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관들에 의해 동의어로 사용된다. 생물학적 생성물 또는 생물학적 의약은 생물학적 공급원, 예컨대 박테리움 또는 효모에 의해 제조되거나 그로부터 유래된 의약이다. 상대적으로 작은 분자 예컨대 인간 인슐린 또는 에리트로포이에틴, 또는 복합 분자 예컨대 단클론성 항체로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 참조 IL-2 단백질이 알데스류킨 (프롤류킨)인 경우, 알데스류킨을 참조하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 단백질은 알데류스킨에 대한 "바이오시밀러"이거나 또는 알데류스킨의 "바이오시밀러"이다. 유럽에서, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약청 (EMA)에 의해 사용되도록 이미 허가된 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 유럽에서 유사한 생물학적 적용에 대한 관련 법적 근거는 개정된 바와 같이 규정(EC) 번호 726/2004의 6항 및 지침 2001/83/EC의 10(4)항이고, 따라서 유럽에서, 바이오시밀러는 허가되고, 허가를 위해 승인되거나 규정(EC) 번호 726/2004의 6항 및 지침 2001/83/EC의 10(4)항에 따른 허가를 위한 적용의 대상이 될 수 있다. 이미 허가된 원래의 생물학적 의약품은 유럽에서 "참조 의약품"으로서 지칭될 수 있다. 바이오시밀러인 것으로 간주되는 제품에 대한 요건의 일부는 유사한 생물학적 의약품에 대한 CHMP 가이드라인에 요약된다. 또한, 단클론성 항체 바이오시밀러에 관한 가이드라인을 포함하는 제품 특이적 가이드라인은 EMA에 의해 제품별로 제공되고 그의 웹사이트에 공개된다. 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 품질 특성, 생물학적 활성, 작용 기전, 안전성 프로파일 및/또는 효능에 의해 참조 의약물과 유사할 수 있다. 또한, 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있거나 사용되도록 의도될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 품질 특성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 효능을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유럽의 바이오시밀러는 EMA에 의해 허가된 참조 의약품과 비교된다. 그러나, 일부 사례에서, 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 영역 밖에서 허가된 생물학적 의약품(비-EEA 허가된 "비교기(comparator)")과 비교될 수 있다. 그와 같은 연구는 예를 들어, 특정 임상 및 생체내 비-임상 연구를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 허가된 비교기에 비교되거나 비교될 수 있는 생물학적 의약품에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 단백질 예컨대 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합부) 및 융합 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩티드의 기능에 유의한 영향을 미치지 않는 아미노산 구조 (예를 들어, 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환을 포함함)에 약간의 변형을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 그것의 참조 의약품의 아미노산 서열에 대해 97% 또는 그 초과, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 하나 이상의 번역후 변형, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및/또는 절단을 포함할 수 있으며, 이는 참조 의약품의 번역후 변형에 상이하지만, 단 차이는 의약품의 안전성 및/또는 효능의 변화를 초래하지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일한 또는 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 배타적이지는 않지만, 바이오시밀러는 차이가 참조 의약품과 관련된 안전성 우려를 해결하거나 해결하려고 하는 경우 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 추가로, 바이오시밀러는 예를 들어, 그것의 강도, 약제학적 형태, 제형, 부형제 및/또는 제시에 있어서 참조 의약품으로부터 벗어날 수 있으며, 의약품의 안전성 및 효능은 손상되지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여 예를 들어, 약동학적 (PK) 및/또는 약력학적 (PD) 프로파일의 차이를 포함할 수 있지만, 허가되거나 허가에 적합한 것으로 간주되는 참조 의약품과 충분히 유사한 것으로 여전히 간주된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여 상이한 결합 특성을 나타내고, 상이한 결합 특성은 EMA와 같은 규제 기관에 의해 유사한 생물학적 생성물로서의 허가에 대한 장벽이 아닌 것으로 간주된다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관들에 의해 동의어로 사용된다.
III. TIL 제조 공정
이들 특징 중 일부를 포함하는 공정 2A로서 공지된 예시적인 TIL 공정이 도 2에 도시되어 있고, 공정 1C에 대한 본 발명의 이러한 실시형태의 이점 중 일부가 도 F 및 G에 기재되어 있다. 공정 2A의 실시형태는 도 1에 도시된다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 환자에게 이식하기 전에 이들의 대사 활성 및 이에 따른 상대적 건강을 증가시키기 위해 동결보존된 TIL의 재자극에 관한 단계, 및 상기 대사 건강을 시험하는 방법을 포함할 수 있다. 본원에서 일반적으로 설명된 바와 같이, TIL은 일반적으로 환자 샘플로부터 채취되고 환자에게 이식하기 전에 그 수를 확장하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, TIL은 아래에 논의된 바와 같이 선택적으로 유전적으로 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, TIL은 동결보존될 수 있다. 일단 해동되면, 또한 환자에게 주입하기 전에 그것의 대사를 증가시키기 위해 재자극될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 (preREP로 지칭된 공정뿐만 아니라 단계 A로서 도 1에 도시된 공정 포함)은 3 내지 14일로 단축되고 제2 확장 (REP로 지칭된 공정뿐만 아니라 단계 B로서 도 1에 도시된 공정 포함)은 아래뿐만 아니라 실시예 및 도에도 상세히 논의된 바와 같이 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 B에 기재된 확장)은 11일로 단축되고 제2 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 기재된 확장)은 11일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장과 제2 확장의 조합 (예를 들어, 도 1의 단계 B 및 단계 D로서 기재된 확장)은 22일로 단축된다.
아래의 "단계" 지정들 A, B, C 등은 도 1을 참조하고 본 명세서에 설명된 특정 실시예를 참조한다. 아래 및 도 1에서의 단계들의 순서는 예시적이고, 단계들의 임의의 조합 또는 순서뿐만 아니라, 추가적인 단계들, 단계의 반복, 및/또는 단계의 생략이 본 출원 및 본 명세서에 개시된 방법에 의해 고려된다.
A. 단계 A: 환자 종양 샘플 수득
일반적으로, TIL은 초기에 환자 종양 샘플("1차 TIL")로부터 수득된 다음, 본원에 기재된 바와 같은 추가의 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 임의로 동결보존되고, 본원에 요약된 바와 같이 재자극되고, TIL 건강의 지표로서 표현형 및 대사 파라미터에 대해 선택적으로 평가된다.
환자 종양 샘플은 일반적으로 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 다른 수단을 통해 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다병변 샘플링이 사용된다. 일부 실시형태에서, 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 다른 수단은 다병변 샘플링 (즉, 환자의 하나 이상의 종양 부위 및/또는 위치, 뿐만 아니라 동일한 위치 또는 매우 근접한 하나 이상의 종양으로부터 샘플을 수득함)을 포함한다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침입성 종양 또는 전이성 종양을 포함하는 임의의 고형 종양으로부터 유래할 수 있다. 종양 샘플은 또한 액체 종양, 예컨대 혈액학적 악성종양으로부터 수득된 종양일 수 있다. 고형 종양은 폐 조직의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 TIL은 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)로부터 수득된다.
일단 수득되면, 종양 샘플은 일반적으로 날카로운 절개를 사용하여 1 내지 약 8 mm3의 작은 조작으로 단편화되고, 약 2-3 mm3이 특히 유용하다. TIL은 효소적 종양 소화물을 사용하여 이들 단편으로부터 배양된다. 그와 같은 종양 소화물은 효소적 배지 (예를 들어, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 완충액, 2 mM 글루타메이트, 10 mcg/mL 겐타마이신, 30 단위/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라겐분해효소)에서 인큐베이션, 그 다음 기계적 해리 (예를 들어, 조직 해리기 사용)에 의해 생성될 수 있다. 종양 소화물은 종양을 효소 배지에 넣고 종양을 약 1분 동안 기계적으로 해리시킨 후, 37℃에서 5% CO2 중에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 기계적 해리의 반복 사이클 및 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 상기 조건 하에서 인큐베이션함으로써 생성될 수 있다. 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우 최종 인큐베이션의 종료 시에, 콜 분지형 친수성 폴리사카라이드를 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. 대안적인 당해 분야에서 알려진 방법이 이용될 수 있고, 그 예는 개시내용이 본원에 인용되어 포함되는 미국 특허출원공개 제2012/0244133 A1호에 기재된 것들이다. 임의의 전술한 방법은 TIL을 확장시키는 방법 또는 암을 치료하는 방법을 위해 본원에 기재된 실시형태 중 임의의 것에 사용될 수 있다.
일반적으로, 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수확된" 세포 집단으로 칭한다.
일부 실시형태에서, 단편화는 예를 들어, 절개뿐만 아니라 소화를 포함하는 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 절개이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 소화에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 소화물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다. 일 실시형태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 소화물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양이 고형 종양인 경우, 종양 샘플이, 예를 들어, (도 1에 제공된 바와 같이) 단계 A에서 수득된 후 종양은 물리적 단편화를 겪는다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 후에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단편화는 종양을 수득한 후 그리고 임의의 동결보존의 부재에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 10, 20, 30, 40 또는 그 초과 개의 단편 또는 조각은 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 30 또는 40개의 단편 또는 조각은 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 40개의 단편 또는 조각은 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 4 내지 약 50 단편을 포함하되 각각의 단편은 약 27 mm3의 부피를 갖는다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1300 mm3 내지 약 1500 mm3의 총 부피를 갖는 약 30 내지 약 60 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1350 mm3의 총 부피를 갖는 약 50 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1 그램 내지 약 1.5 그램의 총 질량을 갖는 약 50 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 4 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 단편으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 날카로운 절개에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 8 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 2 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 3 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 4 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 5 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 6 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 7 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 8 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 9 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 10 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양은 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 1 mm x 1 mm x 1 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 2 mm x 2 mm x 2 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 3 mm x 3 mm x 3 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 4 mm x 4 mm x 4 mm이다.
일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 출혈성, 괴저성, 및/또는 지방 조직의 양을 최소화하기 위해 절제된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 출혈성 조직의 양을 최소화하기 위해 절제된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 괴저성 조직 양을 최소화하기 위해 절제된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 지방 조직의 양을 최소화하기 위해 절제된다.
일부 실시형태에서, 종양 단편화는 종양 내부 구조를 유지하기 위해 수행된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편화는 메스로 톱질 동작을 수행하지 않고 수행된다. 일부 실시형태에서, TIL은 종양 소화물로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 소화물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로 RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL 겐타마이신, 30 U/mL DNase, 및 1.0 mg/mL 콜라겐분해효소, 이어서 기계적 해리 (GentleMACS, 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotec)에서 인큐베이션에 의해 생성되었다. 종양을 효소 배지에 위치시킨 후, 종양은 대략 1 분 동안 기계적으로 해리될 수 있다. 이어서, 용액을 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 약 1분 동안 다시 기계적으로 파괴할 수 있다. 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양을 약 1분 동안 세 번째로 기계적으로 파괴할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 기계적 파괴 후, 큰 조직 조각이 존재하는 경우, 1 또는 2개의 추가의 기계적 해리를 5% CO2에서 37℃에서 30분의 추가의 인큐베이션과 함께 또는 인큐베이션 없이 샘플에 적용하였다. 일부 실시형태에서, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우 최종 인큐베이션의 종료 시에, 피콜을 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 단계 이전의 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수확된" 세포 집단으로 지칭한다.
일부 실시형태에서, 세포는 샘플 수확 후 선택적으로 냉동될 수 있고, 도 1에 예시될 뿐만 아니라, 하기에 더욱 상세히 기재되는 단계 B에 기재된 확장으로 진입하기 전에 냉동 저장될 수 있다.
B. 단계 B: 제1 확장
일부 실시형태에서, 본 방법은 대상체/환자에 투여 시 증가된 복제 주기를 가질 수 있는 어린(young) TIL을 수득하는 것을 제공하고, 따라서 더 오래된 TIL(즉, 대상체/환자에게 투여하기 전에 더 많은 복제 라운드를 추가로 거친 TIL)에 비해 추가의 치료적 이점을 제공할 수 있다. 어린 TIL의 특징은 문헌, 예를 들어, 문헌[Donia, 등, Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)]; 문헌[Dudley 등, Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)]; 문헌[Huang 등, J Immunother, 28(3):258-267 (2005)]; 문헌[Besser 등, Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)]; 문헌[Besser 등, J Immunother 32:415-423 (2009)]; 문헌[Robbins, 등, J Immunol 2004; 173:7125-7130]; 문헌[Shen 등, J Immunother, 30:123-129 (2007)]; 문헌[Zhou, 등, J Immunother, 28:53-62 (2005)]; 및 문헌[Tran, 등, J Immunother, 31:742-751 (2008)]에 기재되었고, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한적이지만 많은 수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (결합), 및 C (불변)은 결합 특이성 및 면역글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 새롭게 수확된 TIL 및/또는 TIL들과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 도 5 및/또는 도 6에서 예시된 바와 같이 공정 1C로 지칭된 방법을 사용하여 제조된 새롭게 수확된 TIL 및/또는 TIL들과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 있다.
예를 들어, 도 1의 단계 A에 기재된 것과 같은 종양 단편의 절개 또는 소화 후, 생성된 세포는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 촉진하는 조건 하에 IL-2를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 종양 소화물은 6000 IU/mL의 IL-2를 갖는 불활성화된 인간 AB 혈청을 포함하는 배지에서 2 mL 웰들에서 인큐베이션된다. 이러한 1차 세포 집단은 며칠 동안, 일반적으로 3 내지 14일 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 1차 세포 집단은 7 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 1차 세포 집단은 10 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 1차 세포 집단은 약 11일의 기간 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다.
바람직한 실시형태에서, TIL의 확장은 하기 및 본원에 기재된 초기 벌크 TIL 팽창 단계 (예를 들어, 프리-REP로 지칭되는 공정을 포함할 수 있는, 도 1의 단계 B에 기재된 것과 같음), 이어서 단계 D 및 본원에서 하기 기재된 제2 확장 (급속 확장 프로토콜 (REP) 단계로 지칭되는 공정을 포함하는 단계 D), 후속적으로 선택적 동결보존, 및 이어서 하기 및 본원에 기재되는 제2 단계 D (재자극 REP 단계로 지칭되는 공정 포함)를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 공정으로부터 수득된 TIL은 선택적으로 본원에 기재된 바와 같은 표현형 특성 및 대사 파라미터에 대해 특정화될 수 있다.
TIL 배양물이 24-웰 플레이트에서, 예를 들어, Costar 24-웰 세포 배양 클러스터, 편평한 바닥 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 Corning Incorporated)을 사용하여 개시되는 실시형태에서, IL-2 (6000 IU/mL; 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재의 Chiron Corp.)를 갖는 2 mL의 완전 배지 (CM)에서 각각의 웰은 1 × 106 종양 소화 세포 또는 하나의 종양 단편으로 씨딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭한다. 일부 실시형태에서, 단계 B에 대한 CM은 10% 인간 AB 혈청, 25 mM Hepes, 및 10 mg/mL 겐타마이신으로 보충된, GlutaMAX를 갖는 RPMI 1640으로 구성된다. 배양이 40 mL 용량 및 10 cm2 기체 투과성 실리콘 저부 (예를 들어, G-Rex10; 미국 미네소타주 뉴브링톤 소재의 Wilson Wolf Manufacturing) (도 1)를 갖는 기체 투과성 플라스크에서 개시되는 실시형태에서, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10-40 mL의 CM 중 10-40x106 생존가능한 종양 소화 세포 또는 5-30 종양 단편이 로딩되었다. G-Rex10 및 24-웰 플레이트는 모두 37℃에서 5% CO2 및 배양 개시 5일 후에 가습 인큐베이터에서 인큐베이션되었고, 배지의 절반이 제거되고 새로운 CM 및 IL-2로 대체되고, 5일 후, 배지 절반은 2 내지 3일마다 교체되었다.
종양 단편의 제조 후, 생성된 세포(즉, 단편)는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 촉진하는 조건 하에 IL-2를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 종양 소화물은 6000 IU/mL의 IL-2와 함께 불활성화된 인간 AB 혈청 (또는, 일부 경우에, 본원에 요약된 바와 같이, aAPC 세포 집단의 존재 하에)을 포함하는 배지에서 2 mL 웰에서 인큐베이션된다. 이러한 1차 세포 집단은 며칠 동안, 일반적으로 10 내지 14일 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1×108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 동안의 성장 배지는 IL-2 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL은 재조합 인간 IL-2 (rhIL-2)이다. 일부 실시형태에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 20-30×106 IU/mg의 고유 활성도(specific activity)를 갖는다. 일부 실시형태에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 20×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 25×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 30×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL- 2 스톡 용액은 그 최종 농도가 4-8×106 IU/mg의 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL- 2 스톡 용액은 그 최종 농도가 5-7×106 IU/mg의 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL- 2 스톡 용액은 그 최종 농도가 6×106 IU/mg의 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 10,000 IU/mL의 IL-2, 약 9,000 IU/mL의 IL-2, 약 8,000 IU/mL의 IL-2, 약 7,000 IU/mL의 IL-2, 약 6000 IU/mL의 IL-2 또는 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 9,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 8,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 7,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제, 및 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지에서 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지에서 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TNFRSF 효능제에 추가하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도에서 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도에서 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 그리고 하나 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"로 지칭한다. 일부 실시형태에서, CM1 (배양 배지 1)로 지칭한다. 일부 실시형태에서, CM은 10% 인간 AB 혈청, 25 mM Hepes, 및 10 mg/mL 겐타마이신으로 보충된, GlutaMAX를 갖는 RPMI 1640으로 구성된다. 배양이 40 mL 용량 및 10 cm2 기체 투과성 실리콘 저부 (예를 들어, G-Rex10; 미국 미네소타주 뉴브링톤 소재의 Wilson Wolf Manufacturing) (도 1)를 갖는 기체 투과성 플라스크에서 개시되는 실시형태에서, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10-40 mL의 CM 중 10-40x106 생존가능한 종양 소화 세포 또는 5-30 종양 단편이 로딩되었다. G-Rex10 및 24-웰 플레이트는 모두 37℃에서 5% CO2 및 배양 개시 5일 후에 가습 인큐베이터에서 인큐베이션되었고, 배지의 절반이 제거되고 새로운 CM 및 IL-2로 대체되고, 5일 후, 배지 절반은 2 내지 3일마다 교체되었다. 일부 실시형태에서, CM은 실시예 1을 참조하여 실시예에 기재된 CM1이다. 일부 실시형태에서, 제1 확장은 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 (예를 들어, 때때로 프리-REP로 지칭되는 것들을 포함할 수 있는 도 1의 단계 B에 기재된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 3 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 (예를 들어, 때때로 프리-REP로 지칭되는 것들을 포함할 수 있는 도 1의 단계 B에 기재된 것들과 같은 공정을 포함함)은 실시예에 논의되고 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 뿐만 아니라 예를 들어, 도 1의 단계 B에 기술된 바와 같은 확장을 포함하여 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 제1 확장은 10 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장은 예를 들어, 도 1의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장에서 논의된 바와 같이 11일로 단축된다.
일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 1일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 3일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 4일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 5일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 6일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 7일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 8일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 9일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 10일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 11일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 12일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 13일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 1일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 2일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 3일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 4일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 5일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 6일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 7일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 8일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 9일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 10일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 11일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 제1 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 예를 들어, 본원에 기재될 뿐만 아니라 도 1에 따른 단계 B 공정 동안을 비롯하여 제1 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 제1 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 1에 따른 그리고 본원에 기재된 바와 같은 단계 B 공정 동안에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 (프리-REP로 지칭되는 공정; 예를 들어, 도 1에 따른 단계 B를 포함함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 3 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 제1 확장은 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 제1 확장은 10 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장은 11일로 단축된다.
일부 실시형태에서, 제1 확장, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 B는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장에 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
C. 단계 C: 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행
일부 경우에, 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터 수득된 TIL 집단을 포함하는, 제1 확장으로부터 수득된 벌크 TIL 집단은, 본원의 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 제2 TIL 집단으로 지칭되는 제1 확장으로부터 수득된 TIL 집단은, 제2 확장 (이는 때때로 REP로 지칭된 확장을 포함할 수 있음)을 거칠 수 있고 그 다음 아래에 논의된 바와 같이 동결보존된다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 제1 TIL 집단 (때때로 벌크 TIL 집단을 지칭함) 또는 제2 TIL 집단 (일부 실시형태에서 REP TIL 개체로 지칭되는 집단을 포함할 수 있음)은 확장 전에 또는 제1 확장 후 그리고 제2 확장 전에 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터) 수득된 TIL은 선택을 위해 표현형이 될 때까지 저장된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터) 수득된 TIL은 저장되지 않고 제2 확장으로 직접 진행한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터 수득된 TIL은 제1 확장 후 및 제2 확장 전에 동결보존되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 4일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 4일 내지 10일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 14일에 일어난다.
일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 1일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 4일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 5일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 6일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 8일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 9일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 10일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 11일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 12일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 13일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 1일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 2일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 3일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 4일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 5일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 6일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 7일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 8일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 9일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 10일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 11일에 일어난다.
일부 실시형태에서, TIL은 제1 확장 후 및 제2 확장 전에 저장되지 않고, TIL 제2 확장으로 직접 진행한다(예를 들어, 일부 실시형태에서, 도 1에 도시된 바와 같이 단계 B로부터 단계 D로의 이행 동안 저장이 없다). 일부 실시형태에서, 이행은 본원에 기재된 바와 같이 폐쇄 시스템에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터의 TIL, TIL의 제2 집단은, 이행 기간 없이 제2 확장으로 직접 진행된다.
일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 C는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장에 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
1. 사이토카인
본원에 기재된 확장 방법은 일반적으로 당 업계에 공지된 바와 같이 높은 용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TIL의 급속 확장 및/또는 제2 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하며, 이는 국제공개 WO 2015/189356호 및 국제공개 WO 2015/189357호에 일반적으로 설명된 바와 같은 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 둘 이상의 조합이 있으며, 상기 공개들은 명시적으로 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하고, 후자는 많은 실시형태에서 특히 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 본원에 기재된 바와 같은 림프구, 및 특히 T-세포의 생성에 특이적으로 유리하게 작동한다.
D. 단계 D: 제2 확장
일부 실시형태에서, TIL 세포 집단은 수확 및 초기 벌크 가공 후, 예를 들어, 단계 A 및 단계 B, 및 도 1에 나타낸 바와 같이 단계 C로 지칭되는 이행 후에 수가 확대된다. 이는 또한 급속 확장 공정 (REP; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 공정)으로서 당업계의 일반적으로 지칭된 확장 공정을 포함할 수 있는 제2 확장으로서 본원에서 지칭된다. 제2 확장은 일반적으로 기체 투과성 용기에서 피더 세포, 사이토카인 공급원, 및 항-CD3 항체를 포함하는 수많은 구성요소를 포함하는 배양 배지를 사용하여 달성된다.
일부 실시형태에서, TIL의의 제2 확장 또는 두 번째 TIL 확장 (때때로 REP로 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 공정을 포함할 수 있음)은 당업자에게 알려진 임의의 TIL 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 7일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 8일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 약 9일 내지 약 14일 확장은 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 10일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 11일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 12일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 13일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 14일 동안 진행될 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 확장은 본 개시내용의 방법 (예를 들어, REP로 지칭된 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 공정을 포함함)을 사용하여 기체 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-15 (IL-15)의 존재에서 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 빠르게 확장될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은 예를 들어, 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 단클론성 항-CD3 항체 (미국 뉴저지주 라리탄 소재의 Ortho-McNeil 또는 미국 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotech로부터 상업적으로 입수가능함) 또는 UHCT-1 (미국 뉴욕주 샌디에고 소재의 BioLegend로부터 상업적으로 입수가능함)을 포함할 수 있다. TIL은 선택적으로 T-세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재에서 벡터, 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3 μΜ MART-1 :26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)로부터 선택적으로 발현될 수 있는 암의 에피토프(들)와 같은 항원부를 비롯하여 제2 확장 동안 하나 이상의 항원을 포함함으로써 시험관내의 추가 자극을 유도하기 위해 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원은 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그의 항원부를 포함할 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2-발현 항원 제시 세포 상에서 펄스화된 암의 동일한 항원(들)에 의한 재자극에 의해 빠르게 확장될 수 있다. 대안적으로, TIL은 예를 들어, 조사된, 자가 림프구로 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 추가로 재자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재자극은 제2 확장의 일부로서 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 조사된, 자가 림프구의 존재에서 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2와 함께 일어난다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제, 및 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지에서 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지에서 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TNFRSF 효능제에 추가하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도에서 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도에서 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 그리고 하나 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 예를 들어, 도 1에 따른 단계 D 공정, 뿐만 아니라 본원에 기재된 것 동안을 포함하는 제2 확장 동안 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 1에 따른 단계 D 공정 동안 그리고 본원에 기재된 바와 같이 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3, 항원 제시 피더 세포, 및 선택적으로 TNFRSF 효능제를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 보충된 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 보충된 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC; 또한 항원 제시 피더 세포로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 피더 세포 (즉, 항원 제시 세포)를 포함하는 세포 배양 배지에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 실시형태에서 항원 제시 피더 세포 (APC)는 PBMC이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서 TIL 대 PBMC 및/또는 항원 제시 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장 중의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장 중의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일 실시형태에서, REP 및/또는 제2 확장은 플라스크에서 수행되고, 벌크 TIL은 150 ml 배지에서 100- 또는 200-배 과잉의 불활성화된 피더 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2 와 혼합된다. 배지 교체(일반적으로 신선한 배지로의 호흡을 통한 2/3 배지 교체)는 세포가 대안적인 성장 챔버로 이동될 때까지 수행된다. 대안적인 성장 챔버는 아래에 더 충분히 논의된 바와 같이 G-REX 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 (REP 공정으로 지칭되는 공정을 포함할 수 있음)은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 11일로 단축된다.
일 실시형태에서, REP 및/또는 제2 확장은 앞서 기재된 바와 같은 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (문헌[Tran, 등, J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42]) 또는 기체 투과성 배양기 (G-Rex 플라스크)를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 (급속 확장으로 지칭되는 확장을 포함함)은 T-175 플라스크에서 수행되고, 150 mL의 배지에 현탁된 약 1 x 106 TIL은 각각의 T-175 플라스크에 첨가될 수 있다. TIL은 3000 IU /mL의 IL-2 및 30 ng /mL의 항-CD3로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물에서 배양될 수 있다. T-175 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 배지의 절반은 3000 IU /mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 5일째에 교환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 7일째에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포는 3 L 백에서 조합될 수 있고 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V는 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가되었다. 각각의 백 내의 세포의 수는 매일 또는 2회 계수될 수 있고 새로운 배지는 첨가되어 세포수 0.5 내지 2.0 x 106 세포/mL의 세포수를 유지할 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭된 확장, 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 언급된 것을 포함할 수 있음)은 100 cm 기체 투과성 실리콘 저부 (미국 미네소타주 뉴브링턴 소재의 Wilson Wolf Manufacturing Corporation로부터 상업적을 입수가능한 G-Rex 100)를 갖는 500 mL 수용력 기체 투과성 플라스크에서 수행될 수 있고, 5 × 106 또는 10 × 106 TIL은 5% 인간 AB 혈청, 3000 IU /mL의 IL-2 및 30 ng /mL의 항-CD3 (OKT3)으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 PBMC 와 함께 배양될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 5일째에, 250 mL의 상청액은 제거되고 원심분리기 병에 배치되고 10분 동안 1500 rpm (491 × g)에서 원심분리된다. TIL 펠렛은 5% 인간 AB 혈청, 3000 IU /mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 배지로 재현탁될 수 있고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 추가된다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 확장되는 경우, 7일째에 각 G-Lex 100의 TIL은 각 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에서 현탁될 수 있고, 세포 현탁액은 3개의G-Rx 100 플라스크를 씨딩하는 데 사용될 수 있는 3개의 100 mL 분취액으로 나누어질 수 있다. 그 다음, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU /mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 플라스크에 첨가될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있고 4일 후 3000 IU /mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 G-REX 100 플라스크에 첨가될 수 있다. 세포는 배양 14일째에 수확될 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭된 확장을 포함함)은 플라스크에서 수행되고, 벌크 TIL은 150 ml 배지에서 100- 또는 200-배 과잉의 불활성화된 피더 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 세포가 대안적인 성장 챔버로 이동될 때까지 배치 대체가 수행된다. 일부 실시형태에서, 배지의 2/3는 새로운 배지를 갖는 호흡으로 대체된다. 일부 실시형태에서, 대안적인 성장 챔버는 아래에 더 충분히 논의된 바와 같은 G-REX 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭된 확장을 포함함)은 수행되고 추가로 TIL이 우수한 종양 반응성에 대해 선택된 단계를 포함한다. 당업계에서 알려진 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 인용되어 포함된미국 특허출원공개 제2016/0010058 A1호에 기재된 방법은 우수한 종양 반응성에 대한 TIL의 선택을 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, 세포 생존력 검정 당업계에서 알려진 표준 검정을 사용하여 제2 확장 (REP 확장으로 지칭된 확장을 포함함) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 배제 검정은 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 이는 선택적으로 죽은 세포를 표지하고 생존력 평가를 허용한다. 일부 실시형태에서, TIL 샘플 계수될 수 있고 생존력은 Cellometer K2 자동화 세포 계수기 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생존력은 표준 Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter 프로토콜에 따라 결정된다.
일부 실시형태에서, TIL의 제2 확장 (REP로 지칭된 확장을 포함함)은 앞서 기재된 바와 같은 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (문헌[Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, 등, 2008, J Immunother., 31:742-751, 및 Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, 등 2003, J Immunother., 26:332-342]) 또는 기체 투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 기체 투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 T-175 플라스크에서 수행되고, 약 1 x 106 TIL은 약 150 mL의 배지에서 현탁되고 이는 각각의 T-175 플라스크에 첨가된다. TIL은 1 대 100의 비(ratio)로 "공급기" 세포로서 조사된 (50 Gy) 동종이계 PBMC과 함께 배양되고 세포는 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3로 보충된 CM 및 AIM-V 배지 (50/50 배지)의 1 대 1 혼합물에서 배양되었다. T-175 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 배지의 절반은 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 5일째에 변화된다. 일부 실시형태에서, 7일째에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포는 3 L 백에서 조합되고 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V는 300 mL의 TIL 현탁액에 첨가된다. 각각의 백 내의 세포의 수는 매일 또는 2회 계수될 수 있고, 새로운 배지는 첨가되어 약 0.5 내지 약 2.0 x 106 세포/mL의 세포수를 유지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭되는 팽창을 포함함)을 100 cm2 기체-투과성 실리콘 저부 (G-Rex 100, Wilson Wolf) (도 1)를 갖는 500 mL 용량 플라스크에서 수행되고, 약 5x106 또는 10x106 TIL은 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/ml의 항-CD3으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 1 대 100의 비로 조사된 동종이계 PBMC와 함께 배양한다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 5일째에, 250 mL의 상청액은 제거되고 원심분리기 병에 배치되고 10분 동안 1500 rpm (491g)에서 원심분리된다. 이어서, TIL 펠렛은 3000 IU/mL의 IL-2와 함께 150 mL의 새로운 50/50 배지로 재현탁되고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 첨가될 수 있다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 확장되는 실시형태에서, 7일째에 각 G-Lex 100의 TIL은 각 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에서 현탁되고, 세포 현탁액은 3개의 100 mL 분취액으로 나누고, 이는 3개의G-Rx 100 플라스크를 씨딩하는 데 사용되었다. 그 다음, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 플라스크에 추가된다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션되고 4일 후 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 G-Rex 100 플라스크에 추가된다. 세포는 배양 14일째 수확된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한적이지만 많은 수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (결합), 및 C (불변)은 결합 특이성 및 면역글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제2 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중의 하나에 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 있다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지 (예를 들어, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로 지칭함)는, 아래에 더 상세히 논의된 바와 같이 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제시 피더 세포 (APC)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 확장, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 D는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장에 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
1. 피더 세포 및 항원 제시 세포
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차 (예를 들어, 확장 예컨대 도 1의 단계 D에 기재된 것, 뿐만 아니라 REP로 지칭된 것을 포함함)은 REP TIL 확장 및/또는 제2 확장 동안 과잉의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 건강한 혈액 공여체로부터 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 실시예에 기재된 바와 같이 REP 절차에서 사용되며, 이는 조사 동종이계 PBMC의 복제 불능(incompetence)을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공한다.
일부 실시형태에서, PBMC는, 14일째에 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0 일째에 배양된 초기 생존 세포 수보다 더 적은 경우 (즉, 제2 확장의 시작일), 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하기 위해 복제 부적합한 것으로 간주되고 허용된다.
일부 실시형태에서, PBMC는, 7일째 및 14일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0 일째에 배양된 초기 생존 세포 수로부터 증가되지 않는 경우 (즉, 제2 확장의 시작일), 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하기 위해 복제 부적합한 것으로 간주되고 허용된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30 ng/ml OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, PBMC는, 7일째 및 14일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0 일째에 배양된 초기 생존 세포 수로부터 증가되지 않는 경우 (즉, 제2 확장의 시작일), 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하기 위해 복제 부적합한 것으로 간주되고 허용된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 5-60 ng/ml OKT3 항체 및 1000-6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 10-50 ng/ml OKT3 항체 및 2000-5000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 20-40 ng/ml OKT3 항체 및 2000-4000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 25-35 ng/ml OKT3 항체 및 2500-3500 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 PBMC이다. 일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 인공 항원 제시 피더 세포이다. 일 실시형태에서, 제2 확장 중의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시형태에서, 제2 확장 중의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시형태에서, 제2 확장 중의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5x109 피더 세포 대 약 100x106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5x109 피더 세포 대 약 50x106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5x109 피더 세포 내지 약 25x106 TIL을 필요로 한다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 제2 확장 동안 과잉의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 건강한 혈액 공여체로부터 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크(Ficoll-Paque) 구배 분리를 사용하여 수득된다. 일 실시형태에서, 인공 항원 제시 (aAPC) 세포는 PBMC 대신에 사용된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 도면 및 실시예에 기재된 예시적인 절차를 포함하는 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용된다.
일 실시형태에서, 인공 항원 제시 세포는 PBMC의 대체물로서 또는 PBMC와 조합하여 제2 확장에서 사용된다.
2. 사이토카인
본원에 기재된 확장 방법은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 높은 용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TIL의 급속 확장 및/또는 제2 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하며, 이는 국제공개 WO 2015/189356호 및 국제공개 WO 2015/189357호에 일반적으로 설명된 바와 같은 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 둘 이상의 조합이 있으며, 상기 공개들은 명시적으로 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하고, 후자는 많은 실시형태에서 특히 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 본원에 기재된 바와 같은 림프구, 및 특히 T-세포의 생성에 특이적으로 유리하게 작동한다.
E. 단계 E: TIL의 수확
제2 확장 단계 후에, 세포가 수확될 수 있다. 일부 실시형태에서 TIL은 예를 들어, 도 1에 제공된 바와 같은 1, 2, 3, 4 또는 그 초과의 확장 단계들 후에 수확된다. 일부 실시형태에서 TIL은 예를 들어, 도 1에 제공된 바와 같이 2개의 확장 단계 후에 수확된다.
TIL은 예를 들어, 원심분리를 포함하는 임의의 적절하고 멸균된 방식으로 수확될 수 있다. TIL 수확을 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 임의의 이러한 공지된 방법이 본 공정에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 자동화시스템을 사용하는 수확이다.
세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 예를 들어, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, 및 Inotech Biosystems International, Inc.를 포함하는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 임의의 세포 기초 수확기는 본 방법으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 막 기반 세포 수확기이다. 일부 실시형태에서, 세포 수확은 세포 가공 시스템, 예컨대 LOVO 시스템 (Fresenius Kabi 제조)을 통해 이루어진다. 용어 "LOVO 세포 처리 시스템"은 또한 멸균 및/또는 폐쇄 시스템 환경에서 막 또는 필터, 예컨대 방사 막 또는 방사 필터를 통해 세포를 포함하는 용액을 펌핑할 수 있는 임의의 판매인에 의해 제조된 임의의 기구 또는 장치를 지칭하며, 펠릿화 없이 상청액 또는 세포 배양 배지를 제거하기 위해 연속 유동 및 세포 처리를 허용한다. 일부 실시형태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 폐쇄된 멸균 시스템에서 세포 분리, 세정, 유체-교환, 농도, 및/또는 다른 세포 가공 단계들을 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 수확, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 E는, 폐쇄 시스템 생물반응기로부터 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장에 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
일부 실시형태에서, 도 1에 따른 단계 E는, 실시예 G에 기재된 공정에 따라 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균성 및 폐쇄 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시형태에서, 실시예 G에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다.
일부 실시형태에서, TIL은 실시예 G에 기재된 방법에 따라 수확된다. 일부 실시형태에서, 1일째와 11일째 사이의 TIL은 섹션 8.5에 기재된 방법을 사용하여 수확된다(실시예 G에서 11일째의 TIL 수확으로 지칭됨). 일부 실시형태에서, 12일째와 22일째 사이의 TIL은 섹션 8.12에 기재된 방법을 사용하여 수확된다(실시예 G에서 22일째의 TIL 수확으로 지칭됨).
F. 단계 F: 최종 제형/주입 백으로의 이동
도 1에서 예시적인 순서로 제공되고 상기 및 본원에 상세히 약술된 바와 같은 단계 A 내지 E가 완료된 후, 세포는 환자에게 투여 시 사용하기 위해 용기로 이동된다. 일부 실시형태에서, 일단 치료상 충분한 수의 TIL이 상기 기재된 확장 방법을 사용하여 수득되면, 이들은 환자에게 투여 시 사용하기 위한 용기로 이동된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 APC를 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당해 분야에서 알려진 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되고, 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척추강내, 및 림프내를 포함한다.
G. 선택적 세포 배지 구성요소
1. 항-CD3 항체
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 확장 방법에 사용되는 배양 배지 (REP로 지칭되는 것을 포함하고, 예를 들어, 도 1을 참조함)은 또한 항-CD3 항체를 유도한다. IL-2와 조합한 항-CD3 항체는 TIL 집단에서 T 세포 활성화 및 세포 분열을 유도한다. 이 효과 전장 항체뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편에서 볼 수 있고, 전자는 일반적으로 바람직하고; 예를 들어, 문헌[Tsoukas 등, J. Immunol. 1985, 135, 1719]를 참조하고, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 쥣과, 인간, 영장류, 랫트, 및 갯과 항체를 비제한적으로 포함하는 다양한 포유동물로부터의 항-인간 CD3 다클론성 및 단클론성 항체를 비롯하여 본 발명에 사용되는 수많은 적합한 항-인간 CD3 항체가 있다. 특정 실시형태에서, OKT3 항-CD3 항체가 사용된다(뉴저지주 라리탄 소재의 Ortho-McNeil 또는 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotech로부터 상업적으로 입수가능하다).
2. 4-1BB (CD137) 효능제
일 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB (CD137) 효능제이다. 4-1BB 효능제는 당업계에서 알려진 임의의 4-1BB 결합 분자일 수 있다. 4-1BB 결합 분자는 인간 또는 포유류 4-1BB에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 아이소타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 항체 (전장 항체 포함), 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab′) 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어, 4-1BB에 결합하는 scFv 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 완전 인간 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 인간화된 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 4-1BB 효능제는 항-4-1BB 항체, 인간 항-4-1BB 항체, 마우스 항-4-1BB 항체, 포유류 항-4-1BB 항체, 단클론성 항-4-1BB 항체, 다클론성 항-4-1BB 항체, 키메라 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 아드넥틴, 항-4-1BB 도메인 항체, 단일 사슬 항-4-1BB 단편, 중쇄 항-4-1BB 단편, 경쇄 항-4-1BB 단편, 항-4-1BB 융합 단백질, 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 작용적 항-4-1BB 항체는 강한 면역 반응을 포함하는 것으로 알려져 있다. 문헌[Lee, 등, PLOS One 2013, 8, e69677]. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 작용적, 항-4-1BB 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체 (즉, 단세포주에서 유래된 항체)이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), 유토밀루맙, 또는 우렐루맙, 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 또는 바이오시밀러이다. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙 또는 우렐루맙, 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 또는 바이오시밀러이다.
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 또한 융합 단백질일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 갖는) 다량체 4-1BB 효능제, 예컨대 삼량체 또는 육량체 4-1BB 효능제는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 작용적 단클론성 항체와 비교하여 우수한 수용체 (4-1BBL) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 착물 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2종 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그 초과의 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47]에 기재되어 있다.
작용적 4-1BB 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 4-1BB 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존적 세포 독성 (ADCC), 예를 들어, NK 세포 세포독성을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP)을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 Fc 영역 작용성을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 고친화도 및 작용적 활성으로 인간 4-1BB (서열번호:9)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 인간 4-1BB (서열번호:9)에 결합하는 결합 분자이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 쥣과 4-1BB (서열번호:10)에 결합하는 결합 분자이다. 4-1BB 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 4-1BB 항원의 아미노산 서열은 표 6에 요약된다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8 × 105 l/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의로 kassoc 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 PF-05082566 또는 MOR-7480 로도 알려져 있는 유토밀루맙, 또는 단편, 유도체, 변이체, 또는 그의 바이오시밀러이다. 유토밀루맙은 Pfizer, Inc로부터 입수 가능하다. 유토밀루맙은 면역글로불린 G2-람다, 항-[호모사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 일원 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모사피엔스 (완전 인간) 단클론성 항체이다. 유토밀루맙의 아미노산 서열은 표 EE에 제시된다. 유토밀루맙은 Asn59 및 Asn292에서 글리코실화 부위; 위치 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) 및 362-420 (CH3)에서 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 22'-87' (VH-VL) 및 136'-195' (CH1-CL)에서 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; IgG2A 동형체 위치 218-218, 219-219, 222-222, 및 225-225에서, IgG2A/B 동형체 위치 218-130, 219-219, 222-222, 및 225-225에서, 그리고 IgG2B 동형체 위치 219-130 (2), 222-222, 및 225-225에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 IgG2A 동형체 위치 130-213' (2), IgG2A/B 동형체 위치 218-213' 및 130-213'에서, 그리고 IgG2B 동형체 위치 218-213' (2)에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 유토밀루맙 및 그것의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,821,867; 8,337,850; 및 9,468,678, 및 국제 특허출원공개 WO 2012/032433 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 유토밀루맙의 전임상 특성은 문헌[Fisher, 등, Cancer Immunolog. & Immunother. 2012 , 61, 1721-33]에 기재되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서 유토밀루맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066, 및 NCT02554812를 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:11에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:12에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:13에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:14에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:15, 서열번호:16, 및 서열번호:17 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:18, 서열번호:19, 및 서열번호:20 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이고, 상기 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다.
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 BMS-663513 및 20H4.9.h4a로도 알려져 있는 단클론성 항체 우렐루맙, 또는 단편, 유도체, 변이체, 또는 그의 바이오시밀러이다. 우렐루맙은 Bristol-Myers Squibb, Inc., 및 Creative Biolabs, Inc.로부터 입수 가능하다. 우렐루맙은 면역글로불린 G4-카파, 항-[호모사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 일원 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모사피엔스 (완전 인간) 단클론성 항체이다. 우렐루맙의 아미노산 서열은 표 EE에 제시된다. 우렐루맙은 위치 298 (및 298'')에서 N-글리코실화 부위; 위치 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) 및 368-426 (CH3)에서 (그리고 위치 22''-95'', 148''-204'', 262''-322'', 및 368''-426''에서) 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 136'-196' (CH1-CL)에서 (그리고 위치 23'''-88''' 및 136'''-196'''에서) 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 227-227'' 및 230-230''에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 135-216' 및 135''-216'''에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 우렐루맙 및 그것의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,288,638호 및 제8,962,804호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 우렐루맙의 전임상 및 임상 특성은 문헌[Segal, 등, Clin. Cancer Res. 2016, http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272에서 이용가능함]에 기재되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서 우렐루맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992, 및 NCT01471210을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:21에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:22에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:23에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:24에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:25, 서열번호:26, 및 서열번호:27 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:28, 서열번호:29, 및 서열번호:30 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이고, 상기 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), ATCC 번호 HB-11248로 기탁되고 미국 특허 제6,974,863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446)에 기재된 세포주에 의해 생성된 항체, 미국 특허출원공개 US 2005/0095244호에 개시된 항체, 미국 특허 제7,288,638호에 개시된 항체 (예컨대 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), 미국 특허 제6,887,673호에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 제7,214,493호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,303,121호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,569,997호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,905,685호에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 제6,362,325호에 개시된 항체 (예컨대 1D8 또는 BMS-469492; 3H3 또는 BMS-469497; 또는 3El), 미국 특허 제6,974,863호에 개시된 항체 (예컨대 53A2); 미국 특허 제6,210,669호에 개시된 항체 (예컨대 1D8, 3B8, 또는 3El), 미국 특허 제5,928,893호에 기재된 항체, 미국 특허 제6,303,121호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,569,997호에 개시된 항체, 국제 특허출원공개 WO 2012/177788호, WO 2015/119923호, 및 WO 2010/042433호에 개시된 항체, 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 또는 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 전술한 특허 또는 특허출원공개의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 국제 특허출원공개 WO 2008/025516 A1호, WO 2009/007120 A1호, WO 2010/003766 A1호, WO 2010/010051 A1호, 및 WO 2010/078966 A1; 미국 특허출원공개 US 2011/0027218 A1호, US 2015/0126709 A1호, US 2011/0111494 A1호, US 2015/0110734 A1호, 및 US 2015/0126710 A1호; 및 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재된 4-1BB 작용적 융합 단백질이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 도 10에 제공된 바와 같은 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 도시된 바와 같은 4-1BB 작용적 융합 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 또는 바이오시밀러이다.
구조 I-A 및 I-B에서, 실린더(cylinder)는 개별 폴리펩티드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어, 4-1BBL로부터 유래된 3개의 선형-연결된 TNFRSF 결합 도메인, 또는 4-1BB에 결합하는 항체를 포함하고, 이는 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이어서 IgG1-Fc를 통해 제2 3가 단백질에 연결되고 (CH3 및 CH2 도메인을 포함함), 이어서 3가 단백질 중 2개를 설파이드 결합 (작은 신장된 계란형)을 통해 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고, 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 합쳐서신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제를 제공한다. 실린더로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어, 가요성을 위한 Gly 및 Ser 서열과 친수성 잔기뿐만 아니라 용해도를 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다. 임의의 scFv 도메인 디자인은 문헌[de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, 등, Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250]; 문헌[Monnier, 등, Antibodies, 2013, 2, 193-208]; 또는 본원의 다른 곳에 포함된 참조문헌에 기재된 것과 같이 사용될 수 있다. 이러한 형태의 융합 단백질 구조는 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
구조 I-A의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 GG에 주어진다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열번호:31의 아미노산 17-230), 완전 힌지 도메인 (서열번호:31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부 (예를 들어, 서열번호:31의 아미노산 4-16)을 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함하여 서열번호:32 내지 서열번호:41에 주어진 실시형태로부터 선택될 수 있다.
구조 I-B의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 HH에 주어진다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호:42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호:43 내지 서열번호:45에 제시된 실시형태로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 우렐루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 GG에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전술한 가변 중쇄와 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인, 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 및 바이오시밀러를 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열번호:46에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 가용성 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열번호:47에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함, 상기 영역 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 표 11에 주어진 VH 및 VL 서열 과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 추가로 N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 각각의 가용성 4-1BB 도메인은 줄기 영역(삼량체화에 기여하고 세포막에 일정한 거리를 제공하지만 4-1BB 결합 도메인의 일부가 아님)이 결여되고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역이 결여되어 있고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 가지며, 그리고 각각의 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 4-1BB 결합 도메인이다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 전술한 VL 도메인 중 임의의 것에 연결된 전술한 VH 도메인의 임의의 것을 포함하는 4-1BB 작용적 scFv 항체이다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BPS Bioscience로부터 상업적으로 입수가능한 BPS Bioscience 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 79097-2이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs로부터 상업적으로 입수가능한 Creative Biolabs 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 MOM-18179이다.
3. OX40 (CD134) 효능제
일 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 OX40 (CD134) 효능제이다. OX40 효능제는 당업계에서 알려진 임의의 OX40 결합 분자일 수 있다. OX40 결합 분자는 인간 또는 포유류 OX40에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 아이소타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 항체 (전장 항체 포함), 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab′) 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어, OX40에 결합하는 scFv 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 완전 인간 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 인간화된 항체인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 OX40 효능제는 항-OX40 항체, 인간 항-OX40 항체, 마우스 항-OX40 항체, 포유류 항-OX40 항체, 단클론성 항-OX40 항체, 다클론성 항-OX40 항체, 키메라 항-OX40 항체, 항-OX40 아드넥틴, 항-OX40 도메인 항체, 단일 사슬 항-OX40개의 단편, 중쇄 항-OX40개의 단편, 경쇄 항-OX40개의 단편, 항-OX40 융합 단백질, 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, OX40 효능제는 작용적, 항-OX40 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체 (즉, 단세포주에서 유래된 항체)이다.
바람직한 실시형태에서, OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 융합 단백질일 수 있다. OX40L에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 OX40 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Sadun, 등, J. Immunother. 2009, 182, 1481-89]에 기재되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 다량체 OX40 효능제, 예컨대 (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 갖는) 삼량체 또는 육량체 OX40 효능제는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 작용적 단클론성 항체와 비교하여 우수한 수용체 (OX40L) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 착물 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2종 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그 초과의 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47]에 기재되어 있다.
작용적 OX40 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 문헌[Curti, 등, Cancer Res. 2013, 73, 7189-98]. 바람직한 실시형태에서, OX40 효능제는 독성을 감소시키는 데 충분한 방식으로 OX40 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체-의존적 세포 독성 (ADCC), 예를 들어, NK 세포 세포독성을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP)을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Fc 영역 작용성을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 고친화도 및 작용적 활성으로 인간 OX40 (서열번호:54)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 인간 OX40 (서열번호:54)에 결합하는 결합 분자이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 쥣과 OX40 (서열번호:55)에 결합하는 결합 분자이다. OX40 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 OX40 항원의 아미노산 서열은 표 12에 요약된다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 MEDI0562 또는 MEDI-0562 로도 알려져 있는 타볼릭시주맙이다. 타볼릭시주맙은 AstraZeneca, Inc의 MedImmune 자회사로부터 입수 가능하다. 타볼릭시주맙은 면역글로불린 G1-카파, 항-[호모사피엔스 TNFRSF4 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 일원 4, OX40, CD134)], 키메라 단클론성 항체이다. 타볼릭시주맙의 아미노산 서열은 표 KK에 제시된다. 타볼릭시주맙은 푸코실화된 복합체 바이-안테너리 CHO-유형 글리칸과 함께 위치 301 및 301''에서 N-글리코실화 부위; 위치 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 265-325 (CH2)에서 및 371-429 (CH3) (그리고 위치 22''-95'', 148''-204'', 265''-325'', 및 371''-429''에서) 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 134'-194' (CH1-CL)에서 (그리고 위치 23'''-88''' 및 134'''-194'''에서) 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 230-230'' 및 233-233''에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 224-214' 및 224''-214'''에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 다양한 고형 종양 징후에서 타볼릭시주맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02318394 및 NCT02705482를 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:56에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:57에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:58에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:59에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:60, 서열번호:61, 및 서열번호:62 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:63, 서열번호:64, 및 서열번호:65 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4이고, 이는 Pfizer, Inc.에서 입수가능한 완전 인간 항체이다. 11D4의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,960,515호; 제8,236,930호; 및 제9,028,824호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 11D4의의 아미노산 서열은 표 LL에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:66에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:67에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:68에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:69에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:70, 서열번호:71, 및 서열번호:72 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:73, 서열번호:74, 및 서열번호:75 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4 와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8이고, 이는 Pfizer, Inc.에서 입수가능한 완전 인간 항체이다. 18D8의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,960,515호; 제8,236,930호; 및 제9,028,824호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 18D8의 아미노산 서열은 표 MM에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:76에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:77에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:78에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:79에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:80, 서열번호:81, 및 서열번호:82 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:83, 서열번호:84, 및 서열번호:85 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 와 관련하여 내지 18D8. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122이고, 이는 GlaxoSmithKline plc.에서 입수가능한 인간화된 항체이다. Hu119-122의 제조 및 특성은 미국 특허 제9,006,399호 및 제9,163,085호, 및 국제 특허 공개 WO 2012/027328호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. Hu119-122의 아미노산 서열은 표 NN에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:86에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:87에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:88, 서열번호:89, 및 서열번호:90 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:91, 서열번호:92, 및 서열번호:93 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222이고, 이는 GlaxoSmithKline plc.에서 입수가능한 인간화된 항체이다. Hu106-222의 제조 및 특성은 미국 특허 제9,006,399호 및 제9,163,085호, 및 국제 특허 공개 WO 2012/027328호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. Hu106-222의 아미노산 서열은 표 OO에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:94에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:95에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:96, 서열번호:97, 및 서열번호:98 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:99, 서열번호:100, 및 서열번호:101 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제 항체는 MEDI6469 (또한 9B12로 지칭됨)이다. MEDI6469은 쥣과 단클론성 항체이다. 문헌[Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585]. 일부 실시형태에서 OX40 효능제는 개시내용이 그 전체가 본원에 인용되어 포함되어 있는 문헌[Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585]에 기재된 바와 같이 Biovest Inc. (미국 매사추세츠주 말베른 소재)에 기탁된 9B12 하이브리도마에 의해 생성된 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 MEDI6469의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 MEDI6469의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 L106 BD (Pharmingen Product #340420)이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (BD Pharmingen Product #340420)의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (BD Pharmingen Product #340420)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35의 CDR (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)를 포함한다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 쥣과 단클론성 항체 항-mCD134/mOX40 (클론 OX86)이고, 이는 미국 뉴햄프셔 웨스트 레바논 소재의 InVivoMAb, BioXcell Inc.에서 상업적으로 입수가능하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 국제 특허출원공개 WO 95/12673호, WO 95/21925호, WO 2006/121810호, WO 2012/027328호, WO 2013/028231호, WO 2013/038191호, 및 WO 2014/148895; 유럽 특허 출원 EP 0672141호; 미국 특허출원공개 US 2010/136030호, US 2014/377284호, US 2015/190506호, 및 US 2015/132288호 (클론 20E5 및 12H3 포함); 및 미국 특허 제7,504,101호, 제7,550,140호, 제7,622,444호, 제7,696,175호, 제7,960,515호, 제7,961,515호, 제8,133,983호, 제9,006,399호, 및 제9,163,085호에 기재된 OX40 효능제로부터 선택되고, 상기 특허 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 도시된 바와 같은 OX40 작용적 융합 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 또는 바이오시밀러이다. 구조 I-A 및 I-B의 특성은 상기 및 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 구조 I-A의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 GG에 주어진다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열번호:31의 아미노산 17-230), 완전 힌지 도메인 (서열번호:31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부 (예를 들어, 서열번호:31의 아미노산 4-16)을 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함하여 서열번호:32 내지 서열번호:41에 주어진 실시형태로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 구조 I-B의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 HH에 주어진다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호:42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호:43 내지 서열번호:45에 제시된 실시형태로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 타볼릭시주맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 11D4의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 18D8의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu119-122의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu106-222의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 OO에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전술한 가변 중쇄와 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 OX40 결합 도메인, 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체, 및 바이오시밀러를 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:102에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 가용성 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:103에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:104에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하되, 상기 영역 각각은 표 18에 주어진 VH 및 VL 서열 과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 그리고 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 여기서 가용성 OX40 결합 도메인 각각은 줄기 영역이 결여되어 있고 (이는 삼량체화에 기여하고 세포막에 특정 거리를 제공하지만, OX40 결합 도메인의 일부가 아님), 그리고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개 아미노산의 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역이 결여되어 있고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 가지며, 그리고 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 OX40 결합 도메인이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 MEDI6383이다. MEDI6383은 OX40 작용적 융합 단백질이고 미국 특허 제6,312,700호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 상기 특허의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 전술한 VL 도메인 중 임의의 것에 연결된 전술한 VH 도메인 중 임의의 것을 포함하는 OX40 작용적 scFv 항체이다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Creative Biolabs OX40 효능제 단클론성 항체 MOM-18455이되, 이는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 입수가능하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 미국 뉴욕주 샌디에고 소재의 BioLegend, Inc.로부터 상업적으로 입수가능한 OX40 작용적 항체 클론 Ber-ACT35이다.
H. 선택적 세포 생존력 분석
선택적으로, 세포 생존력 검정은 당업계에서 알려진 표준 검정을 사용하여 제1 확장 (때때로 초기 벌크 확장으로 지칭됨) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 배제 검정은 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 이는 선택적으로 죽은 세포를 표지하고 생존력 평가를 허용한다. 생존력을 시험하는데 사용하기 위한 다른 검정은 알라마르 블루 검정; 및 MTT 검정을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
1. 세포수, 생존력, 유세포측정
일부 실시형태에서, 세포수 및/또는 생존력이 측정된다. 마커, 예컨대 비제한적으로 CD3, CD4, CD8, 및 CD56, 뿐만 아니라 본원에 개시되거나 기재된 임의의 다른 것의 발현은 항체, 예를 들어, 비제한적으로 FACSCantoTM 유동 세포측정기 (BD Biosciences)를 사용하여 BD Bio-sciences (미국 캘리포니아주 산호세 소재의 BD Bioscience)로부터 시판되는 것을 사용한 유세포측정에 의해 측정될 수 있다. 세포는 일회용 c-칩 혈구계 (VWR, Batavia, IL)를 사용하여 수동으로 계수될 수 있고, 생존력은 트리판 블루 염색을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 세포 생존력은 또한 USSN 15/863,634에 기초하여 분석될 수 있으며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 경우에, 벌크 TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 REP를 거칠 수 있고 그 다음 아래에 논의된 바와 같이 동결보존된다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 벌크 또는 REP TIL 집단은 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
본 개시내용에 따르면, TIL을 생존력에 대해 검정하는 방법 및/또는 대상체에 투여하는 데에서의 추가의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 검정 방법은 하기를 포함한다:
(i) TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(ii) IL-2 및 선택적으로 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
(iii) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여, TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과인 단계;
(iv) TIL의 제3 집단을 수확, 세정 및 동결보존하는 단계;
(v) 극저온 온도에서 동결보존된 TIL을 저장하는 단계;
(vi) 해동하는 TIL의 제3 집단을 해동하여 TIL의 해동된 제1 집단을 제공하는 단계; 및
(vii) 제3 집단의 세포 배양 배지를 IL-2, OKT-3 및 APC로 적어도 3일의 추가 확장 기간 (때때로 reREP 기간으로 지칭됨) 동안 보충함으로써 해동된 제3 TIL 집단의 일부의 추가 제2 확장을 수행하는 단계로서, 제3 확장은 TIL의 제4 집단을 수득하기 위해 수행되고, TIL의 제4 집단에서의 TIL 수는 TIL의 제3 집단에서의TIL 수와 비교되어 비를 수득하는 단계;
(viii) 단계 (vii)의 비율에 기초하여 해동된 TIL 집단이 환자에게 투여하기에 적합한 지를 결정하는 단계;
(ix) 단계 (viii)에서 제4 집단의 TIL의 수 대 제3 집단의TIL의 다수의 비가 5:1을 초과하는 것으로 결정될 때, 해동된 제3의 TIL을 환자에게 치료학적으로 유효한 투여량으로 투여하는 단계.
일부 실시형태에서, TIL은 단계 (vii) 후 생존력에 대해 검정된다.
본 개시내용은 또한 TIL을 검정하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, TIL을 검정하는 방법을 제공한다:
(i) 동결보존된 TIL의 제1 집단의 일부를 수득하는 단계;
(ii) 동결보존된 TIL의 제1 집단의 일부를 해동하는 단계;
(iii) TIL의 제1 집단의 일부를 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 세포 배양 배지에서 적어도 3일의 추가 확장 기간(때때로, reREP 기간으로 지칭됨) 동안 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, TIL의 제1 집단의 일부는 TIL의 제2 집단과 비교되어 TIL 수의 비를 수득하고, TIL의 제2 집단 중 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단의 일부 중 TIL의 수의 비가 5:1 초과인 단계;
(iv) 단계 (iii)에서의 비율에 기초하여, TIL의 제1 집단이 환자에게 치료적 투여에 사용하기에 적합한가를 결정하는 단계;
(v) 단계 (iv)에서 TIL의 제2 집단 중 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단 중 TIL의 수의 비가 5:1 초과인 것으로 결정될 때, TIL의 제1 집단이 치료적 투여에 사용하기에 적합한가를 결정하는 단계.
일부 실시형태에서, TIL의 제2 집단 중 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단의 부분 중 TIL의 수의 비는 50:1 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 본원에 제공된 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법에 따라 단계 (i)로부터의 동결보존된 TIL의 전체 제1 집단의 확장을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 단계 (i)로부터의 동결보존된 TIL의 전체 제1 집단을 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
2. 세포 배양물
일 실시형태에서, 상기에 논의될 뿐만 아니라 도 1에 예시된 것을 포함하는 TIL을 확장시키는 방법은 약 5,000 mL 내지 약 25,000 mL의 세포 배지, 약 5,000 mL 내지 약 10,000 mL의 세포 배지, 또는 약 5,800 mL 내지 약 8,700 mL의 세포 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서의 배지는 무혈청이다. 일부 실시형태에서, 제2 확장에서의 배지는 무혈청이다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 및 제2 확장에서 배지는 둘 다 무혈청이다. 일 실시형태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 단지 하나의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지가 가 사용될 수 있고, 그 예는 AIM-V 세포 배지 (L-글루타민, 50 μM 스트렙토마이신 설페이트, 및 10 μM 겐타마이신 설페이트) 세포 배양 배지 (Invitrogen, Carlsbad CA)이다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 TIL의 수를 확장하는데 필요한 배지의 양 및 배지의 유형의 수를 유리하게 감소시킨다. 일 실시형태에서, TIL의 수를 확장하는 것은 3일 또는 4일마다보다 더 빈번하게 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 기체 투과성 용기 내의 세포들의 수를 확장시키는 것은 세포를 확장시키는데 필요한 공급 빈도를 감소시킴으로써 세포의 수를 확장하는 데 필요한 절차를 단순화시킨다.
일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 내의 세포 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장하는데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 내의 세포 배지는 베타-머캅토에탄올(BME)이 결여되어 있다.
일 실시형태에서, 방법의 지속기간은 상기 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 단계; 내부에 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 상기 종양 조직 시료를 배양하는 단계; 상기 종양 조직에서 TIL을 수득하는 단계, 및 약 7 내지 14일, 예를 들어, 약 11일의 지속기간 동안 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기 내에서 TIL의 수를 확장하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서 프리-REP는 약 7 내지 14일, 예를 들어, 약 11일이다. 일부 실시형태에서, REP은 약 7 내지 14일, 예를 들어, 약 11일이다.
일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 용기에서 확장된다. 기체 투과성 용기는 미국 특허 출원 공개 제2005/0106717 A1호에 기재된 것을 포함하는, 당업계에 공지된 방법, 조성물 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 팽창시키기 위해 사용되어 왔으며, 상기 특허의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 확장된다. 일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 백, 예컨대 Xuri 세포 확장 시스템 W25 (GE Healthcare)에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, TIL은 투과성 백, 예컨대, Xuri 세포 확장 시스템 W5 (GE Healthcare) 로도 알려져 있는 WAVE 생물반응기 시스템에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, 세포 확장 시스템은 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 및 약 10 L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다.
일 실시형태에서, TIL은 G-Rex 플라스크 (Wilson Wolf Manufacturing로부터 상업적으로 입수가능함)에서 확장될 수 있다. 그와 같은 실시형태는 세포 집단이 약 5x105 세포/cm2에서 10x106 및 30x106 세포/cm2로 확장하는 것을 허용한다. 일 실시형태에서 이는 공급되지 않는다. 일 실시형태에서, 이는 배지가 G-Rex 플라스크에서 약 10 cm의 높이에 존재하는 한 공급되지 않는다. 일 실시형태에서 이는 공급하지 않고 하나 이상의 시토카인을 추가한다. 일 실시형태에서, 사이토카인은 사이토카인을 배지와 혼합할 필요 없이 볼러스로서 첨가될 수 있다. 그와 같은 용기, 디바이스, 및 방법은 당해 기술에 알려져 있고 TIL를 확장하는데 사용되어 왔고, 그리고 미국 특허출원공개 US 2014/0377739A1호, 국제공개 WO 2014/210036 A1호, 미국 특허출원공개제us 2013/0115617 A1호, 국제공개 WO 2013/188427 A1호, 미국 특허출원공개 US 2011/0136228 A1호, 미국 특허 US 8,809,050 B2호, 국제공개 WO 2011/072088 A2호, 미국 특허출원공개 US 2016/0208216 A1호, 미국 특허출원공개 US 2012/0244133 A1호, 국제공개 WO 2012/129201 A1호, 미국 특허출원공개 US 2013/0102075 A1호, 미국 특허 US 8,956,860 B2호, 국제공개 WO 2013/173835 A1호, 미국 특허출원공개 US 2015/0175966 A1호에 기재된 것을 포함하고, 이들의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 그와 같은 공정은 또한 문헌[Jin 등, J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292]에 기재되어 있다.
I. TIL의 선택적 유전공학
일부 실시형태에서, TIL은 고친화도 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어, MAGE-1, HER2, 또는 NY-ESO-1과 같은 종양-관련 항원을 표적으로 하는 TCR, 또는 종양-연관 세포 표면 분자(예를 들어, 메소텔린) 또는 계통-제한 세포 표면 분자(예를 들어, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 기능성을 포함하도록 선택적으로 유전적으로 조작된다.
J. TIL의 선택적 동결보존
상기 논의되고, 그리고 도 1에 제공된 바와 같은 단계 A 내지 E에서 예시된 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 공정에 걸쳐 수많은 지점에서 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 도 1의 단계 D에 따라 제공된 바와 같은) 제2 확장 후 TIL의 확장된 집단은 동결보존될 수 있다. 동결보존 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 배치함으로써 달성될 수 있다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다. 일부 실시형태에서, TIL은 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 세포 배양 배지 플러스 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 실시예 F 및 G에 제공된 방법에 따라 동결보존된다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
K. TIL 제조를 위한 폐쇄 시스템
본 발명은 TIL 배양 공정 동안 폐쇄 시스템의 사용을 제공한다. 이러한 폐쇄 시스템은 미생물 오염을 방지 및/또는 감소시키고, 더 적은 플라스크의 사용을 허용하고, 비용 감소를 허용한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 2개의 용기를 사용한다.
이러한 폐쇄 시스템은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm 및 https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm에서 발견될 수 있다.
멸균 연결 장치(STCD)는 2 개의 양립가능한 튜빙 사이에 멸균 용접을 생성한다. 이러한 절차는 다양한 용기 및 튜브 직경의 멸균 연결을 허용한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 예를 들어 실시예 G에 기재된 바와 같은 루어 로크 및 열 밀봉 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균성 및 폐쇄 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시형태에서, 실시예 G에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다. 일부 실시형태에서, TIL은 실시예 G, 섹션 "최종 제형 및 필(fill)"에 기재된 방법에 따라 최종 생성물 제형 용기로 제형화한다.
일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 TIL이 환자에게 투여 또는 동결보존을 위해 준비될 때까지 종양 단편이 얻어지는 시간으로부터 하나의 용기를 사용한다. 일부 실시형태에서 2개의 용기가 사용되는 경우, 제1 용기는 폐쇄된 G-용기이고, TIL의 집단은 원심분리되고 제1 폐쇄 G- 용기를 개방하지 않고 주입 백으로 이송된다. 일부 실시형태에서, 2개의 용기가 사용되는 경우, 주입 백은 HypoThermosol-함유 주입 백이다. 폐쇄 시스템 또는 폐쇄 TIL 세포 배양 시스템은, 일단 종양 샘플 및/또는 종양 단편이 첨가되면, 시스템이 외부로부터 단단히 밀봉되어 박테리아, 진균, 또는 임의의 다른 미생물 오염의 침입이 없는 폐쇄 환경을 형성하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 95%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 90%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 10% 내지 약 90%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 15% 내지 약 85%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%이다.
폐쇄 시스템은 미생물 오염의 부재 및/또는 상당한 감소와 함께 TIL 성장을 허용한다.
또한, TIL 세포 배양 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압은 세포가 배양됨에 따라 각각 변화한다. 결과적으로, 세포 배양에 적합한 배지가 순환되더라도, 폐쇄 환경은 TIL 증식을 위한 최적의 환경으로서 계속 유지될 필요가 있다. 이를 위해, 폐쇄 환경의 배양액 내의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압의 물리적 인자가 센서에 의해 모니터링되고, 그 신호가 배양 환경의 입구에 설치된 기체 교환기를 제어하는 데 사용되고, 상기 폐쇄 환경의 기체 분압이 세포 배양 환경을 최적화하기 위해 배양액의 변화에 따라 실시간으로 조정되는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 폐쇄 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압을 측정하는 모니터링 장치가 구비된 기체 교환기를 폐쇄 환경의 입구에 통합하고, 모니터링 장치로부터의 신호에 기초하여 기체 농도를 자동으로 조정함으로써 세포 배양 환경을 최적화하는 폐쇄 세포 배양 시스템을 제공한다.
일부 실시형태에서, 폐쇄 환경 내의 압력은 연속적으로 또는 간헐적으로 제어된다. 즉, 폐쇄 환경에서의 압력은 예를 들어, 압력 유지 장치에 의해 변화될 수 있어서, 공간이 양압 상태에서 TIL의 성장에 적합한 것을 보장하거나, 음압 상태에서 유체의 삼출을 촉진하여 세포 증식을 촉진한다. 음압을 간헐적으로 적용함으로써, 폐쇄 환경의 부피에서의 일시적인 수축에 의해 폐쇄 환경에서 순환 액체를 균일하고 효율적으로 교체하는 것이 가능하다.
일부 실시형태에서, TIL의 증식을 위한 최적의 배양 성분이 치환 또는 첨가될 수 있고, IL-2 및/또는 OKT3과 같은 인자뿐만 아니라 조합이 첨가될 수 있다.
L. TIL의 선택적 동결보존
벌크 TIL 집단 또는 TIL의 확장된 집단은 선택적으로 동결보존될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 치료적 TIL 집단 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 제2 확장 후에 수확된 TIL 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 도 1의 예시적인 단계 F에서 TIL 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, TIL은 주입 백에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 주입 백에 배치하기 전에 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 동결보존되고 주입 백에 배치되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 동결보존 배지를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 동결보존 배지는 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 함유한다. 이는 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 넣음으로써 달성된다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 CS10 동결보존 배지 (CryoStor 10, BioLife Solutions)를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 함유하는 동결보존 배지를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 CS10 및 세포 배양 배지의 1:1 (vol:vol) 비를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 추가의 IL-2을 추가로 포함하는 CS10 및 세포 배양 배지의 약 1:1 (vol:vol) 비를 사용하여 동결보존된다.
단계 A 내지 E에서 전술한 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 공정에 걸쳐 수많은 지점에서 일어날 수 있다. 단계 B에 따른 제1 확장 후의 벌크 TIL 집단 또는 단계 D에 따른 하나 이상의 제2 확장 후의 TIL의 확장된 집단은 동결보존될 수 있다. 동결보존 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 배치함으로써 달성될 수 있다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
일부 경우에, 단계 B TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 단계 C 및 단계 D를 거칠 수 있고 그 다음 단계 D 후에 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 단계 B 또는 단계 D TIL 집단은 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
IV. 약제학적 조성물, 투여량, 및 투약 레지멘
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당해 분야에서 알려진 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되며, 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척추강내, 및 림프내 투여를 포함한다.
TIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특히 상기 암이 NSCLC인 경우, 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010 TIL은 평균 약 7.8×1010 TIL으로 투여된다. 일 실시형태에서, 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 3×1010 내지 약 12×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 4×1010 내지 약 10×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 5×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 6×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 7×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010이다. 일부 실시형태에서, 특히 암이 NSCLC인 경우 치료 유효한 투여량은 약 7.8×1010 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 3×1010 내지 약 12×1010 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 4×1010 내지 약 10×1010 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 5×1010 내지 약 8×1010 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 6×1010 내지 약 8×1010 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 7×1010 내지 약 8×1010 TIL이다.
일부 실시형태에서, 특히 암이 NSCLC인 경우 약 1×109 내지 약 150×109 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 150×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 140×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 130×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 120×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 110×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 100×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 90×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 80×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 70×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 60×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 50×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 40×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 30×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 20×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 10×109 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효한 투여량은 약 1×109 내지 약 5×109 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013. 일 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 예를 들어, 약제학적 조성물의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL은 넓은 투여 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중, 및 주치의의 선호도 및 경험에 좌우될 것이다. TIL의 임상적으로 확립된 투여량은 또한 적절한 경우 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 투여되는 약제학적 조성물의 양, 예컨대 TIL의 투여량은 치료되는 인간 또는 포유동물, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 활성 제약 성분의 배치 및 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다.
일부 실시형태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 그와 같은 투여는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투약은 연간 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투약은 1개월에 1회, 2주에 1회, 1주에 1회, 또는 격일로 1회일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 만큼 계속될 수 있다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013이다. 일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위이다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.
유효량의 TIL은 비강내 및 경피 경로, 동맥내 주사에 의해, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해를 포함하는, 유사한 유용성을 갖는 제제 허용된 투여 방식 중 임의의 것에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
V. 환자를 치료하는 방법
치료 방법은 초기 TIL 수집 및 TIL의 배양으로 시작한다. 그와 같은 방법은 예를 들어, 문헌[Jin 등, J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨]에 의해 당해 기술에 기재되었다. 치료 방법의 실시형태는 실시예를 비롯한 하기 섹션 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
예를 들어, 상기 단계 A 내지 F에 기재된 바와 같은 또는 상기 단계 B 내지 F(또한, 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같은)에 따른 것을 포함하는, 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 확장된 TIL은 암을 갖는 환자의 치료에서 특정 용도를 발견한다(예를 들어, 문헌[Goff, 등, Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, 뿐만 아니라 보충적 내용도 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨]). 일부 실시형태에서, TIL은 이전에 기재된 바와 같이 전이성 흑색종의 절제된 침착물로부터 성장되었다 (문헌[Dudley, 등, J Immunother., 2003, 26:332-342]을 참조한다; 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)). 새로운 종양은 멸균 조건 하에서 절개될 수 있다. 대표적인 샘플은 정식 병리적 분석을 위해 수집될 수 있다. 2 mm3 내지 3 mm3의 단일 단편이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자당5, 10, 15, 20, 25 또는 30개 샘플이 수득된다. 일부 실시형태에서, 환자당 20, 25, 또는 30개의 샘플이 수득된다. 일부 실시형태에서, 환자당 20, 22, 24, 26, 또는 28개의샘플이 수득된다. 일부 실시형태에서, 환자당 24개 샘플이 수득된다. 샘플은 24-웰 플레이트의 개별 웰에 배치되고, 고용량 IL-2(6,000 IU/mL)를 갖는 성장 배지에서 유지되고, 종양의 파괴 및/또는 TIL의 증식에 대해 모니터링될 수 있다. 가공 후 남아있는 생존가능한 세포를 갖는 임의의 종양은 본원에 기재된 바와 같이 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 소화되고 동결보존될 수 있다.
일부 실시형태에서, 성공적으로 성장된 TIL은 표현형 분석 (CD3, CD4, CD8, 및 CD56)을 위해 샘플링될 수 있고 이용가능한 경우 자가 종양에 대해 시험될 수 있다. 오버나잇 공배양이 인터페론-감마(IFN-γ) 수준 > 200 pg/mL 및 2회 배경을 생성하였다면 TIL은 반응성인 것으로 간주될 수 있다. 문헌[(Goff, 등, J Immunother., 2010, 33:840-847; 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)]. 일부 실시형태에서, 자가 반응성 또는 충분한 성장 패턴의 증거를 갖는 배양물은 때때로 급속 확장(REP)으로 지칭되는 제2 확장을 포함하는 제2 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 따라 제공된 바와 같은 제2 확장)을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 높은 자가 반응성 (예를 들어, 제2 확장 동안의 높은 증식)을 갖는 확장된 TIL은, 추가의 제2 확장을 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 높은 자가 반응성 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 제공된 바와 같은 제2 확장 동안의 높은 증식)을 갖는 증식된 TIL은, 도 1의 단계 D에 따른 추가의 제2 확장을 위해 선택된다.
주입 백 TIL의 동결보존된 샘플의 세포 표현형은 표면 마커 CD3, CD4, CD8, CCR7, 및 CD45RA (BD BioSciences)에 대한 유세포측정 (예를 들어, FlowJo), 뿐만 아니라 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 분석될 수 있다. 혈청 사이토카인은 표준 효소-결합 면역흡착 검정 기술을 사용하여 측정되었다. 혈청 IFN-g의 상승은 100 pg/mL 및 4 3초과의 기준선 수준으로 정의되었다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 도 1에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은 TIL의 임상 효능에서의 놀라운 개선을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 도 1에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은, 예를 들면 도 1에서 예시된 방법 이외의 방법을 비롯한 본원에 기재된 방법 이외의 방법에 의해 생성된 TIL에 비해 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것 이외의 방법은 공정 1C 및/또는 생성 1 (Gen 1)로 지칭된 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 증가된 효능은 DCR, ORR, 및/또는 다른 임상 반응에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 도 1에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은 예를 들어, 도 1에 예시된 것 이외의 방법, 예를 들어, Gen 1 공정을 포함하는, 본원에 기재된 방법 이외의 방법에 의해 제조된 TIL과 비교하여 반응 및 안전성 프로파일과 유사한 시간을 나타낸다.
일부 실시형태에서, IFN-감마 (IFN-γ)은 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 IFN-γ는 활성 TIL을 나타낸다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 생성을 위한 효능 검정이 사용된다. IFN-γ 생성은 세포독성 잠재력의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생성은, 예를 들어, 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 생체외에서 혈액, 혈청 또는 TIL에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, IFN-γ의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL로 치료된 환자에서 치료 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 미치료 환자와 비교하여, 그리고/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 또는 그 초과 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 3-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 4-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 5-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 Quantikine ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 TIL 혈청에서 측정된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 포함하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은, 예를 들어, 공정 1C 방법으로 지칭되는 방법과 같이 도 1에서 예시되지 않는 것들을 포함하여 다른 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 증가된 다클론성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상당히 개선된 다클론성 및/또는 증가된 다클론성은 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 T-세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 다클론성의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL의 투여에 관한 치료 효능을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1-배, 2-배, 10-배, 100-배, 500-배, 또는 1000-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 10-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 100-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 500-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1000-배 증가된다.
효능의 측정은 본원에 기재된 기재될 뿐만 아니라 당해 분야에서 알려진 바와 같이 질환 통제율 (DCR)뿐만 아니라 전반적으로 반응 속도 (ORR)를 포함할 수 있다.
1. NSCLC를 치료하는 방법
본원에 기재된 조성물 및 방법은 비-소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하기 위한 방법에 사용될 수 있고, NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다. 일부 실시형태에서 항-PD-1 항체는, 예를 들어, 비제한적으로 니볼루맙 (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), 펨브롤리주맙 (람브롤리주맙, MK03475 또는 MK-3475, Merck; Keytruda®), 이필리무맙 (Yervoy®), 인간화된 항-PD-1 항체 JS001 (ShangHai JunShi), 단클론성 항-PD-1 항체 TSR-042 (Tesaro, Inc.), 피딜리주맙 (항-PD-1 mAb CT-011, Medivation), 항-PD-1 단클론성 항체 BGB-A317 (BeiGene), 및/또는 항-PD-1 항체 SHR-1210 (ShangHai HengRui), 인간 단클론성 항체 REGN2810 (Regeneron), 인간 단클론성 항체 MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), 및/또는 인간화된 항-PD-1 IgG4 항체 PDR001 (Novartis)를 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1 항체는 클론: RMP1-14 (랫트 IgG) - BioXcell cat# BP0146으로부터의 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 단계 A 내지 F에 따라 생성된 TIL과의 공동-투여 방법에 사용하기에 적합한 다른 적합한 항체는 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 그의 항원-결합부는 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-1과의 상호작용을 억제하여, 면역 활성을 증가시킨다. PD-L1에 결합하고 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 방해하고, 종양 면역 반응을 자극하는 당업계에서 알려진 임의의 항체가 포함된다. 예를 들어, PD-L1을 표적으로 하고 임상 시험 중인 항체는, BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) 및 MPDL3280A (Genentech)를 포함한다. PD-L1을 표적으로 하는 다른 적합한 항체는 미국 특허 제7,943,743호에 개시되어 있고, 이는 인용하여 본원에 포함되어 있다. PD-1 또는 PD-L1에 결합하고, PD-1/PD-L1 상호작용을 방해하고, 항종양 면역 반응을 자극하는 임의의 항체가 포함된다는 것은 당업자에 의해 인정될 것이다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1 항체로 치료되었다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-L1 항체로 치료되었다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉이다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1 항체로 치료되지 않았다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-L1 항체로 치료되지 않았다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 화학요법제로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 화학요법제로 이전에 치료되었지만 더 이상 당해 화학요법제로 치료되지 않고 있다. 일부 실시형태에서, NSCLC 환자는 항-PD-1/PD-L1 미접촉이다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 저발현의 PD-L1을 갖는다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉 NSCLC을 갖거나, 또는 화학요법 후 치료이지만, 항-PD-1/PD-L1 미접촉이다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉 NSCLC 또는 화학요법 후 치료이지만 항-PD-1/PD-L1 미접촉이며 및 저발현의 PD-L1을 갖는다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 기준선에서 큰 부피의 질환을 가지며 저발현의 PD-L1을 갖는다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉 NSCLC 또는 화학요법 후이지만, 저발현의 PD-L1을 갖고/갖거나 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는 항-PD-1/PD-L1 미접촉을 갖는다. 일부 실시형태에서, 최대 종양 직경이 횡방향 또는 관상 평면에서 측정된 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타난다. 일부 실시형태에서, 큰 부피의 질환은 단축 직경이 20 mm 이상인 팽윤된 림프절이 존재할 때 나타난다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 NSCLC에 대한 표준 관리 치료제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 포함하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은, 예를 들어, 공정 1C 방법으로 지칭되는 방법과 같이 도 1에서 예시되지 않는 것들을 포함하여 다른 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 증가된 다클론성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상당히 개선된 다클론성 및/또는 증가된 다클론성은 암치료를 위한 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 T-세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 다클론성의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL의 투여에 관한 치료 효능을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1-배, 2-배, 10-배, 100-배, 500-배, 또는 1000-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 10-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 100-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 500-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1000-배 증가된다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 III기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 종양유전자-유도된 종양을 가지며, 종양유전자에 대한 적어도 하나의 효과적인 표적 요법으로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 가지며 예를 들어, PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제, 예컨대 예를 들어, 예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 III기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 가지며 예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1를 포함하는 전신 요법으로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 가지며 예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1를 포함하는 전신 요법으로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 III기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 가지며 항-PD-1을 포함하는 전신 요법으로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 가지며 항-PD-1을 포함하는 전신 요법으로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 III기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 가지며 항-PD-L1을 포함하는 전신 요법으로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)을 가지며 항-PD-L1을 포함하는 전신 요법으로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 종양유전자-유도된 종양을 가지며, 종양유전자에 대한 적어도 하나의 효과적인 표적 요법으로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 비편평상피, 선암종, 대세포 암종)의 조직학적으로 또는 병리적으로 확인된 진단을 갖는다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 면역요법 미접촉이다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 예를 들어, 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 설정에서, 또는 최종적인 화학방사선요법의 일부로서 전신 요법을 포함하는 최대 3번의 이전의 전신 항암 요법을 받았을 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 예를 들어, EGFR, ALK, 및/또는 ROS에서 돌연변이를 포함하는 종양유전자 돌연변이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 전신 요법의 3개 이하의 이전의 라인의 일부로서 예를 들어, PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제, 예컨대 예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1에 의한 전신 요법을 이전에 받았다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 예를 들어, EGFR, ALK, 및/또는 ROS에서 돌연변이를 포함하는 종양유전자 돌연변이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 TIL 제제에 사용하기 위한 적어도 약 1.5 cm 직경의 절제가능한 적어도 1개의 병변 (또는 응집체 병변)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 제1 연구 치료 (즉, 비골수절성 림프절개 (NMA-LD) 또는 펨브롤리주맙의 시작) 전에 최소 지속기간의 하나 이상의 이전의 항암 요법으로부터의 휴약 기간을 가졌다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), MEK, BRAF, ALK, ROS1 및/또는 다른-표적화된 제제 (예를 들어, 에를로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 오시머티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 및/또는 롤라티닙 포함) 및 TIL 치료의 시작 전 적어도 14일의 사전 치료의 최소 휴약에 의한 이전의 표적 요법을 가졌다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 아쥬반트, 네오아쥬반트 또는 최종적인 화학요법 및/또는 화학방사선 및 치료 시작 전 적어도 21일의 사전 치료의 최소 휴약을 가졌다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 예를 들어, PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제, 예컨대 항-PD-1, 및 안티-PD-L1, 다른 mAb, 및/또는 백신으로 사전 체크포인트-표적화된 요법을 받았고, 최소 휴약 기간은 비골수절제 림프구고갈 (NMA-LD)의 시작 21일 이상 이전이었다.
a. PD-1 및 PD-L1 억제제
프로그래밍된 사망 1 (PD-1)은 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) T 세포, 활성화된 단핵구, 및 수지상 세포에 의해 발현된 288-아미노산 막관통 면역체크포인트 수용체 단백질이다. 또한 CD279로 알려져 있는 PD-1은, CD28 계열에 속하고, 인간은 염색체 2 상의 Pdcd1 유전자에 인코딩될 수 있다. PD-1은 하나의 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 도메인, 막관통 영역, 및 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM) 및 면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프 (ITSM)를 함유하는 세포내 도메인으로 이루어진다. PD-1 및 그것의 리간드 (PD-L1 및 PD-L2)는 문헌[Keir, 등, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 677-704]에 기재된 바와 같이 면역 관용에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. PD-1은 T 세포 면역 반응을 부정적으로 조절하는 억제 신호를 제공한다. PD-L1 (또한 B7-H1 또는 CD274로 알려져 있음) 및 PD-L2 (또한 B7-DC 또는 CD273로 알려져 있음)는 종양 세포 및 기질 세포 상에서 발현되며, 이는 PD-1을 발현하는 활성화된 T 세포가 직면할 수 있고, 이는 T 세포의 면역억제를 유도한다. PD-L1은 인간 염색체 9 상의 Cd274 유전자에 의해 인코딩되는 290개의 아미노산 막관통 단백질이다. PD-1 억제제, PD-L1 억제제, 및/또는 PD-L2 억제제의 사용에 의한 PD-1과 그의 리간드 PD-L1과 PD-F2 사이의 상호작용의 차단은 문헌[Topalian, 등, N. Eng. J. Med. 2012, 366, 2443-54]에 기재된 것과 같이 최근의 임상 연구에서 입증된 바와 같이 면역 내성을 극복할 수 있다. PD-L1은 많은 종양 세포주에서 발현되는 반면, PD-L2는 대부분 수지상 세포 및 소수의 종양 세포주 상에서 발현된다. (활성화 후 PD-1을 유도성으로 발현시키는) T 세포에 추가하여, PD-1은 또한 B 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 활성화된 단핵구, 및 수지상 세포 상에서 발현된다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 당업계에서 알려진 임의의 PD-1 억제제 또는 PD-1 차단제일 수 있다. 특히, 다음의 단락에서 더 상세히 기재된 PD-1 억제제 또는 차단제 중의 하나이다. 용어들 "억제제", "길항제", 및 "차단제"는 PD-1 억제제와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 의심을 피하기 위해, 항체인, 본원에서 PD-1 억제제에 대한 언급은 화합물 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 접합체, 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, 본원에서 PD-1 억제제에 대한 언급은 또한 소분자 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정, 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, PD-1 억제제는, 그의 Fab 단편, 또는 단쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는, 항체 (즉, 항-PD-1 항체), 그의 단편이다. 일부 실시형태에서 PD-1 억제제는 다클론성 항체이다. 바람직한 실시형태에서, PD-1 억제제는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 PD-1과 결합하기 위해 경쟁하고/경쟁하거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 항체는 PD-1과 결합하기 위해 경쟁하고/경쟁하거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 100 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 30 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 20 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 10 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 1 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 7.5 × 105 l/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 8 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 9.5 × 105 l/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하는 것이다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙 (Bristol-Myers Squibb Co.로부터 옵티보 로서 상업적으로 입수가능함), 또는 그의 바이오시밀러, 항원-결합 단편, 접합체, 또는 변이체이다. 니볼루맙은 PD-1 수용체를 차단하는 완전 인간 IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 면역글로불린 G4 카파, 항-(인간 CD274) 항체이다. 니볼루맙은 Chemical Abstracts Service (CAS) 등록번호 946414-94-4로 할당되고 또한 5C4, BMS-936558, MDX-1106, 및 ONO-4538로 알려져 있다. 니볼루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,008,449호 및 국제 특허 공개 WO 2006/121168호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 다양한 형태의 암에서 니볼루맙의 임상 안전성 및 효능은 문헌[Wang, 등, Cancer Immunol Res. 2014, 2, 846-56; Page, 등, Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; 및 Weber, 등, J. Clin. Oncology, 2013, 31, 4311-4318]에 기재되었고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 니볼루맙의 아미노산 서열은 표 48에 제시된다. 니볼루맙은 22-96,140-196, 254-314, 360-418, 22''-96'', 140''-196'', 254''-314'', 및 360''-418''에서 중쇄내 디설파이드 연결기; 23'-88', 134'-194', 23'''-88''', 및 134'''-194'''에서 경쇄내 디설파이드 연결기; 127-214', 127''-214'''에서 중쇄-경쇄간 디설파이드 연결기, 219-219'' 및 222-222''에서 중쇄-중쇄간 디설파이드 연결기; 및 290, 290''에서 N-글리코실화 부위 (H CH2 84.4)를 갖는다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:463에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:128에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:463 및 서열번호:128 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:128 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:128 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:128 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:128 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:128 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:129에 제시된 서열을 포함하고, PD-1 억제제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:130 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:129 및 서열번호:130 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:129 및 서열번호:130 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:129 및 서열번호:130 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:129 및 서열번호:130 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:129 및 서열번호:130 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:131, 서열번호:132, 및 서열번호:133 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:134, 서열번호:135, 및 서열번호:136 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 동일한 PD-1 상의 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-1 항체이고, 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 항-PD-1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다.
또 다른 실시형태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙 (미국 뉴저지주 케니워스 소재의 Merck & Co., Inc.로부터 키트루다로서 상업적으로 입수가능함), 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체, 또는 변이체를 포함한다. 펨브롤리주맙은 CAS 등록번호 1374853-91-4로 할당되고 람브롤리주맙, MK-3475, 및 SCH-900475로도 알려져 있다. 펨브롤리주맙은 면역글로불린 G4, 항-(인간 단백질 PDCD1 (프로그래밍된 세포사 1)) (인간-Mus 무스큘러스 단클론성 중쇄), 인간-Mus 무스큘러스 단클론성 경쇄를 갖는 디설파이드, 이량체 구조를 갖는다. 펨브롤리주맙의 구조는 또한 면역글로불린 G4, 항-(인간 프로그래밍된 세포사 1); 인간화된 마우스 단클론성 κ 경쇄 이량체 (226-226'':229-229'')-비스디설파이드를 갖는 인간화된 마우스 단클론성 [228-L-프롤린(H10-S>P)]γ4 중쇄 (134-218')-디설파이드로서 기재될 수 있다. 펨브롤리주맙의 특성, 용도, 및 제조는 국제 특허 공개 WO 2008/156712 A1호, 미국 특허 제8,354,509호 및 미국 특허출원공개 US 2010/0266617 A1호, US 2013/0108651 A1호, 및 US 2013/0109843 A2호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 다양한 형태의 암에서 펨브롤리주맙의 임상 안전성 및 효능은 문헌[Fuerst, Oncology Times, 2014, 36, 35-36; Robert, 등, Lancet, 2014, 384, 1109-17; 및 Thomas, 등, Exp. Opin. Biol. Ther., 2014, 14, 1061-1064]에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙의 아미노산 서열은 표 49에 제시된다. 펨브롤리주맙은 다음의 디설파이드 브릿지를 포함한다. 22-96, 22''-96'', 23'-92', 23'''-92''', 134-218', 134''-218''', 138'-198', 138'''-198''', 147-203, 147''-203'', 226-226'', 229-229'', 261-321, 261''-321'', 367-425, 및 367''-425'', 및 다음의 글리코실화 부위 (N): Asn-297 및 Asn-297''. 펨브롤리주맙은 Fc 영역에서 안정화 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4/카파 아이소타입이고; IgG4 힌지 영역에서 이러한 돌연변이의 삽입은 IgG4 항체에 대해 전형적으로 관찰되는 절반 분자의 형성을 방지한다. 펨브롤리주맙은 각 중쇄의 Fc 도메인 내의 Asn297에서 불균질하게 글리코실화되어, 온전한 항체에 대해 대략 149 kDa의 분자량을 산출한다. 우세한 글리코형의 펨브롤리주맙은 푸코실화된 아갈락토 디안테너리 글리칸 형태 (G0F)이다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:137에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:138에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:137 및 서열번호:138 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:137 및 서열번호:138 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:137 및 서열번호:138 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:137 및 서열번호:138 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:137 및 서열번호:138 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:137 및 서열번호:138 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:139 제시된 서열을 포함하고, PD-1 억제제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:140에 제시된 서열에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:139 및 서열번호:140 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:139 및 서열번호:140 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:139 및 서열번호:140 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:139 및 서열번호:140 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:139 및 서열번호:140 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:141, 서열번호:142, 및 서열번호:143 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:144, 서열번호:145, 및 서열번호:146 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 동일한 PD-1 상의 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-1 항체이고, 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 항-PD-1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 상업적으로 입수가능한 항-PD-1 단클론성 항체, 예컨대 항-m-PD-1 클론 J43 (Cat # BE0033-2) 및 RMP1-14 (Cat # BE0146) (Bio X Cell, Inc., 미국 뉴햄프셔 웨스트 리바논 소재)이다. 수많은 상업적으로 입수가능한 항-PD-1 항체는 당업자에게 알려져 있다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 제8,354,509 또는 미국 특허출원공개 제2010/0266617 A1호, 제2013/0108651 A1호, 제2013/0109843 A2호에 개시된 항체이고, 상기 특허들의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 제8,287,856, 8,580,247, 및 제8,168,757호 및 미국 특허출원공개 제2009/0028857 A1호, 제2010/0285013 A1호, 제2013/0022600 A1호, 및 제2011/0008369 A1호에 기재된 항-PD-1 항체이고, 상기 특허의 교시는 인용되어 본원에 포함되어 있다. 또 다른 실시형태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 제8,735,553 B1호에 개시된 항-PD-1 항체이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는, 미국 특허 제8,686,119호 기재되어 있는 CT-011 로도 알려져 있는 피딜리주맙이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 소분자 또는 펩티드, 또는 펩티드 유도체, 예컨대 미국 특허 제8,907,053호; 제9,096,642호; 및 제9,044,442호 및 미국 특허출원공개 US 2015/0087581호에 기재된 것들; 1,2,4-옥사디아졸 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 제2015/0073024호에 기재된 것들; 환형 펩티드모사체 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 US 2015/0073042호에기재된 것들; 환형 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 US 2015/0125491호에 기재된 것들; 1,3,4-옥사디아졸 및 1,3,4-티아디아졸 화합물 및 유도체 예컨대 국제 특허출원공개 WO 2015/033301호에 기재된 것들; 펩티드 기반 화합물 및 유도체 예컨대 국제 특허출원공개 WO 2015/036927호 및 WO 2015/04490호에 기재된 것들, 또는 거대환형 펩티드 기반 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 US 2014/0294898호에 기재된 것들일 수 있고; 상기 특허 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 당업계에서 알려진 임의의 PD-L1 또는 PD-L2 억제제, 길항제, 또는 차단제일 수 있다. 특히, 다음의 단락에 더 상세히 기재된 PD-L1 또는 PD-L2 억제제, 길항제, 또는 차단제 중 하나이다. 용어들 "억제제", "길항제", 및 "차단제"는 PD-L1 및 PD-L2 억제제와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 의심을 피하기 위해, 항체인 PD-L1 또는 PD-L2 억제제에 대한 언급은 화합물 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 접합체, 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, PD-L1 또는 PD-L2 억제제에 대한 본원의 언급은 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정, 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물, 공정 및 방법은 PD-L1 또는 PD-L2 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 소분자이다. 바람직한 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 항체(즉, 항-PD-1 항체), Fab 단편을 포함하는 그의 단편, 또는 그의 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시형태에서 PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 다클론성 항체이다. 바람직한 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 결합하기 위해 PD-L1 또는 PD-L2와 경쟁하고/경쟁하거나 PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 PD-L1 또는 PD-L2와 경쟁하고/경쟁하거나 PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 화합물이 PD-L2 수용체를 포함하는 다른 수용체에 결합하거나 상호작용하는 것보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 PD-L1과 결합하거나 상호작용한다는 점에서, 본원에 제공된 PD-L1 억제제는 PD-L1에 대해 선택적이다. 특정 실시형태에서, 화합물은PD-L2 수용체보다 적어도 약 2-배 초과의 농도, 약 3-배 초과의 농도, 약 5-배 초과의 농도, 약 10-배 초과의 농도, 약 20-배 초과의 농도, 약 30-배 초과의 농도, 약 50-배 초과의 농도, 약 100-배 초과의 농도, 약 200-배 초과의 농도, 약 300-배 초과의 농도, 또는 약 500-배 초과의 농도 인 결합 상수로 PD-L1 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 화합물이 PD-L1 수용체를 포함하는 다른 수용체에 결합하거나 상호작용하는 것보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 PD-L2와 결합하거나 상호작용한다는 점에서, 본원에 제공된 PD-L2 억제제는 PD-L2에 대해 선택적이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 PD-L1 수용체보다 적어도 약 2-배 초과의 농도, 약 3-배 초과의 농도, 약 5-배 초과의 농도, 약 10-배 초과의 농도, 약 20-배 초과의 농도, 약 30-배 초과의 농도, 약 50-배 초과의 농도, 약 100-배 초과의 농도, 약 200-배 초과의 농도, 약 300-배 초과의 농도, 또는 약 500-배 초과의 농도인 결합 상수로 PD-L2 수용체에 결합한다.
임의의 이론에 의한 구속됨 없이, 종양 세포는 PD-L1을 발현시키고 T 세포는 PD-1을 발현시키는 것으로 여겨진다. 그러나, 종양 세포에 의한 PD-L1 발현은 PD-1 또는 PD-L1 억제제 또는 차단제의 효능에 필요하지 않다. 일 실시형태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현시킨다. 또 다른 실시형태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은PD-1 및 PD-L1 항체, 예컨대 본원에 기재된 것의 조합을 TIL와 조합하여 포함할 수 있다. PD-1과 PD-L1 항체와 TIL의 조합의 투여는 동시 또는 순차적일 수 있다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 100 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 8 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하 이하의 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하거나; 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하는 것이다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 MEDI4736 (이는 AstraZeneca plc.의 자회사인 머릴랜드주 게티스버그 소재의 Medimmune, LLC로부터 상업적으로 입수가능함) 로도 알려져 있는 더발루맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체, 또는 변이체이다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허 제8,779,108호 또는 미국 특허출원공개 제2013/0034559호에 개시된 항체이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 더발루맙의 임상 효능은 문헌[Page, 등, Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; Brahmer, 등, J. Clin. Oncol. 2014, 32, 5s (보충, 요약 8021); 및 McDermott, 등, Cancer Treatment Rev. 2014, 40, 1056-64]에 기재되었다. 더발루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,779,108호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 더발루맙의 아미노산 서열은 표 50에 제시된다. 더발루맙 단클론성 항체는 22-96, 22''-96'', 23'-89', 23'''-89''', 135'-195', 135'''-195''', 148-204, 148''-204'', 215'-224, 215'''-224'', 230-230'', 233-233'', 265-325, 265''-325'', 371-429, 및 371''-429'에서 디설파이드 연결기; 및 Asn-301 및 Asn-301''에서 N-글리코실화 부위를 포함한다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:147에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:148에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:147 및 서열번호:148 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:147 및 서열번호:148 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:147 및 서열번호:148 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:147 및 서열번호:148 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:147 및 서열번호:148 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:147 및 서열번호:148 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 더발루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:149에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:150에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:149 및 서열번호:150 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:149 및 서열번호:150 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:149 및 서열번호:150 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:149 및 서열번호:150 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:149 및 서열번호:150 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:151, 서열번호:152, 및 서열번호:153 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:154, 서열번호:155, 및 서열번호:156 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 PD-L1 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 더발루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 MSB0010718C (Merck KGaA/EMD Serono에서 상업적으로 입수가능함)로도 알려져 있는 아벨루맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체, 또는 변이체이다. 아벨루맙의 제조 및 특성은 미국 특허출원공개 US 2014/0341917 A1호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다. 아벨루맙의 아미노산 서열은 표 51에 제시된다. 아벨루맙은 22-96, 147-203, 264-324, 370-428, 22''-96'', 147''-203'', 264''-324'', 및 370''-428''에서 중쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 22'-90', 138'-197', 22'''-90''', 및 138'''-197'''에서 경쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 223-215' 및 223''-215'''에서 중-경쇄내 디설파이드 연결기 (h 5-CL 126); 229-229'' 및 232-232''에서 중-중쇄내 디설파이드 연결기 (h 11, h 14); 300, 300''에서 N-글리코실화 부위 (H CH2 N84.4); 푸코실화된 복합체 바이-안테너리 CHO-유형 글리칸; 및 450 및 450'에서 H CHS K2 C-말단 라이신 클립핑을 갖는다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:157에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:158에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:157 및 서열번호:158 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:157 및 서열번호:158 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:157 및 서열번호:158 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:157 및 서열번호:158 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:157 및 서열번호:158 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:157 및 서열번호:158 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 아벨루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:159에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:160에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:159 및 서열번호:160 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:159 및 서열번호:160 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:159 및 서열번호:160 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:159 및 서열번호:160 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:159 및 서열번호:160 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:161, 서열번호:162, 및 서열번호:163 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:164, 서열번호:165, 및 서열번호:166 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 PD-L1 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 아벨루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 MPDL3280A 또는 RG7446 (스위스 바젤 소재의 Roche Holding AG의 자회사인 Genentech, Inc.로부터 TECENTRIQ로 상업적으로 입수가능함) 도 알려져 있는 아테졸리주맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체, 또는 변이체이다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허 제8,217,149호에 개시된 항체이고, 그의 개시내용은 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허출원공개 제2010/0203056 A1호, 제2013/0045200 A1호, 2013/0045201 A1호, 제2013/0045202 A1호, 또는 제2014/0065135 A1호에 개시된 항체이고, 그의 개시내용은 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다. 아테졸리주맙의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,217,149호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 아테졸리주맙의 아미노산 서열은 표 52에 제시된다. 아테졸리주맙은 22-96, 145-201, 262-322, 368-426, 22''-96'', 145''-201'', 262''-322'', 및 368''-426''에서 중쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 23'-88', 134'-194', 23'''-88''', 및 134'''-194'''에서 경쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 221-214' 및 221''-214'''에서 중-경쇄내 디설파이드 연결기 (h 5-CL 126); 227-227'' 및 230-230''에서 중-중쇄내 디설파이드 연결기 (h 11, h 14); 및 298 및 298'에서 N-글리코실화 부위 (H CH2 N84.4>A)를 갖는다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:167에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호:168에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:167 및 서열번호:168 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:167 및 서열번호:168 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:167 및 서열번호:168 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:167 및 서열번호:168 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:167 및 서열번호:168 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 이들 각각은 서열번호:167 및 서열번호:168 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 아테졸리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:169에 제시된 서열을 포함하고, 그리고 PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:170에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:169 및 서열번호:170 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:169 및 서열번호:170 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:169 및 서열번호:170 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:169 및 서열번호:170 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하되, 상기 영역 각각은 서열번호:169 및 서열번호:170 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:171, 서열번호:172, 및 서열번호:173 각각에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환, 및 서열번호:174, 서열번호:175, 및 서열번호:176 각각에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 PD-L1 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다. 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽연합의 EMA에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허출원공개 US 2014/0341917 A1호에 기재된 항체를 포함하고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 또 다른 실시형태에서, PD-L1에 대한 결합에 대해 임의의 이들 항체와 경쟁하는 항체가 또한 포함된다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는, BMS-935559 로도 알려져 있는 MDX-1105이며, 이는 그 개시내용은 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 US 7,943,743호에 개시되어 있다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 미국 특허 US 제7,943,743호에 개시된 항-PD-L1 항체로부터 선택되고, 상기 특허는 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 상업적으로 입수가능한 단클론성 항체, 예컨대 INVIVOMAB 항-m-PD-L1 클론 10F.9G2 (카탈로그 # BE0101, Bio X Cell, Inc., 미국 뉴햄프셔 웨스트 리바논 소재)이다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 상업적으로 입수가능한 단클론성 항체, 예컨대 AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (MIH1)이다. 수많은 상업적으로 입수가능한 항-PD-L1 항체는 당업자에게 알려져 있다.
일 실시형태에서, PD-L2 억제제는 상업적으로 입수가능한 단클론성 항체, 예컨대 BIOLEGEND 24F.10C12 마우스 IgG2a, κ 아이소타입 (카탈로그 # 329602 Biolegend, Inc., San Diego, CA), SIGMA 항-PD-L2 항체 (카탈로그 # SAB3500395, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich Co.), 또는 당업자에게 알려진 다른 상업적으로 입수가능한 항-PD-L2 항체이다.
2. 환자의 선택적 림프구고갈 전처치
일 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 주입으로 암을 치료하는 방법을 포함하고, 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 전-치료된다. 일 실시형태에서, 본 발명은 비-골수절제 화학요법으로 전치료되었던 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 포함한다. 일 실시형태에서, TIL의 집단은 주입에 의한 투여를 위한 것이다. 일 실시형태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 시클로포스파미드 60 mg/kg/d (TIL 주입 전 27일째 및 26일째) 및 5일 동안 플루다라빈 25 mg/m2/d (TIL 주입 전 27일 내지 23일)이다. 일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 비-골수절제 화학요법 및 TIL 주입(0일) 후, 환자는 생리학적 허용 범위까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2(알데스류킨, 프롤류킨으로서 상업적으로 입수가능함)의 정맥내 주입을 받는다. 특정 실시형태에서, TIL의 집단은 IL-2와의 조합으로 암을 치료하는데 사용되고, IL-2는 TIL의 주입 후에 투여된다.
실험적 발견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전의 림프 고갈이 조절성 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소 ('사이토카인 싱크')를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 TIL의 도입 전에 환자에게 림프구고갈 단계 (때때로 "면역억제성 컨디셔닝"으로도 지칭됨)를 이용한다.
일반적으로, 림프구고갈은 플루다라빈의 투여 또는 사이클로포스파미드 (활성 형태는 마포스파미드로 지칭됨) 및 이들의 조합을 사용하여 달성된다. 그와 같은 방법은 문헌[Gassner, 등, Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, 등, Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, 및 Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357]에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 플루다라빈은 0.5 μg/mL -10 μg/Ml의 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 1 μg/mL의 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 25 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 35 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 45 mg/kg/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 2 내지 7일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 4 내지 5일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 25 mg/kg/일로 4 내지 5일 동안 투여된다.
일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는, 사이클로포스파미드의 투여에 의해 0.5 μg/mL 내지 10 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는, 사이클로포스파미드의 투여에 의해 1 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드는 100 mg/m2/일, 150 mg/m2/일, 175 mg/m2/일, 200 mg/m2/일, 225 mg/m2/일, 250 mg/m2/일, 275 mg/m2/일, 또는 300 mg/m2/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드는 정맥내로 (즉, i.v.) 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 35 mg/kg/일로 2 내지 7일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 250 mg/m2/일 i.v.로 4 내지 5일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 250 mg/m2/일 i.v.로 4일 동안 투여된다.
일부 실시형태에서, 림프구고갈은 플루다라빈 및 사이클로포스파미드를 함께 환자에게 투여함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 25 mg/m2/일 i.v.로 투여되고, 사이클로포스파미드는 4일에 걸쳐 250 mg/m2/일 i.v.로 투여된다.
일 실시형태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.
3. IL-2 레지멘
일 실시형태에서, IL-2 레지멘은 고용량 IL-2 레지멘을 포함하고, 고용량 IL-2 레지멘은 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하고, 이는 TIL의 치료 집단의 치료적 유효 부분을 투여한 날에 시작하여 정맥내로 투여되고, 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체는 최대 14회 투여 동안, 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입을 사용하여 0.037 mg/kg 또는 0.044mg/kg IU/kg (환자 체질량)의 용량으로 투여된다. 휴식 9일 후, 이 스케줄은 또 다른 14회 투여 동안, 총 최대 28회 용량 동안 반복될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, IL-2는 최대 6회 용량의 최대 투여량으로 투여된다.
일 실시형태에서, IL-2 레지멘은 점점 약한 IL-2 레지멘을 포함한다. 점점 약한 IL-2 레지멘은 문헌[O'Day, 등, J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 및 Eton, 등, Cancer 2000, 88, 1703-9]에 기재되었고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, 점점 약한 IL-2 레지멘은 6시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18 × 106 IU/m2, 이어서 12시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18 × 106 IU/m2, 이어서 24시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18 × 106 IU/m2, 이어서 72시간에 걸쳐 정맥내로 투여된4.5 × 106 IU/m2을 포함한다. 이 치료 주기는 최대 4사이클 동안 28일마다 반복될 수 있다. 일 실시형태에서, 점점 약한 IL-2 레지멘은 1일째에 18,000,000 IU/m2, 2일째에 9,000,000 IU/m2, 및 3일째 및 4일째에 4,500,000 IU/m2를 포함한다.
일 실시형태에서, IL-2 레지멘은 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량으로 1, 2, 4, 6, 7, 14 또는 21일마다 페길화된 IL-2의 투여를 포함한다.
실시예
본원에 포괄된 실시형태는 이제 다음의 실시예들을 참고하여 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본원에 포괄된 개시내용은 이러한 실시예들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로 명백 해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: PRE-REP 및 REP 프로세스를 위한 배지 제조
본 실시예는 비소세포 폐암종(NSCLC)을 포함한 다양한 종양 유형으로부터 유래된 종양 침윤 림프구(TIL)의 배양을 포괄하는 프로토콜에 사용하기 위한 조직 배양 배지의 제조 절차를 설명한다. 이 배지는 본원 및 실시예에 기재된 임의의 TIL의 제조에 사용될 수 있다.
CM1의 제조
냉장 보관으로부터 다음의 시약을 제거하고, 37℃ 수조에서 가온시켰다: (RPMI1640, 인간 AB 혈청, 200mM L-글루타민). 여과하고자 하는 부피에 적절한 0.2 μm 필터 유닛의 최상부 섹션에 각각의 성분을 첨가하여 하기 표 18에 따라 CM1 배지를 제조하였다. 4℃에서 저장한다.
사용 당일, 필요한 양의 CM1을 37℃ 수조에서 예열하고, 6000 IU/m1 IL-2를 첨가한다.
추가의 보충 - 표 25에 의거하여 필요에 따름.
CM2의 제조
상기 섹션 7.3에 따라, 제조된 CM1을 냉장고에서 제거하거나, 신선한 CM1을 제조한다. 냉장고에서 AIM-V®를 제거하고, 제조된 CM1을 동등 부피의 AIM-V®와 멸균 배지 병에서 혼합하여 필요한 양의 CM2를 제조하였다. 사용 당일, CM2 배지에 3000 IU/ml IL-2를 첨가하였다. 사용 당일, 3000 IU/ml IL-2로 충분한 양의 CM2를 제조하였다. CM2 배지 병에 그것의 명칭, 제조자의 이니셜, 여과일/제조일, 2-주 만료 날짜를 라벨링하고, 조직 배양이 필요할 때까지 4℃에서 보관하였다.
CM3의 제조
사용을 위해 필요한 날에 CM3을 제조하였다. CM3은 사용 당일 3000 IU/ml IL-2이 보충된 AIM-V® 배지와 동일하였다. IL-2 스톡 용액을 AIM-V의 병 또는 백에 직접 첨가하여, 실험 요구에 충분한 양의 CM3을 제조하였다. 부드럽게 셰이킹하여 잘 혼합하였다. AIM-V에 첨가한 직후 병에 "3000 IU/ml IL-2"로 라벨링하였다. CM3이 과잉인 경우, 배지 명칭, 제조자 이니셜, 배지 제조일, 및 그것의 만료일(제조 후 7일)을 라벨링한 병에 4℃에서 저장하였다. 4℃에서 7일 저장한 후, IL-2가 보충된 배지를 폐기하였다.
CM4의 제조
CM4는 2mM G1utaMAXTM(최종 농도)를 추가로 보충하여, CM3과 동일하였다. CM3 1 L 당, 10 ml의 200mM G1utaMAXTM를 첨가하였다. IL-2 스톡 용액 및 G1utaMAXTM 스톡 용액을 AIM-V의 병 또는 백에 직접 첨가하여, 실험 요구에 충분한 양의 CM4를 제조하였다. 부드럽게 셰이킹하여 잘 혼합하였다. AIM-V에 첨가한 직후 병에 "3000 IL/nil IL-2 및 G1utaMAX "로 라벨링하였다. CM4가 과잉인 경우, 배지 명칭, "G1utaMAX", 및 그것의 만료일(제조 후 7일)을 라벨링한 병에 4℃에서 저장하였다. 4℃에서 7일 저장한 후, IL-2가 보충된 배지를 폐기하였다.
실시예 2: IL-2, IL-15, 및 IL-21 사이토카인 칵테일의 사용
본 실시예는 실시예 A 내지 G의 TIL 공정과 조합하여, 추가의 T 세포 성장 인자로서 작용하는 IL-2, IL-15, 및 IL-21 사이토카인의 사용을 설명한다.
본원에 기재된 공정들을 사용하여, TIL은 배양 시작 시에 실험의 한 군에서 IL-2의 존재 하에, 그리고 IL-2 대신에, 또 다른 군에 IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합의 존재 하에 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 종양으로부터 성장할 수 있다. pre-REP 완료시에, 확장, 표현형, 기능(CD107a+ 및 IFN-γ) 및 TCR Vβ 레퍼토리에 대하여 배양물을 평가하였다. IL-15 및 IL-21는 본원의 다른 곳 및 문헌[Gruijl, 등]에 기재되어 있으며, IL-21은 조절 T 세포의 높은 세포독성 잠재적 및 낮은 부차적인 확장으로 CD27+CD28+ 종양 침윤 림프구의 확장을 촉진하고, 문헌[Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37](ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/의 월드 와이드 웹에 위치됨).
결과는 IL-2, IL-15, 및 IL-21 처리된 조건에서의, CD4+ 및 CD8+ 세포 모두에서, 향상된 TIL 확장(>20%)이 IL-2 단독 조건과 비교하여 관찰될 수 있음을 보여줄 수 있다. IL-2 단독 배양과 비교하여, IL-2, IL-15, 및 IL-21 처리된 배양물로부터 수득된 TIL에서 왜곡된 TCR Vβ 레퍼토리를 갖는 주로 CD8+ 집단으로 치우침이 있었다. IL-2 단독 처리된 TIL과 비교하여, IL-2, IL-15, 및 IL-21 처리된 TIL에서 IFN-γ 및 CD107a가 상승하였다.
실시예 3: 감마선-조사된 주변 단핵 세포의 개별 로트 적격화
본 실시예는 예시적인 본원에 기재된 예시적인 방법에서 동종이계 피더 세포로 사용하기 위한 감마-조사된 주변 단핵 세포(PBMC, 또한 MNC로 알려져 있음)의 개별 로트를 적격화하기 위한 새로운 단축된 절차를 설명한다.
각각의 조사된 MNC 피더 로트는 개체 공여체로부터 제조되었다. 정제된 항-CD3(클론 OKT3) 항체 및 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 REP에서 TIL을 확장하는 그것의 능력에 대해 각각의 로트 또는 공여체를 개별적으로 선별하였다. 또한 피더 세포의 각각의 로트를 TIL 첨가없이 시험하여, 받은 감마 방사선의 선량이 복제 불능시키는데 충분한지 검증하였다.
배경
TIL의 REP를 위해 감마선-조사된, 성장-억제된 MNC 피더 세포가 필요하였다. 피더 MNC 상의 멤브레인 수용체는 항-CD3(클론 OKT3) 항체에 결합하고, REP 플라스크에서 TIL에 교차결합하여, TIL이 확장되도록 자극한다. 개별 공여체로부터 채취한 전혈의 백혈구성분채집술로부터 피더 로트를 제조하였다. 백혈구성분채집술 생성물을 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 상에서 원심분리하고, 세척하고, 조사하고, GMP 조건 하에 동결보존하였다.
이는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 초래할 수 있으므로, TIL 요법을 받은 환자에게는 실행가능한 피더 세포를 주입하지 않는 것이 중요하다. 따라서 피더 세포는 감마선-조사로 세포를 투약하여 성장-억제되어, 이중 가닥 DNA가 절단되고, 재배양시 MNC 세포의 세포 생존력이 손실된다.
평가 기준 및 실험 설정
피더 로트를 두가지 기준: 1) 공동배양시 TIL을 >100-배 확장시키는 능력 및 2) 그것의 복제 무능력에 따라 평가하였다.
직립 T25 조직 배양 플라스크에서 성장된 2개의 1차 pre-REP TIL 라인을 사용하여 미니-REP 형식으로 피더 로트를 시험하였다. 각각의 TIL 라인은 REP에서의 활성화에 대응하여 증식하는 능력이 고유하기 때문에, 피더 로트는 2개의 별개의 TIL 라인에 대해 시험되었다. 대조군으로서, 이력상 상기 기준을 충족하는 것으로 밝혀진 많은 조사된 MNC 피더 세포는 테스트 로트와 함께 실행되었다.
단일 실험에서 시험된 모든 로트가 동등한 테스트를 받도록 보장하기 위해, 모든 조건 및 모든 피더 로트를 테스트하기 위해 동일한 pre-REP TIL 라인의 충분한 스톡을 사용할 수 있었다.
시험된 피더 세포의 각각의 로트에 대해, 총 6개의 T25 플라스크: Pre-REP TIL 라인 #1(2 플라스크); Pre-REP TIL 라인 #2(2 플라스크); 및 피더 대조군(2 플라스크)이 있었다. TIL 라인 #1 및 #2를 포함하는 플라스크를 TIL을 확장하는 피더 로트의 능력에 대하여 평가하였다. 피더 대조군 플라스크는 피더 로트의 복제 불능에 대하여 평가하였다.
실험 프로토콜
-2/3일차, TIL 라인의 해동
CM2 배지를 제조하였다. 37℃ 수조에서 CM2를 가온시켰다. 3000 IU/ml IL-2이 보충된 40 ml의 CM2를 제조하였다. 사용할 때까지 보온시킨다. 사용된 TIL 라인의 명칭이 라벨링된 2개의 50 ml 원뿔형 튜브 각각에 IL-2 없이 미리 데운 CM2 20 ml을 넣었다. LN2 저장소에서 2개의 지정된 프리-REP TIL 라인을 제거하고, 바이알을 조직 배양실로 이동시켰다. 소량의 얼음이 남을 때까지 37℃ 수조의 밀봉된 지퍼 보관백에 넣어 바이알을 해동시켰다.
멸균 이송 피펫을 사용하여, 바이알의 내용물을 제조된, 라벨링된 50 ml 원추형 튜브내 20 ml의 M2로 즉시 이동시켰다. IL-2 없이 CM2를 사용하여 40 ml로 QS하여, 세포를 세척하였다. 400 x CF에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 3000 IU/ml IL-2이 보충된 5ml 따뜻한 CM2에 재현탁하였다.
자동화 세포 계수기를 사용한 세포 카운팅을 위해 작은 분취액 (20 μl)을 이중으로 제거하였다. 카운트를 기록한다. 계수하는 동안, TIL 세포가 있는 50 ml 원추형 튜브를 가습된 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣고, 뚜껑을 느슨하게 풀어서 가스를 교환시켰다. 3000 IU/ml에서 IL-2가 보충된 CM2에서 세포 농도를 결정하고, TIL을 1 x 106 세포/ml로 희석시켰다.
mini-REP의 0일까지 가습된 37℃ 인큐베이터에서 필요에 따라 많은 웰들에서 24-웰 조직 배양판의 2ml/웰에서 배양하였다. 혼란 및 잠재적인 교차-오염을 피하기 위해 별도의 24-웰 조직 배양판에서 상이한 TIL 라인을 배양하였다.
0 일째, Mini-REP 개시
시험될 피더 로트의 수에 충분한 CM2 배지를 제조하였다. (예를 들어, 한꺼번에 4개의 피더 로트를 시험하기 위해, 800 ml의 CM2 배지를 제조하였다). 상기 제조된 CM2의 일부를 분취하고, 세포 배양을 위해 3000 IU/ml IL-2를 보충하였다. (예를 들어, 한꺼번에 4개의 피더 로트를 시험하기 위해, 3000 IU/ml IL-2가 포함된 500 ml의 CM2 배지를 제조하였다).
교차-오염을 방지하기 위해 각각의 TIL 라인을 별도로 작업하고, TIL 배양물이 있는 24-웰 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, BSC로 이동시켰다.
멸균 이송 피펫 또는 100-1000 μl 피펫터 및 팁을 사용하여, 사용할 TIL의 각각의 웰에서 약 1ml의 배지를 제거하고, 24-웰 조직 배양판의 미사용된 웰에 넣었다.
신선한 멸균 이송 피펫 또는 100-1000 μl 피펫터 및 팁을 사용하여, 나머지 배지를 웰들에서TIL과 혼합하고, 세포를 재현탁시킨 다음 세포 현탁액을 TIL 명칭이 라벨링된 50 ml 원추형 튜브로 이동시키고, 부피를 기록하였다.
예비 배지로 웰들을 세척하고, 그 부피를 동일한 50 ml 원추형 튜브로 이동시켰다. 400 x CF에서 세포를 회전시켜 세포 펠렛을 수집하였다. 배지 상청액에서 흡인하고, 3000 IU/ml IL-2를 함유하는 CM2 배지 2~5ml에 세포 펠렛을 재현탁시키고, 수확된 웰들의 수와 및 펠렛의 크기를 기반으로 사용될 부피 - 부피는 >1.3 x 106 세포/ml의 농도가 보장되는데 충분해야 한다.
혈청학적 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 철저하게 혼합하고, 부피를 기록하였다. 자동화 세포 계수기를 사용하여 세포 카운트를 위해 200 μl를 제거하였다. 계수하는 동안, TIL 세포가 있는 50 ml 원추형 튜브를 가습된, 5% CO2, 37℃인큐베이터에 넣고, 뚜껑을 느슨하게 풀어서 가스를 교환시켰다. 카운트를 기록하였다.
TIL 세포를 함유하는 50 ml 원추형 튜브를 인큐베이터로부터 제거하고, 3000IU/ml IL-2가 보충된 따뜻한 CM2에 1.3 x106 세포/ml의 농도로 세포를 재현탁시켰다. 50 ml 원추형 튜브를 뚜껑이 느슨한 인큐베이터로 돌려보냈다.
제2 TIL 라인에 대해 상기 단계들을 반복하였다.
TIL을 실험용 T25 플라스크에 넣기 직전에, TIL을 하기에 따라 1.3 x 105 세포/ml의 최종 농도로 1:10으로 희석하였다.
MACS GMP CD3 순수한 (OKT3) 작업 용액 제조
4℃ 냉장고에서 OKT3의 스톡 용액(1 mg/ml)을 꺼내어, BSC에 넣었다. 30ng/ml OKT3의 최종 농도를 mini-REP의 배지에 사용하였다.
실험의 각각의 T25 플라스크에서 20 ml를 위해 600ng의 OKT3이 필요하였으며; 이는 각각의 20 ml에 대해 10 μg/ml 용액 60 μl, 또는 각각의 피더 로트에 대해 시험된 6개의 플라스크 모두에 대해 360 μl에 해당하였다.
시험된 각각의 피더 로트에 대해, 10 μg/ml의 작업 농도로 1 mg/ml OKT3의 1:100 희석액 400 μl을 제조한다(예를 들어, 4개의 피더 로트를 한꺼번에 시험하기 위해, 1 mg/ml OKT3: 16 μl의 1 mg/ml OKT3 + 1.584 ml의 CM2 배지(3000 IU/ml IL-2를 가짐)의 1600 μl의 1:100 희석액을 만든다).
T25 플라스크 제조
피더 세포를 제조하기 전에, 각각의 플라스크를 라벨링하고, 플라스크를 CM2 배지로 채웠다. 37℃ 가습된 5% CO2 인큐베이터에 플라스크를 넣고, 나머지 구성요소들을 추가하는 것을 기다리는 동안 배지를 따뜻하게 유지시킨다. 피더 세포가 일단 제조되면, 구성요소가 각각의 플라스크의 CM2에 첨가될 것이다.
피더 세포 제조
이 프로토콜에 대해 시험된 로트 당 최소의 78 x 106개의 피더 세포가 필요하였다. SDBB에 의해 냉동된 각각의 1ml 바이알은 냉동 시 100 x 106개의 생존 세포를 가졌다. LN2 저장에서 해동 시 50% 회수율을 가정하면, 로트 당 적어도 2개의 1ml 피더 세포 바이알을 해동하여 각각의 REP에 대해 추정된 100 x 106개의 생존 세포를 제공하는 것이 권고되었다. 대안적으로, 1.8ml 바이알에 공급하는 경우, 단 하나의 바이알만 충분한 피더 세포를 제공하였다.
피더 세포를 해동하기 전에, 시험될 각각의 피더 로트에 대해 IL-2 없이 대략 50 ml의 CM2를 예열하였다. LN2 저장소에서 지정된 피더 로트 바이알을 제거하고, 지퍼 저장백에 넣고, 바이알을 얼음 위에 놓았다. 37℃ 수조에 침지시켜서, 밀봉된 지퍼 저장백 내부의 바이알을 해동시켰다. 지퍼백으로부터 바이알을 제거하고, 70% EtOH로 분무하거나 닦아내고, 바이알을 BSC로 이동시켰다.
이송 피펫을 사용하여 즉시 피더 바이알의 내용물을 50 ml 원추형 튜브에 있는 30 ml의 따뜻한 CM2로 옮겼다. 작은 부피의 CM2로 바이알을 세척하여, 바이알내 임의의 잔류 세포를 제거하였다. 400 x CF에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 4ml의 따뜻한 CM2 플러스 3000 IU/ml IL-2에 재현탁시켰다. 자동화 세포 계수기를 사용하여 세포 카운팅을 위해 200 μl을 제거하였다. 카운트를 기록하였다.
따뜻한 CM2 플러스 3000 IU/ml IL-2에 1.3 x 107 세포/ml로 세포를 재현탁시켰다. 1.3 x 106 세포/ml 내지 1.3 x 105 세포/ml로 TIL 세포를 희석시켰다.
공동-배양물 셋업
1.3 x 106 세포/ml 내지 1.3 x 105 세포/ml로 TIL 세포를 희석시켰다. 15ml 원추형 튜브에 4.5ml의 CM2 배지를 첨가하였다. 인큐베이터로부터 TIL 세포를 제거하고, 10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여 잘 재현탁시켰다. 1.3 x 106 세포/ml TIL 현탁액으로부터 0.5ml의 세포를 제거하고, 15ml 원추형 튜브에 있는 4.5ml의 배지에 첨가하였다. TIL 스톡 바이알을 인큐베이터로 반환하였다. 잘 혼합하였다. 제2 TIL 라인에 대해 반복하였다.
인큐베이터에서 BSC로 단일 피더 로트에 대해 사전-가온된 배지가 있는 플라스크로 이동시켰다. 1ml 피펫 팁으로 상하로 몇 번 피펫팅하여, 피더 세포를 혼합하고, 해당 피더 로트의 각각의 플라스크에 1 ml(1.3 x 107개의 세포)를 이동시켰다. 각각의 플라스크에 60 μl의 OKT3 작업 스톡(10 μg/ml)을 첨가하였다. 2개의 대조군 플라스크를 인큐베이터로 돌려보냈다.
1 ml(1.3 x 105)의 각각의 TIL 로트를 상응하여 표지된 T25 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 인큐베이터로 되돌리고, 똑바로 인큐베이션하였다. 5일차까지 방해하지 않았다.
시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
5일차, 배지 변경
3000 IU/ml IL-2로 CM2를 제조하였다. 각각의 플라스크에 10 ml가 필요하다. 10 ml 피펫을 사용하여, 3000 IU/ml IL-2와 함께 10 ml의 따뜻한 CM2를 각각의 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 인큐베이터로 되돌리고, 7일차까지 똑바로 인큐베이션하였다. 시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
7일차, 수확
인큐베이터로부터 플라스크를 제거하고, 플라스크 바닥의 세포층을 방해하지 않도록 주의하면서 BSC로 옮겼다. 플라스크 바닥에서 자라는 세포를 방해하지 않으면서, 각각의 테스트 플라스크에서 10 ml의 배지를 제거하고 각각의 대조군 플라스크에서 15ml의 배지를 제거하였다.
10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여, 세포를 나머지 배지에 재현탁시키고, 잘 혼합하여 임의의 세포 덩어리를 분해하였다. 세포 현탁액을 피펫팅으로 철저하게 혼합한 후, 세포 카운팅을 위해 200 μl 제거하였다. 자동 세포 계수기 장비와 함께 공조하여, 적절한 표준 작동 절차를 사용하여 TIL을 계수하였다. 7일차에 카운트를 기록하였다.
시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
피더 대조군 플라스크를 복제 불능에 대해 평가하고, TIL을 함유하는 플라스크를 하기 표 TT에 따라 0일째부터 배수 확장에 대해 평가하였다.
7일차, 피더 대조군 플라스크를 14일차까지 계속
피더 대조군 플라스크의 7일 카운트를 완료한 후, 3000 IU/ml IL-2를 함유하는 15ml의 신선한 CM2 배지를 각각의 대조군 플라스크에 첨가하였다. 대조군 플라스크를 인큐베이터로 되돌리고, 14일차까지 똑바로 인큐베이션하였다.
14일차, 피더 대조군 플라스크의 연장된 비-증식
인큐베이터로부터 플라스크를 제거하고, 플라스크 바닥의 세포층을 방해하지 않도록 주의하면서 BSC로 옮겼다. 플라스크 바닥에서 자라는 세포를 방해하지 않으면서, 각각의 대조군 플라스크에서 대략 17ml의 배지를 제거하였다. 5ml 혈청학적 피펫을 사용하여, 세포를 나머지 배지에 재현탁시키고, 잘 혼합하여 임의의 세포 덩어리를 분해하였다. 각각의 플라스크의 부피를 기록하였다.
세포 현탁액을 피펫팅으로 철저하게 혼합한 후, 세포 카운팅을 위해 200 μl 제거하였다. 자동 세포 계수기 장비와 함께 공조하여, 적절한 표준 작동 절차를 사용하여 TIL을 계수하였다. 카운트를 기록하였다.
시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
결과 및 허용 기준
결과
감마선 조사 선량은 피더 세포 복제를 불능시키기에 충분하였다. 모든 로트는 평가 기준을 만족시킬 것으로 예상되며, 0일째와 비교하여 REP 배양 7일차에 나머지 피더 세포의 총 생존세포수의 감소를 또한 입증하였다.
모든 피더 로트는 REP 배양 7일까지 TIL 성장의 100-배 확장의 평가 기준을 충족할 것으로 예상되었다.
피더 대조군 플라스크의 14일 카운트는 7일차에 나타난 비-증식성 경향을 계속할 것으로 예상되었다.
허용 기준
다음의 허용 기준은 피더 세포의 각각의 로트에 대해 시험된 각각의 복제 TIL 라인에 대해 충족되었다
허용은 아래와 같이 2-배였다(하기 표 27에 설명됨).
30ng/ml OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양될 때 방사선 선량이 MNC 피더 세포 복제를 불능시키는데 충분한지 평가하였다. 복제 불능은 REP의 7일 및 14일차에 자동화 세포 카운팅에 의해 결정된 대로 총 생존 세포 수(TVC)에 의해 평가하였다.
허용 기준은 "성장 없음"이며, 이는 총 생존 세포 수가 REP의 0일째에 배양에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 7일 및 14일차에 증가되지 않았음을 의미한다.
TIL 확장을 뒷받침하는 피더 세포의 능력을 평가하였다. TIL 성장은 REP의 0일째에 배양 개시로부터 REP의 7일차까지의 생존 세포의 배수 확장 관점에서 측정하였다. 7일차에, TIL 배양은 자동화 세포 카운팅에 의해 평가된 바와 같이, 최소 100-배 확장(즉, REP 0일째에 배양에 투입된 총 생존 TIL 세포 수의 100배 이상)을 달성하였다.
허용 기준을 충족하지 않는 MNC 피더 로트의 비상 테스트(contingency testing)
MNC 피더 로트가 상기 설명된 허용 기준 중 하나를 충족하지 못한 경우, 간단한 실험자 오류를 그의 원인으로 배제하기 위해 로트를 재시험하기 위해 다음의 단계들을 수행할 것이다.
로트의 2개 이상의 위성(satellite) 테스트 바이알이 남아있는 경우 로트를 재시험하였다. 로트의 남아있는 위성 테스트 바이알이 하나 있거나 없는 경우, 위에 열거된 허용 기준에 따라 로트가 실패한 것이다.
적격화되기 위해서는 해당 로트와 대조군 로트가 위의 허용 기준을 충족해야 하였다. 이들 기준을 충족하면, 로트는 사용을 위해 방출되었다.
실시예 4: 감마선-조사된 말초 혈액 단핵 세포의 개별 로트 적격화
본 실시예는 본원에 기재된 예시적인 방법에서 동종이계 피더 세포로 사용하기 위한 감마선-조사된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 개별 로트를 적격화하기 위한 새로운 단축된 절차를 설명한다. 본 실시예는 TIL의 임상 로트 생산에 사용하기 위한, 조사된 PBMC 세포 로트의 평가를 위한 프로토콜을 제공한다. 각각의 조사된 PBMC 로트는 개체 공여체로부터 제조하였다. 100개 이상의 적격화 프로토콜 과정에서, 모든 경우에, SDBB(San Diego 혈액 은행)로부터의 조사된 PBMC 로트가 REP 7일차에 TIL을 >100-배 확장하는 것으로 나타났다. 이러한 변형된 적격화 프로토콜은 SDBB로부터의 조사된 공여체 PBMC 로트에 적용하기 위한 것으로, 받은 감마 방사선의선량이 그들을 복제 불능시키기에 충분한지 검증하기 위해 추가로 시험하였다. 이들이 14일 동안 복제 불능을 유지한다는 사실이 입증되면, 공여체 PBMC 로트는 TIL의 임상 로트를 생산하는데 사용하기에 "적격화된" 것으로 간주되었다.
배경
감마선-조사된, 성장-억제된 PBMC는 TIL의 현재 표준 REP에 필요하였다. PBMC 상의 멤브레인 수용체는 항-CD3(클론 OKT3) 항체와 결합하고, 배양 시에 TIL에 가교결합하여, TIL이 확장되도록 자극한다. PBMC 로트는 개별 공여체로부터 채취한 전혈의 백혈구성분채집술로부터 제조하였다. 백혈구성분채집술 생성물을 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 상에서 원심분리하고, 세척하고, 조사하고, GMP 조건 하에 동결보존하였다.
이는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 초래할 수 있으므로, TIL 요법을 받은 환자에게는 실행가능한 PBMC를 주입하지 않는 것이 중요하다. 따라서 공여체 PBMC는 감마선-조사로 세포를 투약하여 성장-억제되어, 이중 가닥 DNA가 절단되고, 재배양 시 PBMC의 세포 생존력이 손실된다.
평가 기준
7.2.1 조사된 PBMC 로트에 대한 평가 기준은 그것의 복제 불능이었다.
실험 설정
직립 T25 조직 배양 플라스크를 사용하여, TIL과 공배양되는 것처럼 피더 로트를 미니-REP 형식으로 시험하였다. 대조군 로트: 이력상 7.2.1의 기준을 충족하는 것으로 밝혀진, 조사된 PBMC의 한 로트는, 대조군으로서 실험 로트와 함께 실행되었다. 시험된 조사된 공여체 PBMC의 각각의 로트에 대하여, 중복 플라스크를 실행하였다.
실험 프로토콜
0 일차
시험할 공여체 PBMC의 각각의 로트에 대하여 약 90 ml의 CM2 배지를 제조하였다. 37℃ 수조에서 CM2를 따뜻하게 유지하였다. 6 x 106 IU/ml IL-2의 분취약을 해동하였다. 후드에 배치하기 전에 70% EtOH로 닦아, CM2 배지를 BSC로 되돌렸다. 시험된 PBMC의 각각의 로트에 대해, 약 60ml의 CM2를 별도의 멸균 병으로 제거하였다. 해동된 6 x 106 IU/ml 스톡 용액으로부터의 IL-2를 이 배지에 최종 농도 3000 IU/ml로 첨가하였다. 보충되지 않은 CM2와 구별하기 위해 이 병을 "CM2/IL2"(또는 유사한)로 라벨링하였다.
OKT3 제조
4℃ 냉장고에서 항-CD3(OKT3) 스톡 용액을 꺼내어, BSC에 넣었다. 30ng/ml OKT3의 최종 농도를 mini-REP의 배지에 사용하였다. 1 mg/ml 스톡 용액으로부터 항-CD3(OKT3)의 10 μg/ml 작업 용액을 제조하였다. 필요할 때까지 냉장고에 보관하였다.
시험된 각각의 PBMC 로트에 대해, 항-CD3(OKT3) 스톡의 1:100 희석액 150 μl을 제조하였다. 예를 들어, 4개의 PBMC 로트를 한꺼번에 시험하기 위해, 3000 IU/ml IL-2이 보충된 594 μl의 CM2에 6 μl의 1 mg/ml 스톡 용액을 첨가하여, 600 μl의 10 μg/ml 항-CD3(OKT3)을 제조하였다.
플라스크 제조
라벨링한 T25 플라스크에 CM2/IL-2의 플라스크 당 19 ml를 첨가하고, 37℃로 플라스크를 두고, 가습시키고, 세포 제조동안 5% CO2 인큐베이터에 넣었다.
조사 PBMC 제조
시험될 PBMC 로트의 바이알을 LN2 저장소로부터 회수하였다. 해동 전에 이들을 -80℃에 두거나, 드라이아이스 상에서 보관하였다. 해동되는 각각의 로트에 대해 30 ml의 CM2(IL-2 보충물 없음)를 50 ml 원추형 튜브에 넣었다. 해동되는 PBMC의 상이한 로트 번호로 각각의 튜브를 라벨링하였다. 튜브를 단단히 캡핑하고, 사용 전에 37℃ 수조에 두었다. 필요에 따라, 50 ml 원추형 튜브를 BSC로 되돌리고, 후드에 넣기 전에 70% EtOH로 닦았다.
차가운 저장소로부터 바이알 PBMC를 제거하고, 37℃ 수조내 부유 튜브 랙에 넣어 해동하였다. 소량의 얼음이 바이알에 남을 때까지 해동을 진행시켰다. 멸균 이송 피펫을 사용하여, 50 ml 원추형 튜브에 있는 30 ml의 CM2에 바이알의 내용물을 즉시 이동시켰다. 약 1ml의 배지를 튜브로부터 제거하여 바이알을 세정하고; 50 ml 원추형 튜브로 세정을 되돌렸다. 단단히 캡핑하고, 부드럽게 스월링하여 세포를 세척하였다.
실온에서 400 x g에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 흡인시키고, 1000 μl 피펫 팁을 사용하여 따뜻한 CM2/IL-2 1 ml에 세포 펠렛을 재현탁하였다. 대안적으로, 배지를 첨가하기 전에, 캡핑된 튜브를 비어있는 튜브 랙을 따라 끌어서 세포 펠렛을 재현탁하였다. 세포 펠렛을 재현탁한 후, CM2/IL-2 배지를 사용하여 부피를 4 ml로 만들었다. 부피를 기록하였다.
자동화 세포 계수기를 사용하여 세포 카운팅을 위해 소량 분취액(예를 들어, 100 μl)을 제거하였다. 특정 자동화 세포 계수기 SOP에 따라 카운트를 이중으로 수행하였다. 세포 카운트를 수행하기 전에 PBMC의 희석을 수행하는 것이 가장 필요하였다. 권고된 시작 희석은 1:10이었지만, 이는 사용된 세포 계수기의 유형에 따라 변화되었다. 카운트를 기록하였다.
CM2/IL-2 배지를 사용하여 PBMC의 농도를 1.3 x 107 세포/ml로 조정하였다. 부드럽게 스월링하거나 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 흡인하여 잘 혼합하였다.
배양 플라스크 셋업
2개의 라벨링된 T25 플라스크를 조직 배양 인큐베이터로부터 BSC로 되돌렸다. 항-CD3/OKT3의 10 μg/ml 바이알을 BSC에 되돌렸다. 1 ml의 1.3 x 107 PBMC 세포 현탁액을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 60 μl의 10 μg/ml 항-CD3/OKT3을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 캡핑된 플라스크를 방해없이 성장 14일 동안 조직 배양 인큐베이터로 되돌렸다. 다음 로트에 필요할 때까지 항-CD3/OKT3 바이알을 냉장고에 다시 넣었다. 평가되는 PBMC의 각각의 로트에 대하여 반복하였다.
14일차, PBMC의 비-증식 측정
중복된 T25 플라스크를 BSC로 되돌렸다. 각각의 플라스크에 대해, 신선한 10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여 각각의 플라스크에서 약 17 ml를 제거한 다음, 주의하여 나머지 배지를 당겨 플라스크에 남아있는 부피를 측정하였다. 부피를 기록하였다.
동일한 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 샘플을 잘 혼합하였다.
계수를 위해 각 플라스크에서 200 μl 샘플을 제거하였다. 자동화 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하였다. 평가되는 PBMC의 각각의 로트에 대해 단계들 7.4.26 - 7.4.31을 반복하였다.
결과 및 허용 기준
결과
감마선 조사 선량은 피더 세포 복제를 불능시키기에 충분할 것으로 예상되었다. 모든 로트는 평가 기준을 만족시킬 것으로 예상되었으며, 0일째와 비교하여 REP 배양 14일차에 나머지 피더 세포의 총 생존세포수의 감소를 또한 입증하였다.
허용 기준
다음의 허용 기준은 시험되는 각각의 조사된 공여체 PBMC 로트에 대해 충족되었으며: "성장 없음" - 14일차 생존 세포의 총 수가 REP의 0일차에 배양물에 투입된 초기 생존 세포 수보다 적다는 것을 의미한다.
허용 기준을 충족하지 않는 PBMC 로트의 비상 테스트.
조사된 공여체 PBMC 로트가 위의 허용 기준을 충족하지 못한 경우에, 다음의 단계들을 수행하여 로트를 재시험하여 그 실패의 원인으로 단순 실험자 오류를 배제하였다. 로트의 2개 이상의 위성 바이알이 남아있는 경우 로트를 재시험하였다. 로트의 남아있는 위성 바이알이 하나 있거나 없는 경우, 위에 열거된 허용 기준에 따라 로트가 실패한 것이다.
적격이 되기 위해서는, 비상 테스트를 통과하는 PBMC 로트는 대조군 로트와 문제의 로트 복제의 둘 다 허용 기준을 달성하였다. 이들 기준을 충족하면, 로트는 사용을 위해 방출되었다.
실시예 5: IL-2 스톡 용액(CELLGENIX)의 제조
본 실시예는 rhIL-2를 사용하는 것을 포함하는 것을 포함하여, 본원 및 실시예에 기재된 모든 것을 포함하는, 정제된, 동결건조된 재조합 인간 인터류킨-2를 추가의 조직 배양 프로토콜에 사용하기에 적합한 스톡 샘플로 용해시키는 방법을 설명한다.
절차
0.2% 아세트산 용액(HAc)을 제조하였다. 29 mL 멸균수를 50 mL 원추형 튜브에 이동시켰다. lmL 1 N 아세트산을 50 mL 원추형 튜브에 첨가하였다. 튜브를 2~3회 뒤집어 잘 혼합하였다. Steriflip 필터를 사용하여 여과하여 HAc 용액을 멸균하였다.
PBS에서 1% HSA를 제조하였다. 150 mL 멸균 필터 유닛의 96 mL PBS에 4 mL의 25% HSA 스톡 용액에 첨가하였다. 용액을 여과하였다. 4℃에서 저장하였다. 제조된 rhIL-2의 각각의 바이알에 대해, 양식을 작성하였다.
rhIL-2 스톡 용액(6 x 106 IU/mL 최종 농도)을 제조하였다. rhIL-2의 각각의 로트는 상이하였으며, 및 필요한 정보는 제조업체의 분석증명서(COA)에서 찾았다: 예컨대: 1) 바이알 당 rhIL-2의 질량(mg), 2) rhIL-2의 고유 활성도(IU/mg) 및 3) 권고된 0.2% HAc 재구성 부피(mL).
하기 식을 사용하여 rhIL-2 로트에 필요한 1% HSA의 부피를 계산하였다.
예를 들어, CellGenix'의 rhIL-2 로트 10200121 COA에 따르면, lmg 바이알에 대한 고유 활성도는 25x106 IU/mg이다. 2 mL 0.2% HAc에서 rhIL-2를 재구성할 것을 권장한다.
IL-2 바이알의 고무 마개를 알코올 와이프로 와이핑하였다. 3 mL 주사기에 부착된 16G 바늘을 사용하여, 권고된 부피의 0.2% HAc를 바이알에 주입하였다. 바늘을 뺄 때 스토퍼가 빠지지 않도록 주의하였다. 바이알을 3회 뒤집고, 모든 분말이 용해될 때까지 스월링하였다. 스토퍼를 조심스럽게 제거하고 알코올 와이프 위에 따로 두었다. 1% HSA의 계산된 부피를 바이알에 첨가하였다.
rhIL-2 용액의 저장. 단기 저장(72시간 미만)의 경우, 바이알을 4℃에서 저장하였다. 장기 저장(72시간 초과)의 경우, 바이알을 더 작은 부피로 분취하여, 사용할 준비가 될 때까지 -20℃에서 저온바이알에 보관한다. 냉동/해동 사이클을 피하였다. 제조일로부터 6개월후 만료되었다. Rh-IL-2 라벨에는 공급업체 및 카탈로그 번호, 로트 번호, 만료일, 오퍼레이터 이니셜, 분취액의 농도 및 부피가 포함되었다.
실시예 6: 동결보존 프로세스
본 실시예는 CryoMed 속도 제어 냉동고, 모델 7454(Thermo Scientific)를 사용하여 실시예 G에 기재된 단축된, 폐쇄된 절차로 제조된 TIL의 동결보존 프로세스 방법을 설명한다.
사용된 장비는 다음과 같았다: 알루미늄 카셋트 홀더 랙(CS750 냉동고 백과 호환가능), 750 mL 백용 냉동저장 카셋트, 저압(22 psi) 액체 질소 탱크, 냉장고, 열전쌍 센서 (백용 리본 유형), 및 CryoStore CS750 냉동 백(OriGen Scientific).
동결 프로세스는, 핵생성부터 -20℃까지 분당 0.5℃의 속도로 그리고 -80℃의 최종 온도까지 분당 1℃의 냉각 속도를 제공한다. 프로그램 파라미터는 다음과 같다: 단계 1 - 4℃에서 대기; 단계 2: 1.0℃/분(샘플 온도) -4℃까지; 단계 3: 20.0℃/분(챔버 온도) -45℃까지; 단계 4: 10.0℃/분(챔버 온도) -10.0℃까지; 단계 5: 0.5℃/분(챔버 온도) -20℃까지; 및 단계 6: 1.0℃/분(샘플 온도) -80℃까지.
실시예 7: 항-PD-1 항체에 의한 NSCLC 치료
환자 집단:
치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단
치료 스케줄:
종양 단편, 최대 4회 용량의 항-PD-1/PD-L1로 치료, 1차 재발 환자를 동결-보존되고 즉각적인 진행 시 사용할 준비가 된 TIL 제품으로 치료. 1차 재발 환자는 2회 투여 후 진행되었을 수 있다.
재발 환자 또한 진행 시 치료받을 수 있다(타이밍은 수개월에서 수년후로 다양할 수 있음).
전체 강도 IL-2 최대 6회 용량.
앞서 언급한 동일한 제조 순열로 추가로 고려할 환자 집단:
ㆍ 치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단.
ㆍ 치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나, 저발현의 PD-L1을 갖는, 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단.
ㆍ 치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나, 저발현의 PD-L1을 갖고/갖거나, 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단. (예를 들어, CT 상에서 큰 부피로 정의된, 20 mm 이상의 단축 직경을 갖는 횡방향 또는 관상 평면 또는 팽윤된 림프절에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타난다; 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[Samejima, J., Japanese Journal of Clinical Oncology, 45(11): 1050-10541 2015]을 참조한다.).
실시예 8: 고형 종양을 갖는 환자에서 자가 종양 침윤 림프구의 2단계, 다중중심 연구
연구 설계
개요
본 실시예는 펨브롤리주맙과 조합한 TIL을 사용하여, 또는 단일 요법으로서 TIL을 사용하여, 본원뿐만 아니라 이 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 TIL을 사용하여, ACT를 평가하는 전향적, 개방 라벨, 다중-코호트, 비-랜덤화된, 다중중심 2상 연구를 설명한다.
목적:
1차:
연구원에 의해 평가된 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST 1.1)을 사용하여, 객관적 반응 속도(ORR)에 의해 결정된, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 자가 TIL의 효능을 평가하기 위해, 이전에 CPI로 치료시에 이미 진행된, 또는 치료 후에 진행된 재발성 또는 불응성(r/r) NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 효능을 평가하기 위해.
등급 ≥ 3 치료 후 발생한 유해 사례(TEAE)의 발병률에 의해 측정된 바와 같이, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 TIL 또는 r/r NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 안전성 프로파일을 특성화하기 위해.
2차:
완전 반응(CR) 속도, 반응의 지속기간(DOR), 질환 통제율(DCR), 연구원에 의해 평가된 바와 같은, RECIST 1.1을 사용한 무진행 생존(PFS), 및 전체 생존(OS)을 사용하여, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 자가 TIL 또는 r/r NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 효능을 추가로 평가하기 위해.
코호트:
코호트 1A: 면역요법을 제외한 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인으로 IIIC기 또는 IV기 절제불가능 또는 MM을 갖는 환자에서 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료를 받거나 그 이후에 진행을 방사선 사진으로 기록했어야 한다.
코호트 2A: 면역요법을 제외한 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인으로 진행성, 재발성 또는 전이성 HNSCC(예를 들어, T1N1-N2B, T2-4N0-N2b기) 환자에서 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료를 받거나 그 이후에 진행을 방사선 사진으로 기록했어야 한다.
코호트 3A: 면역요법을 제외한 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인으로 국소진행성 또는 전이성(III기~IV기) NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료를 받거나 그 이후에 진행을 방사선 사진으로 기록했어야 한다.
코호트 3B: 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인의 일부로서 CPI(예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)로 이전에 전신 요법을 받은 III기 또는 IV기 NSCLC 환자에서 단일 제제로서의 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료를 받거나 그 이후에 진행을 방사선 사진으로 기록했어야 한다.
이용가능한 효과적인 표적 요법에 의한, 종양유전자-유도된 종양을 갖는 코호트 3A 및 3B(NSCLC)의 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았어야 한다.
모든 환자는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈으로 구성된 비골수절제 림프구고갈(NMA-LD) 전처치 레지멘에 선행되는, 자가 동결보존된 TIL 요법(코호트 할당에 따라, 펨브롤리주맙과 조합하거나 하지 않음)을 받았다. TIL 주입후, 최대 6개의 IV 인터류킨-2(IL-2) 용량이 투여되었다.
달리 명시되지 않는 한, 다음의 일반적인 연구 기간은 4개의 모든 코호트에서 소요되었다.
스크리닝 및 종양 절제: 연구 참가로부터 최대 4주(28일); TIL 제품의 제조: 종양 절제로부터 대략 ≤22일; 및 아래에 논의된 바와 같은, 치료 기간.
치료 기간(코호트 1A, 2A, 및 3A): NMA-LD(7 일), TIL 주입(1일)후 IL-2 투여(1 내지 4일)를 포함하여 최대 2년. 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 그것의 종양 절제를 완료한 후 NMA-LD 레지멘의 개시 전에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 받았다. 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 ≤ 2 년(24 개월) 동안 또는 질환이 진행되거나 허용될 수없는 독성이 발생할 때까지 Q3W ± 3일동안 지속될 것이다. 치료 종료(EOT) 방문은 펨브롤리주맙의 마지막 투여 후 30일 이내에 발생하였다. 적용가능한 경우 해당 방문은 평가 종료(EOA) 방문과 조합될 수 있다(예를 들어, 질환 진행 시 또는 새로운 항암 요법 시작 시 펨브롤리주맙 중단 발생).
치료 기간(코호트 3B): NMA-LD(7일), TIL, 주입(1일)후 IL-2 투여(1 내지 4일)를 포함하여 최대 12일. EOT 방문은 환자가 IL-2의 최종 투여를 받은 후 발생하였다. EOT 방문은 치료 중단 후 30일 이내에 수행되었으며, 평가 기간 동안 이 간격 내에 발생하는 임의의 계획된 방문과 조합될 수 있다.
평가 기간: 0 일차에 TIL 주입 후 시작되고, 새로운 항암 요법의 시작, 연구 평가에 대한 동의의 부분 철회 또는 5년(60개월) 중 먼저 발생한 시점과 함께 질환 진행 시 종료된다. 평가 종료(EOA) 방문은 환자가 질환 진행에 도달하거나 새로운 항암 요법을 개시하면 발생하였다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 TIL을 사용한 TIL자가 요법은 다음의 단계들로 구성되었다:
1. TIL 세포 제품의 공급원 역할을 하는 자가 조직을 제공하기 위한 종양 절제;
2. 중앙 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(GMP) 설비에서 생산된 TIL 제품;
3. 7-일 NMA-LD 전처치 레지멘;
4. 코호트 1A, 2A, 및 3A: 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 종양 절제를 완료한 후, NMA-LD 레지멘을 개시하기 전에 펨브롤리주맙을 단일 주입받았다. 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 Q3W ± 3일 동안 지속될 것이다.
5. 자가 TIL 제품의 주입(0일째); 및
6. 최대 6회 용량의 IV IL-2 투여.
코호트 1A, 2A, 및 3A에서, 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 ≤ 2 년(24 개월) 동안 또는 질환이 진행되거나 허용될 수없는 독성이 발생할 때까지 중 먼저 발생한 시점과 함께 Q3W ± 3일동안 지속될 것이다.
코호트 1A, 2A, 및 3A에 대한 순서도는 도 7에서 찾을 수 있다. 코호트 3B에 대한 순서도는 도 8에서 찾을 수 있다. 환자는 종양 징후에 의해 적절한 코호트로 할당되었다.
TIL 요법 + 펨브롤리주맙 (코호트 1A, 2A, 및 3A)
환자를 선별하고, 종양 절제를 위한 수술을 계획하였다. 그런 다음 환자는 하나 이상의 종양 병변을 절제받고, 이를 TIL 생산을 위해 중앙 제조 설비로 보냈다.
다음으로, NMA-LD 레지멘을 모방하고, -7일 및 -6일에 메스나(부위 표준 관리마다 또는 USPI/SmPC)와 함께 2일의 IV 사이클로포스파미드(60 mg/kg), 이어서 5일의 IV 플루다라빈(25 mg/m2: -5일부터 -1일)으로 구성되었다.
코호트 1A, 2A, 및 3A의 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 종양 절제를 완료한 후, 그리고 NMA-LD 레지멘을 개시하기 전에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 받았다. 600,000 IU/kg IV 용량의 IL-2 투여는 0일째에 TIL 주입이 완료된 후 3시간후 시작되지만, 늦어도 24시간 이내에 시작된다. 추가의 IL-2 투여는 최대 6회 투여 동안 대략 8 내지 12시간마다 주어질 것이다. 두 번째 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2의 완료 후보다 빠르지 않았다. 환자는 제2 펨브롤리주맙 투여 전에 모든 IL-2-관련된 독성(등급 ≤2)에서 회복되어야 한다. 펨브롤리주맙은 이후 ≤2년(24개월) 동안 또는 질환 진행 또는 허용될 수 없는 독성 중 먼저 발생한 시점까지 Q3W ± 3일 동안 지속될 것이다.
단일 제제로서의 TIL 요법(코호트 3B)
환자를 선별하고, 종양 절제를 위한 수술을 계획하였다. 그런 다음 환자는 하나 이상의 종양 병변을 절제받고, 이를 TIL 생산을 위해 중앙 제조 설비로 보냈다.
다음으로, NMA-LD 레지멘은 -7일 및 -6일에 메스나(부위 표준 관리마다 또는 USPI/SmPC)와 함께 2일의 IV 사이클로포스파미드(60 mg/kg), 이어서 5일의 IV 플루다라빈(25 mg/m2: -5일부터 -1일)으로 구성되었다.
종양-유래된 자가 TIL 제품의 주입은 플루다라빈의 마지막 투여 후 24시간 이내에 이루어졌다. 600,000 IU/kg IV 용량의 IL-2 투여는 TIL 주입 완료 후 3시간부터 24시간 이내에 시작되었을 수 있다.
추가의 IL-2 투여는 최대 6회 투여 동안 대략 8 내지 12시간마다 주어졌다.
종양 침윤 림프구의 생산 및 확장
TIL 자가 세포 생성물은 환자의 종양/병변으로부터 유래된 생존 세포독성 T 림프구로 구성되었으며, 이는 중앙 GMP 설비에서 생체외 제조되었다. 예를 들어, TIL 생산 공정을 도시하는 예시적인 흐름 선도가 도 9에 제공되어 있다.
TIL 제조 공정은 각각의 개별 환자에서 직경이 ≥1.5 cm인 1차 또는 2차 전이성 종양 병변(들)을 외과적으로 절제한 후 임상 부위에서 시작되었다. 다양한 해부상의 위치로부터의 다수의 종양 병변을 절제하여 종양 조직의 전체 응집체를 수집할 수 있지만; 그러나, 응집체는 이송 병에 존재하는 생물보존 매질의 제한된 양으로 인해 직경 4.0 cm 또는 무게 10 g을 초과해서는 안된다.
일단 종양 병변(들)이 생물보존 이송 병에 배치되면, 익스프레스 택배를 사용하여 중앙 GMP 제조 설비로 2℃ 내지 8℃에서 출하된다. 도착하자마자, 종양 시료(들)을 단편으로 절개한 다음, 인간 재조합 IL-2를 사용하여 약 11일 동안 사전-급속 확장 프로토콜(Pre-REP)에서 배양하였다.
그런 다음, 이들 pre-REP 세포를 IL-2, OKT3([무로모납-CD3]으로도 알려져 있는, 인간 CD3에 대한 뮤린 단클론성 항체)의 존재 하에 11일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 사용하여, 및 피더 세포로서 조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 추가로 확장하였다.
그 다음, 확장된 세포를 수확하고, 세척하고, 제형화하고, 동결보존하고, 익스프레스 택배를 통해 임상 현장으로 출하하였다. TIL 세포 제품의 투여 형태는 TIL이 유래된 환자에게 주입할 준비가 된 동결보존된 자가 "생세포 현탁액"이었다. 환자는 제품 사양에 따라 1 x 109 및 150 x 109개의 생존 세포를 함유하는, 제조 및 출시된 제품의 전체 용량을 주입받았다. 임상 경험에 따르면, 이 용량 범위에서 객관적인 종양 반응이 달성되었으며, 이는 또한 안전한 것으로 밝혀졌다(문헌[Radvanyi L.G., 등, Clin Cancer Res. 2012;18(24):6758-70]). 제품의 전체 용량은 최대 4개의 주입 백에 제공되었다.
TIL 세포 제품을 받을 환자의 준비
본 연구에서 사용된 NMA-LD 전처치 레지멘(즉, 사이클로포스파미드 플러스 메스나 2일, 이어서 플루다라빈 5일)은 미국 국립 암 연구소에 의해 개발되고 시험된 방법에 기반을 두고 있었다(문헌[Rosenberg S.A., 등, Clin Cancer Res. 2011;17(13):4550-7]; [Radvanyi L.G., 등, Clin Cancer Res. 2012;18(24):6758-70]; [Dudley M.E., 등, J Clin Oncol. 2008;26(32):5233-9]; [Pilon-Thomas S, 등, J Immunother. 2012;35(8):615-20]; [Dudley M.E., 등, J Clin Oncol. 2005;23(10):2346-57]; 및 [Dudley M.E., 등, Science. 2002;298(5594):850-4]). 7-일 전처치 레지멘 후, 환자에게 TIL 세포 제품을 주입하였다.
TIL 주입 후 8 내지 12시간마다 IV IL-2(600,000 IU/kg)를 투여하고, TIL 주입 완료 후 3 내지 24시간 사이에 첫 번째 용량을 투여하고, 최대 6회 투여 동안 지속하였다. 기관 표준에 따라, IL-2의 용량을 실제의 중량을 기준으로 계산할 수 있다.
환자 집단의 선택
코호트 1A:
환자는 절제불가능 MM(IIIC기 또는 IV기, 미국 암 합동위원회 [AJCC] 병기 시스템에 따라 조직학적으로 확인됨)의 확진 진단을 받았다. 안구 흑색종 환자는 배제되었다. 환자는 이전에 면역-종양학 표적화된 제제를 받은 적이 없어야 한다. BRAF-돌연변이 양성인 경우, 환자는 이전 BRAF/MEK표적 요법을 받았을 수 있다.
코호트 2A:
환자는 진행성, 재발성 및/또는 전이성 HNSCC를 가졌으며, 치료 경험이 없을 수 있으며; 병리학 보고서를 통해 원발성 종양의 조직학적 진단이 필요하다. 환자는 이전에 면역요법 레지멘을 받은 적이 없어야 한다.
코호트 3A:
환자는 III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)의 확진 진단을 받았다. 효과적인 표적 요법이 이용가능한 종양유전자-유도된 종양 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았다.
코호트 3B:
환자는 III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 선암종, 대세포 암종)의 확진 진단을 받았으며, 이전에 CPI(예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)로 전신 요법을 받았다. 효과적인 표적 요법이 이용가능한 종양유전자-유도된 종양 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았다.
모든 환자는 코호트 1A, 2A, 및 3A에 대한 면역요법을 배제하고, 최대 3회의 이전 전신 항암 요법(하기 포함 기준 참고)을 받았다. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 요법에 대해 또는 그 후에 방사선촬영으로 진행을 확인하였다.
포함 기준
환자는 연구 참여를 위해 하기 포함 기준을 모두 충족해야 한다.
1. 모든 환자는 그것의 각각의 조직학의 악성종양을 조직학적으로 또는 병리적으로 확진받았다:
o 절제불가능 또는 전이성 흑색종(코호트 1A)
o 두경부의 진행성, 재발성 또는 전이성 편평 세포 암종(코호트 2A)
o III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 비편평상피, 선암종, 대세포 암종)(코호트 3A 및 3B).
2. 코호트 1A, 2A, 및 3A 단독: 환자는 면역요법받은 적이 없다. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료를 받거나 그 이후에 진행하였다. 코호트 1A, 2A, 및 3A는 최대 3회의 이전 전신 항암 요법을 받았을 수 있으며, 구체적으로 하기와 같다:
o 코호트 1A에서: 절제불가능 또는 전이성 흑색종(IIIC기 또는 IV기)을 가진 환자; BRAF 돌연변이-양성인 경우, 환자는 BRAF 억제제를 받았을 수 있다.
o 코호트 2A에서: 절제불가능 또는 전이성 HNSCC 환자. 초기 화학-방사선요법을 받은 사람들은 허용되었다.
o 코호트 3A에서: III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 비편평상피, 선암종, 또는 대세포 암종)를 앓고 있고, 면역요법을 받은 적이 없고, 국소적으로 진행성 또는 전이성 환경에서 이전 전신 요법의 ≤3 라인 후 진행된 환자. 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 환경에서, 또는 최종적인 화학방사선요법의 일부로서, 전신 요법을 받은 환자는 적격이며, 이전 전신 요법 완료 후 12개월 이내에 질환이 진행된 경우, 요법의 한 라인을 받은 것으로 간주되었다. 표적화된 요법에 민감한 돌연변이를 갖는 알려진 종양유전자 동인(예를 들어, EGFR, ALK, ROS)이 있는 환자는 표적 요법의 적어도 1개의 라인후에 진행되어야 한다.
3. 코호트 3B 단독: III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 비편평상피, 선암종, 또는 대세포 암종) 환자는 전신 요법의 ≤ 3의 이전 라인의 일부로서 CPI(예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)와 함께 전신 요법을 이전에 받은 적이 있다.
o 환자는 가장 최근의 치료를 받거나 그 이후에 진행을 방사선 사진으로 기록하였다.
o 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 환경에서, 또는 최종적인 화학방사선요법의 일부로서, 전신 요법을 받은 환자는 적격이며, 이전 전신 요법 완료 후 12개월 이내에 질환이 진행된 경우, 요법의 한 라인을 받은 것으로 간주되었다.
o 표적화된 요법에 민감한 돌연변이를 갖는 알려진 종양유전자 동인(예를 들어, EGFR, ALK, ROS)이 있는 환자는 표적 요법의 적어도 1개의 라인후에 진행되어야 한다.
4. 환자는 TIL 연구용 제품 생산을 위해 절제 후 직경이 최소 1.5 cm인 적어도 1개의 절제가능 병변(또는 응집 병변)을 가졌다. 외과적 절제술이 환자에게 추가의 위험을 초래하지 않는한, 종양 조직은 다수의 다양한 전이성 병변에서 수득되는 것이 권장되었다.
o TIL 생성을 위한 절제를 고려한 병변이 이전에 조사된 영역내에 있는 경우, 절제 전에 방사선촬영 진행에서 병변이 입증되어야 한다.
o 환자는 프로토콜-필수 검사를 위한 적절한 조직병리 시료를 가지고 있어야 한다.
5. 환자는, TIL 제조를 위한 종양 절제 후, 표준 및 잘 알려진 RECIST 1.1 지침(예를 들어, 문헌[Eisenhauer, European Journal of Cancer 45:228-247 (2009)]을 참조하고, 또한 project.eortc.org/recist/wp-content/uploads/sites/4/2015/03/RECISTGuidelines.pdf의 월드 와이드 웹에서 이용가능함)에 정의된 대로 측정가능한 질환이 남아있었다:
o 이전에 조사된 부위의 병변은 해당 병변에서 질병의 진행이 입증된 경우가 아니면 표적 병변으로 선택되지 않았다;
o RECIST에 따라 여전히 측정가능한 TIL 생성을 위해 부분적으로 절제된 병변은 비표적 병변으로 선택될 수 있지만, 반응 평가를 위한 표적 병변으로 작용할 수 없었다.
6. 환자는 동의 당시 18세 이상이었다.
7. 환자는 0 또는 1의 미 동부 종양학협력그룹(ECOG) 성능 상태, 및 3개월 이상의 추정된 기대 수명을 가졌다.
8. 임신 가능성이 있는 환자 또는 임신 가능성이 있는 파트너가 있는 환자는 치료 기간 동안 승인된 매우 효과적인 피임 방법을 기꺼이 시행하고 모든 프로토콜-관련 치료를 받은 후 12 개월 동안 계속해야 한다(주석: 생식 가능성이 있는 여성은 치료 동안, 그리고 마지막 IL-2 투여 후 12개월, 또는 마지막 펨브롤리주맙 투여 후 4개월 동안(마지막 발생시) 효과적인 피임법을 사용하였다). 남성은 연구 기간 동안 또는 치료 중단 후 12 개월 동안 정자를 기증할 수 없었다(마지막 발생시).
9. 환자는 다음의 혈액성 파라미터를 가졌다:
o 절대적인 중성구 수(ANC) ≥1000/mm3;
o 헤모글로빈 ≥9.0 g/dL;
o 혈소판 수 ≥100,000/mm3.
10. 환자는 적절한 기관 기능을 가졌다:
o 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)/혈청 글루탐산-피루브산 아미노전이효소(SGPT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)/SGOT가 정상인 상한치 (ULN)의 3배 이하, 간 전이가 ULN의 5배 이하인 환자.
o 스크리닝시 Cockcroft Gault 식을 사용하여, 추정된 크레아티닌 청소능 ≥40 mL/분.
o 총 빌리루빈 ≤2 mg/dL.
o 길버트 증후군 환자는 3 mg/dL 이하의 총 빌리루빈을 가져야 한다.
11. 환자는 인간 면역결핍 바이러스(HIV1 및 HIV2)에 대해 혈청검사 음성이었다. 급성 또는 만성 감염을 나타내는, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), 간염 B 코어 항체(항 HBc), 또는 간염 C 바이러스(항-HCV)에 대해 양성 혈청학을 가진 환자는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 기반한 바이러스 부하 및 특정 바이러스 노출의 국소 유병률에 따라 등록되었다.
12. 환자는 제1 연구 치료(즉, NMA-LD 또는 펨브롤리주맙 시작) 이전에 하기 상세히 설명된 바와 같이, 최소 지속기간의 이전 항암 요법(들)으로부터의 휴약 기간을 가졌다:
o 표적 요법: 표피 성장 인자 수용체(EGFR), MEK, BRAF, ALK, ROS1 또는 다른-표적화된 제제(예를 들어, 에를로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 오시머티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 로라티닙)를 사용한 사전 표적 요법은 치료 시작 전 최소 14일전에 세정을 제공하는 경우 허용하였다.
o 화학요법: 아쥬반트, 네오아쥬반트 또는 최종적인 화학요법/화학방사선은 치료 시작 전 최소 21일 전에 세정을 제공하는 경우 허용하였다.
o 코호트 3B만을 위한 면역 요법, 항-PD-1, 다른 mAbs, 또는 백신을 사용한 이전 체크포인트-표적 요법은 NMA-LD 시작 전 21일 이상의 휴약 기간으로 허용되었다.
o 고식적 방사선 요법: 탈모증, 피부 색소침착 변화, 또는 다른 임상적으로 무의미한 이벤트, 예를 들어, 소면적 방사선 피부염 또는 대변절박이나 요절박을 제외하고, 모든 방사선-관련된 독성이 1등급 또는 기준선으로 해결된 경우, 사전 외부빔 방사선이 허용되었다.
o RECIST 1.1을 통해 반응 표적으로 평가되는 종양 병변(들)은 방사선 관문 외부에 있었지만; 관문내에 있는 경우, 이들은 진행상황을 입증해야 한다(상기 포함 기준 참고).
o 수술/사전-계획된 절차: 종양 절제 전에 상처 치유가 발생하고 모든 합병증이 해결되었으며, (주요 수술 절차의 경우) 적어도 14일이 경과한 경우 이전 수술 과정(들)이 허용되었다.
13. 환자는 코호트 할당 전에 탈모증 또는 백반증을 제외하고 모든 이전 항암 치료-관련된 유해 사례(TRAE)에서 1 등급 이하(유해 사례에 대한 공통 용어 기준[CTCAE])로 회복되었다.
14. 이전 항암 요법으로부터 안정된 2 등급 이상의 독성을 가진 환자는 의료 모니터와 상담한 후 사례별로 고려되었다.
15. 펨브롤리주맙 치료에 의해 악화될 것으로 상당히 예상되지 않는 비가역 독성을 가진 코호트 1A, 2A, 및 3A 환자는 의료 모니터와 상담한 후에만 포함되었다. 코호트 3B의 환자에 한해, 면역 체크포인트 억제제 CPI(들)를 사용한 이전 치료의 결과로 2등급 이상의 설사 또는 결장염이 문서로 기록된 환자는 적어도 6개월 동안 무증상이거나, 종양 절제 전의 치료 후에 시각적 평가 결장경검사에서 정상이어야 한다.
16. 환자는 보호된 건강 정보의 사용 및 개시에 대한 서면 승인을 제공해야 한다.
제외 기준
다음의 기준 중 하나를 충족하는 환자는 연구에서 배제되었다:
1. 포도막/안구 기원의 흑색종 환자
2. 지난 20년 이내에 비골수절제 또는 골수절제 화학요법 레지멘을 포함하는 기관 동종이식편 또는 이전 세포 전이 요법을 받은 환자. (주석: 이 기준은 그것의 이전의 TIL 치료와 함께 이전에 NMA-LD 레지멘을 받은 경우를 제외하고, TIL로 재치료 중인 환자에게 적용가능하다.)
3. 증상이 있고/있거나 치료되지 않은 뇌 전이를 갖는 환자.
o ㆍ 뇌 전이가 명확하게-치료된 환자는 의료 모니터와의 논의 후 등록이 고려될 것이며; 치료 시작 전 환자가 2주 이상 동안 임상적으로 안정하다면, 자기 공명 영상 (MRI) 후처리를 통해 새로운 뇌 병변이 없으며, 환자는 진행 중인 코르티코스테로이드 치료가 필요하지 않다.
4. 등록 후 21일 이내에 전신 스테로이드 요법을 받고 있는 환자.
5. 임신 중이거나 모유 수유 중인 환자.
6. 연구원의 의견에 따라 연구 참여에 대한 위험이 증가한 활성 의료 질병; 예컨대 전신 감염(예를 들어, 매독 또는 항생제가 필요한 임의의 다른 감염), 응고 장애, 또는 심혈관, 호흡, 또는 면역계의 다른 활성 주요 의료 질병을 앓고 있는 환자.
7. 환자는 활성 또는 사전에 문서로 기록된 자가면역 또는 염증성 장애(폐렴, 염증성 장 질환 [예를 들어, 결장염 또는 크론병], 게실염 [게실증 예외], 전신 홍반성 낭창, 유육종증 증후군, 또는 베게너 증후군 [다발성맥관염을 동반한 육아종증, 그레이브스병, 류마티스성 관절염, 뇌하수체염, 포도막염, 등] 포함)을 가질 수 없다. 다음은 이 기준에 대한 예외이다.
o 백반증 또는 탈모증 환자.
o 호르몬 대체 시 갑상선기능저하증(예를 들어, 하시모토 증후군 이후)이 안정한 환자.
o 전신 요법이 필요하지 않은 임의의 만성 피부 병태.
o 식이요법만으로 제어되는 소아지방변증 환자.
8. 치료 시작 전 28일 이내에 생 또는 약독화된 백신접종을 받은 환자.
9. 임의의 형태의 1차 면역결핍(예컨대 중증 복합성 면역결핍 질환 [SCID] 및 획득된 면역 결핍 증후군 [AIDS])이 있는 환자.
10. 연구 약물의 임의의 구성요소에 대해 과민증 이력을 갖는 환자. 비제한적으로 임의의 하기를 포함하는, TIL 생성물 제형의 임의의 구성요소에 대해 알려진 과민증을 갖는 환자에게는 TIL이 투여되지 않았다:
o ㆍ NMA-LD(사이클로포스파미드, 메스나, 및 플루다라빈)
o ㆍ 프롤류킨®, 알데스류킨, IL-2
o ㆍ 아미노글리코시드 그룹의 항생제(즉, 스트렙토마이신, 겐타마이신 [겐타마이신 과민증에 대한 피부-테스트 음성인 사람 제외])
o ㆍ 디메틸 설폭사이드 [DMSO], HSA, IL-2, 및 덱스트란-40을 포함하는 TIL 생성물 제형의 임의의 구성요소
o ㆍ 펨브롤리주맙
11. 좌심실 박출률(LVEF)이 45% 미만이거나, 뉴욕 심장 협회 부류 II 이상인 환자. 60 세 이상의 임의의 환자 또는 허혈성 심장 질환, 흉통 또는 임상적으로 심각한 심방 및/또는 심실 부정맥의 병력이 있는 환자에서 임의의 비가역적인 벽 운동 비정상을 입증하는 심장 스트레스 테스트.
o 비정상 심장 스트레스 테스트를 받은 환자는, 후원자의 의료 모니터의 승인을 받아, 적절한 박출률 및 심장학 청소능을 가진다면 등록될 수 있다.
12. 폐쇄성 또는 제한적 폐 질환이 있고, 문서로 기록된 FEV1(1초에 강제된 호기량)이 예상된 정상의 60% 이하인, 환자.
o ㆍ 환자가 비정상 상부 기도 해부학(즉, 기관절개술)으로 인해 신뢰할 수 있는 폐활량 측정을 수행할 수 없는 경우, 6-분 걷기 테스트를 사용하여 폐 기능을 평가하였다. 연령과 성별에 대해 예상된 적어도 80%의 거리를 걸을 수 없거나 테스트 중 임의의 시점에서 저산소증의 증거를 보이는 환자(SpO2 <90%)는 배제된다.
13. 지난 3 년 이내에 또 다른 원발성 악성 종양이 있었던 환자(치료가 필요하지 않거나 1년 이상 전에 치유 치료를 받았거나, 연구원의 판단에 따라 비-흑색종 피부암, DCIS, LCIS, 전립선암 글리슨(Gleason) 점수 ≤6 또는 방광암을 포함하는, 심각한 재발 위험이 없었던 환자는 제외함).
14. 치료 개시 후 21일 이내에 연구용 제품에 대한 또 다른 임상 연구에 참여.
연구 평가변수 및 계획된 분석
1차 및 2차 평가변수는 코호트에 의해 별도로 분석하였다.
1차 평가변수:
ORR은 효능 분석 세트 중 RECIST 1.1 당 연구원에 의해 평가된 최상의 반응으로 확인된 PR 또는 CR을 달성한 환자의 비율로 정의되었다.
객관적인 반응을 각각의 질환 평가에 대해 평가하고, ORR을 상응하는 양측 90% CI와 함께 이항 비율로 표현하였다. 각각의 코호트에 대한 주 분석은 평가 기간에서 조기에 진행/만료 또는 중단되지 않는 한, 코호트 당 치료받은 모든 환자가 12개월 동안 추적할 기회를 가질 때 발생하였다.
안전성 1차 평가변수는 상응하는 양측 90% CI와 함께 이항 비율로 표현된 각각의 코호트 내에서 임의의 3등급 이상의 TEAE 발병률에 의해 측정되었다.
2차 평가변수:
효능:
2차 효능 평가변수는 아래와 같이 정의되었다:
연구원에 의해 평가된 바와 같이 확인된 CR을 달성한 반응군에 기반한 CR 비율. DCR은 확인된 PR/CR 또는 지속된 SD(적어도 6주)를 달성한 환자 수의 합계를 효능 분석 세트의 환자 수 × 100%로 나눈 값이다. CR 비율과 DCR은 점추정 및 그것의 양측 90% CI를 사용하여 요약되었다.
DOR은 객관적인 반응을 달성한 환자들 사이에서 정의되었다. 재발성 또는 진행성 질환이 객관적으로 문서화되거나, 또는 후속 항암 요법을 받거나 환자가 사망한 첫번째 날(둘 중 처음 기록된 날짜)까지 최초 반응(PR/CR) 기준을 충족하는 것으로 측정되었다. PD를 경험하지 않았거나 데이터 컷 시간 또는 최종 데이터베이스 잠금 이전에 사망하지 않은 환자는 종양 상태에 대한 적절한 평가가 이루어진 마지막 날짜에 이벤트 시간을 검열받을 것이다.
PFS는 림프구고갈 시점으로부터 PD, 또는 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간(개월 단위) 중 더 이른 시간으로 정의되었다. PD를 경험하지 않았거나 데이터 컷 시간 또는 최종 데이터베이스 잠금 이전에 사망하지 않은 환자는 종양 상태에 대한 적절한 평가가 이루어진 마지막 날짜에 이벤트 시간을 검열받았다.
OS는 림프구고갈 시점으로부터 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간(개월 단위)으로 정의되었다. 데이터 컷 시간 또는 최종 데이터베이스 잠금 이전에 사망하지 않은 환자는 그것의 알려진 생존 상태의 마지막 날짜에 이벤트 시간을 검열받았다.
DOR, PFS, 및 OS는 우측 중도절단을 거쳤다. 카플란-마이어 방법을 사용하여 시간-대-이벤트(time-to-event) 효능 평가변수를 요약할 것이다. 종양 평가에 대한 기준선 데이터는 모든 코호트에 대한 림프구고갈 이전의 마지막 스캔이었다.
상기 효능 파라미터는 기준선 질환 특성; BRAF 상태(코호트 1A 단독), HPV 상태(코호트 2A 단독), 편평상피 또는 비-편평상피 폐 질환(코호트 3A 및 3B 단독), 및 항-PD-L1 상태에 의해 정의된 하위세트에 대한 적용가능한 코호트에 대해 추정될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Iovance Biotherapeutics, Inc.
Fardis, Maria
Natarajan, Arvind
<120> TREATMENT OF NSCLC PATIENTS REFRACTORY FOR ANTI-PD-1 ANTIBODY
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<150> US 62/725,976
<151> 2018-08-31
<150> US 62/726,919
<151> 2018-09-04
<160> 176
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Muromonab heavy chain
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Muromonab light chain
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
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Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
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Asn Arg Asn Glu Cys
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<220>
<223> recombinant human IL-2 (rhIL-2)
<400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Aldesleukin
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Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
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Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant human IL-4 (rhIL-4)
<400> 5
Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp
20 25 30
Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg
35 40 45
Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu
65 70 75 80
Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly
85 90 95
Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
100 105 110
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
115 120 125
Ser Ser
130
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<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant human IL-7 (rhIL-7)
<400> 6
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
50 55 60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
85 90 95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
115 120 125
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Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
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<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 7
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant human IL-21 (rhIL-21)
<400> 8
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser
130
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<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human 4-1BB, Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9
(Homo sapiens)
<400> 9
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 10
<211> 256
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> murine 4-1BB, Tumor necrosis factor receptor superfamily, member
9 (Mus musculus)
<400> 10
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
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Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
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Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
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Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
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Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
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Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain for utomilumab
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
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Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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<220>
<223> Fc domain
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<220>
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<220>
<223> linker
<400> 44
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 45
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 46
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
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195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 47
<211> 168
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BBL soluble domain
<400> 47
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
20 25 30
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
35 40 45
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
50 55 60
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
85 90 95
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
100 105 110
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
115 120 125
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
145 150 155 160
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165
<210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable heavy chain for 4B4-1-1 version 1
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable light chain for 4B4-1-1 version 1
<400> 49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable heavy chain for 4B4-1-1 version 2
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable light chain for 4B4-1-1 version 2
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable heavy chain for H39E3-2
<400> 52
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr
115 120
<210> 53
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable light chain for H39E3-2
<400> 53
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105
<210> 54
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human OX40 (Homo sapiens)
<400> 54
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 55
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> murine OX40 (Mus musculus)
<400> 55
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 56
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain for tavolixizumab
<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain for tavolixizumab
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region for tavolixizumab
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region for tavolixizumab
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR1 for tavolixizumab
<400> 60
Gly Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR2 for tavolixizumab
<400> 61
Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His
1 5 10
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 for tavolixizumab
<400> 62
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR1 for tavolixizumab
<400> 63
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR2 for tavolixizumab
<400> 64
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 for tavolixizumab
<400> 65
Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
1 5
<210> 66
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain for 11D4
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain for 11D4
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 68
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region for 11D4
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region for 11D4
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR1 for 11D4
<400> 70
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR2 for 11D4
<400> 71
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 for 11D4
<400> 72
Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR1 for 11D4
<400> 73
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR2 for 11D4
<400> 74
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 for 11D4
<400> 75
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 76
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain for 18D8
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 77
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain for 18D8
<400> 77
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 78
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region for 18D8
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region for 18D8
<400> 79
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR1 for 18D8
<400> 80
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR2 for 18D8
<400> 81
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 for 18D8
<400> 82
Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR1 for 18D8
<400> 83
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR2 for 18D8
<400> 84
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 for 18D8
<400> 85
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
1 5
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region for Hu119-122
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region for Hu119-122
<400> 87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDRl for Hu119-122
<400> 88
Ser His Asp Met Ser
1 5
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR2 for Hu119-122
<400> 89
Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 for Hu119-122
<400> 90
His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR1 for Hu119-122
<400> 91
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR2 for Hu119-122
<400> 92
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 for Hu119-122
<400> 93
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region for Hu106-222
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region for Hu106-222
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR1 for Hu106-222
<400> 96
Asp Tyr Ser Met His
1 5
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR2 for Hu106-222
<400> 97
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 for Hu106-222
<400> 98
Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR1 for Hu106-222
<400> 99
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR2 for Hu106-222
<400> 100
Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 for Hu106-222
<400> 101
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 102
<211> 183
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OX40L
<400> 102
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 103
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OX40L soluble domain
<400> 103
Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu
1 5 10 15
Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu
20 25 30
Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe
35 40 45
Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser
50 55 60
Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys
85 90 95
Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His
100 105 110
Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe
115 120 125
Cys Val Leu
130
<210> 104
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OX40L soluble domain (alternative)
<400> 104
Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys
20 25 30
Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile
35 40 45
Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
50 55 60
Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val
65 70 75 80
Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu
85 90 95
Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly
100 105 110
Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
115 120 125
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable heavy chain for 008
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable light chain for 008
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable heavy chain for 011
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Asp Arg Tyr Phe Arg Gln Gln Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 108
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable light chain for 011
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable heavy chain for 021
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ile Thr Leu Pro Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 110
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable light chain for 021
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Lys Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable heavy chain for 023
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 112
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variable light chain for 023
<400> 112
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region
<400> 113
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region
<400> 115
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 116
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of humanized antibody
<400> 117
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of humanized antibody
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of humanized antibody
<400> 119
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of humanized antibody
<400> 120
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 121
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of humanized antibody
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of humanized antibody
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of humanized antibody
<400> 123
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 124
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of humanized antibody
<400> 124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 125
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region
<400> 125
Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 126
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region
<400> 126
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
100 105 110
Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 127
<211> 440
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab heavy chain
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 128
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab light chain
<400> 128
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 129
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab variable heavy chain
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab variable light chain
<400> 130
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab heavy chain CDR1
<400> 131
Asn Ser Gly Met His
1 5
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab heavy chain CDR2
<400> 132
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 133
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab heavy chain CDR3
<400> 133
Asn Asp Asp Tyr
1
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab light chain CDR1
<400> 134
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab light chain CDR2
<400> 135
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nivolumab light chain CDR3
<400> 136
Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 137
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pembrolizumab heavy chain
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 138
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pembrolizumab light chain
<400> 138
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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<220>
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65 70 75 80
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195 200 205
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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290 295 300
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 216
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> avelumab light chain CDR1
<400> 164
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> avelumab light chain CDR2
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<210> 166
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<212> PRT
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<220>
<223> avelumab light chain CDR3
<400> 166
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1 5 10
<210> 167
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab heavy chain
<400> 167
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab light chain
<400> 168
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 169
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab variable heavy chain
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 170
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab variable light chain
<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab heavy chain CDR1
<400> 171
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 172
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab heavy chain CDR2
<400> 172
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab heavy chain CDR3
<400> 173
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab light chain CDR1
<400> 174
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab light chain CDR2
<400> 175
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atezolizumab light chain CDR3
<400> 176
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
Claims (124)
- 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법으로서,
(a) 다수의 종양 단편 또는 생검을 비롯하여 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 환자의 NSCLC 종양으로부터의 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 다른 수단으로부터 TIL의 제1 집단을 얻고/얻거나 수용하는 단계;
(c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
(d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는, 단계;
(e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 단계;
(f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
(g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 NSCLC 환자에게 투여하는 단계를 포함하고;
상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 TIL의 제1 집단을 수득하는 것은 다병변 샘플링 방법을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이전에 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 항체로 치료(treat)되었던, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았던, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었던, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환(bulky disease)을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제14항 내지 제17항에 있어서, 20 mm 이상의 단축 직경을 갖는 횡방향 또는 관상 평면 또는 팽윤된 림프절에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타나는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트(neo-adjuvant) 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전(prior) 전신 치료 과정에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14; 및 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 급속 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에서 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 IL-2 레지멘은 허용 범위(tolerance)까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입(bolus intravenous infusion)으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 레지멘인, 방법.
- 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법으로서,
(a) 환자로부터 하나 이상의 종양을 절제하는 단계로서, 하나 이상의 종양은 TIL의 제1 집단을 포함하는, 단계;
(b) 상기 하나 이상의 종양을 종양 단편으로 단편화하는 단계;
(c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
(d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는, 단계;
(e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 얻는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 단계;
(f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
(g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 NSCLC 환자에게 투여하는 단계를 포함하고;
상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성인, 방법. - 제42항에 있어서, 상기 종양은 하나 이상의 종양 부위에서 절제되는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이전에 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 항체로 치료되었던, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았던, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었던, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
- 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 20 mm 이상의 단축 직경을 갖는 횡방향 또는 관상 평면 또는 팽윤된 림프절에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타나는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14; 및 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제42항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제42항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제42항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 급속 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제42항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
- 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에서 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
- 제42항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제42항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제42항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
- 제42항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
- 제42항 내지 제78 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제42항 내지 제80 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제81항에 있어서, 상기 IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 레지멘인, 방법.
- 비-소세포 폐 암종(NSCLC)을 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 암은 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이고, 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)을 투여하고, 하기의 단계들을 포함하는, 방법:
(a) 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 종양을 다수의 종양 단편으로 가공함으로써 대상체에서 절제된 하나 이상의 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하고/수득하거나 수용하는 단계;
(b) 상기 종양 단편을 폐쇄 시스템에 추가하는 단계;
(c) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단을 배양함으로써 상기 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제1 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제1 기체 투과성 표면적을 제공하고, 상기 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 얻고, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 TIL의 제1 집단보다 적어도 50-배 초과이고, 그리고 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여, TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행하여 TIL의 제3 집단을 얻고, 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 제2 집단에 비해 효과기 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 하위집단을 포함하는 TIL의 치료 집단이고, 상기 제2 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제2 기체 투과성 표면적을 제공하고, 그리고 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계; 및
(f) 단계 (e)로부터의 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이동시키는 단계로서, 단계 (e)로부터 (f)로의 이동은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계;
(g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서의 주입 백으로부터의 TIL의 제3 집단의 치료 효과적인 투여량을 상기 대상체에게 투여하는 단계. - 제83항에 있어서, 상기 종양 샘플은 다병변 샘플링 방법으로부터 유래되는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었던, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았던, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었던, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
- 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
- 제96항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 20 mm 이상의 단축 직경을 갖는 횡방향 또는 관상 평면 또는 팽윤된 림프절에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과인 큰 부피의 질환이 나타나는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14; 및 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
- 제83항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제83항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제83항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 약 3 내지 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 제2 확장은 약 7 내지 11일의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제83항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되고 급속 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
- 제83항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
- 제83항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에서 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
- 제83항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제83항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제83항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
- 제83항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
- 제83항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제121항에 있어서, 상기 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제83항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 레지멘인, 방법.
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