KR20210038884A - 신장 장애 치료에 사용하기 위한 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신장 장애, 특히, 만성 신장 질환, 사구체 질환 또는 단백뇨성 신장 질환, 가령, 알포트 증후군, 국소 분절 사구체경화증, 및 당뇨병성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 ABCA1 유도제 화합물에 관한 것이다.

Description

신장 장애 치료에 사용하기 위한 화합물
본 발명은 신장 장애, 특히, 만성 신장 질환, 사구체 질환 또는 단백뇨성 신장 질환, 가령, 알포트 증후군, 국소 분절 사구체경화증, 및 당뇨병성 신장 질환 치료에 사용하기 위한 ABCA1 유도제 화합물에 관한 것이다.
투석이나 신장 이식이 필요한 말기 신장 질환 (ESRD)으로 이어지는 만성 신장 질환 (CKD)은 전세계적으로 수백만 명의 환자에게 영향을 미치는 증가하는 유행병이다 (Bello AK et al, JAMA, 317: 1864, 2017). 당뇨병은 여전히 전세계적으로 ESRD의 가장 흔한 원인이지만 고혈압, 낭포성 신장 질환 및 사구체신염과 같은 다른 원인도 널리 퍼진 ESRD의 상당 부분에 원인이 된다 (USRDS 데이터베이스). 이러한 장애의 대부분은 경증 단백뇨에서 중증 신증 범위 단백뇨에 이르기까지 다양한 단백뇨와 함께 나타날 수 있으며, 심각한 단백뇨는 ESRD 진행의 주요 위험 요소를 나타낸다. 신장 대체 전략은 환자 사망률을 개선하지만 현재의 치료 전략은 CKD의 진행을 늦추기는 하지만 중단시키지는 않는다. 여러 중재시술 연구들은 효과를 입증하지 못했다. 이것은 지금까지 테스트된 많은 중재시술들이 초기 발병 과정이 아닌 신장 질환의 후기 단계를 표적으로 한다는 사실로 인한 것이다.
현재, 본 발명의 치료 전략들은 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 및 안지오텐신-수용체 차단제 (ARB)를 사용하는 것으로 구성되는데, 이들은 단백뇨를 줄이고 사구체경화증의 진행을 늦추는데 도움을 준다. 지금까지 단백뇨성 신장 질환 환자는 베나제프릴, 실라자프릴, 에날라프릴 (바소텍), 포시노프릴 (모노프릴), 리시노프릴 (제스트릴, 프리니빌), 페리노프릴, 라미프릴, 퀴나프릴 (아큐프릴), 트란돌라프릴을 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 ACE 억제제로 치료되어 왔으며 및 ARB는 칸데사르탄 (아타칸드), 에프레사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄 (코자르), 텔미사르탄, 발사르탄을 포함한다. FSGS에서 단백뇨 치료를 위해 승인된 유일한 약물은 ACTHar이다. 다른 면역억제제의 많은 오프 라벨 사용은 FSGS와 같은 여러 단백뇨성 신장 질환에서도 시행된 바 있다. 여기에는 프레드니손 (또는 일반적으로 스테로이드), 리툭시맙, 칼시뉴린 억제제 (사이클로스포린 및 타크롤리무스), 라파마이신, 아바타셉트, 마이코페놀레이트 모페틸이 포함된다. 코엔자임 Q10, 피쉬 오일, 비타민 D 유도체, 글루텐 프리 식단, 알로푸리놀, 스피로놀락톤, LDL 분리, 혈장교환술과 같은 다른 전략이 활용되고 있다.
그러나 이러한 치료법 중 상당수는 일련의 사례를 기반으로 하고 무작위 연구에 의해 뒷받침되지 않으며 종종 심각한 부작용이 수반되고 특정 병원성 메커니즘을 표적으로 하도록 설계되지 않았다. 또한 이러한 치료에 대한 반응은 예측할 수 없다. 따라서 현재 사용되는 약물은 안전하고 효과적인 치료를 제공하지 못한다. 보다 구체적으로, 사구체장애, 보다 광범위하게는 만성 신장 질환을 앓고 있는 환자의 예방 또는 치료를 위한, 새로운 약제에 대하여 오랜 시간 동안 충족되지 않은 필요성이 존재한다.
본 발명자들은 만성 신장 질환, 특히, 일차 사구체 질환, 가령, 알포트 증후군 및 FSGS 및 이차 사구체 질환, 가령, 당뇨병성 신장 질환 (DKD) 환자들을 치료하기 위한 새로운 치료 전략들을 추가로 연구하였다. 이들은 일부 피리딘 카르복스아미드 화합물들이 이러한 신장 질환의 치료에 있어서 매우 유망한 효과를 가짐을 보여주었다.
피리딘 카르복스아미드는 ATP-결합 카세트 수송체 A1 단백질의 소분자 유도제 (ABCA1 유도제)로 기재된 바 있다. 이러한 피리딘 카르복스아미드는 예를 들면 국제 특허 출원 공개 공보 제 WO 2011/029827, WO 2012/032018, WO 2013/037703 및 WO 2014180741에 기재되어 있다.
결과적으로, 본 발명은 신장 질환 치료에 사용하기 위한 화합물에 관한 것으로, 이 때 상기 화합물은 ABCA1 유도제 화합물이다.
한 특정 구체예에서, 이러한 ABCA1 유도제 화합물은 하기 화학식 (I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 나타내어진다:
Figure pct00001
상기 식에서,
A1 및 A2 중 하나는 N이고, A1 및 A2 중 다른 하나는 CH이고;
R1은 C1-7-알킬, C3-7-사이클로알킬, C3-7-사이클로알킬-C1-7-알킬, C1-7-알콕시-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알킬,헤테로사이클릴-C1-7-알킬 (이 때 헤테로사이클릴 기는 치환되지 않거나 옥소로 치환됨), 및 헤테로아릴-C1-7-알킬 (이 때 헤테로아릴 기는 치환되지 않거나 저급 알킬로 일- 또는 이-치환됨)로 구성된 군에서 선택되며;
R2 및 R6은 서로 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
R3 및 R5는 서로 독립적으로 수소, C1-7-알킬, C1-7-알콕시, 할로겐, 할로겐-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알콕시 및 시아노로 구성된 군에서 선택되고;
R4는 수소, C1-7-알킬, C1-7-알콕시, 할로겐, 할로겐-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알콕시, 아미노 및 시아노로 구성된 군에서 선택되고;
R7은 C1-7-알킬, C3-7-사이클로알킬 (상기 사이클로알킬은 치환되지 않거나 하이드록시로 치환됨), 헤테로사이클릴 (상기 헤테로사이클릴은 N, O 및 S에서 선택된 1, 2 또는 3개 헤테로원자를 포함하는 3 내지 7개 고리 원자들을 가지며, 치환되지 않거나 하이드록시 또는 옥소로 치환됨), 페닐 (이 때 페닐은 치환되지 않거나 C1-7-알킬, 하이드록시, C1-7-알콕시, 시아노, 할로겐 및 할로겐-C1-7-알킬로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개 기로 치환됨), 및 헤테로아릴 (이 때 헤테로아릴은 치환되지 않거나 C1-7-알킬, 하이드록시, C1-7-알콕시, 시아노, 할로겐 및 할로겐-C1-7-알킬로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개 기로 치환됨)로 구성된 군에서 선택되고;
G는 -(CH2)m- (이 때 m은 0 또는 1에서 선택됨), 및 -NR8- (이 때 R8은 수소 또는 C1-7-알킬임)로 구성된 군에서 선택된다.
특정 구체예들에서, G는 결합이고 R7은 C3-7-사이클로알킬이며, 상기 사이클로알킬은 치환되지 않거나 하이드록시로 치환된다.
전술한 구체예들과 조합될 수 있는 특정 구체예들에서, R7은 하이드록시로 치환된 사이클로헥실이다.
전술한 구체예들과 조합될 수 있는 특정 구체예들에서, R2 및 R6은 각각 수소이고, R4는 할로겐이고, R3 및 R5 중 하나는 할로겐이고, R3 및 R5 중 다른 하나는 수소이다.
전술한 구체예들과 조합될 수 있는 특정 구체예들에서, R1은 할로겐-C1-7-알킬이다. 통상적으로, R1은 -CF3, -CHF2, -CH2Cl, -CH2CF3, -CH(CF3)2, -CF2-CF3에서 선택될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 ABCA1 유도제 화합물은 6-(3,4-디클로로페닐)-N-[(1R,2R)-2-하이드록시사이클로헥실]-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-2-카르복스아미드이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 ABCA1 유도제 화합물은 5-(3,4-디클로로-페닐)-N-((1R,2R)-2-하이드록시-사이클로헥실)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코틴아미드이다.
전술한 구체예들과 조합될 수 있는 특정 구체예들에서, ABCA1 유도제 화합물은 만성 신장 질환, 일차 및 이차 사구체 질환 또는 단백뇨 질환의 치료에 유용하다. 통상적으로, 이러한 ABCA1 유도제 화합물은 알포트 증후군, 국소 분절 사구체경화증, 또는 당뇨병성 신장 질환의 치료에 사용될 수 있다.
전술한 구체예들과 조합될 수 있는 특정 구체예들에서, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 ABCA1 유도제 화합물은 경구 투여용으로 제형화된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 ABCA1 유도제 화합물은 국소, 비강내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 유리체내, 척수강내 또는 경피 투여용으로 제형화된다.
본 발명은 또한 상기 정의된 ABCA1 유도제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 질환 치료를 필요로 하는 개체의 신장 질환 치료 방법에 관한 것이다.
이러한 방법의 특정 구체예들에서, 상기 ABCA1 유도제는 치료적 유효량의 또 다른 물질, 예를 들면, 안지오텐신-전환 효소 억제제 또는 안지오텐신-수용체 차단제와 복합하여 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 ABCA1 유도제 화합물이 신장 질환, 특히, 사구체 질환, 가령, 알포트 증후군 또는 국소 분절 사구체경화증 또는 기타 만성 신장 질환, 가령, 당뇨병성 신장 질환의 치료에 매우 유망한 효과를 가짐을 보여주었다. 이 화합물은 이들 장애에서 단백뇨를 감소시킬 뿐만 아니라 신장 기능을 개선하고 말기 신장 질환의 발병을 예방한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 ABCA1 유도제 화합물
본원에서 사용되는 용어, "ABCA1 유도제 화합물"은 ATP-결합 카세트 수송체 단백질 (ABCA1)의 발현 수준 또는 활성을 간접적으로 또는 직접적으로 유도할 수 있는 화합물을 지칭한다. 이러한 수송체 ABCA1은 세포 콜레스테롤과 인지질 항상성의 주요 조절자로 알려져 있다. 특히, ABCA1은 지질이 부족한 아포지단백질 (apo-A1 및 apoE)에 대한 콜레스테롤과 인지질의 유출을 매개하여 초기 고밀도 지단백질 (HDL)을 형성한다. 세포에서 ABCA1 단백질의 상향조절을 결정하기 위한 시험관내 분석은 예를 들어 WO2012/031817에 설명되어 있다. 이들 시험관내 분석은 WO2012/031817에 기재된 바와 같은 형광 apo-A1 결합 분석 또는 콜레스테롤 유출 분석을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
피리딘 카르복스아미드는 ATP-결합 카세트 수송체 A1 단백질의 소분자 유도제 (ABCA1 유도제)로 기재된 바 있다. 이러한 피리딘 카르복스아미드는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 공보 제 WO 2011/029827, WO 2012/032018, WO 2013/037703 및 WO 2014/180741에 기재되어 있다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 화학식 (I)의 ABCA1 유도제 화합물 또는이의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00002
상기 식에서,
A1 및 A2 중 하나는 N이고, A1 및 A2 중 다른 하나는 CH이고;
R1은 C1-7-알킬, C3-7-사이클로알킬, C3-7-사이클로알킬-C1-7-알킬, C1-7-알콕시-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알킬, 헤테로사이클릴-C1-7-알킬 (이 때 헤테로사이클릴 기는 치환되지 않거나 옥소로 치환됨), 및 헤테로아릴-C1-7-알킬 (이 때 헤테로아릴 기는 치환되지 않거나 저급 알킬로 일- 또는 이-치환됨)로 구성된 군에서 선택되며;
R2 및 R6은 서로 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
R3 및 R5는 서로 독립적으로 수소, C1-7-알킬, C1-7-알콕시, 할로겐, 할로겐-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알콕시 및 시아노로 구성된 군에서 선택되고;
R4는 수소, C1-7-알킬, C1-7-알콕시, 할로겐, 할로겐-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알콕시, 아미노 및 시아노로 구성된 군에서 선택되고;
R7은 C1-7-알킬, C3-7-사이클로알킬 (상기 사이클로알킬은 치환되지 않거나 하이드록시로 치환됨), 헤테로사이클릴 (상기 헤테로사이클릴은 N, O 및 S에서 선택된 1, 2 또는 3개 헤테로원자를 포함하는 3 내지 7개 고리 원자들을 가지며, 치환되지 않거나 하이드록시 또는 옥소로 치환됨), 페닐 (이 때 페닐은 치환되지 않거나 C1-7-알킬, 하이드록시, C1-7-알콕시, 시아노, 할로겐 및 할로겐-C1-7-알킬로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개 기로 치환됨), 및 헤테로아릴 (이 때 헤테로아릴은 치환되지 않거나 C1-7-알킬, 하이드록시, C1-7-알콕시, 시아노, 할로겐 및 할로겐-C1-7-알킬로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개 기로 치환됨)로 구성된 군에서 선택되고;
G는 -(CH2)m- (이 때 m은 0 또는 1에서 선택됨), 및 -NR8- (이 때 R8은 수소 또는 C1-7-알킬임)로 구성된 군에서 선택된다.
용어 "저급 알킬" 또는 "C1-7-알킬"은 단독으로 또는 조합으로 1 내지 7 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 특히 1 내지 6 개 이상의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 더욱 특히 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 의미한다. 직쇄 및 분지쇄 C1-7 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이성질체 펜틸, 이성질체 헥실 및 이성질체 헵틸, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및 tert-부틸이다.
용어 "저급 알콕시" 또는 "C1-7-알콕시"는 R'-O- 기를 지칭하며, 이 때 R'은 저급 알킬이고 용어 "저급 알킬"은 상기 제공된 의미를 가진다. 저급 알콕시 기의 예들은 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec.-부톡시 및 tert.-부톡시, 특히 메톡시이다.
용어 "저급 알콕시알킬" 또는 "C1-7-알콕시-C1-7-알킬"은 상기 정의된 저급 알콕시 기로 일- 또는 다중 치환된 상기 정의된 저급 알킬 기를 지칭한다. 저급 알콕시알킬 기의 예는 예컨대, -CH2-O-CH3, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-O-CH2-CH3 및 본원에 구체적으로 예시된 기들이다. 더욱 특히, 저급 알콕시알킬은 메톡시에틸이다.
용어 하이드록시는 -OH 기를 의미한다.
용어 "사이클로알킬" 또는 "C3-7-사이클로알킬"은 3 내지 7개 탄소 원자들을 함유하는 포화 탄소고리 기, 가령, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸을 나타낸다.
용어 "저급 사이클로알킬알킬" 또는 "C3-7-사이클로알킬-C1-7-알킬"은 저급 알킬 기의 수소 원자들 중 적어도 하나가 상기 정의된 사이클로알킬 기로 대체된, 상기 정의된 저급 알킬 기를 지칭한다. 특히 관심 대상인 저급 사이클로알킬 기들 중에는 사이클로프로필메틸이 있다.
용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 나타내며, 플루오로, 클로로 및 브로모가 특히 중요하다. 더욱 특히, 할로겐은 플루오로 및 클로로를 지칭한다.
용어 "저급 할로겐알킬" 또는 "할로겐-C1-7-알킬"은 할로겐, 특히 플루오로 또는 클로로, 가장 특히 플루오로로 일- 또는 다중 치환된 저급 알킬 기를 지칭한다. 저급 할로겐알킬 기의 예는 예컨대, -CF3, -CHF2, -CH2Cl, -CH2CF3, -CH(CF3)2, -CF2-CF3, -CH2-CH2-CF3, -CH(CH3)-CF3 및 본원에 구체적으로 예시된 기이다. 그 중 특히 트리플루오로메틸 (-CF3) 및 2,2,2-트리플루오로에틸 (-CH2CF3) 기들이 관심 대상이다.
용어 "저급 할로겐알콕시" 또는 "할로겐-C1-7-알콕시"는 저급 알콕시 기의 수소 원자들 중 적어도 하나가 할로겐 원자, 특히 플루오로 또는 클로로, 가장 특히 플루오로로 대체되어 있는 상기 정의된 저급 알콕시 기들을 지칭한다. 저급 할로겐알콕시 기들 중에서 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 플루오로메톡시 및 클로로메톡시, 더욱 특히 트리플루오로메톡시가 특히 관심 대상이다.
용어 아미노는 -NH2 기를 의미한다.
용어 "시아노"는 -CN 기를 의미한다.
용어 "아지도"는 -N3 기를 의미한다.
용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S에서 선택된 1, 2, 또는 3개 원자들을 포함할 수 있는 방향족 5- 또는 6-원 고리를 지칭한다. 헤테로아릴 기들의 예들은 예컨대, 퓨라닐, 피리딜, 피라진일, 피리미딘일, 피리다진일, 티엔일, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사트리아졸릴, 테트라졸릴, 펜타졸릴, 또는 피롤릴이다. 용어 "헤테로아릴"은 또한 2 개의 5- 또는 6- 원 고리를 포함하는 바이사이클릭 기를 포함하며, 여기서 하나 또는 두 개의 고리는 방향족이고, 질소, 산소 또는 황에서 선택된 1, 2, 또는 3개 원자들을 함유할 수 있으며, 가령, 퀴놀린일, 이소퀴놀린일, 신놀린일, 피라졸로[1,5-a]피리딜, 이미다조[1,2-a]피리딜, 퀴녹살린일, 벤조티아졸릴, 벤조트리아졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 및 3,4-디하이드로-2H-피리도[3,2-b][1,4]옥사진일이 있다. 특히 관심대상인 헤테로아릴 기들은 이속사졸릴, 피라졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 피리딜, 피리다진일, 피리미딘일 및 피라진일이다. 더욱 특히, 헤테로아릴은 피리딜 또는 피리다진일이다.
용어 "저급 헤테로알킬" 또는 "헤테로아릴-C1-7-알킬"은 저급 알킬 기의 수소 원자들 중 적어도 하나가 상기 정의된 헤테로아릴 기로 대체된, 상기 정의된 저급 알킬 기들을 지칭한다.
용어 "헤테로사이클릴"은 N, O 및 S에서 선택된 1, 2, 또는 3개 헤테로원자들을 포함할 수 있는 포화 또는 부분 불포화 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7- 원 고리를 지칭한다. 헤테로사이클릴 고리의 예들에는 피페리딘일, 피페라진일, 아제티딘일, 아제핀일, 피롤리딘일, 피라졸리딘일, 이미다졸린일, 이미다졸리딘일, 옥사졸리딘일, 이속사졸리딘일, 모르폴린일, 티아졸리딘일, 이소티아졸리딘일, 옥시란일, 티아디아졸릴리딘일, 옥세탄일, 디옥솔란일, 디하이드로퓨란일, 테트라하이드로퓨란일, 디하이드로피란일, 테트라하이드로피란일, 및 티오모르폴린일이 포함된다. 특히 피페리딘일 및 테트라하이드로피란일이 관심대상이다.
용어 "저급 헤테로사이클릴알킬" 또는 "헤테로사이클릴-C1-7-알킬"은 저급 알킬 기의 수소 원자들 중 적어도 하나가 상기 정의된 헤테로사이클릴 기로 대체된, 상기 정의된 저급 알킬 기들을 지칭한다.
용어 "옥소"는 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 고리의 C-원자가 =O로 치환될 수 있음을 의미하므로, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 카보닐 (-CO-) 기들을 함유할 수 있음을 의미한다.
화학식 (I)의 화합물의 사용에 관한 특정 구체예들에서, G는 결합이고 R7은 C3-7-사이클로알킬이고, 상기 사이클로알킬은 치환되지 않거나 하이드록시로 치환된다. 예를 들면, R7은 하이드록시로 치환되거나 되지 않을 수 있는 사이클로헥실이다.
특정 구체예들에서, R2 및 R6은 각각 수소이다.
특정 구체예들에서, R4는 할로겐, 예를 들면, 클로로 또는 플루오로이고, R3 및 R5 중 하나는 할로겐, 예를 들면, 클로로 또는 플루오로이고, R3 및 R5 중 다른 하나는 수소이다.
특정 구체예들에서, R1은 할로겐-C1-7-알킬이고, 통상적으로, R1은 -CF3, -CHF2, -CH2Cl, -CH2CF3, -CH(CF3)2, -CF2-CF3에서 선택된다.
구체적인 화합물들의 예는 다음 화합물들이다:
Figure pct00003
Figure pct00004
특정 구체예들에서, 본원에 기재된 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물은 5-(3,4-디클로로-페닐)-N-((1R,2R)-2-하이드록시-사이클로헥실)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코틴아미드 및 6-(3,4-디클로로페닐)-N-[(1R,2R)-2-하이드록시사이클로헥실]-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-2-카르복스아미드로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 신장 질환에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물, 호변이성질체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미체 또는 이들의 혼합물, 또는 수화물, 용매화물, 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 유리 염기 또는 유리 산의 생물학적 효과 및 특성을 보유하고 바람직하지 않은 고유 특성을 갖지 않는 염을 의미한다. 이러한 염들은 무기산, 가령, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 특히, 염화수소산, 및 유기산, 가령, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 살리실산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, N-아세틸시스테인 등을 사용하여 형성된다. 따라서, 특정 구체예들에서, "약학적으로 허용되는 염"은 화학식 (I)의 화합물의 아세테이트, 브로마이드, 클로라이드, 포르메이트, 푸마레이트, 말레에이트, 메실레이트, 니트레이트, 옥살레이트, 포스페이트, 설페이트, 타르트레이트 및 토실레이트 염을 포함한다. 또한, 약학적으로 허용되는 염은 유리 산에 무기 염기 또는 유기 염기를 추가하여 제조 될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염들에는, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 유기 염기로부터 유도된 염들에는, 자연 발생 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 가령, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 리신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 피페라진 등을 비롯한 1차, 2차, 및 3차 아민, 치환된 아민의 염이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학식 (I)의 화합물 또한 양쪽성 이온의 형태로 또는 수화물의 형태로 존재할 수 있다. 특히, 화학식 (I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 하이드로클로라이드 염일 수 있다.
화학식 (I)의 화합물의 합성 방법의 예는 WO2011/029827, WO 2012/032018, WO 2013/37703 및 WO2014/180741에 기재되어 있다. 화합물 G 를 제조하는 예시적인 방법은 WO2011/029827에 기재되어 있으며 화합물 A 를 제조하는 예시적인 방법은 WO2014/180741에 개시되어 있다.
화학식 (I)의 화합물의 사용 방법
화학식 (I)의 화합물, 통상적으로, 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 신장 질환의 치료에 유용한 것으로 나타났다.
본원에서 사용되는 용어 "신장 질환"은 신장의 정상적인 생리 및 기능의 임의의 변화를 의미한다. 이 용어는 질환 및 병태들, 가령, 신장 이식; 신병증; 원발성 사구체병증, 국소 분절 사구체경화증이 있는 산발성 특발성 스테로이드 내성 신 증후군을 비롯한 국소 분절 사구체경화증, 미세 변화 질환, 막성 GN, C3 사구체병증, 신장 의미의 감마병증 (gammopathies of renal significance), IgA 신병증, 만성 신장 질환 (CKD); 사구체신염; 유전 질환, 가령, 다낭성 신장 질환; 급성 및 만성 간질성 신염, 메소아메리카 신병증; 신 증후군; 신염 증후군, 말기 신장 질환 (ESRD); 급성 및 만성 신부전; 간질성 질환; 신염; 경화증, 예를 들어 질병 또는 상해로 인한 염증을 포함하는 원인으로 인한 조직 및/또는 혈관의 경화 또는 굳음; 신장 섬유증 및 흉터; 신장-관련 증식성 장애; 및 기타 일차 또는 이차 신장 병태를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
신장 질환은 또한 일반적으로 "신병증" 또는 "신병증들"로 정의될 수 있다. 용어 "신병증" 또는 "신병증들"은 신장 섬유증 및/또는 사구체 질환 (예컨대, 사구체경화증 또는 사구체신염) 및/또는 만성 신 부전을 가져올 수 있는 신장의 모든 임상-병리학적 변화를 포함하며, 말기 신장 질환 및/또는 신부전을 유발할 수 있다.
본 발명의 일부 양상은 고혈압성 신병증, 당뇨병성 신장 장애와 같은 당뇨병성 신병증, 및 진통성 신병증과 같은 다른 유형의 신병증, 면역-매개 사구체병증 (예컨대, IgA 신병증 또는 버거병, 루푸스 신염), 허혈성 신병증, HIV-관련 신병증, 막성 신병증, 사구체신염, 사구체경화증, 방사선 조영제-유발 신병증, 독성 신병증, 진통제-유발 신장독성, 시스플라틴 신병증, 이식 신병증, 및 기타 형태의 사구체 비정상 또는 손상 또는 사구체 모세관 손상 (관상 섬유증)의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 용어 "신병증" 또는 "신병증들"은 구체적으로 개체의 소변에 단백질 (즉, 단백뇨)의 존재 및/또는 본원에서 단백뇨성 신장 장애로도 지칭되는 신 부전의 존재가 존재하는 장애 또는 질환을 지칭한다.
일부 구체예들에서, 개체는 알부민뇨 또는 단백뇨를 앓고 있다.　 알부민뇨와 관련된 예시적인 장애는 만성 신장 질환, 증식성 사구체신염 (예를 들어, 면역글로불린 A 신병증, 막증식성 사구체신염, 혈관사이질 증식성 사구체신염, 항-GBM 질환, 신장혈관 신염, 세균성 신염, 한랭글로불린혈증-관련 사구체신염, 세균성 심내막염, 헤노흐-쇤라인 (Henoch-Schonlein) 자반병, 감염후 사구체신염 또는 C형 간염) 및 비증식성 사구체신염 (예컨대, 막성 사구체신염, 최소-변화 질환, 원발성 국소 분절 사구체경화증 (FSGS), 섬유소 사구체신염, 면역복합 사구체신염, 아밀로이드증, 알포트 증후군, 고혈압 신경화증, 다발성 골수종으로 인한 경쇄 질환 및 이차 초점성 사구체경화증)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 제공된 임의의 구체예들에서, 개체는 신장 기능을 평가하기 위해 특정한 테스트를 받을 수 있다. 이러한 테스트에는, 제한없이, 개체의 혈액 요소 질소 측정; 개체의 혈액에서 크레아티닌 측정; 개체의 혈액에서 크레아티닌 청소율 측정; 개체의 단백뇨 측정; 개체에서 알부민:크레아티닌 비율 측정; 개체에서 사구체 여과율 측정; 및 개체의 소변 배출량 측정이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태의 진행을 역전, 완화, 억제하거나, 또는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상들의 진행을 역전, 완화, 억제하거나, 이를 예방하는 것을 나타낸다. 결과적으로, 또 다른 양상에서, 본 발명은 또한, 제한없이, 단백뇨 감소, 단백뇨 증가 둔화, 소변 알부민 크레아티닌 비율 (UACR)의 증가 둔화, UACR 감소, UAER 증가 둔화, UAER 감소, 알부민뇨 감소, 알부민뇨 증가 둔화, 사구체 발세포 밀도 증가, 사구체 기저막 (GBM) 비대 방지 또는 둔화, 사구체 영역 감소, 신장 간질성 대식세포 수 감소, 신장 조직의 섬유증 감소 또는 둔화, 신장 염증 중단 또는 감소, 신장에 대한 대식세포-유발 손상 중단 또는 감소, 추정 사구체 여과율 (eGFR) 증가 또는 정상화, eGFR 감쇠의 약화, 사구체경화증 감소, 사구체 세포외 기질의 확장 중단 또는 감소, 유리질 종괴의 침착 중지 또는 감소, 사구체 상피 과형성 병변 (EPHL) 중단 또는 감소, 및 림프구 침윤 중단 또는 감소를 포함한, 신장 장애와 관련된 증상들을 감소, 억제 또는 제거함에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물, 통상적으로, 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
그러므로 본 발명은 또한 상기 정의된 신장 질환들의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 화학식 (I)의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 만성 신장 질환, 단백뇨 및/또는 사구체 질환을 포함하는 신장 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 용도는 알포트 증후군, 국소 분절 사구체경화증, 및 당뇨병성 신장 질환과 관련되어 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 신장 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다. 이러한 신장 질환들의 예들은 만성 신장 질환, 단백뇨 및/또는 사구체 질환을 포함한다. 알포트 증후군, 국소 분절 사구체경화증, 및 당뇨병성 신장 질환의 치료 및/또는 예방 방법이 바람직하다.
또한, 본 발명은 신장 질환의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 통상적으로, 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다. 이러한 신장 질환들의 예들은 만성 신장 질환, 단백뇨 및/또는 사구체 질환을 포함한다. 특히 알포트 증후군, 국소 분절 사구체경화증, 및 당뇨병성 신장 질환의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 상기 정의된 화학식 (I)의 화합물의 용도가 관심대상이다.
약학 조성물의 형태, 투여 경로, 용량 및 요법은 자연적으로 치료할 병태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 달라진다.
본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비강내, 안구내, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 등을 위해 제형화 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 경구 투여용으로 제형화 될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 유리체내, 척수강내 또는 경피 투여용으로 제형화 될 수 있다.
약제 학적 조성물은 정제, 알약, 캡슐, 반고체, 분말, 서방형 제형, 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 에어로졸 또는 임의의 다른 적절한 조성물의 형태를 취할 수 있으며; 상기 정의된 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
특정 구체예에서, 경구 제형은 정제, 구강분산성 정제, 캡슐, 용액, 패치, 설하 정제, 코 스프레이 또는 경구 스프레이이다. 한 하위 구체예에서, 제형은 상기 정의된 화학식 (I)의 화합물의 지속 방출을 위해 제조된다.
투여의 용이함으로 인해 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구 투약 단위 형태를 나타내며, 이 경우 고체 약학 담체가 당연히 사용된다. 필요에 따라, 정제는 표준 기술에 의해 당 코팅되거나 장용 코팅 될 수 있다. 정제 또는 알약을 코팅하여 장기간 작용의 이점을 제공하는 투약 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투약 및 외부 투약 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자를 덮는 외피 형태이다. 두 성분은 장내 층에 의해 분리 될 수 있으며, 이는 위장에서 붕해에 저항하는 역할을 하며 내부 성분들이 손상시키지 않고 십이지장으로 전달될 수 있게 하거나 방출이 지연되도록 한다. 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질과 함께 다수의 중합체 산을 포함하는 이러한 물질과 같은 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅을 위해 사용될 수 있다.
적합한 담체 물질은 무기 담체 물질, 뿐만 아니라 유기 담체 물질이다. 따라서, 예를 들어, 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 이의 염은 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 젤라틴 캡슐의 담체 물질로 사용될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐에 적합한 담체 물질은 예를 들어 식물성 오일, 왁스, 지방 및 반고체 및 액체 폴리올이다 (그러나 활성 성분의 특성에 따라 연질 젤라틴 캡슐의 경우에는 담체가 필요하지 않을 수 있음). 용액 및 시럽의 생산에 적합한 담체 물질은 예를 들어 물, 폴리올, 수크로스, 전화당 등이다. 주사 용액에 적합한 담체 물질은 예를 들어 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤 및 식물성 오일이다. 좌약에 적합한 담체 물질은 예를 들어 천연 또는 경화 오일, 왁스, 지방 및 반-액체 또는 액체 폴리올이다. 국소 제제에 적합한 담체 물질은 글리세라이드, 반-합성 및 합성 글리세라이드, 수소첨가 오일, 액체 왁스, 액체 파라핀, 액체 지방 알코올, 스테롤, 폴리에틸렌 글리콜 및 셀룰로오스 유도체이다.
통상적인 안정제, 방부제, 습윤제 및 유화제, 점도-개선제, 향미-개선제, 삼투압 변화를 위한 염, 완충 물질, 가용화제, 착색제 및 차폐제 및 항산화제가 약학 보조제로 고려된다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 매개 변수의 함수, 특히, 사용된 투여 방식, 관련 병리, 또는 대안적으로 원하는 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다. 화합물 및 화합물을 포함하는 조성물의 적절한 투여량은 환자마다 다를 수 있음이 이해될 것이다. 최적의 투여량을 결정하는 것은 일반적으로 본원에 기재된 치료의 임의의 위험 또는 해로운 부작용에 대하여 치료 이익 수준을 균형있게 하는 것을 포함할 것이다. 선택된 투여량 수준은 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 복합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강상태 및 이전 병력등을 포함한 다양한 요인들에 따라 달라질 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 화합물의 양과 투여 경로는 궁극적으로 의사의 재량에 달려 있지만, 일반적으로 투여량은 실질적으로 해롭거나 해로운 부작용을 일으키지 않고 원하는 효과를 달성하는 작용 부위에서 국소 농도를 달성하는 것이 될 것이다.
성인 환자의 경우 약 1 내지 100mg, 특히, 약 1 내지 50mg의 일일 투여량이 고려된다. 질병의 중증도 및 정확한 약동학 적 프로파일에 따라 화합물은 1회 또는 수회 일일 투약 단위, 예컨대, 1 내지 3 투약 단위로 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 20 내지 800 mg/일의 일일 용량으로 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 200 mg/일의 일일 용량으로 투여된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 편리하게는 약 1-200 mg, 바람직하게는 75-100 mg의 화학식 (I)의 화합물, 전형적으로, 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유한다. 투약 요법은 화학식 (I)의 화합물의 구체적인 약동학적 특성에 맞춰질 수 있다.
특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물, 통상적으로 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 3일에 1회, 주 1회, 2주에 1회 또는 월 1회 투여된다. 바람직하게는, 투약 주기는 1일 2회, 1일 1회 및 격일에 1회에서 선택된다.
또 다른 특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물, 통상적으로 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 부하 용량 요법은 첫 7일, 14일, 및 30일 동안 용량의 두 배이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 약 20-800　mg, 바람직하게는 약 50-400 mg, 및 더욱 바람직하게는 약 200 mg의, 화학식 (I)의 화합물, 통상적으로, 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 화학식 (I)의 화합물, 통상적으로, 실시예에 기재된 화합물 A 및 G , 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 1일 용량은 20 내지 800 mg/일, 바람직하게는 1일 용량은 약 200 mg/일이다.
또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물은 또한 신장 질환 또는 관련 장애 또는 합병증을 예방 또는 치료하기 위한 또 다른 제제와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 복합하여 또는 결합하여 이용될 수 있다. 이러한 공지된 화합물들의 예에는 다음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 약물 (예컨대, 캅토프릴 (Capoten®), 에날라프릴 (Innovace®), 포시노프릴 (Staril®), 리시노프릴 (Zestril®), 페린도프릴 (Coversyl®), 퀴나프릴 (Accupro®), 트란다날로프릴 (Gopten®), 로텐신, 모엑시프릴, 라미프릴); RAS 차단제; 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB) (예컨대, 올메사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄, 발사르탄, 칸데사르탄, 에프로사르탄, 텔미사르탄, 등); 단백질 키나제 C (PKC) 억제제 (예컨대, 루복시스타우린); AGE-의존 경로의 억제제 (예컨대, 아미노구아니딘, ALT-946, 피로독사민 (피로도도린), OPB-9295, 알라게브리움); 항-염증제 (예컨대, 사이클로옥시게나제-2 억제제, 마이코페놀레이트 모페틸, 미조리빈, 펜톡시필린), GAG (예컨대, 술로덱시드 (미국 특허 제 5,496,807)); 피리독사민 (미국 특허 제 7,030,146); 엔도텔린 길항제 (예컨대, SPP 301), COX-2 억제제, PPAR-γ 길항제 및 기타 화합물, 가령, 아미포스틴 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 캅토프릴 (당뇨병성 신병증에 사용됨), 사이클로포스파미드 및 리툭시맙 (특발성 막성 신병증에 사용됨), 소듐 티오설페이트 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 트라닐라스트, 사이클로덱스트린 및 이의 유도체 (예컨대 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린) 등 (Williams 및 Tuttle (2005), Advances in Chronic Kidney Disease, 12 (2):212-222; Giunti 외 (2006), Minerva Medica, 97:241-62). 특정 구체예들에서, 복합하여 또는 결합하여 사용하기 위한 공지된 화합물들은, 제한없이, 바르독솔론 또는 mir-21의 올리고뉴클레오티드 억제제 (mir-21 안타고미르)를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 복합하여 또는 결합하여 사용하기 위한 공지된 화합물은 비타민 D 유도체, 항-고혈당제 (예컨대, SGLT2 억제제, GLP1 효현제, DPP4 억제제), 항-고콜레스테롤혈증제 (예컨대, 스타틴, 니아신, 피브레이트, PCSK9 억제제, 에제티미베)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "복합"은 하나의 단위 투약 형태에서 고정 용량 복합제, 비-고정 용량 복합제, 또는 복합 투여를 위한 부분들의 키트를 지칭하며 이 때 화학식 (I)의 화합물, 및 하나 이상의 조합 파트너 (예컨대, ACE 억제제 약물 또는 ARB 약물)는 독립적으로 동시에 또는 일정 시간 간격 이내에 개별적으로 투여될 수 있으며, 특히 이러한 시간 간격은 상기 복합 파트너들이 협동의, 예컨대, 상승작용적 효과를 보여줄 수 있게 한다.
용어 "고정 용량 복합제"는 활성 성분들이 모두 하나의 엔터티 또는 투약의 형태로 동시에 환자에게 투여되는 것을 의미한다.
용어 "비-고정 용량 복합제"는 활성 성분들, 예컨대, 화학식 (I)의 화합물 및 하나 이상의 조합 파트너들 (예컨대, ACE 억제제 약물 또는 ARB 약물)이 모두, 개별 엔터티로 동시에 또는 특정 시간 제한 없이 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 이 때 이러한 투여는 환자의 신체에서 이러한 2개 화합물들의 치료적 유효 수준을 제공한다.
추가로, 본원에 기재된 방법들은 또한 다음을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 신장 질환 합병증과 직접 또는 간접으로 관련된 또 다른 질환의 치료를 위한 적어도 하나의 다른 치료제의 공동-투여를 포함할 수 있다: 이상지질혈증, 고혈압, 비만, 신경병증, 염증, 및/또는 망막병증. 이러한 추가 치료제에는, 코르티코스테로이드; 면역억제제; 항생제; 항-고혈압제 및 이뇨 약제 (가령, 티아지드 이뇨제 및 ACE-억제제 또는 β아드레날린성 길항제); 담즙 결합 수지 (bile sequestrant resins), 콜레스티라민, 콜레스티폴, 니코틴산과 같은 지질 강하제, 특히, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 감소시키기 위해 사용되는 약물 및 약제 (가령, 피브레이트 (예컨대, Gemfibrozil®) 및 Lovastatin®, Atorvastatin®, Fluvastatin®, Lescol®, Lipitor®, Mevacor®, Pravachol®, Pravastatin®, Simvastatin®, Zocor®, Cerivastatin® 등과 같은 HMG-CoA 억제제); 니코틴산; 및 비타민 D가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "공동-투여" 또는 "복합 투여"는, 선택된 복합 파트너의 하나의 개체 내부로의 투여를 포함하는 의미이며, 상기 물질들이 반드시 동일한 투여 경로로 또는 동시에 투여될 필요가 없는 치료 요법을 포함하는 것으로 한다.
용어 "복합하여 치료적으로 유효한"은 치료 물질들이 (바람직하게는 상승작용적) 상호작용 (즉, 복합 치료 효과)를 보여줄 수 있는 시간 간격으로 개별적으로 (시간적으로 시차를 두는 방식, 특히, 순서-특정 방식으로) 제공될 수 있음을 의미한다.
그러므로 본 발명은 또한
(i) 상기 정의된 화학식 (I)의 화합물, 통상적으로, 실시예에 기재된 화합물 A 또는 G 를,
(ii) 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 약물; RAS 차단제; 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB); 단백질 키나제 C (PKC) 억제제; AGE-의존 경로의 억제제; 항-염증제, GAG; 피리독사민 (미국 특허 제 7,030,146); 엔도텔린 길항제, COX-2 억제제, PPAR-γ 길항제 및 기타 화합물, 가령, 아미포스틴 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 캅토프릴 (당뇨병성 신병증에 사용됨), 사이클로포스파미드 (특발성 막성 신병증에 사용됨), 소듐 티오설페이트 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 또는 트라닐라스트; 사이클로덱스트린 및 이의 유도체 (예컨대 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린)로 구성된 군에서 선택된 화합물, 및
(iii) 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제와 복합하여 또는 결합하여 포함하는 약제에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "약제"는 하나 이상의 부형제의 존재하에 하나 이상의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물 또는 여러 약학 조성물들의 복합제를 의미한다.
본 발명은 또한 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 약물; RAS 차단제; 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB); 단백질 키나제 C (PKC) 억제제; AGE-의존 경로의 억제제; 항-염증제, GAG; 피리독사민 (미국 특허 제 7,030,146); 엔도텔린 길항제, COX-2 억제제, PPAR-γ 길항제 및 기타 화합물, 가령, 아미포스틴 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 캅토프릴 (당뇨병성 신병증에 사용됨), 사이클로포스파미드 (특발성 막성 신병증에 사용됨), 소듐 티오설페이트 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 트라닐라스트 또는 사이클로덱스트린 및 이의 유도체 (예컨대 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 비타민 D 유도체, 항-고혈당제 및 항-고콜레스테롤혈증제로 구성된 군에서 선택된 화합물과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용하기 위한, 상기 정의된 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.또한 본 발명은 신장 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로, 이 방법은 화학식 (I)에 따른 화합물의 치료적 유효량을, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 약물; RAS 차단제; 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB); 단백질 키나제 C (PKC) 억제제; AGE-의존 경로의 억제제; 항-염증제, GAG; 피리독사민 (미국 특허 제 7,030,146); 엔도텔린 길항제, COX-2 억제제, PPAR-γ 길항제 및 기타 화합물, 가령, 아미포스틴 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 캅토프릴 (당뇨병성 신병증에 사용됨), 사이클로포스파미드 (특발성 막성 신병증에 사용됨), 소듐 티오설페이트 (시스플라틴 신병증에 사용됨), 트라닐라스트, 또는 사이클로덱스트린 및 이의 유도체 (예컨대 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 비타민 D 유도체, 항-고혈당제 및 항-고콜레스테롤혈증제로 구성된 군에서 선택된 치료적 유효량의 화합물과 복합하여 또는 결합하여 투여하는 것을 포함한다.
하기 실시예에서, 화학식 (I)의 화합물은 적어도 3가지 별도의 신장 질환들, 즉, 알포트 증후군, 국소 분절 사구체경화증 및 당뇨병성 신장 장애의 생체내 동물 모델에서 테스트되었으며, 이는 수많은 신장 질환들에서 이들 화합물의 유망한 치료 효과를 반영한다.
도면의 범례
도 1. Balb/c 마우스에서 ADR-유발된 신병증에서 화합물의 최적 용량을 테스트하기 위한 실험 설계. 30 마리의 암컷 Balb/c 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 12mg/kg의 용량으로 독소루빈 (ADR, 아드리아마이신)을 주사했다. 5마리 마우스의 기준 그룹은 식염수 용액을 받았다. ADR-주사된 마우스를 각각 5 마리씩 6개 그룹으로 나누어 총 7개의 실험 그룹을 얻었다. 다음날부터 화합물을 5주 동안 경구 섭식으로 1일 1회 투여하였다. 소변을 매주 수집하고 체중을 매주 기록했다. 혈액 및 신장 피질은 ADR-주사 후 35일 후에 희생시 수집되었다.
도 2: Balb/c 마우스의 ADR-유발된 신병증에서 화합물을 테스트하기 위한 실험 설계. 암컷 Balb/c 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 12mg/kg의 용량으로 독소루빈 (ADR, 아드리아마이신)을 주사했다. 5마리 마우스의 대조 그룹은 식염수 용액을 받았다. ADR을 주사한 암컷은 6마리씩 5개 그룹으로 분리되었다. 다음날부터, 운반체 또는 화합물을 표시된 바와 같이 4주 동안 경구 섭식으로 1일 1회 투여하였다. 소변을 매주 수집하고 체중을 매주 기록했다. 혈액 및 신장 피질은 ADR-주사 후 28일 후에 희생시 수집되었다.
도 3. 분화된 인간 발세포에서의 화합물 세포독성. 분화된 인간 발세포들을 0 μM (운반체), 1 μM, 5 μM 및 10 μM의 화합물 A, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 F 및 화합물 G로 18 h 동안 처리하였다. Promega CytoTox 분석 키트를 사용하여 세포독성을 평가했다. 일반 배지를 사용한 처리 (개방 막대)가 기준선으로 사용되었다. 세포독성 신호는 세포 수의 차이로 인한 편향을 제거하기 위해 생존도 신호에 대해 정규화되었다. 모든 처리들을 운반체-처리 세포들과 비교하였다. 유의한 독성은 단지 10 uM 이상 농도의 화합물 A 및 화합물 C에서 발견되었다. 일원-ANOVA, n=3 독립 실험, Dunett 테스트, *p<0.5, ***p<0.001.
도 4. 화합물 C, 화합물 A 및 화합물 G로의 처리는 분화된 발세포에서 ABCA1 발현 및 콜레스테롤 유출을 증가시킨다.
분화된 인간 발세포를 18 h 시간 동안 표시된 바와 같이 운반체 (0.1 % DMSO) 또는 화합물로 처리하고, ABCA1 발현, 국소화 및 콜레스테롤 유출에의 관여도를 측정하였다. (a) LXR 효현제 이용시 (화합물 C, E 및 D) ABCA1 발현의 강력한 유도, 및 10 μM ABCA1 유도제 화합물 A 및 G 사용시 보통의 유도를 보여주는 전 세포 용해물에서 ABCA1 및 GAPDH 웨스턴 블롯. (b-e) 화합물 C, 화합물 A 및 화합물 G는 형질막에서 ABCA1의 발현을 증가시킨다. 지시된 바와 같이 운반체 또는 화합물 C, A 및 G로 18 h 동안 처리된 분화된 인간 발세포를 세포 분획시켰다. (b) 화합물 A (5uM) 및 화합물 G (10 uM)로 처리 후 ABCA1 발현의 보통의 증가를 보여주는 전 세포 용해물에서의 ABCA1 및 GAPDH 웨스턴 블롯. (c-e) ABCA1, Na+/K+ ATPase 펌프 및 MEK에 대해 블롯팅 및 프로브된 형질막, 마이크로솜 및 사이토졸 수집된 분획. (f-h) 화합물 C, A 및 G는 분화된 발세포에서 ApoA1-매개 콜레스테롤 유출을 증가시킨다. [3H]-콜레스테롤을 부하한 분화된 발세포를 표시된 화합물과 함께 18 h 동안 배양하였다. ApoA1과 함께 또는 없이 18h 동안 세포들을 배양한 후 ApoA1-매개 콜레스테롤 유출을 계산하였다. 데이터를 적어도 3번의 독립 실험 평균으로서 s.d.와 함께 기록하였다. 일원 ANOVA, Dunnett's 테스트, *P<0.05%, **P<0.01%
도 5. ADR에 의해 유발된 신장 손상을 약화시키기 위한 최적의 화합물 용량 선택.
(a-e) 지시된 용량의 화합물로 5 주-처리하는 동안 ADR 주사된 마우스의 알부민뇨. 마우스는 ADR 주사 후 2-3주에 대량 단백뇨가 발생했으며, 이는 30 mg/Kg 용량의 화합물 A (b) 및 100 mg/Kg 용량의 화합물 G (e)로 처리된 마우스에서 약화되었다.
(f-j). ADR-주사된 마우스는 ADR 주사 후 2 내지 3주 후 유의한 체중 감소로 특징되며, 이러한 표현형은 30 mg/kg의 화합물 A 또는 100 mg/kg의 화합물 G를 투여받은 마우스에서 부분적으로 약화된다. 제시된 결과는 각 그룹에 대한 평균 및 SE를 나타낸다. 일원 ANOVA n=5, Dunett 테스트 , *P<0.05%.
도 6. ABCA1 유도제 화합물 A 및 화합물 G는 ADR 주사된 마우스에서 알부민뇨 및 체중 감소를 유의하게 감소시킨다. ADR (12 mg/Kg)을 주사한 마우스들은 운반체, LXR 효현제 화합물 C 또는 최적 용량의 ABCA1 유도제, 화합물 A 및 화합물 G를, 28일간 1일 1회 제공받았다. 알부민뇨 및 체중을 주 1회 측정하였다. (a) 4주 처리 후 알부민뇨. (b) 4주 처리 후와 ADR 주사 하루 전 사이 각 마우스의 체중 차이로 표현된 체중 감소. 왼쪽에 제시된, ADR을 주사하지 않은 기준선 그룹 마우스는 신장 손상없는 표현형을 반영한다. 막대들은 각 처리 그룹에 대한 중앙값과 범위를 나타낸다. 모든 그룹들을 맨-휘트니 검정을 사용하여 운반체를 제공받은 그룹과 비교하였다 (n=8, *P<0.05%, **P< 0.01%, ****P<0.0001%).
도 7. ADR을 주사하고 운반체 또는 100 mg/Kg/일의 화합물 G를 4주 동안 처리한 동물들의 신장으로부터 얻은 PAS 및 HE 절편의 병리학적 검사. 병리학자는 완전 경화증 (A); % 분절 경화증 (B); 발세포 비대 (C); 발세포 과형성 (D); 세뇨관 미세낭종 (E) 및 간질성 염증 (F)의 %를 평가하였다. 스케일 값은 다음을 나타낸다: 0: 0 %; 0.5+: 1-10 %; 1+: 11-25%; 2+: 26-50 %; 3+: 51-75 %; 4+ > 75%. 화합물 G-처리 그룹에서 얻은 샘플들을 맨 휘트니 검정을 사용하여 처리된 운반체와 비교하였다 (n=7; * P < 0.05%)
도 8. 식염수 용액 또는 ADR을 주사한 마우스들을 운반체 또는 100 mg/Kg의 화합물 G로 28일 동안 처리하였다. 지질 방울 침착을 검출하기 위해 신장 피질 절편들을 ORO로 염색하였다. 건강한 기준 그룹 (A), ADR을 주사하고 운반체를 처리한 (B), 및 100 mg/Kg/일의 화합물 G를 처리한 (C) 그룹으로부터 얻은 절편들의 대표도.
도 9. 화합물 G는 ADR-주사된 마우스의 신장 조직에서 에스테르화 콜레스테롤의 축적을 감소시킨다. 운반체 또는 화합물 G를 28일 동안 처리한 ADR-주사된 마우스의 신장 피질로부터 추출한 지질을 콜레스테롤 에스테르, 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드에 대해 분석하였다. 각 지질 종의 양은 표본에 존재하는 총 단백질에 대해 정규화되었다. (a) 에스테르화 콜레스테롤, (b) 총 콜레스테롤 함량 및 (c) 신장 조직에서 발견된 트리글리세라이드 함량. ADR 주사하지 않은 동물을 왼쪽에 표시하고 신장 손상이 유도되지 않은 경우를 기준 값으로 나타낸다. 화합물 G 및 운반체 처리된 그룹들을 맨 휘트니 양측 검정을 사용하여 비교하였다, n=8 ; **** P<0.0001%. (d-f). 각 마우스의 알부민뇨와 그 신장 피질에 존재하는 지질 종의 양 사이의 상관관계. 강한 상관관계가 콜레스테롤 에스테르 (d)과는 발견되었으나, 총 콜레스테롤 (e) 및 트리글리세라이드 (f)과는 발견되지 않았다. 피어슨 테스트, n=10
도 10. 12 mg/Kg의 ADR을 주사한 동물들을 ADR 주사 하루 후에 운반체 또는 100 mg/Kg의 화합물로 처리하였다. 운반체 (A-B) 및 100 mg/Kg의 화합물 G (C-D) 처리 20일 후 촬영한 사진
도 11. Col4A3 KO 마우스의 화합물 G 처리는 말기 신장 질환으로의 진행을 지연시킨다. 4 주령의 129-Col4A3 KO 마우스를 운반체 또는 100 mg/Kg의 화합물 G로 4 주 동안 처리하였다. 실험 종료시인 56 일차에, 체중을 측정하고, 단회뇨와 혈액을 수집하고 신장을 지질 축적에 대해 분석하였다. (a) 알부민뇨, (b) 혈청 크레아티닌, (c) 혈중 요소 질소 및 (d) 운반체 또는 화합물 G로 처리된 KO 마우스의 체중. (e) 각 그룹으로부터 PAS-염색된 신장 절편의 대표 사진, (f) e에서 언급한 PAS-염색된 신장 절편의 맹검 병리학 분석 후 메산지움 증식 정량. 만성 신장 질환 부재시 표현형을 반영하기 위하여 동일령의 Col4a3+/+ 마우스 (중량)들을 왼쪽에 포함시켰다. (g) 6주령시에 시작하여 4주 동안 운반체 또는 화합물 G (100mg/Kg/일)를 투여받은 129-Col4a3 KO 마우스의 생존 곡선. 가로 막대는 각 그룹의 중앙값을 나타낸다. 그룹들 간 통계적 차이는 양측 검정 맨 휘트니 검정을 사용하여 계산되었다, n=4, * P< 0.05 %, **P<0.01 %.
도 12. Db/+, db/db 운반체 처리되고 db/db ABCA1 유도제 (화합물 A) 처리된 마우스를 이용하였으며 다음에 대하여 분석하였다: 처리 시작시 (14주차), 처리 2주 후 (16주차) 및 처리 4주 후 (18 주차) 희생시 결정된 알부민 대 크레아티닌 비율 (A); 마우스 혈청으로부터 결정하여 mg/dL로 나타낸 혈중 요소 질소 (BUN) (B); 총 콜레스테롤 (TC), 유리 콜레스테롤 (FC) 및 콜레스테롤 에스테르 (CE) 형태에서 신장 피질 콜레스테롤 함량 (단백질 mg 당 콜레스테롤의 nmol 배수 변화) (C); BUN과 CE 사이의 상관관계 (D); WT1 항체를 통해 결정된, 사구체 단면 당 발세포 수 (E) 및 정량화 (F); PAS 염색된 신장 피질 절편을 사용한 메산지움 증식 점수 (G) 및 정량화 (H); TEM 이미지로부터 결정된 발세포 발 돌기 소실 (I) 및 정량화 (J). 일원 ANOVA 이후 Tukey 검정 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 13. 화합물 G는 신장 피질에서 에스테르화 콜레스테롤 축적을 감소시킨다 (a) 에스테르화 콜레스테롤 (CE), (b) 총 콜레스테롤 (TC) 및 (c) 트리글리세라이드 함량 (TG)은 4주령에서 시작하여 28일 동안 운반체 또는 화합물 G를 투여받은 8주령 Col4A3KO로부터 얻은 신장 피질에서 결정되었다. 각 지질의 함량은 총 단백질 함량에 대해 정규화되었다. 야생형 한배새끼 그룹도 이 연구에 포함되었다 (열린 원). 가로 막대는 각 그룹의 중앙값을 나타낸다. 양측 맨 휘트니 검정 (n=8)을 사용하여 통계적 차이를 결정하였다, *P<0.05, **P<0.001.
실시예
ABCA1 유도제 화합물의 제조
화합물 목록:
Figure pct00005
상기 화합물 및 이들의 합성 방법은 WO2014/180741에 기재되어 있다.
화합물 G (5-(3,4-디클로로-페닐)- N -((1 R ,2 R )-2-하이드록시-사이클로헥실)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코틴아미드)의 제조
상기 화합물은 WO 2011/029827의 실시예 3에 기재된 절차에 따라 5-브로모-6-클로로-3-피리딘카르복실릭 애시드, 2,2,2-트리플루오로에탄올, (1R,2R)-2-아미노-사이클로헥산올 및 3,4-디클로로페닐보로닉 애시드를 제조하였다. MS 463.079, 465.077 (M+H)+.
화합물 A 6-(3,4-디클로로페닐)- N -[( 1R,2R )-2-하이드록시사이클로헥실]-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-2-카르복스아미드의 제조
화합물 A를 WO 2014/180741에 기재된 다음 단계들의 절차에 따라 제조하였다:
a) 6-클로로-2-(3,4-디클로로페닐)-3-플루오로피리딘
100 mL 4구 플라스크에서, 2,6-디클로로-3-플루오로피리딘 (765 mg, 4.61 mmol, 당량: 1.00, CAS 등록 번호 52208-50-1) 및 포타슘 (3,4-디클로로페닐)트리플루오로보레이트 (1.21 g, 4.61 mmol, 당량: 1.00, CAN 850623-68-6)를 디옥산 (23 mL) 및 물 (13 mL)과 조합하였다. 2M Na2CO3 (6.91 mL, 13.8 mmol, 당량: 3), 이어서, PdCl2(DPPF)-CH2Cl2 부가물 (169 mg, 230 μmol, 당량: 0.05, CAS 등록 번호 95464-05-4)을 추가하였다. 반응 혼합물을 3x 탈기시키고 아르곤으로 퍼징 한 다음 교반하면서 밤새 60℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 50 mL H2O에 붓고 tert. 부틸-메틸-에테르 (2x100mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O/염수로 세척하고, 조합하고, Na2SO4를 통해 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 이러한 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 70g, 헵탄 중의 5% 내지 20% 디클로로메탄)로 2회 정제하여 표제 화합물 540mg을 백색 반고체로 수득하였다.
b) 6-클로로-2-(3,4-디클로로페닐)-3-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘
25 mL 복숭아형 플라스크에서, 상기 제조된 6-클로로-2-(3,4-디클로로페닐)-3-플루오로피리딘 (530 mg, 1.44 mmol, 당량: 1.00)을 DMSO (8 mL)와 조합하였다. KOH (118 mg, 2.1 mmol, 당량: 1.46) 및 2,2,2-트리플루오로에탄올 (211 mg, 153 μl, 2.11 mmol, 당량: 1.47)을 추가하고 주위 온도에서 2h 동안 반응을 진행시켰다. 혼합물을 30mL H2O에 붓고 tert. 부틸-메틸-에테르 (2x40mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O/염수로 세척하고, 조합하고, Na2SO4를 통해 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 이러한 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 70g, 헵탄 중의 5% 내지 20% EtOAc)로 정제하여 표제 화합물 444mg을 무색 액체로 수득하였다; MS (ESI) 356.3, 358.3, 360.3 (M+H)+.
c) 메틸 6-(3,4-디클로로페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-2-카르복실레이트
35 mL 오토클레이브에서 상기 제조된 6-클로로-2-(3,4-디클로로페닐)-3-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘 (437 mg, 1.22 mmol, 당량: 1.00)을 5 mL MeOH에 용해시켰다. 아르곤으로 산소 및 습기로부터 보호한, PdCl2(DPPF)-CH2Cl2 부가물 (75.2 mg, 92 μmol, 당량: 0.083, CAS 등록 번호 95464-05-4), 이어서 트리에틸아민 (233 mg, 321 mL, 2.31 mmol, 당량: 2.31)을 추가하였다. 이후 반응기를 CO로 3번 플러싱하고, 70 bar로 가압한 다음, 110℃에서 20h 동안 카르보닐화를 진행시켰다. 냉각 및 압력 해제 후, 미정제 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 이어서 잔부를 AcOEt/H2O에 재용해시키고 분별 깔때기로 옮겼다. 수성층을 EtOAc로 역추출하고, 유기층을 H2O 및 염수로 세척하고, 조합하고, Na2SO4를 통해 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 70g, 헵탄 중의 10% 내지 40% EtOAc)하여 최종적으로 표제 화합물 327 mg을 백색 고체로 수득하였다; MS (ESI) 380.4, 382.4 (M+H)+.
d) 6-(3,4-디클로로페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-2-카르복실릭 애시드
25 mL 복숭아형 플라스크에서, 상기 제조된 메틸 6-(3,4-디클로로페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피콜리네이트 (326 mg, 858 μmol, 당량: 1.00)를 테트라하이드로퓨란 (5 mL)과 조합하여, 무색 용액을 얻었다. 물 (2.5 ml), 이어서 LiOH (41.1 mg, 1.72 mmol, 당량: 2)를 추가하고 반응 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 5mL 포화 NH4Cl 용액 및 3mL 1N KHSO4 용액에 붓고 EtOAc (2 x 30 mL)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, Na2SO4를 통해 건조시키고 진공에서 농축시켜 표제 산 322 mg가 백색 폼으로 남았다; MS (ESI) 366.4, 368.4 (M+H)+.
e) 6-(3,4-디클로로페닐)-N-[(1R,2R)-2-하이드록시사이클로헥실]-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-2-카르복스아미드
25 mL 복숭아형 플라스크에서, 상기 합성된 6-(3,4-디클로로페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)-피콜린산 (322 mg, 879 μmol, 당량: 1.00)을 DMF (12 mL)에 용해시켰다. TBTU (O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, 424 mg, 1.32 mmol, 당량: 1.5, CAS 등록 번호 125700-67-6) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (568 mg, 768 μl, 4.4 mmol, 당량: 5)을 추가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 10분 동안 교반한 다음 (1R,2R)-2-아미노사이클로헥산올 하이드로클로라이드 (160 mg, 1.06 mmol, 당량: 1.2, CAS 등록 번호 13374-31-7)를 추가 용매 없이 추가하였다. 이어서 반응을 실온에서 3h 동안 진행시켰다. 미정제 혼합물을 H2O로 희석시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 합하고, Na2SO4를 통해 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피 (염기성 알루미나, 50g, 헵탄 중의 10% 내지 80% EtOAc)로 정제하고 미정제 생성물을 EtOAc 및 헵탄으로부터 침전시켜 표제 아미드를 백색 고체로 얻었다; 고 분해능 MS (ESI) 463.0798, 465.0769 (M+H)+; 추정치: 463.0798, 465.0768.
화합물 H (N'-(6-클로로피리다진-3-일)-5-(4-시아노페닐)-N'-메틸-6-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-3-카르보하이드라지드)의 제조
화합물 H를 WO 2014/180741에 기재된 다음 단계들의 절차에 따라 제조하였다:
a) 5-(4-시아노-페닐)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코티닉 애시드 메틸 에스테르
50 mL 4구 플라스크에서, 메틸 5-브로모-6-(2,2,2-트리플루오로에톡시)니코티네이트 (1 g, 3.18 mmol, 당량: 1.00, CAS 등록 번호 1211589-51-3) 및 세슘 카보네이트 (3.11 g, 9.55 mmol, 당량: 3)를 톨루엔 (25 mL) 및 물 (2.8 mL)과 조합하여 무색 용액을 얻었다. 반응 혼합물을 3x 탈기시키고 아르곤으로 퍼지시켰다; 이어서 팔라듐(II) 아세테이트 (14.3 mg, 63.7 μmol, 당량: 0.02), 포타슘 (4-시아노페닐)트리플루오로보레이트 (732 mg, 3.5 mmol, 당량: 1.1, CAS 등록 번호 850623-36-8) 및 부틸디-1-아다만틸포스핀 (68.5 mg, 191 μmol, 당량: 0.06, CAS 등록 번호 321921-71-5)을 연속으로 추가하였다. 각 추가 후 탈기-퍼지 사이클을 반복하였다. 이어서 반응 혼합물을 5시간 동안 120℃까지 가열하였다. 냉각 후, 반응 혼합물을 50mL H2O에 붓고 AcOEt (2x50mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O/염수로 세척하고, 조합하고, Na2SO4 를 통해 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 50 g, 헵탄 중의 50% 내지 100 % CH2Cl2)로 정제하여 최종적으로 표제 화합물 898mg을 백색 폼으로 수득하였다; MS (ESI) 337.2 (M+H)+.
b) 5-(4-시아노-페닐)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코티닉 애시드
25 mL 둥근-바닥 플라스크에서, 상기 제조된 5-(4-시아노-페닐)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코티닉 애시드 메틸 에스테르 (0.891 g, 2.65 mmol, 당량: 1.00)를 THF (7 mL) 및 물 (3.5 mL)과 조합하여 연황색 2상 시스템을 수득하였다. 리튬 하이드록사이드 (127 mg, 5.3 mmol, 당량: 2)를 추가하고 반응 혼합물을 3시간 동안 40℃에서 교반하였으며 이 때 TLC가 반응이 완결되었음을 나타내었다. 워크 업: 10mL H2O 및 7 mL HCl 1N을 추가하고, 혼합물을 AcOEt (2x50mL)로 추출하고, 유기층을 조합하고, 염수로 세척하고, Na2SO4를 통해 건조시켜 진공에서 농축시켰다. 헵탄/EtOAc 9:1로 배산시켜 최종적으로 원하는 표제 생성물 794 mg을 백색 고체로 수득하였다; MS (ESI) 321.2 (M-H)-.
c) N'-(6-클로로피리다진-3-일)-5-(4-시아노페닐)-N'-메틸-6-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-3-카르보하이드라지드
5mL 둥근-바닥 플라스크에서, 상기 제조된 5-(4-시아노-페닐)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코티닉 애시드 (0.050 g, 155 μmol, 당량: 1.00)를 THF (2 mL)와 조합하여 무색 용액을 제공하였다. TBTU (O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, 74.7 mg, 233 μmol, 당량: 1.5, CAS 등록 번호 125700-67-6) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (100 mg, 135 μL, 776 μmol, 당량: 5)을 추가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 3-클로로-6-(1-메틸하이드라진일)-피리다진 (29.5 mg, 186 μmol, 당량: 1.2, CAN 76953-33-8)을 추가하고 반응 혼합물을 밤새 실온으로 유지시켰다. 25 mL 1 M HCl에 붓고, EtOAc (2 x 50 mL)로 추출하고, 1 M NaOH로 세척하고, Na2SO4 를 통해 건조시키고 진공에서 용매 모두를 증발시킨 다음, 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 10 g, CH2Cl2 중 2% 내지 10 % MeOH)하고 헵탄/AcOEt로부터 결정화시켜, 최종적으로 표제 화합물 28mg가 백색 고체로 생성되었다; MS (ESI) 463.1, 465.3 (M+H)+.
화합물 J (6-(4-클로로-페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-피리딘-2-카르복실릭 애시드 (3-이소프로필-이속사졸-5-일메틸)-아미드)의 제조
화합물 J를 WO 2014/180741에 기재된 다음 단계들의 절차에 따라 제조하였다:
표제 화합물은 6-(4-클로로-페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-2-피리딘 카르복실릭 애시드 및 3-(1-메틸에틸)-5-이속사졸메탄아민 (CAS 등록 번호 543713-30-0)로부터 WO 2012/032018의 실시예 64에 기재된 방법에 따라 합성되었다. LC-MS (UV 피크 면적/ESI) 100.0%, 454.4 (M+H)+.
화합물 F (6-(4-클로로페닐)-N-(피리미딘-5-일)-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피콜린아미드, 비교 화합물)의 제조:
6-(4-클로로-페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-피리딘-2-카르복실릭 애시드 (WO 2012/032018, 실시예 AE에 기재된 바와 같이 제조됨)를 DMF (30 ml)와 실온에서 조합하여 무색 용액을 제공하였다. 피리미딘-5-아민, TBTU 및 N-에틸디이소프로필아민을 추가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15h 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 150 mL H2O를 붓고, EtOAc로 추출하였다 (2 x 150 mL). 조합된 유기층을 염수로 세척하고, MgSO4를 통해 건조시키고 증발시켰다. 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 20g, 헥산 중 0% 내지 50% EtOAc)로 정제하였다. LC-MS (ESI) 409.068 (M+H)+.
기타 비교 화합물
Figure pct00006
화합물 C (1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-{2-메틸-1-[5-메틸-2-(3-트리플루오로메틸-페닐)-옥사졸-4-일메틸]-1H-인돌-5-일}-프로판-2-올, LXR 효현제)의 합성은 WO 2005/105791의 실시예 56에 기재되어 있다.
화합물 D (4-{5-[(RS)-(3-브로모-벤젠설폰일)-((SR)-7-클로로-1,2,3,4-테트라하이드로-사이클로펜타[b]인돌-2-일)-플루오로-메틸]-[1,3,4]옥사디아졸-2-일}-벤조익 애시드 부분 LXR 효현제)는 WO 2005/092856의 실시예 113에 기재되어 있다.
화합물 E ((R)-2-[(S)-벤젠설폰일-플루오로-(5-메틸-[1,3,4]옥사디아졸-2-일)-메틸]-7-클로로-1,2,3,4-테트라하이드로-사이클로펜타[b]인돌, 부분 LXR 효현제)는 WO 2005/092856의 실시예 74(6)에 기재되어 있다.
재료 및 방법
시험관내 실험을 위해 동결건조시킨 화합물을 DMSO (Sigma)에서 재구성하고 동일한 용매에 희석하여 20mM, 10mM, 5mM, 1mM 및 0mM 스톡을 생성하였으며 이를 -20℃에서 보관하였다.
생체내 실험들을 위해 동결건조시킨 화합물들을 운반체에 현탁시켰다 (Roche에서 설계된 특정 제제: 1.25% 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 0.10 % 도쿠세이트 소듐 염, 0.18% 프로필 파라벤 소듐, 0.02% 시트르산 일수화물, pH 6). 3번의 짧은 펄스 초음파를 얼음에서 3번 처리하여 미세 입자 현탁액을 확보하였다. 현탁액 중의 화합물 농도를 화합물 C (LXR 효현제)에 대하여 2 mg/ml로 조정하고, ABCA1 유도제인, 화합물 A 및 화합물 G에 대하여는 2가지 농도, 6 mg/ml 및 20 mg/ml로 조정하였다. 화합물 현탁액을 장기간 보관을 위해 -20℃에서, 화합물이 1주일 내 사용될 경우 4℃에서 보관하였다. 용량을 균일하게 전달하기 위해 투여 전 현탁액을 완전히 혼합하였다.
세포 배양
랫트 콜라겐 I형 (Rat Collagen Type I), RPMI 및 ITS를 Corning사로부터 구입하였다. FBS는 GIBCO사로부터 구입하고, 무지방 BSA는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다. 콜레스테롤 유출 분석을 위해, 인간 ApoA1 및 3H-콜레스테롤을 각각 Calbiochem사 및 American Radiolabeled Chemicals사로부터 구입하였다.
조건부 불멸화된 인간 발세포들은 Moin Saleem사의 친절한 선물이었다. 세포들을 콜라겐 I형-코팅된 플라스크에서 씨딩하고 1 X ITS를 보충한 33℃, 5 % CO2의 완전 배지 (RPMI, 10 % FBS, 1 X Pen/스트렙토마이신)에서 증식시켰다. 분화를 위해, 세포들을 ITS 없는 완전 배지에서 2,500개 세포/cm2 밀도로 씨딩하고 37℃ 및 5 % CO2에서 15일 동안 배양하였다.
세포독성
발세포를 96-웰 플레이트 (Greiner사)에 씨딩하고, 14일 동안 분화시켰다. 이어서 세포들을 PBS로 세척하고, 운반체 및 화합물들이 있는 또는 없는 배지 (RPMI-0.2 % BSA)를 이용하여 18 h 동안 37℃, 5 % CO2에서 배양하였다. 테스트한 화합물 농도는 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 20 μM였다. 운반체 (DMSO) 최종 농도는 0.1 %였다. 모든 처리는 중복실험으로 수행되었다. 제조업체의 지침에 따라 ApoTox-Glo Triplex 분석 (Promega)을 사용하여 세포독성을 분석했다. 요약하면, 세포-투과제 (GF-AFC) 및 세포 불투과제 (비스-AAF-R110) 펩티드 기질들을 희석시켜 모든 웰들에 첨가하고 세포들을 37℃, 5 % CO2 에서 1 시간 동안 배양하였다. 일련의 세포들을 세포의 세포독성 양성 대조로서 사포닌 (2 mg/ml)으로 처리하였다. 형광 마이크로플레이트 판독기 (SpectraMax i3)를 사용하여 세포 생존력 및 세포독성 형광 신호들을 각각 400 nm /505 nm 및 485 nm/ 520 nm의 여기/방출에서 측정하였다. 세포 독성 기질을 사용하여 얻은 RFU 신호를 동일한 웰에서 생존가능한 기질을 사용하여 얻은 신호에 대해 정규화하여, 웰 당 상이한 세포 수의 영향을 제거하였다.
콜레스테롤 유출
13일 동안 분화시킨 인간 발세포들을 2% FBS 보유 RPMI 배지에서 24 h 동안 1 μCi/ml의 [3H]-콜레스테롤로 표지하였다. 이어서 세포들을 PBS로 세척하고 운반체 또는 화합물들, 화합물 C (1μM), 화합물 A (1 μM, 5 μM) 및 화합물 G (1 μM, 5 μM, 10 μM)를 보충한 평형 배지 (RPMI-0.2 % 무 지방-BSA)를 이용하여 18h 동안 배양하였다. 이어서 세포들을 PBS로 세척하고, 20 μg/ml의 인간 ApoA1을 보유한 또는 보유하지 않은 평형 배지를 이용하여 18 h 동안 37℃, 5 % CO2에서 배양하였다. 배지를 수집하고, 12,000 x g에서 5분 동안 회전시키고, 200 μl 분취량의 방사능을 액체 섬광으로 계수하였다. 세포들을 PBS로 세척하고, 250 μl 0.1 % SDS, 0.1 M NaOH로 용해시키고 100 μl 분취량의 방사능을 액체 섬광으로 측정하였다. 콜레스테롤 유출은 세포로부터 배지로 이동한 표지된 콜레스테롤의 %로서 다음 식에 의하여 계산되었다:
유출 (%)= 100 x { (cpm 배지)/[(cpm 배지) + (cpm 용해물)] }
ApoA1 매개 콜레스테롤 유출은 ApoA1의 유무에 따른 유출간의 차이로 계산되었다. 모든 처리는 중복실험으로 수행되었다. 3 회 이상의 독립 실험이 수행되었다.
ABCA1 발현
14일 동안 분화된 발세포를 RPMI-0.2 % FBS에서 18 h 동안 기아시킨 다음, 37℃ 및 5 % CO2에서 18h 동안 완전 배지에서 새로 준비된 화합물 희석액으로 처리하였다. 1 μM, 5 μM 및 10 μM의 화합물 농도를 평가하였다. 이어서 세포들을 PBS로 세척하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Roche)이 보충 된 1X 세포 용해 완충액 (Cell Signaling)으로 용해시켰다. 총 단백질 함량은 BCA 방법 (Pierce, Thermoscientific)에 의해 결정되었다. ABCA1 발현은 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.
세포 분별
14일 분화된 발세포를 화합물 C (1μM), 화합물 A (5μM) 및 화합물 G (10μM)로 18 h 동안 처리한 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 긁어 냈다. 세포를 1,000 xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 Roche사의 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 저장성 완충액 (15mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM HEPES 및 1mM DTT)에 재현탁했다. 또한 세포를 유리 다운서 (douncer)에서 발포시키고 2회의 동결 및 해동 주기를 거치게 하여 파열시켰다. 수크로스를 227 mM 최종 농도까지 첨가하고, 세포들을 1,000 x g에서 30 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 이어서 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 10,000 x g에서 15 분 동안 4℃에서 원심분리시켰다. 마이크로 솜 분획을 포함하는 펠렛을 수집하고 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 100,000 x g에서 1 시간 동안 4℃에서 원심분리하였다. 펠렛형 형질막 분획을 수집하고 비막성 세포질 분획을 함유하는 상청액을 Vivaspin 500 필터 컬럼에 농축시켰다. 각 분획에서, ABCA1, 및 형질막 (Na+/K+ 나트륨 펌프) 및 사이토졸 (MEK)에 존재하는 것으로 알려진 단백질을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
웨스턴 블롯
용해물 또는 세포 분획물을 환원 조건하에서 10 분 동안 55℃에서 완충 샘플과 함께 배양시켰다. 용해물에서 총 30 g의 단백질, 및 세포 분획물 프렙에서 수집된 부피의 3분의 1을 4-20 % 겔 (Biorad)에서 SDSPAGE로 분리시킨 후, 단백질들을 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 5 % 우유로 차단시키고 단백질-특이적 항체로 18 h 동안 4℃에서 블롯팅하였다. 다음 항체들을 사용하였다: 마우스 항-ABCA1 (Abcam; 1:1,000), 토끼 항-GAPDH 항체 (Millipore; 1:10,000), 토끼 항-MEK 및 항-Na+/K+ ATPase (Cell Signaling; 1:1,000). PBS-T로 세척한 후, 막을 5% 우유에서 HRP (Promega) 1:10,000에 접합된 항-마우스 및 항-토끼 특이적 항체와 함께 배양했다. 막을 세척하고 웨스턴 브라이트 ECL 기질 (Advansta)을 사용하여 신호를 전개시켰다.
생체내 실험
연구 승인
마우스에서 화합물을 테스트하기위한 연구 프로토콜은 마이애미 대학의 IACUC에 의해 승인되었다. 마이애미 대학교 (UM)는 실험실 동물 복지 사무국의 파일 NIH (A-3224-01, 2014 년 11 월 24 일 발효)에 동물 복지에 대한 승인을 가지고 있다. 또한 UM은 2014 년 12 월부터 등록 58-R-007로 미국 농무부 동물 및 식물 건강 검사 서비스에 등록되었다. 2013 년 10 월 22 일부터 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC International)의 인증위원회는 UM의 전체 인증을 계속하였다.
아드리아마이신-유도된 신장 손상
구입한 암컷 Balb/c 마우스는 6 주령에 Jackson Labs에서 구입하여 실험을 시작하기 전에 2주 동안 우리 시설에 보관되었다.
먼저, 사용할 화합물의 최적 용량을 탐색하고 다른 실험 변수를 조정해야 하는지 결정하기 위해 예비 실험을 수행했다. 이 실험에서, 30마리의 마우스에게 아드리아마이신 (Sigma-Aldrich, 12mg/Kg, 꼬리 정맥 주사를 통해)을 1회 투여한 다음 무작위로 각각 5마리씩 6개 그룹으로 분리했다. 다른 5 마리의 마우스에게 동일한 경로로 0.9 % NaCl을 주입하고 신장 손상이 없는 기준선 그룹으로 사용했다. ADR 주사 24h 후에서 시작하여, 운반체, 또는 상이한 용량의 화합물들이 35일 동안 경구 섭식으로 1일 1회 제공되었다. 테스트된 화합물들의 용량들은 다음과 같았다: LXR 효현제 (화합물 C, 10 mg/Kg); ABCA1 유도제 화합물 A 및 화합물 G (30 mg/Kg 및 100 mg/Kg). 체중 측정 및 단회뇨 수집은 주 1회 이루어졌다. 동물은 ADR 주입 후 35 일차에 희생되었다 (도 1).
첫 번째 실험에서 화합물 A와 G의 용량으로 얻은 신장 기능의 개선을 확인하기 위해 두 번째 실험을 반복하였다. 요약하면, 8주령의 암컷 Balb/c 마우스 30 마리에게 꼬리 정맥을 통해 12mg/Kg의 ADR을 주사하고 마우스를 각각 6 마리씩 5개 그룹으로 무작위로 분배했다. ADR 주사 후 1일차에서 시작하여 28일 동안 1일 1회 경구 섭식으로 동물들에게 운반체 또는 화합물을 제공하였다 다음 용량의 화합물들을 테스트하였다: 화합물 C, 10 mg/Kg/일; 화합물 A, 30 mg/Kg/일 및 화합물 G, 30 mg/Kg/일 및 100 mg/Kg/일. 꼬리 정맥 주사를 통해 식염수 용액을 투여하고 운반체로 처리한 5마리의 동물 그룹을 건강한 기준 대조군으로 사용했다. 체중 측정 및 단회뇨 수집은 주 1회 이루어졌다. 동물들은 ADR 주사 28 일 후 희생되었다 (도 2).
알포트 마우스 모델
129 Col4a3tm1/Dec/J 마우스를 Jackson Labs으로부터 구입하고 사육하여 Col4a3 KO 마우스를 생성하였다. 마우스들을 유전자형으로 분류하고 프라이머: F (TGCTCTCTCAAATGCACCAG), R (CCAGGCTTAAAGGGAAATCC) 및 Rm (GCTATCAGGACATAGCGTTGG)를 사용하여 PCR 반응에서 선택되었다 (5분간 94℃, 이어서 95℃에서 30초, 60℃에서 15초 및 72℃에서 30초 30주기, 및 72℃에서 1분). 129 Col4A3-KO 마우스들을 각각 5마리 마우스 (수컷 및 암컷)의 2개 그룹으로 나누었다. 4주령에 마우스들은 운반체 또는 화합물 G (100 mg/Kg)를 경구 섭식으로 4주 동안 1일 1회 제공받기 시작하였다. 체중 측정 및 단회뇨 수집은 주 1회 수행되었다. 동물들은 8 주령에 처리 종료시 희생되었다. 질환 확립시 Col4A3-KO 마우스의 처리가 마우스의 생존을 연장시킬 것인지를 평가하기 위해 후기 연구가 수행되었다. 이 연구에서, 마우스들을 6주령에서 시작하여 경구 섭식으로 매일 화합물 G (100 mg/Kg/일)를 처리하고 생존을 평가하였다.
DKD 마우스 모델
B6.BKSdb/db 및 B6.BKSdb/+ 마우스들을 Jackson 실험실로부터 구입하였다. 14주령에, 마우스들은 운반체 또는 ABCA1 유도제 화합물 A (30 mg/Kg)를 4주 동안 1일 1회 경구 섭식으로 제공받기 시작했다. 체중 측정 및 소변 수집은 매주 수행되었다. 마우스들은 18주령에 희생되었으며, 혈액을 수집하고 조직을 처리하여 하기와 같이 분석하였다.
생쥐의 표현형 분석
기준선 및 희생시에 모든 마우스에 대해 단회뇨 샘플들을 수집하였다. 알부민 ELISA 키트 (Bethyl 실험실)와 크레아티닌 측정을 위한 비색 분석 (Stanbio)을 사용하여 소변 알부민과 크레아티닌을 측정했다. 알부민뇨를 계산하고 mg의 크레아티닌으로 나눈 μg의 알부민으로 표현하였다. 당뇨병 마우스 모델에서, 체중과 혈당을 격주로 측정하였다.
희생시 혈액을 헤파린화 튜브에 수집하고 마우스들을 등장성 식염수 용액으로 과심실 관류를 통해 관류시켰다. 신장 피질을 조심스럽게 절제하고 다음 분석을 위해 추가로 절편화하였다 : 발세포 수 결정, 지질 방울 염색, 전자 현미경검사 (EM), 신장 지질 함량 분석, 병리학적 평가를 위한 PAS& HE 염색.
세포 수 결정
면역형광 염색 및 지질 방울의 추가 분석을 위해 신장 피질 절편들을 OCT에 침지시켰다. 구체적으로, 사구체 단면 당 발세포 수는, 절단되어 WT1 항체 (1:200, Santa Cruz)로 염색되고 prolong GOLD DAPI 봉입제로 봉입된 4 μm-두께 조직 절편을 사용하여 결정되었다. 40x 습식 대물렌즈가 구비된 Leica SP5 도립 현미경을 사용하여 공초점 현미경을 이용하여 이미지들을 얻었다. 마우스 당 20개 사구체를 정량하였다.
지질 방울 염색 여과 Oil-Red O-이소프로판올 용액 (Electron Microscopy Science, PA)을 물로 희석시켰다 (6:4). 4 μm 신장 절편을 100 μl 새로 준비한 Oil-Red O 용액 (ORO)과 함께 15분 동안 배양하고 지질 침착을 검출하기 위해 Hematoxylin Harris Hg Free (VWR, PA)로 대비염색하였다. 사구체 염색을 광학 현미경 (Olympus BX 41, Tokyo, 일본)을 사용하여 평가하였다.
전자 현미경검사. 투과 전자 현미경검사를 위해 신장 피질 절편들을 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중 4% 파라포름알데하이드, 1% 글루타르알데하이드에 넣었다. 1 μm 사구체 기저막 당 발 돌기들을 정량하였다.
신장 지질 종 분석. 신장 피질 절편을 스냅 동결시키고 지질 추출 및 콜레스테롤 함량 결정에 사용하였다. 조직을 얼음 위의 유리 다운스에서 2 mM 포타슘 포스페이트 완충액에 균질화시켰다. 1 ml 헥산: 이소프로판올 (3:2)로 2회 연속 30분 추출동안 100 μl 균질화물 (~5-10 mg 조직) 중의 지질을 추출하였다. 이후 지질을 함유하는 용매를 질소 대기에서 건조시켰다. 이어서 지질을 이소프로판올: NP-40 (9:1)을 사용하여 재구성하고 제조업체의 프로토콜에 따라 콜레스테롤 함량을 Amplex red 콜레스테롤 분석 키트 (Invitrogen)를 사용하여 정량하였다. 제조업체의 지침 (Cayman)에 따라 지질 추출물 중의 트리글리세라이드를 비색 키트를 사용하여 분석하였다. 총 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르를 효소 형광측정법을 사용하여 분석하였다. 총 콜레스테롤의 경우, 신장 지질 추출물을 분석 완충액 (100 mM 포타슘 포스페이트, 50 mM NaCl, 5 mM 콜산, 0.1% Triton X-10, pH 7.4)에 희석시키고 1 U/ml 콜레스테롤 옥시다제, 1 U/ml 콜레스테롤 에스테라제 1 U/ml 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 및 75 μM Amplex Red의 최종 농축액으로 보충된 동일한 완충액과 함께 배양하였다. 반응을 검은색 불투명 96웰 플레이트 (Greiner)에서 30분 동안 37℃에서 배양하고 530 nm 여기 및 580 방출을 사용하여 마이크로플레이트 판독기 (Spectramax i3X, Molecular Devices)에서 형광을 측정하였다.
콜레스테롤 에스테르는 Mizoguchi 외 (Mizoguchi, 2004)의 문헌에 기재된 직접적 방법을 사용하여 분석하였다. 간단히 말하면, 150 μl의 FC 분해 시약 (상기 분석 완충액 중 45 U/ml 소 카탈라제 및 1 U/ml 콜레스테롤 옥시다제)을 최대 1 mM 총 콜레스테롤을 함유하는 25 μl 샘플에 추가하였다. 유리 콜레스테롤을 37℃에서 밤새 분해시킨 다음 75 μl의 4X 콜레스테롤 에스테르 검출 시약 (1 U/ml 콜레스테롤 옥시다제, 4 U/ml 콜레스테롤 에스테라제, 24 U/ml 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 300 μM Amplex Red)을 추가하였다. 반응을 37℃에서 30분 동안 배양하고 총 콜레스테롤에 대한 형광을 상기 기재한 바와 같이 측정했다. 분석 감도 및 특이성을 검증하기 위해 1 mM의 콜레스테롤 및 5 μM의 콜레스테롤 올레이트 표준을 내부 대조군으로 포함시켰다.
병리학적 평가. 신장 피질 절편을 파라핀-침지시키고 과요오드산-쉬프 (PAS) 및 HE를 위해 4μm 두께로 절단하였다. 반-정량적 분석 (스케일 0-5) 또는 메산지움 증식이 있는 사구체의 퍼센트 (%)를 기반으로, 메산지움 증식 점수를 이중-맹검 방식으로 수행하여 점수를 매겼다.
통계
통계.　모든 값은 SD와 함께 평균으로 나타낸다. Prism GraphPad 7 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 1 이상의 화합물 용량을 사용하고 그룹들이 정규 데이터 분포를 보인 경우 1-원 ANOVA를 사용하여 결과를 분석하였다. 차이가 관찰된 경우, 대조군 (운반체)의 평균을 Dunnett 테스트를 사용하여 각 그룹의 평균과 비교하였다. 다중 비교를 위해 Tukey 테스트를 수행하였다.
생체내 연구를 위해, 운반체 및 화합물-처리 그룹들을 양측 t-검정을 사용하여 비교하였다. 불균등 분산의 경우 Welch 보정이 사용되었다. 정규성 분포를 주장할 수 없는 경우, 그룹들을 또한 맨-휘트니 검정을 사용하여 비교하였다. P 값 < 0.05 %는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
화합물 세포독성
우리는 배양된 인간 발세포에서 안전하게 사용할 수 있는 화합물 농도 범위를 결정하기 위해 세포 세포독성 분석을 수행하였다.
모든 화합물들은 세포독성 징후 없이 최대 10 μM 농도로 사용될 수 있다. 그러나, 화합물 A 및 C를 사용할 경우 5 μM 농도를 초과하지 않기로 결정하였는데, 이들 두 개 화합물들은 20 μM에서 유의한 독성을 유발하였기 ‹š문이다 (도 3)
ABCA1 발현 및 콜레스테롤 유출
우리는 동물 연구에서 추가로 사용하기 위해 발세포에서 ABCA1의 기능적 발현을 유도함에 더 우수한 화합물을 선택하기 위해 시험관내 실험을 수행했다. 따라서, 우리는 ABCA1 단백질 발현, 형질막에서 ABCA1 국소화 및 ApoA1-매개 콜레스테롤 유출에 대한 화합물들의 효과를 연구하였다.
화합물들에 의해 유도된 ABCA1 발현은 웨스턴 블롯으로 연구하였다. 모든 LXR 효현제, 화합물 C, 화합물 E 및 화합물 D는 1 uM 만큼 낮은 용량에서 발세포에서 ABCA1 발현을 두드러지게 증가시켰다. 테스트된 이들 ABCA1 유도제들 (화합물 A, 화합물 F 및 화합물 G) 중에서, 화합물 A, 및 화합물 G만이, ABCA1 발현을 증가시켰으나, 10 uM에서는, LXR 효현제들만큼 두드러지게 증가시키지는 않았다 (도 4a).
관찰된 ABCA1 발현 증가가 보다 기능적인 단백질의 생성과 관련있는지 여부를 알아보기 위해, 우리는 1 μM 화합물 C, 5 μM 화합물 A 및 10 μM 화합물 G로 처리된 발세포의 세포 분획법을 수행하였다. 사용된 약물 농도에 따른 ABCA1의 발현 증가를 먼저 검증하고 (도 4b) 수득된 분획들 각각에서 ABCA1 국소화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 성공적인 세포 분획을 확인하기 위해 수득된 분획들을 또한 형질막에 위치한 것으로 공지된 단백질, 사이토졸 분획, Na+/K+ ATPase 및 MEK 각각에 대하여 블롯하였다 (도 4c-e). 사용된 3가지 화합물들의 용량들은 형질막에서 ABCA1 국소화를 촉진시켰으며 (도 4c), 예상대로, 비막성 사이토졸 분획에서 ABCA1은 발견되지 않았다. ABCA1 유도제 화합물 A 및 화합물 G로 처리된 세포들의 마이크로솜 구획에서 ABCA1이 더 적게 발견되었는데 (도 4d), 이는 이들 화합물들이 LXR 효현제 보다 형질막에서 이러한 단백질의 국소화를 촉진시킴에 더 효과적임을 시사한다. 또한, 콜레스테롤 담체로서 ApoA1을 사용하여 콜레스테롤 유출 분석을 수행하였다. ABCA1이 세포들로부터 초기 HDL 입자들로의 콜레스테롤 전달을 위해 ApoA1과 특이적으로 상호작용하기 때문에 이 분석은 콜레스테롤 유출에 대한 ABCA1의 기능을 측정한다. ApoA1-매개 유출의 유의한 증가는 1 μM 화합물 C (LXR 효현제), 5 μM 화합물 A 및 10 μM 화합물 G에서 달성될 수 있었다 (도 4 d-e).
이러한 시험관내 실험들을 기반으로 우리는 LXR 효현제 화합물 C와 함께 신장 손상의 동물 모델에서 테스트하기 위해, ABCA1 유도제 화합물 A 및 화합물 G를 참조로 선택하였다.
ABCA1 유도제는 실험 FSGS로부터 보호한다.
신장 손상의 ADR 모델은 단백뇨 신장 질환의 약물 유도 모델이며 가장 널리 사용되는 국소 분절 사구체경화증 (FSGS)의 실험 모델로 남아있다. 시험관내 실험들로부터 선택된 화합물들을 사용하여 용량 범위 찾기 실험을 수행하였다.
ADR 주사는 심각한 일시적 단백뇨와 체중 감소를 유도했다. 알부민뇨 및 체중을 매주 확인하였다. LXR 효현제로 처리된 그룹들에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (화합물 C, 도 5a). 그러나, 단백뇨는 30 mg/Kg의 화합물 A 및 100 mg/Kg의 화합물 G를 투여받은 그룹들에서 감소되었으며 (도 5,b 및 e), 30 mg/Kg의 화합물 G를 투여받은 그룹에서는 보다 적은 정도로 감소되었다 (도 5d). 유사하게, ADR을 주사한 동물들은 10-20 % 체중 감소를 경험하였으며 이는 30 mg/Kg의 화합물 A 및 100 mg/Kg의 화합물 G로 처리된 동물들에서는 예방되었으나 (도 5, g 및 j) LXR 효현제로 처리된 동물에서는 그렇지 않았다 (도 5, f).
두 번째 독립 생체내 실험에서, 우리는 보다 많은 수의 마우스를 이용하여 이전 실험에서 유익한 것으로 밝혀진 화합물 A 및 G의 용량, 즉, 30 mg/Kg의 화합물 A 및 100 mg/Kg의 화합물 G를 선택하였다. 이전 실험에서와 유사하게, 두 가지 ABCA1 유도제 모두는 알부민뇨 및 체중 감소를 감소시켰다 (도 6b).
화합물 G가 가장 유익한 효과를 가지는 것으로 밝혀졌으며, 신장 질환의 ADR 모델이 손상된 신장 기능을 나타내지 않았기 때문에, 이 화합물로 처리되었던 동물들에서 추가로 정량적 조직학 연구를 수행하였다. 신장 피질에 관한 맹검 병리학 연구에서, 100 mg/Kg/일의 화합물 G를 투여받은 동물들에서 전체 및 분절 사구체 경화증, 발세포 비대 및 과형성, 세뇨관 미세낭종 및 간질성 염증의 감소가 나타났다 (도 7). 이들 데이터는 함께 화합물 G가 아드리아마이신에 의해 유발된 FSGS의 특징을 감소시킴에 매우 효과적이며 비교제로서 평가된 LXR 효현제 보다 보다 효과적이었음을 입증하였다.
우리는 콜레스테롤 대사에 영향을 미칠 것으로 예상되는 화합물을 투여하면서 실험 동물의 혈중 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수치를 측정하였다. 두 임상 매개변수 모두에 있어서 유의한 차이는 발견되지 않았다 (표 1 및 2).
표 1: ADR 주사 후 35일 동안 운반체, LXR 효현제 (화합물 C) 및 ABCA1 유도제 (화합물 A 및 화합물 G)로 처리한 동물들의 혈중 콜레스테롤 및 트리글리세라이드.
Figure pct00007
표 2: ADR 주사 후 28일 동안 운반체, LXR 효현제 (화합물 C) 및 ABCA1 유도제 (화합물 A 및 화합물 G)로 처리된 동물들의 혈중 콜레스테롤 및 트리글리세라이드.
Figure pct00008
신장 손상 설정에서 신장 조직의 지질 침착을 기록하였다. ADR을 주사한 동물에서 지질 축적이 존재하는지 여부 및 화합물 G가 이러한 효과를 감소시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 Oil Red O (ORO) 염색을 수행하였다. ADR-주사된 마우스의 신장에서 지질 방울들의 유의한 침착이 발견되었으며, 이는 화합물 G로 처리된 동물에서 유의하게 감소되었다 (도 8). 실제로, 운반체를 투여받은 ADR-주사된 마우스는 신장 피질에서 유의한 지질 침착을 보였으며, 대조적으로, 화합물 G는 ADR에 대한 반응으로 사구체 지질의 축적을 완전히 예방하였는데, 이는 연령-일치 정상 대조 마우스에 비해 신장 피질에서 검출가능한 지질 축적이 없음을 나타낸다.
신장 조직에 축적된 지질의 종류를 결정하기 위하여, 신장 피질에서의 지질을 추출하고 이를 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르에 대해 분석하였다. ADR 또는 일반 식염수 용액을 주사한 동물들의 신장들 간에 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤의 함량에 있어서 차이를 발견할 수 없었다. 그러나, 우리는 ADR-주사된 마우스에서 에스테르화 콜레스테롤 함량이 유의하게 더 높음을 발견하였는데, 이는 화합물 G 처리에 의해 유의하게 감소되었다 (도 9a-c). 신장 조직에서 검출된 알부민뇨의 중증도와 콜레스테롤 에스테르 함량 사이의 강한 상관관계가 존재하였으나 (도 9d) 분석된 다른 지질 종들에서는 그렇지 않았다 (도 9e 및 f). ADR-주사된 마우스의 화합물 G 처리는 콜레스테롤 에스테르의 축적을 예방하였으며 특정 이론에 얽매이지 않고 이 화합물은 ABCA1의 상향조절을 통해 사구체 콜레스테롤 제거를 개선할 수 있다고 여겨진다.
우리는 다음으로 혈청학에 의한 화합물 C, A 및 G 독성을 조사하였다. 보다 구체적으로, 우리는 간 독성 및 혈액 이혼화증이 이 화합물들과 관련이 있는지를 결정하기 위해 모든 처리된 동물들의 헤마토크릿, 헤모글로빈 백혈구 수 및 간 트랜스아미나제 ALT 및 AST를 결정하였다. 실험 마우스들에서 이러한 독성들의 명확한 징후는 발견되지 않았다 (표 3).
표 3: 화합물 C, A 또는 G로 처리된 동물은 운반체 처리된 대조군과 비교했을 때 화합물로 35 일 처리 후 WBC, 헤모글로빈, 헤마토크리트 및 ALT 및 AST 트랜스아미나제 수준에 이상이 나타나지 않았다. 데이터는 각 매개변수의 평균과 표준 편차를 나타낸다.
Figure pct00009
최적 용량의 화합물 G로 처리된 동물은 실험 내내 ADR을 투여받은 동물보다 더 나은 외모를 가졌다. 이는 처리 3주차 및 4주차 동안 특히 두드러졌다 (도 10).
화합물 G는 진행성 신장 질환 (알포트 증후군)의 마우스 모델에서 신장 부전으로부터 보호한다.
처리되지 않은 CoL4a3 KO 마우스는 4주령과 8주령 사이에 중증 알부민뇨와 높은 BUN 및 혈청 크레아티닌 수준을 발달시킨다. 이들 마우스들은 8주령까지 ESRD에 도달하며 그 시점 이후에는 생존하지 못한다.
이러한 알포트 증후군에서 화합물 G의 신장보호 효과를 연구하기 위하여, 우리는 CoL4a3 KO 마우스를 4주령에서 시작하여 100 mg/Kg의 화합물 G 또는 운반체로 4주 동안 처리하였다. 100 mg/Kg의 화합물 G로 처리된 동물들은 운반체만을 투여받은 동물들에 비해 ESRD로의 진행 지연을 보였으며, 알부민뇨, BUN 및 혈청 크레아티닌이 현저히 적었다 (도 11 참고). 화합물 G로 처리된 동물은 또한 운반체를 투여받은 동물보다 체중이 적게 감소했다.
신장 절편의 조직학적 분석은 운반체 처리된 Col4a3 KO에서보다 화합물 G 처리된 Col4a3 KO 마우스에서 메산지움 증식이 유의하게 적음을 나타내었다. 신장 부전이 확실한 마우스에서 화합물 G로의 처리가 생존을 개선시키는지 조사하기 위해 별도의 연구가 수행되었다. 실제로, 비교적 진행된 CKD가 있는 6주령 마우스에서 화합물 G 처리가 시작되었을 때, 화합물 G 처리된 Col4a3 KO 마우스에서 신장 기능의 개선은 사망률 감소와 관련되어, 수명을 거의 15% 연장시켰다.
마지막으로, 8주령 Col4a3 KO 마우스의 신장 피질 절편은 유의한 지질 축적을 보였으며 (Oil-red O 염색 증가), 이는 화합물 G를 투여받은 동물들에서 감소되었다 (도 13 참고). ADR 모델에서의 이전 결과들과 일치되게, 야생형 한배새끼에서 유의하게 더 높았던 Col4a3 KO 마우스 신장에서의 콜레스테롤 에스테르는, 화합물 G 처리에 의해 유의하게 감소되었다.
화합물 A는 당뇨병성 신장 질환의 마우스 모델로부터 부분적으로 보호한다.
ABCA1 증가는 발세포 손상 및 DKD를 역전시킨다.
우리는 비만 당뇨병 db/db 마우스 모델에서 DKD에 대한 치료 표적으로서 ABCA1을 검증하는 것을 목표로 하였다. ABCA1의 약리학적 유도제로 처리된 db/db 마우스는 운반체 처리 db/db 마우스에 비해 처리 2주 후 (16주차) 알부민뇨가 감소되었으며 처리 4주 후 (18주차) 훨씬 더 감소되었다 (도 12A). 혈중 요소 질소 (BUN)가 유의하게 개선된 것으로 밝혀졌으며 (도 12B), 이는 db/db 마우스에 비해 ABCA1 유도제 (화합물 A) 처리 그룹에서 콜레스테롤 에스테르의 유의한 감소와 상관관계가 있다 (도 12C-D). 신장 피질 절편들을 사용하여 다양한 조직학적 평가를 하였으며, 평가 결과는 db/db 마우스에서 ABCA1 유도제 처리는 다음을 개선함을 보여주었다: WT1 양성 세포들을 정량하여 결정된 발세포 수 (도 12E-F), PAS 염색된 절편을 사용하여 결정된 메산지움 증식 (도 12G-H), 및 TEM 이미지를 사용하여 결정된 발세포 발 돌기 소실 (도 12I-J).

Claims (27)

  1. 신장 질환 치료에 사용하기 위한 화합물로서, 상기 화합물은 ABCA1 유도제 화합물인, 화합물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 화합물:
    Figure pct00010

    상기 식에서,
    A1 및 A2 중 하나는 N이고, A1 및 A2 중 다른 하나는 CH이고;
    R1은 C1-7-알킬, C3-7-사이클로알킬, C3-7-사이클로알킬-C1-7-알킬, C1-7-알콕시-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알킬, 헤테로사이클릴-C1-7-알킬 및 헤테로아릴-C1-7-알킬로 구성된 군에서 선택되되, 여기서 상기 헤테로사이클릴 기는 치환되지 않거나 옥소로 치환되고, 상기 헤테로아릴 기는 치환되지 않거나 저급 알킬로 일- 또는 이-치환되고;
    R2 및 R6은 서로 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
    R3 및 R5는 서로 독립적으로 수소, C1-7-알킬, C1-7-알콕시, 할로겐, 할로겐-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알콕시 및 시아노로 구성된 군에서 선택되고;
    R4는 수소, C1-7-알킬, C1-7-알콕시, 할로겐, 할로겐-C1-7-알킬, 할로겐-C1-7-알콕시, 아미노 및 시아노로 구성된 군에서 선택되고;
    R7은 C1-7-알킬, C3-7-사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 페닐 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택되되, 상기 사이클로알킬은 치환되지 않거나 하이드록시로 치환되고, 상기 헤테로사이클릴은 N, O 및 S에서 선택된 1, 2 또는 3개 헤테로원자를 포함하는 3 내지 7개 고리 원자를 가지며, 치환되지 않거나 하이드록시 또는 옥소로 치환되고, 상기 페닐은 치환되지 않거나 C1-7-알킬, 하이드록시, C1-7-알콕시, 시아노, 할로겐 및 할로겐-C1-7-알킬로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개 기로 치환되고, 상기 헤테로아릴은 치환되지 않거나 C1-7-알킬, 하이드록시, C1-7-알콕시, 시아노, 할로겐 및 할로겐-C1-7-알킬로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개 기로 치환되고;
    G는, m이 0 또는 1에서 선택되는 -(CH2)m-, 및 R8이 수소 또는 C1-7-알킬인 -NR8-로 구성된 군에서 선택된다.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    G는 결합이고, R7은 C3-7-사이클로알킬이며, 상기 사이클로알킬은 치환되지 않거나 하이드록시로 치환됨을 특징으로 하는, 화합물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    R7은 하이드록시로 치환된 사이클로헥실임을 특징으로 하는, 화합물.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    R2 및 R6은 각각 수소이고, R4는 할로겐이고, R3 및 R5 중 하나는 할로겐이고 R3 및 R5 중 다른 하나는 수소임을 특징으로 하는, 화합물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    R1은 할로겐-C1-7-알킬임을 특징으로 하는, 화합물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    R1은 -CF3, -CHF2, -CH2Cl, -CH2CF3, -CH(CF3)2, -CF2-CF3에서 선택됨을 특징으로 하는, 화합물.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    6-(3,4-디클로로페닐)-N-[(1R,2R)-2-하이드록시사이클로헥실]-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)피리딘-2-카르복스아미드임을 특징으로 하는, 화합물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    5-(3,4-디클로로-페닐)-N-((1R,2R)-2-하이드록시-사이클로헥실)-6-(2,2,2-트리플루오로-에톡시)-니코틴아미드임을 특징으로 하는, 화합물.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 질환은 만성 신장 질환, 일차 또는 이차 사구체 질환 또는 단백뇨성 신장 질환에서 선택됨을 특징으로 하는, 화합물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 사구체 질환은 알포트 증후군 또는 국소 분절 사구체경화증임을 특징으로 하는, 화합물.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 신장 질환은 당뇨병성 신장 질환에서 선택됨을 특징으로 하는, 화합물.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
    경구 투여용으로 제형화됨을 특징으로 하는, 화합물.
  14. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
    국소, 비강내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 유리체내, 척수강내 또는 경피 투여용으로 제형화됨을 특징으로 하는, 화합물.
  15. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
    1일 용량은 20 내지 800 mg/일임을 특징으로 하는, 화합물.
  16. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
    1일 용량은 200 mg/일임을 특징으로 하는, 화합물.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서,
    투약 요법은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 3일에 1회, 주 1회, 2주에 1회, 또는 월 1회임을 특징으로 하는, 화합물.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서,
    부하 용량 요법은 첫 7일, 14일, 또는 30일 동안 용량의 2배임을 특징으로 하는, 화합물.
  19. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서,
    안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 약물; RAS 차단제; 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB); 단백질 키나제 C (PKC) 억제제; AGE-의존 경로의 억제제; 항염증제; GAG; 피리독사민; 엔도텔린 길항제, COX-2 억제제, PPAR-γ 길항제 및 기타 화합물, 가령, 아미포스틴, 캅토프릴, 사이클로포스파미드, 소듐 티오설페이트, 트라닐라스트 또는 사이클로덱스트린 및 이들의 유도체, 비타민 D 유도체, 항-고혈당제 및 항-고콜레스테롤혈증제로 구성된 군으로부터 선택된 화합물과 동시에, 순차로 또는 별도로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 화합물.
  20. 청구항 2 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    신장 질환의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  21. 청구항 1 내지 16에 정의된 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 포함하는, 청구항 1 내지 20 중 한 항에 따라 사용하기 위한 약학 조성물.
  22. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 정의된 ABCA1 유도제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 질환 치료를 필요로 하는 개체의 신장 질환 치료 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 ABCA1 유도제는 국소, 경구, 비강내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 유리체내, 척수강내 또는 경피 경로에 의해 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
  24. 청구항 22 또는 23에 있어서,
    투여는 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 3일에 1회, 주 1회, 2주에 1회, 또는 월 1회, 바람직하게는 1일 1회임을 특징으로 하는, 방법.
  25. 청구항 22 또는 23에 있어서,
    청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 정의된 ABCA1 유도제의 1일 용량은 20 내지 800 mg/일 범위임을 특징으로 하는, 방법.
  26. 청구항 22 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ABCA1 유도제는 치료적 유효량의 안지오텐신-전환 효소 억제제 또는 안지오텐신-수용체 차단제와 조합하여 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
  27. 청구항 22 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ABCA1 유도제는 안지오텐신- 전환 효소 (ACE) 억제제 약물; RAS 차단제; 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB); 단백질 키나제 C (PKC) 억제제; AGE-의존 경로의 억제제; 항염증제; GAG; 피리독사민; 엔도텔린 길항제, COX-2 억제제, PPAR-γ 길항제 및 기타 화합물, 가령, 아미포스틴, 캅토프릴, 사이클로포스파미드, 소듐 티오설페이트, 트라닐라스트 또는 사이클로덱스트린 및 이들의 유도체, 비타민 D 유도체, 항-고혈당제 및 항-고콜레스테롤혈증제로 구성된 군으로부터 선택된 치료적 유효량의 화합물과 조합하여 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
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