TW202019486A - 用於治療腎臟病之化合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於ABCA1誘導劑化合物，用於治療腎臟病，且特別是慢性腎病、腎小球疾病或蛋白尿腎病，諸如奧爾波特症候群(Alport syndrome)、局部區段性腎小球硬化及糖尿病性腎病。

Description

用於治療腎臟病之化合物
本發明係關於用於治療腎臟病，且特定言之，慢性腎病、腎小球疾病或蛋白尿腎病，諸如奧爾波特症候群(Alport syndrome)、局部區段性腎小球硬化及糖尿病性腎病之ABCA1誘導劑化合物。
導致需要透析或腎臟移植之末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的慢性腎病(Chronic Kidney disease，CKD)為日益增長的流行病，影響世界範圍內數百萬患者(Bello AK等人, JAMA, 317: 1864, 2017)。儘管糖尿病仍為世界範圍內ESRD之最常見病因，但諸如高血壓、囊性腎病及絲球體腎炎之其他病因造成大部分普遍ESRD (USRDS資料庫)。許多此等病症可伴隨在輕度蛋白尿至重度腎病範圍蛋白尿範圍內之蛋白尿存在，其中重度蛋白尿表示發展至ESRD之主要風險因素。雖然腎替代策略改良患者死亡率，但當前治療策略減緩且未中斷CKD之發展。若干干預研究未能表明有效性。此主要歸因於以下事實：迄今為止所測試之許多干預靶向晚期腎病而非早期致病過程。
目前，本發明之治療策略在於使用有助於減少蛋白尿且減緩腎小球硬化發展之血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑及血管收縮素受體阻斷劑(ARB)。迄今為止，患有蛋白尿腎病之患者已用ACE抑制劑治療，該等ACE抑制劑包括但不限於：貝那普利(Benazepril)、西拉普利(Cilazapril)、依那普利(Enalapril) (Vasotec)、福辛普利(Fosinopril) (Monopril)、賴諾普利(Lisinopril) (Zestril、Prinivil)、培哚普利(Perinopril)、雷米普利(Ramipril)、喹那普利(Quinapril) (Accupril)、群多普利(Trandolapril)以及ARB，其包括坎地沙坦(Candesartan) (Atacand)、依普羅沙坦(Epresartan)、依貝沙坦(Irbesartan)、氯沙坦(Losartan) (Cozaar)、替米沙坦(Telmisartan)、纈沙坦(Valsartan)。用於治療FSGS中之蛋白尿的唯一經批准藥物為ACTHar。許多未經檢驗而使用之其他免疫抑制劑亦已實施於數種蛋白尿腎病，諸如FSGS中。此等包括潑尼松(prednisone)(或通常類固醇)、利妥昔單抗(rituximab)、鈣調神經磷酸酶抑制劑(環孢靈及他克莫司(tacrolimus))、雷帕黴素(rapamycin)、阿巴西普(abatacept)、黴酚酸嗎啉乙酯(mychophenolate mophetyl)。正在使用其他策略，諸如輔酶Q10、魚油、維生素D衍生物、無麩質飲食、別嘌呤醇、螺內酯、LDL血球分離術、血漿清除術。
然而，許多此等治療係基於病例系列，不受隨機化研究支持，通常伴隨著嚴重副作用，且未經設計以靶向特定致病機制。此外，對此等治療中之任一者的反應為不可預測的。因此，當前使用之藥物未能提供安全且有效的治療。更特定言之，長期以來對新穎藥學製劑之需要並未得到滿足，該等藥學製劑用於預防或治療患有腎小球病症及更廣泛地慢性腎病之患者。
本發明者進一步研究用於治療患有慢性腎病，尤其原發性腎小球疾病，諸如奧爾波特症候群及FSGS及繼發性腎小球疾病，諸如糖尿病性腎病(diabetic kidney disease，DKD)之患者的新治療策略。其顯示一些吡啶甲醯胺化合物在治療此類腎病方面具有極有前景的效果。
吡啶甲醯胺已描述為ATP結合盒轉運體A1蛋白之小分子誘導劑(ABCA1誘導劑)。此類吡啶甲醯胺例如描述於國際專利申請公開案第WO 2011/029827號、第WO 2012/032018號、第WO 2013/037703號及第WO 2014180741號。
因此，本發明係關於一種用於治療腎病之化合物，其中該化合物為ABCA1誘導劑化合物。
在一特定實施例中，此類ABCA1誘導劑化合物由下式I表示：
Figure 02_image003
其中 A1 及A2 中之一者為N及A1 及A2 中之另一者為CH； R1 係選自由以下各者組成之群：C1-7 烷基、C3-7 環烷基、C3-7 環烷基C1-7 烷基、C1-7 烷氧基-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷基、雜環基-C1-7 烷基，其中雜環基未經取代或經側氧基取代，及雜芳基-C1-7 烷基，其中雜芳基未經取代或經低碳烷基單取代或雙取代； R2 及R6 彼此獨立地為氫或鹵素； R3 及R5 彼此獨立地選自由以下各者組成之群：氫、C1-7 烷基、C1-7 烷氧基、鹵素、鹵素-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷氧基及氰基； R4 係選自由以下各者組成之群：氫、C1-7 烷基、C1-7 烷氧基、鹵素、鹵素-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷氧基、胺基及氰基； R7 係選自由以下各者組成之群：C1-7 烷基、C3-7 環烷基，該環烷基未經取代或經羥基取代、雜環基，該雜環基具有3至7個環原子，包含一個、兩個或三個選自N、O及S之雜原子且未經取代或經羥基或側氧基取代、苯基，其中苯基未經取代或經一個或兩個選自由以下各者組成之群的基團取代：C1-7 烷基、羥基、C1-7 烷氧基、氰基、鹵素及鹵素-C1-7 烷基，以及雜芳基，其中雜芳基未經取代或經一個或兩個選自由以下各者組成之群的基團取代：C1-7 烷基、羥基、C1-7 烷氧基、氰基、鹵素及鹵素-C1-7 烷基，及 G係選自由以下各者組成之群：-(CH2 )m -，其中m選自0或1、及-NR8 -，其中R8 為氫或C1-7 烷基， 及其醫藥學上可接受之鹽。
在特定實施例中，G為一鍵且R7 為C3-7 環烷基，該環烷基未經取代或經羥基取代。
在可與先前實施例組合之特定實施例中，R7 為經羥基取代之環己基。
在可與先前實施例組合之特定實施例中，R2 及R6 各自為氫，R4 為鹵素，且R3 及R5 中之一者為鹵素且R3 及R5 中之另一者為氫。
在可與先前實施例組合之特定實施例中，R1 為鹵素-C1-7 烷基。通常，R1 可選自-CF3 、-CHF2 、-CH2 Cl、-CH2 CF3 、-CH(CF3 )2 、-CF2 -CF3 。
在一較佳實施例中，如本文所描述使用之ABCA1誘導劑化合物為6-(3,4-二氯苯基)-N-[(1R,2R)-2-羥基環己基]-5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-甲醯胺。
在另一較佳實施例中，如本文所描述使用之ABCA1誘導劑化合物為5-(3,4-二氯-苯基)-N-((1R,2R)-2-羥基-環己基)-6-(2,2,2-三氟-乙氧基)-菸鹼醯胺。
在可與先前實施例組合之特定實施例中，ABCA1誘導劑化合物適用於治療慢性腎病、原發性及繼發性腎小球疾病或蛋白尿疾病。通常，此類ABCA1誘導劑化合物可用於治療奧爾波特症候群、局部區段性腎小球硬化或糖尿病性腎病。
在可與先前實施例組合之特定實施例中，如本文所描述使用之ABCA1誘導劑化合物經調配用於經口投與。
在另一特定實施例中，如本文所描述使用之ABCA1誘導劑化合物經調配用於局部、鼻內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、玻璃體內、鞘內或經皮投與。
本發明亦關於一種治療有需要個體之腎病之方法，其包含投與如上文所定義之治療有效量之ABCA1誘導劑。
在此類方法之特定實施例中，該ABCA1誘導劑可與治療有效量之另一藥劑(例如，血管收縮素轉化酶抑制劑或血管收縮素受體阻斷劑)同時、分開或依序投與。
本發明者已表明，ABCA1誘導劑化合物在治療腎臟病，且尤其是腎小球疾病，諸如奧爾波特症候群或局部區段性腎小球硬化，或其他慢性腎病，諸如糖尿病性腎病中具有非常有希望的效果。化合物不僅降低此等病症中之蛋白尿且改良腎功能且防止末期腎病發展。
根據本發明使用之 ABCA1 誘導劑化合物 如本文所使用，術語「ABCA1誘導劑化合物」係指能夠間接或直接誘導ATP結合盒轉運體蛋白(ABCA1)之表現量或活性的化合物。轉運體ABCA1已知為細胞膽固醇及磷脂穩態之主要調節子。特定言之，ABCA1調節膽固醇及磷脂至乏脂質性脂蛋白元(apo-A1及apoE)之流出，其隨後形成新生高密度脂蛋白(HDL)。用於測定細胞中之ABCA1蛋白質之上調的活體外分析已描述於例如WO2012/031817中。彼等活體外分析包括但不限於WO2012/031817中所描述之膽固醇流出分析或螢光apo-A1結合分析。
吡啶甲醯胺已描述為ATP結合盒轉運體A1蛋白之小分子誘導劑(ABCA1誘導劑)。此類吡啶甲醯胺例如描述於國際專利申請公開案第WO 2011/029827號、第WO 2012/032018號、第WO 2013/037703號及第WO 2014/180741號。
在一較佳實施例中，本發明係關於式I之ABCA1誘導劑化合物之用途
Figure 02_image005
其中A1 及A2 中之一者為N及A1 及A2 中之另一者為CH；
R1 係選自由以下各者組成之群：C1-7 烷基、C3-7 環烷基、C3-7 環烷基-C1-7 烷基、C1-7 烷氧基-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷基、雜環基-C1-7 烷基，其中雜環基未經取代或經側氧基取代，及雜芳基-C1-7 烷基，其中雜芳基未經取代或經低碳烷基單取代或雙取代；
R2 及R6 彼此獨立地為氫或鹵素；
R3 及R5 彼此獨立地選自由以下各者組成之群：氫、C1-7 烷基、C1-7 烷氧基、鹵素、鹵素-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷氧基及氰基；
R4 係選自由以下各者組成之群：氫、C1-7 烷基、C1-7 烷氧基、鹵素、鹵素-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷氧基、胺基及氰基；
R7 係選自由以下各者組成之群：C1-7 烷基、C3-7 環烷基，該環烷基未經取代或經羥基取代、雜環基，該雜環基具有3至7個環原子，包含一個、兩個或三個選自N、O及S之雜原子且未經取代或經羥基或側氧基取代、苯基，其中苯基未經取代或經一個或兩個選自由以下各者組成之群的基團取代：C1-7 烷基、羥基、C1-7 烷氧基、氰基、鹵素及鹵素-C1-7 烷基，以及雜芳基，其中雜芳基未經取代或經一個或兩個選自由以下各者組成之群的基團取代：C1-7 烷基、羥基、C1-7 烷氧基、氰基、鹵素及鹵素-C1-7 烷基，及
G係選自由以下各者組成之群：-(CH2 )m -，其中m選自0或1及-NR8 -，其中R8 為氫或C1-7 烷基，其醫藥上可接受之鹽。
單獨或組合形式之術語「低碳烷基」或「C1-7 烷基」表示具有1至7個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，尤其具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且更尤其具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。直鏈及分支鏈C1-7 烷基之實例為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、異構戊基、異構己基及異構庚基，尤其甲基、乙基、丙基、異丙基及第三丁基。
術語「低碳烷氧基」或「C1-7 烷氧基」係指基團R'-O-，其中R'為低碳烷基且術語「低碳烷基」具有先前所給之意義。低碳烷氧基之實例為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基及第三丁氧基，尤其甲氧基。
術語「低碳烷氧基烷基」或「C1-7 烷氧基-C1-7 烷基」係指如上文所定義經如上文所定義之低碳烷氧基單取代或多取代之低碳烷基。低碳烷氧基烷基之實例為例如-CH2 -O-CH3 、-CH2 -CH2 -O-CH3 、-CH2 -O-CH2 -CH3 及本文中特定例示之基團。更特定言之，低碳烷氧基烷基為甲氧基乙基。
術語羥基意謂基團-OH。
術語「環烷基」或「C3-7 環烷基」表示含有3至7個碳原子之飽和碳環基，諸如環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環庚基。
術語「低碳環烷基烷基」或「C3-7 環烷基-C1-7 烷基」係指如上文所定義之低碳烷基，其中低碳烷基之至少一個氫原子經上文所定義之環烷基置換。在低碳環烷基烷基中，環丙基甲基備受關注。
術語「鹵素」係指氟、氯、溴及碘，其中氟、氯及溴備受關注。更特定言之，鹵素係指氟及氯。
術語「低碳鹵烷基」或「鹵素-C1-7 烷基」係指經鹵素、特定言之經氟或氯、最特定言之經氟單取代或多取代之低碳烷基。低碳鹵烷基之實例為例如-CF3 、-CHF2 、-CH2 Cl、-CH2 CF3 、-CH(CF3 )2 、-CF2 -CF3 、-CH2 -CH2 -CF3 、-CH(CH3 )-CF3 及本文中特定例示之基團。備受關注之基團為三氟甲基(-CF3 )及2,2,2-三氟乙基(-CH2 CF3 )。
術語「低碳鹵烷氧基」或「鹵素-C1-7 烷氧基」係指如上文所定義之低碳烷氧基，其中低碳烷氧基之至少一個氫原子經鹵素原子，特定言之氟或氯，最特定言之氟置換。備受關注之低碳鹵烷氧基為三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧基及氯甲氧基，更特定言之三氟甲氧基。
術語胺基意謂基團-NH2 。
術語「氰基」意謂基團-CN。
術語「疊氮基」意謂基團-N3 。
術語「雜芳基」係指芳族5員或6員環，其可包含一個、兩個或三個選自N、O及S之原子。雜芳基之實例為例如呋喃基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、噁二唑基、噁三唑基、四唑基、五唑基或吡咯基。術語「雜芳基」亦包括包含兩個5員或6員環之雙環基團，其中一個或兩個環為芳族且可含有一個、兩個或三個選自氮、氧或硫之原子，諸如喹啉基、異喹啉基、㖕啉基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、喹喏啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲哚基、吲唑基及3,4-二氫-2H-吡啶并[3,2-b][1,4]噁嗪基。備受關注之雜芳基為異噁唑基、吡唑基、噁二唑基、噻唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基及吡嗪基。更特定言之，雜芳基為吡啶基或噠嗪基。
術語「低碳雜芳基烷基」或「雜芳基-C1-7 烷基」係指如上文所定義之低碳烷基，其中低碳烷基之至少一個氫原子經如上文所定義之雜芳基置換。
術語「雜環基」係指飽和或部分不飽和3、4、5、6或7員環，其可包含一個、兩個或三個選自N、O及S之雜原子。雜環基環之實例包括哌啶基、哌嗪基、氮雜環丁烷基、氮雜卓基、吡咯啶基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、環氧乙烷基、噻二唑啶基、氧雜環丁烷基、二氧戊環基、二氫呋喃基、四氫呋喃基、二氫哌喃基、四氫哌喃基及硫代嗎啉基。備受關注的為哌啶基及四氫哌喃基。
術語「低碳雜環基烷基」或「雜環基-C1-7 烷基」係指如上文所定義之低碳烷基，其中低碳烷基之至少一個氫原子由如上文所定義之雜環基置換。
術語「側氧基」意謂雜環基或雜芳基環之C原子可經=O取代，因此意謂雜環基或雜芳基環可含有一或多個羰基(-CO-)基團。
在用於式(I)化合物之特定實施例中，G為一鍵且R7 為C3-7 環烷基，該環烷基未經取代或經羥基取代。舉例而言，R7 為可經羥基取代或不可經羥基取代之環己基。
在特定實施例中，R2 及R6 各自為氫。
在特定實施例中，R4 為鹵素，例如氯或氟，且R3 及R5 中之一者為鹵素，例如氯或氟，且R3 及R5 中之另一者為氫。
在特定實施例中，R1 為鹵素-C1-7 烷基，通常R1 係選自-CF3 、-CHF2 、-CH2 Cl、-CH2 CF3 、-CH(CF3 )2 、-CF2 -CF3 。
特定化合物之實例為以下化合物：
Figure 108126640-A0304-0001
在特定實施例中，用於治療如本文所描述之腎病之化合物係選自由以下各者組成之群：5-(3,4-二氯-苯基)-N-((1R,2R )-2-羥基-環己基)-6-(2,2,2-三氟-乙氧基)-菸鹼醯胺及6-(3,4-二氯苯基)-N-[(1R,2R )-2-羥基環己基]-5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-甲醯胺。
本發明亦涵蓋用於腎病之式(I)之化合物、互變異構體、對映異構體、非對映異構體、外消旋體或其混合物、或水合物、溶劑合物、醫藥學上可接受之鹽。
術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留游離鹼或游離酸之生物學有效性及特性且不具有任何不合需要之自身特性的鹽。該等鹽用以下形成：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物，尤其鹽酸；及有機酸，諸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、柳酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、N -乙醯半胱胺酸及其類似物。因此，在特定實施例中，「醫藥學上可接受之鹽」包括式I之化合物之乙酸鹽、溴化物、氯化物、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽及甲苯磺酸鹽。另外，醫藥學上可接受之鹽可由向游離酸添加無機鹼或有機鹼來製備。衍生自無機鹼之鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽及類似物。衍生自有機鹼之鹽包括但不限於以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺；經取代之胺，其包括天然存在之經取代之胺；環胺及鹼離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙胺、離胺酸、精胺酸、N -乙基哌啶、哌啶、哌嗪及其類似物。式I之化合物亦可以兩性離子形式或以水合物形式存在。特定言之，式I之化合物之醫藥學上可接受之鹽可為氫氯酸鹽。
式I之化合物之合成方法之實例描述於WO2011/029827、WO 2012/032018、WO 2013/37703及WO2014/180741中。用於製備化合物 G 之例示性方法描述於WO2011/029827中，且用於製備化合物 A 之例示性方法揭示於WO2014/180741中。
式 I 之化合物之使用方法
已展示式I之化合物(通常如實例中所描述之化合物 A 及 G )或其醫藥學上可接受之鹽適用於治療腎病。
如本文所使用，術語「腎病」意謂正常生理學及腎臟功能中之任何改變。此術語包括但不限於疾病及病症，諸如腎臟移植；腎病變；原發性腎小球病、局部區段性腎小球硬化，其包括患有局部區段性腎小球硬化之偶發性特發性激素耐藥型腎病症候群、微小改變疾病、膜性GN、C3腎小球病變、腎重要性相關之球蛋白症、IgA腎病變、慢性腎病(CKD)；絲球體腎炎；諸如多囊性腎病之遺傳性疾病； 急性及慢性間質性腎炎、中美洲腎病變；腎病症候群；腎炎症候群；末期腎病(ESRD)；急性及慢性腎衰竭；間質性疾病；腎炎；硬化；組織及/或血管之硬結或硬化，其原因包括：例如由疾病或損傷引起之發炎；腎纖維化及疤痕；腎相關增生性病症；及其他原發性或繼發性腎源性病症。
腎病亦可一般定義為「腎病變(nephropathy/ nephropathies)」。術語「腎病變(nephropathy/nephropathies)」涵蓋腎臟中之所有臨床病理學變化，其可導致腎臟纖維化及/或腎小球疾病(例如腎小球硬化或絲球體腎炎)及/或慢性腎機能不全，且可導致末期腎病及/或腎衰竭。
本發明之一些態樣係關於組合物及其用於預防及/或治療高血壓腎病變、糖尿病性腎病變(諸如糖尿病性腎臟病症)及其他類型之腎病變(諸如鎮痛腎病變)、免疫介導性腎小球病(例如IgA腎病變或伯格氏病(Berger's disease)、狼瘡性腎炎)、缺血性腎病變、HIV相關腎病變、膜性腎病變、絲球體腎炎、腎小球硬化、放射性造影劑誘導之腎病變、中毒性腎病變、鎮痛劑誘導之腎毒性、順鉑(cisplatin)腎病變、移植腎病變及腎小球異常或損傷之其他形式或腎小球毛細血管損傷(管狀纖維化)。在一些實施例中，術語「腎病變(nephropathy/nephropathies)」特定言之係指病症或疾病，其中個體之尿液中存在蛋白質（亦即蛋白尿）及/或存在腎機能不全，在本文中亦稱為蛋白尿腎臟病症。
在一些實施例中，個體患有白蛋白尿或蛋白尿。與白蛋白尿相關聯之例示性病症包括但不限於慢性腎病、增生性絲球體腎炎(例如免疫球蛋白A腎病變、膜增生性絲球體腎炎、腎小球膜增生性絲球體腎炎、抗GBM病、腎脈管炎、狼瘡性腎炎、冷凝球蛋白血症相關之絲球體腎炎、細菌性心內膜炎、亨偌-絲奇恩賴紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、感染後絲球體腎炎或C型肝炎)及非增殖性絲球體腎炎(例如膜性絲球體腎炎、微小改變疾病、原發性局部區段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)、纖維性絲球體腎炎、免疫觸覺性絲球體腎炎、澱粉樣變性病、奧爾波特症候群、高血壓腎硬化、多發性骨髓瘤輕鏈病及繼發性局部腎小球硬化。
在本文所提供之實施例中之任一者中，可對個體進行某些測試以評估腎功能。此類測試包括但不限於量測個體中之血尿素氮；量測個體血液中之肌酐；量測個體血液中之肌酐清除；量測個體中之蛋白尿；量測個體中之白蛋白:肌酐比率；量測個體中之腎小球濾過率；及量測個體中之排尿量。
如本文所用，術語「治療(treating /treatment)」表示逆轉、緩解、抑制此類術語所適用之病症或病狀的發展或預防此類術語所適用之病症或病狀，或逆轉、緩解、抑制此類術語所適用之病症或病狀之一或多種症狀的發展，或預防此類術語所適用之病症或病狀的一或多種症狀。因此，在另一態樣中，本發明亦關於式I化合物，通常如實例中所描述之化合物 A 及 G ，或其醫藥學上可接受之鹽，用於降低、抑制或消除與腎病相關之症狀，包括但不限於減少蛋白尿、減緩蛋白尿增加、減緩泌尿白蛋白肌酐比率(urinary albumin creatinine ratio，UACR)之升高、減少UACR、減緩UAER之增加、降低UAER、減少白蛋白尿、減緩白蛋白尿之增加、增加腎小球足細胞密度、預防或減緩腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)變厚、 減少腎小球面積、減少腎間質性巨噬細胞之數目、降低或減緩腎組織之纖維化、遏止或減少腎臟中之炎症、遏止或減少巨噬細胞誘導之對腎臟之損傷、提高或正規化估計之腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、減弱eGFR之下降、減少腎小球硬化、遏止或減少腎小球胞外基質之擴增、遏止或減少透明物質之沈積、遏止或減少腎小球上皮增生病變(glomerular epithelial hyperplasia lesion，EPHL)及遏止或減少淋巴細胞浸潤。
因此，本發明亦關於用於治療如上文所定義之腎病的醫藥組合物，其包含如上文所定義之式I 之化合物及醫藥學上可接受之載劑及/或佐劑。
特別地，本發明係關於如上文所定義之醫藥組合物，其用於治療及/或預防腎病，包括慢性腎病、蛋白尿及/或腎小球疾病。較佳用途係關於奧爾波特症候群、局部區段性腎小球硬化及糖尿病性腎病。
在另一實施例中，本發明係關於一種用於治療及/或預防腎病之方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之式I 之化合物。此類腎病之實例包括慢性腎病、蛋白尿及/或腎小球疾病。一種用於治療及/或預防奧爾波特症候群、局部區段性腎小球硬化及糖尿病性腎病之方法為較佳的。
另外，本發明係關於如上文所定義之式I 之化合物，通常如實例中所描述之化合物 A 及 G 或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製備治療及/或預防腎病之藥劑。此類腎病之實例包括慢性腎病、蛋白尿及/或腎小球疾病。尤其關注如上文所定義之式I 之化合物製備用於治療及/或預防奧爾波特症候群、局部區段性腎小球硬化及糖尿病性腎病之藥劑之用途。
醫藥組合物之形式、投與途徑、劑量及方案當然視欲治療之病狀，疾病之嚴重程度，患者之年齡、重量及性別等而定。
本發明之醫藥組合物可經調配用於局部、經口、鼻內、眼內、靜脈內、肌肉內或皮下投與及其類似方式。較佳地，本發明之醫藥組合物可經調配用於經口投與。
在一個特定實施例中，本發明之醫藥組合物可經調配用於玻璃體內、鞘內或經皮投與。
醫藥組合物可呈錠劑、丸劑、膠囊、半固體、散劑、持續釋放調配物、溶液、懸浮液、乳液、糖漿、酏劑、噴霧劑或任何其他適當組合物之形式；且包含至少一種如上文所定義之式I之化合物。
在一特定實施例中，口服調配物為錠劑、口腔分散的錠劑、膠囊、溶液、貼片、舌下錠劑、鼻用噴霧或口服噴霧。在一個子實施例中，調配物經製備用於如上文所定義之可持續釋放之式I之化合物。
因為錠劑及膠囊容易投與，所以其代表最有利之口服單位劑型，在此情況下顯然使用固體醫藥載劑。必要時，錠劑可藉由標準技術包覆糖衣或包覆腸溶包衣。錠劑或丸劑可經包衣以提供有延長作用之優勢的劑型。舉例而言，錠劑或丸劑可包含內部劑量及外部劑量組份，後者呈包覆前者之包膜形式。兩種組份可由腸溶層隔開，該腸溶層用以阻止在胃中崩解且允許內部組份完整進入十二指腸或延遲釋放。多種材料可用於此類腸溶層或包衣，此類材料包括多種聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及乙酸纖維素之材料。
適合載劑材料不僅為無機載劑材料，而且亦為有機載劑材料。因此，例如，乳糖、玉米澱粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽可用作錠劑、包衣錠劑、糖衣藥丸(dragée)及硬明膠膠囊之載劑材料。用於軟明膠膠囊之適合載劑材料為例如植物油、蠟、脂肪及半固體及液體多元醇(然而，視活性成份之性質而定，在軟明膠膠囊之情況下可不需要載劑)。用於製備溶液及糖漿之適合載劑材料為例如水、多元醇、蔗糖、轉化糖及其類似物。注射溶液之適合載劑材料為例如水、醇、多元醇、甘油及植物油。栓劑之適合載劑材料為例如天然或硬化油、蠟、脂肪及半液體或液體多元醇。表面製劑之適合載劑材料為甘油酯、半合成及合成甘油酯、氫化油、液體蠟、液體石蠟、液體脂肪醇、固醇、聚乙二醇及纖維素衍生物。
考慮常見穩定劑、防腐劑、濕潤及乳化劑、稠度改良劑、風味改良劑、改變滲透壓之鹽、緩衝物質、增溶劑、著色劑及遮蔽劑及抗氧化劑作為醫藥佐劑。
用於投與之劑量可隨各種參數而調適，且詳言之隨所用投與模式、相關病理學或者所需治療持續時間而調適。應瞭解，化合物及包含該等化合物之組合物之適合劑量可因患者而異。確定最佳劑量將一般涉及治療益處程度相對於本文所描述之治療之任何風險或有害副作用之平衡。所選擇的劑量濃度將視各種因素而定，包括但不限於特定化合物之活性、投與途徑、投與時間、化合物之排出速率、治療之持續時間、組合使用之其他藥物、化合物及/或材料；及患者之年齡、性別、體重、病狀、整體健康狀況及先前病史。化合物之量及投與途徑最終將由醫師酌情處理，但一般而言，劑量將在作用部位達成局部濃度，該等濃度獲得所需效果而不會引起實質上有害或不利的副作用。
對於成人患者，考慮約1至100 mg、尤其約1至50 mg之日劑量。視疾病之嚴重性及精確藥物動力學概況而定，化合物可以一或數個日劑量單位(例如以1至3個劑量單位)投與。
在一特定實施例中，根據本發明使用之化合物以20至800毫克/天之日劑量投與。
在另一特定實施例中，根據本發明使用之化合物以200毫克/天之日劑量投與。
根據本發明使用之醫藥組合物宜含有約1-200 mg、較佳75-100 mg式I之化合物，通常如實例中所描述之化合物 A 及 G 或其醫藥學上可接受之鹽。給藥方案可根據式I之化合物之特定藥物動力學特性進行調整。
在一個特定實施例中，式I之化合物，通常如實例中所描述之化合物 A 及 G ，或包含其之醫藥組合物係每天一次、每天兩次、每天三次、每三天一次、每週一次、每兩週一次或每月一次投與。較佳地，給藥週期係選自每天兩次、每天一次及每隔一天一次。
在另一特定實施例中，式I之化合物，通常如實例中所描述之化合物 A 及 G ，或其醫藥學上可接受之鹽之速效給藥方案加倍前7天、14天及30天之劑量。
在另一特定實施例中，根據本發明使用之醫藥組合物可含有約20-800 mg、較佳約50-400 mg且更佳約200 mg式I之化合物，通常如實例中所描述之化合物 A 及 G 或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一特定實施例中，根據本發明使用之式I化合物，通常如實例中所描述之化合物 A 及 G 或其醫藥學上可接受之鹽，日劑量為20至800毫克/天，較佳日劑量為約200毫克/天。
另外，根據本發明使用之式I之化合物亦可適用於與用於預防或治療腎病或相關病症或併發症之另一藥劑同時、分開或依序地組合或結合使用。此類已知化合物之實例包括但不限於：血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑藥物(例如卡托普利(captopril) (Capoten®)、依那普利(Innovace®)、福辛普利(Staril®)、賴諾普利(Zestril®)、培哚普利(Coversyl®)、喹那普利(Accupro®)、群多普利(Gopten®)、洛汀新(lotensin)、莫西普利(moexipril)、雷米普利)；RAS阻斷劑、血管緊張素受體阻斷劑(ARB) (例如奧美沙坦(Olmesartan)、依貝沙坦、氯沙坦、纈沙坦、坎地沙坦、依普羅沙坦、替米沙坦等)；蛋白激酶C (PKC)抑制劑(例如魯伯斯塔(ruboxistaurin))；AGE依賴型路徑之抑制劑(例如氨基胍、ALT-946、吡哆胺(pyrodoxamine) (吡哆辛(pyrododorin))、OPB-9295、阿拉格布(alagebrium))；消炎劑(例如氯環氧化酶-2抑制劑、黴酚酸酯、咪唑立賓(mizoribine)、己酮可可鹼)；GAG (例如舒洛地特(sulodexide) (美國專利第5,496,807號))、 吡哆胺(美國專利第7,030,146號)；內皮素拮抗劑(例如，SPP 301)、COX-2抑制劑、PPAR-γ拮抗劑及類似於阿米福汀之其他化合物(用於順鉑腎病變)、卡托普利(用於糖尿病性腎病變)、環磷醯胺及利妥昔單抗(rituximab) (用於特發性膜性腎病變)、硫代硫酸鈉(用於順鉑腎病變)、曲尼司特、環糊精及其衍生物(例如，羥丙基-β-環糊精)等。(Williams及Tuttle (2005), Advances in Chronic Kidney Disease, 12 (2): 212-222; Giunti等人(2006), Minerva Medica, 97:241-62)。在特定實施例中，用於組合或結合之已知化合物包括但不限於mir-21 (mir-21拮抗物)之巴多曲龍(Bardoxolone)或寡核苷酸抑制劑。
在另一特定實施例中，用於組合或結合使用之已知化合物包括維生素D衍生物、抗高血糖劑(例如SGLT2抑制劑、GLP1促效劑、DPP4抑制劑)、抗高膽固醇劑(例如士他汀(statin)、菸酸、纖維酸酯、PCSK9抑制劑、依澤替米(ezetimibe))。
如本文所使用，術語「組合」係指以一個單位劑型之固定劑量組合、非固定劑量組合或用於組合投與之分裝部分之套組，其中式I之化合物及一或多個組合搭配物(例如，ACE抑制劑藥物或ARB藥物)可同時獨立地或分別在時間間隔內(尤其在此等時間間隔允許組合搭配物展示合作，例如協同效應之情況下)投與。
術語「固定劑量組合」意謂以單一實體或劑量形式同時向患者投與活性成份。
術語「非固定劑量組合」意謂作為單獨實體同時或依序向患者投與活性成份(例如式I之化合物及一或多種組合搭配物(例如ACE抑制劑藥物或ARB藥物))，而無特定時間限制，其中此類投與在患者體內提供治療有效量之兩種化合物。
另外，本文所描述之方法亦可包括共投與至少一種其他治療劑以治療與腎病併發症直接或間接相關之另一疾病，該疾病包括但不限於：血脂異常、高血壓、肥胖症、神經病變、發炎及/或視網膜病變。此類額外治療劑包括但不限於皮質類固醇；免疫抑制藥劑；抗生素；抗高血壓及利尿劑藥劑(諸如噻嗪利尿劑及ACE-抑制劑或β-腎上腺素拮抗劑)；降脂劑，諸如膽汁錯隔劑樹脂、消膽胺、考來替潑(colestipol)、菸鹼酸及更特定言之用於降低膽固醇及三酸甘油酯之藥物及藥劑(例如纖維酸酯(例如Gemfibrozil®)及HMG-CoA抑制劑，諸如Lovastatin®、Atorvastatin®、Fluvastatin®、Lescol®、Lipitor®、Mevacor®、Pravachol®、Pravastatin®、Simvastatin®、Zocor®、Cerivastatin®等)；菸鹼酸及維生素D。
如本文所用之術語「共投與」或「組合投與」意欲涵蓋向單一個體投與所選擇之組合搭配物，且意欲包括治療方案，其中藥劑不一定藉由相同投與途徑或同時投與。
術語「聯合治療有效」意謂可以該等時間間隔單獨地(以按時間順序錯開之方式，尤其序列特異性之方式)提供治療劑以展示(較佳協同)相互作用(亦即聯合治療作用)。
因此，本發明亦關於一種藥劑，其包含 (i) 如上文所定義之式I 之化合物，通常為如實例中所描述之化合物 A 或 G ，其與以下組合或結合： (ii)             選自由以下各者組成之群的化合物：血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑藥物、RAS阻斷劑、血管收縮素受體阻斷劑(ARB)、蛋白激酶C (PKC)抑制劑、AGE依賴型路徑之抑制劑、消炎劑、GAG、吡哆胺(美國專利第7,030,146號)、內皮素拮抗劑、COX-2抑制劑、PPAR-γ拮抗劑及類似於阿米福汀之其他化合物(用於順鉑腎病變)、卡托普利(用於糖尿病性腎病變)、環磷醯胺(用於特發性膜性腎病變)、硫代硫酸鈉(用於順鉑腎病變)或曲尼司特、環糊精及其他衍生物(例如羥丙基-β-環糊精)及 (iii)          醫藥學上可接受之載劑及/或佐劑。
如本文所使用，術語「藥劑」意指醫藥組合物，或若干個醫藥組合物之組合，其在一或多種賦形劑存在下含有一或多種活性成份。
本發明進一步係關於如上文所定義之式I 之化合物，其用於與選自由以下各者組成之群的化合物同時、依序或分開使用：血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑藥物、RAS阻斷劑、血管收縮素受體阻斷劑(ARB)、蛋白激酶C (PKC)抑制劑、AGE依賴型路徑之抑制劑、消炎劑、GAG、吡哆胺(美國專利第7,030,146號)、 內皮素拮抗劑、COX-2抑制劑、PPAR-γ拮抗劑及類似於阿米福汀之其他化合物(用於順鉑腎病變)、卡托普利(用於糖尿病性腎病變)、環磷醯胺(用於特發性膜性腎病變)、硫代硫酸鈉(用於順鉑腎病變)、曲尼司特或環糊精及其衍生物(例如羥丙基-β-環糊精)、維生素D衍生物、抗高血糖劑及抗高膽固醇劑。
本發明亦係關於一種治療及/或預防腎病之方法，該方法包含投與治療有效量之根據式I之化合物與治療有效量之選自由以下各者組成之群的化合物的組合或結合：血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑藥物、RAS阻斷劑、血管收縮素受體阻斷劑(ARB)、蛋白激酶C (PKC)抑制劑、AGE依賴型路徑之抑制劑、消炎劑、GAG、 吡哆胺(美國專利第7,030,146號)、內皮素拮抗劑、COX-2抑制劑、PPAR-γ拮抗劑及類似於阿米福汀之其他化合物(用於順鉑腎病變)、卡托普利(用於糖尿病性腎病變)、環磷醯胺(用於特發性膜性腎病變)、硫代硫酸鈉(用於順鉑腎病變)、曲尼司特或環糊精及其衍生物(例如羥丙基-β-環糊精)、維生素D衍生物、抗高血糖劑及抗高膽固醇劑。
在以下實例中，特定言之已在至少3種不同腎病，亦即奧爾波特症候群、局部區段性腎小球硬化及糖尿病性腎病之活體內動物模型中測試式(I)之化合物，反映此類化合物在多種腎病中有前景的治療效果。
實例 製備 ABCA1 誘導劑化合物 化合物列表 ：
Figure 108126640-A0304-0002
 以上化合物及其合成方法已描述於WO2014/180741中。
製備化合物 G (5-(3,4- 二氯 - 苯基 )-N-((1R ,2R )-2- 羥基 - 環己基 )-6-(2,2,2- 三氟 - 乙氧基 )- 菸 鹼醯胺 ) 根據描述於WO 2011/029827，實例3中之程序由5-溴-6-氯-3-吡啶甲酸、2,2,2-三氟乙醇、(1R,2R )-2-胺基-環己醇及3,4-二氯苯硼酸製備化合物。MS 463.079, 465.077 (M+H)+ 。
製備化合物 A 6-(3,4- 二氯苯基 )-N -[(1R,2R )-2- 羥基環己基 ]-5-(2,2,2- 三氟乙氧基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 根據WO 2014/180741中所描述之程序在以下步驟中製備化合物A： a) 6-氯-2-(3,4-二氯苯基)-3-氟吡啶 在100 mL四頸燒瓶中，將2,6-二氯-3-氟吡啶(765 mg，4.61 mmol，當量：1.00，CAS登記號第52208-50-1號)及(3,4-二氯苯基)三氟硼酸鉀(1.21 g，4.61 mmol，當量：1.00，CAN 850623-68-6)與二噁烷(23 mL)及水(13 mL)組合。添加2 M Na2 CO3 (6.91 mL，13.8 mmol，當量：3)，隨後添加PdCl2 (DPPF)-CH2 Cl2 加合物(169 mg，230 µmol，當量：0.05，CAS登記號第95464-05-4號）。將反應混合物脫氣3次且用氬氣沖洗，且隨後在攪拌下隔夜加熱至60℃。將反應混合物冷卻至環境溫度，倒入50 mL H2 O中且用第三丁基-甲基-醚(2×100 mL)萃取。用H2 O/鹽水洗滌有機層，合併，經Na2 SO4 乾燥且在真空中濃縮。藉由急驟層析(矽膠，70 g，5%至20%二氯甲烷於庚烷中)純化粗材料兩次以產生540 mg呈白色半固體狀之標題化合物。
b) 6-氯-2-(3,4-二氯苯基)-3-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶 在25 mL梨形燒瓶中，將以上製備之6-氯-2-(3,4-二氯苯基)-3-氟吡啶(530 mg，1.44 mmol，當量：1.00)與DMSO (8 mL)組合。添加KOH (118 mg，2.1 mmol，當量：1.46)及2,2,2-三氟乙醇(211 mg，153 µl，2.11 mmol，當量：1.47)且使反應在環境溫度下繼續進行2小時。將混合物倒入30 mL H2 O中且用第三丁基-甲基-醚(2×40 mL)萃取。用H2 O/鹽水洗滌有機層，合併，經Na2 SO4 乾燥且在真空中濃縮。藉由急驟層析(矽膠，70 g，5%至20%之EtOAc於庚烷中)純化粗產物以產生444 mg呈無色液體狀之標題化合物；MS (ESI) 356.3, 358.3, 360.3 (M+H)+ 。
c) 6-(3,4-二氯苯基)-5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-甲酸甲酯 在35 mL高壓釜中，將以上製備之6-氯-2-(3,4-二氯苯基)-3-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶(437 mg，1.22 mmol，當量：1.00)溶解於5 mL MeOH中。藉由氬氣保護免受氧氣及濕氣影響，添加PdCl2 (DPPF)-CH2 Cl2 加合物(75.2 mg，92 µmol，當量：0.083，CAS登記號第95464-05-4號)，隨後添加三乙胺(233 mg，321 mL，2.31 mmol，當量：2.31)。隨後用CO沖洗反應器三次，加壓至70巴(bar)且隨後在110℃下使羰基化進行20小時。在冷卻及釋放壓力之後，在真空中濃縮粗反應混合物。隨後將殘餘物再溶解於AcOEt/H2 O中且轉移至分液漏斗中。用EtOAc反萃取含水層，用H2 O及鹽水洗滌有機層，合併，經Na2 SO4 乾燥且在真空中濃縮。急驟層析(矽膠，70 g，10%至40% EtOAc於庚烷中)最後遞送327 mg呈白色固體狀之標題產物；MS(ESI) 380.4, 382.4 (M+H)+ 。
d) 6-(3,4-二氯苯基)-5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-甲酸 在25 mL梨形燒瓶中，將以上製備之6-(3,4-二氯苯基)-5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶甲酸甲酯(326 mg，858 µmol，當量：1.00)與四氫呋喃(5 mL)組合以得到無色溶液。添加水(2.5 ml)，隨後添加LiOH (41.1 mg，1.72 mmol，當量：2)且在40℃下攪拌反應混合物2小時。將反應混合物倒入5 mL飽和NH4 Cl溶液及3 mL 1N KHSO4 溶液且用EtOAc (2×30 mL)萃取。合併有機層，經Na2 SO4 乾燥且在真空中濃縮，得到322 mg呈白色發泡體狀之標題酸；MS(ESI) 366.4, 368.4 (M+H)+ 。
e) 6-(3,4-二氯苯基)-N -[(1R,2R)-2-羥基環己基]-5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-甲醯胺 在25 mL梨形燒瓶中，將以上合成之6-(3,4-二氯苯基)-5-(2,2,2-三氟乙氧基)-吡啶甲酸(322 mg，879 µmol，當量：1.00)溶解於DMF (12 mL)中。添加TBTU (四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N' -四甲
Figure 108126640-A0304-12-01
，424 mg，1.32 mmol，當量：1.5，CAS登記號第125700-67-6號)及N,N -二異丙基乙胺(568 mg，768 µl，4.4 mmol，當量：5)，且在環境溫度下攪拌反應混合物10分鐘，之後在無額外溶劑之情況下添加(1R,2R)-2-胺基環己醇鹽酸鹽(160 mg，1.06 mmol，當量：1.2，CAS登記號第13374-31-7號)。隨後使反應物在室溫下繼續進行3小時。用H2 O稀釋且用CH2 Cl2 萃取粗混合物。合併有機層，經Na2 SO4 乾燥且在真空中濃縮。藉由急驟層析(鹼性氧化鋁，50 g，10%至80% EtOAc於庚烷中)純化且粗產物自EtOAc及庚烷沈澱，得到呈白色固體狀之標題醯胺；高解析度MS (ESI) 463.0798, 465.0769 (M+H)+ ；預期：463.0798、465.0768。
化合物 H (N'-(6- 氯噠嗪 -3- 基 )-5-(4- 氰基苯基 )-N'- 甲基 -6-(2,2,2- 三氟乙氧基 ) 吡啶 -3- 甲醯肼 ) 之 製備 根據WO 2014/180741中所描述之程序在以下步驟中製備化合物H：
a) 5-(4-氰基-苯基)-6-(2,2,2-三氟-乙氧基)-菸鹼酸甲酯 在50 mL 4頸燒瓶中，將5-溴-6-(2,2,2-三氟乙氧基)菸鹼酸甲酯(1 g，3.18 mmol，當量：1.00，CAS登記號第1211589-51-3號)及碳酸銫(3.11 g，9.55 mmol，當量：3)與甲苯(25 mL)及水(2.8 mL)組合，得到無色溶液。將反應混合物脫氣3次且用氬氣沖洗；隨後連續添加乙酸鈀(II) (14.3 mg，63.7 µmol，當量：0.02)、(4-氰基苯基)三氟硼酸鉀(732 mg，3.5 mmol，當量：1.1，CAS登記號第850623-36-8號)及丁基二-1-金剛烷基膦(68.5 mg，191 µmol，當量：0.06，CAS登記號第321921-71-5號)。在各添加之後，重複脫氣-沖洗循環。隨後將反應混合物加熱至120℃持續5小時。冷卻後，將反應混合物倒入50 mL H2 O中且用AcOEt (2×50 mL)萃取。用H2 O/鹽水洗有機層，合併，經Na2 SO4 乾燥且在真空中濃縮。藉由急驟層析(矽膠，50 g，50%至100% CH2 Cl2 於庚烷中)純化，最後產生898 mg呈白色發泡體之標題化合物；MS(ESI) 337.2 (M+H)+ 。
b) 5-(4-氰基-苯基)-6-(2,2,2-三氟-乙氧基)-菸鹼酸 在25 mL圓底燒瓶中，將以上製備之5-(4-氰基-苯基)-6-(2,2,2-三氟-乙氧基)-菸鹼酸甲酯(0.891 g，2.65 mmol，當量：1.00)與THF (7 mL)及水(3.5 mL)組合，得到淡黃色二相系統。添加氫氧化鋰(127 mg，5.3 mmol，當量：2)，且當TLC指示反應完成時，在40℃攪拌反應混合物3小時。處理：添加10 mL H2 O及7 mL HCl 1N，用AcOEt (2×50 mL)萃取混合物，合併有機層，用鹽水洗，經Na2 SO4 乾燥且在真空中濃縮。以庚烷/EtOAc 9:1研磨，最後得到794 mg呈白色固體之所需標題產物；MS (ESI) 321.2 (M-H)- 。
c)N' -(6-氯噠嗪-3-基)-5-(4-氰基苯基)-N' -甲基-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-甲醯肼 在5 mL圓底燒瓶中，將以上製備之5-(4-氰基-苯基)-6-(2,2,2-三氟-乙氧基)-菸鹼酸(0.050 g，155 µmol，當量：1.00)與THF (2 mL)組合以得到無色溶液。添加TBTU (四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N' -四甲
Figure 108126640-A0304-12-01
，74.7 mg，233 µmol，當量：1.5，CAS登記號第125700-67-6號)及N,N-二異丙基乙胺(100 mg，135 µl， 776 µmol，當量：5)。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘，隨後添加3-氯-6-(1-甲基肼基)-噠嗪(29.5 mg，186 µmol，當量：1.2，CAN 76953-33-8)且將反應混合物保持在室溫下隔夜。倒入至25 mL 1 M HCl中，用EtOAc (2×50 mL)萃取，用1 M NaOH洗滌，經Na2 SO4 乾燥且在真空中蒸發所有溶劑，隨後急驟層析(矽膠，10 g，2%至10% MeOH於CH2 Cl2 中)且自庚烷/AcOEt結晶，最終產生28 mg呈白色固體狀之標題化合物；MS (ESI) 463.1, 465.3 (M+H)+ 。
製備化合物 J (6-(4- 氯 - 苯基 )-5-(2,2,2- 三氟 - 乙氧基 )- 吡啶 -2- 甲酸 (3- 異丙基 - 異噁唑 -5- 基甲基 )- 醯胺 ) 根據WO 2014/180741中所描述之程序在以下步驟中製備化合物J： 根據描述於WO 2012/032018，實例64中之方法自6-(4-氯-苯基)-5-(2,2,2-三氟-乙氧基)-2-吡啶甲酸及3-(1-甲基乙基)-5-異噁唑甲胺(CAS 登記號第543713-30-0號)合成標題化合物。LC-MS (UV峰面積/ESI) 100.0%,454.4 (M+H)+ 。
製備 Cpd F (6-(4- 氯苯基 )-N-( 嘧啶 -5- 基 )-5-(2,2,2- 三氟乙氧基 ) 吡啶醯胺 ， 比較化合物 ) ： 在室溫下將6-(4-氯-苯基)-5-(2,2,2-三氟-乙氧基)-吡啶-2-甲酸(如WO 2012/032018，實例AE中所描述製備)與DMF (30 ml)組合，得到無色溶液。添加嘧啶-5-胺、TBTU及N-乙基二異丙胺。在室溫下攪拌反應混合物15小時。將反應混合物倒入150 mL H2 O中且用EtOAc (2×150 mL)萃取。將經合併之有機層用鹽水洗滌，經MgSO4 乾燥且蒸發。藉由急驟層析(矽膠，20 g，0%至50% EtOAc於己烷中)純化粗材料。LC-MS (ESI) 409.068 (M+H)+ 。
其他比較化合物
Figure 108126640-A0304-0003
如描述於WO 2005/105791，實例56中之Cpd C (1,1,1,3,3,3-六氟-2-{2-甲基-1-[5-甲基-2-(3-三氟甲基-苯基)-噁唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-丙-2-醇，LXR促效劑)的合成。
如描述於WO 2005/092856，實例113中之Cpd D (4-{5-[(RS)-(3-溴-苯磺醯基)-((SR)-7-氯-1,2,3,4-四氫-環戊[b]吲哚-2-基)-氟-甲基]-[1,3,4]噁二唑-2-基}-苯甲酸，部分LXR促效劑)。
如描述於WO 2005/092856，實例74(6)中之Cpd E ((R)-2-[(S)-苯磺醯基-氟-(5-甲基-[1,3,4]噁二唑-2-基)-甲基]-7-氯-1,2,3,4-四氫-環戊[b]吲哚，部分LXR促效劑)。
材料及方法 對於活體外實驗，使凍乾化合物在DMSO (Sigma)中復原且在相同溶劑中稀釋，以產生20 mM、10 mM、5 mM、1 mM及0 mM儲備液(儲存在-20℃下)。
對於活體內實驗，將凍乾化合物懸浮於媒劑(羅氏(Roche)設計之特定調配物：1.25%羥丙基甲基纖維素、0.10%多庫酯鈉鹽、0.18%對羥基苯甲酸丙酯鈉、0.02%檸檬酸單水合物，pH 6)中。藉由冰上之3個短暫脈衝音波來確保精細微粒懸浮液。針對Cpd C (LXR促效劑)，將懸浮液中之化合物濃度調節至2 mg/ml；且針對ABCA1誘導劑、Cpd A及Cpd G兩者，兩者濃度為6 mg/ml及20 mg/ml。將化合物懸浮液儲存在-20℃下進行長期儲存，且若化合物在一週內使用，則儲存在4℃下。在投與之前充分混合懸浮液以確保均質劑量遞送。
細胞培養 大鼠膠原蛋白I型、RPMI及ITS購自Corning。FBS購自GIBCO且無脂肪之BSA購自Sigma-Aldrich。對於膽固醇流出分析，人類ApoA1及3 H-膽固醇分別購自Calbiochem及American Radiolabeled Chemicals。
條件性永生化之人類足細胞係由Moin Saleem饋贈。將細胞接種在塗佈有膠原蛋白I型之燒瓶中且在補充有1×ITS之完全培養基(RPMI，10% FBS，1×Pen/鏈黴素)中在33℃，5% CO2 下繁殖。對於分化，細胞以2,500個細胞/cm2 之密度接種於無ITS之完全培養基中且在37℃及5% CO2 下培養15天。
細胞毒性 將足細胞接種於96孔板(Greiner)中且使其分化14天。隨後用PBS洗滌細胞，且在37℃，5% CO2 下用具有或不具有媒劑及化合物之培養基(RPMI-0.2% BSA)培育細胞18小時。所測試之化合物濃度為1 μM、5 μM、10 μM及20 μM。媒劑(DMSO)最終濃度為0.1%。所有處理均一式兩份地進行。遵照製造商的說明書，使用ApoTox-Glo Triplex Assay (Promega)分析細胞毒性。簡言之，將細胞滲透劑(GF-AFC)及細胞非滲透劑(雙AAF-R110)肽受質稀釋且添加至所有孔中且在37℃，5% CO2 下培育細胞1小時。用皂素(2 mg/ml)處理一組細胞作為細胞毒性之陽性對照。使用螢光微定量盤式讀取器(SpectraMax i3)分別以400 nm/505 nm及485 nm/520 nm激發/發射量測細胞存活率及細胞毒性螢光信號。將用細胞毒性受質獲得之RFU信號根據在相同孔中用存活受質獲得之RFU信號正規化，以消除每孔不同細胞數目之影響。
膽固醇流出 將分化13天之人類足細胞用1 μCi/ml [3 H]-膽固醇在具有2% FBS之RPMI培養基中標記24小時。隨後用PBS洗滌細胞，且用補充有媒劑或化合物Cpd C (1 μM)、Cpd A (1 μM、5 μM)及Cpd G (1 μM、5 μM、10 μM)之平衡培養基(RPMI-0.2%不含脂肪BSA)培育細胞18小時。隨後用PBS洗滌細胞，且在37℃、5% CO2 下用具有或不具有20 µg/ml人類ApoA1之平衡培養基培育18小時。收集培養基，以12,000×g旋轉5分鐘且藉由液體閃爍計數200 µl等分試樣之放射性。用PBS洗滌細胞，用250 µl 0.1% SDS、0.1 M NaOH溶解，且藉由液體閃爍量測於100 µl等分試樣中之放射性。藉由下式計算自細胞移動至培養基之經標記膽固醇之%的膽固醇流出： 流出(%)=100×{(cpm培養基)/[(cpm培養基)+(cpm溶解物)]}
根據在ApoA1存在或不存在下流出之間的差異計算ApoA1介導之膽固醇流出。所有處理均一式兩份地進行。進行超過3個獨立實驗。
ABCA1 表現 . 使分化14天的足細胞在RPMI-0.2% FBS中饑餓18小時，且隨後在37℃及5% CO2 下用新鮮製備之於完全培養基中之化合物的稀釋液處理18小時。評估1 μM、5 μM及10 μM之化合物濃度。隨後用PBS洗滌細胞且用補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物(Roche)之1×細胞溶解緩衝液(Cell Signaling)溶解。藉由BCA方法(Pierce, Thermoscientific)測定總蛋白質含量。藉由西方墨點分析ABCA1表現。
細胞分離 用化合物Cpd C (1 μM)、Cpd A (5 μM)及Cpd G (10 μM)處理14天分化之足細胞18小時且隨後用冰冷PBS洗滌且刮擦。以1,000×g離心細胞5分鐘，小心地抽吸上清液且將集結粒再懸浮於補充有羅氏蛋白酶抑制劑混合液之低滲緩衝液(15 mM KCl、1.5 mM MgCl2 、10 mM HEPES及1 mM DTT)中。藉由玻璃沖洗器及兩個冷凍及解凍循環中之起泡確保進一步的細胞破裂。添加蔗糖，227 mM最終濃度，且在4℃下以1,000×g離心細胞30分鐘。隨後將上清液轉移至新試管中且在4℃下以10,000×g離心15分鐘。收集含有微粒體溶離份之集結粒且將上清液轉移至新試管中且在4℃下以100,000×g離心1小時。收集粒狀質膜溶離份且將含有非膜性胞質溶離份之上清液在Vivaspin 500過濾器管柱中濃縮。藉由西方墨點驗證各溶離份中ABCA1及已知存在於質膜(Na+ /K+ 鈉泵)及細胞溶質(MEK)之蛋白質之存在。
西方墨點。
在55℃下將溶解物或細胞溶離份在還原條件下與緩衝液樣品一起培育10分鐘。在4-20%凝膠(Biorad)中藉由SDSPAGE分離溶解物中之總共30 Ⅴg蛋白質及在細胞溶離份製備物中收集之體積的三分之一，且隨後將蛋白質轉移至PVDF膜。用5%牛乳阻斷膜且在4℃下用蛋白質特異性抗體印跡18小時。使用以下抗體：小鼠抗-ABCA1 (Abcam；1:1,000)、兔抗-GAPDH抗體(Millipore；1:10,000)、兔抗-MEK及抗-Na+ /K+ ATP酶(Cell Signaling；1:1,000)。用PBS-T洗滌之後，將膜與共軛至HRP (Promega) 1:10,000之抗小鼠及抗兔特異性抗體在5%牛乳中培育。洗滌膜且使用西方發光ECL受質(Advansta)產生信號。
活體內實驗 研究批准 測試小鼠中之化合物的研究方案由邁阿密的大學IACUC批准。邁阿密大學(UM)在與實驗室動物福利辦公室，NIH (A-3224-01，2014年11月24日生效)的文件上具有動物福利保證。另外，UM在US Department of Agriculture Animal and Plant Health Inspection Service註冊，2014年12月生效，註冊號58-R-007。截至2013年10月22日，Council on Accreditation of the Association for Assessment及Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International)已繼續對UM進行全面認證。
阿德力黴素誘導之腎損傷 雌性Balb/c小鼠在6週齡時購自Jackson Lab，且在吾人之設施下圈養兩週，隨後開始實驗。
首先，吾人進行初步實驗以探究待使用之化合物之最佳劑量且測定是否需要調節其他實驗變量。在此實驗中，30隻小鼠接受單次劑量阿德力黴素(Sigma-Aldrich，12 mg/Kg，經由尾部靜脈注射)且隨後隨機分成6組，每組5隻小鼠。另外5隻小鼠藉由相同途徑注射0.9% NaCl且用作無腎損傷之基準組。在ADR注射之後24小時開始，藉由經口管飼每日一次給予媒劑或不同劑量之化合物，持續35天。所測試化合物之劑量如下：LXR促效劑(Cpd C，10 mg/Kg)；ABCA1誘導劑Cpd A及Cpd G (30 mg/Kg及100 mg/Kg)。一週一次進行體重量測及單點尿樣本收集。在ADR注射之後35天處死動物(圖1)。
重複第二實驗以確認在第一實驗中在Cpd A及G之劑量下獲得腎功能之改良。簡言之，藉由經尾靜脈向8週齡之30隻雌性Balb/c小鼠注射12 mg/Kg ADR，且將小鼠隨機分配成5個組，每組6隻動物。在ADR注射之後一天開始，藉由經口管飼每日一次給予動物媒劑或化合物，持續28天。測試以下劑量之化合物：Cpd C，10 mg/Kg/天；Cpd A，30 mg/Kg/天及Cpd G，30 mg/Kg/天及100 mg/Kg/天。將一組經由尾部靜脈注射接受鹽水溶液且用媒劑處理之5隻動物用作健康基準對照。一週一次進行體重量測及單點尿樣本收集。在ADR注射之後28天處死動物(圖2)。
奧爾波特小鼠模型 129隻Col4a3tm1/Dec /J小鼠購自Jackson Lab且培育以產生Col4a3 KO小鼠。使用引子對小鼠基因分型及選擇：PCR反應中之F (TGCTCTCTCAAATGCACCAG)、R (CCAGGCTTAAAGGGAAATCC)及Rm (GCTATCAGGACATAGCGTTGG) (94℃下持續5分鐘，隨後在95℃下持續30秒、在60℃下持續15秒且在72℃下持續30秒，且在72℃下持續1分鐘之30個週期)。將129隻Col4A3-KO小鼠各自分成兩組，每組5隻小鼠(雄性及雌性)。在4週齡時，小鼠藉由經口管飼開始接受每日一次媒劑或Cpd G (100 mg/kg)，持續4週。一週一次進行體重量測及單點尿樣本收集。在處理結束時在8週齡時處死動物。亦進行晚期研究以評估在已確定疾病發生時對Col4A3-KO小鼠之處理是否延長小鼠存活期。在此研究中，在6週齡開始藉由經口管飼每日用Cpd G (100 mg/Kg/天)處理小鼠且評估存活率。
DKD 小鼠模型 B6.BKSdb/db 及B6.BKSdb/+ 小鼠購自Jackson laboratory。在14週齡時，小鼠藉由經口管飼每日一次接受媒劑或ABCA1誘導劑Cpd A (30 mg/kg)持續4週。一週一次進行體重量測及尿液收集。在18週齡處死小鼠，如下文所描述收集血液且處理及分析組織。
對小鼠之表現型分析 在基準及處死時間收集所有小鼠之單點尿樣本。使用白蛋白ELISA套組(Bethyl laboratories)及用於肌酐測定(Stanbio)之比色檢定測定泌尿白蛋白及肌酐。計算白蛋白尿且以μg白蛋白除以mg肌酐表示。對於糖尿病小鼠模型，兩週一次量測體重及血糖。
在處死時，將血液收集於肝素化管中且經左心室灌注用等張鹽水溶液灌注小鼠。小心地切除腎臟皮質且進一步切片用於以下分析：測定足細胞數目、脂質小液滴染色、電子顯微法(electron microscopy，EM)、腎脂質含量分析、PAS& HE染色用於病理評估。
測定足細胞數目 將腎臟皮質切片包埋於OCT中以進一步分析免疫螢光染色及脂質小液滴。特定言之，為了測定每個腎小球橫截面之足細胞數目，使用4 μm厚組織切片測定，該等組織切片經切割且用WT1抗體(1:200，Santa Cruz)染色且延長GOLD DAPI封固劑。藉由共焦顯微鏡使用Leica SP5倒置顯微鏡用40x濕潤物鏡獲取影像。對每個小鼠20個腎小球進行定量。
用水(6:4)稀釋脂質小液滴染色之經過濾之油紅O-異丙醇溶液(Electron Microscopy Science，PA)。用100 μl新鮮製備之油紅O溶液(Oil-Red O solution，ORO)培育4 μm腎臟切片15分鐘且用蘇木精Harris Hg Free (VWR，PA)對比染色以檢測脂質沈積。使用光學顯微鏡(Olympus BX 41, Tokyo, Japan)評估腎小球染色。
電子顯微法。對於透射電子顯微法，將腎臟皮質切片置放於含4%多聚甲醛、1%戊二醛之0.1 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中。根據1 μM腎小球基底膜定量足突。
腎脂質物種分析。將腎臟皮質切片速凍且用於脂質提取及膽固醇含量測定。在冰上之玻璃沖洗器中，將組織均質化於2 mM磷酸鉀緩衝液中。用1 ml己烷:異丙醇(3:2)萃取於100 μl均質物(約5-10 mg組織)中之脂質，持續兩次連續30分鐘提取。隨後在氮氣氛圍中乾燥含有脂質之溶劑。隨後使用異丙醇：NP-40(9:1)復原脂質且根據製造商方案使用Amplex red膽固醇分析套組(Invitrogen)定量膽固醇含量。根據製造商說明書(Cayman)，藉由比色套組分析脂質提取物中之三酸甘油酯。使用酶螢光方法分析總膽固醇及膽固醇酯。對於總膽固醇，在分析緩衝液(100 mM磷酸鉀、50 mM NaCl、5 mM膽酸、0.1%曲拉通(Triton) X-10，pH 7.4)中稀釋腎脂質提取物且與補充有1 U/ml膽固醇氧化酶、1 U/ml膽固醇酯酶、1 U/ml辣根過氧化酶及75 μM Amplex Red之最終濃度的相同緩衝液一起培育。反應物在37℃下在黑色不透明96孔板(Greiner)中培育30分鐘，且使用530 nm激發及580發射在微定量盤式讀取器(Spectramax i3X，Molecular Devices)中量測螢光。
使用Mizoguchi等人(Mizoguchi,2004)所描述之直接方法分析膽固醇酯。簡言之，將150 µl FC分解試劑(45 U/ml牛過氧化氫酶及1 U/ml膽固醇氧化酶，在上文所描述之分析緩衝液中)添加至25 µl含有至多1 mM總膽固醇之樣品中。使游離膽固醇在37℃下分解隔夜且隨後添加75 µl 4X膽固醇酯偵測試劑(1 U/ml膽固醇氧化酶、4 U/ml膽固醇酯酶、24 U/ml辣根過氧化酶、300 μM Amplex Red)。在37℃下培育反應物30分鐘，且如上文關於總膽固醇所描述量測螢光。包括1 mM膽固醇及5 μM油酸膽固醇標準作為內部對照以驗證分析靈敏性及特異性。
病理學評估。腎臟皮質切片經石蠟包埋且針對過碘酸-希夫(Schiff) (periodic acid-Schiff，PAS)及HE在4 μm厚處切割。基於在雙盲實驗中進行之半定量分析(0-5級)或具有腎小球膜擴張之腎小球的百分比(%)，對腎小球膜擴張進行評估。
統計 統計。所有值均表示為具有SD之平均值。使用Prism GraphPad 7軟體進行統計分析。若使用超過一種化合物劑量且群組顯示正常資料分佈，則使用單因素ANOVA分析結果。若觀測到差異，則使用鄧尼特檢驗比較對照(媒劑)之平均值與各組之平均值。進行塔基檢驗以進行多次比較。
對於活體內研究，使用雙尾t測試比較媒劑及經Cpd處理之組。在不等變化之情況下使用韋爾奇修正法(Welch's correction)。當不可確證正態分佈時，亦使用曼惠特尼測試比較組。P值＜0.05視為統計顯著。
結果 . 化合物細胞毒性 . 吾人進行細胞毒性分析以測定可安全地用於經培養之人類足細胞中之Cpd濃度範圍。
所有化合物可以至多10 μM之濃度使用而無細胞毒性跡象。然而，當使用Cpd A及C時，吾人決定不超過5 μM之濃度，因為此兩種化合物在20 μM下誘導顯著毒性(圖3)。
ABCA1 表現及膽固醇流出 吾人進行活體外實驗以選擇在誘導足細胞中之ABCA1之功能性表現方面較好的化合物供進一步用於動物研究中。因此，吾人研究化合物對ABCA1蛋白質表現、在血漿膜處之ABCA1定位及ApoA1介導之膽固醇流出的影響。
化合物誘導之ABCA1表現係藉由西方墨點解決。所有LXR促效劑、Cpd C、Cpd E及Cpd D在低至1 μM之劑量下明顯增加足細胞中之ABCA1表現。在所測試之三種ABCA1誘導劑(Cpd A、Cpd F及Cpd G)中，僅Cpd A及Cpd G增加ABCA1表現，但在10 μM下，且不與LXR促效劑類似(圖4a)。
為了解決所觀測到之ABCA1表現增加是否與產生更多功能蛋白相關，吾人用1 μM Cpd C、5 μM Cpd A及10 μM Cpd G處理之足細胞進行細胞分離。首先驗證出ABCA1之表現隨著所用藥物濃度增加(圖4b)且藉由西方墨點檢驗所獲得部分中之每一者中的ABCA1定位。所獲得之部分亦針對已知分別位於質膜及胞質溶離份、Na+ /K+ ATP酶及MEK上之蛋白質點樣以驗證成功的細胞分離(圖4c-e)。所使用之三種化合物之劑量促進質膜處之ABCA1定位(圖4c)，且正如所料，在非膜胞質溶離份中未發現ABCA1。在用ABCA1誘導劑Cpd A及Cpd G處理之細胞的微粒體隔室中發現較少ABCA1 (圖4d)，表明相比於LXR促效劑，此等化合物在質膜處更有效促進此蛋白質之定位。另外，吾人使用ApoA1作為膽固醇載劑進行膽固醇流出分析。此分析量測ABCA1在膽固醇流出方面之功能性，因為ABCA1特異性地與ApoA1相互作用以用於將膽固醇自細胞轉移至初生HDL粒子。可在1 μM Cpd C (LXR促效劑)、5 μM Cpd A及10 μM Cpd G之情況下實現細胞ApoA1介導之流出的顯著增加(圖4d-e)。
基於此等活體外實驗，吾人選擇ABCA1誘導劑Cpd A及Cpd G以在腎損傷之動物模型中測試，以及LXR促效劑Cpd C作為參考。
ABCA1 誘導劑保護免受實驗性 FSGS 腎損傷之ADR模型為藥物誘導之蛋白尿腎病之模型，且仍為局部區段性腎小球硬化(FSGS)之最廣泛使用之實驗模型。用選自活體外實驗之化合物進行劑量範圍發現實驗。
ADR注射誘導嚴重暫時蛋白尿及體重損失。每週檢查白蛋白尿及體重。在用LXR促效劑處理之組中未觀測到顯著差異(Cpd C，圖5a)。然而，在接受30 mg/Kg Cpd A及100 mg/Kg Cpd G之組中，蛋白尿減少(圖5b及e)，且在較小程度上，在接受30 mg/Kg Cpd G之組中蛋白尿減少(圖5d)。類似地，注射ADR之動物經歷10-20%體重損失，其在用30 mg/Kg Cpd A及100 mg/Kg Cpd G (圖5g及j)處理但不用LXR促效劑(圖5f)之動物中得以阻止。
在第二獨立活體內實驗中，吾人利用較大數目之小鼠且選擇在先前實驗中發現為有利劑量之Cpd A及G，亦即30 mg/Kg Cpd A及100 mg/Kg Cpd G。類似於先前實驗中，ABCA1誘導劑均減少白蛋白尿且減輕體重(圖6b)。
由於發現化合物G為具有最佳有益效應之化合物，且腎病之ADR模型不呈現腎功能受損，因此吾人在用此化合物處理之動物中進行額外定量組織學研究。腎臟皮質之盲病理學研究揭示，接受100 mg/Kg/天Cpd G之動物之總體及區段性腎小球硬化、足細胞肥大及增生、管狀微囊及間質發炎減少(圖7)。此等資料一起證明化合物G在減少由阿德力黴素引起的FSGS之標誌方面高度有效，且比評估為比較劑之LXR促效劑更有效。
如吾人投與預期影響膽固醇代謝之化合物，吾人量測實驗動物血液中之膽固醇及三酸甘油酯含量。對於兩個臨床參數均未發現顯著差異(表1及表2)。
Figure 108126640-A0304-0004
 表 1. 在ADR注射之後，用媒劑、LXR促效劑(Cpd C)及ABCA1誘導劑(Cpd A及Cpd G)處理35天之動物中的血液膽固醇及三酸甘油酯。
Figure 108126640-A0304-0005
 表 2. 在ADR注射之後，用媒劑、LXR促效劑(Cpd C)及ABCA1誘導劑(Cpd A及Cpd G)處理28天之動物中的血液膽固醇及三酸甘油酯。
已記載腎損傷之環境中的腎組織中之脂質沈積。吾人執行油紅O (ORO)染色以測定在注射有ADR之動物中是否存在脂質積聚及Cpd G是否可降低此作用。脂質小液滴之顯著沈積發現於經ADR注射之小鼠腎臟中，其在用Cpd G處理之動物中顯著減少(圖8)。實際上，已接受媒劑之經ADR注射之小鼠展示腎臟皮質中之顯著脂質沈積，且相比之下，Cpd G回應於ADR而完全防止腎小球脂質之堆積，表明與年齡匹配之正常對照小鼠相比，在腎臟皮質之脂質中無可偵測之積聚。
為了測定積聚於腎組織中之脂質之物種，吾人提取用於腎臟皮質之脂質，且針對三酸甘油酯、總膽固醇及膽固醇酯對其進行分析。吾人未能發現來自注射有ADR或普通鹽水溶液之動物的腎臟之間的三酸甘油酯及總膽固醇含量之差異。然而，吾人發現經ADR注射之小鼠中酯化膽固醇含量顯著較高，其經Cpd G處理顯著降低(圖9a-c)。在腎組織中偵測到之白蛋白尿之嚴重程度與膽固醇酯含量之間存在強相關性(圖9d)，但與所分析之其他脂質物種不存在強相關性(圖9e及f)。經ADR注射之小鼠之Cpd G處理預防膽固醇酯積聚且不希望受任何理論束縛，咸信此化合物可經ABCA1之上調來改良腎小球膽固醇移除。
吾人隨後藉由血清學研究化合物C、A及G毒性。更特定言之，吾人確定所有經處理之動物的血容比、血紅素白細胞血球計數及肝轉胺酶ALT及AST，以確定肝毒性及惡血質是否與該等化合物相關。在實驗小鼠中未發現此類毒性之明顯跡象(表3)
Figure 108126640-A0304-0006
 表 3 ： 當與經媒劑處理之對照相比時，用化合物處理35天之後，用化合物C、A或G處理之動物未展示WBC、血紅素、血容比及ALT及AST轉胺酶含量之異常。資料表示各參數之平均值及標準差。
用最佳劑量之Cpd G處理之動物的身體外觀比在整個實驗中接受ADR之動物好。此在治療之第3週及第4週期間特別明顯(圖10)。
Cpd G 保護進行性腎病 ( 奧爾波特症候群 ) 之小鼠模型免受腎衰竭 未經處理之CoL4a3 KO小鼠在第4週與第8週之間出現嚴重白蛋白尿及高BUN及血清肌酐水準。此等小鼠在8週齡時達到ESRD且未存活超過該時間點。
為研究Cpd G在奧爾波特症候群模型中之腎保護作用，吾人在4週齡開始用100 mg/Kg Cpd G或媒劑處理CoL4a3 KO小鼠4週。與僅接受媒劑之動物相比，用100 mg/Kg Cpd G處理之動物展示延遲發展為ESRD，具有明顯更少白蛋白尿、BUN及血清肌酐(參見圖11)。用Cpd G處理之動物所損失之重量亦小於接受媒劑之動物所損失之重量。
腎臟切片之組織學分析顯示，與用媒劑處理之Col4a3 KO小鼠相比，用Cpd G處理之Col4a3 KO小鼠中之腎小球膜擴張明顯較少。進行單獨研究以調查用Cpd G處理確定已患有腎衰竭的小鼠是否會引起存活率提高。實際上，即使對患有相對晚期CKD之6週齡小鼠開始用Cpd G處理，用Cpd G處理之Col4a3 KO小鼠中腎功能之改善與死亡率降低相關，從而延長幾乎15%之壽命。
最後，來自8週齡Col4a3 KO小鼠之腎臟皮質切片展示顯著脂質積聚(增加之油紅O染色)，其在接受Cpd G之動物中減少(參見圖13)。與ADR模型中之先前結果一致，在Col4a3 KO小鼠之腎臟中之膽固醇酯顯著高於WT同窩幼畜，該膽固醇酯藉由用Cpd G處理顯著減少。
CpdA 部分地保護小鼠模型免受糖尿病性腎病 增加之 ABCA1 恢復足細胞損傷及 DKD 吾人旨在在肥胖糖尿病db/db小鼠模型中驗證ABCA1作為DKD之治療目標。與經媒劑處理之db/db小鼠相比，用ABCA1之藥理學誘導劑處理之db/db小鼠在處理兩週之後(16週)經歷白蛋白尿減少，且在處理四週之後(18週)經歷甚至進一步減少(圖12A)。發現血尿素氮(BUN)顯著改良(圖12B)，與db/db小鼠相比，其與ABCA1誘導劑(化合物A)處理組中之膽固醇酯之顯著減少(圖12C-D)相關。腎臟皮質切片用於各種組織學評定，其展示db/db小鼠中之ABCA1誘導劑處理經歷改良：如藉由定量WT1陽性細胞所測定之足細胞數目(圖12E-F)、如使用PAS染色切片所測定之腎小球膜擴張(圖12G-H)及如使用TEM影像所測定之足細胞足突消失(圖12I-J)。
圖 1. 測試在 Balb/c 小鼠中之 ADR 誘導之 腎病變 中之化合物的最佳劑量的實驗設計。 經由尾部靜脈注射以12 mg/kg之劑量向30隻雌性Balb/c小鼠注射Doxorubin (ADR，阿德力黴素(adriamycin))。基準組之5隻小鼠接受鹽水溶液。隨後將經ADR注射之小鼠分成6組，每組五隻動物，產生總共七個實驗組。第二天開始，藉由經口管飼每日投與一次化合物持續5週。每週收集尿液且每週記錄體重。在經ADR注射後35天在處死時收集血液及腎臟皮質。圖 2. 測試在 Balb/c 小鼠中之 ADR 誘導之腎病變中之化合物的實驗設計。 經由尾部靜脈注射以12 mg/kg之劑量向雌性Balb/c小鼠注射Doxorubin (ADR，阿德力黴素)。對照組之5隻小鼠接受鹽水溶液。將經ADR注射之雌性分成五組，每組6隻。第二天開始，如所指示藉由經口管飼每日投與一次媒劑或化合物持續4週。每週收集尿液且每週記錄體重。在經ADR注射後28天在處死時收集血液及腎臟皮質。
圖 3. 分化之人類足細胞中之化合物細胞毒性。 將分化之人類足細胞用0 μM (媒劑)、1 μM、5 μM及10 μM之Cpd A、Cpd C、Cpd D、Cpd E、Cpd F及Cpd G處理18小時。使用Promega CytoTox分析套組評估細胞毒性。將用普通培養基(空心棒)之處理用作基準。將細胞毒性信號根據存活率信號正規化以消除因細胞數目差異所致之偏差。將所有處理與經媒劑處理之細胞進行比較。在高於10 μM之濃度下僅發現Cpd A及Cpd C之顯著毒性。單因素ANOVA，n=3獨立實驗，鄧尼特檢驗(Dunett test)，*p＜0.5，***p＜0.001。圖 4. 用 Cpd C 、 Cpd A 及 Cpd G 處理增加分化之足細胞中之 ABCA1 表現及膽固醇流出。 如所指示用媒劑(0.1% DMSO)或化合物處理分化之人類足細胞18小時，且量測ABCA1表現、局部化及參與膽固醇流出。(a ) 在整個細胞溶解物中之ABCA1及GAPDH西方墨點顯示用LXR促效劑(Cpd C、E及D)之ABCA1表現的較強誘導及用10 μM ABCA1誘導劑Cpds A及G的適度誘導。(b-e ) Cpd C、Cpd A及Cpd G增加ABCA1在質膜處之表現。對如所指示之用媒劑或化合物C、A及G處理18小時之分化之人類足細胞進行細胞分離。(b ) 整個細胞溶解物中之ABCA1及GAPDH西方墨點，其顯示在用Cpd A (5 μM)及Cpd G(10 μM)處理之後ABCA1表現適度增加。(c-e ) 質膜、微粒體及細胞溶質收集部分，該等收集部分針對ABCA1、Na+ /K+ ATP酶泵及MEK進行印跡及探測。(f-h ) Cpd C、A及G增加分化之足細胞中之ApoA1介導之膽固醇流出。如所指示將負載有[3 H]-膽固醇之分化之足細胞與化合物一起培育18小時。在將細胞與或不與ApoA1一起培育18小時之後，計算ApoA1介導之膽固醇流出。資料報導為具有s.d之至少三個獨立實驗之平均值。單因素ANOVA，鄧尼特之檢驗(Dunnett's test)，*P＜0.05%，**P＜0.01%。圖 5. 選擇最佳劑量之化合物以減弱由 ADR 誘導之腎損傷。 (a-e ) 在用指定劑量之cpd處理5週期間之經ADR注射之小鼠中之白蛋白尿。小鼠在ADR注射之後2-3週產生大量蛋白尿，其在用30 mg/Kg Cpd A(b) 及100 mg/Kg Cpd G (e )之劑量處理之小鼠中減弱。 (f-j ). 經ADR注射之小鼠的特徵為在ADR注射之後二至三週體重顯著下降，表現型即在接受30 mg/kg Cpd A或100 mg/kg Cpd G之小鼠中部分減輕。所展示之結果表示各組之平均值及SE。單因素ANOVA n=5，鄧尼特檢驗(Dunett test)，*P＜0.05%。
圖 6. ABCA1 誘導劑 Cpd A 及 Cpd G 顯著減少在注射有 ADR 之小鼠中之白蛋白尿且體重減輕。 注射有ADR (12 mg/Kg)之小鼠接受媒劑、LXR促效劑Cpd C或最佳劑量之ABCA1誘導劑Cpd A及Cpd G，每日一次，持續28天。每週一次量測白蛋白尿及體重。(a ) 在處理4週之後之白蛋白尿。(b ) 體重損失表示為各小鼠在4週處理之後及在ADR注射之前一天具有的體重之間的差值。基準組、未注射ADR之小鼠(展示於左側)反映無腎臟損傷之表現型。條形圖表示各處理組之中值及範圍。將所有組與使用曼惠特尼檢驗(Mann Whitney test)接受媒劑之組相比(n=8，*P＜0.05%，**P＜0.01%，****P＜0.0001%)。圖 7. 來自注射有ADR且用媒劑或100 mg/Kg/天之Cpd G處理4週之動物之腎臟的PAS及HE切片之病理檢查。病理學家評估總體硬化症(A )之%、部分硬化症(B )之%、足細胞肥大(C )、足細胞增生(D )、管狀微囊(E )及間質炎症(F )。比例值表示如下：0：0%、0.5+：1-10%、1+：11-25%、2+：26-50%、3+：51-75%、4+ ＞75%。將來自經Cpd G組處理之樣品與使用曼惠特尼檢驗處理之媒劑進行比較(n=7；*P＜0.05%)圖 8. 用媒劑或100 mg/Kg Cpd G處理注射有鹽水溶液或ADR之小鼠28天。用ORO將腎臟皮質切片染色以檢測脂質小液滴沈積。來自健康基準組(A)之切片的代表性圖像，該組注射有ADR且用媒劑(B)及100 mg/kg/天之Cpd G (C)處理。
圖 9. Cpd G 減少經 ADR 注射之小鼠之腎組織中之酯化膽固醇之堆積。 分析自用媒劑或Cpd G處理28天之經ADR注射之小鼠之腎臟皮質提取的脂質的膽固醇酯、總膽固醇及三酸甘油酯。將各脂質物種之量根據樣品中所存在之總蛋白質正規化。在腎組織中發現之(a )酯化膽固醇、(b )總膽固醇含量及(c )三酸甘油酯含量。未接受ADR注射之動物顯示於左側且在未誘發腎損傷時表示基準值。使用曼惠特尼雙尾檢驗(Mann Whitney double tailed test)比較用Cpd G及媒劑處理之組，n=8；****P＜0.0001%。(d-f) 。各小鼠之白蛋白尿與其腎臟皮質中存在之脂質物種之量之間的相關性。在膽固醇酯(d) 之情況下發現強相關性，但在總膽固醇(e) 及三酸甘油酯(f) 之情況下未發現強相關性。皮爾森檢驗(Pearson test)，n=10。圖 10. 在ADR注射之後一天用媒劑或100 mg/Kg Cpd處理注射有12 mg/Kg ADR之動物。在用媒劑(A-B )及100 mg/Kg Cpd G (C-D) 處理20天之後拍攝的圖像。圖 11. 用 Cpd G 處理之 Col4A3 KO 小鼠延遲發展至末期腎病。 用媒劑或100 mg/Kg Cpd G處理4週齡之129-Col4A3 KO小鼠4週。在實驗結束時，56天，量測體重、收集單點尿樣本及血液且分析腎臟之脂質積聚。(a )白蛋白尿、(b )血清肌酐、(c )血尿素氮及(d )用媒劑或Cpd G處理之KO小鼠之體重。(e )來自各組之經PAS染色之腎臟切片之代表性圖像，(f )在e 中提及之經PAS染色之腎臟切片之盲病理學分析之後的系膜擴張定量。在無慢性腎病存在之情況下，在左側包括同一年齡之Col4a3+/+小鼠(wt)以反映表現型。(g )自6週齡開始，接受媒劑或Cpd G (100 mg/Kg/天)持續4週之129-Col4a3 KO小鼠之生存曲線。水平條形圖表示各組之中值。使用雙尾曼惠特尼檢驗計算各組之間的統計學差異，n=4，*P＜0.05%，**P＜0.01%。
圖 12. 利用經Db/+、db/db媒劑處理及db/db ABCA1誘導劑(化合物A)處理之小鼠且分析：在(A )中在處理開始(14週)時、在處理2週(16週)之後及在處理4週(18週)之後處死時測定之白蛋白與肌酸酐比率；自小鼠血清測定且以mg/dL形式呈現之血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN) (B )；呈總膽固醇(total cholesterol，TC)、無膽固醇(free cholesterol，FC)及膽固醇酯(cholesterol ester，CE)形式之腎臟皮質膽固醇含量(每mg蛋白質之nmol膽固醇之倍數變化) (C )； BUN與CE之間的相關性(D )；經由WT1抗體測定之每個腎小球截面之足細胞數目(E )及定量之其(F )；使用經PAS染色之腎臟皮質切片之腎小球膜擴張評估(G )及定量之其(H )；由TEM影像測定之足細胞足突消失(I )及定量之其(J )。單因素ANOVA，隨後為塔基檢驗(Tukey's test)*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。圖 13. Cpd G 減少腎臟皮質中之酯化膽固醇積聚 自在4週齡起始接受媒劑或Cpd G 28天之8週齡Col4A3KO之腎臟皮質中來測定(a )酯化膽固醇(CE)、(b )總膽固醇(TC)及(c )三酸甘油酯含量(TG)。將各脂質之含量根據總蛋白質含量正規化。一組野生型同窩幼畜亦包括於此研究中(空心圓)。水平條形圖表示各組之中值。使用雙尾曼惠特尼測試來測定統計學差異(n=8)，*P＜0.05，**P＜0.001。
Figure 108126640-A0101-11-0002-1

Claims (27)

  1. 一種用於治療腎病之化合物，其中該化合物為ABCA1誘導劑化合物。
  2. 如請求項1所使用之化合物，其係由以下式I表示：
    Figure 03_image027
    其中 A1 及A2 中之一者為N及A1 及A2 中之另一者為CH； R1 係選自由以下組成之群：C1-7 烷基、C3-7 環烷基、C3-7 環烷基-C1-7 烷基、C1-7 烷氧基-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷基；雜環基-C1-7 烷基，其中該雜環基未經取代或經側氧基(oxo)取代；及雜芳基-C1-7 烷基，其中該雜芳基未經取代或經低碳烷基單取代或雙取代； R2 及R6 彼此獨立地為氫或鹵素； R3 及R5 彼此獨立地選自由以下組成之群：氫、C1-7 烷基、C1-7 烷氧基、鹵素、鹵素-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷氧基及氰基； R4 係選自由以下組成之群：氫、C1-7 烷基、C1-7 烷氧基、鹵素、鹵素-C1-7 烷基、鹵素-C1-7 烷氧基、胺基及氰基； R7 係選自由以下組成之群：C1-7 烷基；C3-7 環烷基，該環烷基未經取代或經羥基取代；雜環基，該雜環基具有3至7個環原子，包含一個、兩個或三個選自N、O及S之雜原子，且未經取代或經羥基或側氧基取代；苯基，其中苯基未經取代或經一個或兩個選自由以下組成之群的基團取代：C1-7 烷基、羥基、C1-7 烷氧基、氰基、鹵素及鹵素-C1-7 烷基；以及雜芳基，其中雜芳基未經取代或經一個或兩個選自由以下組成之群的基團取代：C1-7 烷基、羥基、C1-7 烷氧基、氰基、鹵素及鹵素-C1-7 烷基，及 G係選自由以下組成之群：-(CH2 )m-，其中m選自0或1；及-NR8 -，其中R8 為氫或C1-7 烷基， 及其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1或2所使用之化合物，其中G為一鍵且R7 為C3-7 環烷基，該環烷基未經取代或經羥基取代。
  4. 如請求項3所使用之化合物，其中R7 為經羥基取代之環己基。
  5. 如請求項1或2所使用之化合物，其中R2 及R6 各自為氫，R4 為鹵素，且R3 及R5 中之一者為鹵素且R3 及R5 中之另一者為氫。
  6. 如請求項1或2所使用之化合物，其中R1 為鹵素-C1-7 烷基。
  7. 如請求項6所使用之化合物，其中R1係選自-CF3 、-CHF2 、-CH2 Cl、-CH2 CF3 、-CH(CF3 )2 、-CF2 -CF3 。
  8. 如請求項1或2所使用之化合物，其為6-(3,4-二氯苯基)-N-[(1R,2R)-2-羥基環己基]-5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-甲醯胺。
  9. 如請求項1或2所使用之化合物，其為5-(3,4-二氯-苯基)-N-((1R,2R)-2-羥基-環己基)-6-(2,2,2-三氟-乙氧基)-菸鹼醯胺。
  10. 如請求項1或2所使用之化合物，其中該腎病係選自慢性腎病、原發性或繼發性腎小球疾病或蛋白尿腎病。
  11. 如請求項10所使用之化合物，其中該腎小球疾病為奧爾波特症候群(Alport syndrome)或局部區段性腎小球硬化。
  12. 如請求項10所使用之化合物，其中該腎病係選自糖尿病性腎病。
  13. 如請求項1或2所使用之化合物，其經調配用於經口投與。
  14. 如請求項1或2所使用之化合物，其經調配用於局部、鼻內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、玻璃體內、鞘內或經皮投與。
  15. 如請求項1或2所使用之化合物，其中每日劑量為20至800毫克/天。
  16. 如請求項1或2所使用之化合物，其中每日劑量為200毫克/天。
  17. 如請求項1或2所使用之化合物，其中給藥方案為每天一次、每天兩次、一天三次、每三天一次、每週一次、每兩週一次或每月一次。
  18. 如請求項1或2所使用之化合物，其中速效劑量(loading dose)方案加倍前7天、14天或30天之劑量。
  19. 如請求項1或2所使用之化合物，其用於與選自由以下組成之群的化合物同時、依序或分開使用：血管收縮素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制劑藥物、RAS阻斷劑、血管收縮素受體阻斷劑(angiotensin receptor blockers，ARBs)、蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)抑制劑、AGE依賴路徑之抑制劑、消炎劑、GAGs、吡哆胺、內皮素拮抗劑、COX-2抑制劑、PPAR-γ拮抗劑，及其他化合物，如阿米福汀(amifostine)、卡托普利(captopril)、環磷醯胺、硫代硫酸鈉、曲尼司特(tranilast)，或環糊精及其衍生物，維生素D衍生物、抗高血糖劑及抗高膽固醇劑。
  20. 一種如請求項2之式I化合物或醫藥學上可接受之鹽，其用於製備用以治療及/或預防腎病之藥劑。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至16中任一項之化合物及醫藥學上可接受之載劑及/或佐劑。
  22. 一種如請求項1至9中任一項之ABCA1誘導劑之用途，其用於製造用以治療有需要個體之腎病的藥劑。
  23. 如請求項22之用途，其中該ABCA1誘導劑係藉由局部、經口、鼻內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、玻璃體內、鞘內或經皮途徑投與。
  24. 如請求項22或23之用途，其中該藥劑係每天一次、每天兩次、一天三次、每三天一次、每週一次、每兩週一次或每月一次，較佳每天一次投與。
  25. 如請求項22或23之用途，其中如請求項1至9中任一項之ABCA1誘導劑之每日劑量在20至800毫克/天範圍內。
  26. 如請求項22或23之用途，其中該ABCA1誘導劑與治療有效量之血管收縮素轉化酶抑制劑或血管收縮素受體阻斷劑同時、分開或依序投與。
  27. 如請求項22或23之用途，其中該ABCA1誘導劑與治療有效量之選自由以下組成之群的化合物同時、分開或依序投與：血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑藥物、RAS阻斷劑、血管收縮素受體阻斷劑(ARBs)、蛋白激酶C (PKC)抑制劑、AGE依賴路徑之抑制劑、消炎劑、GAGs、吡哆胺、內皮素拮抗劑、COX-2抑制劑、PPAR-γ拮抗劑，及其他化合物，如阿米福汀(amifostine)、卡托普利(captopril)、環磷醯胺、硫代硫酸鈉、曲尼司特(tranilast)，或環糊精及其衍生物，維生素D衍生物、抗高血糖劑及抗高膽固醇劑。
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