KR20240058898A - 히스톤 디아세틸라제 6 및 열 충격 단백질 90의 이중 억제제 - Google Patents

히스톤 디아세틸라제 6 및 열 충격 단백질 90의 이중 억제제 Download PDF

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윤 엔
쿠오-시앙 추앙
징-핑 리우
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타이페이 메디컬 유니이버시티
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Abstract

본 발명은 종양 미세환경으로부터의 면역 억제 제거 또는 종양에 대한 면역계의 자극을 통해 종양의 개선 및/또는 치료를 위한 히스톤 디아세틸라제 6(HDAC6) 및 열 충격 단백질 90(HSP90)을 억제하는 이중 억제제를 제공한다. 이중 억제제를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 용도도 제공된다.

Description

히스톤 디아세틸라제 6 및 열 충격 단백질 90의 이중 억제제
우선권
본 출원은 2021년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/241,066호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 약제학적 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 6 및 열 충격 단백질 90의 이중 억제제에 관한 것이다.
종양 형성은 개시, 진행, 및 전이의 세 단계로 구성된 복잡하고 역동적인 과정이다. 종양은 세포외기질(ECM)과 기질세포(stromal cell)로 둘러싸여 있으며, 종양 미세환경(TME)의 생리학적 상태는 종양 형성의 모든 단계와 밀접하게 연결되어 있다. TME는 신체 내부의 종양을 둘러싸고 있는 생태계이다. 여기에는 면역 세포, 세포외기질, 혈관 및 섬유아세포와 같은 기타 세포가 포함된다. 질환의 심각성으로 인해 TME를 관리하고 암을 치료하기 위한 효과적인 전략을 개발하는 것이 중요하다.
본 명세서는 종양 미세환경으로부터 면역 억제를 제거하거나 종양에 대한 면역계를 자극하기 위한 이중 억제제를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소 농축 유도체 또는 전구약물을 나타내고,
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
R1은 수소 또는 알킬이고,
R2는 알킬이거나 이고, 여기서 R2a는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시, NR'R", 헤테로사이클릴 또는 아릴을 나타내거나, 인접한 두 개의 R2a는 이들이 부착된 페닐의 탄소 원자와 함께 페닐에 융합된 헤테로사이클릴을 형성하며, 상기 헤테로사이클릴 및 아릴은 비치환되거나 또는 알킬, 할로겐, 하이드록시, NR'R", 알콕시 또는 하이드록시로 치환되고, 상기 헤테로사이클릴은 N, O, S 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하되, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 수소 또는 알킬을 나타내고,
L은 이고, 여기서 n은 0 또는 1이고, L1은 결합, 알킬렌 또는 알케닐렌이되, 단, n이 1인 경우, L1은 결합이 아니며,
R3은 OH이거나, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 하이드록시 또는 NR'R"로 선택적으로 치환된 페닐이되, 여기서 R' 및 R"은 독립적으로 수소 또는 알킬을 나타낸다.
본 발명의 일부 구현예에서, R1은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2-부틸 또는 2,2-디메틸에틸이다.
본 발명의 일부 구현예에서, R2는 C1-6 알킬 또는 이다.
본 발명의 일부 구현예에서, R2는 메틸, 에틸, 프로필, 페닐, 플루오로페닐, 클로로페닐, 요오도페닐, 벤조디옥솔, 모르폴리노페닐, (디메틸아미노)페닐, 메틸피페라지닐, 피페리디닐페닐, 메톡시페닐 또는 하이드록시페닐이다.
본 발명의 일부 구현예에서, L은 결합, 또는 L은 이되, n은 1이고, L1은 C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이다.
본 발명의 일부 구현예에서, R3은 OH이거나, 또는 NR'R"로 치환된 페닐이다.
본 발명의 일부 구현예에서, R1은 C1-C6 알킬이고, R2는 C1-6 알킬 또는 이고, L은 결합이고, R3은 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 하이드록시 또는 NR'R"로 선택적으로 치환된 페닐이되, 여기서 R' 및 R"은 독립적으로 수소 또는 알킬을 나타낸다.
본 발명의 일부 구현예에서, R1은 C1-C6 알킬이고, R2는 C1-6 알킬 또는 이고, L은 결합 또는 알케닐렌이고, R3은 OH이다.
본 발명의 일부 구현예에서, R1은 C1-C6 알킬이고, R2는 이고, L은 이되, 여기서 n은 1이고, L1은 C1-C6 알킬렌이고, R3은 OH이다.
본 발명의 일부 구현예에서, R1은 이소프로필이고, R2는 4-메톡시페닐이고, L은 이고, 여기서 (1) n은 1이고, L1은 알킬렌이거나, (2) n은 0이고, L1은 알케닐렌이고, R3은 OH이다.
화합물의 예에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-메틸벤즈아미드, N-에틸-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-페닐벤즈아미드, N-(4-플루오로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, N-(4-클로로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일) 벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-N-(4-요오드페닐)-5-이소프로필벤즈아미드, N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-모르폴리노페닐)벤즈아미드, N-(4-(디메틸아미노)페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(피페리딘-1-일)페닐)벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질)-5-이소프로필-N-(4-메톡시-페닐)-벤즈아미드, 및 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질)-N-(4-하이드록시-페닐)-5-이소프로필-벤즈아미드.
또한, 본 발명은 또한 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물을 이중 억제제로서 포함하는 약제학적 조성물 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 제공한다.
본 발명은 또한 종양의 개선 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양의 개선 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 특히 면역 관문(immune checkpoint)이 PD-1인 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 종양 표적 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 종양 표적 억제제의 예로는 항-EGFR 항체와 같은 항체가 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 화학요법 약물, 호르몬 요법 약물, 면역요법 약물 및 종양 특이적 억제제와 같은 항암 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 화학요법 약물의 예로는 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 토포이소머라제 I 및 II 억제제, 유사분열 억제제, 백금계 약물, 스테로이드 또는 항혈관신생제가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 면역요법 약물의 예로는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, CTLA-4 억제제 및 TF 억제제가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 종양의 개선 및/또는 치료가 필요한 대상체에서 종양의 개선 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 종양 미세환경으로부터의 면역 억제 제거 또는 종양에 대한 면역체계 자극이 필요한 대상체에서 종양 미세환경으로부터 면역 억제를 제거하거나 종양에 대한 면역체계를 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 미세환경으로부터의 면역 억제를 제거하거나 이러한 제거 또는 자극을 필요로 하는 대상체에서 종양에 대한 면역계를 자극하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 히스톤 디아세틸라제 6 (HDAC6)의 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 히스톤 디아세틸라제 6 (HDAC6)을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 IFN-γ에 의해 유도된 STAT1 경로의 신호 변환기 및 활성화제를 차단하기 위한 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 방법은 종양의 예정된 세포사 리간드 1(programmed death ligand 1; PD-L1) 또는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제(IDO)의 발현을 낮추기 위한 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 α-튜불린 및 히스톤의 아세틸화를 억제하기 위한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 HDAC6 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 HDAC6 억제를 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 세포독성 T 세포의 침윤의 유도를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 세포독성 T 세포의 침윤을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 그랜자임 B(granzyme B) 발현을 유도하기 위한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 세포독성 T 세포의 침윤의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 미세환경에서 세포독성 T 세포의 침윤을 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 열 충격 단백질 90(HSP90)의 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 열 충격 단백질 90(HSP90)을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 종양 성장을 위해 단백질을 불안정화하기 위한 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 열 충격 단백질 70(HSP70) 발현을 증가시키기 위한 것이다. 또한, 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 Src, AKT, 망막모세포종 단백질(Rb) 또는 국소 접착 키나아제(FAK)의 발현을 감소시키기 위한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 HSP90 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 HSP90 억제를 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 종양의 예로는 대장암, 췌장암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신세포 암종, 유방암, 두경부암, 전립선암, 악성 신경교종, 골육종, 위암, 악성 중피종, 다발골수종, 난소암, 활막육종, 갑상선암 또는 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 종양 재발의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 재발을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 재발의 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 재발을 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 Treg 세포 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에서 Treg 세포 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 Treg 세포 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에서 Treg 세포 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 중추 기억 T 세포 수준의 증가가 필요한 대상체에서 중추 기억 T 세포 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 중추 기억 T 세포 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 중추 기억 T 세포 수준을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
도 1은 HSP90/HDAC 이중 억제제가 IFN-γ 유도 대장암 세포에서 PD-L1 발현을 억제하는 것을 보여준다. HCT116 세포의 PD-L1 발현은 32 x 104 세포/웰의 6웰 플레이트에서 100ng/ml IFN-γ에 의해 유도된 후 1μM HSP90/HDAC 이중 억제제를 48시간 동안 투여했다. HCT116 세포의 PD-L1 발현은 각 유도체 SD에 대한 유세포 분석으로 측정되었다.
도 2a 및 도 2b는 화합물 75가 HDAC6 및 HSP90 활성을 억제한다는 것을 보여준다. 도 2a는 화합물 75(0.25 내지 1μM), 양성 대조군 SAHA(0.25 내지 1μM) 또는 DMSO(대조군)가 인간 대장암 세포 HCT116 내에서 6웰 플레이트, 32 x 104 세포/웰에서 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis)을 통해 6시간 동안 테스트되었음을 보여준다. α-튜불린과 히스톤 H3 아세틸화 능력을 측정했다. 도 2b는 다양한 HSP90 클라이언트 단백질(HSP90, HSP70, Src, AKT, p-Rb, Rb, FAK)을 화합물 75(0.25 내지 1μM), 양성 대조군 STA9090(0.25μM) 또는 DMSO(대조군)로 48시간 동안 분석되었음을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 화합물 75가 정상 세포주에 대한 세포독성에 미치는 영향을 보여준다. 세포를 DMSO 또는 다른 농도의 화합물 75로 48시간 동안 처리하고 MTT 분석으로 세포 생존율을 평가했다. 도 3a는 CCD841CON (인간 유래 결장 세포)를 나타낸다. 도 3b는 IMR90(인간 유래 폐 세포)를 나타낸다. 데이터는 평균 ± S.D로 표시된다. N 값이 3보다 크다. 대조군과 비교하여 * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 이다.
도 4a 및 도 4b는 화합물 75가 IFN-γ 유도 PD-L1 및 IDO 발현을 억제한다는 것을 보여준다. 도 4a는 인간 결장암 세포(HCT116 및 LS174T), 인간 췌장암 세포(Mia paca-2 및 BXPC3), 인간 폐암 세포(A549) 및 마우스 결장암 세포(CT26 세포)의 세포막에서 IFN-γ 유도 PD-L1 발현을 보여준다. 세포를 32 x 104 세포/웰로 구성된 6웰 플레이트에서 테스트하고 48시간 동안 화합물 75와 공동 처리하고 유세포 분석, Bar, 표준편차(SD)로 분석했다. 도 4b는 웨스턴 블롯 분석에서 IFN-γ에 의해 유도되고 화합물 75(표시된 농도)와 48시간 동안 병용 처리한 HCT116 및 CT26 세포의 PD-L1 및 IDO 발현을 보여준다.
도 5a 내지 도 5d는 화합물 75가 면역 능력이 있는 마우스(Balb/c)에서 대장암 세포(CT26) 종양의 성장을 억제하는 데 사용되었음을 보여준다. CT26 세포를 2 x 105 세포로 마우스의 등에 피하 주사했으며, 도 5a에 도시된 바와 같이, 화합물 75를 대장암 종양(CT26, 50 mm3)이 있는 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 이틀마다 10 mg/kg, 25 mg/kg 및 50 mg/kg으로 24일 동안 투여하였다. 각 마우스의 종양 크기(도 5b) 및 평균 종양 크기(도 5c)를 주기적으로 측정했다. Bar, SEM. 도 5d는 마우스의 체중을 보여준다; Bar, 표준편차. N 값이 3보다 크다.
도 6a 및 도 6b는 화합물 75가 백혈구 및 림프구 수에 미치는 영향을 보여준다. 화합물 75를 CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에 이틀마다(10, 25 및 50 mg/kg) 투여하고, 25일째에 심장에서 혈액을 채취했다. 혈액을 백혈구 및 림프구 수(도 6a에 표시됨) 및 림프구 백분율(도 6b에 표시됨)에 대해 분석했다.
도 7a 내지 7c는 화합물 75의 혈액독성 분석을 보여준다. 화합물 75를 CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에 이틀마다(10, 25 및 50 mg/kg) 투여하고, 25일째에 심장에서 혈액을 채취하여 적혈구(도 7a 참조), 헤모글로빈(도 7b) 및 혈소판(도 7c) 수를 분석했다.
도 8a와 도 8b는 화합물 75를 대장암 종양(CT26)이 있는 마우스에게 꼬리를 통해 이틀마다 10 mg/kg, 25 mg/kg 및 50 mg/kg의 양으로 정맥 주사로 투여했음을 보여준다. 대장암 종양이 있는 생쥐에서 꼬리 정맥 주사 후 25일에 종양을 제거하고 면역조직화학적으로 염색하였다. 도 8a는 PD-L1 및 IDO(갈색)의 발현을 보여준다. 도 8b는 HistoQuest 소프트웨어를 사용하여 정량 분석이 수행되었음을 보여준다. Bar, 표준편차.
도 9a 내지 도 9c는 대장암 종양(CT26)이 있는 면역 능력이 있는 마우스 (Balb/c)에서 화합물 75를 이틀에 한 번 꼬리를 통해 10 mg/kg, 25 mg/kg 및 50 mg/kg의 농도로 정맥 주사했음을 보여준다. 25일째에 마우스로부터 종양을 제거하고 파라핀에 포매(embeding)하고 면역조직화학적 염색을 위해 절개하였다. 도 9a는 CD8 세포독성 T 세포의 양을 보여준다. 도 9b는 그랜자임 B의 발현을 보여준다. 도 9c는 HistoQuest 소프트웨어를 사용하여 정량 분석이 수행되었음을 보여준다. Bar, 표준편차.
도 10a 내지 10c는 화합물 75에 의한 말초 혈액의 면역 세포 조절을 보여준다. CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스를 이틀마다 10, 25 및 50 mg/kg의 화합물 75로 치료하고, 심장에서 혈액을 채취하여 25일째에 세포독성 T 세포(CD3+CD8+)(도 10a 참조), 헬퍼 T 세포 (CD3+CD4+)(도 10b 참조) 및 조절 T 세포 (CD3+CD4+FOXP3+)(도 10c 참조)에 대해 유세포 분석을 통해 분석했다. 데이터는 평균 ± 표준편차(S.D)로 표시된다. N 값이 3보다 크다. 대조군과 비교하여 * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 이다.
도 11a 및 도 11b는 화합물 75가 말초 혈액 사이토카인에 미치는 영향을 보여준다. CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에 이틀마다 10, 25 및 50 mg/kg의 화합물 75로 처리하고 25일째에 희생시켰다. 데이터는 평균 ± S.D로 표시된다. N 값이 3보다 크다. 대조군과 비교하여 * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 이다.
도 12a 내지 도 12c는 화합물 75가 생체 내 항-PD1 치료의 효과를 향상시킨다는 것을 보여준다. CT26 세포를 2 x 105 세포와 함께 면역 능력이 있는 마우스(Balb/c)의 등에 피하 주사하고, 화합물 75를 이틀마다 50mg/kg으로 투여했다; 항-PD1 200μg를 3일마다 투여하고, 6회 용량의 항-PD1을 꼬리를 통해 대장암 종양(CT26, 50 mm3)이 있는 마우스에 24일 동안 정맥 주사했다(도 12a 참조). 각 마우스의 종양 크기(도 12b 참조) 및 평균 종양 크기(도 12c 참조)를 주기적으로 측정했다. Bar, SEM. (D) 마우스의 체중; Bar, SD. N 값이 3보다 크다.
도 13a 내지 도 13c는 화합물 75가 화학요법제 CPT-11의 종양 억제 능력을 향상시킨다는 것을 보여준다. CT26을 면역 능력이 있는 마우스 (BALB/c)에 피하 주사했다. 마우스는 종양이 50 내지 100 mm3로 성장했을 때 CPT-11 또는 화합물 75와 CPT-11의 병용물로 처리했다. CPT-11은 연속 7일 동안 20 mg/kg을 투여했고, 화합물 75는 이틀마다 50 mg/kg으로 투여했다(총 8회 투여, 14일 후 현탁액 투여). 마우스는 25일째에 희생되었다(도 13a 참조). 도 13b는 평균 종양 크기를 나타낸다. 도 14c는 마우스의 체중을 나타낸다. Bar, S.E.M.
도 14a 내지 도 14e는 화합물 75가 종양의 재발을 억제한다는 것을 보여준다. 단계 1: CT26을 면역 능력이 있는 마우스 (BALB/c)의 왼쪽 등쪽에 피하 주사하고, 화합물 75 처리를 3일 후 시작하여 이틀마다 50mg/kg의 용량으로 정맥내 투여했다(총 7회 투여). 종양 제거 후, 체외 배양을 위해 종양 세포를 분리했다(처리되지 않은 종양: 대조군 종양; 화합물 75-처리된 종양: 화합물 75-종양). 단계 2: 17일째에 분리된 종양 세포를 마우스 등의 오른쪽에 피하 주사하고 37일째에 마우스를 희생시켰다(도 14a 참조). 도 14b는 각 처리군에서의 각 종양의 부피를 나타낸다. 도 14c는 평균 종양 크기를 나타낸다. 도 14d는 37일째의 마우스 등 사진을 보여준다. 도 14e는 중추 기억 T 세포의 백분율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± S.E.M이다. N 값이 4보다 크다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 기술 용어들은 본 발명이 속하는 당업자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 또는 물질은 당업자가 이해하고 사용하여 본 발명을 수행할 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태("a", "an" 및 "the")들은 문맥상 명백하게 달리 언급하지 않는 한, 복수의 지시대상도 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서 문맥상 달리 요구되지 않는 한 단수 용어에는 복수형이 포함되고 복수 용어에는 단수가 포함된다.
본원에 사용된 "선택적"또는 "선택적으로"라는 용어는, 차후 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하며, 상세한 설명에는 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다. 예를 들어, "선택적으로 제제를 포함한다"는 문구는 제제가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 의미한다.
"및/또는"이라는 용어는 언급한 것들 모두 또는 언급한 2가지 중 하나를 지칭하는데 사용한다.
종종, 범위는 본 명세서에서 하나의 특정 값 "약"으로부터 및/또는 또 다른 특정 값 "약"까지로 표현된다. 이러한 범위가 표현될 때, 구현예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지의 범위를 포함한다. 마찬가지로, 값이 "약"이라는 단어를 사용하여 근사치로 표현되는 경우 특정 값이 또 다른 구현예를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 각 범위에서의 끝점들은 다른 끝점과 관련하여 그리고 다른 끝점과는 독립적으로 모두 중요하다는 점도 추가로 이해할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 ± 20%, 바람직하게는 ± 10%, 더 바람직하게는 ± 5%를 지칭한다.
"치료", "치료하는" 및 "치료하다"라는 용어는 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병, 질환, 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 관점에서 예방적일 수 있고, 질병, 질환 및/또는 그에 따른 증상에 대한 부분적 또는 완전한 치료 측면에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유류, 바람직하게는 인간의 질병에 대한 임의의 치료를 포함하며, (1) 대상체에서의 질병, 질환 또는 증상의 발병을 억제하거나 (2) 대상체의 질병, 질환 또는 증상을 완화 또는 개선하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 "개체", "대상체" 및 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 진단, 치료 또는 치료법이 요구되는 임의의 포유동물 대상을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "치료가 필요하다"라는 용어는 간병 관리인(예를 들어, 인간의 경우 의사, 간호사, 전문간호사 또는 개인, 비인간 포유류를 포함한 동물의 경우 수의사)이 내린 판단을 의미하며, 이러한 판단은 대상체가 치료를 필요로 하거나 치료를 통해 혜택을 받을 수 있다고 판단하는 것이다. 이러한 판단은 간병 관리인의 전문 지식 영역에 있는 다양한 요인들을 바탕으로 이루어지지만, 여기에는 본 발명의 화합물에 의해 치료될 수 있는 병태의 결과로서 대상체가 아프거나 아플 수 있을 것이라는 인식도 포함한다.
"투여"라는 용어는 본 발명의 활성 성분이 의도한 기능을 수행할 수 있게 하는 투여 경로를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 동물이 앓고 있는 특정 질병 또는 병리학적 상태를 치료 또는 제거하기 위해 동물, 예를 들어 인간에게 투여되는 치료제를 함유하는 혼합물을 지칭한다.
본원에 제공된 활성 성분의 "유효량"이라는 용어는 원하는 작용에 대해 원하는 조절을 제공하는데 충분한 성분의 양을 지칭한다. 아래에서 짚어 보겠지만, 정확한 필요량은 대상체의 질병 상태, 신체 조건, 연령, 성별, 종 및 체중, 구체적인 정체성 및 조성물의 제형 등에 따라 대상체마다 다를 수 있다. 약물 투여 방법을 조정하여 최적의 치료 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 여러 번으로 분할한 용량을 매일 투여할 수 있거나, 또는 용량을 치료 상황의 긴급성에 따라 비례하여 감소시킬 수도 있다. 따라서, 정확한 "유효량"을 명시한다는 것은 불가능하다. 그러나, 당업자라면 누구나 통상적인 실험만으로도 적절한 유효량을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 합당한 이익/위험 비율에 상응하는 기타 문제 또는 합병증 없이 대상체(인간 또는 비인간 동물 중 하나)의 조직과 접촉하는데 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 각 담체, 부형제 등도 제형의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "허용"되어야 한다. 적합한 담체, 부형제 등은 표준 약학 문헌에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 "비치환된 또는 치환된"이라는 문구는 치환이 선택적임을 의미한다. 치환이 필요한 경우, 이러한 치환은 지정된 원자의 정상 원자가를 초과하지 않고 치환으로 인해 안정적인 화합물이 생성되는 경우 지정된 원자 상의 임의의 수의 수소가 표시된 그룹의 선택으로 대체되는 것을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어 "알킬"은 탄소 원자 1 내지 12개를 함유하는 1가, 포화, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 바람직하게는, 알킬은 C1-C8 알킬기이다. 더 바람직하게는, 알킬은 C1-C6 알킬기이다. 알킬은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. C1-C6 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸(모든 이성질체 형태 포함) 및 헥실(모든 이성질체 형태 포함), 헵틸(모든 이성질체 형태 포함), 옥틸(모든 이성질체 형태 포함)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로사이클릭 고리"와 "헤테로사이클릴"은 같은 의미로 사용된다. "헤테로사이클릭 고리" 또는 "헤테로사이클릴"이라는 용어는 3 내지 14개의 원자, 대안적으로 3 내지 12개의 원자, 대안적으로 3 내지 10개의 원자, 대안적으로 3 내지 8개의 원자, 대안적으로 4 내지 7개의 원자, 대안적으로 5 또는 6개의 원자를 갖는 모노-, 바이-, 또는 폴리사이클릭 구조를 지칭하며, 여기서 하나 이상의 원자, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 원자는 N, O, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 나머지 고리를 구성하는 원자는 탄소 원자이다. 고리 구조는 포화 또는 불포화일 수 있지만 방향족은 아니다. 예시적인 헤테로사이클릭 고리는 이미다졸릴, 이미다졸리노일, 이미다졸리디닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 인돌릴, 인다졸릴, 인다졸리놀릴, 퍼하이드로피리다질, 피리다질, 피리딜, 피롤릴, 피롤리닐, 피롤리디닐, 피라졸릴, 피라지닐, 퀴녹솔릴, 피페리디닐, 피라닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 푸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 티아졸릴, 카르볼리닐, 테트라졸릴, 티아졸리디닐, 벤조푸라노일, 티아모르폴리닐설폰, 옥사졸릴, 벤즈옥사졸릴, 옥소피페리디닐, 옥소피롤리디닐, 옥소아제피닐, 아제피닐, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 푸라자닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로푸라닐, 티아졸릴, 티아디아조일, 디옥솔릴, 디옥시닐, 옥사티올릴, 벤조디옥소릴, 디티올릴, 티오페닐, 테트라하이드로티오페닐, 설폴라닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 테트라하이드로푸로디하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라노디하이드로푸라닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로푸로푸라닐 및 테트라하이드로피라노푸라닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "할라이드" 및 "할로"는 상호교환적으로 사용되며 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어 "알콕시"는 일반식 -O- (알킬)의 라디칼을 의미하며, 여기서 알킬은 위에서 정의한 바와 같다. 예시적인 알콕시는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시 및 n-헥옥시를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
TME는 면역 억제 세포와 단백질로 가득 차 있기 때문에 T 세포 활성화를 어렵게 만들고 항암 작용을 억제할 수도 있다. 따라서 TME는 암 치료에 딜레마를 안겨주었다. 면역 세포가 암세포를 공격할 때, 신호 변환기 및 전사 활성제 1(STAT1) 경로를 통해 예정된 세포사-리간드 1(PD-L1)의 발현을 유도하는 인터페론 감마(IFN-γ)를 분비한다. 이후 PD-L1은 T 세포 표면의 PD-1(예정된 세포사 1)과 결합하여 T 세포의 항암 효과를 더욱 억제한다(Juneja, 외, J Exp Med 214, 895-904, 2017). 종양 부위에서 PD-L1 발현이 높을수록 환자의 예후가 더 나쁘다는 것도 임상적으로 입증됐다(Shen 외, World J Surg Oncol 17, 4, 2019). 또 다른 측면에서, IFN-γ는 또한 종양에 의한 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 분비를 유도하는데, 이는 종양 미세환경에서 트립토판을 고갈시키고 키누레닌의 생성을 촉진한다. 이는 T 세포 성장을 억제하고 T 세포 사멸을 유도하여 면역 회피 메커니즘을 유도한다(Prendergast, 외, Oncogene 26; 27(28):3889-900, 2008).
본 명세서에서는 종양 미세환경으로부터의 면역 억제 제거 또는 종양에 대한 면역계의 자극을 통해 종양의 개선 및/또는 치료를 위한 히스톤 디아세틸라제 6 및 열 충격 단백질 90을 억제하는 이중 억제제가 제공된다. 일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소 농축 유도체 또는 전구약물을 제공한다.
[화학식 I]
치환의 정의 및 구현예는 본 명세서에 설명된 바와 같다.
본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 무기산 또는 유기산 및 염기로부터 유래한 염의 형태로 사용되는 본 발명에 따른 화합물을 지칭한다. 산성 염에는 예를 들어 다음이 포함된다: 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레산염, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살산염, 파모에이트, 펙티아네이트, 과황산염, 페닐프로피오네이트, 피크르산염, 피발산염, 프로피오네이트, 숙신산염, 주석산염, 티오시아네이트, 토실산염 및 운데카노에이트. 적절한 염기에서 파생된 염에는 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨), 알칼리 토금속 (예를 들어, 마그네슘), 암모늄 및 NW4+(여기서 W는 C1-4 알킬임)를 포함한다.
본원에 사용된 "전구약물"은 이러한 전구약물이 대상체에게 투여될 때 가수분해, 대사 등과 같은 생체내 생리학적 작용을 통해 화학식 I에 따른 활성 화합물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 포함하도록 의도된다. 전구약물의 제조 및 사용에 관련된 적합성 및 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 화학식 I의 화합물(모 화합물)의 전구약물은 변형이 일상적인 조작으로 또는 생체내에서, 모 화합물로 절단되는 방식으로 화합물에 존재하는 작용기를 변형함으로써 제조될 수 있다. "전구약물"에는 하이드록시, 아미노 또는 설프하이드릴기가 전구약물이 대상체에게 투여될 때 절단되어 각각 유리 하이드록실, 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴기를 형성하는 임의의 기에 결합된 화학식 I의 화합물이 포함된다. 전구약물의 예로는 생가수분해성 아미드, 생가수분해성 에스테르, 생가수분해성 카르바메이트, 생가수분해성 카보네이트, 생가수분해성 우레이드 및 생가수분해성 인산염 유사체와 같은 생가수분해성 모이어티를 포함하는 화학식 I의 화합물의 유도체 및 대사산물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 카르복실 작용기를 갖는 화학식 I의 화합물의 전구약물은 카르복실산의 저급 알킬(예를 들어, C1-C6) 에스테르이다. 카르복실레이트 에스테르는 분자 상에 존재하는 임의의 카르복실산 모이어티를 에스테르화함으로써 편리하게 형성된다.
본 발명의 화합물은 용매화물로서 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "용매화물"은 달리 나타내지 않는 한, 비공유 분자간 힘에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 용매를 추가로 포함하는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 지칭한다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 편의상 "수화물", 예를 들어 반수화물, 일수화물, 세스키수화물, 이수화물, 삼수화물 등으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "호변이성질체"는 구조가 원자 배열에서 현저하게 다르지만 쉽고 빠른 평형으로 존재하는 화합물을 지칭하며, 본원에 제공된 화합물은 서로 다른 호변이성질체로 묘사될 수 있고, 화합물이 호변이성질체 형태를 갖는 경우 모든 호변이성질체 형태가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 하며 화합물의 명명은 어떠한 호변이성질체도 배제하지 않는다. 예시적인 호변이성화에는 아미드에서 이미드로; 엔아민에서 이민으로; 에나민에서 (다른) 에나민으로의 호변이성화; 및 케토에서 에놀이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
"입체이성질체"라는 용어는 화학적 구성이 동일하지만 공간에서의 원자 또는 그룹 배열이 다른 화합물을 지칭한다. 입체이성질체에는 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 형태이성질체(conformer)등이 포함된다.
용어 "다형체"는 화합물(또는 이의 염, 수화물 또는 용매화물)의 결정질 형태를 지칭한다. 모든 다형체는 동일한 원소 조성을 가지고 있다. 상이한 결정질 형태는 일반적으로 상이한 X선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정 형태, 광학 및 전기적 특성, 안정성 및 용해도를 갖는다. 재결정화 용매, 결정화 속도, 저장 온도 및 기타 요인으로 인해 하나의 결정형이 지배적일 수 있다. 화합물의 다양한 다형체는 다양한 조건에서 결정화하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 "동위원소 농축 유도체"는 해당 원자의 천연 동위원소 조성 이외의 동위원소 조성을 갖는 적어도 하나의 원자를 포함하는 화합물을 의미한다. "동위원소 농축"은 원자의 천연 동위원소 존재비 대신에 분자 내 주어진 원자에 일정량의 특정 동위원소가 통합되는 비율로 표현될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 하나 이상의 특정 기하학적, 광학, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 에피메릭, 아트로픽, 입체 이성질체, 호변이성질체, 형태이성질체 또는 아노머 형태로 존재할 수 있으며, 시스- 및 트랜스-형태; E- 및 Z-형태; c-, t- 및 r-형태; 엔도- 및 엑소-형태, R-, S- 및 메소-형태; D- 및 L-형태; d- 및 I-형태; (+) 및 (-) 형태; 케토-, 에놀- 및 에놀레이트-형태; 신형(synform) 및 안티형(anti-form); 시클라인형(synclinal-form) 및 앤티클라인형(anticlinal-form); α-형 및 β-형; 축형 및 적도형; 보트형, 의자형, 비틀림형, 봉지형 및 반의자형; 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제안되지 않는다.
본 발명의 화합물은 본 명세서를 고려하여 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 화합물은 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.
합성예
반응식 1 시약 및 조건 a) 4-아미노-벤조산 메틸 에스테르, EDC, HOBt, DIPEA, DMF, 실온; b) LiOH (1M, aq), 디옥산, 40℃; c) NH2OBn, EDC, HOBt, DIPEA, DMF, 실온; d) Pd/C, H2, CH3OH, 실온;
반응식 2 시약 및 조건 a) R-NH2, NaCNBH3, C2H5OH, 실온;
반응식 2 시약 및 조건 a) i) 옥살릴 클로라이드, DCM, 실온; ii) 3,5-비스(벤질옥시)-2-이소프로필벤조산, TEA, DCM, 0℃, 실온; b) LiOH (1M, aq), 디옥산, 40℃; c) NH2OBn, EDC, HOBt, DIPEA, DMF, 실온; d) 49-52 및 56-62의 경우, Pd/C, H2, CH3OH, 실온; 53-55의 경우, BCl3 (헵탄 중 1M), DCM.
본 발명의 화합물의 구체적이지만 비제한적인 구현예는 아래에 열거되어 있다.
4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-메틸벤즈아미드(화합물 63), N-에틸-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드(화합물 64), 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-프로필벤즈아미드(화합물 65), 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-페닐벤즈아미드(화합물 66), N-(4-플루오로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드(화합물 67), N-(4-클로로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일) 벤질)-5-이소프로필벤즈아미드(화합물 68), 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-N-(4-요오드페닐)-5-이소프로필벤즈아미드(화합물 69), N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드(화합물 70), 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-모르폴리노페닐)벤즈아미드(화합물 71), N-(4-(디메틸아미노)페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드(화합물 72), 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)벤즈아미드(화합물 73), 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(피페리딘-1-일) 페닐)벤즈아미드(화합물 74), 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질)-5-이소프로필-N-(4-메톡시-페닐)-벤즈아미드(화합물 75), 및 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질)-N-(4-하이드록시-페닐)-5-이소프로필-벤즈아미드(화합물 76).
본 명세서에 기재된 화합물은 순수 화학물질로서 치료적으로 투여될 수 있지만, 화합물을 약제학적 조성물 또는 제형의 일부로서 투여하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 이작용성 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 호변이성질체, 입체이성질체, 용매화물, 수화물, 다형체, 동위원소가 풍부한 유도체 또는 전구약물, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 고체 투여 형태 또는 액체 투여 형태, 경구 투여 형태, 비경구 투여 형태, 비강내 투여 형태, 좌약 형태, 로젠지제(lozenge) 형태, 정제 형태, 구강 형태, 정제, 제어 방출 투여 형태, 펄스 방출 투여 형태, 즉시 방출 투여 형태, 정맥내 용액, 현탁액 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 투여 형태로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 직장, 질 및 국소(협측 및 설하 포함) 투여를 포함하는 경구 또는 비경구 경로에 의해 투여될 수 있다.
"부형제"는 일반적으로 약리학적 조성물에 첨가되거나 화합물의 투여를 더욱 용이하게 하기 위한 매개체로 사용되는 물질, 종종 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예에는 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제, 방부제, 발포성 혼합물 및 흡착제가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 불활성 희석제에는 나트륨 및 탄산칼슘, 나트륨 및 인산칼슘, 락토오스 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 붕해제에는 옥수수 전분, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 이들의 염, 예를 들어 알긴산나트륨 등과 같은 전분이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 결합제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 옥수수, 밀 또는 쌀 전분과 같은 전분, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 윤활제가 존재하는 경우 일반적으로 마그네슘 스테아레이트 및 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 활석 또는 수소화 식물성 오일이 될 것이다. 필요한 경우, 정제는 위장관에서 흡수를 지연시키기 위해, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질로 코팅될 수 있다. 상기 조성물은 또한 예를 들어 제형에 만니톨과 같은 물질을 사용하여 씹을 수 있는 정제로서 제형화될 수 있다.
본 발명은 또한 종양의 개선 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양의 개선 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 종양 미세환경으로부터 면역 억제의 제거 또는 종양에 대한 면역계의 자극이 필요한 대상체에서 종양 미세환경으로부터 면역 억제를 제거하거나 종양에 대한 면역계를 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
어떠한 이론적 한계에 의해 제한되도록 의도되지는 않았지만, HDAC6 억제제는 IFNγ-유도된 STAT1 경로를 차단할 수 있고(Ginter 외, Cell Signal 24(7):1453-60, 2012), 추가로 TME에서 세포독성 T 세포의 침윤을 유도한다(Falkenber 외, Nature Reviews Drug Discovery 13, 673-691, 2014). 본 발명은 또한 HDAC6 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 HDAC6을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 IFN-γ에 의해 유도된 STAT1 경로의 신호 변환기 및 활성화제를 차단하기 위한 것이다. 종양 침윤 림프구(TIL)가 암세포를 공격하면 세포호르몬인 IFN-γ가 생성되고, 종양 세포는 종양 세포의 STAT1 경로를 활성화하여 PD-L1 및 IDO 발현을 유도함으로써 자가 보호 메커니즘을 발전시킨다. IDO는 트립토판을 세포질 효소인 키누레닌으로 분해하는 면역 억제 단백질이다. 그러나 트립토판은 T 세포의 필수 아미노산으로 T 세포는 트립토판 결핍에 매우 민감하다. 따라서 증가된 IDO 활성 및 감소된 트립토판 농도는 T 세포 증식을 억제하고 T 세포 사멸을 유도할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 종양의 PD-L1 또는 IDO 발현을 감소시키기 위한 것이다. 또한 HDAC는 히스톤 또는 기타 단백질의 라이신 부위의 탈아세틸화를 유도하여 전사 및 번역 기능에 영향을 미치고 유전자 발현을 조절한다. 암세포는 탈아세틸화를 과도하게 활성화시켜 종양 억제 유전자의 발현을 감소시켜 암세포 성장을 촉진한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 α-튜불린 및 히스톤의 아세틸화를 억제하기 위한 것이다. HDAC의 억제는 암 세포의 성장에 영향을 미치는 종양 억제 유전자의 발현을 증가시킨다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 종양 특이적 억제제, 예를 들어 라파마이신, 카보잔티닙 및/또는 에를로티닙을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 억제제는 폴리펩티드, 소분자 억제제, RNA 간섭 (RNAi), 항체, 또는 이들의 임의의 단편 또는 조합을 포함한다. 일 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 부분적으로 인간화되거나, 완전히 인간화되거나, 키메라적(chimeric)이다. 선택적으로, 항체 또는 항체 단편은 나노바디, Fab, Fab', (Fab') 2, Fv, 단일사슬 가변 단편 (scFv), 다이바디, 트라이바디, 테트라바디, Bis-scFv, 미니바디, Fab2, Fab3 단편 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 항체의 예로는 항-EGFR 항체가 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 화학요법 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 화학요법 약물은 암세포에 미치는 영향, 약물이 방해하는 세포 활동 또는 과정 또는 약물이 영향을 미치는 세포 주기의 특정 단계에 따라 여러 그룹으로 나뉜다. 따라서 화학 요법 약물은 알킬화제, 항대사물질, 안트라 사이클린, 토포이소머라제 I 및 II 억제제, 유사분열 억제제, 백금계 약물, 스테로이드 및 항혈관신생제 중 하나에 속한다.
항대사물질의 예로는 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제 및 엽산 길항제가 있다. 항대사물질의 구체적인 예로는 5-플루오로우라실 (5FU 라고도 함), 카페시타빈, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 젬시타빈, 시타라빈, 플루다라빈 및 페메트렉시드를 포함한다. 백금 기반 화학요법 약물에는 시스플라틴(시스플라티늄 또는 시스-디아민디클로리도플라티늄 II(CDDP)이라고도 알려져 있음), 카보플라틴 및 옥살리플라틴이 포함된다. 유사분열 억제제의 예에는 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포사이드, 빈블라스틴 및 빈크리스틴이 포함된다. 예를 들어 안트라사이클린 항생제에는 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신® 및 독소루비신 하이드로 클로라이드라고도 함), 레스피노마이신 D 및 이다루비신이 포함된다. 알킬화 항종양제는 비특이적으로 작용한다. 사이클로포스파미드는 알킬화제이지만 매우 강력한 면역 억제 물질이다. 토포이소머라제 I 억제제의 예로는 토포테칸 및 이리노테칸을 포함한다. 토포이소머라제 II 억제제의 예로는 에토포사이드 및 테니포사이드를 포함한다. 항혈관신생제의 비제한적인 예로는 단일 클론 항체 베바시주맵, 도파민 및 테트라티오몰리브데이트를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역요법 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 "면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 면역계 억제 관문을 차단하는 임의의 제제를 지칭한다. 관문 억제제의 예로는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, 또는 A2aR의 억제제가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 면역 관문 억제제는 인간 PD-1 축 결합 길항제이다. 일부 측면에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1-결합 길항제 및 PDL2 결합 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 측면에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제이다. 일부 측면에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1 및/또는 PDL2에 결합하는 것을 억제한다. 특정 측면에서, PD-1-결합 길항제는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 측면에서, PD-1-결합 길항제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙(예를 들어, KEYTRUDA®), 피딜리주맙, AMP-514, REGN2810, CT-011, BMS 936559, MPDL328OA 또는 AMP-224이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체이다. 특정 측면에서, 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙 또는 이필리무맙(예를 들어, YERVOY®)이다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 면역 관문 억제제는 항-킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 항체이다. 일부 측면에서 항-MR 항체는 리릴루맙이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 화합물과 면역 관문 억제제, 종양 표적 억제제 또는 화학요법 약물은 각각 동시, 개별 또는 순차 투여를 위한 단일 약제로서 제형화된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 화합물과 면역 관문 억제제, 종양 표적 억제제 또는 화학요법 약물은 동시, 개별적으로 또는 순차적으로 병용 투여되거나 복합제형으로서 병용 투여된다. 본원에서 사용된 "병용제" "치료적 병용제" 또는 "약제학적 병용제"라는 용어는, 하나의 단위 제형의 고정된 병용제, 또는 화합물 A와 화합물 B가 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에서 개별적으로 투여될 수 있는 병용 투여를 위한 성분 키트를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "공동 투여(co-administration)" 또는 "병용 투여(combined administration)"라는 용어는 단일 환자에 대한 선택된 치료제의 투여를 포함하도록 정의되며, 치료제가 반드시 동일한 투여 경로로 또는 동시에 투여되지 않는 치료 요법을 포함하도록 의도된다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 치료 조합은 본 명세서에 개시된 각 화합물과 면역 관문 억제제, 종양 표적 억제제 또는 화학요법 약물의 특성보다 큰 시너지 특성을 갖는다.
본 발명은 또한 세포독성 T 세포의 침윤의 유도를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 세포독성 T 세포의 침윤을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 그랜자임 B(granzyme B) 발현을 유도하기 위한 것이다.
이론적 한계에 의해 제한하려는 의도는 아니지만, HSP90은 종양 성장에 필요한 많은 단백질을 안정화하고, 종양 생존율과 면역 체계에 대한 저항성을 높이고, 암세포 성장을 촉진하는 등 단백질의 올바른 형태와 안정성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다고 믿어진다(Trepel 외, Nature Reviews Cancer 10, 537- 549, 2010). 본 발명은 HSP90 억제를 필요로 하는 대상체의 종양 미세환경에서 HSP90을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 종양 성장을 위해 단백질을 불안정화하기 위한 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 HSP70 발현을 증가시키기 위한 것이다. 또한, 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 Src, AKT, Rb 또는 FAK의 발현을 감소시키기 위한 것이다.
본 발명은 종양 성장 억제 및/또는 종양 재발 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장을 억제 및/또는 종양 재발을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 종양의 예로는 대장암, 췌장암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신세포 암종, 유방암, 두경부암, 전립선암, 악성 신경교종, 골육종, 위암, 악성 중피종, 다발골수종, 난소암, 활막육종, 갑상선암 또는 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 조절 T 세포의 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 조절 T 세포(Treg 또는 Treg 세포라고도 함)의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 조절 T 세포는 면역 억제 작용을 하며 종양 면역 회피를 돕는다.
본 발명은 또한 중추 기억 T 세포 수준 증가가 필요한 대상체에서 중추 기억 T 세포 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 중추 기억 T 세포는 암의 재발을 억제한다.
항 PD1 항체를 이용한 단독요법의 임상적 효능은 제한적이며, 환자의 20 내지 25%만이 효과적으로 치료되는 것으로 알려져 있다. 종양 미세환경의 복잡성으로 인해 암과 면역계 사이의 상호작용에는 세포독성 T 세포가 종양 부위에 침투할 수 없는 것과 면역억제 단백질 등 많은 요인이 있어 치료 효능이 제한된다. 따라서 약물 투여 전략만으로 여러 약물을 조합하는 것보다 더 나은 임상 결과를 얻을 수 있다.
본 명세서에 설명된 발명이 보다 완전하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 다음의 실시예들이 제시된다. 본 출원에 설명된 실시예는 본원에 제공된 화합물, 약제학적 조성물 및 방법을 설명하기 위한 것으로, 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
물질 및 방법
화학
합성예에서 설명한 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제의 화학적 특성을 평가한다. 300MHz에서 작동하는 브루커 DRX-300 분광계를 사용하여 핵 자기 공명 스펙트럼을 얻었다. 1H NMR 스펙트럼은 300MHz에서 기록되었고 13C NMR 스펙트럼은 75MHz에서 기록되었다. JEOL (JMS-700) 전기분무 이온화(ESI) 질량 분석기를 사용하여 고해상도 질량 스펙트럼(HRMS)을 얻었다. Shimadzu LC-2030C LT는 최종 화합물의 순도를 결정하는 데 사용되었다. 컬럼 크로마토그래피에는 실리카겔(Merck Kieselgel 60, No. 9385)을 사용했다. 화합물의 특성화 데이터는 지원 정보에 포함되었다.
생물학
세포 배양
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제가 세포에 미치는 영향을 평가했다. HCT116 세포를 10% FBS가 보충된 McCoy의 5a 배지에서 배양했다. LS174T 세포를 10% FBS를 함유한 MEM 배지에서 배양하였다. CT26 세포를 CCS가 10%인 DMEM 배지에서 배양하였다. 모든 배양 배지는 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하고, 모든 세포주를 37℃에서 5% CO2를 함유한 세포 인큐베이터에서 배양하였다.
HDAC 효소 억제 분석
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HDAC 효소에 대한 HSP90/HDAC6 이중 억제제의 억제 효과는 펜실베이니아 주 말번의 반응 생물학 회사에서 수행한 효소 억제 분석을 사용하여 평가되었다. HADC 1, 3 및 6의 기질은 p53 잔기 379 내지 382 (RHKK (Ac))에서 유래된 형광 펩티드였다. 모든 화합물을 DMSO에 용해시키고 10μM에서 시작하는 3배 연속 희석으로 최소 10회 용량의 IC50 모드에서 테스트했다. IC50 값은 단일 실험의 결과였다. 트리코스타틴 A (Trichostatin A; TSA)를 기준으로 사용했다.
HSP90 억제 분석
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90에 대한 HSP90/HDAC6 이중 억제제의 억제 효과는 펜실베이니아 주 말번의 반응 생물학 회사에서 수행한 HSP90 억제 분석을 사용하여 평가되었다. 이 분석은 HSP90 결합에 대한 형광 표지된 겔다나마이신 (FITC-GM)과의 경쟁을 기반으로 한다. FITC-GM은 HSP90의 ATP 결합 포켓에 결합하고, 따라서 이 실험적 분석을 통해 ATP 경쟁적 억제제를 확인할 수 있다. 분석 절차에는 음향 기술을 사용하여 화합물 (DMSO에 용해된)을 HSP 용액에 첨가한 후 30분 동안 배양하는 과정이 포함되었다. 이어서 FITC-GM을 추가하고 용액을 3시간 동안 인큐베이션했다. 마지막으로 형광 편광을 측정하고 mP를 계산했다.
MTT 분석
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제의 세포 생존율에 미치는 영향을 평가하였다. 세포를 96웰 플레이트 (5000세포/웰)에 시딩하였다. 다음 날, 연속 희석된 약물을 웰에 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션했다. 세포 생존율은 MTT 분석법으로 측정되었으며 치료되지 않은 대조군 세포에 비해 생존한 약물 처리된 세포의 백분율로 표시된다. IC50은 비선형 회귀 분석을 통해 계산되었다.
면역블로팅 분석(Immunoblotting analysis)
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제가 여러 요인에 미치는 영향을 평가했다. 세포를 RIPA 완충액(Thermo Fisher Scientific, Wal-tham, MA, USA) 및 프로테아제 억제제(Roche, Basel, CH)에서 용해시켰다. 샘플을 8% 또는 15% SDS-PAGE에서 추가로 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 5% 탈지유(PBS에서는 w/v)로 차단했다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 막을 다음 항원에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션했다. HSP90, Src, AKT, Rb, 인산화 Rb (p-Rb), FAK, HSP70, α-튜불린 아세틸화, 아세틸 히스톤 H3, 인산화 STAT1 (p-STAT1), STAT1 (세포 신호 전달, Danvers, MA, 미국), α-튜불린, 히스톤 H3 (Genetex, Irvine, 미국), IDO (Santa Cruz Biotechnology Dallas, TX, 미국) 와 PD-L1 (Novus, Littleton, CO, USA)에서 하룻밤 동안 4℃로 온도를 유지. 표적 단백질은 HRP-접합 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) 와 향상된 화학발광 키트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)를 사용하여 시각화되었다.
유세포 분석을 통한 세포 표면의 PD-L1 발현 분석
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제가 PD-L1 발현에 미치는 영향을 평가했다. 세포를 6웰 플레이트 (3.2 x 105 세포/웰)에 시딩하고 다음 날 48시간 동안 표시된 농도의 IFN-γ 및 화합물 또는 DMSO (비히클)로 처리하였다. 처리된 세포를 현탁시키고 (3x105 세포/튜브) 및 PD-L1 항체(Invitrogen, Waltham, USA) 및 FITC-접합 2차 항체로 1시간 동안 얼음 위에서 현탁시켰다. 세포의 형광 신호는 FASCalibur 유세포 분석기와 CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 의해 분석되었다.
합성 종양 연구
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제가 합성 종양 치료에 미치는 영향을 평가했다. 암컷 BALB/c 마우스의 왼쪽 한쪽 등에 마우스 대장암 CT26 세포 (2 x 105 세포/마우스)를 피하 이식했다. 종양 크기가 50mm3에 도달한 후, 마우스에 화합물 17, STA9090 (Ganetespib) 또는 항PD-1 항체 (클론 RMP1-14) (그룹당 마우스 4 내지 8마리)를 주사했다. 종양 크기 및 체중의 진행은 일주일에 두 번 측정되었다. 종양 부피 공식: V (mm3) = (길이 x 너비 x 높이)/2. 마우스를 25일째에 희생시키고 면역 세포 집단 분석을 위해 종양과 혈액을 채취했다.
면역조직화학 (IHC) 염색
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제가 여러 요인에 미치는 영향을 평가했다. IHC-파라핀: 마우스에서 종양 조직을 절제하고 PBS의 4% 포름알데히드 용액에 고정하고 파라핀에 삽입했다. 4 내지 5μm의 단면을 절단하고 60℃의 오븐에 하룻밤 동안 두었다. 절편을 탈파라핀화하고 재수화한 후, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브에 의해 시트르산 완충액 (10mM 시트레이트산, pH 6) 또는 트리스 완충액 (10mM 트리스, 1mM EDTA, pH9)을 사용하여 항원 회수를 수행했다. 절편을 10% 염소 혈청으로 차단한 다음 다음 항원에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션했다: IDO (Santa Cruz Biotechnology Dallas, TX, USA), CD8 (Novus, Littleton, CO, USA) 및 그랜자임 B (Abcam, Cambridge, UK)를 하룻밤 동안 4℃에서 유지. PD-L1에 대한 IHC-동결: OCT 화합물(Sakura Finetek, Torrance, CA, U.S.A.)에 내장된 마우스로부터 종양 조직을 채취하였다. 10μm의 절편을 절단하고, 10분 동안 100% 아세톤으로 고정하고, 10% 염소 혈청으로 차단했다. 슬라이드를 4℃에서 하룻밤 동안 PD-L1 1차 항체와 함께 인큐베이션했다. 이어서, 슬라이드를 0.3% 과산화수소 (H2O2)에 10분 동안 첨가하여 내인성 과산화효소 활성을 감소시켰다. 슬라이드를 HRP 폴리머 접합 2차 항체 (R&D system, Minneapolis, MN, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션했다. DAB 기질 키트(Dako, Glostrup, Denmark)에 따라 발색을 수행하고 핵을 헤마톡실린으로 대비염색되었다. 종양 조직 절편의 이미지는 Mirax Scan(CARL ZEISS, 독일) 또는 TissueFaxs (오스트리아 비엔나)로 캡처하고 HistoQuest 소프트웨어(오스트리아 비엔나)로 분석했다.
유세포 분석을 통한 종양 세포의 면역 세포 침윤 분석
합성예(예를 들어, 화합물 63, 64 및 66 내지 76)에 설명된 바와 같이 HSP90/HDAC6 이중 억제제가 종양 세포의 면역 세포 여과에 미치는 영향을 평가했다. 마우스에서 종양 조직을 절제하고 메스를 사용하여 작은 조각으로 자른다. 종양 기질 내의 세포를 MACS 종양 해리 키트 (밀Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일)에 따라 분리하고 70μm 세포 여과기를 통해 여과하였다. ACK 용해 완충액(Gibco, Life Technologies, Eugene, OR, U.S.A.)을 사용하여 적혈구를 제거했다. 이어서, 표시된 형광 표지 항체로 세포를 1시간 동안 염색하였다. 세포 내 분자를 염색하기 위해 FOXP3/전사 인자 염색 완충 키트(Tonbo Biosciences, San Diego, CA, U.S.A.)에 따라 세포를 고정 및 투과시키고 형광 표지된 항체로 1시간 동안 염색했다. 세포의 형광 신호는 유세포 분석기(Sony SA3800 San Jose, CA, U.S.A.)에 의해 검출되었다.
통계학적 분석
데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석되었다. t-검정 (양측)을 사용하여 평균값 간에 통계적 차이가 있는지 확인했다. P 값 <0.05는 중요한 것으로 간주된다.
합성예
실시예 1 4-[(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-벤조일아미노)-메틸]-벤조산 메틸 에스테르 (2)의 합성
DMF (5 mL) 중의 화합물 1(500 mg, 1.32 mmol), EDC.HCl (509 mg, 2.65 mmol), HOBt (267 mg, 1.98 mmol) 및 DIPEA (0.574 mL, 3.30 mmol)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후 4-아미노-벤조산 메틸 에스테르 (199 mg, 1.32 mmol)를 첨가하였다. 추가로 5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출했다. 결합된 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산: EtOAc: 3 : 2)로 정제하여 반고체 생성물을 제공한다. 생성된 생성물을 CH3OH (10mL)에 용해시켰다. 탄소에 촉매량의 10% 팔라듐을 첨가하고 반응 혼합물을 수소 하에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여액을 진공에서 건조하여 2를 82% 수율로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.15 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.25 (m, 1H), 3.89 (s, 3H) 4.72 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 5.11 (s, 2H), 6.34 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.31 - 7.44 (m, 12H), 7.71 (d, J = 8.7 Hz, 2H).
실시예 2 4-[(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-벤조일아미노)-메틸]-벤조산 (3)의 합성
화합물 2 (600 mg, 1.14 mmol), 1M LiOH (aq) (7 ml) 및 다이옥산 (15 mL)의 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 감압 하에서 농축하고 물을 첨가하였다. 혼합물을 3N HCl로 산성화하고 에틸 아세테이트 (50mL x 3) 로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 96%의 수율로 산 3을 수득했다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.11 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.21 (m, 1H), 4.79 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 6.38 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.35 - 7.42 (m, 12H), 7.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H).
실시예 3 2,4-비스-벤질옥시-N-(4-벤질옥시카르바모일-벤질) -5-이소프로필-벤즈아미드 (4)의 합성
화합물 3(500mg, 0.98mmol), EDC.HCl(374mg, 1.96mmol), HOBt(198mg, 1.47mmol), 및 DIPEA(0.42mL, 2.44mmol)의 혼합물을 DMF(5mL)에서 30분 동안 실온에서 교반한 다음 NH2OBn.HCl (156 mg, 0.98 mmol)을 첨가했다. 추가로 5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출했다. 결합된 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc)로 정제하여 75% 수율의 화합물 4를 제공했다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.11 (m, 1H), 4.79 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 5.13 (s, 4H), 6.38 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.31 - 7.41 (m, 17H), 7.71 (d, J = 8.7 Hz, 2H).
실시예 4 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질)-5-이소프로필-벤즈아미드 (5)의 합성
CH3OH (10 mL) 중의 화합물 4 (200 mg, 0.32 mmol)의 용액에 탄소에 10% 팔라듐의 촉매량을 첨가하고 반응 혼합물을 수소 하에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여액을 진공에서 건조하여 잔류물을 얻었고, 이를 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc:CH3OH: 9.5:0.5)로 정제하여 화합물 5를 62% 수율로 5를 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.24 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.18 (m, 1H), 4.64 (s, 2H), 6.32 (s, 1H), 7.46 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.4 Hz, 2H). C26H21ClN8O3 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 345.1450; 관측치, 345.1450.
실시예 5 메틸 4-((메틸아미노)메틸)벤조에이트 (7)의 합성
메탄올 (10ml) 중의 화합물 6 (500 mg, 3.04 mmol)의 용액에 메틸 아민 (H2O, 1 mL 중 40 중량%)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 0℃에서 수소화붕소나트륨 (172 mg, 4.56 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출했다. 결합된 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 92%의 수율로 7을 제공했다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 2.48 (s, 3H), 3.83 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), 7.42 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 6 메틸 4-((에틸아미노)메틸)벤조에이트 (8)의 합성
화합물 7의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 에틸아민을 사용하여 화합물 6으로부터 표제 화합물 8을 94% 수율로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) :1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 2.70 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.93 (s, 3H), 7.41 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 7 메틸 4-(프로필아미노)메틸)벤조에이트 (9)의 합성
화합물 7의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 프로필아민을 사용하여 화합물 6으로부터 표제 화합물 9를 91% 수율로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) :0.94 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.56 (m, 2H), 2.63 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.85 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 7.40 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 8 메틸 4-(페닐아미노)메틸)벤조에이트 (10)의 합성
에탄올 (20 mL) 중의 화합물 6 (500 mg, 3.04 mmol)의 용액에 아닐린 (283 mg, 3.04 mmol) 및 빙초산 몇 방울을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후 나트륨 시아노보로하이드라이드(286mg, 4.56mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 환류시킨 후 물로 켄칭하였다. 추출에는 에틸 아세테이트 (20mL x 3)를 사용했다. 결합된 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산:EtOAc:3:2)로 정제하여 78% 수율로 10을 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 3.81 (s, 3H), 4.79 (s, 2H), 6.79 - 6.83 (m, 3H), 7.13 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 9 메틸 4-(((4-플루오로페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (11)의 합성
표제 화합물 11은 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-플루오로아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 64% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 3.98 (s, 3H), 4.44 (s, 2H), 6.49 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 10 메틸 4-(((4-클로로페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (12)의 합성
표제 화합물 12은 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-클로로아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 68% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 3.92 (s, 3H), 4.54 (s, 2H), 6.48 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 11 메틸 4-(((4-요오도페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (13)의 합성
표제 화합물 13은 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-요오도아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 71% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 3.94 (s, 3H), 4.41 (s, 2H), 6.42 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 8.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 12 메틸 4-((벤조[d][1,3]디옥솔-5-일아미노)메틸)벤조에이트 (14)의 합성
화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 벤조[d][1,3]디옥솔-5-아민을 사용하여 화합물 6으로부터 표제 화합물 14를 79% 수율로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 3.84 (s, 3H), 4.97 (s, 2H), 5.99 (s, 2H), 6.52 (dd, J = 2.1 and 8.1 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.1 Hz 2H), 7.65 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 13 메틸 4-(((4-모르폴리노페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (15)의 합성
표제 화합물 15는 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-모르폴리노아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 77% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) : 3.15 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.78 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.93 (s, 3H), 4.98 (s, 2H), 6.86 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 14 메틸 4-(((4-(디메틸아미노)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (16)의 합성
화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 N1, N1-디메틸벤젠-1,4-디아민을 사용하여 화합물 6으로부터 표제 화합물 16를 72% 수율로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 2.91 (s, 3H), 2.98 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 4.98 (s, 2H), 6.68 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 15 메틸 4-(((4-(4-메틸피페라진-1-일) 페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (17)의 합성
표제 화합물 17은 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 74% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 2.65 (s, 3H), 2.97 (bs, 4H), 3.12 (bs, 4H), 3.90 (s, 3H), 4.39 (s, 2H), 6.61 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 16 메틸 4-(((4-(피페리딘-1-일)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (18)의 합성
표제 화합물 18은 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-(피페리딘-1-일)아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 74% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.59 - 1.72 (m, 6H), 3.09 (bs, 4H), 3.91 (s, 3H), 4.37 (s, 2H), 6.68 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.91 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 17 메틸 4-(((4-메톡시페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (19)의 합성
표제 화합물 19는 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-메톡시아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 85% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 3.79 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 4.98 (s, 2H), 6.85 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 17 메틸 4-(((4-(벤질옥시)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (20)의 합성
표제 화합물 20은 화합물 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 4-(벤질옥시)아닐린을 사용하여 화합물 6으로부터 81% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 3.83 (s, 3H), 4.89 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 6.61 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.25 - 7.431 (m, 7H), 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 18 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-메틸벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (21)의 합성
2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필벤조산 (1) (500 mg, 1.32 mmol)을 건조한 DCM (10mL)에 녹이고 옥살릴 클로라이드(1mL)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시키고 잔류물을 건조 DCM (10mL)에 다시 용해시켰다. 이어서 화합물 7 (236 mg, 1.32 mmol)을 용액에 첨가한 다음 0℃에서 트리메틸아민(0.46 ml, 3.32 mmol)을 첨가하였다. 추가로 실온에서 5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출했다. 결합된 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산:EtOAc: 1:1) 로 정제하여 화합물 21을 78%의 수율로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.13 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.89 (s, 3H), 3.23 (m, 1H), 3.89 (s, 3H) 4.79 (s, 2H), 4.99 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 6.34 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.35 - 7.41 (m, 12H), 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 19 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-에틸-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (22)의 합성
표제 화합물 22는 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 8로부터 84% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.16 (d, J = 6.3 Hz, 6H), 1.25 (t, J = 5.4 Hz, 3H), 3.19 (m, 1H), 3.39 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 4.79 (s, 2H), 5.01 (s, 4H), 6.49 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.32 - 7.49 (m, 12H), 7.79 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 20 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (23)의 합성
표제 화합물 23은 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 9로부터 78% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.92 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.13 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.76 (m, 2H), 3.21 (m, 1H), 3.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 4.71 (s, 2H), 5.12 (s, 4H), 6.32 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 7.35 - 7.48 (m, 12H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 21 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-페닐벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (24)의 합성
표제 화합물 24는 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 10으로부터 75% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.85 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.95 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 4.79 (s, 2H), 5.21 (s, 4H), 6.34 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 7.13 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.19 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 7.21 - 7.42 (m, 14H), 7.64 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 22 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-플루오로페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (25)의 합성
표제 화합물 25는 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 11로부터 67% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.13 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.24 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 4.98 (s, 2H), 5.12 (s, 4H) 6.31 (s, 1H), 6.72-6.75 (m, 4H), 7.06 (s, 1H), 7.34 - 7.44 (m, 12H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 23 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-클로로페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (26)의 합성
표제 화합물 26은 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 12로부터 69% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.15 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.26 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 4.88 (s, 2H), 4.99 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 6.35 (s, 1H), 6.75 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.11 (s, 1H), 7.35 - 7.44 (m, 12H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 24 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-요오도페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (27)의 합성
표제 화합물 27은 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 13으로부터 72% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.15 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.25 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 4.86 (s, 2H), 4.99 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 6.31 (s, 1H), 6.57 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.11 (s, 1H), 7.30 - 7.40 (m, 14 H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 25 메틸 4-((N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (28)의 합성
표제 화합물 28은 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 14로부터 78% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.92 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.22 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.96 (s, 2H), 4.99 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.93 (s, 2H), 6.29 (s, 1H), 6.57 (dd, J = 2.1 and 8.1 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 7.32 - 7.49 (m, 12H), 7.68 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 26 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-모르폴리노페닐)벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (29)의 합성
표제 화합물 29는 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 15로부터 83% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.87 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.91 (m, 1H), 3.16 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.72 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.93 (s, 3H), 4.99 (s, 2H), 5.09 (s, 4H), 6.41 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.89 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.31 - 7.40 (m, 12H), 7.79 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 27 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (30)의 합성
표제 화합물 30은 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 16으로부터 76% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) : 0.86 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.97 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.11 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 4.99 (s, 4H), 5.13 (s, 2H), 6.22 (s, 1H), 6.64 - 6.69 (m, 3H), 6.89 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.35 - 7.43 (m, 12H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 28 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (31)의 합성
표제 화합물 31은 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 17로부터 78% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.89 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.32 (s, 3H), 2.68 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.94 (m, 1H), 3.23 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.83 (s, 3H), 4.99 (s, 2H), 5.12 (s, 4H), 6.24 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.83 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.35 - 7.42 (m, 12H), 7.69 (d, J = 7.5 Hz, 2H).
실시예 29 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-(피페리딘-1-일)페닐)벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (32)의 합성
표제 화합물 32는 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 18로부터 72% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.10 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 1.57 - 1.67 (m, 6H), 3.07 (bs, 4H), 3.19 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 5.00 (s, 2H), 5.17 (s, 4H), 6.73-6.98 (m, 6H), 7.35 - 7.43 (m, 12H), 7.80 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 30 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-메톡시페닐)벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (33)의 합성
표제 화합물 33은 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 19로부터 75% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.99 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.98 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 4.99 (s, 4H), 5.16 (s, 2H), 6.21 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.89 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.27 - 7.43 (m, 12H), 7.74 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 31 메틸 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-(벤질옥시)페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조에이트 (34)의 합성
표제 화합물 34는 화합물 21의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 1을 사용하여 화합물 20으로부터 75% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.98 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.99 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 4.89 (s, 4H), 5.01 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 6.23 (s, 1H), 6.67 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.71 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.25 - 7.431 (m, 17H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 32 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-메틸벤즈아미도)메틸)벤조산 (35)의 합성
표제 화합물 35는 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 21로부터 92% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.11 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.83 (s, 3H), 3.29 (m, 1H), 4.81 (s, 2H), 4.92 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 6.31 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.32 - 7.38 (m, 12H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 33 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-에틸-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (36)의 합성
표제 화합물 36은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 22로부터 91% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 1.27 (t, J = 5.4 Hz, 3H), 3.21 (m, 1H), 3.43 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 4.73 (s, 2H), 5.11 (s, 4H), 6.51 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 7.37 - 7.42 (m, 12H), 7.84 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 34 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (37)의 합성
표제 화합물 37은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 23으로부터 89% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.11 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.79 (m, 2H), 3.24 (m, 1H), 3.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 5.17 (s, 4H), 6.39 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 7.38 - 7.45 (m, 12H), 7.68 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 35 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-페닐벤즈아미도)메틸)벤조산 (38)의 합성
표제 화합물 38은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 24로부터 95% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.98 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.99 (m, 1H), 4.87 (s, 2H), 5.16 (s, 4H), 6.39 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 7.18 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.23 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 7.29 - 7.41 (m, 14H), 7.68 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 36 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-플루오로페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (39)의 합성
표제 화합물 39는 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 25로부터 93% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.17 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.14 (m, 1H), 4.92 (s, 2H), 5.16 (s, 4H) 6.37 (s, 1H), 6.75 - 6.81 (m, 4H), 7.12 (s, 1H), 7.36 - 7.41 (m, 12H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 37 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-클로로페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (40)의 합성
표제 화합물 40은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 26으로부터 91% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.11 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.21 (m, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.31 (s, 1H), 6.72 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.31 - 7.43 (m, 12H), 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 38 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-요오도페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (41)의 합성
표제 화합물 41은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 27로부터 92% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.18 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.21 (m, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.93 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 6.39 (s, 1H), 6.68 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.27 - 7.45 (m, 14 H), 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 39 4-((N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (42)의 합성
표제 화합물 42는 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 28로부터 91% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.98 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.18 (m, 1H), 4.99 (s, 4H), 5.08 (s, 2H), 5.98 (s, 2H), 6.32 (s, 1H), 6.52 (dd, J = 2.1 and 8.1 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.92 (s, 1H), 7.26 - 7.42 (m, 12H), 7.62 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 40 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-모르폴리노페닐)벤즈아미도)메틸)벤조산 (43)의 합성
표제 화합물 43은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 29로부터 88% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.91 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.98 (m, 1H), 3.15 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.87 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 5.01 (s, 2H), 5.08 (s, 4H), 6.49 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.92 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.35 - 7.43 (m, 12H), 7.81 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 41 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (44)의 합성
표제 화합물 44는 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 30으로부터 81% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.96 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.99 (s, 3H), 3.02 (s, 3H), 3.18 (m, 1H), 5.03 (s, 4H), 5.18 (s, 2H), 6.31 (s, 1H), 6.62 - 6.67 (m, 3H), 6.86 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.32 - 7.41 (m, 12H), 7.62 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 42 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)벤즈아미도)메틸)벤조산 (45)의 합성
표제 화합물 45는 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 31로부터 87% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.98 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.75 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.98 (m, 1H), 3.34 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.92 (s, 2H), 5.14 (s, 4H), 6.32 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.87 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 - 7.48 (m, 12H), 7.78 (d, J = 7.5 Hz, 2H).
실시예 43 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-(피페리딘-1-일)페닐)벤즈아미도)메틸)벤조산 (46)의 합성
표제 화합물 46은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 32로부터 83% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.89 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.55 - 1.72 (m, 6H), 3.23 (m, 1H), 3.34 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 4.98 (s, 2H), 5.13 (s, 4H), 6.39 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.97 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.35 - 7.38 (m, 12H), 7.72 (d, J = 7.2 Hz, 2H).
실시예 44 4-((2,4-비스(벤질옥시)-5-이소프로필-N-(4-메톡시페닐)벤즈아미도)메틸)벤조산 (47)의 합성
표제 화합물 47은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 33으로부터 89% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.97 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 4.93 (s, 4H), 5.18 (s, 2H), 6.27 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.82 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.33 (m, 12H), 7.68 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 45 4-((2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-(벤질옥시)페닐)-5-이소프로필벤즈아미도)메틸)벤조산 (48)의 합성
표제 화합물 48은 화합물 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 34로부터 94% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.92 (m, 1H), 4.99 (s, 4H), 5.11 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 6.31 (s, 1H), 6.62 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.98 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.29 - 7.45 (m, 17H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 46 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-메틸벤즈아미드 (49)의 합성
표제 화합물 49는 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 35로부터 71% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.13 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.89 (s, 3H), 3.19 (m, 1H), 4.89 (s, 2H), 4.96 (s, 2H), 5.23 (s, 4H), 6.37 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 7.31 - 7.35 (m, 17H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 47 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-N-에틸-5-이소프로필벤즈아미드 (50)의 합성
표제 화합물 50은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 36으로부터 68% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.15 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 1.21 (t, J = 5.4 Hz, 3H), 3.19 (m, 1H), 3.32 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 4.84 (s, 2H), 5.11 (s, 4H), 5.21 (s, 2H), 6.47 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.32 - 7.41 (m, 17H), 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 48 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-프로필벤즈아미드 (51)의 합성
표제 화합물 51은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 37로부터 73% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.19 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 1.83 (m, 2H), 3.17 (m, 1H), 3.31 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 5.17 (s, 4H), 5.21 (s, 2H), 6.45 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 7.33 - 7.49 (m, 17H), 7.63 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 49 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-페닐벤즈아미드 (52)의 합성
표제 화합물 52는 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 38로부터 75% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.18 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.98 (m, 1H), 4.87 (s, 2H), 5.16 (s, 6H), 6.38 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 7.16 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.22 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 7.35 - 7.41 (m, 19H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 50 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-N-(4-플루오로페닐)-5-이소프로필벤즈아미드 (53)의 합성
표제 화합물 53은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 39로부터 71% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.15 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 3.19 (m, 1H), 4.92 (s, 2H), 5.16 (s, 4H), 5.21 (s, 2H), 6.32 (s, 1H), 6.69 - 6.79 (m, 4H), 7.17 (s, 1H), 7.36 - 7.41 (m, 17H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 51 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-N-(4-클로로페닐)-5-이소프로필벤즈아미드 (54)의 합성
표제 화합물 54는 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 40으로부터 76% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.14 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 3.25 (m, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 5.15 (s, 4H), 6.38 (s, 1H), 6.78 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.34 - 7.45 (m, 17H), 7.78 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 52 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-N-(4-요오도페닐)-5-이소프로필벤즈아미드 (55)의 합성
표제 화합물 55는 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 41로부터 69% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.13 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 3.18 (m, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.93 (s, 2H), 5.19 (s, 4H), 6.32 (s, 1H), 6.81 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.19 (s, 1H), 7.29 - 7.42 (m, 19 H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 53 N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드 (56)의 합성
표제 화합물 56은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 42로부터 79% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) : 1.18 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.23 (m, 1H), 4.99 (s, 4H), 5.08 (s, 4H), 5.99 (s, 2H), 6.31 (s, 1H), 6.58 (dd, J = 2.4 and 8.4 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.21 - 7.48 (m, 17H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 54 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-모르폴리노페닐)벤즈아미드 (57)의 합성
표제 화합물 57은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 43으로부터 72% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.98 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.91 (m, 1H), 3.19 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 5.04 (s, 4H), 5.08 (s, 4H), 6.56 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.99 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.8 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.32 - 7.41 (m, 17H), 7.87 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 55 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-5-이소프로필벤즈아미드 (58)의 합성
표제 화합물 58은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 44로부터 62% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.98 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.12 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.28 (m, 1H), 5.03 (s, 4H), 5.18 (s, 4H), 6.37 (s, 1H), 6.57 - 6.65 (m, 3H), 6.89 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.35 - 7.45 (m, 17H), 7.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 56 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)벤즈아미드 (59)의 합성
표제 화합물 59는 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 45로부터 65% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.41 (s, 3H), 2.79 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.93 (m, 1H), 3.38 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.99 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 5.14 (s, 4H), 6.38 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 - 7.42 (m, 17H), 7.72 (d, J = 7.8 Hz, 2H).
실시예 57 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(피페리딘-1-일)페닐)벤즈아미드 (60)의 합성
표제 화합물 60은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 46으로부터 65% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 1.58 - 1.71 (m, 6H), 3.13 (m, 1H), 3.23 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.97 (s, 2H), 5.07 (s, 2H), 5.13 (s, 4H), 6.42 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.99 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 - 7.39 (m, 17H), 7.71 (d, J = 7.8 Hz, 2H).
실시예 58 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-메톡시페닐)벤즈아미드 (61)의 합성
표제 화합물 61은 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 47로부터 69% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.98 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.91 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.99 (s, 4H), 5.18 (s, 4H), 6.37 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.25 - 7.38 (m, 17H), 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 2H).
실시예 59 2,4-비스(벤질옥시)-N-(4-((벤질옥시)카르바모일)벤질)-N-(4-(벤질옥시)페닐)-5-이소프로필벤즈아미드 (62)의 합성
표제 화합물 62는 화합물 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 NH2OBn. HCl을 사용하여 화합물 48로부터 71% 수율로 얻어졌다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) : 0.98 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.98 (m, 1H), 4.99 (s, 4H), 5.11 (s, 4H), 5.17 (s, 2H), 6.39 (s, 1H), 6.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 7.01 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 - 7.41 (m, 22H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 2H).
실시예 60 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-메틸벤즈아미드 (63)의 합성
화합물 49 (200 mg, 0.31 mmol)를 CH3OH (10 mL)에 용해시켰다. 탄소에 촉매량의 10% 팔라듐을 첨가하고 반응 혼합물을 수소 하에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여액을 진공에서 건조하여 잔류물을 얻었고, 이를 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc:CH3OH: 9.5:0.5)로 정제하여 화합물 63을 82% 수율로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.15 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.99 (s, 3H), 3.20 (m, 1H), 4.75 (s, 2H), 6.37 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 2H). C19H23N2O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 359.1607; 관측치, 359.1608.
실시예 61 N-에틸-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드 (64)의 합성
표제 화합물 64는 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 50으로부터 86% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 1.13 (d, J = 6.3 Hz, 6H), 1.20 (t, J = 5.4 Hz, 3H), 3.14 (m, 1H), 3.34 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 4.74 (s, 2H), 6.41 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 7.45 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C20H25N2O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 373.1763; 관측치, 373.1765.
실시예 62 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-프로필벤즈아미드 (65)의 합성
표제 화합물 65는 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 51로부터 84% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.89 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.14 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.59 (m, 2H), 3.17 (m, 1H), 3.34 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 4.75 (s, 2H), 6.39 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C21H27N2O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 387.1920; 관측치, 387.1922.
실시예 63 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-페닐벤즈아미드 (66)의 합성
표제 화합물 66은 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 52로부터 79% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.81 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.92 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 6.23 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 7.10 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.22 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 7.24 - 7.31 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C24H25N2O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 421.1763; 관측치, 421.1761.
실시예 64 N-(4-플루오로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드 (67)의 합성
화합물 53 (100 mg, 0.14 mmol)을 DCM에 용해시키고 BCl3(헵탄 중 1M, 6 eq)을 0℃에서 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 45분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 고체 침전된 고체 (화합물 67, 수율 - 64%)를 수집하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.98 (m, 1H), 5.18 (s, 2H), 6.22 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.99 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 7.10 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 7.8 Hz, 2H). C24H25FN2O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 439.1669; 관측치, 439.1672.
실시예 65 N-(4-클로로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드 (68)의 합성
표제 화합물 68은 화합물 67에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 54로부터 71% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 2.98 (m, 1H), 5.19 (s, 2H), 6.23 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 7.07 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C24H24ClN2O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 455.1374; 관측치, 455.1377.
실시예 66 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-N-(4-요오도페닐)-5-이소프로필벤즈아미드 (69)의 합성
표제 화합물 69는 화합물 67에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 55로부터 73% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.87 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.99 (m, 1H), 5.17 (s, 2H), 6.25 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 7.8 Hz, 2H). C24H24ClN2O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 547.0730; 관측치, 547.0735.
실시예 67 N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드 (70)의 합성
표제 화합물 70은 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 56으로부터 81% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.90 (s, 6H), 3.02 (m, 1H), 5.14 (s, 2H), 5.92 (s, 2H), 6.24 (s, 1H), 6.54 (dd, J = 2.1 and 8.1 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C25H25N2O7 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 465.1662; 관측치, 465.1661.
실시예 68 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-모르폴리노페닐)벤즈아미드 (71)의 합성
표제 화합물 71은 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 57로부터 79% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.81 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 2.94 (m, 1H), 3.06 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.78 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 5.11 (s, 2H), 6.25 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.82 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C28H32N3O6 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 506.2291; 관측치, 506.2292.
실시예 69 N-(4-(디메틸아미노)페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드 (72)의 합성
표제 화합물 72는 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 58로부터 79% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.81 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.94 (m, 1H), 2.89 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 5.13 (s, 2H), 6.22 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.64 - 6.69 (m, 3H), 6.89 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 6.3 Hz, 2H). C26H30N3O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 464.2185; 관측치, 464.2187.
실시예 70 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)벤즈아미드 (73)의 합성
표제 화합물 73은 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 59로부터 69% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.82 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.37 (s, 3H), 2.62 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.94 (m, 1H), 3.18 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 5.14 (s, 2H), 6.22 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 7.8 Hz, 2H). C29H35N4O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 519.2607; 관측치, 519.2614.
실시예 71 2,4-디하이드록시-N-(4- 하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(피페리딘-1-일)페닐)벤즈아미드 (74)의 합성
표제 화합물 74는 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 60으로부터 79% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.82 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.57-1.66 (m, 6H), 2.91 (m, 1H), 3.10 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 5.12 (s, 2H), 6.24 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.83 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 7.5 Hz, 2H). C29H34N3O5 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 504.2498; 관측치, 504.2526.
실시예 72 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질) -5-이소프로필-N-(4-메톡시-페닐)-벤즈아미드 (75)의 합성
표제 화합물 75는 화합물 63에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 61로부터 83% 수율로 합성되었다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.84 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.97 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 5.15 (s, 2H), 6.22 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.82 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C25H27N2O6 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 451.1869; 관측치, 451.1873.
실시예 73 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질) -N-(4-하이드록시-페닐)-5-이소프로필-벤즈아미드 (76)의 합성
화합물 62 (300 mg, 0.366 mmol)를 DCM (20 mL)에 용해시키고 BCl3(1M 인헥산, 5 Ml.0)을 0℃에서 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 물로 켄칭시켰다. 추출에는 에틸 아세테이트 (3 x 20 ml)를 사용했다. 결합된 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc)로 정제하여 78% 수율의 화합물 76을 제공했다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): 0.86 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 2.95 (m, 1H), 5.14 (s, 2H), 6.23 (s, 1H), 6.67 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.71 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H). C24H25N2O6 (M+H+)에 대한 HRMS (ESI): 계산치, 437.1713; 관측치, 437.1714.
생물학적 분석 실시예
실시예 74 HSP90/HDAC 이중 억제제에 의한 인간 대장암 세포의 성장 억제
인간 대장암 세포 HCT116 생존율에 대한 합성예에 기재된 바와 같은 HSP90/HDAC6 이중 억제제의 억제 효과는 MTT 분석을 사용하여 평가된다. 결과는 HSP90/HDAC6 이중 억제제가 표 1과 같이 HCT116 세포의 성장을 억제하는 데 특히 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 75 HDAC6 활성에 대한 HSP90/HDAC 이중 억제제의 억제 능력
HSP90/HDAC 이중 억제제는 HDAC의 다양한 하위 유형의 활성을 억제하는 능력에 대해 평가된다. 결과는 표 2에 나와 있으며 화합물 63 내지 76이 HDAC6 억제에 가장 큰 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
* 양성 대조군: 트리코스타틴 A
실시예 76 HSP90α에 대한 HSP90/HDAC 이중 억제제의 억제 능력
HSP90/HDAC 이중 억제제는 HSP90α 및 HSP90 활성을 억제하는 능력이 있는 것으로 평가된다. 표 3에 나타난 바와 같이, 화합물 63 내지 76은 HSP90α 및 HSP90의 활성을 억제하는 능력을 갖는다. 상기 결과 (표 2 및 표 3)를 종합하면, 화합물 63 내지 76은 DHAC6 및 HSP90의 활성을 억제하는 능력을 갖는다.
실시예 77 HSP90/HDAC 이중 억제제는 대장암 세포에서 IFN-γ 유도된 PD-L1 발현을 감소시킨다.
활성화된 T 세포와 NK 세포는 IFN-γ를 분비하여 종양 성장을 억제한다. 또한 IFN-γ는 T 세포막 상의 PD-1과 상호작용하는 종양 표면의 PD-L1 발현을 상향 조절하여 암 세포에 대한 세포 독성 T 세포의 억제를 유발하고 종양 세포의 면역 회피를 촉진한다. 우리는 HSP90/HDAC 이중 억제제가 IFN-γ 유도 암세포의 PD-L1 성능을 하향 조절할 수 있는지 여부를 평가했다. 유세포 분석에서는 IFN-γ를 사용하여 HCT116 대장암 세포에서 PD-L1 발현을 유도하고, 세포를 HSP90/HDAC 이중 억제제로 48시간 동안 추가 처리했다. 결과는 HSP90/HDAC 이중 억제제가 IFN-γ 유도 대장암 세포의 PD-L1 발현을 감소시키는 데 효과적이라는 것을 보여준다 (도 1).
실시예 78 HSP90/HDAC 이중 억제제인 화합물 75는 HDAC6의 증가된 아세틸화를 억제하고 HSP90 관련 클라이언트 단백질을 하향 조절한다.
우리는 α-튜불린과 히스톤 H3의 아세틸화에 대한 화합물 75의 능력을 평가했다. HCT116 세포를 화합물 75와 함께 6시간 동안 투여하고 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 결과는 화합물 75가 α-튜불린과 히스톤 H3의 아세틸화를 촉진한다는 것을 보여준다 (도 2a). 다음으로 화합물 75가 HSP90 억제 여부를 평가했다. HSP90 억제는 HSP70 발현을 대체적으로 증가시키고 클라이언트 단백질 (예를 들어, Src, AKT, Rb 및 FAK)에 영향을 미친다. HCT116을 48시간 동안 화합물 75와 함께 투여하였고, HSP70 발현의 증가 및 클라이언트 단백질(Src, AKT, Rb 및 FAK)의 단백질 수준의 하향조절이 웨스턴 분석에 나타나 있다(도 2b). 요약하자면, 화합물 75는 HDAC6 및 HSP90 활성을 억제하는 HSP90/HDAC 이중 억제제이다.
실시예 79 화합물 75는 정상 세포에 세포 독성을 유발하지 않는다.
화합물 75의 정상 세포에 대한 세포독성을 평가하였다. 결과는 화합물 75가 인간 결장 정상 상피 세포 (CCD841CON) 및 인간 폐 정상 섬유아세포 (IMR-90)(IC50>20μM)의 증식을 크게 억제하지 않는다는 것을 보여준다(도 3a 및 도 3b).
실시예 80 화합물 75는 STAT1 경로를 억제하여 IFN-γ 유도 PD-L1 및 IDO 발현을 감소시킨다.
유세포 분석을 사용하여 화합물 75가 다양한 암 세포주, 즉 인간 대장암 세포주 (HCT116 및 LS174T), 인간 췌장암 세포주 (Mia paca-2 및 BXPC3), 인간 폐암 세포주 (A549) 및 마우스 대장암 세포주 (CT26)에서 IFN-γ 유도 PD-L1 성능을 하향 조절할 수 있는지 평가했다. 이는 화합물 75가 모든 IFN-γ 유도 세포막 단백질 PD-L1 발현을 억제한다는 것을 보여준다 (도 4a).
웨스턴 블롯을 사용하여 화합물 75가 STAT1 경로를 억제하여 IFN-γ 유도 PD-L1 및 IDO 성능을 감소시켰는지 여부를 평가했다. 화합물 75는 p-STAT1 및 STAT1 경로를 억제함으로써 HCT116 및 CT26 세포주에서 PD-L1 및 IDO 발현을 하향 조절하는 것으로 밝혀졌다 (도 4b).
실시예 81 화합물 75는 면역 능력이 있는 마우스에서 대장암 종양의 성장을 억제한다.
CT26을 면역 능력이 있는 마우스(Balb/c)의 등에 피하 주사한 후 종양이 50 mm3까지 성장했다. 화합물 75를 이틀마다 10 mg/kg, 25 mg/kg 및 50 mg/kg으로 정맥 주사하였다(도 5a). 화합물 75는 마우스에서 대장암 종양의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌고(도 5b 및 도 5c), 독성이 크지 않고 체중에 큰 변화가 없었다(도 5d).
실시예 82 화합물 75는 혈액 독성을 유발하지 않는다.
마우스 혈액 세포를 분석하여 화합물 75가 혈액 독성을 유발하는지 여부를 평가했다. 결과는 백혈구 및 림프구 수(도 6a), 림프구 백분율(도 6b), 적혈구, 헤모글로빈 및 혈소판 수(도 7a 내지 7c)가 처리군과 대조군 간에 큰 차이가 없음을 보여준다. 이러한 결과를 종합하면 화합물 75가 마우스의 대장암 성장을 효과적으로 억제하고 면역 능력이 있는 마우스에서 심각한 장기 독성 또는 혈액독성을 유발하지 않는다는 것을 시사한다. 중요한 것은 기존의 화학요법제는 체내의 다양한 면역 세포를 억제하는 반면, 화합물 75는 면역 세포에 대한 독성이 크지 않아 종양을 공격할 수 있는 충분한 면역 세포를 체내에 유지한다는 것이다.
실시예 83 화합물 75는 종양 부위의 PD-L1 및 IDO 발현을 감소시킨다.
화합물 75를 평가하여 종양 미세 환경에서 PD-L1 및 IDO를 감소시키는 능력을 확인했다. 결과는 화합물 75가 약물 농도 의존성을 갖는 마우스 대장암(CT26)의 종양 부위에서 PD-L1 및 IDO 발현을 감소시켜(도 8a 및 8b), 이에 의해 종양 미세환경을 파괴한다는 것을 보여준다.
실시예 84 화합물 75는 종양 부위의 CD8 세포 침투를 촉진하고 그랜자임 B 발현을 증가시킨다.
TME는 기능성 면역 세포가 종양 부위로 침투하는 것을 차단하는 것으로 알려져 있다. 종양 부위의 CD8 세포 침윤에 대한 화합물 75의 효과를 평가했다. 결과로부터, 화합물 75가 약물 농도 의존성과 함께 마우스 종양 부위(도 9a)에서 CD8 면역 세포 침윤을 크게 증가시키는 것을 발견하였다. 또 다른 측면에서 CD8+ T 세포는 암세포를 죽이는 이펙터(effector) 기능을 생성하므로 CD8+ T 세포가 그랜자임 B를 분비하는 능력을 평가했다. 따라서 우리는 그랜자임 B를 분비하는 CD8+ T 세포의 능력을 평가했다. 결과는 화합물 75가 농도 의존적으로 그랜자임 B 분비를 증가시킨다는 것을 보여준다(도 9b).
실시예 85 화합물 75는 혈액 내 면역 세포의 Treg 발현을 감소시킨다.
마우스 혈액 분석 결과에 따르면 화합물 75는 혈액 내 CD8+ 세포독성 T 세포(도 10a)와 CD4+ 헬퍼 T 세포(도 10b)의 비율에는 영향을 미치지 않았지만 면역 억제성 Treg 세포 수준(도 10c)은 농도에 의존적으로 감소할 수 있는 것으로 나타났다. 우리는 혈중 Treg 감소 이유를 추가로 조사했다. 우리는 화합물 75로 치료한 마우스에서 혈청 TGF-β 및 IL-2 수준을 조사한 결과, 화합물 75가 농도 의존적 방식으로 혈청 TGF-β 발현을 크게 감소시켰으나 IL-2에는 효과가 없음을 발견하였고(도 11a 및 11b), 이는 화합물 75에 의한 Treg의 감소가 혈청 TGF-β 함량의 감소로 인한 것일 수 있음을 시사한다.
실시예 86 화합물 75는 대장암 세포를 가진 마우스에서 종양 성장을 억제하고 항-PD1의 치료 효과를 향상시킨다.
우리는 화합물 75와 항 PD1의 병용 효과를 평가했다(도 12a). 실험 결과, 화합물 75 (50mg/kg/2일) 및 항 PD1 (200μg) 단독으로는 치료 효과가 제한적인 것으로 나타났다. 그러나 병용 치료는 종양 성장을 크게 억제했으며(도 12b 및 12c), 화합물 75로 치료한 마우스에게 큰 독성이 없었고 체중에도 큰 변화가 없었다(도 12d). 종합하면, 화합물 75는 마우스의 대장암 종양 세포에 대한 항PD1의 치료 효과를 향상시켰다.
실시예 87 화학요법과 결합된 화합물 75는 항종양 효능을 향상시킨다.
우리는 화합물 75가 화학요법제의 종양 억제 효과를 향상시킬 수 있는지 평가했다. 도 13a와 같이 대조군(비히클), CPT-11 (20 mg/kg) 또는 화합물 75 (50 mg/kg)를 CPT-11 조합하여 마우스에 투여하고 25일째에 희생시켰다. 결과는 화합물 75가 CPT-11 요법의 효과를 크게 향상시켰음을 보여준다. 또한, 병용 요법과 CPT-11 단독 투여군 간에는 체중 측면에서 큰 차이가 없었다.
실시예 88 화합물 75는 기억 T 세포의 비율을 증가시키고 종양의 재발을 억제한다.
화합물 75가 기억 T 세포의 성능을 유도하여 종양 재발을 방지하는지 여부를 추가로 조사했다. 면역 능력이 있는 마우스(BALB/c)의 등에 마우스 대장암 세포 (CT26)를 접종하고 3일 후 이틀마다 대조군 또는 화합물 75 (50 mg/kg)를 투여하고 14일째에 종양을 제거했다. 암세포를 분리하여 시험관 내에서 배양하였다. 분리된 암세포를 17일째에 마우스의 등에 재주입하고 37일째에 마우스를 희생시켰다(도 14a). 그 결과 화합물 75로 치료하고 대조군 암세포를 재접종한 그룹(화합물 75/대조군-종양)과 화합물 75로 치료하고 화합물 75로 치료한 암세포를 재접종한 그룹(화합물 75/화합물 75-종양)에서 암이 재발한 마우스는 단 한 마리에 불과했다. 그러나 대조군 (대조군/대조군-종양)에서는 암 재발 5건 중 4건이 발생했고 종양이 더 컸다(도 14b, 14c 및 14d). 이 결과는 화합물 75가 암세포의 재발을 막을 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여준다.
또한 유세포 분석을 사용하여 마우스의 비장에 있는 중추 기억 T 세포(TCM)를 분석한 결과, 화합물 75로 치료된 그룹에서 중추 기억 T 세포의 비율이 크게 증가하여 종양 재발을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 14e).
당업자는 과도한 실험 없이, 본 명세서에 기술된 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 본 명세서에 설명된 본 구현예의 범위는 제공된 설명에 한정되는 것이 아니라, 첨부된 청구항에 명시된 바와 같다. 당업자는 다음 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 본 설명에 대한 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소 농축 유도체 또는 전구약물.
    [화학식 I]

    상기 화학식 I에서,
    R1은 수소 또는 알킬이고,
    R2는 알킬이거나 이고, 여기서 R2a는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시, NR'R", 헤테로사이클릴 또는 아릴을 나타내거나, 인접한 두 개의 R2a는 이들이 부착된 페닐의 탄소 원자와 함께 페닐에 융합된 헤테로사이클릴을 형성하며, 상기 헤테로사이클릴 및 아릴은 비치환되거나 또는 알킬, 할로겐, 하이드록시, NR'R", 알콕시 또는 하이드록시로 치환되고, 상기 헤테로사이클릴은 N, O, S 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하되, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 수소 또는 알킬을 나타내고,
    L은 이고, 여기서 n은 0 또는 1이고, L1은 결합, 알킬렌 또는 알케닐렌이되, 단, n이 1인 경우, L1은 결합이 아니며,
    R3은 OH이거나, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 하이드록시 또는 NR'R"로 선택적으로 치환된 페닐이며, 여기서 R' 및 R"은 독립적으로 수소 또는 알킬을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, R1은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2-부틸 또는 2,2-디메틸에틸인 것인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R2는 C1-6 알킬 또는 인 것인, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R2는 메틸, 에틸, 프로필, 페닐, 플루오로페닐, 클로로페닐, 요오도페닐, 벤조디옥솔, 모르폴리노페닐, (디메틸아미노)페닐, 메틸피페라지닐, 피페리디닐페닐, 메톡시페닐 또는 하이드록시페닐인 것인, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, L은 결합이거나, 또는 L은 이되, n은 1이고, L1은 C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌인 것인, 화합물.
  6. 제1항에 있어서, R3은 OH이거나 NR'R"로 치환된 페닐인 것인, 화합물.
  7. 제1항에 있어서, R1은 C1-C6 알킬이고, R2는 C1-6 알킬 또는 이고, L은 결합이고, R3은 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 하이드록시 또는 NR'R"로 선택적으로 치환된 페닐이되, 여기서 R' 및 R"은 독립적으로 수소 또는 알킬을 나타내는 것인, 화합물.
  8. 제1항에 있어서, R1은 C1-C6 알킬이고, R2는 C1-6 알킬 또는 이고, L은 결합 또는 알케닐렌이고, R3은 OH인 것인, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, R1은 C1-C6 알킬이고, R2는 이고, L은 이되, 여기서 n은 1이고, L1은 C1-C6 알킬렌이고, R3은 OH인 것인, 화합물.
  10. 제1항에 있어서, R1은 이소프로필이고, R2는 4-메톡시페닐이고, L은 이되, 여기서 (1) n은 1이고, L1은 알킬렌이거나, (2) n은 0이고 L1은 알케닐렌이고, R3은 OH인 것인, 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-메틸벤즈아미드, N-에틸-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-페닐벤즈아미드, N-(4-플루오로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, N-(4-클로로페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-N-(4-요오드페닐)-5-이소프로필벤즈아미드, N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-모르폴리노페닐)벤즈아미드, N-(4-(디메틸아미노)페닐)-2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-(하이드록시카르바모일)벤질)-5-이소프로필-N-(4-(피페리딘-1-일)페닐)벤즈아미드, 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질)-5-이소프로필-N-(4-메톡시-페닐)-벤즈아미드, 및 2,4-디하이드록시-N-(4-하이드록시카르바모일-벤질)-N-(4-하이드록시-페닐)-5-이소프로필-벤즈아미드로부터 선택되는 것인, 화합물.
  12. 치료적 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 종양의 개선 및/또는 치료가 필요한 대상체에서 종양의 개선 및/또는 치료, 종양 성장의 억제, 및/또는 종양 재발의 억제를 위한 약제의 제조에 있어서 제12항에 기재된 약제학적 조성물의 용도.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제는 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor), 종양 표적 억제제, 또는 화학요법 약물과 함께 투여되는 것인, 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 면역 관문은 PD-1인 것인, 용도.
  16. 제14항에 있어서, 상기 종양 표적 억제제는 항체인 것인, 용도.
  17. 제14항에 있어서, 상기 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 토포이소머라제 I 및 II 억제제, 유사분열 억제제, 백금계 약물, 스테로이드 또는 항혈관신생제인 것인, 용도.
  18. 제13항에 있어서, 상기 종양은 고형 종양인 것인, 용도.
  19. 제13항에 있어서, 상기 종양은 대장암, 췌장암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신세포 암종, 유방암, 두경부암, 전립선암, 악성 신경교종, 골육종, 위암, 악성 중피종, 다발골수종, 난소암, 활막육종, 갑상선암 또는 흑색종으로부터 선택되는 것인, 용도.
  20. 종양 미세 환경으로부터의 면역 억제를 제거하거나, 종양에 대한 면역 체계를 자극하고, 종양 미세 환경에서 히스톤 디아세틸라제 6(HDAC6)을 억제하고, 종양 미세 환경에서 세포 독성 T 세포의 침윤을 유도하고, 종양 미세 환경에서 열 충격 단백질 90(HSP90)을 억제하고/하거나, Treg 세포 수준을 감소시키는 것이 필요한 대상체에서, 종양 미세 환경으로부터의 면역 억제를 제거하거나, 종양에 대한 면역 체계를 자극하고, 종양 미세 환경에서 히스톤 디아세틸라제 6(HDAC6)을 억제하고, 종양 미세 환경에서 세포 독성 T 세포의 침윤을 유도하고, 종양 미세 환경에서 열 충격 단백질 90(HSP90)을 억제하고/하거나, Treg 세포 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 제12항에 기재된 약제학적 조성물의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 약제는 인터페론-감마(IFN-γ)에 의해 유도된 전사 1(STAT1) 경로의 신호 변환기 및 활성화제를 차단하고, 종양의 예정된 세포사 리간드 1(PD-L1) 또는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제(IDO)의 발현을 낮추고, α-튜불린 및 히스톤의 아세틸화를 억제하고, 그랜자임 B 발현을 유도하고, 종양 성장을 위한 단백질을 불안정화시키고, 열 충격 단백질 70(HSP70)의 발현을 증가시키고, 및/또는 Src, AKT, 망막모세포종 단백질(Rb) 또는 국소 접착 키나아제(FAK)의 발현을 감소시키기 위한 것인, 용도.
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