JP2022512874A - 癌を処置するためのマドラシン誘導体化合物、組成物およびこれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は医薬の分野、特に癌処置に関する。より具体的には、本発明は典型的に医薬として使用するための新規化合物に関する。特に、本発明は、対象における細胞、特に癌細胞によるPioneer Translation Products (PTP)由来抗原の提示、典型的には産生および提示の増加、または免疫ペプチドームの変化、および対象における免疫応答の誘発または刺激のための、これらの新規化合物の使用に関する。本発明はまた、このような化合物の使用、特に、医薬組成物を製造するための、および／または処置を必要とする対象における治療法、特に、癌療法の有効性を付与するもしくは改善するための使用に関する。本発明はまた、対象における疾患、特に癌の処置、癌転移および／または癌再発の予防または処置のための方法を開示する。本発明はさらに、本発明による組成物の製造および／または本明細書に記載の方法の実施に適切なキットを提供する。

Description

本発明は一般に医薬の分野、特に癌処置に関する。具体的には、本発明はマドラシン誘導体であり、各々が典型的に医薬として使用されるものである新規化合物に関する。特に、本発明は、対象における、細胞、特に癌細胞による、(抗原性)ペプチド、好ましくはPioneer Translation Products(PTP)由来抗原の提示、典型的には産生および提示の増加、または免疫ペプチドームの変化、および対象における免疫応答の誘発または刺激のための、これらの新規化合物の使用に関する。免疫応答は、典型的には、腫瘍抗原に対して、より一般的には、対象が有する癌性腫瘍に対して向けられる。

本発明はまた、このような化合物の使用、特に、医薬組成物を製造するための、および／または処置を必要とする対象における治療、特に、癌治療の効率化を可能とするまたは改善するための使用に関する。本発明の化合物の各々は、実際に、対象における癌の処置、癌転移の予防もしくは処置および／または癌再発の予防のために、少なくとも１つの異なる抗癌剤、典型的には、化学療法薬および／または放射線療法と組み合わせて、有利に使用され得る。

本発明はまた、対象における疾患、特に癌の処置、癌転移の処置または予防および／または癌再発の予防または処置のための方法を開示する。本発明はさらに、本発明による組成物の製造および／または本明細書に記載の方法の実施に適切なキットを提供する。

全ての有核細胞は、クラスＩ主要組織適合性複合体(ＭＨＣ－Ｉ)経路によりそれらの表面に抗原ペプチド(ＡＰ)を提示する。ＡＰは、８～１０個のアミノ酸長であり、固有の細胞活動を反映する(Caronら)。それらの提示は、主に細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔ細胞(ＣＴＬ)およびＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞である免疫細胞による潜在的に危険な要素の監視を誘導するため、ＡＰは現在開発されている治療的抗癌ワクチンの標的である。有望であるにもかかわらず、腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)を標的化する治療ワクチンを用いた臨床試験の結果は期待通りではなかった。主な失敗は、免疫抑制性メカニズムおよび抗原の最適ではない選択に関連していた(Mellmanら；Burgら)。腫瘍免疫選択を駆動し、予後不良に相関する重要な事象の一つは、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩ抗原提示の減少または下方調節である(Watsonら；Liuら)。これらの最後は、ＭＨＣクラスＩ経路の構成における欠如のため、ＣＴＬおよびナチュラルキラー細胞の認識からの回避であり得る(Leoneら)。ＭＨＣクラスＩ抗原提示の全体的な減少と並んで、ＭＨＣＩクラスＩ免疫ペプチドーム(ＭＩＰ)と称される細胞表面に提示された抗原の性質は、免疫認識に極めて重要である。乳癌におけるＨｅｒ／ｎｅｕまたは結腸癌におけるＣＥＡのような特定のＴＡＡが特定され、免疫療法で標的化される癌において、腫瘍細胞表面でのこのＴＡＡ発現の減少は免疫回避をもたらす(Lee ら；Kmieciakら)。これに対抗するために、現在の戦略は、標的化された癌ペプチドの範囲を広げることおよび抗原提示を回復させることを目的とする。

ＭＩＰの動態を理解するために、ＭＨＣクラスＩ提示経路についてのＡＰの供給源が注目され得る。内因性ＡＰは、最初は完全に老化タンパク質の分解に由来すると考えられた。しかしながら、別の供給源を示唆するモデルはこの概念に異議を申し立てた。１９９６年、J. Yewdellのグループが、最初はそれらの不安定な立体配座のために急速に分解す産物として記載された欠陥リボソーム産物(ＤＲＩＰ)の概念を紹介した(Yewdellら)。より最近では、本発明者らは、ＡＰの主な供給源は、イントロンが切り出される前に生じ、かつ完全長タンパク質の翻訳事象から独立した先駆翻訳事象に由来することを示す異なる観点からの概念を研究した(Apcherら)。従って、産生された非標準的ペプチドは、イントロン配列、３’または５’ＵＴＲ領域および代替読み取り枠に由来し得る。これらのポリペプチドは、Pioneer Translation Product(ＰＴＰ)として記載される。ＰＴＰの発見は、ＭＨＣクラスＩ経路に関連し、かつ適切なポリペプチドを産生することによりＭＩＰを形成することを一部目的とする複雑な翻訳核メカニズムの存在を示唆する。さらに、ＰＴＰは、癌進展の速度における役割を果たすと考えられる。マウスに接種したとき、細胞表面にＰＴＰ由来抗原を提示する癌細胞は特定のＴ細胞により認識され、腫瘍増殖低減をもたらし得る。さらに、モデルエピトープを含む精製されたＰＴＰは、マウスにペプチドワクチンとして注射したとき、効率的に抗癌免疫応答を促進する(Duvalletら)。

前駆体ｍＲＮＡ(プレｍＲＮＡ)スプライシングは、核において、２００を超えるタンパク質との複合体である５つの小核ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５およびＵ６から成る保存された動的多タンパク質複合体であるスプライセオソームにより触媒される。スプライセオソーム複合体の制御緩和が異常腫瘍細胞増殖および進行に寄与する多くの癌における異常なスプライシングパターンを必然的に伴うことを報告する研究が増えている。２０１１年以来、骨髄単球性白血病、骨髄白血病、慢性リンパ性白血病、乳癌または多発性骨髄腫を含むいくつかの癌においてスプライセオソーム変異の再発が報告されている。

Darrigrandら(Drug Discovery and new Therapeutics、パリ・サクレ大学におけるFirst international symposium、2018年4月)は、エピトープに基づく免疫療法のための創薬可能な標的(druggable target)であることを教示している。国際公開第２０１７／１６５４９５号には、癌の処置のためのＰＩＭキナーゼ阻害剤とＲＮＡスプライシング調節剤／阻害剤の組合せが記載されている。Saltonらは、癌治療における小分子プレｍＲＮＡスプライシング調節剤の使用を開示している。近年、プラジエノライドＢおよびＤ、スプライソスタチンＡ、ＦＲ９０１４６４、Ｅ７１０７、Ｉｓｏｇｉｎｋｇｅｔｉｎおよびマドラシンを含む数種の微生物天然物およびこれらの合成アナログがスプライセオソームを阻害することが報告された。本発明者らは、各々のいくつかの抗原提示の調節剤としての潜在的な効果を試験した。

マドラシンおよび産生したいくつかの誘導体が癌に対する正の免疫調節剤として使用され得ることをここに示す。マウス癌細胞株で発現されるＰＴＰ由来抗原モデルの抗原提示を観察し、マドラシンおよび本明細書に記載の種々の誘導体を用いたインビトロ処置が抗原提示を増加させることを観察した。さらに、水に溶解したマドラシン塩酸塩(本明細書において「Ｍａｄｒａ.ＨＣｌ」、ＥＹＰ３４または式Ｉの化合物としても特定される)を用いた肉腫担持マウスのインビボ処置は、免疫依存的方法で腫瘍増殖を減速させることを示した。その効果を改善するために、水に可溶または不溶である種々のマドラシン誘導体を試験し、いくつかの誘導体はマドラシンそれ自体より強力なマウス肉腫増殖の阻害剤であることを観察した。天然物およびその誘導体は免疫不全Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍増殖に対して全く効果を有さないため、それらの効果は免疫応答に依存すると結論付けられる。これらの結果は、ＰＴＰ由来抗原提示が処置により調節され得て、かつスプライシング阻害が抗癌応答をブーストし得ることを示す。本明細書において、発明者らは抗腫瘍免疫応答を増強するための正の免疫調節剤として使用され得るスプライシング阻害剤の別の作用機構を記載する。

本発明者らは、対象における疾患の処置において、特に、癌の処置において、癌転移の予防においておよび／または癌再発の予防において使用するための新規化合物をここに記載する。

本発明者らは、マドラシンに由来する次の特定の化合物を初めて製造し、ここに記載する：
－ マドラシン塩酸塩(本明細書において「Ｍａｄｒ.ＨＣｌ」、「ＥＹＰ３４」または「式Ｉの化合物」としても特定される)

－ ５，６－ジメチル－２－((４－メチル－７－(２－モルホリノエトキシ)キナゾリン－２－イル)アミノ)ピリミジン－４(３Ｈ)－オン(本明細書において「ＥＹＰ２０１」、「化合物６」または「式IIの化合物」としても特定される)、

－ ナトリウム ２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－４－メチルキナゾリン－７－イル ホスフェート(本明細書において「ＥＹＰ５９」、「化合物７」または「式IIIの化合物」としても特定される)、

〔式中、
「Ｎａ」は「ナトリウム」を表し、
式－ＯＮａのラジカルは「ナトリウムヒドロキシド」を示す〕
－ Ｎ－(２－メトキシピリミジン－５－イル)キナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ２８１」、「化合物３２」または「式IVの化合物」としても特定される)、

－ Ｎ－(１Ｈ－インドール－３－イル)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１６５」、「化合物５７」または「式Ｖの化合物」としても特定される)、

－ ((１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ)－５－アセトキシ－７，８－ジアセチル－４－((２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－８－イル)チオ)－３，７λ^３，８λ^３－トリオキサビシクロ[４.２.０]オクタン－２－イル)メチル アセテート(本明細書において「ＥＹＰ８６」、「化合物１０」または「式VIの化合物」としても特定される)、

〔式中、式－ＯＡｃのラジカルは構造ＣＨ_３－Ｃ(＝Ｏ)－Ｏ－の「アセトキシ基」を示す〕
－ ７－メトキシ－４－メチル－Ｎ－(３，４，５－トリメトキシフェニル)キナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１８８」、「化合物４２」または「式VIの化合物Ｉ」としても特定される)、

－ ７－メトキシ－Ｎ－(６－メトキシピリジン－３－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１７４」、「化合物４１」または「式VIIIの化合物」としても特定される)、

－ Ｎ２－(７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)－Ｎ４－メチルピリミジン－２，４－ジアミン(本明細書において「ＥＹＰ１８１」、「化合物４９」または「式IXの化合物」としても特定される)、

－ ７－メトキシ－Ｎ－(４－メトキシピリミジン－２－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１７９」、「化合物５０」または「式Ｘの化合物」としても特定される)、

－ ７－メトキシ－Ｎ－(２－メトキシピリミジン－４－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１９０」、「化合物５４」または「式XIの化合物」としても特定される)

これらの化合物の各々およびその任意の組合せは、本明細書において医薬として使用されるために記載される。

あらゆるこれらの化合物およびその薬学的に許容される塩は、医薬として有利に使用される。

本明細書に記載の好ましい態様において、任意の上記の式(Ｉ)～(XI)の化合物またはその薬学的に許容される塩またはそのいずれかの組合せは、対象における疾患の処置において使用するための、特に、癌の処置において使用するための、癌転移の予防において使用するための、および／または癌再発の予防において使用するためのものである。

対象における、細胞、特に癌細胞による、(抗原性)ペプチド、好ましくは、Pioneer Translation Products(PTP)由来抗原の提示、典型的には産生および提示の誘発または増加、または免疫ペプチドームの変化のための、式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物のインビボ、インビトロまたはエクスビボでの使用が、さらに記載される。

式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物は、対象の免疫系を刺激することにより、医師が癌細胞増殖を予防または制御、好ましくは減少させることを可能とする。さらに、他の癌処置の有効性を増加させることが有利に可能である。本発明者らは、本化合物はさらに、転移および／または癌再発のリスクを低減することができることをここに示す。

このような式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物および薬学的に許容される担体を、好ましくは、同時に、別々にまたは逐次的に使用される少なくとも１つの異なる抗癌剤とともに含む組成物もまた、ここに記載される、このような組成物は、典型的に対象における疾患の処置、特に癌の処置、癌転移の予防および／または癌再発の予防のために使用されるものである。

本明細書に記載の化合物、典型的には、式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物または組成物を対象に投与する過程を含む、対象における疾患、特に、癌を処置する方法もまた、ここに記載される。

式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物および好ましくは、少なくとも１つの異なる抗癌剤を異なる容器に含むキットおよびその使用、特に、本明細書に記載の組成物の製造のための使用もまた、ここに記載される。

本発明の詳細な説明
本発明者らは、本明細書において最初に記載され、より詳細には、式(Ｉ)～(XI)の化合物として下記で特定されるマドラシン誘導体を合成した：
－ マドラシン塩酸塩(本明細書において「Ｍａｄｒ.ＨＣｌ」、「ＥＹＰ３４」または「式Ｉの化合物」としても特定される)、

－ ５，６－ジメチル－２－((４－メチル－７－(２－モルホリノエトキシ)キナゾリン－２－イル)アミノ)ピリミジン－４(３Ｈ)－オン(本明細書において「ＥＹＰ２０１」、「化合物６」または「式IIの化合物」としても特定される)、

－ ナトリウム ２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－４－メチルキナゾリン－７－イル ホスフェート(本明細書において「ＥＹＰ５９」、「化合物７」または「式IIIの化合物」としても特定される)、

〔式中、
「Ｎａ」は「ナトリウム」を表し、
式－ＯＮａのラジカルは「ナトリウムヒドロキシド」を示す〕
－ Ｎ－(２－メトキシピリミジン－５－イル)キナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ２８１」、「化合物３２」または「式IVの化合物」としても特定される)、

－ Ｎ－(１Ｈ－インドール－３－イル)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１６５」、「化合物５７」または「式Ｖの化合物」としても特定される)、

－ ((１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ)－５－アセトキシ－７，８－ジアセチル－４－((２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－８－イル)チオ)－３，７λ３，８λ３－トリオキサビシクロ[４.２.０]オクタン－２－イル)メチル アセテート(本明細書において「ＥＹＰ８６」、「化合物１０」または「式VIの化合物」としても特定される)、

〔式中、式－ＯＡｃのラジカルは構造ＣＨ_３－Ｃ(＝Ｏ)－Ｏ－の「アセトキシ基」を示す〕
－ ７－メトキシ－４－メチル－Ｎ－(３，４，５－トリメトキシフェニル)キナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１８８」、「化合物４２」または「式VIの化合物Ｉ」としても特定される)、

－ ７－メトキシ－Ｎ－(６－メトキシピリジン－３－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１７４」、「化合物４１」または「式VIIIの化合物」としても特定される)、

－ Ｎ２－(７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)－Ｎ４－メチルピリミジン－２，４－ジアミン(本明細書において「ＥＹＰ１８１」、「化合物４９」または「式IXの化合物」としても特定される)、

－ ７－メトキシ－Ｎ－(４－メトキシピリミジン－２－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１７９」、「化合物５０」または「式Ｘの化合物」としても特定される)、

－ ７－メトキシ－Ｎ－(２－メトキシピリミジン－４－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１９０」、「化合物５４」または「式XIの化合物」としても特定される)

特定の態様において、本発明者らは、式(Ａ)：

〔式中、
Ｒ^１およびＲ^２は独立して、Ｈ、ＣＨ_４(メチル)およびＣｌ(塩素)から選択され、
Ｒ^３はＨ、ＣＨ_４(メチル)、Ｃ_２Ｈ_６(エチル)、ｎ－プロピル、Ｎ(ＣＨ_２)_４またはＮ(ＣＨ_２)_５であり、
ＺはＣＨ_２またはＣ＝Ｏであり、
ｎは１、２または３であり、
ＸはＯ、ＮまたはＣＨである〕
の化合物をここに記載する。

特定のおよび好ましい態様において、式(Ａ)の化合物は、式IIの化合物(「ＥＹＰ２０１」または「化合物６」としても特定される)である。

別の特定の態様において、本発明者らは、式(Ｂ)：

〔式中、
Ｒ^１およびＲ^２は独立して、Ｈ、ＣＨ_４(メチル)、Ｃｌ(塩素)およびチオ糖から選択され；
Ｒ^３はＰ(Ｏ)(ＯＮａ)_２または

（式中、
Ｒ^４はＨ、ＣＨ_４(メチル)、Ｃ_２Ｈ_６(エチル)、ｎ－プロピル、Ｎ(ＣＨ_２)_４またはＮ(ＣＨ_２)_５であり、
ＺはＣＨ_２またはＣ＝Ｏであり、
ｎは１、２または３であり、
ＸはＯ、ＮまたはＣＨである）
である〕
の化合物をここに記載する。

アリール基は、例えば、３，４，５－トリメトキシフェニル；２－クロロ－３，４，５－トリメトキシフェニル；３，５－トリメトキシフェニル；または２－クロロ－３，５－トリメトキシフェニルであり得る。

ヘテロアリール基は、例えば、３－インドリル；２－インドリル；２－イミダゾール；２－ベンゾイミダゾール；カルバゾール；Ｎ－メチルピリミジン；メトキシピリミジン－２－イル；メトキシピリミジン－４－イル；メトキシピリジン－２－イルまたはメトキシピリジン－４－イルであり得る。

特定の態様において、式(Ｂ)の化合物は、式(III)の化合物、式(Ｖ)の化合物、式(VI)の化合物、式(VII)の化合物、式(VIII)の化合物、式(IX)の化合物、式(Ｘ)の化合物および式(ＸＩ)の化合物から選択される。

本明細書における上記の式(Ａ)および式(Ｂ)または式(Ｉ)～(XI)のいずれかの化合物およびその薬学的に許容される塩は、有利に、医薬として使用され得る。

本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で対象の組織の接触に適切であり得るか、または合理的な利益／リスク比に相応する過剰な毒性または他の合併症なしに対象に投与され得る組成物、化合物、塩などをいう。例えば、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、クロライド塩、アンモニウム塩、酢酸塩などを包含する。

本発明者らは、式(Ａ)、(Ｂ)および(Ｉ)～(XI)の化合物は、正の免疫調節剤として、有利に、特に癌に対して使用され得ることをここに示す。

本発明者らは、マウス癌細胞株において発現されたＰＴＰ由来抗原モデルの抗原提示を観察し、マドラシンおよび、好ましくは、式(Ａ)および(Ｂ)または(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物を用いたれらのインビトロ処置が、この抗原の提示を増加させることを観察した。さらに、ＤＭＳＯに溶解したマドラシンを用いた肉腫担持マウスのインビボ処置は、免疫依存的な方法で腫瘍増殖を減速させることを示した。その効果を改善するために、本明細書に記載の水に可溶なマドラシン誘導体を試験し、驚くべきことに、それらはマドラシン自体よりはるかに強力な癌阻害剤であることを観察した。免疫不全Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいて、天然物および誘導体は腫瘍増殖に全く効果を有さないため、それらの効果は免疫応答に依存することを結論付けた。それらの結果は、ＰＴＰ由来抗原提示が調節できることを示し、本発明者らは、他のマドラシン誘導体と対照的に、特に抗癌応答をブーストし、癌を処置するために使用され得る、市場開発のための新たな有望な分子を提供する。

本明細書に記載の好ましい態様において、式(Ａ)および(Ｂ)または(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物、特に、式(Ｉ)、式(II)、(III)、式(Ｖ)、式(VI)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(Ｘ)または(XI)の化合物(本明細書において「目的の化合物」としても特定される)は、対象における疾患の、特に癌の処置における使用、癌転移の予防における使用および／または癌再発の予防における使用のためのものである。

本明細書に記載の別の好ましい態様において、式(Ａ)および(Ｂ)または(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物は、処置を必要とする患者における抗癌免疫応答を刺激するために使用するためのものである。

さらに好ましい態様において、式(Ａ)および(Ｂ)または(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物は、対象における癌細胞によるPioneer Translation Products (PTP)由来抗原の提示、典型的には、産生および提示を誘発し、増加させるか、または免疫ペプチドームを変化させるために使用するものである。

本発明の化合物は、半合成または全合成のような当業者に既知の方法により得られ得る。目的の化合物の製造方法の例は、実験の部において本明細書に記載され、さらに図９および１０において示される。式(Ａ)、(Ｂ)および(Ｉ)～(XI)の化合物は、天然においては見ることができない人工的な生成物である。

式(Ａ)、(Ｉ)～(III)および(VI)の化合物は、典型的には、プレｍＲＮＡスプライシングの浸透阻害剤として記載されたマドラシンから製造され得る。式(IV)、式(Ｖ)、(VII)～(XI)の化合物は、従来の化学反応を用いて、化学合成により製造され得る。

本発明のさらなる目的は、異なる抗癌剤、典型的には、異なる化学療法剤に対する癌または癌に罹患している対象の耐性を低下させるための、式(Ａ)および(Ｂ)または(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物(またはその薬学的に許容される塩)の使用である。

少なくとも１つの異なる抗癌剤、典型的には、化学療法薬および／または放射線療法と組み合わせて使用するための、対象における疾患の処置、特に癌の処置のための、癌転移の予防のためのおよび／または癌再発の予防のための、本発明による式(Ａ)および(Ｂ)または(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物またはその薬学的に許容される塩)またはこのような塩および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた、ここに記載される。

用語「対象」は、あらゆる対象、好ましくは哺乳動物をいう。

哺乳動物の例は、ヒトおよび非ヒト動物、例えば、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、非ヒト霊長類(例えば、サル)、ウサギおよび齧歯類(例えば、マウスおよびラット)を含む。処置は、好ましくは、処置を必要とするあらゆる年齢および性別のヒトが対象とされる。

用語「対象」とは、典型的に、患者、特に、腫瘍を有する患者をいう。特に断らない限り、本発明において、腫瘍は癌性腫瘍または悪性腫瘍である。特定の態様において、対象は、化学療法および／または放射線療法のような癌の処置を受けている対象であるか、または癌を発症するリスクがある対象であるか、または癌を発症するリスクがあることが疑われる対象である。

対象は、例えば、癌に罹患し、かつ癌処置、典型的には、化学療法に対して耐性であるヒトである。

対象は、完全な従来の処置プロトコル、例えば、全ての処置プロトコルの少なくとも１サイクル、例えば、全ての処置プロトコルの２サイクルの一部に曝されていてよい。

癌または腫瘍は、あらゆる種類の癌または新生物であり得る。腫瘍は典型的には、固形腫瘍、特に、上皮性、神経外胚葉性または間葉性由来の固形腫瘍である。癌はまた、典型的に、癌、肉腫、リンパ腫、生殖細胞腫瘍、芽細胞腫、白血病および多発性骨髄腫から選択され、好ましくは、癌、肉腫、芽細胞腫、リンパ腫、白血病および多発性骨髄腫から選択される。癌は、転移癌であってもなくてもよい。

癌は、例えば、限定されないが、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病(Ｐｈ^＋ ＡＬＬ)、ホジキン病、ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽腫、脳癌、中枢神経系癌、膵臓癌、多形神経膠芽腫、頸部癌、胃癌、膀胱癌、悪性肝細胞癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児癌、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、軟組織肉腫、副鼻腔ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、骨髄腫、黒色腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および慢性リンパ性白血病から成る群から選択され得る。

好ましい実施態様において、癌は、肺癌、乳癌、尿生殖器癌(例えば、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、子宮頸癌または卵巣癌)および肉腫(例えば、小児軟組織肉腫を含む骨肉腫または軟組織肉腫、神経芽腫、骨髄腫および黒色腫)から成る群から選択される。

特定の実施態様において、癌は、肉腫である。

より好ましくは、癌は、黒色腫、肺癌(非小細胞肺癌(またはＮＳＣＬＣ)および小細胞肺癌(またはＳＣＬＣ)を含む)および乳癌から選択される。

さらにより好ましくは、癌は、黒色腫または肺癌である。

ある態様において、癌は、肺癌、典型的には、小細胞肺癌または非小細胞性肺癌である。

別の態様において、癌は、白血病、典型的には、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)または慢性リンパ性白血病である。

さらなる態様において、癌は、結腸癌、典型的には、結腸癌である。癌はまた、結腸直腸癌であり得る。

さらなる態様において、癌は、小児癌、典型的には、小児科肉腫、リンパ腫、白血病、神経芽腫、脳癌または中枢神経系癌である。

本明細書に記載の特定の態様において、抗癌剤は、化学療法剤、免疫チェックポイント阻害剤および抗癌ワクチン(本明細書において「癌ワクチン」としても特定される)から選択される。これらの薬剤は、典型的に、癌を処置するための「従来の」薬剤と考えられる。

化学療法剤は、典型的に、例えば、抗腫瘍／細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、白金ベースの成分、特異的キナーゼ阻害剤、ホルモン、サイトカイン、抗血管新生剤、抗体、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および血管崩壊剤から選択される薬剤である。

抗腫瘍剤または細胞毒性抗生物質は、例えば、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン)、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、プリカマイシンおよびヒドロキシ尿素から選択され得る。

アルキル化剤は、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、テモゾロミド、ブスルファン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素 (ＭＮＵ)、カルムスチン(ＢＣＮＵ)、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、セムスチン(ＭｅＣＣＮＵ)、ホテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン(ＡＺＱ)、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミンおよびウラムスチンから選択され得る。

代謝拮抗剤は、例えば、ピリミジン類縁体(例えば、フルオロピリミジン類縁体、５－フルオロウラシル(５－ＦＵ)、フロクスウリジン(ＦＵＤＲ)、シトシンアラビノシド(シタラビン)、ゲムシタビン(Ｇｅｍｚａｒ(登録商標))、カペシタビン)；プリン類縁体(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、クロファラビン)；葉酸類縁体(例えば、メトトレキサート、葉酸、ペメトレキセド、アミノプテリン、ラルチトレキセド、トリメトプリム、ピリメタミン)から選択され得る。

トポイソメラーゼ阻害剤は、例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェートおよびテニポシドから選択され得る。

有糸分裂阻害剤は、例えば、タキサン[パクリタキセル(ＰＧ－パクリタキセルおよびＤＨＡ－パクリタキセル)(タキソール(登録商標))、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、ラロタキセル、カバジタキセル、オルタタキセル、テセタキセルまたはタキソプレキシン]；紡錘体阻害剤またはビンカアルカロイド(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンまたはビンフルニン)；メベンダゾール；およびコルヒチンから選択され得る。

白金ベースの成分は、例えば、白金、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンおよびトリプラチンテトラナイトレートから選択され得る。

特異的キナーゼ阻害剤は、例えば、ベムラフェニブのようなＢＲＡＦキナーゼ阻害剤；ＭＡＰＫ阻害剤(例えば、ダブラフェニブ)；ＭＥＫ阻害剤(例えば、トラメチニブ)；およびイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブまたはカルボザンチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤から選択され得る。

タモキシフェン、抗アロマターゼまたは抗エストロゲン薬物はまた、典型的に、ホルモン療法において使用され得る。

免疫療法において使用可能なサイトカインは、例えば、ＩＬ－２(インターロイキン－２)、ＩＬ－１１(インターロイキン－１１)、ＩＦＮ(インターフェロン)アルファ(ＩＦＮα)、および顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)から選択され得る。

抗血管形成剤は、例えば、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブおよびエベロリムスから選択され得る。

抗体、特に、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)は、抗ＣＤ２０抗体(抗汎Ｂ細胞抗原)、抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ(ヒト上皮細胞増殖因子受容体－２／ＮＥＵ)抗体；癌細胞表面標的化抗体(例えば、リツキシマブおよびアレムツズマブ)；増殖因子標的化抗体(例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブおよびトラスツズマブ)；アゴニスト抗体(例えば、抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ、抗ＯＸ４０ ｍＡｂ、抗４１ＢＢ ｍＡｂ)；および免疫コンジュゲート(例えば、９０Ｙ－イブリツモマブチウキセタン、１３１Ｉ－トシツモマブまたはａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン)から選択され得る。

ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、例えば、２’－デオキシ－５－アザシチジン(ＤＡＣ)、５－アザシチジン、５－アザ－２’－デオキシシチジン、１－[β]－Ｄ－アラビノフラノシル－５－アザシトシンおよびジヒドロ－５－アザシチジンから選択され得る。

血管崩壊剤は、例えば、フラボン酢酸誘導体、５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸(ＤＭＸＡＡ)およびフラボン酢酸(ＦＡＡ)から選択され得る。

他の化学療法薬は、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ)、ＤＮＡ鎖崩壊化合物(例えば、チラパザミン)、チオレドキシンレダクターゼおよびリボヌクレオチドレダクターゼの両方の阻害剤(例えば、キシトリン)およびＴｈｌ免疫応答強化剤(例えば、チマルファシン)を含む。

好ましい実施態様において、化学療法薬または化学療法剤は、抗腫瘍／細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、白金ベースの成分、特異的キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、抗体およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤から選択される。

免疫チェックポイント阻害剤は、典型的に、免疫チェックポイント標的化抗体である。このような免疫チェックポイント阻害剤は、有利に、抗ＣＴＬＡ４(イピリムマブおよびトレメリムマブ)、抗ＰＤ－１(ニボルマブおよびペンブロリズマブ)、抗ＰＤ－Ｌ１(アテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブ)、抗ＰＤ－Ｌ２および抗Ｔｉｍ３から選択される。

癌ワクチンは、例えば、(抗原性)ペプチド、特に、ＰＴＰを含むワクチン組成物；ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)ワクチン(例えば、Gardasil (登録商標)、Gardasil 9(登録商標)およびCervarix(登録商標))；前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)シプロイセルＴに対する免疫応答を刺激するワクチン(Provenge(登録商標))；腫瘍溶解性ウイルス；およびタリモジンラヘルパレプベク(T-VECまたはImlygic(登録商標))から選択され得る。

別の特定の態様において、(「従来の」)癌処置は、照射(本明細書において、「放射線療法」としても特定される)である。放射線療法は、典型的に、Ｘ線(「ＸＲ」)、ガンマ線および／またはＵＶＣ線から選択される光線を含む。

数種の抗癌剤を含み得る処置は、予防または処置される特定の癌に応じて、癌専門医により選択される。

特定の黒色腫は、従来イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＩＦＮα、ダカルバジン、ＢＲＡＦ阻害剤、ダブラフェニブ、トラメチニブ、ソラフェニブ、テモゾロミド、電気化学療法、ＴＮＦαおよび／またはホテムスチンを用いて処置される黒色腫である。
特定の実施態様において、前記の細胞毒性の従来の治療法に耐性の黒色腫である。

特定の乳癌は、従来、乳房腫瘍を除去するための手術前または後に、好ましくは、手術後に、アントラサイクリン、タキサン、トラスツズマブ、抗ＰＡＲＰ(ポリ(ＡＤＰ－リボース)ポリメラーゼ)、抗ＰＩ３Ｋ(ホスホイノシチド３－キナーゼ)、ｍＴＯＲ(哺乳類ラパマイシン標的)阻害剤、ビノレルビン、ゲムシタビン、抗エストロゲンおよび／または抗アロマターゼを用いて処置される。
特定の実施態様において、乳癌は、前記の従来の治療法に耐性の乳癌である。

特定の肺癌は、従来ＸＲおよびプラチンまたはペメトレキセド(permetrexed)を用いて処置される。

特定の初期段階のＮＳＣＬＣは、従来パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、エトポシド、タキサン、アバスチン[抗ＶＥＧＦ(血管内皮細胞増殖因子)抗体]、エルロチニブおよび／またはゲフィチニブを用いて処置されるＮＳＣＬＣである。特定の実施態様において、肺癌は、従来の治療法に耐性である。

結腸直腸癌または腸癌としても知られる特定の結腸癌は、従来乳房腫瘍を除去するための手術後に、代謝拮抗剤(５－ＦＵ、ラルチトレキセド)、白金ベースの成分(オキサリプラチン)、トポイソメラーゼ阻害剤(イリノテカン)、増殖因子標的化抗体(ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ)を用いて処置される。

本発明はさらに、医薬組成物または医薬を製造するための、本発明による式(Ａ)および式(Ｂ)または式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物(またはその薬学的に許容される塩)の使用であって、前記組成物が、処置を必要とする対象の免疫系を刺激することにより、対象における疾患、特に癌を処置することができる、または治療の有効性を改善することができるものである、使用に関する。

特定の態様において、化合物は、式(Ａ)、式(Ｂ)、式II、式III、式IV、式Ｖ、式VIおよび式VIIの化合物から選択され、癌は、肉腫である。

別の特定の態様において、化合物は、式IIの化合物、式III、式IV、式Ｖ、式VIII、式IX、式Ｘおよび式XIの化合物から選択され、癌は、黒色腫である。

本発明の化合物は、対象における疾患を処置するために、特に、癌を処置するために、癌転移を予防するためにおよび／または癌再発を予防するために、少なくとも１つの異なる前記抗癌剤または他の何らかの治療活性化合物および／または放射線療法と組み合わせて、有利に使用され得る。

疾患の処置、特に癌の処置における同時、別個または逐次使用のための、典型的には組合せ製剤として式(Ａ)および(Ｂ)または(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物および薬学的に許容される担体を、好ましくは、少なくとも１つの異なる治療剤、特に、抗癌剤とともに含む組成物もまた、ここに記載される。

(ｉ)疾患、特に癌を処置する方法、(ii)疾患、特に癌の、治療剤／抗癌剤に対する感受性を増加させる方法、および(iii)治療剤／抗癌剤に対する疾患／癌の耐性を低下させる方法もまた、ここに記載され、前記方法の各々は、処置を必要とする対象に有効量、典型的には治療有効量の少なくとも１つの式(Ａ)および式(Ｂ)または式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物または上記医薬組成物を、好ましくは本明細書に記載の疾患／癌の処置に古典的に使用される別の治療剤／抗癌剤とともに(組合せ製剤として)投与することを含む。

別の特定の態様において、前記方法はさらに、疾患／癌を処置するために、または疾患／癌処置副作用を予防または処置するために、有効量の別の治療活性化合物を投与することを含む。

本明細書に記載の「処置」または「処置する」とは、処置される対象の自然経過を変化させるための治療的介入をいい、典型的に、治癒目的のために実施される。処置の所望の効果は、限定されないが、疾患の再発の予防、症状の軽減、および疾患の何らかの直接的もしくは間接的な病理学的帰結の減少、疾患進行速度の低減、疾患状態の改善または緩和ならびに寛解または予後の改善を含む。

好ましい実施態様において、本明細書の組成物および方法は、癌の進展を減速させるため、または癌の進行、典型的には腫瘍増殖の進行を減速させるために使用される。

典型的に、処置は、対象の免疫系の治療的応答、典型的に、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を誘発する。

Ｔ細胞応答の誘発は、典型的に、特定の抗原に向けられたＴ細胞応答が誘発されることを意味する。前記誘導の前には、前記Ｔ細胞応答は存在しなかったか、または検出以下のレベルであるか、機能的ではなかった。Ｔ細胞応答の強化は、前記強化前の前記Ｔ細胞の全体の作用と比較して、特定の抗原に向けられたＴ細胞の全体の作用が高められるおよび／またはより効率的であることを意味する。例えば、前記強化後、前記抗原に向けられたより多くのＴ細胞が産生され得る。結果として、さらに産生されたＴ細胞の作用は、前記抗原に対する全体の作用を増加させる。あるいは、前記強化は、前記抗原に向けられたＴ細胞の作用の増大を含み得る。例えば、前記Ｔ細胞は、前記抗原とより強くおよび／または前記抗原とより速く反応し得る。当然、前記強化の結果は、前記Ｔ細胞の作用の増大を伴うさらなるＴ細胞の産生であり得る。あるいは、前記強化は、さらなるＴ細胞の産生またはＴ細胞の作用の増大の一方のみを含み得る。

本明細書に記載の別の目的は、典型的に、特定の標的、好ましくは腫瘍抗原または癌／腫瘍細胞または組織に対する、対象における免疫応答を作り出す方法であって、本発明による式(Ａ)および式(Ｂ)または式(Ｉ)～(XI)から選択される式の化合物を、典型的に、有効量で前記対象に注射することを含む、方法に関する。

治療免疫応答の検出は、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、遅延型過敏反応、細胞内サイトカイン染色および／または細胞外サイトカイン染色のような技術により、当業者により容易に決定され得る。

本明細書に記載の「有効量または用量」または「治療有効量または用量」とは、対象における疾患、特に癌を除去する、減速させる、または前記疾患により引き起こされるまたは前記疾患に関連する１以上の症状または障害を低減するまたは遅延させるか、対象、好ましくはヒトにおいて測定可能な免疫応答を誘発する本発明の化合物の量をいう。本発明の化合物およびその医薬組成物の有効量、より一般には投与レジメンは、当業者により決定され、適合され得る。有効用量は、従来技術の使用および類似の状況下で得られた結果の観察により決定され得る。本発明の化合物の治療的有効用量は、処置される疾患、その重症度、投与経路、関連する何らかの併用療法、患者の年齢、体重、一般的な医学的状態、病歴などに応じて変化する。

典型的に、患者に投与される化合物の量は、ヒト患者に対して、約０.０１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。特定の実施態様において、本発明による医薬組成物は、０.１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０.５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物を含む。

特定の態様において、本発明の目的の化合物は、非経腸経路、経口経路または静脈内(ＩＶ)、腫瘍内(ＩＴ)もしくは腹腔内(ＩＰ)注射により、対象に投与され得る。本発明の化合物は、連続した数日間、例えば、連続した２～１０日間、好ましくは連続した３～６日間、毎日(１日１回)対象に投与され得る。前記処置は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間または７週間または２週間毎、３週間毎または１か月毎、２か月ごとまたは３か月毎の期間繰り返され得る。あるいは、所望により２つの処置サイクルの間に、例えば１週間、２週間、３週間、４週間または５週間の休薬期間を設けて、複数の処置サイクルが実施され得る。本明細書に記載の本発明の化合物のいずれか１つは、例えば、週１回、２週間に１回または月１回、単回用量として投与され得る。処置は、年間１回以上繰り返され得る。

用量は、当業者により決定され得る適切な間隔で投与される。選択される量は、投与経路、投与期間、投与時間、式(Ａ)および式(Ｂ)または式(Ｉ)～(XI)から選択される式を有する選択された化合物または前記化合物と組み合わせて使用される多様な生成物の排出速度、患者の年齢、体重および健康状態および患者の病歴および医学で知られるあらゆる他の情報を含む複数の因子に依存する。

投与経路は多様な経路により実施され得る。例えば、投与経路は、経口または非経腸であり得る。

それは、典型的に、全身注射、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、皮下などにより実施される。医薬組成物は、１以上の上記経路に適合される。医薬組成物は、好ましくは、適切な無菌溶液の注射もしくは静脈内点滴により投与されるか、または液体または固体用量の形態で、消化管を介して投与される。

医薬組成物は、薬学的に適合可能な溶媒またはビークルの溶液として、または当分野において既知の方法で、場合により、持続および／または遅延放出を提供する投与形態またはデバイスを通して固体ビークルを含むピル剤、錠剤、カプセル剤、散剤、坐薬剤などとして製剤され得る。この種類の製剤について、セルロース、脂質、炭酸塩またはデンプンのような物質が、有利に使用される。

製剤に使用され得る物質またはビークル(液体および／または注射溶液および／または固体)は、賦形剤または不活性ビークル、すなわち、薬学的に不活性かつ非毒性のビークルである。

例えば、医薬的使用と適合可能であり、当業者に既知である食塩水、生理学的、等張および／または緩衝液が言及され得る。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤などから選択される１以上の物質またはビークルを含み得る。

経口投与に適切な本発明の製剤は、カプセル剤、サシェ剤、錠剤またはロゼンジ剤として別個の単位の形態で存在し得て、これらは各々、予め決定された量の有効成分を、粉末または顆粒の形態で；水性液体または非水性液体中に溶液または懸濁液の形態で；または水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンの形態で含む。

非経腸投与に適切な製剤は、便利に、好ましくは受容者の血液と等張である、活性成分の無菌油性または水性製剤を含む。全てのこのような製剤はまた、他の薬学的に適合可能かつ非毒性の補助剤、例えば、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、染色剤、乳化剤または風味剤を含み得る。

本発明の製剤は、有効成分である本発明による式(Ａ)および式(Ｂ)または式(Ｉ)～(XI)から選択される式を有する化合物(またはその薬学的に許容される塩)とともに、薬学的に許容される担体および場合により、他の有効成分または治療成分を含む。担体は、他の製剤成分と適合可能であり、かつその受容者にとって無害であるという意味で「許容される」ものでなければならない。これらの抗癌剤の多くの安全かつ有効な投与は、当業者に既知である。さらに、これらの投与は標準的な文献に記載されている。

本発明の別の目的は、本発明による式(Ａ)および式(Ｂ)または式(Ｉ)～(XI)から選択される式を有する化合物(またはその薬学的に許容される塩)および好ましくは、少なくとも１つの異なる治療剤、特に抗癌剤、典型的には化学療法薬を異なる容器に含むキットである。キットはさらに、第三者に対して本明細書に記載の方法、例えば、対象における疾患、特に癌を処置するための、癌転移を予防または処置するためのおよび／または癌再発を処置するための方法を実施するための、本発明による組成物を製造するための指示を含む。

別の特定の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の組成物を製造するための本発明によるキットの使用に関する。

別の特定の実施態様において、第三者に対して本明細書に記載の方法、特に、対象における癌を処置するための、癌転移を予防または処置するためのおよび／または癌再発を処置するための方法を実施するのに適切である。

本発明のさらなる態様および利点は、説明としてのみ考慮される次の実験項および図面に開示される。

図１Ａおよび１Ｂ：マドラシンおよびＭａｄｒａ.ＨＣｌ処置は、癌細胞におけるイントロン由来抗原提示を増加させる。５μＭまたは１０μＭの(Ａ)マドラシン、(Ｂ)Ｍａｄｒａ.ＨＣｌで処置した後のイントロン由来ＳＬ８抗原を発現するＭＣＡ２０５肉腫細胞およびＢ１６Ｆ１０黒色腫におけるＢ３Ｚ特異的Ｔ細胞活性化。Ｔ細胞アッセイを非飽和条件で実施すること、およびＭＨＣ－Ｉ分子の発現を結果の計算に入れることを確実にするために、遊離のＳＬ８ペプチドを各条件において添加した。各グラフは少なくとも３回の独立した実験のうちの１つの代表例である。データは平均±ＳＥＭとして与えられる。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１(対応のないスチューデントｔ検定)。

Ｍａｄｒａ.ＨＣｌは、イントロン由来ＳＬ８エピトープを有する腫瘍の増殖を減速させる。野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞またはグロブリン－ＳＬ８－イントロン構築物を発現するＭＣＡ２０５肉腫細胞(ＭＣＡ２０５ グロブリン－ＳＬ８－イントロン)を免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下接種し、続いて、腫瘍接種後４日、７日、１０日および１４日に２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌを腹腔内注射した。確立された倫理的なエンドポイントに達するまで、３～４日毎に腫瘍サイズを評価した。パネルＣはグロブリン－ＳＬ８－イントロン構築を発現するＭＣＡ２０５肉腫細胞(ＭＣＡ２０５ グロブリン－ＳＬ８－イントロン)の増殖曲線を表し、パネルＤは２５日目の腫瘍サイズを表す。パネルＥは野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞(ＭＣＡ２０５ ＷＴ)の増殖曲線を表し、パネルＦは２１日目の腫瘍サイズを表す。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１(全グループを比較するテューキー多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡ)。

Ｍａｄｒａ.ＨＣｌは、イントロン由来ＳＬ８発現腫瘍担持マウスの全体的な生存を延長する。ＭＣＡ２０５ グロブリン－ＳＬ８－イントロンを皮下注射し、続いて、腫瘍接種後４日、７日、１０日および１４日に２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌで腹腔内処置したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。

Ｍａｄｒａ.ＨＣｌは持続性の特異的抗腫瘍応答を誘発する。 Ｍａｄｒａ.ＨＣｌで処置した後に完全腫瘍退縮を経験したＣ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹および左脇腹に１００日目に接種されたＭＣＡ２０５ グロブリン－ＳＬ８－イントロン細胞およびＢ１６Ｆ１０ＷＴ細胞、それぞれの増殖曲線。

各マドラシン誘導体のＭＴＴ試験。増加する用量の種々のマドラシン誘導体で処置されたＭＣＡ２０５細胞(Ａ)またはＢ１６Ｆ１０細胞(Ｂ)について実施されたＭＴＴアッセイ。データは種々の誘導体の最大阻害濃度の半分の濃度(ＩＣ_５０)として表される。ＩＣ_５０は、対照条件と比較して細胞生存の５０％阻害に必要な試験化合物の濃度を表す。６０μｍの閾値が示される。それは、何ら細胞死を示さない全ての化合物について使用される最大用量である。

両方のマウス細胞株において抗原提示を増加させるマドラシン誘導体。(Ａ)６０μＭのＥＹＰ５９(化合物７)、(Ｂ)２０μＭのＥＹＰ２０１(化合物６)、(Ｃ)６０μＭのＥＹＰ１６５(化合物５７)または(Ｄ)５０μＭのＥＹＰ２８１(化合物３２)で処置した後の、イントロン由来ＳＬ８抗原を発現するＭＣＡ２０５およびＢ１６Ｆ１０におけるＢ３Ｚ特異的Ｔ細胞活性化。Ｔ細胞アッセイを非飽和条件で実施すること、およびＭＨＣ－Ｉ分子の発現を結果の計算に入れることを確実にするために、遊離のＳＬ８ペプチドを各条件において添加した。各グラフは少なくとも３回の独立した実験のうちの１つの代表例である。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１(対応のないスチューデントｔ検定)。

ＭＣＡ２０５肉腫細胞株のみにおいて抗原提示を増加させるマドラシン誘導体。(Ａ)６０μＭのＥＹＰ１８８(化合物４２)、(Ｂ)５０μＭのＥＹＰ８６(化合物１０)で処置した後の、イントロン由来ＳＬ８抗原を発現するＭＣＡ２０５におけるＢ３Ｚ特異的Ｔ細胞活性化。Ｔ細胞アッセイを非飽和条件で実施すること、およびＭＨＣ－Ｉ分子の発現を結果の計算に入れることを確実にするために、遊離のＳＬ８ペプチドを各条件において添加した。各グラフは少なくとも３回の独立した実験のうちの１つの代表例である。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１(対応のないスチューデントｔ検定)。

Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株のみにおいて抗原提示を増加させるマドラシン誘導体。(Ａ)２０μＭのＥＹＰ１７４(化合物４１)、(Ｂ)２０μＭのＥＹＰ１７９(化合物５０)、(Ｃ)６０μＭのＥＹＰ１９０(化合物５４)および(Ｄ)１０μＭのＥＹＰ１８１(化合物４９)で処置した後の、イントロン由来ＳＬ８抗原を発現するＭＣＡ２０５におけるＢ３Ｚ特異的Ｔ細胞活性化。Ｔ細胞アッセイを非飽和条件で実施すること、およびＭＨＣ－Ｉ分子の発現を結果の計算に入れることを確実にするために、遊離のＳＬ８ペプチドを各条件において添加した。各グラフは少なくとも３回の独立した実験のうちの１つの代表例である。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１(対応のないスチューデントｔ検定)。

両方の腫瘍細胞株において抗原提示を増加させないマドラシン誘導体。(Ａ)６０μＭのＥＹＰ１７７(化合物４６)、(Ｂ)６０μＭＥＹＰ１５６(化合物４３)、(Ｃ)１０μＭのＥＹＰ１１３(化合物１１)および(Ｄ)２０μＭのＥＹＰ１０２(化合物９)で処置した後の、イントロン由来ＳＬ８抗原を発現するＭＣＡ２０５におけるＢ３Ｚ特異的Ｔ細胞活性化。Ｔ細胞アッセイを非飽和条件で実施すること、およびＭＨＣ－Ｉ分子の発現を結果の計算に入れることを確実にするために、遊離のＳＬ８ペプチドを各条件において添加した。各グラフは少なくとも３回の独立した実験のうちの１つの代表例である。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１(対応のないスチューデントｔ検定)。

ＥＹＰ５９(化合物７)は、ＭＣＡ－ＷＴ肉腫およびＭＣＡ－イントロン－ＳＬ８の増殖を減速させる。野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞またはグロブリン－ＳＬ８－イントロン構築物を発現するＭＣＡ２０５肉腫細胞(ＭＣＡ２０５ グロブリン－ＳＬ８－イントロン)を免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下接種し、続いて、腫瘍接種後４日、７日、１０日および１４日に２０ｍｇ／ｋｇのＥＹＰ５９を腹腔内注射した。確立された倫理的なエンドポイントに達するまで、３～４日毎に腫瘍サイズを評価した(Ａ)。パネルＢの上部はグロブリン－ＳＬ８－イントロン構築物を発現するＭＣＡ２０５肉腫細胞(ＭＣＡ２０５ グロブリン－ＳＬ８－イントロン)の増殖曲線を表し、パネルＢの下部は２３日目の腫瘍サイズを表す。パネルＣの上部は野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞(ＭＣＡ２０５ ＷＴ)の増殖曲線を表し、パネルＣの下部は、１９日目の腫瘍サイズを表す。パネルＤは、免疫応答マウスについて先に記載されたものと同様の設定を有する免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスにおける野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞(ＭＣＡ２０５ ＷＴ)の増殖曲線を表す。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１(全グループを比較するテューキー多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡ)。

腫瘍内または静脈内経路で注射したとき、マドラシン誘導体ＥＹＰ５９(化合物７)はインビボの腫瘍増殖を効率的に低減する。野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞を免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下接種し、続いて、腫瘍接種後４日、７日、１０日および１４日に２.５ｍｇ／ｋｇのＥＹＰ５９を腫瘍内注射するか、腫瘍接種後４日、７日、１０日および１４日に５ｍｇ／ｋｇのＥＹＰ５９を静脈内注射した。パネルＡの上部は野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞の増殖曲線を表し、パネルＡの下部は２１日目の腫瘍サイズを表す。パネルＢの上部は野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞の増殖曲線を表し、パネルＢの下部は、２５日目の腫瘍サイズを表す。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１(全グループを比較するテューキー多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡ)。

マドラシンおよびマドラシン塩酸塩(Ｍａｄｒａ.ＨＣｌ)の合成。

マドラシンのファーマコモジュレーション(pharmacomodulation)およびマドラシン誘導体の合成。

材料および方法
細胞培養
１％ グルタミン、１％ ピルビン酸ナトリウム、１％ 非天然アミノ酸、１％ ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ＦＢＳ(ライフテクノロジーズ)の存在下、ＲＰＭＩ １６４０培地(ライフテクノロジーズ)中、５％ ＣＯ_２下、３７℃で、ＭＣＡ２０５マウス肉腫細胞株を培養する。標準的な条件下、１％ グルタミン、１％ ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地(ライフテクノロジーズ)培地中、５％ ＣＯ_２下、３７℃で、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞株を培養する。選択のために、安定なＭＣＡ２０５－グロブリン－ＳＬ８－イントロン細胞株を、さらに５００μｇ／ｍｌのＧ４１８(ライフテクノロジーズ)を加えたＭＣＡ２０５細胞株と同一の条件下で培養する。選択のために、安定なＢ１６Ｆ１０－グロブリン－ＳＬ８－イントロン細胞株を、さらに５００μｇ／ｍｌのＧ４１８(ライフテクノロジーズ)を加えたＢ１６Ｆ１０細胞株と同一の条件下で培養する。１％ Ｌ－グルタミン、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭ β－メルカプトエタノールおよび１０％ ＦＣＳの存在下、ＲＰＭＩ１６４０培地(ライフテクノロジーズ)中、５％ ＣＯ_２下、３７℃で、ＳＬ８／Ｋｂ特異的(Ｂ３Ｚ)Ｔ細胞レポーターハイブリドーマを培養する。

マドラシンおよび全ての誘導体化合物の合成スキーム
１)マドラシンおよびマドラシン塩酸塩(Ｍａｄｒａ.ＨＣＬ)の合成

ａ．７－メトキシ－２，２，４－トリメチル－１，２－ジヒドロキノリン(化合物１)(参照Org. Lett. 2015, 17, 4125)

アルゴン下、ｍ－アニシジン(２.３ｍＬ、２０.３ｍｍｏｌ)およびＩｎＣｌ_３(２３２ｍｇ、１.０３ｍｍｏｌ)のアセトン(３０ｍＬ)溶液を５０℃で１４時間加熱した。溶媒を除去し、粗製物をＤＣＭおよび飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液に分配した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー(シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ １００：０から９９：１)で精製することにより、所望の化合物を黄色固体として得た。スペクトルデータは文献のものと一致する(Tamariz, J. et al. J. Org. Chem. 2013, 78, 9614-9626)。収率：６１％(２.５１ｇ、１２.３ｍｍｏｌ)。融点６８.８℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.５(シクロ／ＥｔＯＡｃ ９：１)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ６.９７(ｄ、Ｊ＝８.４Ｈｚ、１Ｈ)、６.２０(ｄｄ、Ｊ＝８.４、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、６.０１(ｄ、Ｊ＝２.５Ｈｚ、１Ｈ)、５.１９(ｓ、１Ｈ)、３.７５(ｓ、３Ｈ)、１.９６(ｄ、Ｊ＝１.５Ｈｚ、３Ｈ)、１.２６(ｓ、６Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１３Ｈ_１８ＮＯについての計算値２０４.１３８８、実測値２０４.１３８５。

ｂ．１－(７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)グアニジン(化合物２)

７－メトキシ－２，２，４－トリメチル－１，２－ジヒドロキノリン(化合物１)(２.０ｇ、０.９８ｍｍｏｌ)およびＨＣｌ(０.２５ｍＬ、０.９８ｍｍｏｌ、４Ｍ ジオキサン溶液)を室温で３０分間撹拌した。その後、Ｈ_２Ｏ(９５ｍＬ)およびジシアンジアミド(８３１ｍｇ、０.９８ｍｍｏｌ)を添加し、混合物を４８時間還流した。６０℃に冷却後、油をろ過し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を用いてｐＨを１１に調整した。形成された沈殿をろ過し、減圧下で乾燥させた。化合物２を灰白色粉末として単離した。収率：７８％(１.７６ｇ、０.７６ｍｍｏｌ)。融点２３５～２３６℃。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６) δ ７.９５(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.８２(ｓ、２Ｈ)、７.１１(ｄ、Ｊ＝２.５Ｈｚ、１Ｈ)、７.００(ｄｄ、Ｊ＝９.０、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、３.９０(ｓ、３Ｈ)、２.７０(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１１Ｈ_１４Ｎ_５Ｏについての計算値２３２.１１９８、実測値２３２.１１９３。

ｃ．２－((７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)アミノ)－５，６－ジメチルピリミジン－４(３Ｈ)－オン(マドラシン、化合物３)

１－(７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)グアニジン(化合物２)(３.２ｇ、１３.８ｍｍｏｌ)、エチル ２－メチル－３－オキソブタノエート(２.３ｍＬ、１６.２ｍｍｏｌ)、ＮａＨＣＯ_３(１.４３ｇ、１７ｍｍｏｌ)のＤＭＳＯ(２２ｍＬ)溶液を１１０℃で４８時間加熱した。室温まで冷却後、水を添加した。形成した沈殿をろ過し、カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：から９８：２)により精製し、マドラシン３をベージュ色の粉末として得た。収率：８３％(３.５８ｇ、１１.５ｍｍｏｌ)。融点２１６.４～２１７.５℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.２６(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ １３.２５(ｓ、１Ｈ)、８.５４(ｓ、１Ｈ)、７.８６(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.１７(ｄ、Ｊ＝２.５Ｈｚ、１Ｈ)、７.０７(ｄｄ、Ｊ＝９.１、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、３.９８(ｓ、３Ｈ)、２.８０(ｓ、３Ｈ)、２.２７(ｓ、３Ｈ)、２.０６(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１６Ｈ_１８Ｎ_５Ｏ_２についての計算値３１２.１４６２、実測値３１２.１４５８。

ｄ．マドラシン塩酸塩(Ｍａｄｒ.ＨＣｌ、ＥＹＰ３４)

マドラシン(化合物３)(６００ｍｇ、１.９８ｍｍｏｌ)の乾燥ジオキサン(１０ｍＬ)溶液にＨＣｌ(０.５ｍＬ、２ｍｍｏｌ、４Ｍ ジオキサン溶液)を添加した。混合物を室温で１０分間撹拌した。形成した沈殿をろ過し、減圧下で乾燥させ、マドラシン塩酸塩を透明な緑色粉末(５６５ｍｇ、１.６８ｍｍｏｌ、８５％)として得た。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、重水) δ ７.７６(ｓ、１Ｈ)、６.８８(ｓ、１Ｈ)、６.８０(ｓ、１Ｈ)、３.８７(ｓ、３Ｈ)、２.７１(ｓ、３Ｈ)、２.１１(ｓ、３Ｈ)、１.７４(ｓ、３Ｈ)。融点＞３３０℃(分解)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１６Ｈ_１８Ｎ_５Ｏ_２についての計算値３１２.１４６２、実測値３１２.１４６０。Ｃ_１６Ｈ_１８ＣｌＮ_５Ｏ_２．２／３Ｈ_２Ｏについての分析計算値：Ｃ、５３.４１ Ｈ、５.４２。実測値：Ｃ、５３.４０；Ｈ、５.４７。

２)マドラシンのファーマコモジュレーション
第１部：

ａ．２－((７－ヒドロキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)アミノ)－５，６－ジメチルピリミジン－４(３Ｈ)－オン(化合物４、ＥＹＰ１０７)

アルゴン下、－７８℃で、マドラシン(化合物３)(２５０ｍｇ、０.８ｍｍｏｌ)のＤＣＥ(１５ｍＬ)溶液にＢＢｒ_３(１２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ)を滴下添加した。溶液を室温まで昇温させ、６０℃で２０時間加熱した。クエンチ後、溶媒を減圧下で濃縮した。粗製物をＥｔＯＡｃで取り込み、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃで１０回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。所望の化合物４をＤＣＭ中に沈殿させ、ろ過し、ＤＣＭで数回洗浄した。収率：４２％(１.０ｇ、０.３４ｍｍｏｌ)。融点３４８.８～３４９.９℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.１８(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９７：３)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ) δ １３.５２(ｓ、１Ｈ)、１０.９３(ｓ、２Ｈ)、８.０５(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.０３(ｄｄ、Ｊ＝９.８、１.１Ｈｚ、１Ｈ)、６.９４(ｄ、Ｊ＝２.２Ｈｚ、１Ｈ)、２.７７(ｓ、３Ｈ)、２.１８(ｓ、３Ｈ)、１.９０(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１５Ｈ_１６Ｎ_５Ｏ_２についての計算値２９８.１３０４、実測値２９８.１３１２。

ｂ．ナトリウム ２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－４－メチルキナゾリン－７－オラート(化合物５、ＥＹＰ１１２)

２－((７－ヒドロキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)アミノ)－５，６－ジメチルピリミジン－４(３Ｈ)－オン(化合物４)(１５ｍｇ、０.０５ｍｍｏｌ)の水(１.５ｍＬ)懸濁液にＮａＯＨ(５０μＬ、０.０５ｍｍｏｌ、１Ｍ Ｈ_２Ｏ溶液)を添加した。透明な溶液が得られるまで、撹拌を５分間継続した。蒸発乾固させ、黄色固体を得た。収率：＞９９％(１５ｍｇ、０.０５ｍｍｏｌ)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ) δ ７.５１(ｄ、Ｊ＝８.８Ｈｚ、１Ｈ)、６.６７(ｄ、Ｊ＝８.８Ｈｚ、１Ｈ)、６.４０(ｓ、１Ｈ)、２.４９(ｓ、３Ｈ)、２.０３(ｓ、３Ｈ)、１.７１(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１５Ｈ_１６Ｎ_５Ｏ_２についての計算値２９８.１３０４、実測値２９８.１２５９。

ｃ．５，６－ジメチル－２－((４－メチル－７－(２－モルホリノエトキシ)キナゾリン－２－イル)アミノ)ピリミジン－４(３Ｈ)－オン(化合物６、ＥＹＰ２０１)

不活性雰囲気下、化合物４(３５ｍｇ、０.１１８ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(１ｍＬ)中で懸濁し、ＫＯＨ(１３ｍｇ、０.２３ｍｍｏｌ)を添加した。透明になるまで、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、２－クロロ－Ｎ－エチルモルホリン(２２ｍｇ、０.１２ｍｍｏｌ)を添加し、混合物を室温で１４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：０から９７：３)後、化合物６を灰白色粉末として得た。収率：１９％(９.１ｍｇ、０.０２２ｍｍｏｌ)。ＴＬＣ Ｒｆ：０.２(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９６：４)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ １３.２６(ｓ、１Ｈ)、７.８５(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.１９(ｓ、１Ｈ)、７.０８(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、４.２９(ｔ、Ｊ＝５.６Ｈｚ、２Ｈ)、３.７６(ｔ、Ｊ＝４.７Ｈｚ、４Ｈ)、２.８９(ｔ、Ｊ＝５.７Ｈｚ、２Ｈ)、２.８０(ｓ、３Ｈ)、２.６２(ｔ、Ｊ＝４.６Ｈｚ、４Ｈ)、２.２６(ｓ、３Ｈ)、２.０５(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_２１Ｈ_２７Ｎ_６Ｏ_３についての計算値４１１.２１４５、実測値４１１.２１５２。

ｄ．ナトリウム ２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－４－メチルキナゾリン－７－イル ホスフェート(化合物７、ＥＹＰ５９)

化合物４(１００.４ｍｇ、０.３３ｍｍｏｌ)およびＫＯＨ(２５ｍｇ、０.４４ｍｍｏｌ)のＨ_２Ｏ(５ｍＬ)懸濁液を室温で３０分間撹拌した。その後ＤＣＭ(５ｍＬ)を添加し、(ＥｔＯ)_２Ｐ(Ｏ)Ｃｌ(０.０６４ｍＬ、０.４４ｍｍｏｌ)およびＴＢＡＢ(１４１ｍｇ、０.４４ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。有機層を分離し、水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：０から９７：３)後、中間体ジエチルホスフェート誘導体を得た。収率：３８％(５５ｍｇ、０.１２ｍｍｏｌ)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ １３.１６(ｓ、１Ｈ)、７.９８(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.６６(ｄ、Ｊ＝２.３Ｈｚ、１Ｈ)、７.４２(ｄｄ、Ｊ＝９.０、２.４Ｈｚ、１Ｈ)、４.２８(ｐ、Ｊ＝７.４Ｈｚ、４Ｈ)、２.８４(ｓ、３Ｈ)、２.２７(ｓ、３Ｈ)、２.０５(ｓ、３Ｈ)、１.３９(ｔ、Ｊ＝７.０Ｈｚ、６Ｈ)。

精製したジエチルホスフェート化合物(５５ｍｇ、０.１２ｍｍｏｌ)をＤＣＭ(２.５ｍＬ)に溶解し；ＴＭＳＩを添加し、反応物を室温で３時間撹拌した溶媒を蒸発させ、粗製物をＤＣＭで磨砕し、ろ過し、その後Ｈ_２Ｏ中で懸濁した。ＮａＯＨ水溶液(０.２５０ｍＬ、０.２５４ｍｍｏｌ)をゆっくりと添加し、３０分間撹拌後、混合物が透明になった。溶媒を真空下で除去し、マドラシン－ホスフェート(化合物７)を得た。収率：９３％(５０ｍｇ、０.１１ｍｍｏｌ)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ) δ ７.９７(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.４７－７.３８(ｍ、２Ｈ)、２.７３(ｓ、３Ｈ)、２.２６(ｓ、３Ｈ)、１.８７(ｓ、３Ｈ)。^３１Ｐ ＮＭＲ(８１ ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ) δ －１７４.１７。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１５Ｈ_１６Ｎ_５ＮａＯ_５Ｐについての計算値４００.０７８７、実測値４００.０７９２。

第２部

ａ．２－((８－ヨード－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)アミノ)－５，６－ジメチルピリミジン－４(３Ｈ)－オン(化合物８)

冷却したマドラシン(化合物３)(３６０ｍｇ、１.１６ｍｍｏｌ)の濃Ｈ_２ＳＯ_４(１.２ｍＬ)溶液にＮＩＳ(２４８ｍｇ、１.１０ｍｍｏｌ)を(暗所で)添加した。溶液を室温で５分間撹拌した。混合物を氷水に注ぎ、ｐＨを５に調整した。ＤＣＭで抽出した後、合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：０から９８：２)により精製し、所望の化合物８を得た。収率：２５％(１２７ｍｇ、０.２９ｍｍｏｌ)。ＴＬＣ Ｒｆ：０.２２(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ １３.５０(ｓ、１Ｈ)、８.８８(ｓ、１Ｈ)、７.９６(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.０９(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、４.０８(ｓ、３Ｈ)、２.８３(ｓ、３Ｈ)、２.２８(ｓ、３Ｈ)、２.０７(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１６Ｈ_１７Ｎ_５Ｏ_２についての計算値４３８.０４２７、実測値４３８.０４２７。

ｂ．Ｎ－アセチル－Ｓ－(２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－８－イル)システイン(化合物９、ＥＹＰ１０２)

不活性雰囲気下、密封可能なバイアルに、２－((８－ヨード－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)アミノ)－５，６－ジメチルピリミジン－４(３Ｈ)－オン化合物８(１０.６ｍｇ、０.０２５ｍｍｏｌ)、システインＮＨＡｃ(７ｍｇ、０.０４ｍｍｏｌ)、ＰｄＧ_３キサントホス(５ｍｇ、０.００５ｍｍｏｌ)およびＴＨＦ(０.１ｍＬ)を添加した。混合物をアルゴンでパージし、ＮＥｔ_３(１０μＬ、０.０７ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を５０℃で１８時間撹拌し、７０℃で６時間撹拌した。溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：０から７０：３０)により精製し、所望の化合物９を得た。純粋な化合物９を白色粉末として得るために、分取ＴＬＣ(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ７５：２５)による二回目の精製が必要であった。収率：４８％(５.７ｍｇ、０.０１２ｍｍｏｌ)。ＴＬＣ Ｒｆ：０.１(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ) δ ８.１１(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.３２(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、４.０８(ｓ、３Ｈ)、３.７０－３.５５(ｍ、２Ｈ)、２.８０(ｓ、３Ｈ)、２.７０(ｓｌ、１Ｈ)、２.２３－１.９８(ｍ、６Ｈ)、１.７３(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_２１Ｈ_２５Ｎ_６Ｏ_５Ｓについての計算値４７３.１６０７、実測値４７３.１６０８。

ｃ．((１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ)－５－アセトキシ－７，８－ジアセチル－４－((２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－８－イル)チオ)－３，７λ^３，８λ^３－トリオキサビシクロ[４.２.０]オクタン－２－イル)メチル アセテート(化合物１０、ＥＹＰ８６)

不活性雰囲気下、２－((８－ヨード－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)アミノ)－５，６－ジメチルピリミジン－４(３Ｈ)－オン 化合物８(２５ｍｇ、０.０５５ｍｍｏｌ)およびチオグルコース(２２ｍｇ、０.０６ｍｍｏｌ)のＴＨＦ(０.５ｍＬ)溶液をアルゴンでパージした。触媒ＰｄＧ_３キサントホス(１０ｍｇ、０.０１ｍｍｏｌ)およびＥｔ_３Ｎ(２０μＬ、０.１４ｍｍｏｌ)を添加し、反応混合物を５０℃で３時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：０から９７：３)により精製し、所望の化合物１０を橙色固体として得た。収率：４１％。(１５.４ｍｇ、０.０２２ｍｍｏｌ)。ＴＬＣ Ｒｆ：０.３(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９６：４)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ) δ ８.１８(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.３４(ｄ、Ｊ＝９.５Ｈｚ、１Ｈ)、５.１７(ｔ、Ｊ＝９.３Ｈｚ、１Ｈ)、４.７５－４.６６(ｍ、１Ｈ)、４.０７(ｓ、３Ｈ)、３.９９－３.８９(ｍ、１Ｈ)、３.６２－３.５２(ｍ、２Ｈ)、２.８３(ｓ、３Ｈ)、２.６２(ｓ、２Ｈ)、２.１０(ｓ、６Ｈ)、１.９４(ｄ、Ｊ＝９.４Ｈｚ、６Ｈ)、１.６６(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｎａ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_３０Ｈ_３５Ｎ_５Ｏ_１１ＮａＳについての計算値６９６.１６５１、実測値６９６.１６５７。

ｄ．２－((７－メトキシ－４－メチル－８－(((２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ)－３，４，５－トリヒドロキシ－６－(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル)チオ)キナゾリン－２－イル)アミノ)－５，６－ジメチルピリミジン－４(３Ｈ)－オン(化合物１１、ＥＹＰ１１３)

化合物１０のＭｅＯＮａ(０.１９ｍＬ、０.０３８ｍｍｏｌ、０.２Ｍ ＭｅＯＨ溶液)溶液を室温で１時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、化合物１１を黄色粉末として得た。収率：＞９９％(７ｍｇ、０.０１４ｍｍｏｌ)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ) δ ７.８８(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.０２(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、３.８７(ｓ、３Ｈ)、３.５３－３.２８ (ｍ、５Ｈ)、２.９８－２.９１(ｍ、２Ｈ)、２.５８(ｓ、２Ｈ)、２.１０(ｓ、３Ｈ)、１.８０(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_２２Ｈ_２８Ｎ_５Ｏ_７Ｓについての計算値５０６.１７０９、実測値５０６.１７２９。

３)一般的方法Ａ：

不活性雰囲気下、２－アミノキナゾリン誘導体(１当量)(化合物１２)、ハロゲン化アリール(特に断らない限り、１.５当量)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(７.５ｍｏｌ％または１０ｍｏｌ％)、キサントホス(１５ｍｏｌ％または２０ｍｏｌ％)およびＣｓ_２ＣＯ_３(２当量)を添加した。混合物をアルゴンでパージした。ＴＨＦを添加した。バイアルを密封し、反応混合物を８０℃で１４時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下で除去し、粗製物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の化合物を得た。

Ｎ－(２－メトキシピリミジン－５－イル)キナゾリン－２－アミン(化合物３２、ＥＹＰ２８１、Ｃ_１３Ｈ_１１Ｎ_５Ｏ、２５３，２６５０ｇ／ｍｏｌ)：一般的方法Ａに従って、２－アミノキナゾリン(２１ｍｇ、０.１３ｍｍｏｌ)、５－ブロモ－２－メトキシピリミジン(２６ｍｇ、０.１９ｍｍｏｌ)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(９ｍｇ、０.０１ｍｍｏｌ)、キサントホス(１２ｍｇ、０.０２ｍｍｏｌ)、Ｃｓ_２ＣＯ_３(８４ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(０.６５ｍＬ)から出発した。収率：４２％(１３ｍｇ、０.０５ｍｍｏｌ)。ベージュ色粉末。融点２１０.９～２１１.７℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.２(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ９.１１(ｓ、１Ｈ)、９.０３(ｓ、２Ｈ)、７.７７(ｄ、Ｊ＝７.４Ｈｚ、３Ｈ)、７.３８(ｔ、Ｊ＝７.３Ｈｚ、１Ｈ)、７.２１(ｓ、１Ｈ)、４.０４(ｓ、３Ｈ)。

４)方法論部分からの別の方法

ａ．７－メトキシ－Ｎ－(６－メトキシピリジン－３－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(化合物４１、ＥＹＰ１７４)

一般的方法Ａに従って(１.１当量の臭化ヘテロアリールを使用したことのみを除く)、２－アミノ－４－メチル－７－メトキシキナゾリン(化合物３９)(２５ｍｇ、０.１３ｍｍｏｌ)、２－メトキシ－５－ブロモピリジン(０.０１７ｍＬ、０.１４ｍｍｏｌ)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(１２ｍｇ、０.０１３ｍｍｏｌ)、キサントホス(１５ｍｇ、０.０２６ｍｍｏｌ)、Ｃｓ_２ＣＯ_３(８４ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(０.６５ｍＬ)から出発した。収率：７６％(２９ｍｇ、０.１０ｍｍｏｌ)。橙色粉末。融点１７２.１～１７３.０℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.６(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ８.５９(ｄ、Ｊ＝２.８Ｈｚ、１Ｈ)、８.０４(ｄｄ、Ｊ＝８.８、２.８Ｈｚ、１Ｈ)、７.７５(ｄ、Ｊ＝９.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.３６(ｓ、１Ｈ)、６.９８(ｄ、Ｊ＝２.５Ｈｚ、１Ｈ)、６.８９(ｄｄ、Ｊ＝９.０、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、６.７６(ｄ、Ｊ＝８.８Ｈｚ、１Ｈ)、３.９３(ｓ、３Ｈ)、３.８９(ｓ、３Ｈ)、２.７２(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１６Ｈ_１７Ｎ_４Ｏ_２についての計算値２９７.１３５２、実測値２９７.１３２８。

ｂ．７－メトキシ－４－メチル－Ｎ－(３，４，５－トリメトキシフェニル)キナゾリン－２－アミン(化合物４２、ＥＹＰ１８８)

一般的方法Ａに従って、２－アミノ－４－メチル－７－メトキシキナゾリン(化合物３９)(２５ｍｇ、０.１３ｍｍｏｌ)、１－ブロモ－３，４，５－トリメトキシベンゼン(４７ｍｇ、０.１９ｍｍｏｌ)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(１２ｍｇ、０.０１３ｍｍｏｌ)、キサントホス(１５ｍｇ、０.０２６ｍｍｏｌ)、Ｃｓ_２ＣＯ_３(８４ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(０.６５ｍＬ)から出発した。収率：５８％(２６ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ)。淡黄色粉末；Ｍｐ １５９.５～１６０.１℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.８(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ７.７８(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.３９(ｓ、１Ｈ)、７.１１(ｓ、２Ｈ)、６.９７(ｄ、Ｊ＝２.６Ｈｚ、１Ｈ)、６.９２(ｄｔ、Ｊ＝９.０、２.４Ｈｚ、１Ｈ)、３.９１(ｓ、３Ｈ)、３.８９(ｓ、６Ｈ)、３.８３(ｓ、３Ｈ)、２.７５(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_２２Ｎ_３Ｏ_４についての計算値３５６.１６１０、実測値３５６.１５４６。

ｃ．７－メトキシ－４－メチル－Ｎ－(ｐ－トリル)キナゾリン－２－アミン(化合物４３、ＥＹＰ１５６)

一般的方法Ａに従って、２－アミノ－４－メチル－７－メトキシキナゾリン(化合物３９)(２５ｍｇ、０.１３ｍｍｏｌ)、４－ブロモトルエン(３２ｍｇ、０.１９ｍｍｏｌ)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(１２ｍｇ、０.０１３ｍｍｏｌ)、キサントホス(１５ｍｇ、０.０２６ｍｍｏｌ)、Ｃｓ_２ＣＯ_３(８４ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(０.６５ｍＬ)から出発した。収率：３９％(１４.０ｍｇ、０.０５ｍｍｏｌ)。灰白色固体。融点１４２.８～１４３.３℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.７(ＤＣＭ １００％)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ７.７７(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.６８(ｄ、Ｊ＝８.２Ｈｚ、２Ｈ)、７.２４－７.１２(ｍ、３Ｈ)、７.０５(ｄ、Ｊ＝２.５Ｈｚ、１Ｈ)、６.９０(ｄｄ、Ｊ＝９.１、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、３.９３(ｓ、３Ｈ)、２.７５(ｓ、３Ｈ)、２.３４(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１７Ｈ_１８Ｎ_３Ｏについての計算値２８０.１４５０、実測値２８０.１４４４。

ｄ．ｔ－ブチル ３－((７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)アミノ)－１Ｈ－インドール－１－カルボキシレート(化合物４６、ＥＹＰ１７７)

一般的方法Ａに従って(１.１当量のみの臭化ヘテロアリールを使用した以外)、２－アミノ－４－メチル－７－メトキシキナゾリン(化合物３９)(２５ｍｇ、０.１３ｍｍｏｌ)、３－ブロモインドール誘導体(４１ｍｇ、０.１４ｍｍｏｌ)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(１２ｍｇ、０.０１３ｍｍｏｌ)、キサントホス(１５ｍｇ、０.０２６ｍｍｏｌ)、Ｃｓ_２ＣＯ_３(８４ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(０.６５ｍＬ)。収率：３１％(１６ｍｇ、０.０４ｍｍｏｌ)から出発した。橙色粉末。融点１１４～１１６℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.５５(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ８.５７(ｓ、１Ｈ)、８.１７(ｓ、１Ｈ)、７.８２(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.５８(ｄ、Ｊ＝７.７Ｈｚ、１Ｈ)、７.４０－７.２７(ｍ、４Ｈ)、７.０９(ｄ、Ｊ＝２.５Ｈｚ、１Ｈ)、６.９４(ｄｄ、Ｊ＝９.１、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、３.９５(ｓ、３Ｈ)、２.８０(ｓ、３Ｈ)、１.７３(ｓ、９Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_２３Ｈ_２５Ｎ_４Ｏ_３についての計算値４０５.１９２７、実測値４０５.１９３２。

ｅ．Ｎ^２－(７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)－Ｎ^４－メチルピリミジン－２，４－ジアミン(化合物４９、ＥＹＰ１８１)

一般的方法Ａに従って(１.１当量のみの塩化ヘテロアリールを使用した以外)、２－アミノ－４－メチル－７－メトキシキナゾリン(化合物３９)(２５ｍｇ、０.１３ｍｍｏｌ)、２－クロロ－Ｎ－メチルピリミジン－４－アミン(２０ｍｇ、０.１４ｍｍｏｌ)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(１２ｍｇ、０.０１３ｍｍｏｌ)、キサントホス(１５ｍｇ、０.０２６ｍｍｏｌ)、Ｃｓ_２ＣＯ_３(８４ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(０.６５ｍＬ)から出発した。収率：３１％(１１ｍｇ、０.０４ｍｍｏｌ)。灰色粉末。融点２４７.４～２４９.１℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.４５(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９：１)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ) δ ８.０２(ｄ、Ｊ＝９.２Ｈｚ、２Ｈ)、７.４９(ｓ、１Ｈ)、７.１３(ｄ、Ｊ＝９.２Ｈｚ、１Ｈ)、６.３９(ｄ、Ｊ＝６.５Ｈｚ、１Ｈ)、４.００(ｓ、３Ｈ)、３.０７(ｓ、３Ｈ)、２.８５(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１５Ｈ_１７Ｎ_６Ｏについての計算値２９７.１４６４、実測値２９７.１４７３。

ｆ．７－メトキシ－Ｎ－(４－メトキシピリミジン－２－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(化合物５０、ＥＹＰ１７９)

一般的方法Ａに従って(１.１当量のみの塩化ヘテロアリールを使用した以外)、２－アミノ－４－メチル－７－メトキシキナゾリン(化合物３９)(２５ｍｇ、０.１３ｍｍｏｌ)、２－クロロ－４－メトキシピリミジン(２０ｍｇ、０.１４ｍｍｏｌ)、Ｐｄ_２ｄｂａ_３(１２ｍｇ、０.０１３ｍｍｏｌ)、キサントホス(１５ｍｇ、０.０２６ｍｍｏｌ)、Ｃｓ_２ＣＯ_３(８４ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(０.６５ｍＬ)。収率：６２％(２３ｍｇ、０.０８ｍｍｏｌ)から出発した。黄色粉末。融点１６０.８～１６１.５℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.３(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ８.４２－８.３３(ｍ、１Ｈ)、８.２８－８.１６(ｍ、１Ｈ)、７.８４(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.２３(ｓ、１Ｈ)、７.０１(ｄｄ、Ｊ＝９.０、２.３Ｈｚ、１Ｈ)、６.３５(ｄ、Ｊ＝５.６Ｈｚ、１Ｈ)、３.９７(ｓ、３Ｈ)、３.９２(ｓ、３Ｈ)、２.８１(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１５Ｈ_１６Ｎ_５Ｏ_２についての計算値２９８.１３０４、実測値２９８.１３０２。

ｇ．７－メトキシ－Ｎ－(２－メトキシピリミジン－４－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(化合物５４、ＥＹＰ１９０)

化合物５３(ＥＹＰ１９３)(１０ｍｇ、０.０３３ｍｍｏｌ)のＭｅＯＨ(０.５ｍＬ)溶液にＮａＯＭｅ(０.１５ｍＬ、０.０７５ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を８０℃で６時間加熱した。その後、溶媒を減圧下で除去し、カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：０から９９：１)により精製し、所望の化合物５４を白色固体として得た。収率：６１％(６ｍｇ、０.０２ｍｍｏｌ)。融点１７３.９～１７４.３℃。ＴＬＣ Ｒｆ：０.２７(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３) δ ８.４１(ｄ、Ｊ＝５.７Ｈｚ、１Ｈ)、８.３５(ｄ、Ｊ＝５.８Ｈｚ、１Ｈ)、７.９６(ｓ、１Ｈ)、７.８６(ｄ、Ｊ＝９.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.１２(ｄ、Ｊ＝２.６Ｈｚ、１Ｈ)、７.０５(ｄｄ、Ｊ＝９.１、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、３.９８(ｓ、３Ｈ)、３.９７(ｓ、３Ｈ)、２.８１(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１５Ｈ_１６Ｎ_５Ｏ_２についての計算値２９８.１３０４、実測値２９８.１３０９。

ｈ．Ｎ－(１Ｈ－インドール－３－イル)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－アミン(化合物５７、ＥＹＰ１６５)

化合物４６(ＥＹＰ１７７)(３５ｍｇ、０.０８ｍｍｏｌ)のＤＣＭ(２ｍＬ)溶液にＴＦＡ(０.１ｍＬ、１.３ｍｍｏｌ)を添加した。溶液を室温で２時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加し、ＤＣＭで抽出した後、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固させた。カラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００：１から２００：１)により精製し、所望の化合物５７を白色固体として得た。収率：４８％(１１ｍｇ、０.０４ｍｍｏｌ)。白色粉末。ＴＬＣ Ｒｆ：０.６(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９８：２)。^１Ｈ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６) δ １０.６９(ｓ、１Ｈ)、９.５１(ｓ、１Ｈ)、８.１７(ｓ、１Ｈ)、８.０１(ｄ、Ｊ＝８.０Ｈｚ、１Ｈ)、７.９１(ｄ、Ｊ＝８.９Ｈｚ、１Ｈ)、７.３４(ｄ、Ｊ＝８.１Ｈｚ、１Ｈ)、７.０９(ｔ、Ｊ＝７.５Ｈｚ、１Ｈ)、７.０１(ｄ、Ｊ＝２.４Ｈｚ、１Ｈ)、６.９６(ｔ、Ｊ＝７.５Ｈｚ、１Ｈ)、６.８８(ｄｄ、Ｊ＝９.０、２.５Ｈｚ、１Ｈ)、３.９１(ｓ、３Ｈ)、２.７３(ｓ、３Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)(Ｍ＋Ｈ)^＋ ｍ／ｚ Ｃ_１８Ｈ_１７Ｎ_４Ｏについての計算値３０５.１４０２、実測値３０５.１４０８。

Ｔ細胞アッセイ
トランスフェクト試薬ｊｅｔＰＲＩＭＥ(Ｏｚｙｍｅ)またはＧｅｎｅＪｕｉｃｅ(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)をそれぞれ用いて、各々の製造者のプロトコルに従って、ＭＣＡ２０５およびＢ１６Ｆ１０マウス細胞株をプラスミドＹＦＰ－グロブリン－ＳＬ８－イントロンまたはＰＣＤＮＡ３欠損プラスミド(陰性対照)にトランスフェクトする。トランスフェクトの２４時間後、細胞を種々の用量のマドラシン(Ｓｉｇｍａ ＳＭＬ １４０９)、Ｍａｄｒａ.ＨＣｌ(３.ＨＣｌ)または本明細書において引用される種々の化合物で処理する。細胞をＰＢＳ １×で３回洗浄し、５.１０^４個の腫瘍細胞を１.１０^５個のＢ３Ｚハイブリドーマとともに９６ウェルプレートで共培養する。陽性対照のウェルにおいて、４μｇ／ｍｌの合成ペプチドＳＬ８を添加する。その後、細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２で一晩インキュベートする。プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をＰＢＳ １×で２回洗浄し、０.２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０.２％ ＤＴＴ、０.５Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０.５Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４中で振盪しながら４℃で５分間溶解させる。溶解物を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を９６ウェルｏｐｔｉｐｌａｔｅ(ＯｐｔｉＰｌａｑｕｅ－９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)に移す。ＰＢＳ中に１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１１.２ｍＭ β－メルカプトエタノール、０.００１５％ ＩＧＥＰＡＬ(登録商標)ＣＡ－６３０および４０μＭ ４－メチルウンベリフェリル β－Ｄ－ガラクトピラノシド(ＭＵＧ)を含む発現緩衝液を添加し、プレートを室温で３時間インキュベートする。最後に、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ(ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ Ｇｍｂｈ、オッフェンブルク３０、ドイツ)を用いてβ－ガラクトシダーゼ活性を測定する。結果を平均±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１(対応のないスチューデントｔ検定)。

腫瘍負荷および処理
Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ(スイス)から、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雌性マウスを入手する。１.１０^５のＭＣＡ２０５肉腫またはＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞または１，５.１０^５個のＭＣＡ２０５ グロブリン－ＳＬ８－イントロンまたはＢ１６Ｆ１０グロブリン－ＳＬ８－イントロン細胞を、７週齢のマウスの右脇腹に皮下注射する。肉腫細胞は１００μＬ 無菌ＰＢＳ溶液で注射し、黒色腫細胞は５０：５０ ＰＢＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液で注射し、腫瘍細胞の拡散を防ぐ。腫瘍接種後４日、７日、１０日および１４日に、Ｍａｄｒａ.ＨＣｌの１００μＬ Ｈ_２Ｏ＋３０％(２－ヒドロキシプロピル)－β－シクロデキストリン(ｗ／ｖ)溶液を注射する。同様の方法で、腫瘍接種後４日、７日、１０日および１４日に、ＥＹＰ５９(化合物７)を１００μＬ Ｈ_２Ｏ溶液で注射する。腫瘍が倫理的なエンドポイントに達するまで、腫瘍領域を３～４日毎に記録する。全ての動物実験は、フランス国および欧州の法律および規則に則り実施した。結果を平均±ＳＥＭとして表す。＊ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１(全グループを比較するテューキー多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡ)。

結果
マドラシン処理は、癌細胞におけるＰＴＰ由来抗原の抗原提示を増加させる。
近年の研究において、本発明者らは、ＰＴＰがインビトロでの内因性ＭＨＣクラスＩ経路のためのペプチドの主要な供給源であることを示した。癌細胞表面のＰＴＰ由来抗原提示を調節するために、本発明者らは、マウス腫瘍細胞株、１つは黒色腫(Ｂ１６Ｆ１０)およびもうひとつは肉腫(ＭＣＡ２０５)細胞株に対するマドラシン処理の影響を試験した。両方のマウス細胞株は、β－グロブリン遺伝子構築物内のイントロンに由来するＰＴＰ－ＳＬ８エピトープを一時的に発現していたか、またはトランスフェクトされていない状態であった。マドラシンは両方のマウス細胞株において用量依存的な有効性で、ＰＴＰ依存性抗原提示における増加を誘発する(図１Ａ)。これらの結果は、ＰＴＰ由来抗原の産生および提示は、マドラシン処理後に癌細胞株において正に調節され得ることを示す。これらは、この分子がＰＴＰ産生および提示に依存する特定の抗腫瘍免疫応答を増強するための正の免疫調節剤として使用され得るという仮説を支持する。

合成されたマドラシン塩酸塩(Ｍａｄｒａ.ＨＣｌ)による処理は、インビトロでＰＴＰ由来抗原の抗原提示を増加させ、インビボで腫瘍増殖を減速させる。
上記の結果は、マドラシンは、処理された腫瘍細胞株の細胞表面で、イントロン配列によりコードされたＰＴＰ依存性抗原のインビトロ産生および提示を増加させることができることを示す。次の疑問は、ＤＭＳＯのみに溶解し得るマドラシンが、インビボで腫瘍増殖およびＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖に対して同様の効果を有するかどうかということであった。残念ながら、本発明者らは、ＤＭＳＯにおけるマドラシンが薄い濃度のため、マドラシンを用いたインビボ実験を実施できなかった。この最初の結果が有望であったため、本発明者らは癌免疫応答を増加させるためにマドラシン誘導体を産生することを決定した。実際に、マドラシンは水に不溶であり、ＤＭＳＯ溶媒にのみ溶解させることができ、これはマウスにおけるその薬物動態の効率を低下させる。

毒性の担体または共溶媒(ＤＭＳＯ)を使用することなくマドラシンをより広いインビトロおよびインビボの検証に使用可能にするために、マドラシンおよびその誘導体の溶解度および免疫調節活性を強化するためのこれらの合成戦略を見出すことが必要であると考えられた。

この目標を達成するために、例えば、ホスフェートプロドラッグは典型的に、優れた水溶解度、化学安定性およびホスファターゼによる親薬物への迅速な生物変換を示し得る。ホスフェートプロドラッグの形成はコンブレタスタチンＡ－４により例示される抗新生物であるフェノール性天然物およびこれらの誘導体を含む様々な分子の水溶解度の上昇に適用されてきた。

腫瘍細胞株に対する正の免疫調節剤としての新規化合物の試験という観点で、本発明者らは、初めに、これらをインビトロアッセイで試験することを決定した。予想どおり、本明細書において「Ｍａｄｒａ.ＨＣｌ」として特定される新規化合物は水に溶解させることができた。β－グロブリン遺伝子のイントロンに由来するＰＴＰ－ＳＬ８エピトープ(グロブリン－イントロン－ＳＬ８)を一時的に発現する両方のマウス細胞株ＭＣＡ２０５またはＢ１６Ｆ１０を５μＭまたは１０μＭのＭａｄｒａ.ＨＣｌで処理した後、本発明者らは、用量依存的方法において、ＰＴＰ依存性抗原提示の増加を観察した(図１Ｂ)。β－グロブリン遺伝子のイントロンからのＳＩＩＮＦＥＫＬ(ＳＬ８)エピトープ(グロブリン－イントロン－ＳＬ８)を安定に発現する１.１０^５個のＭＣＡ２０５肉腫細胞をマウスに皮下接種した。この接種の４日後、マウスに決定した用量のＭａｄｒａ.ＨＣｌを腹腔内接種した。その後、３日毎に２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌを注射した。その期間中、２～３日毎に腫瘍増殖をモニタリングした(図１Ｃ)。本発明者らは、２０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌで処置したマウスにおいて接種後２７日に腫瘍増殖の有意な５０％減少を観察し(図１Ｄ)、さらに４０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌで処置したマウスにおいて接種後２７日に６０～７０％減少を観察した(図１Ｄ)。同様の方法で、１.１０^５個の非トランスフェクトＭＣＡ２０５肉腫細胞をマウスに皮下接種した(図１Ｄ)。グロブリン－イントロン－ＳＬ８構築を発現するＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞において同様の実験を実施する。

同様の方法で、１.１０^５個の非トランスフェクトＭＣＡ肉腫細胞をマウスに皮下接種した。この接種の４日後、マウスに決定した用量のＭａｄｒａ.ＨＣｌを腹腔内接種した。その後、３日毎に同用量を注射した。その期間中、２～３日毎に腫瘍増殖をモニタリングした(図１Ｅ)。本発明者らは、２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌで処置したマウスにおいて接種後２１日に腫瘍増殖の有意な４０％減少を観察した(図１Ｆ)。

さらに、Ｍａｄｒａ.ＨＣｌ処置はマウスの生存の延長を示し、４０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌでマウスを処置したとき、腫瘍接種１２０日後に約２５％が生存し、２０ｍｇ／ｋｇのＭａｄｒａ.ＨＣｌでマウスを処置したとき、腫瘍接種１２０日後に約１５％が生存した(図１Ｇ)。

最後に、グロブリン－イントロン－ＳＬ８構築物を発現するＭＣＡ２０５腫瘍細胞を接種され、かつ上記のＭａｄｒａ.ＨＣｌを用いた処置後に腫瘍退縮を経験したマウスに、１００日後、グロブリン－イントロン－ＳＬ８構築を発現するＭＣＡ２０５腫瘍細胞を右脇腹に接種し、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を左脇腹に接種した。マウス体内でＢ１６Ｆ１０腫瘍は時間と共に増殖したが、ＭＣＡ２０５腫瘍細胞は増殖しなかった(図１Ｈ)。これらの結果は、マウスがＭＣＡ２０５腫瘍特異的な長期間の抗腫瘍応答を獲得したことを示す。

マドラシン誘導体は、イントロン由来抗原のＭＨＣクラスＩ提示をインビトロで効率的に増大する。
毒性の担体または共溶媒(ＤＭＳＯ)を使用することなくマドラシンをより広いインビトロおよびインビボの検証のためにＭａｄｒａ.ＨＣｌの免疫調節活性を改善するために、その活性を活性維持するための構造変換の戦略を見出すことが必要であると考えられた。次の本発明の化合物は、上記のとおり製造した。

腫瘍細胞株に対する正の免疫調節剤としての新規化合物を試験するために、本発明者らは、初めに、インビトロアッセイにおいてこれらを試験することを決定した。予想どおり、水に可溶なＭａｄｒａ.ＨＣｌ誘導体は数種であり、その他は水に不溶であった。ＭＴＴ試験を用いて、ＭＣＡ肉腫およびＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株における各化合物のＩＣ_２５およびＩＣ_５０を特定した(図２)。残りの実験のために、水に可溶または不溶な各化合物のＩＣ_５０で両方の細胞株を処理することを決定した。この目的のために、β－グロブリン遺伝子のイントロンに由来するＰＴＰ－ＳＬ８エピトープ(グロブリン－イントロン－ＳＬ８)を一時的に発現する両方のマウス細胞株を各化合物で一晩処理した。各化合物の免疫調節活性について、４つの異なる観察が得られた。

まず、両方のマウス腫瘍細胞株においていくつかの化合物がＰＴＰ依存性抗原提示における増加を示すことを発見した(図３)。マウス細胞株をＥＹＰ５９(化合物７)(Ａ)、ＥＹＰ２０１(化合物６)(Ｂ)、ＥＹＰ１６５(化合物５７)(Ｃ)およびＥＹＰ２８１(化合物３２)(Ｄ)でそれぞれ処理した後、ＰＴＰ－ＳＬ８提示の増加がみられた。

第二の観察は、いくつかの化合物がβ－グロブリン遺伝子におけるイントロンに由来するＰＴＰ－ＳＬ８エピトープを一時的に発現するＭＣＡ細胞株のみにおいて、それらのＰＴＰ由来抗原の提示を積極的に増加させることができたことであった(図４)。マウス肉腫細胞株をＥＹＰ１８８(化合物４２)(Ａ)およびＥＹＰ８６(化合物１０)(Ｂ)でそれぞれ処理した後、ＰＴＰ－ＳＬ８提示の増加がみられた。

さらに、第三の観察は、いくつかの化合物がβ－グロブリン遺伝子におけるイントロンに由来するＰＴＰ－ＳＬ８エピトープを一時的に発現するＢ１６Ｆ１０細胞株のみにおいて、ＰＴＰ由来抗原の提示を積極的に増加させることができたことである(図５)。本発明者らは、マウス黒色腫細胞株をＥＹＰ１７４(化合物４１)(Ａ)、ＥＹＰ１７９(化合物５０)(Ｂ)、ＥＹＰ１９０(化合物５４)(Ｃ)およびＥＹＰ１８１(化合物４９)(Ｄ)でそれぞれ処理した後、ＰＴＰ－ＳＬ８提示の増加を発見できた。

そして最後に、第四の観察は、いくつかの化合物試験された両方のマウス細胞株におけるＰＴＰ由来抗原の提示を正に増加させることができないことであった(図６)。本発明者らは、それぞれＥＹＰ１７７(化合物４６)(Ａ)、ＥＹＰ１５６(化合物４３)(Ｂ)、ＥＹＰ１１３(化合物１１)(Ｃ)、およびＥＹＰ１０２(化合物９)(Ｄ)を用いて両方のマウス細胞株を処理した後に、ＰＴＰ－ＳＬ８提示の増加を見ることができなかった。

マドラシン誘導体ＥＹＰ５９(化合物７)は、免疫依存的な方法で、インビボで効率的に腫瘍増殖を低減する。
β－グロブリン遺伝子のイントロンからのＳＩＩＮＦＥＫＬ(ＳＬ８)エピトープ(グロブリン－イントロン－ＳＬ８)を安定に発現する１.１０^５個のＭＣＡ２０５肉腫細胞をマウスに皮下接種した。この接種の４日後、マウスに決定した用量のＥＹＰ５９を腹腔内接種した。その後、３日毎に２０ｍｇ／ｋｇを注射した。その期間中、２～３日毎に腫瘍増殖をモニタリングした(図７Ａ)。本発明者らは、２０ｍｇ／ｋｇのＥＹＰ５９で処置したマウスにおいて接種後２３日に腫瘍増殖の有意な８５％減少を観察した(図７Ｂ)。同様の方法で、１.１０^５個の非トランスフェクトＭＣＡ２０５肉腫細胞をマウスに皮下接種した。この接種の４日後、マウスに決定した用量のＥＹＰ５９を腹腔内接種した。その後、３日毎に同じ用量を注射した。その期間中、２～３日毎に腫瘍増殖をモニタリングした。本発明者らは、２０ｍｇ／ｋｇのＥＹＰ５９で処置したマウスにおいて接種後１９日に腫瘍増殖の有意な７０％減少を観察した(図７Ｃ)。

これらの効果についての免疫応答の要件を評価するために、本発明者らは、先に記載したものと同様の設定で免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスにおける２０ｍｇ／ｋｇ ＥＹＰ５９処置の影響を試験し、腫瘍増殖には全く影響がないことを観察した(図７Ｄ)。これらの結果は、ＥＹＰ５９処置による腫瘍サイズ減少はインビボの活性な免疫応答の存在が必要であることを示す。

マドラシン誘導体ＥＹＰ５９(化合物７)は、腫瘍内または静脈内の方法で注射されたとき、インビボで効率的に腫瘍増殖を低減する。
１.１０^５個の野生型ＭＣＡ２０５肉腫細胞をマウスに皮下接種した。この接種の４日後、決定した用量のＥＹＰ５９を腫瘍内注射(２.５ｍｇ／ｋｇ)または静脈内注射(５ｍｇ／ｋｇ)した。その後、３日毎に同じ用量をそれぞれの投与方法で注射した。その期間中、２～３日毎に腫瘍増殖をモニタリングした。本発明者らは、５ｍｇ／ｋｇのＥＹＰ５９で静脈内処置したマウスにおいて接種後２５日に腫瘍増殖の有意な８０％減少を観察した(図８Ｂ)。

考察
本発明は、特定のスプライセオソーム阻害剤が抗腫瘍免疫応答に正の効果を有し、そのため、腫瘍増殖に対する効果を有することを明らかにする。スプライシング異常は、癌の特異的な特徴として現れ、患者の生存のための予測マーカーおよびスプライシング阻害剤を用いた癌処置の標的として研究され、これらのいくつかは現在、急性骨髄白血病において開発中である。本発明において、本発明者らは、いくつかの特定のマドラシン誘導体が肉腫および黒色腫腫瘍細胞株におけるインビトロの抗腫瘍免疫応答の強力な刺激剤であることを示す。本発明者らはまた、いくつかのマドラシン誘導体は肉腫癌モデルにおいてＰＴＰ依存性抗原提示を特異的に増加させ、それらと異なる他のいくつかの誘導体は、黒色腫癌モデルにおいてＰＴＰ依存性抗原提示を特異的に増加させることができることを示す。本発明者らは、従来の生物分子プロファイルに焦点を当てることにより、標的化分子療法の枠組み内での新たな適用方法を開示する。

ＰＴＰモデルは、プレスプライシングされたｍＲＮＡは、核において起こる代替翻訳事象によるＰＴＰのテンプレートとして記載する。この代替翻訳を記載する研究において、本発明者らは、イントロンＳＬ８ペプチドをコードするｍＲＮＡの強制的な核保持がＳＬ８抗原提示における増加をもたらすことを示した。さらに、プラジエノライドおよびスプライソスタチンＡ(ＳＳＡ)は、スプライセオソームにおけるＵ２小核リボ核タンパク質(ｓｎＲＮＰ)のサブ複合体であるＳＦ３ｂを標的化することによりスプライシングを阻害
することが示され、核におけるプレＲＮＡ蓄積を促進することが記載されている核。マドラシンは、Ｕ２ ｓｎＲＮＰ固定直後の安定なＵ４／Ｕ６／Ｕ５トリｓｎＲＮＰ動員を阻害することにより、異なってスプライシングを阻害する。しかしながら、それはまた、核におけるプレｍＲＮＡ蓄積を誘発し、抗原提示の増加をもたらすと考えられる。プレｍＲＮＡ核蓄積および抗原提示の増加の関連性は知られていない。核におけるプレｍＲＮＡ蓄積は、ＳＬ８直接提示のための主な基礎として使用されるＳＬ８含有ＰＴＰの富化をもたらすＰＴＰ産生のためのより多くの鋳型を提供すると仮定される。

さらに、プレｍＲＮＡスプライシングは全ての哺乳動物細胞の正常な機能のために必要とされる不可欠なメカニズムである。ここ数年において、いくつかの研究により、種々の癌における異常なスプライシング活性に関連する主要なスプライセオソーム因子の変異および過剰発現の存在が報告された。数年前、本発明者らもまた、スプライセオソームの阻害がＭＨＣクラスＩ ＰＴＰ依存性抗原提示を増加させるといういくつかの根拠を提供した。これらの発見は、抗癌処置における潜在的な標的としてスプライセオソームに焦点を当てる。

既に記載したとおり、スプライセオソームを阻害し、スプライセオソーム因子であるＳＦ３Ｂ１機能を特異的に阻害する数小分子が既に報告されている。これらの小分子の詳細なメカニズムは未だ完全に理解されていないが、これらは使用される化合物により腫瘍サイズを４０～８０％減少させることにより、癌治療に有効であり得ることが報告されている。現在までにヒトにおいて試験された小分子は、Ｅ７１０７のみである。それは毒性の問題により中止された。この化合物は、ＳＦ３Ｂ１に相互作用することによりスプライセオソームを阻害することが知られている。

さらに、腫瘍を拒絶できない細胞毒性Ｔリンパ球は、ｐＡＰＣによる初期の不適切なＣＴＬ活性化により一部説明され得る。定義された樹状細胞(ＤＣ)のサブセットは、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)において腫瘍流入領域リンパ節に移動し、ＴＭＥで遭遇した無傷の抗原を送達し、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を直接的にまたは間接的に刺激することができると記載されている。さらに、ＴＭＥにおいてナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を直接的に刺激できることが示唆された。最近、本発明者らは、腫瘍関連ＰＴＰは、ＤＣによるＣＤ８^＋Ｔ細胞相互刺激の基礎物質であり、ＰＴＰ運搬エキソソームにより主に腫瘍細胞からＤＣへ主に輸送され得ることを示した。さらに、内因性および相互提示のためのＰＴＰは、同一の翻訳事象により産生される、および２つの経路はその後急速に分岐するという示唆が提供された。ＰＴＰは希少な産生物であり、ＰＴＰワクチンまたはエキソソーム含有ＰＴＰワクチンの有効性は、ＰＴＰプロテアソーム阻害剤による事前のＰＴＰ富化に依拠することが示された。本発明者らは、スプライシング阻害剤であるマドラシンおよびその種々の誘導体は、直接的な抗原提示のためのより多くの基礎物質を提供することに加えて、腫瘍内ＤＣ取り込みおよび相互提示のための基礎物質として機能するＳＬ８含有ＰＴＰのプールを富化し、ＳＬ８－特定のＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖の強化を誘発すると考えている。

本明細書において、本発明者らは、特定のマドラシンからの誘導体化合物を用いてスプライセオソーム活性を調節することにより、種々の癌モデルに対して特定の抗腫瘍免疫応答を誘発できる可能性があるという証明を提供する。実際に、マドラシンはプレスプライセオソームのＡ複合体から大型のプレ触媒スプライセオソームＢ複合体の形成を阻害する。我々は、マドラシン誘導体を用いて、できる限り早くインビトロおよびインビボでスプライセオソームの形成を阻害することにより、抗腫瘍抗原提示が有意に増加し、ＰＴＰ依存性エピトープに対して特異的にＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を誘発したことを示す。発明者らは、これらの誘導体が黒色腫および肉腫に対する化学療法剤として使用され得ることを報告する。

引用文献
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- Burg, S. H. et al. Vaccines for established cancer: overcoming the challenges posed by immune evasion. Nat. Publ. Gr. 16, 219-233 (2016)
- Caron, E. et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Mol Syst Biol. 7, 533 (2011)
- Duvallet, E., et al. Exosome-driven transfer of tumor-associated Pioneer Translation Products (TA-PTPs) for the MHC class I cross-presentation pathway. Oncoimmunology 5, e1198865 (2016)
- Kmieciak, M.,et al. HER-2/neu antigen loss and relapse of mammary carcinoma are actively induced by T cell-mediated anti-tumor immune responses. Eur. J. Immunol. 37, 675-685 (2007)
- Lee, S. & Sin, J. MC32 tumor cells acquire Ag-specific CTL resistance through the loss of CEA in a colon cancer model. Hum Vaccin Immunother 11, 2012-2020 (2015)
- Leone, P. et al. MHC class I antigen processing and presenting machinery: organization, function, and defects in tumor cells. J. Natl. Cancer Inst. 105, 1172-87 (2013)
- Liu, Y. et al. Expression of antigen processing and presenting molecules in brain metastasis of breast cancer. Cancer Immunol. Immunother. 61, 789-801 (2012)
- Mellman, I.,et al. Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480, 480-489 (2014)
- Watson, N. F. S. et al. Immunosurveillance is active in colorectal cancer as downregulation but not complete loss of MHC class I expression correlates with a poor prognosis. Int. J. Cancer 118, 6-10 (2006)
- Yewdell, JW., et al. Defective ribosomal products (DRiPs): a major source of antigenic peptides for MHC class I molecules? J Immunol 157(5):1823-6 (1996)

Claims (15)

1. 医薬として使用するための、
   

   

   〔式中、
   Ｒ^１およびＲ^２は独立して、Ｈ、ＣＨ_４およびＣｌから選択され、
   Ｒ^３はＨ、ＣＨ_４、Ｃ_２Ｈ_６(エチル)、ｎ－プロピル、Ｎ(ＣＨ_２)_４またはＮ(ＣＨ_２)_５であり
   ＺはＣＨ_２またはＣ＝Ｏであり、
   ｎは１、２または３であり、
   ＸはＯ、ＮまたはＣＨである〕；
   

   

   〔式中、
   Ｒ^１およびＲ^２は独立して、Ｈ、ＣＨ_４、Ｃｌおよびチオ糖から選択され；および
   Ｒ^３はＰ(Ｏ)(ＯＮａ)_２または
   

   

   （式中、
   Ｒ^４はＨ、ＣＨ_４(メチル)、Ｃ_２Ｈ_６(エチル)、ｎ－プロピル、Ｎ(ＣＨ_２)_４またはＮ(ＣＨ_２)_５であり、
   ＺはＣＨ_２またはＣ＝Ｏであり、
   ｎは１、２または３であり、
   ＸはＯ、ＮまたはＣＨである）
   である〕；および
   

   

   から選択される化合物。
2. 式(Ａ)の化合物が
   ５，６－ジメチル－２－((４－メチル－７－(２－モルホリノエトキシ)キナゾリン－２－イル)アミノ)ピリミジン－４(３Ｈ)－オン
   

   

   であるか、または
   式(Ｂ)の化合物が
   ナトリウム ２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－４－メチルキナゾリン－７－イル ホスフェート
   

   

   Ｎ－(１Ｈ－インドール－３－イル)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１６５」、「化合物５７」または「式Ｖの化合物」としても特定される)、
   

   

   ((１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ)－５－アセトキシ－７，８－ジアセチル－４－((２－((４，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル)アミノ)－７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－８－イル)チオ)－３，７λ３，８λ３－トリオキサビシクロ[４.２.０]オクタン－２－イル)メチル アセテート(本明細書において「ＥＹＰ８６」、「化合物１０」または「式VIの化合物」としても特定される)、
   

   

   ７－メトキシ－４－メチル－Ｎ－(３，４，５－トリメトキシフェニル)キナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１８８」、「化合物４２」または「式VIの化合物Ｉ」としても特定される)、
   

   

   ７－メトキシ－Ｎ－(６－メトキシピリジン－３－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン
   

   

   Ｎ２－(７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル)－Ｎ４－メチルピリミジン－２，４－ジアミン(本明細書において「ＥＹＰ１８１」、「化合物４９」または「式IXの化合物」としても特定される)、
   

   

   ７－メトキシ－Ｎ－(４－メトキシピリミジン－２－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１７９」、「化合物５０」または「式Ｘの化合物」としても特定される)、
   

   

   ７－メトキシ－Ｎ－(２－メトキシピリミジン－４－イル)－４－メチルキナゾリン－２－アミン(本明細書において「ＥＹＰ１９０」、「化合物５４」または「式XIの化合物」としても特定される)
   

   

   から選択される、請求項１に記載の使用のための化合物。
3. 対象における癌の処置、癌転移の予防および／または癌再発の予防に使用するための、請求項１または２に記載の化合物。
4. 少なくとも１つの異なる抗癌剤および／または放射線療法と組み合わせられる、請求項３に記載の使用のための化合物。
5. 癌が、癌腫、肉腫、リンパ腫、生殖細胞腫瘍、芽細胞腫、白血病および多発性骨髄腫から選択される、請求項３または４に記載の使用のための化合物。
6. 化合物が式II、式III、式IV、式Ｖ、式VIおよび式VIIの化合物から選択され、癌が肉腫である、請求項５に記載の使用のための化合物。
7. 化合物が式II、III、式IV、式Ｖ、VIII、式IX、式Ｘおよび式XIの化合物から選択され、癌腫が黒色腫である、請求項５に記載の使用のための化合物。
8. 化学療法剤、免疫チェックポイント阻害剤および抗癌ワクチンから選択される、請求項４～７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
9. 処置を必要とする対象における抗癌免疫応答の刺激に使用するための、請求項１または２に記載の化合物。
10. 請求項１または２に記載の化合物および薬学的に許容される担体を、好ましくは同時に、別個にまたは逐次的に使用される少なくとも１つの異なる抗癌剤とともに含む組成物。
11. 癌の処置、癌転移の予防および／または癌再発の予防に使用するための、請求項１０に記載の組成物。
12. 対象における癌細胞によるPioneer Translation Product (ＰＴＰ)由来の抗原の提示、典型的には、産生および提示を誘発もしくは増加させるまたは免疫ペプチドームを変化させるために使用するための、請求項１に記載の化合物。
13. 対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項３～９のいずれか一項に記載の使用のための化合物または請求項９または１０に記載の組成物。
14. 請求項１または２に記載の化合物および少なくとも１つの異なる抗癌剤を異なる容器に含むキット。
15. 請求項１０、１１または１３のいずれか一項に記載の組成物を製造するための、請求項１４に記載のキットの使用。

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