KR20190021369A - 항-프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 유형 9(항-pcsk9) 화합물 및 심혈관 질환의 치료 및/또는 예방에 이를 사용하는 방법 - Google Patents

항-프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 유형 9(항-pcsk9) 화합물 및 심혈관 질환의 치료 및/또는 예방에 이를 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는, 프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 유형 9(PCSK9)의 생리 작용을 조절하는 화합물, 및 또한 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 이러한 화합물의 사용을 위한 및/또는 고콜레스테롤혈증의 치료를 비롯한 심혈관 질환(CVD)의 치료 및/또는 예방을 위한 치료 방법이 개시되어 있다.

Description

항-프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 유형 9(항-PCSK9) 화합물 및 심혈관 질환의 치료 및/또는 예방에 이를 사용하는 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 6월 21일자 출원된 미국 특허 가출원 제62/352,701의 이익을 향유한다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 선언
본 발명은 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구원(NHLBI)으로부터 SBIR 수여 번호 HL096167 하에 지원받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 가진다.
기술분야
본 발명은 프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 유형 9(PCSK9)의 생리 작용을 조절하는 화합물, 및 이의 저밀도 지방단백질 수용체(LDLR)와의 상호작용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 PCSK9 기능의 소분자 조절제를 포함하는 조성물 및 이러한 조절제를 약제로서 사용하는 방법에 관한 것이다. PCSK9 기능의 소분자 조절제는 혈액 중 LDL-콜레스테롤 수준을 낮추도록 치료적으로 사용될 수 있으며, 가족성 고콜레스테롤혈증, 죽상경화성 이상지질혈증, 죽상동맥경화증 및, 보다 일반적으로, 심혈관 질환(CVD)을 포함하는 콜레스테롤 및 지방단백질 대사 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
심혈관 질환은 주요한 사망 원인이며, 죽상동맥경화증은 심혈관 질환의 주된 원인이다. 죽상동맥경화증은 동맥의 질환이며 산업화된 국가에서의 많은 사망과 관련된 관상성 심장 질환의 원인이다. 이제 관상성 심장 질환의 몇가지 위험 인자가 밝혀졌다: 이상지질혈증, 고혈압, 당뇨, 흡연, 빈약식, 무활동 및 스트레스. 이상지질혈증은 혈장 콜레스테롤 및/또는 트리글리세리드(TG)의 증가(고콜레스테롤혈증) 또는 죽상동맥경화증의 발달에 기여하는 낮은 고밀도 지방단백질(HDL) 수준이다. 이는 심혈관 질환에 기여하는 것으로 밝혀진 대사 장애이다. 혈액에서, 콜레스테롤은 지방단백질 입자로 운반되며, 여기서 저밀도 지방단백질(LDL) 콜레스테롤(LDL-C)은 "나쁜" 콜레스테롤로 간주되고, 한편 HDL-콜레스테롤(HDL-C)은 "좋은" 콜레스테롤로 공지되어 있다. 지질 및 지방단백질 이상은 일반 대중에서 극히 흔하며 죽상동맥경화증에 대한 콜레스테롤의 영향으로 인해 심혈관 질환에 대해 고도로 수식 가능한(modifiable) 위험 인자로 여겨진다. 60-70%의 심혈관 질환, 심근경색 및 뇌졸중이 스타틴(죽상동맥경화증 치료의 현재 표준)으로의 치료에도 불구하고 발생하는 CVD에 대하여 오래 지속된 중요한 충족되지 않은 필요가 있다. 더 나아가, 새로운 가이드라인은 고위험 환자를 조기 CVD로부터 보호하도록 더 낮은 LDL 수준이 달성되어야 한다고 제시한다(1).
PCSK9와 콜레스테롤 대사 사이의 연결의 확립은 PCSK9 유전자 내 선택적 돌연변이가 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증을 일으킨다는 발견으로 빠르게 이어졌고(2), 이는 PCSK9의 정상 활성을 증가시킴으로써 돌연변이가 기능 획득을 부여함을 시사한다(3). 이것은 야생형 및 돌연변이 PCSK9(S127R 및 F216L)가 마우스의 간에서 높은 수준으로 발현된 실험에서 뒷받침되며; 간 LDLR 단백질 수준은 야생형 또는 돌연변이 PCSK9를 수여받은 마우스에서 극적으로 하락했다(4, 5). LDLR mRNA 수준에서 관련된 감소는 관찰되지 않았으며, 이는 돌연변이이든 야생형이든 PCSK9의 과발현이 전사후 메커니즘을 통해 LDLR을 감소시킴을 나타낸다.
PCSK9에서의 기능 획득 돌연변이가 고콜레스테롤혈증을 일으킴을 고려할 때, 기능 상실 돌연변이가 반대의 효과를 가지며 저콜레스테롤혈증을 일으킬 것인지 의문을 가질만 하다. 아프리카계 미국인에게서 PCSK9에서의 3가지 기능 상실 돌연변이(Y142X, L253F, 및 C679X)가 확인되었다(6). 이러한 돌연변이는 LDL-C 수준을 28%까지 감소시키며 (심근경색, 관상동맥사 또는 관상동맥 재개통으로 정의된) CHD의 빈도를 88%까지 감소시키는 것으로 나타났다. 라시드(Rashid) 등(7)은 PCSK9가 불활성화된 마우스에서의 기능 상실 돌연변이의 메커니즘을 연구했다. 이들은 이러한 녹아웃 마우스가 증가된 간 LDLR 단백질(mRNA는 제외), 순환 지방단백질의 증가된 제거(clearance) 및 감소된 혈장 콜레스테롤 수준을 나타냄을 보고했다. PCSK9에서 자연 발생 돌연변이의 구조-기능 관계 분석은 또한 PCSK9의 작용 메커니즘에 대한 통찰을 제공했다. 흥미롭게도, LDL-C 혈장 수준에서의 가장 큰 감소와 관련되는 것으로 밝혀진 PCSK9에서의 돌연변이는 이의 합성(Y142X), 자가촉매 프로세싱(L253F), 또는 폴딩(C679X)의 방해에 의해 성숙 PCSK9의 분비를 방지하는 돌연변이이다(8). Y142X 돌연변이는, 이것이 전사체에서 초기에 발생하고 미성숙 종결코돈 의존성 mRNA 분해를 개시할 것으로 예상되기 때문에, 검출 가능한 단백질을 생성하지 않는다. 촉매 도메인(L253F)에서의 돌연변이는 단백질의 자가촉매 절단을 방해한다. PCSK9-253F를 발현하는 세포에서, PCSK9-WT를 발현하는 세포에서와 비교하여 성숙 단백질의 양이 감소되며, 이는 돌연변이가 자가촉매 절단을 억제한다는 점을 암시한다. L253F 돌연변이는 촉매 3작용기조(catalytic triad) 근처에 있으며(PCSK9는 세린 프로테아제임), 따라서 활성 부위를 방해할 수 있다(8). PCSK9의 자가촉매 절단이 단백질의 ER 밖으로의 방출에 요구된다는 점을 고려하면, L253F 돌연변이는 ER로부터 세포 표면으로의 PCSK9의 운반을 지연시킨다. 단백질을 14개 아미노산으로 자르는 PCSK9 중의 넌센스 돌연변이(C679X)는, 단백질 프로세싱을 방해하지 않지만, 성숙 단백질이 세포에 축적되고 분비되는 것이 없어, 단백질이 정상적으로 절단되지만 잘못 폴딩되고 ER에 보유됨을 암시한다(8, 9).
PCSK9가 LDLR의 분해를 야기하는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았다. 그러나, PCSK9의 프로테아제 작용이 LDLR 분해에 필요하지 않다는 점은 명백하다(10, 11). 리(Li) 등(10)은 프로도메인 및 촉매 도메인을 트랜스로 공발현하며, 분비된 PCSK9는 촉매적으로 불활성이지만 이는 세포 LDL 흡수 및 LDLR 수준을 저하하는 데 있어서 야생형 단백질과 기능적으로 동등하다는 것을 나타낸다. 유사한 연구가 또한 맥넛(McNutt) 등에 의해 보고되었다(11). 더 나아가, 장(Zhang) 등(12)은 PCSK9 결합을 LDLR의 EGF-A 반복에 맵핑하고, 이러한 결합이 수용체 재순환을 감소시키고 이의 분해를 증가시킴을 나타냈다. 이들은 또한 EGF-A 도메인으로의 결합이 칼슘 의존적이며 pH가 7로부터 5.2로 감소함에 따라 극적으로 증가한다는 것을 보고하였다. 권(Kwon) 등(13)은 LDLR-EGF-AB(EGF-A 및 EGF-B)와의 복합체인 PCSK9의 결정 구조를 결정하였다. 상기 구조는 명확한 EGF-A 도메인을 나타내지만, EGF-B 도메인은 흐트러져 있고 이의 전자 밀도 지도에서 빠져 있다. EGF-A 도메인은 촉매 부위로부터 떨어진 부위에서 PCSK9 촉매 도메인에 결합하고, C 말단 도메인 또는 프로도메인과 접촉하지 않는다(14).
몇가지 전략이 PCSK9를 표적화하는 데 제안되었다(15). 전략 1: mRNA 녹다운 접근법은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi의 사용을 포함한다. 마우스에 투여된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PCSK9 발현을 >90%까지 감소시키고 혈장 콜레스테롤 수준을 53%까지 감소시킨다(16). 사이노몰구스 원숭이에 리피도이드 나노입자로 전달된 RNAi의 단일 정맥내 주사는 혈장 PCSK9 수준을 70%까지 감소시키고 혈장 LDL-C 수준을 56%까지 감소시킨다(17). 전략 2: 소분자, 펩티드, 또는 PCSK9에 대한 항체와 함께 세포 표면 상의 LDLR로의 PCSK9의 결합을 방지하는 것이다. EGF-A 단편을 배양된 세포에 첨가하는 것은 외인성 첨가된 PCSK9의 능력을 억제하여 LDLR 분해를 매개한다. 전략 3: PCSK9 프로세싱의 소분자 억제제를 개발하는 것이다. PCSK9의 촉매 활성이 LDLR 분해에 필요하지 않다는 증거에도 불구하고(11), PCSK9의 자가촉매 프로세싱이 ER로부터 단백질을 분비하는 데 필요하기 때문에 PCSK9 촉매 활성의 세포내 억제제는 효과적이어야 한다. 이의 합성에 이어서, PCSK9는 프로도메인을 잘라내는 자가촉매 절단 반응을 겪으나, 프로도메인은 촉매 도메인에 붙은 채로 남는다(18, 19). 자가촉매 프로세싱 단계는 PCSK9의 분비에 요구되며(20), 이는 프로도메인이 샤페론으로서 기능하며 폴딩을 가능하게 하기 때문이다. 프로도메인의 지속된 부착은 PCSK9의 기질 결합 포켓을 부분적으로 차단한다(18, 19). 맥넛(McNutt) 등(21)은 분비된 PCSK9의 길항작용이 HepG2 세포에서LDLR 발현을 증가시킴을 입증하였다. 이들은, 기능 획득 돌연변이를 일으키는 FH 연관 LDLR 대립유전자(H306Y)가 PCSK9의 LDLR에 대한 친화력의 증가로 인한 것이며, 이는 증진된 LDLR 파괴 및 감소된 혈장 LDL-C 제거를 유도함을 나타내었다. 더 나아가, 이들은 LDLR(H306Y) 서브단편과 함께 분비된 PCSK9를 차단하는 것이 배양된 HepG2 세포에서의 LDLR 수준의 증가를 야기한다는 점을 고상하게 보여줄 수 있었다. 따라서, LDLR 분해를 일으키기 위한 분비된 인자, 및 자가촉매 프로세스를 방해하는 소분자 억제제로서의 PCSK9 작용은, 성숙 분비된 PCSK9의 양을 감소시키여 한다. 본 발명은 전략 2를 이용하여 PCSK9의 기능을 하향 조절하는 소분자를 동정하는 것에 관한 것이다.
현재는(22-24), FDA 승인된 주사 가능한 PCSK9 단일클론 항체 길항제가 시장에 존재한다. 이는 리제네론/사노피(Regeneron/Sanofi)의 프랄런트(PRALUENT, 알리로쿠맙) 및 암젠(Amgen)의 레파타(REPATHA, 에볼로쿠맙)이며, 둘 다 완전 인간 항-PCSK9 단일클론 항체이다. 할로자임과 합작 개발된 화이자(Pfizer)의 보코시주맙은 3상에서 가장 앞서있다. 일라이 릴리(Eli Lily)의 인간화 mAb는 2상 임상시험을 시작했다. 이러한 단일클론 항체 접근법은 소분자 대신 주사 가능한 항체를 이용하여 전략 2를 따른다. 전략 2는 또한 여러 다른 회사에 의해 추진되고 있다(25).
본 발명은, PCSK9 기능과 선택적으로 상호작용하고 이를 하향 조절하는 소분자의 치료적 적용에 관한 것이다. 제1 실시양태에서, 본 발명의 실시에 사용되는 제제는 하기 화학식 I을 가진다:
Figure pct00001
여기서 A는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되고: `
Figure pct00002
상기 식에서 Ra는 독립적으로 H 및 저급 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R1은 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 히드록실, 및 임의로 치환된 아미노, 알콕시, 알콕시카보닐, 알콕시알킬, 알킬티오, 알킬티오알킬, 아실, 카복시, 아미도, 아미노카보닐, 모노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 모노알킬아미노설피닐, 디알킬아미노설피닐, 모노알킬아미노설포닐, 디알킬아미노설포닐, 알킬설포닐아미노, 히드록시설포닐, 알콕시설포닐, 알킬설포닐알킬, 모노알킬아미노설포닐알킬, 디알킬아미노설포닐알킬, 및, 임의로 치환된, 저급 알킬, 시클로알킬알킬, 아르알킬, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클, 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 인접한 R1과 함께 임의로 치환된 5-7원 카보사이클, 아릴, 헤테로사이클, 또는 헤테로아릴을 형성한다. R2는 H 및 임의로 치환된 저급 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며; 단, A는 2-치환된 인돌이 아니다.
B는 임의로 치환된 시클로알킬, 아릴, 헤테로사이클, 및 헤테로아릴 및 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 및 모든 입체이성질체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을, 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이러한 환자에게 치료적 유효량의 상기 화학식의 화합물 I을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
한 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기 화학식 II의 적어도 하나의 화합물의 투여를 수반한다:
Figure pct00003
상기 식에서, R1은 독립적으로 H, 및 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬, (C1-C3)-알콕시알킬, 아릴옥시알킬, (C1-C3)-알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 아릴, 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3은 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, (C1-C3)-알콕시, (C1-C3)-알콕시카보닐, (C1-C3)-알콕시알킬, 아릴옥시알킬, (C1-C3)-알킬티오, (C1-C3)-알킬티오알킬, 아릴티오알킬, (C1-C3)-아실, 카복시, 아미도, 아미노카보닐, 모노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 모노알킬아미노설포닐, 디알킬아미노설포닐, 알킬설포닐아미노, 히드록시설포닐옥시, 알콕시설포닐옥시, 알킬설포닐옥시, 히드록시설포닐, 알콕시설포닐, 알킬설포닐알킬, 모노알킬아미노설포닐알킬, 디알킬아미노설포닐알킬, 및, 임의로 치환된, 저급 알킬, 시클로알킬알킬, 아르알킬, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클, 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 인접한 R3과 함께 임의로 치환된 5-7원 카보사이클, 아릴, 헤테로사이클, 또는 헤테로아릴을 형성하고; R4는 독립적으로 H, 할로겐, (C1-C3) 알킬 및 (C1-C3) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고; R5는 독립적으로 H 및 CONR6R7로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R6 및 R7은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬알킬, 아르알킬, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클, 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 함께 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 임의로 치환된 5-7원 헤테로사이클을 형성하거나; 또는 인접한 R4와 함께 임의로 치환된 5-7원 헤테로사이클을 형성한다.
보다 바람직한 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기 화학식 III의 적어도 하나의 화합물의 투여를 수반한다:
Figure pct00004
상기 식에서, R1은 독립적으로 H 또는 CH3로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3은 독립적으로 H, 또는 (C1-C3)-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되며; R6 및 R7은 독립적으로 H, CH3, 및 임의로 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 아릴은 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되며
Figure pct00005
여기서 R8은 CO2H, CONHR9, 2-옥사졸, 2-옥사졸린, 2-벤즈옥사졸로 이루어진 군으로부터 선택되고; R9는 H 또는 CH3이다.
또 하나의 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기 화학식 IV의 적어도 하나의 화합물의 투여를 수반한다:
Figure pct00006
상기 식에서 R1은 H 또는 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬이고; R3은 독립적으로 H, 할로겐, 또는 임의로 치환된 (C1-C3)-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되며; R4는 H이고; R9는 (C1-C3)-알킬이다.
추가의 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 V의 화합물로서, 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 및 입체이성질체를 포함하는 화합물을 제공하며:
Figure pct00007
상기 식에서, Xa 및 Xb는 독립적으로 H 또는 CH3의 군으로부터 선택되며;
Ya, Yb 및 Yc는 동일하거나 상이할 수 있고 H, 할로겐 또는 (C1-C3)-알콕시의 군으로부터 선택되며;
Za, Zb 및 Zc는 동일하거나 상이하고 H, 할로겐, (C1-C3)-알콕시, (C1-C4)-알킬, COOH, CONR10R11, 2-옥사졸, 2-옥사졸린 및 2-벤즈옥사졸의 군으로부터 선택되고; R10 및 R11은 독립적으로 H, 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬 및 임의로 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; n=1 또는 2이며, n=1인 경우, CONR10R11은 상기 CONR10R11이 부착된 벤젠 고리에 융합된 N-치환된 숙신이미드 고리를 형성할 수 있으며, 여기서 숙신이미드 치환기는 임의로 치환된 (C1-C3) 알킬 또는 아릴이며, 단, 상기 화학식은 하기를 포함하지 않는다:
Figure pct00008
.
도면 및 표의 간단한 설명
도 1a 및 도 1b는 화학식 I의 선택된 화합물, 즉 2-카복스아닐리드 피롤 및 2-카복스아닐리드 인돌의 구조를 기술하며, 이는 대조군에 비해 LDLR 상향조절에 영향을 갖는 한편 PCSK9 프로세싱 및 분비에는 영향을 주지 않으며, 100 μM > 20%에서 PCSK9/LDLR 상호작용의 시험관 내 억제를 보여준다.
도 2a 내지 도 2b는 화학식 II-IV의 바람직한 화합물, 즉 2-카복스아닐리드 벤조퓨란의 구조를 기술하고, 이는 대조군에 비해 LDLR 상향조절에 영향을 갖는 한편 PCSK9 프로세싱 및 분비에는 영향을 주지 않으며, >10 μM 이지만 ≤50 μM인 PCSK9/LDLR 상호작용(IC50, μM) 의 시험관 내 억제를 보여준다.
도 3a 내지 도 3b은 화학식 II-IV의 가장 바람직한 화합물의 구조를 기술하고, 이는 대조군에 비해 LDLR 상향조절에 영향을 갖는 한편 PCSK9 프로세싱 및 분비에는 영향을 주지 않으며, <10 μM인 PCSK9/LDLR 상호작용(IC50, μM)의 시험관 내 억제를 보여준다.
도 4는 PCSK9/ LDLR 상호작용에 대한 상이한 화합물들의 효과를 보여준다: 시험관 내 ELISA 분석 키트를 이용하였다(서큘렉스(Circulex)). PCSK9/LDLR 상호작용의 스크리닝 억제제에 있어서, 상이한 농도(0.01nM-100 μM)의 선택된 화합물을 His-태그된 PCSK9와 함께 인큐베이션한 후 재조합 LDLR-AB 도메인으로 프리코팅된 웰에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고 재조합 His-태그된 PCSK9의 양을 바이오티닐화된 항-His-태그 및 호스래디시 과산화효소 접합된 스트렙타비딘을 이용하여 측정하고, BioTek Synergy 2 플레이트 판독기를 이용하여 정량하였다. 재조합 LDLR-AB 도메인으로의 PCSK9 결합에 대한 각 화합물의 효과를 계산하였다.
도 5는 HEK293 형질감염된 세포에서 PCSK9 합성, 프로세싱 및 분비에 대한 상이한 화합물들의 효과를 보여준다. HEK-293T 세포를 10% 소 태아 혈청 배지를 함유하는 DMEM 중의 96 웰 플레이트 내에 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 리포펙타민-LTX을 이용하여 cDNA 작제물로 일시적으로 형질감염시켰다. 화합물(25 μM) 또는 비히클을 첨가하고, 이어서 추가 43 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 PCSK9, 분비된 PCSK9, 및 세포 생존능을 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이 분석하였다.
도 6은 PCSK9에 의한 LDLR의 증가된 분해를 보여준다. HEK-293T 세포를 10% 소 태아 혈청 배지를 함유하는 DMEM에 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 리포펙타민-LTX을 이용하여 Mock(레인 1 및 2), PCSK9(레인 3 및 4), LDLR & PCSK9(레인 5 및 6), 및 LDLR(레인 7 및 8) cDNA 작제물로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 추가 72 시간 동안 인큐베이션하고, 세포 및 배지를 문서에 기록된 바와 같이 분석하였다.
도 7은 PCSK9 길항제에 의한 LDLR의 상향조절을 보여준다. HEK-293T 세포를 10% 소 태아 혈청 배지를 함유하는 DMEM에 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 상기 기재된 바와 같이 리포펙타민-LTX을 이용하여 LDLR & PCSK9 cDNA 작제물로 일시적으로 형질감염시켰다. 24 시간 후에, 세포를 상이한 화합물로 처리하고 추가 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 LDLR 발현에 대해 상기 기재된 바와 같이 분석하였다.
도 8은 HepG2 세포에서 LDLR 상향조절에 대한 상이한 화합물의 영향을 보여준다. HepG2 세포를 10% 소 태아 혈청 배지를 함유하는 MEM 중의 96 웰 플레이트 내에 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 리포펙타민-LTX을 이용하여 PCSK9 cDNA 작제물로 일시적으로 형질감염시켰다. 화합물을 첨가하고, 이어서 추가 43 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 용해시키고 상기 기재된 바와 같이 측정된 LDLR 발현 및 세포 생존능에 대해 분석하였다.
도 9는 HepG2 세포에서 4종의 억제제를 이용하는 형광 Dil-LDL의 증가된 흡수를 보여준다. SBC 화합물은 HepG2 세포 중 형광 Dil-LDL의 흡수를 증가시키는 이의 능력에 대해 인증되었다. 데이터는 1.2 μM의 화합물를 사용하는 형광 Dil-LDL 흡수에서의 증가를 보여준다.
도 10은 보통식이 급이된 동물에 비해 LPS가 있는 또는 없는 고지방식(HFD)가 급이된 8마리 마우스의 LDL 콜레스테롤 수준에 대한 SBC-115,337의 효과를 보여준다. C57/블랙 6 마우스 및 BalB/C 마우스를 4주 동안 HFD로 유지하였다. 혈장을 1일째에 SBC 화합물 주사 전에 수집하였다. 혈장을 4일째에 LPS 주사 후 4 시간에, 그리고 다시 LPS 주사 후 24 시간에 수집하였다. 혈장 콜레스테롤, LDL-C, HDL-C, 및 트리글리세리드 수준을 효소적으로 측정하였다.
도 11은 PCSK9/ LDLR 상호작용 상의 SBC-115,337 부근 SAR을 나타내며: 시험관 내 ELISA 분석 키트는 도 4에 기재된 바와 같이 사용된다.
도 12는 HepG2 세포에서 다양한 억제제를 이용하는 형광 Dil-LDL의 증가된 흡수를 보여준다. SBC 화합물은 도 9에 기재된 바와 같이 HepG2 세포 중 형광 Dil-LDL의 흡수를 증가시키는 이의 능력에 대해 인증되었다.
도 13은 HEK293/PCSK9 형질감염된 세포에서 PCSK9 합성, 프로세싱 및 분비에 대한 상이한 화합물들의 효과를 보여준다. SBC 화합물은 도 5에 관하여 기재된 바와 같이 PCSK9 합성, 프로세싱 및 분비에 영향을 미치는 이의 능력에 대해 인증되었다.
도 14는 PCSK9 길항제에 의한 LDLR의 상향조절을 보여준다. HEK-293T 세포를 도 7에 관하여 기재된 바와 같이 분석하였다.
도 15a 내지 도 15b는 고지방식 급이된 C57/블랙6 마우스에서의 LDL 콜레스테롤 수준에 대한 SBC-115,418의 효과를 보여준다: C57BL/6 마우스를 각각 5마리 동물의 2개 군으로 나누고; 대조군은 PBS를 수여받고; SBC 군은 10 mg/kg 경구를 5 일 동안 매일 수여하였다. 혈장을 1일째에 화합물의 주사 전에 수집하였다. 혈장을 5일째에 다시 수집하였다. 혈장 LDL-C 수준을 효소적으로 측정하였다. (도 5a) LDL-C에서의 실제 변화를 mg/dL로 나타내고 (도 5b) 5 일 동안 SBC-115,418 투여 후 LDL-C의 % 감소를 나타냄.
표 1은 SBC-115,337 및 11종의 유사체의 요약을 보여준다.
본 발명은 세포외 단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 유형 9(PCSK9)의 기능을 하향 조절하는 소분자, 및 이의 저밀도 지방단백질(LDL) 수용체(LDLR)와의 상호작용, 및 이의 길항제를 약제로서 이용하는 방법에 관한 것이다. PCSK9 기능의 소분자 조절제는 혈액 중 LDL-콜레스테롤 수준을 낮추도록 치료적으로 사용될 수 있으며, 가족성 고콜레스테롤혈증, 죽상경화성 이상지질혈증, 죽상동맥경화증 및, 보다 일반적으로, 심혈관 질환(CVD)을 포함하는 콜레스테롤 및 지방단백질 대사 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 분지된 또는 비분지된 포화된 탄화수소 사슬 모이어티이다. "저급 알킬"은 1개 내지 약 8개의 탄소를 갖는 분지된 또는 비분지된 탄화수소 사슬, 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, 2-메틸펜틸 펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸 펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸 등을 표기한다. "치환된 알킬"은, 히드록시, 할로겐, 머캅토 또는 티오, 시아노, 알킬티오, 카복시, 카브알콕시, 아미노, 니트로, 알콕시, 또는 임의로 치환된, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴 등과 같이 이러한 사슬에 통상적으로 부착되어 알킬기, 예컨대 트리플루오로 메틸, 3-히드록시헥실, 2-카복시프로필, 2-플루오로에틸, 카복시메틸, 시아노부틸, 페네틸, 벤질 등을 형성하는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는 알킬기를 포함한다.
단독 또는 다른 기의 일부로서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 염소, 브롬, 불소 및 요오드를 지칭한다.
용어 "알콕시"는 알킬-O-를 지칭하며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "알킬티오"는 알킬-S-를 지칭하며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "아미노", "모노알킬아미노", "디알킬아미노"는 모이어티 -NR'R"를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은, 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "카복시"는 모이어티 -C(=O)OH를 지칭한다.
용어 "카브알콕시"는 모이어티 -C(=O)O-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "아미노 (모노알킬아미노-, 디알킬아미노-) 카보닐아미노"는 모이어티 -NHC(=O)NR'R"를 지칭하고, 여기서 R'R"은, 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "카바마토(carbamato)"는 모이어티 -NR'C(=O)OR"를 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은, 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "아미노(모노알킬아미노, 디알킬아미노) 카보닐"(또한 "카복스아미도")은 모이어티 ―C(=O)NR'R"을 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 H, 알킬, 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "아미도"는 모이어티 -NRC(=O)-R"을 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은, 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "알킬설포닐"은 모이어티 -S(=O)2-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "알킬설포닐옥시"는 모이어티 -OS(=O)2-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "아미노(모노알킬아미노-, 디알킬아미노-) 설피닐"은 모이어티 -S(=O)NR'R"을 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "아미노(모노알킬아미노-, 디알킬아미노-) 설포닐"은 모이어티 -S(=O)2NR'R"을 지칭하고, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "알킬설포닐아미노"는 모이어티 -NHS(=O)2-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "히드록시설포닐옥시"는 모이어티 -OS(=O)2OH를 지칭한다.
용어 "알콕시설포닐옥시"는 모이어티 -OS(=O)2O-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "알킬설포닐옥시"는 모이어티 -OS(=O)2-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "히드록시설포닐"은 모이어티 -S(=O)2OH를 지칭한다.
용어 "알콕시설포닐"은 모이어티 -S(=O)2O-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "알킬설포닐알킬"은 모이어티 -알킬-S(=O)2-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬(각 경우)은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "아미노(모노알킬아미노-, 디알킬아미노-) 설포닐알킬"은 모이어티 -알킬-S(=O)2-NR'R"를 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같고, R' 및 R"은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내며, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "아미노(모노알킬아미노-, 디알킬아미노-) 설피닐알킬"은 모이어티 -알킬-S(=O)-NR'R"을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같으며, R' 및 R"은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴을 나타내고, 전부 본원에 정의된 바와 같다.
달리 기재되지 않은 한, 단독 또는 다른 기의 일부로서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "시클로알킬"은, 고리를 형성하는 전체 3개 내지 20개의 탄소, 바람직하게는 고리를 형성하는 3개 내지 10개의 탄소를 포함하는, 모노시클릭알킬, 비시클릭알킬 및 트리시클릭알킬를 비롯한 1개 내지 3개의 고리를 포함하는 포화된 또는 부분적으로 불포화된(1개 또는 그 이상의 이중결합 함유) 시클릭 탄화수소기(카보시클릭)를 포함하며, 이는 아릴에 대해 기재된 바와 같이 1개 또는 2개 방향족 고리에 융합될 수 있으며, 이는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로데실 시클로도데실 및 시클로헥세닐을 포함한다.
"치환된 시클로알킬"은, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 히드록시, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 시클로알킬, 알킬아미도, 알카노일아미노, 옥소, 아실, 아릴카보닐아미노, 아미노, 니트로, 시아노, 티올 및/또는 알킬티오 및/또는 "치환된 알킬"의 정의에 포함된 치환기 중 임의의 것과 같은 1개 또는 그 이상의 치환기로 치환될 수 있는 시클로알킬기를 포함한다.
달리 기재되지 않은 한, 단독 또는 다른 기의 일부로서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "알케닐"은 노르말 사슬 중 2개 내지 20개의 탄소, 바람직하게는 2개 내지 12개의 탄소, 보다 바람직하게는 2개 내지 8개의 탄소의 직쇄형 또는 분지된 사슬을 지칭하고, 이는 비닐, 2-프로페닐, 3-부테닐, 2-부테닐, 4-펜테닐, 3-펜테닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 2-헵테닐, 3-헵테닐, 4-헵테닐, 3-옥테닐, 3-노네닐, 4-데세닐, 3-운데세닐, 4-도데세닐, 4,8,12-테트라데카트리에닐 등과 같이 노르말 사슬 중에 하나 이상의 이중결합을 포함한다. "치환된 알케닐"은 하나 이상의 치환기, 예컨대 "치환된 알킬" 및 "치환된 시클로알킬"의 정의에서 상기 포함된 치환기로 치환될 수 있는 알케닐기를 포함한다.
달리 기재되지 않은 한, 단독 또는 다른 기의 일부로서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "알키닐"은 노르말 사슬 중 2개 내지 20개의 탄소, 바람직하게는 2개 내지 12개의 탄소, 보다 바람직하게는 2개 내지 8개의 탄소의 직쇄형 또는 분지된 사슬을 지칭하고, 이는 노르말 사슬, 예컨대 2-프로피닐, 3-부티닐, 2-부티닐, 4-펜티닐, 3-펜티닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 2-헵티닐, 3-헵티닐, 4-헵티닐, 3-옥티닐, 3-노니닐, 4-데시닐, 3-운데시닐, 4-도데시닐 등 중에 하나 이상의 삼중 결합을 포함한다. "치환된 알키닐"은 하나 이상의 치환기, 예컨대 "치환된 알킬" 및 "치환된 시클로알킬"의 정의에서 상기 포함된 치환기로 치환될 수 있는 알키닐기를 포함한다.
달리 기재되지 않은 한, 단독 또는 다른 기의 일부로서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "아릴" 또는 "아르"는 고리 부분에 6개 내지 10개의 탄소를 포함하는 모노시클릭 및 폴리시클릭 방향족 기(예컨대 페닐 또는 1-나프틸 및 2-나프틸을 비롯한 나프틸)를 지칭하고 임의로 시클로알킬 고리와 같은 카보시클릭 고리에 융합되거나 아릴 또는 헤테로시클릭 고리 또는 이의 치환된 형태에 융합된 1개 내지 3개의 추가 고리를 포함할 수 있다.
"치환된 아릴"은 하나 이상의 치환기, 예컨대 할로, 알킬, 할로알킬(예: 트리플루오로메틸), 알콕시, 할로알콕시(예: 디플루오로메톡시), 알케닐, 알키닐, 시클로알킬-알킬, 헤테로시클로-알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 아릴알콕시, 알콕시카보닐, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 아릴알케닐, 아미노카보닐, 모노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 아미노카보닐아릴, 아릴티오, 아릴설피닐, 아릴아조, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 히드록시, 니트로, 시아노, 아미노, 치환된 아미노(여기서 아미노는 1개 또는 2개의 치환기를 포함함(이는 임의로 치환된 알킬, 아릴 또는 정의에 언급된 다른 치환기 중 임의의 것임)), 티올, 알킬티오, 헤테로아릴티오, 아릴티오알킬, 알콕시아릴티오, 알킬아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 아릴설피닐알킬, 아릴설포닐아미노 또는 아릴설폰아미노카보닐 및/또는 상기 지칭된 알킬 치환기 중 임의의 것으로 치환될 수 있는 아릴기를 포함한다.
달리 기재되지 않은 한, 단독 또는 다른 기의 일부로서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤트(Het)"는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 헤테로 원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황 및 아릴, 시클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로시클로알킬 고리에 융합된 이러한 고리를 포함하고 가능한 N-옥사이드를 포함하는 5원 또는 7원 방향족 고리를 지칭한다. 헤테로아릴기의 예는 피롤릴, 퓨라닐, 티에닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴 및 옥사디아졸릴을 포함한다. 융합된 헤테로아릴기의 예는 퀴놀린, 이소퀴놀린, 인돌, 이소인돌, 카바졸, 아크리딘, 벤즈이미다졸, 벤조퓨란, 벤즈옥사졸, 이소벤조퓨란, 벤조티오펜, 페난트롤린, 퓨린 등을 포함한다. "치환된 헤테로아릴"은 "치환된 알킬" "치환된 시클로알킬" 및 "치환된 아릴"의 정의에서 상기 포함된 치환기와 같은 1개 내지 4개의 치환기로 치환될 수 있는 헤테로아릴기를 포함한다.
단독 또는 다른 기의 일부로서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로시클로", "헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭 고리"는 비치환된 또는 치환된 안정한 5원 내지 7원 모노시클릭 고리계를 나타내고, 이는 포화되거나 부분적으로 불포화될 수 있으며, 탄소 원자 및 N, O 또는 S로부터 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자로 이루어지고, 여기서 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4차화될 수 있다. "치환된 헤테로시클로(또는 헤테로사이클 또는 헤테로시클릭 고리)는 "치환된 알킬" "치환된 시클로알킬" 및 "치환된 아릴"의 정의에서 상기 포함된 치환기와 같은 1개 내지 4개의 치환기로 치환될 수 있는 헤테로시클릭기를 포함한다. 헤테로시클릭 고리는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에 부착될 수 잇고 이는 안정한 구조의 생성을 유도한다. 이러한 헤테로시클릭기의 예는 피페리디닐, 피페라지닐, 옥소피페라지닐, 옥소피페리디닐, 옥소피롤리디닐, 옥소아제피닐, 아제피닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모폴리닐, 티아졸리디닐, 테트라히드로피라닐, 티아모폴리닐, 티아모폴리닐 설폭사이드 및 티아모폴리닐 설폰을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "임의로 치환된"은 본원에서 화학 모이어티가 예를 들어, 알킬, 아릴, 헤테로아릴을 지칭하는 것을 의미하도록 사용되며, 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴알킬, 아릴, 할로아릴, 헤테로사이클, 헤테로시클로알킬, 헤테로아릴, 히드록실, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시, 할로겐, 할로알콕시, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 알킬아릴옥시, 아릴알콕시, 알콕시아릴, 카복시, 카브알콕시, 카복스아미도, 아미노카보닐, 모노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 모노알킬아미노설피닐, 디알킬아미노설피닐, 모노알킬아미노설포닐, 디알킬아미노설포닐, 알킬설포닐아미노, 히드록시설포닐옥시, 알콕시설포닐옥시, 알킬설포닐옥시, 히드록시설포닐, 알콕시설포닐, 알킬설포닐알킬, 모노알킬아미노설포닐알킬, 디알킬아미노설포닐알킬, 모노알킬아미노설피닐알킬, 디알킬아미노설피닐알킬 등을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 기로 치환되거나 비치환될 수 있다. 임의로 치환될 수 있는 상기의 화학식 I-V의 화학 모이어티는 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴알킬, 아릴, 헤테로사이클, 및 헤테로아릴을 포함한다. 예를 들어, 임의로 치환된 알킬은 프로필 및 2-클로로-프로필을 둘 다 포함할 수 있다. 추가로, "임의로 치환된"은 또한 지명된 치환기 또는 치환기가 그냥 단일 치환기보다 복수의 치환기를 갖는 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 임의로 치환된 아릴은 페닐 및 3-브로모-4-클로로-6-에틸-페닐을 둘 다 포함할 수 있다.
달리 명시적으로 기재되지 않은 한, 본원에서 알킬 및 아릴기에 대한 모든 참조는 또한 이의 치환된 형태를 포함한다.
상기의 화학식 I 중 R1에 의해 나타내어지는 A 모이어티의 치환기 중에서, H 또는 위치 3에서 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬이 바람직하고, 여기서 위치 4 및 위치 5가 함께 연결되어 임의로 치환된 6원 방향족 고리를 형성하며; 특히 바람직한 치환기는 H 또는 위치 3에서의 CH3이며, 위치 4 및 위치 5에서 융합된 벤젠 고리는 할로겐 및 (C1-C3)-알콕시로 임의로 치환된다.
상기 화학식 II, III 및 IV 중R3에 의해 나타내어지는 치환기 중에서, H, 할로겐, 또는 (C1-C3)-알콕시가 바람직하며, H 및 (C1-C3) 알콕시가 특히 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 인간 및 동물을 둘 다 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PCSK9"는 PCSK9 돌연변이 및 변이체를 비롯한 단백질 PCSK9의 임의의 형태를 지칭하며, 이는 PCSK9 활성 또는 기능의 적어도 일부를 유지한다. 달리 기재되지 않은 한, 예컨대 인간 PCSK9에 대한 구체적인 참조에 의해, PCSK9는 인간, 돼지, 소, 말, 개 및 고양이와 같은 모든 포유류 종의 고유 서열 PCSK9을 지칭한다. 한 예시적인 인간 PCSK9 서열은 유니프롯 수납 번호(Uniprot Accession Number) Q8NBP7(서열번호 16)로서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, "PCSK9 기능의 조절제"는 PCSK9 생물학적 활성 또는 기능, 및/또는 LDLR의 PCSK9-매개된 하향 조절을 포함하는 PCSK9 신호전달에 의해 매개된 다운스트림 경로(들), 및 LDL 혈액 제거 감소의 PCSK9-매개된 억제를 억제할 수 있는 소분자를 지칭한다. PCSK9 기능의 조절제는 (상당한 것을 포함하는 임의의 정도로) PCSK9 신호전달에 의해 매개된 다운스트림 경로를 포함하는 PCSK9 생물학적 활성, 예컨대 LDLR 상호작용 및/또는 PCSK9로의 세포 반응의 유도를 차단, 길항, 억압 또는 감소시키는 화합물을 포함한다. 본 발명의 목적에 있어서, 용어 "PCSK9 기능의 조절제"가, PCSK9 자체, PCSK9 생물학적 활성(LDLR과의 상호작용, LDLR의 하향 조절, 및 혈액 LDL 제거 감소의 억제의 임의 양태를 매개하는 이의 능력을 포함하나 이에 제한되지 않음), 또는 생물학적 활성의 결과가 임의 측정 가능한 정도로 실질적으로 무효화, 감소 또는 중화되는 모든 이전에 확인된 용어, 표제, 및 기능 상태 및 특성을 포괄함이 명확히 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, PCSK9 기능의 조절제는 PCSK9에 결합하고 이의 LDLR과의 상호작용 또는 이의 분비를 방지한다. 다른 실시양태에서, PCSK9 기능의 조절제는 PCSK9의 활성 부위에 결합하여 이의 효소원(zymogen)을 안정화하고 오토프로세싱을 방지한다. 추가의 실시양태에서, PCSK9 기능의 조절제는 LDLR의 PCSK9 매개된 하향 조절을 감소 또는 차단하고; LDL 혈액 제거에서의 PCSK9-매개된 감소를 억제하며; 배양된 간세포에 의해 배지에서의 LDL 제거를 증가시키고; 생체 내 간에 의한 혈액 LDL 제거를 증가시키며; 스타틴을 비롯한 다른 LDL 저하 약물에 대한 환자의 감수성을 개선하며; 스타틴을 비롯한 다른 LDL 저하 약물에 대해 상승적(synergistic)이며; 다른 아직 확인될 인자와의 PCSK9 상호작용을 차단한다. PCSK9 기능의 조절제의 예시가 본원에 제공된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 화합물은 염으로서 투여될 수 있으며, 이는 또한 본 발명의 범위 내이다. 약학적으로 허용 가능한(즉, 비독성, 생리적으로 상용 가능한) 염이 바람직하다. 본 발명의 방법의 화합물이 예를 들어 적어도 하나의 염기 중심을 갖는 경우, 이는 산 부가 염을 형성할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 강한 무기 산, 예컨대 광산, 예를 들어 황산, 인산 또는 할로겐화수소산으로, 강한 유기 카복실산, 예컨대, 비치환되거나 예를 들어 할로겐으로 치환된 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알칸카복실산, 예를 들어 아세트산, 예컨대 포화된 또는 불포화된 디카복실산, 예를 들어 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 프탈산 또는 테레프탈산, 예컨대 히드록시카복실산, 예를 들어 아스코르브산, 글리콜산, 젖산, 말산, 타타르산 또는 시트르산, 예컨대 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산 또는 리신 또는 아르지닌, 또는 벤조산으로, 또는 유기 설폰산, 예컨대, 비치환되거나 예를 들어 할로겐으로 치환된 (C1-C4) 알킬 또는 아릴설폰산, 예를 들어 할로겐, 예를 들어 메틸- 또는 파라-톨루엔-설폰산으로 형성된다. 필요한 경우, 상응하는 산 부가 염은 또한 복수의 염기 중심을 갖고 형성될 수 있다. 적어도 하나의 산기(예를 들어 COOH)를 갖는 본 발명의 방법에서 사용된 화합물은 또한 적합한 염기로 염을 형성할 수 있다. 이러한 염의 대표적인 예는 금속 염, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 마그네슘 염, 또는 암모니아 또는 유기 아민, 예컨대 모폴린, 티오모폴린, 피페리딘, 프롤리딘, 모노, 디 또는 트리-저급 알킬아민, 예를 들어 에틸, tert-부틸, 디에틸, 디이소프로필, 트리에틸, 트리부틸 또는 디메틸-프로필아민, 또는 모노, 디 또는 트리히드록시 저급 알킬아민, 예를 들어 모노, 디 또는 트리에탄올아민과의 염을 포함한다. 상응하는 분자내 염이 또한 형성될 수 있다.
염기성기를 포함하는 본원에 기재된 화합물의 바람직한 염은 일염산염, 황산수소염, 메탄설폰산염, 인산염 또는 질산염을 포함한다.
산기를 포함하는 본원에 기재된 화합물의 바람직한 염은 나트륨, 칼륨 및 마그네슘 염 및 약학적으로 허용 가능한 유기 아민을 포함한다.
혼합물인 또는 순수 형태인 또는 실질적으로 순수 형태인, 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 화합물의 모든 입체이성질체는, 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다. 본 발명의 화합물은 R 치환기 중 임의의 하나를 포함하는 탄소 원자 중 임의의 원자에 비대칭 중심을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용된 화합물은 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 형태 또는 이들의 혼합물로 존재할 수 있다. 이러한 화합물의 제조 공정은 출발 물질로서 라세미 화합물, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 이용할 수 있다. 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체 생성물을 제조하는 경우, 종래 방법, 예를 들어, 크로마토그래피, 키랄 HPLC 또는 분별 결정에 의해 분리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약물특이분자단(pharmacophore)"은, 경우에 따라, 특이적 생물학적 표적 구조와의 최적 초분자 상호작용을 보장하고 생물학적 표적의 생물학적 활성을 촉발(trigger), 활성화, 차단, 억제 또는 조절하기 위해 필요한 입체적 및 전자적 특징의 총체를 지칭한다. 문헌 [IUPAC, Pure 및 Applied Chemistry (1998) 70: 1129-1143]를 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약물특이분자단 모델"은 정의된 좌표계 중의 포인트의 표현을 지칭하며, 여기서 포인트는 리간드의 결합 입체구조(bound conformation)의 원자 또는 화학 모이어티 및/또는 상호작용하는 폴리펩티드, 단백질, 또는 정렬된 물 분자의 위치 또는 다른 특성에 상응한다. 정렬된 물 분자는 폴리펩티드 또는 단백질의 구조 결정으로부터 유도되는 모델 중에서 관찰 가능한 물이다. 약물특이분자단 모델은 예를 들어 리간드의 결합 입체구조 또는 이의 일부의 원자를 포함할 수 있다. 약물특이분자단 모델은 리간드의 결합 입체구조 또는 이의 일부, 및 리간드와 상호작용하는 하나 이상의 원자를 포함할 수 있고, 결합된 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래한다. 따라서, 리간드의 결합 입체구조의 기하 특성 외에도, 약물특이분자단 모델은 예를 들어 원자 또는 화학 모이어티의 전하 또는 소수성을 포함하는 다른 특성을 나타낼 수 있다. 약물특이분자단 모델은 리간드의 결합 입체구조 내의 내부 상호작용 또는 예를 들어, 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 이온 결합, 및 소수성 상호작용을 포함하는 리간드와 폴리펩티드, 단백질, 또는 다른 수용체와의 결합 입체구조 사이의 상호작용을 포함한다. 약물특이분자단 모델은 리간드의 2 이상의 결합 입체구조로부터 유도될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리간드"는 수용체의 도메인에 결합한 리간드와 상호작용하고 이의 활성을 조절하는 임의의 화합물, 조성물 또는 분자를 지칭한다. "리간드"는 또한 수용체에 직접 결합하지 않으면서 이를 조절하는 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 수행에서, 상기 기재된 화합물은 그 상태로, 또는 프로드러그와 같은 활성제를 유도할 수 있는 형태로 투여될 수 있다. 프로드러그는 본원에 기재된 화합물의 본원에 기재된 화합물의 유도체이며, 이의 약리학적 작용은 활성 화합물로의 생체 내 화학 또는 대사 공정에 의한 전환으로부터 유도된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "프로드러그 에스테르"는, 아세테이트, 피발레이트, 메틸카보네이트, 벤조에이트 등을 생성하기 위한 당업자에게 공지된 절차를 사용하는, 본 발명의 방법에서 사용되는 화합물의 하나 이상의 히드록실과 알킬, 알콕시, 또는 아릴 치환된 아실화 제제와의 반응에 의해 형성되는 에스테르 및 탄산염을 포함한다. 생물학적 활성 제제(즉, 화학식 I의 화합물)를 제공하도록 생체 내에서 전환될 수 있는 임의의 화합물은 본 발명의 범위 및 사상 내의 프로드러그이다. 프로드러그의 다양한 형태가 당업계에 주지되어 있다. 프로드러그 및 프로드러그 유도체의 종합적인 설명은 하기 문헌에 기재되어 있다: (a) The Practice of Medicinal Chemistry, Camille G. Wermuth et al., Ch 31 (Academic Press, 1996); (b) Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985); (c) A Textbook of Drug Design and Development, P. Krogsgaard-Larson and H. Bundgaard, eds., Ch. 5, pgs, 113-191 (Harwood Academic Publishers, 1991).
본 발명의 방법을 실시하는 데 사용되는 치료제는 이의 수용자에게서 원하는 치료 효과를 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 따라서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료적 유효량"은 화학식 I-V 또는 이의 프로드러그의 화합물 중 하나 이상의 투여에 의해 치료 가능한 질병을 치료 또는 예방하기에 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 바람직하게는, 치료적 유효량은 PCSK9 연관 질병을 치료하기에, 즉 거의 검출 가능한 치료적 또는 예방적 또는 개선적 효과를 가져오는 데 적합한 양을 지칭한다. 이러한 효과는 예를 들어 본 발명에 기재된 질병의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 화합물(들)은 하루에 체중 1 kg 당 약 0.01 mg 내지 약 200 mg 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 하루 1회 이상의 적용에서 하루에 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 1 mg 내지 30 mg 용량이 원하는 결과를 생성하기에 효과적이어야 한다. 예시로서, 경구 투여에 적합한 용량은 하루에 체중 1 kg 당 약 1-30 mg 범위 내일 수 있고, 한편 정맥내 투여에 대한 통상 용량은 하루에 체중 1 kg 당 1-10 mg일 수 있다. 물론, 당업자가 이해할 것과 같이, 실제 투여되는 투여량은 치료될 질병, 연령, 건강 및 수용자의 무게, 존재하는 경우, 병용 치료의 유형, 및 치료 빈도에 의존할 것이다. 더 나아가, 유효 투여량은 생물학적 검정에서 화합물(들)의 생활성(bioactivity)을 측정하기 위한 규칙적인 실증적 활성 시험의 기준 상에서 당업자에 의해 측정될 수 있고, 이로써 투여될 적절한 투여량을 확립한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 화합물은 통상적으로 상기 언급된 일일 투여량의 전달을 위해 하루 1-4회 투여될 것이다. 그러나, 본원에 기재된 화합물의 투여를 위한 정확한 요법은 치료될 개별 대상의 필요, 적용될 치료의 유형, 및 주치 전문의의 판단에 필연적으로 따를 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을 개인에게서 치료 또는 예방하는 방법으로서, 순환 PCSK9를 길항하는 PCSK9 기능의 유효량의 조절제를 개인에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을 개인에게서 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 순환 PCSK9를 길항하는 PCSK9 기능의 유효량의 조절제를 제공한다. 본 발명은 추가로, 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을 개인에게서 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 세포외 또는 순환 PCSK9를 길항하는 유효량의 PCSK9 기능의 조절제의 용도를 제공한다.
본 발명의 방법은, PCSK9에 대한 세포 반응의 유도와 같은 PCSK9 신호전달에 의해 매개된 다운스트림 경로를 포함하는, PCSK9 생물학적 활성을 차단, 억압 또는 감소(현저한 감소 포함)시키는 임의의 분자를 지칭하는, PCSK9 기능의 조절제를 이용한다.
PCSK9 기능의 조절제는 하기 특성 중 임의의 하나 이상을 나타내어야한다: (a)PCSK9으로의 결합; (b) LDLR과의 PCSK9 상호작용의 감소 또는 차단; (c) PCSK9의 분비의 감소 또는 차단; (d) LDLR의 PCSK9 매개된 하향 조절의 감소 또는 차단; (e) LDL 혈액 제거에서 PCSK9-매개된 감소의 억제, (f) 배양된 간세포에 의한 배지에서의 LDL 제거의 증가, (g) 생체 내 간에 의한 혈액 LDL 제거의 증가, (h) 스타틴을 비롯한 다른 LDL 저하 약물에 대한 환자의 감수성 개선, (i) 스타틴을 비롯한 다른 LDL 저하 약물에 대해 상승적; 및 (j) 다른 아직 확인될 인자와의 PCSK9 상호작용 차단.
일반적으로, 본 발명의 방법에서 사용되는 화합물(들)은 당업계의 공지된 임의의 허용 가능한 경로를, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제와 함께 사용함으로써 PCSK9 기능의 조절을 달성하도록 투여될 수 있다. 따라서, 활성제(들)는 경구, 구강내, 비경구, 예컨대 정맥내 또는 동맥내 주입, 근육내, 복강내, 척추강내 또는 피하 주사, 리포솜 매개 전달, 직장내, 질내, 흡입 또는 취입, 경피 또는 귀내 전달에 의해 투여될 수 있다.
경구 투여된 투여 단위는 정제, 당의정, 드라제, 알약, 반고체, 연질 또는 경질의 젤라틴 캡슐, 수성 또는 유성 용액, 에멀션, 현탁액 또는 시럽의 형태일 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 투여 형태는 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 좌약, 분말 제형(powder formulation), 예컨대 미결정 또는 에어로졸 스프레이를 포함한다. 활성제는 또한 종래 경피 전달 시스템 내에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "생리적으로 상용 가능한 캐리어 매질"은 원하는 특정 투여 형태에 적합한 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산제 또는 현탁액 보조제, 표면 제제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고형 결합제, 윤활제, 충전제 등을 포함한다. 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition (A.R. Genaro et al., Part 5, Pharmaceutical Manufacturing, pp. 669-1015 (Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD/Philadelphia, PA) (2000))]에서는 약학 조성물을 제형화하는 데 사용되는 다양한 캐리어 및 이의 제조를 위한 공지된 기술이 개시되어 있다. 예를 들어 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 이러한 화합물을 포함하는 제형의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 것에 의해, 임의의 종래의 약학적 캐리어 매질이 본 발명에서 사용되는 PCSK9 조절제와 상용 불가능한 한을 제외하고 이의 용도는 본 발명의 범위 내로 고려된다.
경질 및 연질 캡슐을 포함하여, 이의 고형 투여 형태의 제조에 있어서, 치료제는 약학적으로 불활성인 무기 또는 유기 첨가제, 예컨대 락토스, 수크로스, 글루코스, 젤라틴, 맥아, 실리카 겔, 녹말 또는 이의 유도체, 탈크, 스테아르산 또는 이의 염, 탈지분유, 채소, 석유, 동물 또는 합성 오일, 왁스, 지방, 폴리올 등과 혼합될 수 있다. 액체 용액, 에멀션 또는 현탁액 또는 시럽의 제조에 있어서, 첨가제, 예컨대 물, 알코올, 수성 식염수, 수성 덱스트로스, 폴리올, 글리세린, 지질, 인지질, 시클로덱스트린, 채소, 석유, 동물 또는 합성 오일을 사용할 수 있다. 좌약에 있어서, 첨가제, 예컨대 채소, 석유, 동물 또는 합성 오일, 왁스, 지방 및 폴리올을 사용할 수 있다. 에어로졸 제형에 있어서, 이 목적에 적합한 압축된 기체, 예컨대 산소, 질소 및 이산화탄소를 이용할 수 있다. 약학 조성물 또는 제형은 또한 보존제, 안정화제, 예를 들어 UV 안정화제, 유화제, 감미제, 삼투압을 조정하기 위한 염, 완충제, 코팅 물질 및 항산화제를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명은 활성제 투여를 위한 지효성(controlled-release), 서방출형(sustained-release), 또는 지속성(extended-release) 치료적 투여 형태를 추가로 포함하고, 이는 적합한 전달 시스템 내로 활성제의 혼입을 수반한다. 이러한 투여 형태는, 치료적 결과를 개선하고/하거나 부작용을 최소화하도록, 혈액 내 농도가 비교적 일정하게 유지되면서, 연장된 시간 동안 혈류 내 활성제(들)의 유효 농도가 유지될 수 있도록 하는 방식으로 활성제(들)의 방출을 제어한다. 추가로, 지효성 시스템은 활성제의 혈장 수준에서 최소 피크 내지 골 변동(trough fluctuation)을 제공할 것이다.
본 발명의 방법을 시행하는 데 사용되는 약학 조성물에서, 활성제(들)은, 존재하는 경우, 캐리어 매질 및/또는 보충적 활성제(들)을 포함하여, 조성물의 총 중량을 기준으로, 적어도 0.5 중량% 및 일반적으로 95 중량% 이하의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 활성제(들)의 비율은 조성물의 30-90중량% 사이에서 달라진다.
본 발명의 실시에서 사용하기 위한 화합물은 상기 화학식 I-IV의 화합물을 포함한다. 도 2a 내지 도 2b에 기재된 화합물이 보다 바람직하다. 도 3a 내지 도 3b에 기재된 화합물이 가장 바람직하다.
본원에 기재된 화합물 중 일부는 상업원, 예컨대 라이프케미칼스(Life Chemicals)(SBC-115,202), 에나민(Enamine)(SBC-115,270 및 SBC-115,271), 켐브릿지(ChemBridge)(SBC-115,337), 및 프린스톤 바이오몰레큘라(Princeton Biomolecular)(SBC-115,341)로부터 얻을 수 있다. 다른 바람직한 화합물 및 거의 모든 가장 바람직한 화합물은 상업원으로부터 얻을 수 없지만 유기 합성의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 방법은 보통 본원에 기재된 화합물(들) 및/또는 조성물(들)로 치료를 받은 대상에서 치료 또는 예방 효과가 유도되는지 측정하기 위한 의학적 추적을 포함할 것이다.
본원에 기재된 화합물의 활성은 실험적으로 입증되었다. 하기 실시예는 본 발명을 추가로 상세히 설명하도록 제공된다. 이러한 실시예는 설명 목적으로만 제공되며 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1
LDLR /PCSK9 결합에 대한 시험
상업원으로부터 얻어진 화합물의 시험을 PCSK9/LDLR 상호작용을 억제하는 이의 가능성에 대한 본원의 결합분석에서 수행하였다. 초기 스크리닝은 100μM의 화합물을 이용하여 수행하였다. 각각의 화합물을 3배로 결합 반응 혼합물에 첨가하고 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 스크리닝으로부터, 대조군에 비해 LDLR 상향조절에 대한 효과를 갖는 몇가지 화합물을 동정하고(실시예 3 하기 참조) 한편 PCSK9 프로세싱 및 분비에 영향이 없는 화합물을 동정하였다(실시예 2 하기 참조). 100 uM에서 >20% 억제를 갖는 화학식 I의 예시적인 2-카복시아닐리드 인돌 및 2-카복스아닐리드 피롤이 도 1a 내지 도 1b에 나타나 있다. 55 구조적으로 연관된 2-카복시아닐리드 벤조퓨란(화학식 II-IV의 화합물)을 또한 얻었다. PCSK9/LDLR 상호작용을 억제하는 화합물을 선택하고 100 μM 내지 0.01 nM 범위의 상이한 화합물 농도
를 이용하여 분석하였다. 가장 강한 벤조퓨란 화합물은 각각 IC50가 7, 7.3, 0.5 및 9.5 μM인 SBC-115,270, SBC-115,271, SBC-115,337 및 SBC-115,202였다(도 4). 이러한 예비 SAR에 기초하여, 추가의 34종의 화합물을 디자인하고 SBC-115,337 부근으로 합성한 후, 화합물을 도 4에 기재된 바와 같이 본원의 결합 분석으로 시험하였다. 스크리닝으로부터, 다수의 벤조퓨란 화합물이 >10 uM이지만 </= 50 uM인 IC50를 갖는 것을 측정하였다 (도 2a 내지 도 2b). 여전히 더 강한 화합물은 IC50이 <10 uM이었다(도 3a 내지 도 3b). 도 11 및 표 1은 이러한 화합물 중 상위 10개의 IC50을 보여준다. 낮은 또는 마이크로몰 미만의 효능을 나타내는 화합물을 복수의 상이한 세포 기반 분석에서 추가 평가를 위해 선택하였다.
실시예 2
분비된 PCSK9에 대한 시험
상기 화합물에 의한 PCSK9 존재 하의 재조합 LDLR 수준의 증가는 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 것으로 인한 것이거나 PCSK9의 프로세싱 및 분비를 억제하는 것에 의한 것일 수 있다. 이러한 화합물이 PCSK9 합성, 프로세싱 또는 분비로 방해받을 가능성을 제거하기 위해, 본 발명자들은 상기 기재된 바와 같이 PCSK9의 프로세싱 및 분비에 대한 이들 화합물의 영향을 시험하였다. HEK-293T 세포를 10% 소 태아 혈청 배지를 함유하는 DMEM 중의 96 웰 플레이트 내에 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 리포펙타민-LTX을 이용하여 cDNA 작제물로 일시적으로 형질감염시켰다. 화합물(25 μM) 또는 담체를 첨가하고, 이어서 추가 43 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 PCSK9, 분비된 PCSK9, 및 세포 생존능을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 PCSK9 분비에 대해 분석하고, 이미지화한 후 LAS-4000(GE)를 이용하여 정량화하였다. 4종의 선택된 화합물로부터의 결과는 도 5에 나타냈다. 상기 화합물들은 모두 세포에서 또는 배지 내로의 PCSK9의 합성, 프로세싱 및 분비에 대한 아무런 효과도 나타내지 않았다(도 5).
실시예 3
LDLR 상향조절에 대한 시험
본 발명자들은 HEK-293 세포에서의 PCSK9 및 LDLR DNA의 공발현이 세포내 LDLR의 발현 수준에서의 감소를 야기한다는 것을 입증하는 본 발명의 재조합 분석을 이용하였다. 본 발명자들은 거대세포바이러스 프로모터-인핸서 (pCMV-LDLR)의 조절 하의 인간 LDLR의 발현 벡터를 작제하였다. 추가로, PCSK9를 담은 작제물(pCMV-PCSK9-FLAG)은 상기 기재된 바와 같다. 이러한 작제물을 이용하여 포유동물 세포를 일시적으로 형질감염시키고, 세포 용해물 및 상청액 모두를 항-PCSK9 또는 LDLR 항체를 사용한 면역블룻 분석 및 SDS-PAGE로 처리하였다. 블롯으로부터의 데이터는 pCMV-PCSK9-FLAG로만 형질감염된 세포가 비가공된(세포) 및 가공된(배지) PCSK9 둘 다를 발현했다(도 6). pCMV-LDLR만으로 형질감염된 세포는 세포 중 LDLR의 발현을 나타냈다(도 6). 그러나, pCMV-PCSK9-FLAG 및 pCMV-LDLR 둘 다로 형질감염된 세포는 세포내 LDLR 밴드의 소실을 나타내며(도 6), 이는 PCSK9의 존재가 LDLR의 분해를 야기하거나 이를 분해 경로로의 샤페론 역할을 하는 추가 증거를 제공한다. 후자의 세포에 대한 PCSK9 프로세싱의 억제제의 첨가는 LDLR의 감소된 분해 및 겔 상의 160K 달톤의 출현을 유도해야 한다. 이 분석을 이용하여, 본 발명자들은 본원의 화합물을 LDLR의 분해를 감소시키는 이의 능력에 대해 시험하였다. HEK-293 세포를 본 분석에서 사용하였다. 이를 96 웰 플레이트에 밤새 증식시키고, LDLR/PCSK9로 형질감염시켰다. DMSO에 용해된 화합물 또는 비히클을 배양 배지에 첨가하고, 24-48 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 상기 면역분석을 이용하는 정량화로 처리하였다. 도 7은 세포내 재조합 LDLR 상향조절에 대한 4종의 화합물의 효과를 나타낸다. 화합물 SBC-115,270, SBC-115,271, SBC-115,337 및 SBC-115,202는 1.2 μM에서 5 내지 10 배 상향조절을 나타냈다. 시험은 이러한 화합물들이 HepG2 세포에서 내인성 발현된 LDLR을 상향조절하는 것이 가능함을 확인하였다. PCSK9로 형질감염된 HepG2 세포를 96 웰 플레이트에서 웰당 30,000 세포의 밀도로 배양하였다. 다음날, 세포를 선택된 스크리닝 화합물 또는 비히클로 처리하였다. 세포를 48 시간 동안 인큐베이션한 후 LDL 수용체-다중클론 항체를 이용하여 정량화 처리하고 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 도 8의 데이터는, LDLR의 4-8 배 상향조절로 동일한 부피의 DMSO로 처리된 세포에 비해, 상기 화합물들이 LDLR 수준에서의 증가를 보임을 나타내었다.
실시예 4
계 내 HepG2 세포에서의 Dil -LDL 흡수
상기 PCSK9 길항제가 기능성 LDLR을 상향조절한다는 점을 확인하기 위해, 본 발명자들은 HepG2 세포에서 형광 Dil-LDL의 흡수를 증진하는 이러한 화합물의 능력을 시험하였다. 간략하게, PCSK9로 형질감염된 HepG2 세포(도 4)를 플레이팅하고 밤새 생장시켰다. 화합물을 세포에 첨가하고 이어서 형광 Dil-LDL을 첨가하였다. 세포를 광범위하게 세척하고, 세포에 의해 취해진 형광 Dil-LDL을 Synergy 2 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다(도 9 및 도 12). 도 9에 나타난 바와 같이, 본원의 화합물(SBC-115,337, SBC-115,270, SBC-115,271 및 SBC-115,202)은 1.2 uM에서 HepG2 처리된 세포의 형광 라벨된 LDL 흡수에서의 증가를 나타낸다. 본원의 결합 연구(표 1) 유래의 추가로 선택된 화합물의 추가 분석은 4종의 화합물(SBC-115,418, SBC-115,424, SBC-115,432 및 SBC-115,433)이 1.2uM 화합물 농도에서 Dil-LDL 흡수에서의 현저한 증가를 나타냄을 보였다(도 12). 이러한 화합물을 생체 내 연구에서의 추가 분석을 위해 선택하였다.
실시예 5
LDLR 상향조절에 대한 시험
본 발명자들은 본원의 재조합 LDLR 상향조절 분석(실시예 3)을 SBC-115,418, SBC-115,424, SBC-115,432 및 SBC-115,433이 동일한 부피의 DMSO로 처리된 세포에 비해 LDLR 수준에서 현저한 증가를 나타낸다는 것을 인증하도록 사용하였다(도 13).
실시예 6
분비된 PCSK9에 대한 시험
도 14에 나타낸 4종의 선택된 화합물(SBC-115,418, SBC-115,424, SBC-115,432 및 SBC-115,433)의 재조합 LDLR 수준에서의 증가는 PCSK9의 합성 및 분비에 대한 이의 효과로 인한 것이 아니며, 반면 LDLR/PCSK9 상호작용에 대한 이의 효과에 대한 것이다(실시예 2 참조).
실시예 7
세포 생존능에 대한 시험
내인성 발현된 LDLR을 상향조절하는 모든 화합물을 계 내 세포 생존능에 대해 시험하기 위해 사용하였다. HEK-293T 세포 또는 HepG2 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 세포 배지 중 96 웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 화합물(25uM)을 24 시간 후에 세포에 첨가하고 추가 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존능을 레자주린(Sigma 199303) 및 Synergy-II 플레이트 판독기를 이용하여 분석하였다. 세포 독성을 나타내는 화합물을 배제하였다.
실시예 8
동물 모델에서의 효능 시험
SBC-115,337을 수컷 마우스(C57BL/6 마우스)에서 효능에 대해 시험하였다. 마우스를 온도(20-24℃), 습도(60-70%)의 기후 조절되는 조건, 및 교대 12 h 광/암 사이클 하에 케이지당 4마리 동물로 하우징하였다. 마우스를 도 10에 나타낸 것과 같이 5개 군으로 나누었다. 하나의 군에 상업적 식단(Prolab RMH 3000, PMI feeds, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 공급하여 음성 대조군으로서 역할을 하게 하고, 한편 다른 4개의 군에 고지방식(TD.06414)을 공급하였으며, 이는 지방으로부터 60%의 칼로리를 제공한다. 물을 임의 양으로(ad libitum) 제공하였다. 혈장을 1주에 1회 수집하여 LDL 수준을 모니터링하였다. 고지방 식단 공급 4주 후에, 상이한 군들 사이에 평균 LDL 수준이 동일하도록 마우스를 여러 군 중 하나에 무작위 배정하였다. 고지방식 공급된 마우스의 4개 군 중 하나에 비히클로 처리하고 양성 대조군 역할을 하게 하고, 반면 2번째 군에 4일 동안 피하로 3 mg/kg의 SBC-115,337로 매일 처리하였다. 고지방식 공급된 마우스의 3번째 군을 비히클 및 LPS(5mg/Kg)로 처리하고 LPS 양성 대조군 역할을 하게 하고, 반면 4번째 군에 4일 동안 피하에 SBC-115,337+LPS (5mg/Kg)로 매일 처리하였다. 튜브당 암모늄 헤파린의 2 USP 단위를 포함하는 헤파린화된 모세관을 통해 안와후방 정맥총으로부터 약물을 투여한 후 4일에 혈액 샘플(75 μl)을 수집했다(미국 노스캐롤라이나주 버링턴 캐롤라이나). 실온에서 5분 동안 원심분리(5,000 x g)에 의해 혈장을 즉시 분리한 후 지질 프로필에 대해 분석할 때까지 -80℃에서 유지하였다. 혈장 콜레스테롤, LDL-C, HDL-C, 및 트리글리세리드 수준을 효소적으로 측정하였다.
본원의 데이터는 SBC-115,337이 고지방식이 공급되고 LPS로 처리되거나 처리되지 않은 마우스에서 LDL-C 수준을 저하시킨다는 것을 입증하였다. 도 10 은 고지방식 동물 수준과 관련하여 4일후 LDL-C 수준에서 20-25% 감소를 나타내는 SBC-115,337로 얻어진 데이터를 보여준다.
마찬가지로, SBC-115,418을 상기 기재된 바와 같이 마우스에서 시험하였다. C57BL/6 마우스를 각각 5마리 동물의 4개 군 - 2개의 기선 군, PBS를 수여받은 대조군 군 및 5일 동안 매일 10 mg/kg 경구를 수여받은 SBC 군 - 으로 나눴다. 혈장을 1일째에 화합물의 주사 전에 수집하였다. 혈장을 5일째에 다시 수집하였다. 혈장 LDL-C 수준을 효소적으로 측정하였다. (a) LDL-C에서의 실제 변화를 mg/dL로 나타내고 (b) 5 일 동안 SBC-115,418 투여 후 LDL-C의 % 감소를 나타냄. 본원의 데이터는 SBC-115,418이 고지방식이 공급된 마우스에서 LDL-C 수준을 저하시킨다는 것을 입증하였다. 도 15a 및 도 15b는 고지방식 동물 수준과 관련하여 10mg/kg의 SBC-115,418의 매일 경구 투여의 5일후 LDL-C 수준에서 20-25% 감소를 나타내는 SBC-115,418로 얻어진 데이터를 보여준다.
상기 명세서는 특정 간행물에 대한 인용을 포함하며, 이는 본 발명이 존재하는 기술분야를 나타내도록 제공된다. 인용된 간행물 각각의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 실시양태가 상기 기재되고/기재되거나 설명되었으나, 다양한 다른 실시양태가 상기 개시내용으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 기재되고/기재되거나 설명된 특정 실시양태에 제한되지 않지만, 첨부된 특허청구범위의 범위를 벗어나지 않고 고려 가능한 변형 및 변경이 가능하다. 더 나아가, 이행 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어지는" 및 "이루어지는"은, 원본 및 보정된 형태의 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 경우, 존재하는 경우, 특허청구범위(들)의 범위로부터 제외된 나열되지 않은 추가의 청구 요소 또는 단계에 대한 특허청구범위를 정의한다. 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 확장 가능하도록 의도되며 임의의 추가의 나열되지 않은 요소, 방법, 단계 또는 재료를 배제하지 않는다. 용어 "이루어지는"은 특허청구범위에 명시된 것과 다른 임의의 요소, 단계 또는 재료를 제외하며, 후자의 경우, 불순물은 대개 명시된 재료(들)와 관련된다. 용어 "본질적으로 이루어지는"은 명시된 요소, 단계 또는 재료(들) 및 본 발명에서 특허 청구된 기본적 및 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 받지 않는 것에 대한 특허 청구의 범위를 제한한다. 본 발명이 포함하는 모든 조성물 및 이의 사용 방법은, 대안적인 실시양태에서, 보다 구체적으로 이행 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어지는" 및 "이루어지는" 중 임의의 것에 의해 정의될 수 있다.
참고문헌
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012

Claims (11)

  1. 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을, 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료적 유효량의 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체를 투여하는 것을 포함하는, 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을 치료 또는 예방하는 방법:
    Figure pct00013

    상기 식에서, A는 임의로 치환된 시클로알킬, 아릴, 헤테로사이클, 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Ra는 H 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    B는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되며:
    Figure pct00014
    ;
    여기서 각각의 R1은 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 히드록실, 및 임의로 치환된 아미노, 알콕시, 알콕시카보닐, 알콕시알킬, 알킬티오, 알킬티오알킬, 아실, 카복시, 아미도, 아미노카보닐, 모노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 모노알킬아미노설피닐, 디알킬아미노설피닐, 모노알킬아미노설포닐, 디알킬아미노설포닐, 알킬설포닐아미노, 히드록시설포닐, 알콕시설포닐, 알킬설포닐알킬, 모노알킬아미노설포닐알킬, 디알킬아미노설포닐알킬, 및, 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬알킬, 아르알킬, 헤테로시클로알킬, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클, 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R1은 인접한 R1과 함께 임의로 치환된 5-7원 카보사이클, 아릴, 헤테로사이클, 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며;
    R2는 H 및 임의로 치환된 저급 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며; 단, B1은 2-치환된 인돌이 아니다.
  2. 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을, 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료적 유효량의 하기 화학식 (II)의 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체를 투여하는 것을 포함하는, 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을 치료 또는 예방하는 방법:
    Figure pct00015

    상기 식에서, R1은 H, 및 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬, (C1-C3)-알콕시알킬, 아릴옥시알킬, (C1-C3)-알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 아릴, 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; 각각의 R3은 독립적으로 H, 할로겐, (C1-C3)-알킬, (C1-C3)-알콕시, 및, 임의로 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 인접한 R3과 함께 임의로 치환된 5-7원 아릴 고리를 형성하며;
    각각의 R4는 독립적으로 H, 할로겐, (C1-C3) 알킬 및 (C1-C3) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    R5는 H 및 CONR6R7로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R6 및 R7은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬알킬, 아르알킬, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클, 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 i) R6 및 R7은 함께 임의로 치환된 5-7원 헤테로사이클 고리를 형성하거나; 또는 ii) R6 또는 R7은 인접한 R4와 함께 임의로 치환된 5-7원 헤테로사이클 고리를 형성한다.
  3. 제2항에 있어서, 치료적 유효량의 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체를 투여하는 것을 포함하는 방법:
    Figure pct00016

    상기 식에서, R1은 H 또는 CH3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 독립적으로 H 및 (C1-C3)-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    R6 및 R7은 독립적으로 H, 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬 및
    Figure pct00017
    로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기서, R8은 CO2H, CONHR9, 2-옥사졸, 2-옥사졸린, 2-벤즈옥사졸로 이루어진 군으로부터 선택되고; R9는 H 또는 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬이다.
  4. 제2항에 있어서, 치료적 유효량의 하기 화학식 (IV)의 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체를 투여하는 것을 포함하는 방법:
    Figure pct00018

    상기 식에서 R1은 H 또는 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬이고;
    R3은 독립적으로 H, 할로겐, 또는 임의로 치환된 (C1-C3)-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    R4는 H이고; R9는 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬이다.
  5. 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, CVD 또는 관상성 심장 질환 중 적어도 하나의 증상을, 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료적 유효량의 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법:
    N-(4-{[4-(1,3-벤즈옥사졸-2-일)페닐]카르바모일}페닐)-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,337);
    N-(4-{[4-(1,3-벤즈옥사졸-2-일)페닐]카르바모일}페닐)-5-메톡시-3-메틸-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,418);
    N-{4-[(4-카르바모일페닐)카르바모일]페닐}-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,424);
    N-(4-{[4-(4,5-디히드로-1,3-옥사졸-2-일)페닐]카르바모일}페닐)-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,432);
    N-(4-{[4-(1,3-옥사졸-2-일)페닐]카르바모일}페닐)-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,433); 및
    7-메톡시-3-메틸-N-(4-{[4-(1,3-옥사졸-2-일)페닐]카르바모일}페닐)-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,445).
  6. 하기 화학식의 화합물로서, 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 및 입체이성질체를 포함하는 화합물:
    Figure pct00019

    상기 식에서, Xa 및 Xb는 독립적으로 H 또는 CH3의 군으로부터 선택되며;
    Ya, Yb 및 Yc는 동일하거나 상이할 수 있고 H, 할로겐 또는 (C1-C3)-알콕시의 군으로부터 선택되며;
    Za, Zb 및 Zc는 동일하거나 상이하고 H, 할로겐, (C1-C3)-알콕시, (C1-C4)-알킬, COOH, CONR10R11, 2-옥사졸, 2-옥사졸린 및 2-벤즈옥사졸의 군으로부터 선택되고; R10 및 R11은 독립적으로 H, 임의로 치환된 (C1-C3)-알킬 및 임의로 치환된 아릴의 군으로부터 선택되고; n=1 또는 2이며, n=1인 경우, CONR10R11은 상기 CONR10R11이 부착된 벤젠 고리에 융합된 N-치환된 숙신이미드 고리를 형성할 수 있으며, 여기서 숙신이미드 치환기는 임의로 치환된 (C1-C3) 알킬 또는 아릴이며, 단, 상기 화학식은 하기를 포함하지 않는다:
    Figure pct00020
    .
  7. 제6항에 있어서, X는 메틸이고, Ya, Yb 및 Yc 중 하나는 벤조퓨란 고리의 위치 5 또는 위치 7에서 치환되고 메톡시이며 다른 것들은 H이고, Za, Zb 및 Zc 중 하나는 벤젠 고리의 위치 4에서 치환되고 아미노카보닐, 메틸아미노카보닐, 분지된 (C3-C4)-알킬, 메톡시, 플루오로 및 2-옥사졸릴, 4,5-디히드로-옥사졸-2-일, 및 2-벤즈옥사졸 치환기의 군으로부터 선택되고, 다른 것들은 H이며; n=2인 화합물.
  8. 제6항에 있어서, X는 메틸이고, Ya, Yb 및 Yc 중 하나는 벤조퓨란 고리의 위치 5 또는 위치 7에서 치환되고 메톡시이며 다른 것들은 H이고, Za, Zb 및 Zc 중 하나는 벤젠 고리의 위치 3에서 치환되고 아미노카보닐, 메틸아미노카보닐, 분지된 (C3-C4)-알킬, 메톡시, 플루오로 및 2-옥사졸릴, 4,5-디히드로-옥사졸-2-일, 및 2-벤즈옥사졸 치환기의 군으로부터 선택되고, 다른 것들은 H이며; n=2인 화합물.
  9. 제6항에 있어서, X는 메틸이고, Ya, Yb 및 Yc 중 하나는 벤조퓨란 고리의 위치 5 또는 위치 7에서 치환되고 메톡시이며 다른 것들은 H이고, Za, Zb 및 Zc 중 하나는 벤젠 고리의 위치 4에서 치환되고 아미노카보닐, 메틸아미노카보닐, 분지된 (C3-C4)-알킬, 메톡시, 플루오로 및 2-옥사졸릴, 4,5-디히드로-옥사졸-2-일, 및 2-벤즈옥사졸 치환기의 군으로부터 선택되고, 다른 것들은 H이며; n=1인 화합물.
  10. 제6항에 있어서, N-(4-{[4-(1,3-벤즈옥사졸-2-일)페닐]카르바모일}페닐)-5-메톡시-3-메틸-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,418)인 화합물.
  11. 제6항에 있어서, N-(4-{[4-(1,3-벤즈옥사졸-2-일)페닐](메틸)카르바모일}페닐)-1-벤조퓨란-2-카복사미드(SBC-115,423)인 화합물.
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