KR20210038539A - 푸칸의 효소 가수분해 - Google Patents

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앨리스데어 보라스톤
첼시 조이 비커스
올리 에스터 살라마-앨버
켄토 타케히토 아베
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에이알시 메디컬 디바이시즈 인코포레이션
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Abstract

본 발명은 P5AFcnA 푸카나제와 P19DFcnA 푸카나제를 포함하는 사이크로모나스 종의 푸카나제에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 시스템, 조성물 등은 이런 푸카나제에 의한 가수 분해후 평균 분자량이 감소된 푸칸 조성물을 포함하는 것에 관한 것이기도 하다.

Description

푸칸의 효소 가수분해
본 발명은 푸칸의 효소 가수분해에 관한 것이다.
(후코이단을 포함한) 푸칸은 황산화 다당류이다. 이는 푸칸이 많은 당기로 구성된 분자이며 당기에 부착된 부착된 황 원자를 갖고 있음을 의미한다. 주요 당기를 "푸코스(fucose)"라 하는데, 6개의 탄소 원자를 갖고 화학식 C6H12O5를 갖는 당이다. "후코이단"(또는 후코이딘)은 갈조류(해조류)에서 유도된 푸칸이다. 푸칸은 단독으로 존재하거나, 자일로스, 갈락토스, 글루코스, 글루쿠론산 및/또는 만노스와 같은 다른 당들의 혼합물로 존재할 수 있다. 이런 다른 당은 푸칸과 함께 해조류나 기타 공급원에서 추출할 수 있다. 푸칸은 현재는 여기서 언급한 갈조류(해조류), 해삼 등과 같은 천연 공급원에서 유도되지만, 최종 공급원에 관계없이 본 명세서에서 언급한 푸칸의 화학적 구조적 모티프를 갖는 중합체 분자를 포함한다.
후코이단은 Hizikia fusiforme, Himanthalia Elongata, Kjellmaniella crassifolia, Laminaria brasiliensis, Laminaria cichorioides, Laminaria hyperborea, Laminaria japonica, Laminaria saccharina, Lessonia trabeculata, Macrocystis pyrifera, Saccharina laponica, Saccharina laponica, Saccharina, Saccharina, confusum, Sargassum fusiforme 및 Undaria pinnatifida을 포함한 다양한 종의 갈조류로부터 얻을 수 있지만, 이에 한정되지도 않는다. 예로 든 종들은 모두 Phaeophyceae의 분류학적인 분류에 속하며 이들 종의 대부분은 Fucales 및 Laminariaceae 계통에 속한다.
후코이단을 포함한 푸칸은 섬유 접착의 형성을 방지, 억제 및 치료하는 장벽 장치로서의 역할에 효과적인 것으로 나타났다. 푸칸은 다른 관련 질병 및 상태의 치료에도 효과적임이 밝혀졌다.
따라서, 원하는 분자량 분포를 갖는 푸칸 조성물의 제조시 개선된 방법에 대한 요구가 충족되지 않았다. 이전 연구에서는 일부 푸칸의 가수분해에서 기질 특이 적 MfFcnA 효소 (Colin, 2006)로 알려진 플라보 박테리아 균주 SW5로부터 푸칸 특이적 푸카나제의 사용에 대해 논의했다. 본 발명의 방법, 시스템 등은 선택된 푸칸 조성물을 가수분해할 수 있는 효소와, 이들 효소를 사용해 공급원료인 푸칸 조성물로부터 원하는 분자량 푸칸 분포 조성물을 획득하는 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
공급원료인 푸칸 조성물에 대해 원하는 저분자량 분포 푸칸을 얻기 위해 푸칸 조성물에서 푸칸을 포함해 푸칸의 효소 가수분해가 가능한 푸카나제를 수득하고 이용하는 방법, 시스템, 조성물 등이 제공된다. 본 명세서의 실시예들은 푸카나제에 의한 가수분해 후 푸카나제의 생산이나 합성 및 평균 분자량이 낮은 푸칸을 갖는 푸칸 조성물의 생산에 사용될 수 있는 푸카나제-유전 및 푸카나제-아미노산 서열을 포함한다. 생산된 푸카나제를 사용해 공급원료 푸칸 조성물을 가수분해하는 방법은 효소 가수분해 동안 푸칸 기질 선택성 및 시간 기반 제어를 제공한다.
본 발명의 방법, 시스템 등은 공급원료 푸칸 조성물로부터 원하는 분자량 분포를 포함하는 원하는 푸칸 조성물은 물론 이런 원하는 푸칸 분자량 분포를 포함하는 조성물 및 이런 조성물의 사용 방법을 구하는 것을 포함한다. 어느 면에서, 이 방법은 다음을 포함한다 :
본 발명의 조성물, 시스템 및 방법 등은 수용액과 첨가된 푸칸에 P5AFcnA 푸카나제 및/또는 P19DFcnA 푸카나제를 포함할 수 있는 조성물을 제공한다. 첨가된 푸칸은 공급원료 푸칸 조성물일 수 있고, 이 조성물은 pH 약 6.5-9.0, 온도 약 15℃-40℃이며, 푸카나제가 푸칸내 글리코시드 결합을 가수분해하도록 하는 조건에 있을 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법 등은 원핵이나 진핵 개체에 의해 생성된 푸카나제와 같은 효소를 포함하고, 푸카나제는 SEQ ID NOS. 1내지 4 중의 어느 하나에 따른 유전자 서열이나, 이런 SEQ ID NOS.에 기초한 유전자 서열에 의해 코딩되는데, 여기서 적어도 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 코돈 및 1 %, 2 %, 3 %, 4 % 또는 5 % 미만의 코돈이 치환된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법 등은 원핵이나 진핵 개체에 의해 생성된 푸카나제를 포함하고, 푸카나제는 SEQ ID NOS. 5내지 9 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 적어도 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산 및 1 %, 2 %, 3 %, 4 % 또는 5 % 미만의 아미노산이 치환된다. 원핵 개체는 Psychromonas 종이나 Escherichia Coli 일 수 있다.
이 방법은 여기서 설명한 것처럼 Psychromonas 푸카나제나 다른 푸카나제를 사용하여 Psychromonas 종이 아닌 수용액, 예를 들어 인공 용기에 들어있는 인공 용액에서 푸칸을 효소적으로 가수분해하는 것을 포함할 수 있다. 푸칸은 후코이단일 수 있고, 아데노사이스티스 유트리큘라리스(Adenocystis utricularis), 해조추출물(Ascophyllum nodosum), 코르다필럼(Chorda filum), 시스토세리아비스 마리나(Cystoseirabies marina), 더빌리아 안타락티카(Durvillaea Antarctica), 검둥감태(Ecklonia kurome), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 대황(Eisenia bicyclis), 푸쿠스 에반에센스(Fucus evanescens), 푸쿠스 베시쿨로시스), 톳(Hizikia fusiforme), 히만탈리아 엘롱가타(Himanthalia Elongata), 개다시마(Kjellmaniella crassifolia), 라미나리아 브라실리엔시스(Laminaria brasiliensis), 라미나리아 시코리오데스(Laminaria cichorioides), 라미나리아 하이퍼보레아(Laminaria hyperborean), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 라미나리아 사카리나(Laminaria saccharina), 레소니아 트라베쿨라타(Lessonia trabeculata), 마크로시스티스 피리페라(Macrocystis pyrifera), 펠베티아 파스티기아타(Pelvetia fastigiata), 펠베티아 카나리쿨라타(Pelvetia Canaliculata), 사카리나 자포니카(saccharinajaponica), 사카리나 라티스시마(saccharina latissima), 사르가숨 스테노필룸(sargassum stenophylum), 사르가숨 툰베르기(sargassum thunbergii), 사르가숨 콘푸숨(Sargassum confusum), 사르가숨 푸시포름(Sargassum fusiforme) 및 운다리아 핀나시피다(Undaria pinnatifida Sarfutia) 중의 적어도 하나로부터 구할 수 있다. 특정 실시예에서, 푸칸 또는 후코이단은 Saccharina japonica, Laminaria hyperborea, Macrocystis pyifera 및 Chorda filum 중 하나 이상으로부터 획득된다. 가수분해는 푸칸의 평균 분자량을 적어도 약 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %까지 감소시킬 수 있다. 가수분해는 가수분해되는 푸칸에서의 글리코시드 결합의 적어도 약 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %를 초래할 수 있다.
또한, 공급원료 푸칸 조성물에서의 푸칸의 효소 가수분해에 의해 공급원료 푸칸 조성물에 비해 원하는 저분자량 푸칸 조성물을 얻는 방법이 제공된다. 이 방법은 아래 단계들을 포함한다:
수용액에서 공급원료 푸칸 조성물 및 사이크로모나스 푸카나제를 제공하는 단계;
공급원료 푸칸 조성물 및 사이크로모나스 푸카나제를 공급원료 푸칸 조성물에서 가수분해하기에 충분한 조건하에서 배양해 가수분해된 푸칸 및 가수분해 잔류 분자들을 생성하는 단계; 및
원하는 분자량 푸칸 조성물을 얻기 위해 가수분해 잔류 분자들과 푸카나 제로부터 가수분해된 푸칸을 분리하는 단계.
푸카나제는 유전자 서열에 의해 코딩 될 수 있고 및/또는 전술한 바와 같이 예컨대 SEQ ID NOS. 1-8중의 하나에 따른 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 푸칸/푸칸 공급원료 조성물이 본원에서 논의 된 바와 같이 공급 될 수 있다. 푸칸/푸칸 조성물에 존재하는 평균 분자량 및/또는 글리코시드 결합은 적어도 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80%, 90 % 또는 95 %까지 감소 될 수 있다.
또한, 발현 가능한 P5AFcnA 푸카나제 유전자, P19DFcnA 푸카나제 유전자, 또는 본원에 논의 된 기타 서열을 포함하는 발현벡터가 제공됨은 물론, 이런 발현벡터로부터 발현되고 수집 및 정제된 효소 및 푸카나제도 제공된다.
이들 및 다른 측면, 특징 및 실시예는 이하의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 포함해 본 명세서에서 설명한다. 달리 명시적으로 언급되지 않는한, 모든 실시예, 측면, 특징 등은 임의의 원하는 방식으로 혼합 및 정합, 결합 및 치환 될 수 있다.
도 1은 효소 가수분해에 의해 공급원료 푸칸 조성물에 비해 저분자량 푸칸 조성물을 얻는 예시적인 방법에 대한 순서도이다.
도 2A는 P5AFcnA 푸카나제 및 P19DFcnA 푸카나제에 의해 Saccharina Japonica에서 추출된 후코이단 조성물의 가수분해 및 MfFcnA 푸카나제에 의해 Saccharina Japonica에서 추출된 후코이단 조성물의 가수분해 부재를 보여주는 C-PAGE 겔의 일례를 보여준다.
도 2B는 P5AFcnA 푸카나제 및 P19DFcnA 푸카나제에 의해 라미나리아 하이퍼보레아로부터 추출된 후코이단 조성물의 가수분해 및 MfFcnA 푸카나제에 의한 이런 후코이단 조성물의 가수분해의 부재를 보여주는 C-PAGE 겔의 일례를 보여준다.
도 2c는 P5AFcnA 푸카나제 및 P19DFcnA 푸카나제에 의해 마크로시스티스 피리페라로부터 추출된 후코이단 조성물의 가수분해 및 MfFcnA 푸카나제에 의한 이런 후코이단 조성물의 가수분해의 부재를 보여주는 C-PAGE 겔의 일례를 보여준다.
순서도를 포함한 도면들은 본 발명의 일례를 보여줄 뿐이다. 본 명세서의 시스템, 방법 등의 실제 실시예는 도면에 도시되지 않은 추가 특징이나 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 제시된 예시는 하나 이상의 형태로 시스템, 방법 등의 실시예를 예시하고, 이러한 예시는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서의 실시예는 완전하지 않으며 다음의 상세한 설명에 개시된 형태로 제한되지 않는다.
본원의 방법, 시스템, 조성물 등은 공급원료 푸칸 조성물에 대해 원하는 저분자량 분포 푸칸을 획득하기 위해 공급원료 푸칸 조성물의 효소 가수분해가 가능한 푸카나제에 관한 것이다. 따라서, 본원에 논의된 푸카나제는 푸칸을 선택적으로, 제어 가능하게 절단하여 크기를 감소시켜, 공급원료 조성물에서 푸칸의 분자량 분포가 선택적으로 제어 가능하게 감소되어 원하는 저분자량 분포의 변형된 푸칸을 포함하는 변형된 푸칸 조성물을 제공하는 데 사용된다.
이 방법 등의 특정 실시예는 푸칸의 예로서 후코이단을 사용하는 도면에 예로서 도시된다. 각각의 천연 및 합성 푸카나제의 코딩 영역 푸카나제-유전 서열 및 푸카나제-아미노산 서열의 조성이 논의된다. 공급원료 푸칸 조성물의 효소 가수분해의 생성물로서 수득된 저분자량 푸칸 조성물은 공급원료 푸칸 분포에 비해 더 낮은 평균 분자량 분포를 갖는다. 이러한 분자량 분포의 변화는 분포의 분산성과 모양의 변화를 수반한다.
본원에서 논의 된 특정 푸카나제의 개발로 돌아가서, 후코이다놀리틱 사이크로모나스 종 SW5A 및 SW19D는 Cadboro Bay 및 Willows Beach(캐나다 브리티시 컬럼비아 주 밴쿠버 섬 빅토리아) 해안에서 수집된 갈색 거대 조류로부터 분리되었다. 배양된 사이크로모나스 종 SW5A 및 SW19에서 게놈 DNA를 추출하고, 그 게놈의 차세대 시퀀싱을 Illumina MiSeq 플랫폼에서 수행했다. 이 게놈에 탄수화물 활성효소를 암호화하는 추정 유전자를 식별하기 위해 주석을 달았다. 효소 P5AFcnA 및 P19DFcnA를 암호화하는 푸카나제 유전자 서열은 주석과정 동안 사이크로모나스 종 Psychromonas sp. SW5A 및 Psychromonas sp. SW19D의 게놈에서 확인되었다.
효소 P5AFcnA 및 P19DFcnA를 암호화하는 푸카나제 유전자 서열을 Psychromonas 종 Psychromonas sp. SW5A 및 Psychromonas sp. SW19D에서 구했다. 대장균에서의 발현을 위해 코돈 최적화되고 대장균 발현 플라스미드 pET28a에 사전 삽입된 효소 P5AFcnA 및 P19DFcnA를 코딩하는 합성 푸카나제 유전자를 Genscript®에서 주문했다. 이런 구성을 pET28a_p5AFcnA 및 pET28a_P19DFcnA라고 한다. 이 구성들의 서열 충실도는 양방향 DNA 시퀀싱으로 확인되었다. 푸카나제는 6- 히스티딘 태그가 있는 발현 시스템을 통해 대장균에서 발현되었다. 재조합 단백질을 정제하기 위해, 세포를 수확하고 화학적으로 용해하고 원심분리하여 세포 용해물 상청액에서 세포 파편을 분리했다. 그후 고정된 니켈 친화성 크로마토그래피로 이 용해물로부터 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질을 0.5M NaCl 완충액으로 20mM Tris pH 8.5로 투석하고 추가 사용을 위해 29μM로 농축했다. 천연 및 합성 P5AFcnA 푸카나제의 푸카나제-유전자에 대한 코딩 영역 서열은 표 1A와 1B에 각각 서열번호 1과 2로 제시되어있다. 천연 및 합성 P19DFcnA 푸카나제의 푸카나제-유전자에 대한 코딩영역 서열은 표 1C와 1D에 각각 서열 번호 3과 4로 제시되어있다. 천연 및 합성 P5AFcnA 푸카나제에 대한 아미노산 서열은 각각 표 1E와 1F에 각각 서열 번호 5와 6으로 제시되어있다. 천연 및 합성 P19DFcnA 푸카나제에 대한 아미노산 서열은 각각 표 1G와 1H에 서열 번호 7과 8로 에 제시되어있다. 일부 실시예에서, 본원에 제시된 핵산서열은 적절한 발현벡터로 제어 가능하게 발현됨을 보여주었다(https://en.wikipedia.org/wiki/Expression_vector). 이런 발현벡터는 원핵 또는 진핵 발현에 최적화될 수 있으며 플라스미드, 발현 바이러스, 무세포 시스템 등을 원하는대로 포함할 수 있다. 발현벡터는 선택된 프라이머, 복제 기점 등을 원하는대로 포함할 수도 있다.
표 1A에 제시된 푸카나제-유전자 서열 SEQ ID NO. 1을 이하 천연 P5AFcnA 유전자 서열이라 한다. 표 1B에 제시된 푸카나제 유전자 서열 SEQ ID NO.2를 이하 합성 P5AFcnA 유전자 서열이라 한다. 표 1C 에 제시된 푸카나제 유전자 서열 SEQ ID NO.3를 이하 천연 P19DFcnA 유전자 서열이라 한다. 표 1D 에 제시된 푸카나제 유전자 서열 SEQ ID NO.4를 이하 합성 P19DFcnA 유전자 서열이라 한다. 합성 서열은 대장균을 이용한 효소발현에 최적화된다. 표 1E에 제시된 아미노산 서열 SEQ ID NO5를 이하 천연 P5AFcnA 아미노산 서열이라 한다. 표 1F에 제시된 아미노산 서열 SEQ ID NO.6를 이하 합성 P5AFcnA 아미노산 서열이라 한다. 표 1G에 제시된 아미노산 서열 SEQ ID NO.7을 이하 천연 P19DFcnA 아미노산 서열이라 한다. 표 1H에 제시된 아미노산 서열 SEQ ID NO.8을 이하 합성 P19DFcnA 아미노산 서열이라 한다.
표 1A: 천연 P5AFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 코딩 영역 서열, SEQ ID NO. 1
10 20 30 40 50 60
ATGTTAATTT CAGTTACTGT TTTAGTAGGC TGTGGAAGCA GTAGTGATGA AGTTGAGTCT
70 80 90 100 110 120
ACAAATACAA CTGACTCATA TAACATTAAT AACACAGAAG CGACTGGTAT TGAATACAAT
130 140 150 160 170 180
GCTAGTTGGA TGGCAGGTAC TTGGGGGATT ACACAACGTG TAGACGGTGG TTATAAATTG
190 200 210 220 230 240
GATAACTCCG CAGACTCCTC TAATTGGCAG GCAGGTGCAG AAGAAATTGT TACTAACATT
250 260 270 280 290 300
CCTGCGGCAG AATACGTCAT AACATCATTT ACCCACCCAG CGCACGGTCA CCTATTCACA
310 320 330 340 350 360
TTACGAACTA ATAATAATGT GGATGTATCA GCAATTCACC CTGATATGGT ACCCACATTA
370 380 390 400 410 420
GAAAATGAAA AAATCATTCT TGATGTTATT AATATATATC GCGCTGCGGG TAAAAAAGTA
430 440 450 460 470 480
ATTCTATATT TAAATTCAGC AGGACCTTCA ATGGCAGAGG AGCGAGGTGA TACTGATATC
490 500 510 520 530 540
CAAGCTGCAT GGGATGAATA CTATATCAAT GAGTGGGATG GAGATGAAGC AGCTGCTTGG
550 560 570 580 590 600
CGTAATTTAG CTCGAGGATA TGTAGAGCGT TTCGATGGTT TAGTAGATGG CTATTGGTTA
610 620 630 640 650 660
GACAACTCCA GAAACTTGCC AGGTGAGGTA TCTGACTTTG TTGCTATGCT GCGTAGCGTT
670 680 690 700 710 720
GATCCCGAAT TAACGATTGC CGTTAATTAT GACCAACACT ACTTTACCGA TGATAACGGA
730 740 750 760 770 780
GAATATTTAT ATGTTGATTC TGACGGTTTA GATGATGAAG ATGAAAGCGA TTATAAAATA
790 800 810 820 830 840
GTAAAACATG TAGTGACAAA TGAATACATG GATTTTACTA ACGGACATGT CACACCATTA
850 860 870 880 890 900
GGGCGAGGTG CGCCTCCCAA TTCTTGGGCT TATGAGGAAT ATACTATTCC AGATATGATT
910 920 930 940 950 960
GAGGTACCAT GGGAAACCTA TGATGGCAGT AAATATGCAT TAAAACACGG CTGGTTCCCT
970 980 990 1000 1010 1020
ATTAGAAACT CGTGGAGTGG TTCAAAAGCT GAACTTATGT TTGATGTTGA GCAAGCTTAT
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CGATTTGTTA GAACAGTTAC TGATGGAGGA GCTGCAATGA CATGGTCAAC GACTCAAGAC
1090 1100 1110 1120 1130 1140
AATGGCTACA TGACTGCCGA TGAAATGAGT ATAATGATTG AAATTAGTAA TAGAATGACA
1150 1160 1170 1180 1190 1200
CAAACCCCTA AACCAGATTA CTCAGTTTAT GAAAGGCCAA AAGGCGCATA TCTAGTGAGT
1210
GAAATAGAAT AA
표 1B: 합성 P5AFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 코딩 영역 서열, SEQ ID NO. 2
10 20 30 40 50 60
ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT
70 80 90 100 110 120
ATGGGTAGCA GCAGCGACGA GGTTGAAAGC ACCAACACCA CCGATAGCTA CAACATTAAC
130 140 150 160 170 180
AACACCGAGG CGACCGGCAT CGAATATAAC GCGAGCTGGA TGGCGGGTAC CTGGGGCATT
190 200 210 220 230 240
ACCCAGCGTG TGGACGGTGG CTACAAGCTG GACAACAGCG CGGATAGCAG CAACTGGCAA
250 260 270 280 290 300
GCGGGTGCGG AGGAAATTGT GACCAACATC CCGGCGGCGG AATACGTTAT TACCAGCTTC
310 320 330 340 350 360
ACCCATCCGG CGCATGGTCA CCTGTTTACC CTGCGTACCA ACAACAACGT GGACGTTAGC
370 380 390 400 410 420
GCGATCCACC CGGATATGGT TCCGACCCTG GAGAACGAAA AAATCATTCT GGACGTGATC
430 440 450 460 470 480
AACATTTACC GTGCGGCGGG TAAGAAAGTT ATCCTGTATC TGAACAGCGC GGGTCCGAGC
490 500 510 520 530 540
ATGGCGGAGG AACGTGGCGA CACCGATATT CAGGCGGCGT GGGATGAGTA CTATATCAAC
550 560 570 580 590 600
GAGTGGGATG GTGATGAAGC GGCGGCGTGG CGTAACCTGG CGCGTGGCTA CGTGGAGCGT
610 620 630 640 650 660
TTCGACGGTC TGGTTGATGG CTATTGGCTG GACAACAGCC GTAACCTGCC GGGTGAAGTG
670 680 690 700 710 720
AGCGACTTTG TTGCGATGCT GCGTAGCGTG GATCCGGAGC TGACCATTGC GGTTAACTAC
730 740 750 760 770 780
GATCAACACT ATTTCACCGA CGATAACGGT GAATACCTGT ATGTGGACAG CGATGGCCTG
790 800 810 820 830 840
GACGATGAGG ACGAAAGCGA TTACAAGATC GTTAAACACG TGGTTACCAA CGAGTATATG
850 860 870 880 890 900
GACTTTACCA ACGGTCATGT GACCCCGCTG GGTCGTGGCG CGCCGCCGAA CAGCTGGGCG
910 920 930 940 950 960
TACGAGGAAT ATACCATTCC GGACATGATC GAGGTTCCGT GGGAAACCTA CGATGGTAGC
970 980 990 1000 1010 1020
AAGTATGCGC TGAAACACGG CTGGTTCCCG ATTCGTAACA GCTGGAGCGG CAGCAAGGCG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
GAACTGATGT TCGACGTGGA GCAGGCGTAC CGTTTTGTGC GTACCGTTAC CGATGGTGGC
1090 1100 1110 1120 1130 1140
GCGGCGATGA CCTGGAGCAC CACCCAAGAC AACGGTTATA TGACCGCGGA TGAAATGAGC
1150 1160 1170 1180 1190 1200
ATCATGATTG AGATCAGCAA CCGTATGACC CAGACCCCGA AGCCGGATTA CAGCGTGTAT
1210 1220 1230 1240
GAACGTCCGA AAGGCGCGTA CCTGGTTAGC GAGATCGAAT AA
표 1C: 천연 P19DFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 코딩 영역 서열, SEQ ID NO.3
10 20 30 40 50 60
ATGTTAATCG GCTGTGGTGG AAGTAGTGCA AATCAAACTC AATCTACGAG CGACCAGGAC
70 80 90 100 110 120
TCATCTGAAG TTAATGAAAC GGTGAGCTTA GACAGCGAAT ATACAGCTAA TTGGATGGCT
130 140 150 160 170 180
GGTGCTTGGG GCATAACTCA ACGCGTAGAC GGCGGTTATA AACTTGATGC TTCTGTAGAA
190 200 210 220 230 240
ACAGGAAAAT ATGATTGGGT CGCTGGTGCA GAAGAAATTG TTGAAAATAT TCCTTCAGCT
250 260 270 280 290 300
GGTTATGTAA TTACATCATT TACTCATCCC GCCCATGGTT TTTTATATAC TTTAAGAGAT
310 320 330 340 350 360
AATGAAAACG TAGATGTTGC TGCTATTCAT CCTGATATGG TGCCTTCTTT AGAAAATGAA
370 380 390 400 410 420
AAAATCATCT TTGATGTTAT TAATGTATAT AAATCTGCCG GTAAGAAAGT ATTATTATAT
430 440 450 460 470 480
TTGAATACGG CAGGTCCTAC TCATGCTGCA GATAGAAACT CCCCCGAAAT TCAAGATGCA
490 500 510 520 530 540
TGGGATGATT ATGTAAATAC GAATTGGAAT GGGGATCATG GTGCAGCTTG GAGGAATCTA
550 560 570 580 590 600
GTTGAAGGTT ACGCTAAAAG ATTCAAAGGT TTAGTTGATG GGTTTTGGTT AGATAATTCA
610 620 630 640 650 660
AAAAACATGG CTGGAGGTCA AAAAGAAATC CCTGAATTTG TTGCAATGCT TAGAGATATT
670 680 690 700 710 720
GATCCGTCAT TTGCAATAGG CGTAAATTAT GAAACTCATT ATTTTGAAGA TGAAGATGGT
730 740 750 760 770 780
AACTACTTAA AAGTAGCATC AGATAGCATA GATGATAACG ATGATCGTGA ATACAAAATA
790 800 810 820 830 840
ATAAAACATG TAGTGACCAA TGAATATATG GACTTTACTA ATGGCCATGT CACTCCAATG
850 860 870 880 890 900
GGACAAGGTG CCCCACCTAA TTCTTGGGGG TATGAAGAAT ATACAATCCC ACACATGATT
910 920 930 940 950 960
GAAAAACCTT GGGATAGTGT TGATGGTAAT CATTATGCAC TTATGCATGG TTGGTTCCCT
970 980 990 1000 1010 1020
ATCAGATTCT CTTGGAGCGG TTCAGGTGCT GAGCTCATGT TTGAAACTGA ACAAGCTTAT
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CGGTTTGTCC GCACGATCAC TGATGGTGGT GCAGCAATGA CATGGTCAAC CACTCAAAAA
1090 1100 1110 1120 1130 1140
AAGGGTTATA TGTCAGCAGA TGAAATGGAT ATAATGATTG AAATTAACAA CAGAATGACA
1150 1160 1170 1180 1190 1200
CAAGCCCCTA AACTAGATTA CGAAGCTTAT GAAAGACCAG AAGGGGCATA TTTGGTTGGT
1210
GAAATAGAAT AA
표1D: 합성 P19DFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 코딩 영역 서열, SEQ ID NO. 4
10 20 30 40 50 60
ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT
70 80 90 100 110 120
ATGAACCAGA CCCAAAGCAC CAGCGACCAG GATAGCAGCG AGGTGAACGA AACCGTTAGC
130 140 150 160 170 180
CTGGACAGCG AATATACCGC GAACTGGATG GCGGGTGCGT GGGGCATTAC CCAACGTGTG
190 200 210 220 230 240
GACGGTGGCT ACAAGCTGGA TGCGAGCGTT GAAACCGGTA AATATGATTG GGTGGCGGGC
250 260 270 280 290 300
GCGGAGGAAA TTGTTGAGAA CATCCCGAGC GCGGGTTACG TGATCACCAG CTTCACCCAC
310 320 330 340 350 360
CCGGCGCACG GCTTTCTGTA TACCCTGCGT GACAACGAGA ACGTGGATGT TGCGGCGATT
370 380 390 400 410 420
CACCCGGACA TGGTGCCGAG CCTGGAGAAC GAAAAGATCA TCTTCGATGT GATCAACGTT
430 440 450 460 470 480
TACAAGAGCG CGGGTAAGAA AGTTCTGCTG TATCTGAACA CCGCGGGTCC GACCCATGCG
490 500 510 520 530 540
GCGGACCGTA ACAGCCCGGA AATTCAGGAT GCGTGGGACG ATTACGTGAA CACCAACTGG
550 560 570 580 590 600
AACGGTGACC ACGGTGCGGC GTGGCGTAAC CTGGTGGAGG GTTATGCGAA GCGTTTCAAA
610 620 630 640 650 660
GGTCTGGTTG ACGGCTTTTG GCTGGATAAC AGCAAGAACA TGGCGGGTGG CCAAAAAGAG
670 680 690 700 710 720
ATTCCGGAAT TCGTGGCGAT GCTGCGTGAC ATTGATCCGA GCTTTGCGAT CGGTGTTAAC
730 740 750 760 770 780
TACGAAACCC ACTATTTCGA GGACGAAGAT GGCAACTACC TGAAGGTTGC GAGCGACAGC
790 800 810 820 830 840
ATCGACGATA ACGACGATCG TGAATACAAG ATCATTAAAC ACGTGGTTAC CAACGAGTAT
850 860 870 880 890 900
ATGGATTTCA CCAACGGTCA TGTGACCCCG ATGGGTCAAG GTGCTCCGCC GAACAGCTGG
910 920 930 940 950 960
GGCTACGAGG AATATACCAT TCCGCACATG ATCGAAAAAC CGTGGGACAG CGTTGATGGT
970 980 990 1000 1010 1020
AACCACTATG CGCTGATGCA CGGCTGGTTC CCGATTCGTT TTAGCTGGAG CGGTAGCGGC
1030 1040 1050 1060 1070 1080
GCGGAGCTGA TGTTCGAAAC CGAACAGGCG TACCGTTTTG TTCGTACCAT TACCGATGGT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
GGCGCGGCGA TGACCTGGAG CACCACCCAA AAGAAAGGTT ATATGAGCGC GGACGAAATG
1150 1160 1170 1180 1190 1200
GATATCATGA TTGAGATCAA CAACCGTATG ACCCAAGCGC CGAAGCTGGA TTACGAGGCG
1210 1220 1230 1240
TATGAACGTC CGGAGGGTGC GTACCTGGTT GGCGAGATCG AATAA
표 1E: 천연 P5AFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 아미노산 서열, SEQ ID NO. 5
10 20 30 40 50 60
MLISVTVLVG CGSSSDEVES TNTTDSYNIN NTEATGIEYN ASWMAGTWGI TQRVDGGYKL
70 80 90 100 110 120
DNSADSSNWQ AGAEEIVTNI PAAEYVITSF THPAHGHLFT LRTNNNVDVS AIHPDMVPTL
130 140 150 160 170 180
ENEKIILDVI NIYRAAGKKV ILYLNSAGPS MAEERGDTDI QAAWDEYYIN EWDGDEAAAW
190 200 210 220 230 240
RNLARGYVER FDGLVDGYWL DNSRNLPGEV SDFVAMLRSV DPELTIAVNY DQHYFTDDNG
250 260 270 280 290 300
EYLYVDSDGL DDEDESDYKI VKHVVTNEYM DFTNGHVTPL GRGAPPNSWA YEEYTIPDMI
310 320 330 340 350 360
EVPWETYDGS KYALKHGWFP IRNSWSGSKA ELMFDVEQAY RFVRTVTDGG AAMTWSTTQD
370 380 390 400
NGYMTADEMS IMIEISNRMT QTPKPDYSVY ERPKGAYLVS EIE
표 1F: 합성 P5AFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 아미노산 서열, SEQ ID NO. 6
10 20 30 40 50 60
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MGSSSDEVES TNTTDSYNIN NTEATGIEYN ASWMAGTWGI
70 80 90 100 110 120
TQRVDGGYKL DNSADSSNWQ AGAEEIVTNI PAAEYVITSF THPAHGHLFT LRTNNNVDVS
130 140 150 160 170 180
AIHPDMVPTL ENEKIILDVI NIYRAAGKKV ILYLNSAGPS MAEERGDTDI QAAWDEYYIN
190 200 210 220 230 240
EWDGDEAAAW RNLARGYVER FDGLVDGYWL DNSRNLPGEV SDFVAMLRSV DPELTIAVNY
250 260 270 280 290 300
DQHYFTDDNG EYLYVDSDGL DDEDESDYKI VKHVVTNEYM DFTNGHVTPL GRGAPPNSWA
310 320 330 340 350 360
YEEYTIPDMI EVPWETYDGS KYALKHGWFP IRNSWSGSKA ELMFDVEQAY RFVRTVTDGG
370 380 390 400 410
AAMTWSTTQD NGYMTADEMS IMIEISNRMT QTPKPDYSVY ERPKGAYLVS EIE
표 1G: 천연 P19DFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 아미노산 서열, SEQ ID NO. 7
10 20 30 40 50 60
MLIGCGGSSA NQTQSTSDQD SSEVNETVSL DSEYTANWMA GAWGITQRVD GGYKLDASVE
70 80 90 100 110 120
TGKYDWVAGA EEIVENIPSA GYVITSFTHP AHGFLYTLRD NENVDVAAIH PDMVPSLENE
130 140 150 160 170 180
KIIFDVINVY KSAGKKVLLY LNTAGPTHAA DRNSPEIQDA WDDYVNTNWN GDHGAAWRNL
190 200 210 220 230 240
VEGYAKRFKG LVDGFWLDNS KNMAGGQKEI PEFVAMLRDI DPSFAIGVNY ETHYFEDEDG
250 260 270 280 290 300
NYLKVASDSI DDNDDREYKI IKHVVTNEYM DFTNGHVTPM GQGAPPNSWG YEEYTIPHMI
310 320 330 340 350 360
EKPWDSVDGN HYALMHGWFP IRFSWSGSGA ELMFETEQAY RFVRTITDGG AAMTWSTTQK
370 380 390 400
KGYMSADEMD IMIEINNRMT QAPKLDYEAY ERPEGAYLVG EIE
표 1H: 합성 P19DFcnA 푸카나제를 코딩하는데 사용되는 푸카나제-유전자에 대한 아미노산 서열, SEQ ID NO. 8
10 20 30 40 50 60
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MNQTQSTSDQ DSSEVNETVS LDSEYTANWM AGAWGITQRV
70 80 90 100 110 120
DGGYKLDASV ETGKYDWVAG AEEIVENIPS AGYVITSFTH PAHGFLYTLR DNENVDVAAI
130 140 150 160 170 180
HPDMVPSLEN EKIIFDVINV YKSAGKKVLL YLNTAGPTHA ADRNSPEIQD AWDDYVNTNW
190 200 210 220 230 240
NGDHGAAWRN LVEGYAKRFK GLVDGFWLDN SKNMAGGQKE IPEFVAMLRD IDPSFAIGVN
250 260 270 280 290 300
YETHYFEDED GNYLKVASDS IDDNDDREYK IIKHVVTNEY MDFTNGHVTP MGQGAPPNSW
310 320 330 340 350 360
GYEEYTIPHM IEKPWDSVDG NHYALMHGWF PIRFSWSGSG AELMFETEQA YRFVRTITDG
370 380 390 400 410
GAAMTWSTTQ KKGYMSADEM DIMIEINNRM TQAPKLDYEA YERPEGAYLV GEIE
푸칸의 효소 가수분해
도 1의 순서도는 공급원료 푸칸 조성물에 비해 원하는 저분자량 푸칸 조성물을 얻기 위한, 즉 공급원료 푸칸 조성물의 효소 가수분해에 의해 이 조성물내 푸칸의 평균 분자량을 감소시키기 위한 방법(100)의 일례를 보여준다. 이 예시적이고 비 제한적인 방법은 다음 단계들을 포함한다: 수용액(즉, 인공적이고 일반적으로 완충된 용액)에 공급원료 푸칸 조성물을 제공하는 단계(110); 상기 공급원료 푸칸 조성물을 푸카나제와 함께 용액에서 배양하여 가수분해된 푸칸 조성물, 푸카나제 및 가수분해 잔류 분자를 포함하는 용액을 생성하는 단계(120); 및 가수분해된 푸칸 조성물을 포함하는 용액을 가수분해 잔류 분자 및 푸카나제로부터 분리하여 원하는 저분자량 푸칸 조성물을 얻는 단계(130).
공급원료 푸칸 조성물을 제공하는 단계(110)에서 Adenocystis utricularis, Ascophyllum nodosum, Chorda filum, Cystoseirabies marina, Durvillaea antarctica, Ecklonia kurome, Ecklonia maxima, Eisenia bicymax, Fucus evanescens, Fucus vesiculosis, Hizikia fusiforme, Himanthalia Elongata, Kjellmaniella crassifolia, Laminaria brasiliensis, Laminaria cichorioides, Laminaria hyperborea, Laminaria japonica, Laminaria saccharina, Lessonia trabeculata, Macrocysculata, Saccharelvea, Macrocystis, pyrifera, Pelinaphystis , Sargassum thunbergii, Sargassum confusum, Sargassum fusiforme 및 Undaria pinnatifida 중의 적어도 하나로부터 추출된 푸칸/공급원료 후코이딘 조성물을 제공할 수 있다. 특정 실시예에서는, 푸칸을 Saccharina japonica, Laminaria hyperborea, Macrocystis pyifera 및 Chorda Filum 중 하나 이상으로부터 얻을 수 있다.
수용액에 공급원료 푸칸 조성물을 제공하는 단계(100)에서 용액에 약 0.01% w/v 내지 약 30% w/v의 푸칸 농도로 공급원료 푸칸 조성물을 제공할 수 있다. 수용액에 공급원료 푸칸 조성물을 제공할 때 용액에 약 0.05% w/v 내지 약 10% w/v의 푸칸 농도로 공급원료 푸칸 조성물을 제공할 수 있다. 수용액에 공급원료 푸칸 조성물을 제공할 때 용액에 약 0.1% w/v 내지 약 5% w/v의 푸칸 농도로 공급원료 푸칸 조성물을 제공할 수도 있다.
수용액에 공급원료 푸칸 조성물을 제공하는 단계에서 인산일나트륨, 인산이나트륨, 인산삼나트륨, 인산완충액, 인산 완충식염수, 트리신 완충액, 붕산염 완충액, 트리스아미노메탄 완충액(트리스 완충액이라고도 함), 염화나트륨, Trizma™ 완충액, 베타-히드록시-4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산(HEPPSO라고도 함) 완충액, 피페라진-1,4-bis(2-히드록시프로파네설폰산) 디히드레이트(POPSO라고도 함) 완충액, 트리에탄올아민(TEA) 완충액, 3-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]프로판-1-설 폰산 (EPPS) 완충액, 글리신 완충액, N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N '-(4-부탄설폰산) (HEPBS) 완충액, 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산(HEPES) 완충액, [트리스(히드록시메틸)메틸아미노]프로판설폰산(TAPS) 완충액, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD라고도 함) 완충액, N-tris(히드록시메틸)메틸-4-아미노-부탄설폰산(TABS라고도 함) 완충액, N-(1,1-디메틸-2-히드록시에틸)-3-아미노-2-히드록시-프로판설폰산(AMPSO) 완충액, 2-(시클로헥실아미노)에탄설폰산(CHES) 완충액, 3-(시클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판-술폰산(CAPSO) 완충액, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP라고도 함) 완충액, 3-(시클로헥실아미노)-1-프로판-술폰산(CAPS) 완충액, 4-(시클로헥실아미노)-1-부탄술폰산(CABS) 완충액, 시트레이트 완충액, 시트레이트-포스페이트 완충액, 탄산나트륨-중탄산 완충액 및 중탄산암모늄 중 하나 이상을 포함하는 용액에 공급원료 푸칸 조성물을 제공할 수 있다. 완충 용액의 pH는 약산성 내지 약 염기성이고, 예를 들어 약 5.5-10.5, 6.5-9.0, 7.5-8.8 또는 8.0-8.5의 pH를 가질 수 있다.
푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 사이크로모나스 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양할 수 있다. 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 대장균으로 생산된 재조합 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양할 수도 있다. 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 P5AFcnA 및 P19DFcnA 푸카나제, 예를 들어 합성으로 생산된 비천연 P5AFcnA 및 P19DFcnA 푸카나제 중의 적어도 하나 또는 둘 모두와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양할 수도 있다. 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 대장균이나 사이크로모나스 종, 또는 다른 적합한 원핵이나 진핵 숙주/생산 종에 의해 푸카나제 유전자나 변형된 푸카나제 유전자로부터 번역된 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양할 수도 있다. 본원의 방법은 5 % 미만의 코돈이 치환 된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 4 중의 적어도 하나의 푸카나제-유전자 서열을 발현하여 효소를 생산하는 것을 포함할 수 있다. 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 천연 P5AFcnA 서열, SEQ ID NO. 1과 5의 적어도1, 3 또는 5 개이되 1 %, 3 % 또는 5 % 미만의 코돈이나 아미노산이 각각 치환되는 서열로 코딩된 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양할 수도 있다. 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 천연 P19DFcnA 서열, SEQ ID NO. 3과 7의 적어도 1, 3 또는 5 개이되 1 %, 3 % 또는 5 % 미만의 코돈이나 아미노산이 각각 치환되는 서열로 코딩된 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양할 수도 있다. 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 합성 P19DFcnA 서열, SEQ ID NO. 4와 8의 1 %, 3 % 또는 5 % 미만의 코돈이 각각 치환되는 서열로 코딩된 푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양할 수도 있다.
푸카나제와 함께 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계(120)에서 공급원료 푸칸 조성물-푸카나제 혼합물을 약 0℃ 내지 60℃, 약 15℃ 내지 40℃, 약 20℃로, 예를 들어 약 23℃, 25℃ 및 27℃ 정도로 유지할 수 있다.
배양 단계(120)에서, 예를 들어 공급원료 푸칸 조성물-푸카나제 혼합물을 배양기간 내내 적어도 1분간 교반, 진탕, 흔들기 또는 혼합할 수도 있다.
이런 배양 단계(120)에서, 공급원료 푸칸 조성물-푸카나제 혼합물을 약 30분 내지 300시간, 약 1 시간 내지 100시간, 약 2 시간 내지 50 시간 동안, 약 3시간 내지 24시간, 예를 들어 약 5 시간, 약 10 시간, 약 15 시간 및 약 20 시간 배양할 수 있다.
또, 이런 배양단계(120)에서, 푸칸 조성물에서 원하는 분자량을 얻을 때까지 공급원료 푸칸 조성물-푸카나제 혼합물을 배양할 수도 있다. 또, 배양 단계(120)에서, 푸칸 조성물의 평균 분자량이 적어도 약 5%나 10% 감소나, 적어도 약 20% 감소될 때까지 예를 들면 푸칸 조성물의 평균 분자량 감소가 약 40%, 약 50% 또는 약60 % 될 때까지 공급원료 푸칸 조성물-푸카나제 혼합물을 배양할 수도 있다. 또, 배양단계(120)에서, 공급원료 푸칸 조성물의 푸칸에서의 글리코시드 결합의 적어도 5 % 또는 10 %, 적어도20 %가 가수분해 될 때까지, 예를들면 약 40 %, 약 50 % 및 약 60 %가 가수분해 될 때까지 공급원료 푸칸 조성물-푸카나제 혼합물을 배양할 수도 있다.
가수분해 잔류 분자 및 푸카나제로부터 가수분해된 푸칸 조성물을 포함한 용액을 분리하는 단계(130)에서, 분리 전에 가수분해를 끝내기 위해 가수분해된 푸칸 조성물을 포함한 용액내의 푸카나제를 급냉제로 급냉할할 수 있다. 용액내 푸카나제를 급냉하면 용액을 알칼리성으로 만들 수 있다. 용액을 알칼리성으로 만들면 용액의 p를 약 9-14 정도로 높일 수 있다. 용액을 알칼리성으로 만들 때 NaOH, KOH 및 LiOH 중 하나 이상을 용액에 첨가할 수 있다. 상기 급냉은 용액을 60-100℃ 사이, 예를 들어 약 80℃ 이상으로 가열하는 것을 포함 하거나, 에탄올, 이소프로판올, 프로판올 및 메탄올 중 적어도 하나의 침전제로 푸카나제를 침전시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 분리단계(130)에서, 접촉유동여과(TFF; tangential flow filtration) 필터를 통해 용액을 초여과(diafilter)할 수 있다. 초여과는 가수분해된 푸칸 조성물을 포함한 용액을 원하는 푸칸 조성물내의 원하는 분자량보다 작은 분자량 컷오프를 갖는 TFF 필터 로 여과하는 것을 포함한다. 초여과는 5kDa, 10kDa, 30kDa, 50kDa, 70kDa 또는 100kDa 분자량 컷오프 중의 어느 하나를 갖는 TFF 필터를 통해 용액내 공급원료 푸칸 조성물을 여과하는 것을 포함할 수 있다. 이런 분리단계(130)가 원심분리, 여과 및 침강 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
실시예
도 1에서 설명한 방법을 Saccharina japonica, Ascophyllum nodosum, Pelvetia canaliculata, Fucus vesiculosus, Laminaria hyperborea 및 Macrocystis pyifer에서 추출한 개별 공급원료 후코이단 조성물에 적용했다. 사용된 푸카나제는 전술한 MfFcnA 푸카나제 (Colin, 2006) 및 전술한 바와 같이 수득된 P5AFcnA 및 P19DFcnA 푸카나제였다. 공급원료 후코이단 조성물은 0.5M NaCl과 함께 pH 8.5의 20mM 트리스 완충액에 약 0.1 내지 0.2% w/v로 용해되었다. 0.5M NaCl과 함께 pH 8.5에서 동일한 트리스 완충액에 있는 MfFcnA, P5AFcnA 또는 P19DFcnA의 용액 29μM를 독립적으로 첨가하여 공급원료 후코이단 조성물의 개별 용액을 10μM 푸카나제의 최종 농도에 첨가했다. 공급원료 후코이단 조성물-푸카나제 혼합물은 모두 100rpm의 회전진탕기에서 25℃로 15 시간 동안 배양되었다.
15 시간 후, 각각의 개별 공급원료 후코이단 조성물-푸카나제 혼합물에서의 가수분해의 발생을 탄수화물-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(C-PAGE) 기술을 이용해 분석했다: 가수분해된 후코이단 조성물-푸카나제 혼합물 10 μL를 로딩 염료 10μL (물속에10% v/v 글리세롤, 0.01% w/v 브로모페놀 블루)와 혼합했다. 생성된 혼합물을 먼저 15 분 동안 100 볼트의 전압에서, 두번째로 20분 동안 150 볼트의 전압에서, 마지막으로 20 분 동안 200 볼트의 전압에서 얼음 위에 흐르는 24% w/v C-PAGE 겔에 로드했다.
C-PAGE 분석의 결과는 가수분해의 발생을 평가한 하기 표 2와 같다. C-PAGE 겔에서의 가수분해의 부재 및 가수분해의 존재의 예를 도 2A, 도 2B 및 도 2C에 보여준다. 표에서 '+'는 겔에서 푸칸 조성물의 가수분해가 관찰 된 곳, '-'는 겔에서 푸칸 조성물의 가수분해가 관찰되지 않은 곳, '+/-'는 최소 가수분해가 관찰된 곳을 의미한다.
공급원료 후코이단 조성물의 공급원 MfFcnA P5AFcnA P19DFcnA
Saccharina japonica - + +
Ascophyllum nodosum + - -
Pelvetia canaliculata + - -
Fucus vesiculosus +/- - -
Laminaria hyperborea - + +
Macrocystis pyifera - + +
표 2. 3가지 푸코나제를 이용한 후코이단의 효소 가수분해
도 1에서 설명한 방법을 상이한 조건하에 마크로시스티스 피리페라, 코다 필룸, 아스코필룸 노도섬, 라미나리아 하이퍼보레아, 사카리나 자포니카 및 푸쿠스 베시큘로서스의 상이한 공급원으로부터 추출된 개별 공급원료 후코이단 조성물에 적용했다. 공급원료 후코이단 조성물을 0.25% w/v로 용해시키고 1μM의 동일한 푸카나제와 함께 실온에서 40시간 동안 배양했다. 동일한 트리스 완충액 조성물을 사용하여 pH 8.0으로 조정했다.
C-PAGE에 대한 분석 결과가 가수분해의 발생을 평가한 아래 표 3에 나와있다. 표에서 '+'는 겔에서 푸칸 조성물의 가수분해가 관찰된 곳, '-'는 겔에서 푸칸 조성물의 가수분해가 관찰되지 않은 곳, '+/-'는 최소 가수분해가 관찰된 곳을 의미한다.
공급원료 후코이단 조성물의 공급원 MfFcnA P5AFcnA P19DFcnA
Macrocystis pyifera - + +
Chorda filum + +/- +/-
Ascophylum nodosum + - -
Laminaria hyperborea - + +
Saccharina japonica +/- +/- +/-
Fucus vesiculosus - - -
표 3. 3가지 푸코나제를 이용한 후코이단의 효소 가수분해
표 2, 3은 도 2A, 도 2B 및 도 2C와 함께 P5AFcnA 푸카나제와 P19DFcnA 푸카나제가 전술한 MfFcnA 푸카나제와 비교해 다른 효소 활성을 보임을 나타낸다. P5AFcnA 푸카나제와 P19DFcnA 푸카나제는 Laminaria hyperborea 및 Macrocystis pyifera에서 추출한 후코이단을 효소적으로 분해하고 Saccharina japonica를 더 많이 분해할 수 있지만, MfFcnA 푸카나제는 이를 달성할 수 없다. 실행된 두 개의 개별 실험 간의 결과의 변동성은 동일한 종의 다른 출처에서 추출된 후코이단이 지리적이나 계절적 변동에 따라 좌우되는 백본 구조에서 약간의 차이를 보일 수 있다는 사실을 나타낸다.
본 출원은 추가로 본 명세서에서 논의 된 방법, 시스템 등의 다양한 요소에 따라 제조된 푸칸 조성물 뿐만 아니라 이 조성물을 사용하는 방법 및 이를 수행하도록 구성된 시스템 및 장치 등에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 모든 용어는 문맥 또는 정의에서 달리 명시하지 않는한 일반적인 의미로 사용된다. 또한, 별도로 명시하지 않는한, 명세서에서 "또는"의 사용은 "및"을 포함하고 그 반대의 경우도 마찬가지다. 비제한적인 용어는 명시적으로 언급되지 않는한 제한적인 것으로 해석되어서는 안되며, 문맥상 달리 명시하지 않는 경우 (예를 들어, "포함하는", "갖는" 및 "포함하는"은 일반적으로 "제한없이 포함하는"을 나타냄)). "a", "an"및 "the"와 같은 청구 범위를 포함하는 단수 형태는 명시적으로 언급되지 않는한 복수 참조를 포함하거나, 문맥이 명확하게 나타내지 않는한 달리 표시한다.
달리 명시되지 않는한, 본 명세서에서 "실질적으로" 및 "약"과 같은 형용사는 실시예의 특징, 특징의 조건 또는 관계 특성을 수정하는 것으로, 조건이나 특성은 의도된 적용을 위한 실시예의 작동에 허용되는 허용범위내로 정의됨을 나타낸다.
본 발명의 방법, 구성, 시스템 등의 범위는 수단 플러스 기능 및 단계 플러스 기능 개념을 모두 포함한다. 그러나, "수단"이란 단어가 청구범위에서 구체적으로 언급되지 않는한 청구범위는 "의미 플러스 기능"관계를 나타내는 것으로 해석되어서는 안되며, "수단"이란 단어가 청구범위에 구체적으로 언급되어 있으면 "수단 플러스 기능"관계를 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 마찬가지로, "단계"란 단어가 청구에서 구체적으로 언급되지 않는한, 청구범위는 "단계 플러스 기능"관계를 나타내는 것으로 해석되어서는 안되며, "단계"가 청구범위에 구체적으로 언급되어 있으면 "단계 플러스 기능"관계를 나타내는 것으로 해석되어야 한다.
이상으로부터, 특정 실시예가 예시의 목적으로 본 명세서에서 논의되었지만, 본 명세서에서의 논의의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 시스템 및 방법 등은 여기 설명된 주제의 모든 순열 및 조합뿐만 아니라 그러한 수정을 포함하고 첨부 된 청구범위나 여기의 논의 및 도면에서 적절한 지원을 받는 다른 청구항에 의한 경우를 제외하고는 제한되지 않는다.
100 공급원료 푸칸 조성물의 효소 가수분해에 의해 공급원료 푸칸 조성물에 비해 원하는 저분자량 푸칸 조성물을 얻는 방법.
110 수용액에 공급원료 푸칸 조성물 제공하는 단계.
120 가수분해된 푸칸 조성물, 푸카나제 및 가수분해 잔류 분자를 포함하는 용액을 생성하기 위해 푸카나제와 함께 용액에서 공급원료 푸칸 조성물을 배양하는 단계.
130 가수분해된 푸칸 조성물을 포함하는 용액을 가수분해 잔류 분자 및 푸카나제로부터 분리하여 원하는 분자량의 푸칸 조성물을 얻는 단계.
SEQUENCE LISTING <110> ARC Medical Devices Inc. <120> ENZYMATIC HYDROLYSIS OF FUCANS <130> 1946-023-05 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 1 atgttaattt cagttactgt tttagtaggc tgtggaagca gtagtgatga agttgagtct 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 2 acaaatacaa ctgactcata taacattaat aacacagaag cgactggtat tgaatacaat 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 3 gctagttgga tggcaggtac ttgggggatt acacaacgtg tagacggtgg ttataaattg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 4 gataactccg cagactcctc taattggcag gcaggtgcag aagaaattgt tactaacatt 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 5 cctgcggcag aatacgtcat aacatcattt acccacccag cgcacggtca cctattcaca 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 6 ttacgaacta ataataatgt ggatgtatca gcaattcacc ctgatatggt acccacatta 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 7 gaaaatgaaa aaatcattct tgatgttatt aatatatatc gcgctgcggg taaaaaagta 60 <210> 8 <211> 60 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DNA <213> bacterial <400> 56 ataaaacatg tagtgaccaa tgaatatatg gactttacta atggccatgt cactccaatg 60 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 57 ggacaaggtg ccccacctaa ttcttggggg tatgaagaat atacaatccc acacatgatt 60 <210> 58 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 58 gaaaaacctt gggatagtgt tgatggtaat cattatgcac ttatgcatgg ttggttccct 60 <210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 59 atcagattct cttggagcgg ttcaggtgct gagctcatgt ttgaaactga acaagcttat 60 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 60 cggtttgtcc gcacgatcac tgatggtggt gcagcaatga catggtcaac cactcaaaaa 60 <210> 61 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 61 aagggttata tgtcacgaga tgaaatggat ataatgattg aaattaacaa cagaatgaca 60 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> bacterial <400> 62 caagccccta aactagatta cgaagcttat gaaagaccag aaggggcata tttggttggt 60 <210> 63 <211> 12 <212> DNA <213> bacterial <400> 63 gaaatagaat aa 12 <210> 64 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 64 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 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bacterial <400> 72 gcggaccgta acagcccgga aattcaggat gcgtgggacg attacgtgaa caccaactgg 60 <210> 73 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 73 aacggtgacc acggtgcggc gtggcgtaac ctggtggagg gttatgcgaa gcgtttcaaa 60 <210> 74 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 74 ggtctggttg acggcttttg gctggataac agcaagaaca tggcgggtgg ccaaaaagag 60 <210> 75 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 75 attccggaat tcgtggcgat gctgcgtgac attgatccga gctttgcgat cggtgttaac 60 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 76 tacgaaaccc actatttcga ggacgaagat ggcaactacc tgaaggttgc gagcgacagc 60 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> modfied bacterial <400> 77 atcgacgata acgacgatcg tgaatacaag atcattaaac acgtggttac caacgagtat 60 <210> 78 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 78 atggatttca ccaacggtca tgtgaccccg atgggtcaag gtgctccgcc gaacagctgg 60 <210> 79 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 79 ggctacgagg aatataccat tccgcacatg atcgaaaaac cgtgggacag cgttgatggt 60 <210> 80 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 80 aaccactatg cgctgatgca cggctggttc ccgattcgtt ttagctggag cggtagcggc 60 <210> 81 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 81 gcggagctga tgttcgaaac cgaacaggcg taccgttttg ttcgtaccat taccgatggt 60 <210> 82 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 82 ggcgcggcga tgacctggag caccacccaa aagaaaggtt atatgagcgc ggacgaaatg 60 <210> 83 <211> 60 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 83 gatatcatga ttgagatcaa caaccgtatg acccaagcgc cgaagctgga ttacgaggcg 60 <210> 84 <211> 45 <212> DNA <213> modified bacterial <400> 84 tatgaacgtc cggagggtgc gtacctggtt ggcgagatcg aataa 45 <210> 85 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 85 Met Leu Ile Ser Val Thr Val Leu Val Gly Cys Gly Ser Ser Ser Asp 1 5 10 15 Glu Val Glu Ser Thr Asn Thr Thr Asp Ser Tyr Asn Ile Asn Asn Thr 20 25 30 Glu Ala Thr Gly Ile Glu Tyr Asn Ala Ser Trp Met Ala Gly Thr Trp 35 40 45 Gly Ile Thr Gln Arg Val Asp Gly Gly Tyr Lys Leu 50 55 60 <210> 86 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 86 Asp Asn Ser Ala Asp Ser Ser Asn Trp Gln Ala Gly Ala Glu Glu Ile 1 5 10 15 Val Thr Asn Ile Pro Ala Ala Glu Tyr Val Ile Thr Ser Phe Thr His 20 25 30 Pro Ala His Gly His Leu Phe Thr Leu Arg Thr Asn Asn Asn Val Asp 35 40 45 Val Ser Ala Ile His Pro Asp Met Tyr Pro Thr Leu 50 55 60 <210> 87 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 87 Glu Asn Glu Lys Ile Ile Leu Asp Val Ile Asn Ile Tyr Arg Ala Ala 1 5 10 15 Gly Lys Lys Val Ile Leu Tyr Leu Asn Ser Ala Asp Pro Ser Met Ala 20 25 30 Glu Glu Arg Gly Asp Thr Asp Ile Gln Ala Ala Trp Asp Glu Tyr Tyr 35 40 45 Ile Asn Glu Trp Asp Gly Asp Glu Ala Ala Ala Trp 50 55 60 <210> 88 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 88 Arg Asn Leu Ala Arg Gly Tyr Val Glu Arg Phe Asp Gly Leu Val Asp 1 5 10 15 Gly Tyr Trp Ile Leu Asp Asn Ser Arg Asn Leu Pro Gly Glu Val Ser 20 25 30 Asp Phe Val Ala Met Leu Arg Ser Val Asp Pro Glu Leu Thr Ile Ala 35 40 45 Val Asn Tyr Asp His Tyr Phe Thr Asp Asp Asn Gly 50 55 60 <210> 89 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 89 Glu Tyr Leu Tyr Val Asp Ser Asp Gly Leu Asp Asp Glu Asp Glu Ser 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Ile Val Lys His Val Val Thr Asn Glu Tyr Met Asp Phe 20 25 30 Thr Asn Gly His Val Thr Pro Leu Gly Arg Gly Ala Pro Pro Asn Ser 35 40 45 Trp Ala Tyr Glu Glu Asp Thr Ile Pro Asp Met Ile 50 55 60 <210> 90 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 90 Glu Val Pro Trp Glu Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Tyr Ala Leu Lys His 1 5 10 15 Gly Trp Phe Pro Ile Arg Asn Ser Trp Ser Gly Ser Lys Ala Glu Leu 20 25 30 Met Phe Asp Val Glu Gln Ala Tyr Arg Phe Val Arg Thr Val Thr Asp 35 40 45 Gly Gly Ala Ala Met Thr Trp Ser Thr Thr Gln Asp 50 55 60 <210> 91 <211> 43 <212> PRT <213> amino acid <400> 91 Asn Gly Tyr Met Thr Ala Asp Glu Met Ser Ile Met Ile Glu Ile Ser 1 5 10 15 Asn Arg Met Thr Gln Thr Pro Lys Pro Asp Tyr Ser Val Tyr Glu Arg 20 25 30 Pro Lys Gly Ala Tyr Leu Val Ser Glu Ile Glu 35 40 <210> 92 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 92 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Gly Ser Ser Ser Asp Glu Val Glu Ser Thr Asn 20 25 30 Thr Thr Asp Ser Tyr Asn Ile Asn Asn Thr Glu Ala Thr Gly Ile Glu 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Trp Met Ala Gly Thr Trp Gly Ile 50 55 60 <210> 93 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 93 Thr Gln Arg Val Asp Gly Gly Tyr Lys Leu Asp Asn Ser Ala Asp Ser 1 5 10 15 Ser Asn Trp Gln Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Thr Asn Ile Pro Ala 20 25 30 Ala Glu Tyr Val Ile Thr Ser Phe Thr His Pro Ala His Gly His Leu 35 40 45 Phe Thr Leu Arg Thr Asn Asn Asn Val Asp Val Ser 50 55 60 <210> 94 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 94 Ala Ile His Pro Asp Met Val Pro Thr Leu Glu Asn Glu Lys Ile Ile 1 5 10 15 Leu Asp Val Ile Asn Ile Tyr Arg Ala Ala Gly Lys Lys Val Ile Leu 20 25 30 Tyr Leu Asn Ser Ala Gly Pro Ser Met Ala Glu Glu Arg Gly Asp Thr 35 40 45 Asp Ile Gln Ala Ala Trp Asp Glu Tyr Tyr Ile Asn 50 55 60 <210> 95 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 95 Glu Trp Asp Gly Asp Glu Ala Ala Ala Trp Arg Asn Leu Ala Arg Gly 1 5 10 15 Tyr Val Glu Arg Phe Asp Gly Leu Val Asp Gly Tyr Trp Leu Asp Asn 20 25 30 Ser Arg Asn Leu Pro Gly Glu Val Ser Asp Phe Val Ala Met Leu Arg 35 40 45 Ser Val Asp Pro Glu Leu Thr Ile Ala Val Asn Tyr 50 55 60 <210> 96 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 96 Asp Gln His Tyr Phe Thr Asp Asp Asn Gly Glu Tyr Leu Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Asp Gly Leu Asp Asp Glu Asp Glu Ser Asp Tyr Lys Ile Val Lys 20 25 30 His Val Val Thr Asn Glu Tyr Met Asp Phe Thr Asn Gly His Val Thr 35 40 45 Pro Leu Gly Arg Gly Ala Pro Pro Asn Ser Trp Ala 50 55 60 <210> 97 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 97 Tyr Glu Glu Tyr Thr Ile Pro Asp Met Ile Glu Val Pro Trp Glu Thr 1 5 10 15 Tyr Asp Gly Ser Lys Tyr Ala Leu Lys His Gly Trp Phe Pro Ile Arg 20 25 30 Asn Ser Trp Ser Gly Ser Lys Ala Glu Leu Met Phe Asp Val Glu Gln 35 40 45 Ala Tyr Arg Phe Val Arg Thr Val Thr Asp Gly Gly 50 55 60 <210> 98 <211> 53 <212> PRT <213> amino acid <400> 98 Ala Ala Met Thr Trp Ser Thr Thr Gln Asp Asn Gly Tyr Met Thr Ala 1 5 10 15 Asp Glu Met Ser Ile Met Ile Glu Ile Ser Asn Arg Met Thr Gln Thr 20 25 30 Pro Lys Pro Asp Tyr Ser Val Tyr Glu Arg Pro Lys Gly Ala Tyr Leu 35 40 45 Val Ser Glu Ile Glu 50 <210> 99 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 99 Met Leu Ile Gly Cys Gly Gly Ser Ser Ala Asn Gln Thr Gln Ser Thr 1 5 10 15 Ser Asp Gln Asp Ser Ser Glu Val Asn Glu Thr Val Ser Leu Asp Ser 20 25 30 Glu Tyr Thr Ala Asn Trp Met Ala Gly Ala Trp Gly Ile Thr Gln Arg 35 40 45 Val Asp Gly Gly Tyr Lys Leu Asp Ala Ser Val Glu 50 55 60 <210> 100 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 100 Thr Gly Lys Tyr Asp Trp Val Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Glu Asn 1 5 10 15 Ile Pro Ser Ala Gly Tyr Val Ile Thr Ser Phe Thr His Pro Ala His 20 25 30 Gly Phe Leu Tyr Thr Leu Arg Asp Asn Glu Asn Val Asp Val Ala Ala 35 40 45 Ile His Pro Asp Met Val Pro Ser Leu Glu Asn Glu 50 55 60 <210> 101 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 101 Lys Ile Ile Phe Asp Val Ile Asn Val Tyr Lys Ser Ala Gly Lys Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Tyr Leu Asn Thr Ala Gly Pro Thr His Ala Ala Asp Arg 20 25 30 Asn Ser Pro Glu Ile Gln Asp Ala Trp Asp Asp Tyr Val Asn Thr Asn 35 40 45 Trp Asn Gly Asp His Gly Ala Ala Trp Arg Asn Leu 50 55 60 <210> 102 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 102 Val Glu Gly Tyr Ala Lys Arg Phe Lys Gly Leu Val Asp Gly Phe Trp 1 5 10 15 Leu Asp Asn Ser Lys Asn Met Ala Gly Gly Gln Lys Glu Ile Pro Glu 20 25 30 Phe Val Ala Met Leu Arg Asp Ile Asp Pro Ser Phe Ala Ile Gly Val 35 40 45 Asn Tyr Glu Thr His Tyr Phe Glu Asp Glu Asp Gly 50 55 60 <210> 103 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 103 Asn Tyr Leu Lys Val Ala Ser Asp Ser Ile Asp Asp Asn Asp Asp Arg 1 5 10 15 Glu Tyr Lys Ile Ile Lys His Val Val Thr Asn Glu Tyr Met Asp Phe 20 25 30 Thr Asn Gly His Val Thr Pro Met Gly Gln Gly Ala Pro Pro Asn Ser 35 40 45 Trp Gly Tyr Glu Glu Tyr Thr Ile Pro His Met Ile 50 55 60 <210> 104 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 104 Glu Lys Pro Trp Asp Ser Val Asp Gly Asn His Tyr Ala Leu Met His 1 5 10 15 Gly Trp Phe Pro Ile Arg Phe Ser Trp Ser Gly Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Met Phe Glu Thr Glu Gln Ala Tyr Arg Phe Val Arg Thr Ile Thr Asp 35 40 45 Gly Gly Ala Ala Met Thr Trp Ser Thr Thr Gln Lys 50 55 60 <210> 105 <211> 43 <212> PRT <213> amino acid <400> 105 Lys Gly Tyr Met Ser Ala Asp Glu Met Asp Ile Met Ile Glu Ile Asn 1 5 10 15 Asn Arg Met Thr Gln Ala Pro Lys Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr Glu Arg 20 25 30 Pro Glu Gly Ala Tyr Leu Val Gly Glu Ile Glu 35 40 <210> 106 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 106 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Asn Gln Thr Gln Ser Thr Ser Asp Gln Asp Ser 20 25 30 Ser Glu Val Asn Glu Thr Val Ser Leu Asp Ser Glu Tyr Thr Ala Asn 35 40 45 Trp Met Ala Gly Ala Trp Gly Ile Thr Gln Arg Val 50 55 60 <210> 107 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 107 Asp Gly Gly Tyr Lys Leu Asp Ala Ser Val Glu Thr Gly Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Trp Val Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Glu Asn Ile Pro Ser Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Ile Thr Ser Phe Thr His Pro Ala His Gly Phe Leu Tyr Thr 35 40 45 Leu Arg Asp Asn Glu Asn Val Asp Val Ala Ala Ile 50 55 60 <210> 108 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 108 His Pro Asp Met Val Pro Ser Leu Glu Asn Glu Lys Ile Ile Phe Asp 1 5 10 15 Val Ile Asn Val Tyr Lys Ser Ala Gly Lys Lys Val Leu Leu Tyr Leu 20 25 30 Asn Thr Ala Gly Pro Thr His Ala Ala Asp Arg Asn Ser Pro Glu Ile 35 40 45 Gln Asp Ala Trp Asp Asp Tyr Val Asn Thr Asn Trp 50 55 60 <210> 109 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 109 Asn Gly Asp His Gly Ala Ala Trp Arg Asn Leu Val Glu Gly Tyr Ala 1 5 10 15 Lys Arg Phe Lys Gly Leu Val Asp Gly Phe Trp Leu Asp Asn Ser Lys 20 25 30 Asn Met Ala Gly Gly Gln Lys Glu Ile Pro Glu Phe Val Ala Met Leu 35 40 45 Arg Asp Ile Asp Pro Ser Phe Ala Ile Gly Val Asn 50 55 60 <210> 110 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 110 Tyr Glu Thr His Tyr Phe Glu Asp Glu Asp Gly Asn Tyr Leu Lys Val 1 5 10 15 Ala Ser Asp Ser Ile Asp Asp Asn Asp Asp Arg Glu Tyr Lys Ile Ile 20 25 30 Lys His Val Val Thr Asn Glu Tyr Met Asp Phe Thr Asn Gly His Val 35 40 45 Thr Pro Met Gly Gln Gly Ala Pro Pro Asn Ser Trp 50 55 60 <210> 111 <211> 60 <212> PRT <213> amino acid <400> 111 Gly Tyr Glu Glu Tyr Thr Ile Pro His Met Ile Glu Lys Pro Trp Asp 1 5 10 15 Ser Val Asp Gly Asn His Tyr Ala Leu Met His Gly Trp Phe Pro Ile 20 25 30 Arg Phe Ser Trp Ser Gly Ser Gly Ala Glu Leu Met Phe Glu Thr Glu 35 40 45 Gln Ala Tyr Arg Phe Val Arg Thr Ile Thr Asp Gly 50 55 60 <210> 112 <211> 54 <212> PRT <213> amino acid <400> 112 Gly Ala Ala Met Thr Trp Ser Thr Thr Gln Lys Lys Gly Tyr Met Ser 1 5 10 15 Ala Asp Glu Met Asp Ile Met Ile Glu Ile Asn Asn Arg Met Thr Gln 20 25 30 Ala Pro Lys Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr Glu Arg Pro Glu Gly Ala Tyr 35 40 45 Leu Val Gly Glu Ile Glu 50

Claims (88)

  1. 수용액내 P5 AFcnA 푸카나제와 첨가된 푸칸을 포함하는 조성물.
  2. 수용액내 Pl9DFcnA 푸카나제와 첨가된 푸칸을 포함하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 첨가된 푸칸이 공급원료 푸칸인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 하나에 있어서, pH가 6.5~9.0인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 하나에 있어서, l5℃-40℃ 의 온도를 갖는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 하나에 있어서, 푸카나제가 푸칸내 글리코시드 결합을 가수분해하도록 하는 조건에 있는 조성물.
  7. 진핵 개체에 의해 생성되고, 5 % 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 또는SEQ ID NO. 4중의 어느 하나에 따른 유전자 서열에 의해 코딩되는 푸카나제.
  8. 사이크로모나스 종에 의해 생성되고, 적어도 하나의 코돈과 5 % 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 1 또는SEQ ID NO. 3중의 어느 하나에 따른 유전자 서열에 의해 코딩되는 푸카나제.
  9. 사이크로모나스 종에 의해 생성되고, 5 % 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 2 또는SEQ ID NO. 4중의 어느 하나에 따른 유전자 서열에 의해 코딩되는 푸카나제.
  10. 사이크로모나스 종에 의해 생성되고, 5 % 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 2 또는SEQ ID NO. 4중의 어느 하나에 따른 유전자 서열에 의해 코딩되는 푸카나제.
  11. 진핵 개체에 의해 생성되고, 5 % 미만의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 또는SEQ ID NO. 8중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 푸카나제.
  12. 사이크로모나스 종에 의해 생성되고, 적어도 하나의 아미노산과 아미노산과 5 % 미만의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO. 5 또는SEQ ID NO. 7중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 푸카나제.
  13. 사이크로모나스 종에 의해 생성되고, 5 % 미만의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO. 6 또는SEQ ID NO. 8중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 푸카나제.
  14. 사이크로모나스 종 이외의 다른 원핵 개체에 의해 생성되고, 5 % 미만의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 또는SEQ ID NO. 8중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 푸카나제.
  15. 제10항 또는 제14항에 있어서, 상기 원핵 개체가 E. Coli 인 푸카나제.
  16. 사이크로모나스 푸카나제를 이용해 인공 수용액에서 푸칸을 선택적으로 효소적으로 가수분해하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 사이크로모나스 푸카나제가 5 % 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 4중의 어느 하나에 따른 유전자 서열에 의해 코딩되는 방법.
  18. 18. 제16항에 있어서, 사이크로모나스 푸카나제가 3 % 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 4중의 어느 하나에 따른 유전자 서열에 의해 코딩되는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 사이크로모나스 푸카나제가 1 % 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 4중의 어느 하나에 따른 유전자 서열에 의해 코딩되는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 사이크로모나스 푸카나제가 5 % 미만의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 사이크로모나스 푸카나제가 3 % 미만의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  22. 제16항에 있어서, 사이크로모나스 푸카나제가 1 % 미만의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  23. 제16항에 있어서, 푸칸이 후코이단이고 아데노사이스티스 유트리큘라리스(Adenocystis utricularis), 해조추출물(Ascophyllum nodosum), 코르다필럼(Chorda filum), 시스토세리아비스 마리나(Cystoseirabies marina), 더빌리아 안타락티카(Durvillaea Antarctica), 검둥감태(Ecklonia kurome), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 대황(Eisenia bicyclis), 푸쿠스 에반에센스(Fucus evanescens), 푸쿠스 베시쿨로시스), 톳(Hizikia fusiforme), 히만탈리아 엘롱가타(Himanthalia Elongata), 개다시마(Kjellmaniella crassifolia), 라미나리아 브라실리엔시스(Laminaria brasiliensis), 라미나리아 시코리오데스(Laminaria cichorioides), 라미나리아 하이퍼보레아(Laminaria hyperborean), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 라미나리아 사카리나(Laminaria saccharina), 레소니아 트라베쿨라타(Lessonia trabeculata), 마크로시스티스 피리페라(Macrocystis pyrifera), 펠베티아 파스티기아타(Pelvetia fastigiata), 펠베티아 카나리쿨라타(Pelvetia Canaliculata), 사카리나 자포니카(saccharinajaponica), 사카리나 라티스시마(saccharina latissima), 사르가숨 스테노필룸(sargassum stenophylum), 사르가숨 툰베르기(sargassum thunbergii), 사르가숨 콘푸숨(Sargassum confusum), 사르가숨 푸시포름(Sargassum fusiforme) 및 운다리아 핀나시피다(Undaria pinnatifida Sarfutia) 중의 적어도 하나로부터 획득되는 방법.
  24. 제16항에 있어서, 푸칸이 후코이단이고 Saccharina japonica, Laminaria hyperborea, Macrocystis pyifera 및 Chorda filum 중 적어도 하나로부터 획득되는 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 5%까지 감소되는 방법.
  26. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 10%까지 감소되는 방법.
  27. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 20%까지 감소되는 방법.
  28. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 30%까지 감소되는 방법.
  29. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 40%까지 감소되는 방법.
  30. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 50%까지 감소되는 방법.
  31. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 60%까지 감소되는 방법.
  32. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 70%까지 감소되는 방법.
  33. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 80%까지 감소되는 방법.
  34. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 90%까지 감소되는 방법.
  35. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 95%까지 감소되는 방법.
  36. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 5%가 가수분해되는 방법.
  37. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 10%가 가수분해되는 방법.
  38. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 20%가 가수분해되는 방법.
  39. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 30%가 가수분해되는 방법.
  40. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 40%가 가수분해되는 방법.
  41. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 50%가 가수분해되는 방법.
  42. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 60%가 가수분해되는 방법.
  43. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 70%가 가수분해되는 방법.
  44. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 80%가 가수분해되는 방법.
  45. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 90%가 가수분해되는 방법.
  46. 제16항 내지 제24항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 95%가 가수분해되는 방법.
  47. 공급원료 푸칸 조성물에서의 푸칸의 효소 가수분해에 의해 공급원료 푸칸 조성물에 비해 원하는 저분자량 푸칸 조성물을 얻는 방법에 있어서:
    수용액에 공급원료 푸칸 조성물 및 사이크로모나스 푸카나제를 제공하는 단계;
    공급원료 푸칸 조성물 및 사이크로모나스 푸카나제를 공급원료 푸칸 조성물에서 가수분해하기에 충분한 조건하에서 배양해 가수분해된 푸칸 및 가수분해 잔류 분자들을 생성하는 단계; 및
    원하는 분자량 푸칸 조성물을 얻기 위해 가수분해 잔류 분자들과 푸카나 제로부터 가수분해된 푸칸을 분리하는 단계;를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 푸카나제가 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 4 중의 하나에 따른 유전자서열에 의해 코딩되는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 푸카나제가 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO.62, SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8 중의 하나에 따른 유전자서열에 의해 코딩되는 방법.
  50. 제47항에 있어서, 푸칸이 아데노사이스티스 유트리큘라리스(Adenocystis utricularis), 해조추출물(Ascophyllum nodosum), 코르다필럼(Chorda filum), 시스토세리아비스 마리나(Cystoseirabies marina), 더빌리아 안타락티카(Durvillaea Antarctica), 검둥감태(Ecklonia kurome), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 대황(Eisenia bicyclis), 푸쿠스 에반에센스(Fucus evanescens), 푸쿠스 베시쿨로시스), 톳(Hizikia fusiforme), 히만탈리아 엘롱가타(Himanthalia Elongata), 개다시마(Kjellmaniella crassifolia), 라미나리아 브라실리엔시스(Laminaria brasiliensis), 라미나리아 시코리오데스(Laminaria cichorioides), 라미나리아 하이퍼보레아(Laminaria hyperborean), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 라미나리아 사카리나(Laminaria saccharina), 레소니아 트라베쿨라타(Lessonia trabeculata), 마크로시스티스 피리페라(Macrocystis pyrifera), 펠베티아 파스티기아타(Pelvetia fastigiata), 펠베티아 카나리쿨라타(Pelvetia Canaliculata), 사카리나 자포니카(saccharinajaponica), 사카리나 라티스시마(saccharina latissima), 사르가숨 스테노필룸(sargassum stenophylum), 사르가숨 툰베르기(sargassum thunbergii), 사르가숨 콘푸숨(Sargassum confusum), 사르가숨 푸시포름(Sargassum fusiforme) 및 운다리아 핀나시피다(Undaria pinnatifida Sarfutia) 중의 적어도 하나로부터 획득되는 방법.
  51. 제47항에 있어서, 푸칸이 Saccharina japonica, Laminaria hyperborea, Macrocystis pyifera 및 Chorda filum 중 적어도 하나로부터 획득되는 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 5%까지 감소되는 방법.
  53. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 10%까지 감소되는 방법.
  54. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 20%까지 감소되는 방법.
  55. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 30%까지 감소되는 방법.
  56. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 40%까지 감소되는 방법.
  57. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 50%까지 감소되는 방법.
  58. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 60%까지 감소되는 방법.
  59. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 70%까지 감소되는 방법.
  60. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 80%까지 감소되는 방법.
  61. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 9-%까지 감소되는 방법.
  62. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸의 평균분자량이 적어도 95%까지 감소되는 방법.
  63. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 5%가 가수분해되는 방법.
  64. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 10%가 가수분해되는 방법.
  65. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 20%가 가수분해되는 방법.
  66. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 30%가 가수분해되는 방법.
  67. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 40%가 가수분해되는 방법.
  68. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 50%가 가수분해되는 방법.
  69. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 60%가 가수분해되는 방법.
  70. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 70%가 가수분해되는 방법.
  71. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 80%가 가수분해되는 방법.
  72. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 90%가 가수분해되는 방법.
  73. 제47항 내지 제51항 중의 어느 하나에 있어서, 푸칸내 글리코시드 결합의 적어도 95%가 가수분해되는 방법.
  74. 발현 가능한 P5AFcnA 푸카나제 유전자를 포함하는 발현벡터.
  75. 발현 가능한 Pl9DFcnA 푸카나제 유전자를 포함하는 발현벡터.
  76. 발현 가능한 사이크로모나스 푸카나제 유전자를 포함하는 발현벡터.
  77. 5% 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO. 3 중의 어느 하나에 따른 발현 가능한 유전자 서열을 포함하는 발현벡터.
  78. 5% 미만의 코돈이 치환된 SEQ ID NO. 2 또는 SEQ ID NO. 4 중의 어느 하나에 따른 발현 가능한 유전자 서열을 포함하는 발현벡터
  79. 제74항 내지 제78항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 발현벡터가 플라스미드인 발현벡터.
  80. 제74항 내지 제78항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 발현벡터가 원핵-발현 플라스미드인 발현벡터.
  81. 제80항에 있어서, 상기 원핵-발현 플라스미드가 E. coli에서 발현하도록 구성된 발현벡터.
  82. 제74항 내지 제78항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 발현벡터가 진핵-발현 플라스미드인 발현벡터.
  83. 제71항 내지 제82항 중의 어느 하나에 따른 유전자를 발현하는 단계와, 이 유전자에 의해 발현된 효소를 수집하는 단계를 포함하는 효소제조방법.
  84. 제71항 내지 제82항 중의 어느 하나에 따른 유전자 서열을 발현하는 단계와, 이 유전자 서열로부터 발현된 효소를 수집하는 단계를 포함하는 효소제조방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 효소가 푸카나제인 효소제조방법.
  86. 제74항 내지 제82항 중의 어느 하나에 따른 발현벡터로부터 획득된 푸카나제를 제공하는 단계와, 푸칸을 가수분해하도록 푸카나제를 위해 선택된 조건하에 푸칸과 발현된 푸카나제를 결합하는 단계를 포함하는, 발현된 푸카나제를 이용하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 푸칸이 공급원료 푸칸 조성물에 제공되는, 발현된 푸카나제를 이용하는 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 발현된 푸카나제가 푸칸내 글리코시드 결합을 가수분해하는, 발현된 푸카나제를 이용하는 방법.
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