JP2021531791A - フカンの酵素加水分解 - Google Patents
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Abstract
Psychromonas属菌から得られたフカナーゼであり、P5AFcnAフカナーゼ及びP19DFcnAフカナーゼを含む。また、これに関連する方法、システム、組成物などであり、かかるフカナーゼによる加水分解の後で重量平均分子量が低減したフカン組成物を含む。
Description
フカン(フコイダンを含む)は、硫酸化多糖である。一般的に言えば、このことは、それらが多くの糖類から構成される分子であり、前記糖類に付加した硫黄原子も有することを意味する。主要糖類は、6個の炭素原子を有し且つ化学式C6H12O5を有する糖である「フコース」と呼ばれる。「フコイダン」(又はフコイジン)は、褐藻(海草)に由来するフカンを示す。フカンは、単独で存在することが可能であり、あるいは他の糖の混合物、例えば、キシロース、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸及び/又はマンノースなどの糖との混合物の状態で存在することも可能である。これらの他の糖は、フカンを有する海草又は他の原料から抽出されうる。フカンは現在、褐藻(海草)、ナマコなどの天然原料に由来するが、本明細書に記載される「フカン」は、フカンの(1又は複数の)究極的原料にかかわらず、本明細書で考察されるフカンの化学的モチーフ及び構造的モチーフを有するポリマー分子を含む。
フコイダンはAdenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaを含む褐藻類の多様な種から得ることができるが、これらに限定されるものではない。これらの例示的な種は全て分類学上の褐藻綱(Phaeophyceae)から出たものであり、これらの種の大部分は、ヒバマタ科(Fucales)又はコンブ科(Laminariaceae)に入る。
フコイダンを含むフカンは、線維性癒着の形成を予防、阻害、又は処置するためのバリア器具(barrier device)として供するにおいて有効であることが示されている。フカンには他の関連する疾患及び状態の処置への用途も見いだされている。
所望の分子量分布を有するフカン組成物の調製における改良された方法には、まだ満たされていない需要が存在する。先行研究では、いくつかのフカンの加水分解における基質特異的MfFcnA酵素(Colin,et al.,2006)として知られている、フラボバクテリウム株SW5由来のフカン特異的フカナーゼの使用が考察されている。本方法、本システムなどは、他の利点の中でも、選択されたフカン組成物を加水分解することが可能である酵素、及び、これらの酵素を使用して、原料フカン組成物から所望の分子量分布を有するフカン組成物を得るための方法を提供することを対象とする。
原料フカン組成物中のフカンを含むフカンの酵素加水分解が可能であるフカナーゼを得、当該フカナーゼを利用して、前記原料フカン組成物に較べて分子量分布が低分子量側にある所望のフカン(a desired lower molecular weight distribution fucan relative to the feedstock fucan composition)を得るための方法、システム、組成物などが提供される。本明細書に記載の実施形態は、フカナーゼの産生又は合成、及び、前記フカナーゼ(複数可)による加水分解後に平均分子量が低減されたフカンを有するフカン組成物の生成において使用され得るフカナーゼ遺伝子配列及びフカナーゼアミノ酸配列を含む。前記産生されたフカナーゼを使用して前記原料フカン組成物を加水分解するための方法により、フカン基質選択性及び酵素加水分解における時間ベースでの制御(time-based control during the enzymatic hydrolysis)が提供される。
本方法、本システムなどは、所望の分子量分布を有する所望のフカン組成物を原料フカン組成物から得ること、並びに、かかる所望のフカン分子量分布を含む組成物、及びかかる組成物の使用の方法を含む。一態様において、前記方法は以下を含む。
本組成物、本システム及び本方法などは、水溶液中のP5AFcnAフカナーゼ及び/又はP19DFcnAフカナーゼ、並びに、添加されたフカンを含みうる組成物を提供する。前記添加されたフカンは原料フカン組成物であり得、当該組成物は、pHが約6.5〜9.0、温度が約15℃〜40℃であり得、また、前記フカナーゼがフカン中のグリコシド結合を加水分解し得るような条件にありうる。
ある特定の実施形態において、本組成物、本システム及び本方法などは、原核生物又は真核生物(prokaryotic or eukaryotic entity)によって産生されるフカナーゼなどの酵素を含み、前記フカナーゼは、配列番号1〜4のいずれか1つに記載の遺伝子配列、又は、かかる配列番号に記載の遺伝子配列において少なくとも0個、1個、2個、3個、4個若しくは5個且つ1%未満、2%未満、3%未満、4%未満若しくは5%未満のコドンが置換されている遺伝子配列によってコードされている。さらなる実施形態において、本組成物、本システム及び本方法などは、原核生物又は真核生物によって産生されるフカナーゼを含み、前記フカナーゼは、配列番号5〜9のいずれか1つに記載のアミノ酸配列において少なくとも0個、1個、2個、3個、4個又は5個のアミノ酸又はアミノ酸の1%未満、2%未満、3%未満、4%未満若しくは5%未満が置換されているアミノ酸配列を含みうる。前記原核生物は、Psychromonas属菌(Psychromonas species)又は大腸菌(Escherichia Coli)でありうる。
前記方法は、Psychromonas属菌中ではなく、水溶液中、例えば、人工の容器に収容されている人工の溶液中で、Psychromonasフカナーゼ又は本明細書において考察されている他のフカナーゼを使用してフカンを酵素的に加水分解することを含みうる。前記フカンはフコイダンであってよく、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一つから得ることができる。特定の実施形態では、フカン又はフコイダンはSaccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一つから得られる。前記加水分解によってフカンの平均分子量は少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%低下しうる。前記加水分解によってフカンにおけるグリコシド結合のうち少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%が加水分解されうる。
原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物(desired lower molecular weight fucan compositions relative to a feedstock fucan compositions)を前記原料フカン組成物中のフカンの酵素加水分解によって得るための方法も提供する。前記方法は、
前記原料フカン組成物及びPsychromonasフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Psychromonasフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン(hydrolyzed fucans)及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含みうる。
前記原料フカン組成物及びPsychromonasフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Psychromonasフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン(hydrolyzed fucans)及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含みうる。
前記フカナーゼは、例えば配列番号1〜8のうちの1つに記載の本明細書において考察されている遺伝子配列によってコードされ且つ/又はアミノ酸配列を含んでいてよく、前記フカン/フカン原料組成物は、本明細書において考察されているように調達されてよい。前記フカン/フカン組成物の平均分子量、及び/又は、前記フカン/フカン組成物に存在するグリコシド結合は、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%低減され得る。
発現可能なP5AFcnAフカナーゼ遺伝子、P19DFcnAフカナーゼ遺伝子又は本明細書において考察されている他の配列を含む発現ベクター、並びに、本明細書において考察され、かかる発現ベクターから発現され、且つ典型的にはかかる発現ベクターから回収及び精製される、酵素及びフカナーゼも提供される。
これら及び他の態様、特徴及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付の図面を含め、本出願の範囲内で記載されている。別途明確に記述されていない限り、全ての実施形態、態様、特徴などは、いかなる所望の方法で、混合及び適合され、組み合わされ、順序が変えられてもよい。
上記のフローチャートを含め、図面は、本開示の例示的な実施形態を提示する。本明細書に記載のシステム、方法などの実際の実施形態は、前記図面に示されていないさらなる特徴又は工程をさらに含みうる。本明細書において設定されている例示は、前記システム、方法などの、1又は複数の形態での実施形態を示しており、かかる例示は、いかなる方法によっても本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施形態は網羅的なものではなく、本開示を例えば、以下の詳細な説明において開示されている詳細形態に限定するものではない。
本明細書に記載の方法、システム、組成物などは、原料フカン組成物に較べて分子量分布が低分子量側にある所望のフカンを得るための、原料フカン組成物を酵素加水分解することができるフカナーゼに関する。そのため、本明細書において考察されるフカナーゼは、原料組成物におけるフカンの分子量分布が選択的且つ制御可能に低減されるように、選択的且つ制御可能に前記フカンを切断(cleave)して前記フカンのサイズを低減して、分子量分布がより低分子量側にある所望の修飾フカンを含む修飾フカン組成物を提供するために使用される。
フカンの例としてフコイダンを使用する図面において、前記方法などのある特定の実施形態を例として示す。天然フカナーゼ及び合成フカナーゼそれぞれのフカナーゼ遺伝子配列のコード領域及びフカナーゼアミノ酸配列の組成を考察する。前記原料フカン組成物の酵素加水分解の産物として得られる低分子量フカン組成物(lower molecular weight fucan composition)は、原料フカンの分布に較べてより低分子量側にある平均分子量分布(a lower average molecular weight distribution relative to the feedstock fucan distribution)を有する。分子量分布におけるこのシフトは、前記分布の分散度及び形状の変更に伴って起こり得る。
本明細書において考察されるある特定のフカナーゼの開発では、フコイダン分解性Psychromonas属菌株SW5A及びSW19Dは、カドボロ湾及びウィローズビーチの岸から収集された褐色の巨大な藻類から単離されたものであった(Victoria,Vancouver Island,British Columbia,Canada)。培養されたたPsychromonas属菌株SW5A及びSW19DからゲノムDNAを抽出し、これらのゲノムの次世代配列決定をIllumina MiSeqプラットフォームで実施した。これらのゲノムをアノテーションして、炭水化物活性酵素をコードする推定遺伝子を同定した。酵素であるP5AFcnA及びP19DFcnAをコードするフカナーゼ遺伝子配列を、このアノテーションプロセスの際にPsychromonas属菌であるPsychromonas属菌株SW5A(Psychromonas sp. SW5A)及びPsychromonas属菌株SW19D(Psychromonas sp. SW19D)のゲノムにおいて同定した。
酵素であるP5AFcnA及びP19DFcnAをコードする前記フカナーゼ遺伝子配列を、Psychromonas属菌であるPsychromonas属菌株SW5A及びPsychromonas属菌株SW19Dのゲノムから得た。大腸菌における発現用にコドン最適化され且つ大腸菌発現プラスミドpET28aに予め挿入された、酵素であるP5AFcnA及びP19DFcnAをコードする合成フカナーゼ遺伝子を、Genscript(登録商標)からオーダーした。これらの構築物は、pET28a_p5AFcnA及びpET28a_P19DFcnAと称された。当該構築物の配列忠実度は双方向DNA配列決定によって確認した。フカナーゼを、6ヒスチジンタグを有する大腸菌過剰発現系において発現させた。組み換えタンパク質を精製するために、細胞を採取し、化学的に溶解し、遠心分離して、細胞デブリスを細胞溶解物上清から分離した。前記タンパク質を次いで前記溶解物から固定化親和性クロマトグラフィによって精製した。精製されたタンパク質を0.5M NaCl緩衝液によって20mM Tris(pH8.5)中に透析し、29μMに濃縮してさらに使用した。天然及び合成のP5AFcnAフカナーゼについてのフカナーゼ遺伝子のコード領域配列、それぞれ、配列番号1及び配列番号2を、それぞれ、表1A及び表1Bに示す。天然及び合成のP19DFcnAフカナーゼについてのフカナーゼ遺伝子のコード領域配列、それぞれ、配列番号3及び配列番号4を、それぞれ、表1C及び表1Dに示す。天然及び合成のP5AFcnAフカナーゼについてのアミノ酸配列、それぞれ、配列番号5及び配列番号6を、それぞれ、表1E及び表1Fに示す。天然及び合成のP19DFcnAフカナーゼについてのアミノ酸配列、それぞれ、配列番号7及び配列番号8を、それぞれ、表1G及び1Hに示す。いくつかの実施形態において、本明細書に示される核酸配列は、好適な発現ベクター、https://en.wikipedia.org/wiki/Expression_vectorにおいて制御可能に発現される。かかる発現ベクターは、原核発現又は真核発現のいずれかについて最適化されてよく、所望により、プラスミド、発現ウイルス、無細胞系などを含んでもよい。前記発現ベクターはまた、所望により、選択されたプライマー、複製起源などを含んでもよい。
表1Aに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号1を、以下、天然P5AFcnA遺伝子配列と称する。表1Bに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号2を、以下、合成P5AFcnA遺伝子配列と称する。表1Cに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号3を、以下、天然P19DFcnA遺伝子配列と称する。表1Dに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号4を、以下、合成P19DFcnA遺伝子配列と称する。これらの合成配列は、大腸菌による酵素の発現に最適化される。表1Eに示されるアミノ酸配列である配列番号5を、以下、天然P5AFcnAアミノ酸配列と称する。表1Fに示されるアミノ酸配列である配列番号6を、以下、合成P5AFcnAアミノ酸配列と称する。表1Gに示されるアミノ酸配列である配列番号7を、以下、天然P19DFcnAアミノ酸配列と称する。表1Hに示されるアミノ酸配列である配列番号8を、以下、合成P19DFcnAアミノ酸配列と称する。
フカンの酵素加水分解
図1のフローチャートは、原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を得るための、すなわち、前記原料フカン組成物の酵素加水分解によって前記組成物中のフカンの平均分子量を低減するための、例示的な方法[100]を示す。この例示的な非限定方法において、当該方法は、前記原料フカン組成物を水溶液(すなわち、人工の、典型的には緩衝液化された、溶液)中に提供すること[110]、溶液中で前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートして、加水分解された前記フカン組成物、前記フカナーゼ及び加水分解残余分子を含む溶液を生成すること[120]、及び前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離して、所望の前記低分子量フカン組成物を得ること[130]、を含む。
図1のフローチャートは、原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を得るための、すなわち、前記原料フカン組成物の酵素加水分解によって前記組成物中のフカンの平均分子量を低減するための、例示的な方法[100]を示す。この例示的な非限定方法において、当該方法は、前記原料フカン組成物を水溶液(すなわち、人工の、典型的には緩衝液化された、溶液)中に提供すること[110]、溶液中で前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートして、加水分解された前記フカン組成物、前記フカナーゼ及び加水分解残余分子を含む溶液を生成すること[120]、及び前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離して、所望の前記低分子量フカン組成物を得ること[130]、を含む。
前記原料フカン組成物を提供すること[110]は、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一つから抽出されたフカン/原料フコイダン組成物を提供することを含みうる。特定の実施形態では、前記フカンはSaccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda Filumのうち少なくとも一つから得られる。
前記原料フカン組成物を水溶液中に提供すること[110]は、前記原料フカン組成物を溶液中に約0.01%w/v〜約30%w/vのフカン濃度で提供することを含みうる。水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること[110]は、前記原料フカン組成物を溶液中に約0.05%w/v〜約10%w/vのフカン濃度で提供することを含みうる。水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること[110]は、前記原料フカン組成物を溶液中に約0.1%w/v〜約5%w/vのフカン濃度で提供することを含みうる。
水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること[110]は、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水、トリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリスアミノメタン緩衝液(Tris緩衝液としても知られている)、塩化ナトリウム、Trizma(商標)緩衝液、ベータ−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸(HEPPSOとしても知られている)緩衝液、ピペラジン−1,4−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)二水和物(POPSOとしても知られている)緩衝液、トリエタノールアミン(TEA)緩衝液、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]プロパン−1−スルホン酸(EPPS)緩衝液、グリシン緩衝液、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸)(HEPBS)緩衝液、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液、[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパンスルホン酸(TAPS)緩衝液、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール(AMPDとしても知られている)緩衝液、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−4−アミノ−ブタンスルホン酸(TABSとしても知られている)緩衝液、N−(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸(AMPSO)緩衝液、2−(シクロ−ヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)緩衝液、3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシ−1−プロパン−スルホン酸(CAPSO)緩衝液、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMPとしても知られている)緩衝液、3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパン−スルホン酸(CAPS)緩衝液、4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液及び重炭酸アンモニウムのうちの少なくとも1つを含む溶液中に、前記原料フカン組成物を提供することを含みうる。これらの緩衝溶液は、pHが、例えば、弱酸性から弱塩基性であり得、例えば、pHが約5.5〜10.5、6.5〜9.0、7.5〜8.8、又は8.0〜8.5でありうる。
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、Psychromonasフカナーゼと共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、大腸菌によって産生された組み換えフカナーゼと共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、P5AFcnA及びP19DFcnAフカナーゼ、例えば合成により生成された非天然P5AFcnA及びP19DFcnAフカナーゼ、のうちの少なくとも1つ又は両方と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、そのフカナーゼ遺伝子(its fucanase-gene)又は修飾されたフカナーゼ遺伝子から大腸菌及びPsychromonas属細菌のうちいずれか又は他の好適な原核宿主/産生種及び真核宿主/産生種のうちいずれかによって翻訳されたフカナーゼと共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。本明細書に記載の方法は、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のうちの少なくとも1つから置換されているコドンが5%未満であるフカナーゼ遺伝子配列(a fucanase-gene sequence of at least one of SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 4 in which fewer than 5% of codons are substituted)を発現することによって酵素を産生することを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記天然P5AFcnA配列、配列番号1及び配列番号5のそれぞれから置換されているコドン又はアミノ酸が少なくとも1つ、3つ又は5つであるが1%未満、3%未満、又は5%未満である配列によってコードされるフカナーゼ(a fucanase coded by a sequence in which at least one, three or five, but fewer than 1%, 3%, or 5% of codons or amino acids of the native P5AFcnA sequence, SEQ ID NOS. 1 and 5, respectively, are substituted)と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記合成P5AFcnA配列、配列番号2及び配列番号6のそれぞれから置換されているコドン又はアミノ酸が1%未満、3%未満、又は5%未満である配列によってコードされるフカナーゼ(a fucanase coded by a sequence in which fewer than 1%, 3%, or 5% of codons or amino acids of the synthetic P5AFcnA sequence, SEQ ID NOS. 2 and 6, respectively, are substituted)と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記天然P19DFcnA配列、配列番号3及び配列番号7のそれぞれから置換されているコドン又はアミノ酸が少なくとも1つ、3つ又は5つであるが1%未満、3%未満、又は5%未満である配列によってコードされるフカナーゼ(a fucanase coded by a sequence in which at least one, three or five, but fewer than 1%, 3%, or 5% of codons or amino acids of the native P19DFcnA sequence, SEQ ID NOS. 3 and 7, respectively, are substituted)と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記合成P19DFcnA配列、配列番号4及び配列番号8のそれぞれから置換されているコドンが1%未満、3%未満、又は5%未満である配列によってコードされるフカナーゼ(a fucanase coded by a sequence in which fewer than 1%, 3%, or 5% of codons of the synthetic P19DFcnA sequence, SEQ ID NOS. 4 and 8, respectively, are substituted)と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を約0℃〜約60℃、約15℃〜40℃、約20℃〜30℃、例えば、約23℃、約25℃、又は約27℃で維持することを含みうる。
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記混合物を、例えば、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を例えば少なくとも1分間からインキュベーション期間全体にわたって撹拌、振とう、振動又は混合することを通じてかき混ぜる少なくとも1つの形態を含みうる。
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を、約30分〜約300時間、約1時間〜約100時間、約2時間〜約50時間、約3時間〜約24時間、例えば約5時間、約10時間、約15時間又は約20時間インキュベートすることを含みうる。
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を、前記フカン組成物において所望の分子量が得られるまでインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記フカン組成物の平均分子量の少なくとも約5%又は10%の低減が得られるまで、前記フカン組成物の平均分子量の少なくとも約20%の低減が得られるまで、例えば、前記フカン組成物の平均分子量の約40%、約50%又は約60%の低減が得られるまで、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること[120]は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を、前記原料フカン組成物におけるフカン中のグリコシド結合の少なくとも5%又は10%が加水分解されるまで、前記原料フカン組成物におけるフカン中のグリコシド結合の少なくとも20%が加水分解されるまで、例えば、前記グリコシド結合の約40%、約50%及び約60%が加水分解されるまで、インキュベートすることを含みうる。
前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること[130]は、前記の加水分解フカン組成物を含む溶液において反応制御剤によって前記フカナーゼを反応制御して前記加水分解を終了させた上で前記分離を行うこと(quenching the fucanase in the solution comprising the hydrolyzed fucan composition with a quenching agent to terminate the hydrolysis before the separating)を含みうる。前記溶液において前記フカナーゼを反応制御することは、前記溶液をアルカリ性にすることを含みうる。前記溶液をアルカリ性にすることは、前記溶液のpHを約9〜14まで上昇させることを含みうる。前記溶液をアルカリ性にすることは、NaOH、KOH及びLiOHのうちの少なくとも1つを前記溶液に添加することを含みうる。前記溶液において前記フカナーゼを反応制御することは、前記溶液を60〜100℃、例えば約80℃に又はこれを超えて加熱することも含み得、又はこれを代替的に含みうる。前記溶液において前記フカナーゼを反応制御することは、エタノール、イソプロパノール、プロパノール及びメタノールのうちの少なくとも1つなどの沈殿剤によって前記フカナーゼを沈殿させることも含み得、又はこれを代替的に含みうる。
前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること[130]は、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)フィルタを通して前記溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記の加水分解フカン組成物を含む溶液を、蒸留水、塩溶液及び緩衝液溶液のうちの少なくとも1つによって透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記所望のフカン組成物における所望の分子量よりも分子量カットオフが小さいTFFフィルタを通して前記加水分解フカン組成物を含む溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、分子量カットオフが5kDa、10kDa、30kDa、50kDa、70kDa又は100kDaのいずれかであるTFFフィルタを通して溶液において前記原料フカン組成物を透析濾過することを含みうる。前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること[130]は、遠心分離、濾過及び沈降のうちの少なくとも1つを含みうる。
図1において考察されている上記方法を、Saccharina japonica、Ascophyllum nodosum、Pelvetia canaliculata、Fucus vesiculosus、Laminaria hyperborea及びMacrocystis pyiferaから抽出した個々の原料フコイダン組成物に適用した。使用した前記フカナーゼは、先に考察したMfFcnAフカナーゼ(Colin,et al.,2006)並びに上記で考察されたように得られたP5AFcnAフカナーゼ及びP19DFcnAフカナーゼであった。原料フコイダン組成物を、0.5MのNaClを含むpH8.5の20mMのTris緩衝液中に約0.1〜0.2%w/vで溶解した。0.5MのNaClを含むpH8.5の同じTris緩衝液中のMfFcnA、P5AFcnA又はP19DFcnAの29μM溶液を独立に個別の原料フコイダン組成物の溶液に10μMの最終フカナーゼ濃度まで添加した。前記原料フコイダン組成物−フカナーゼ混合物を全て、25℃にて軌道振とう機上で100rpmで15時間インキュベートした。
15時間後、それぞれ個々の原料フコイダン組成物−フカナーゼ混合物において加水分解が起こったことを、炭水化物−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(C−PAGE)技術を使用して分析した。10μLの前記加水分解フコイダン組成物−フカナーゼ混合物を10μLのローディング染料(水中、10%v/vグリセロール、0.01%w/vブロモフェノールブルー)と混合した。得られた混合物を、氷上における24%w/vC−PAGEのゲル泳動に、最初に100ボルトの電圧で15分間、次に150ボルトの電圧で20分間、最後に200ボルトの電圧で20分間供した。
前記C−PAGE分析の結果を以下の表2に示し、加水分解の発生を評価する。前記C−PAGEゲルにおける加水分解の非存在及び加水分解の存在の例を図2A、図2B及び図2Cに示す。当該表において、「+」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されたことを示し、「−」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されなかったことを示し、「+/−」は最小限の加水分解が観察されることを示す。
上記及び図1において考察されている方法を、異なる供給源Macrocystis pyrifera、Chorda filum、Ascophylum nodosum、Laminaria hyperborea、Saccharina japonica及びFucus vesiculosusから抽出された個々の原料フコイダン組成物に、異なる条件下で適用した。前記原料フコイダン組成物を0.25%w/vで溶解し、1μMの同フカナーゼと共に室温で40時間インキュベートした。同じTris緩衝液組成物を使用してpHを8.0に調整した。
分析をC−PAGEにおいて行った。結果を以下の表3に示し、加水分解の発生を評価する。当該表において、「+」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されたことを示し、「−」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されなかったことを示し、「+/−」は最小限の加水分解が観察されることを示す。
表2及び表3は、図2A、図2B及び図2Cと共に、P5AFcnAフカナーゼ及びP19DFcnAフカナーゼが、先に考察されたMfFcnAフカナーゼと較べて異なる酵素活性を示すことを示唆している。P5AFcnAフカナーゼ及びP19DFcnAフカナーゼは、Laminaria hyperborea及びMacrocystis pyiferaから抽出されたフコイダンを酵素的に分解することが可能であり、Saccharina japonicaを、MfFcnAフカナーゼでは達成し得ない、より高い程度まで分解することができる。上記の2つの別個の泳動実験の間において結果が変動していることは、同じ種のものであっても異なる供給源から抽出されたフコイダンが、地理的又は季節的な変動に依りうる骨格構造上の僅かな差を示しうることを実証している。
本出願は、本明細書において考察されている方法、システムなどの種々の要素によって作製されたフカン組成物、並びに、当該組成物の使用方法並びに本明細書に記載の方法を実施し且つ前記所望のフカン組成物を得るように構成されているシステム及びデバイスなどもさらに対象とする。
部分リスト:
100 原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物の酵素加水分解によって得るための方法。
110 水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること。
120 溶液中において前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートして、前記の加水分解フカン組成物、前記フカナーゼ及び加水分解残余分子を含む溶液を生成すること。
130 前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから前記の加水分解フカン組成物を含む前記溶液を分離して、前記所望のフカン組成物を得ること。
100 原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物の酵素加水分解によって得るための方法。
110 水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること。
120 溶液中において前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートして、前記の加水分解フカン組成物、前記フカナーゼ及び加水分解残余分子を含む溶液を生成すること。
130 前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから前記の加水分解フカン組成物を含む前記溶液を分離して、前記所望のフカン組成物を得ること。
本明細書において用いられる全ての用語は、特に文脈又は定義が明確に指示しない限り、それらの通常の意味に従って用いられる。また、特に明示的に示されない限り、本開示において、「又は」の使用は「及び」を含み、且つ、逆もまた同じである。非限定的な用語は、明示的に述べられない限り、又は特に文脈が明確に指示しない限り、限定的なものとして解釈されるものではない(例えば、「含む(including)」、「有する(having)」及び「含む(comprising)」は、典型的には、「含むが、これに限定されるものではない(including without limitation)」を示す)。単数形、例えば、「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「前記(the)」は、請求項におけるものを含め、明示的に述べられない限り、又は特に文脈で明確に別途示されない限り、複数の参照(plural reference)を含む。
特に断らない限り、実施形態の1つの特徴又は複数の特徴の条件又は関係特性を修飾する「実質的に」及び「約」などの本明細書における形容詞は、前記条件又は特性が、それが意図される適用のための実施形態の実施のために許容し得る許容範囲内に規定されることを示す。
本方法、本組成物、本システムなどの範囲は、ミーンズ・プラス・ファンクション概念及びステップ・プラス・ファンクション概念の両方を含む。しかし、請求項は、「手段」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「手段」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。同様に、請求項は、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。
上文から、具体的な実施形態が例示の目的のために本明細書において考察されたが、本明細書における考察の精神及び範囲から逸脱することなく各種修正を為してもよいことは理解されよう。したがって、前記システム及び前記方法などは、かかる修正並びに本明細書において記載される主題の全ての順列及び組み合わせを含むものであって、添付の請求項又は本明細書における考察及び図における適切な裏付けを有する他の請求項によるものを除き、限定されるものではない。
本方法、本システムなどは、所望の分子量分布を有する所望のフカン組成物を原料フカン組成物から得ること、並びに、かかる所望のフカン分子量分布を含む組成物、及びかかる組成物の使用の方法を含む。
前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること[130]は、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)フィルタを通して前記溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記の加水分解フカン組成物を含む溶液を、蒸留水、塩溶液及び緩衝液溶液のうちの少なくとも1つによって透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記所望のフカン組成物における所望の分子量よりも分子量カットオフが小さいTFFフィルタを通して前記加水分解フカン組成物を含む溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、分子量カットオフが5kDa、10kDa、30kDa、50kDa、70kDa又は100kDaのいずれかであるTFFフィルタを通して溶液において前記加水分解フカン組成物を透析濾過することを含みうる。前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること[130]は、遠心分離、濾過及び沈降のうちの少なくとも1つを含みうる。
本方法、本組成物、本システムなどの範囲は、ミーンズ・プラス・ファンクション概念及びステップ・プラス・ファンクション概念の両方を含む。しかし、請求項は、「手段」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「手段」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。同様に、請求項は、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
<1>
水溶液中のP5AFcnAフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
<2>
水溶液中のP19DFcnAフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
<3>
前記添加されたフカンは原料フカン組成物である、<1>又は<2>に記載の組成物。
<4>
pHが約6.5〜9.0である、<1>〜<3>のいずれか一項に記載の組成物。
<5>
温度が約15℃〜40℃である、<1>〜<4>のいずれか一項に記載の組成物。
<6>
フカン中のグリコシド結合を前記フカナーゼが加水分解できる条件にある、<1>〜<5>のいずれか一項に記載の組成物。
<7>
真核生物(eukaryotic entity)によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<8>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1及び配列番号3のいずれか1つにおいて1個以上且つ5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<9>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号2及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<10>
Psychromonas属菌以外の原核生物(prokaryotic entity)によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<11>
真核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<12>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5及び配列番号7のいずれか1つにおいて1個以上且つ5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<13>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号6及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<14>
Psychromonas属菌以外の原核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<15>
前記原核生物が大腸菌(Escherichia Coli)である、<10>又は<14>に記載のフカナーゼ。
<16>
人工の水溶液中でPsychromonasフカナーゼを使用してフカンを選択的に酵素的に加水分解することを含む方法。
<17>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、<16>に記載の方法。
<18>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて3%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、<16>に記載の方法。
<19>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて1%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、<16>に記載の方法。
<20>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、<16>に記載の方法。
<21>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて3%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、<16>に記載の方法。
<22>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて1%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、<16>に記載の方法。
<23>
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、<16>に記載の方法。
<24>
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、<16>に記載の方法。
<25>
前記フカンの平均分子量が少なくとも5%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<26>
前記フカンの平均分子量が約10%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<27>
前記フカンの平均分子量が約20%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<28>
前記フカンの平均分子量が約30%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<29>
前記フカンの平均分子量が約40%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<30>
前記フカンの平均分子量が約50%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<31>
前記フカンの平均分子量が約60%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<32>
前記フカンの平均分子量が約70%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<33>
前記フカンの平均分子量が約80%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<34>
前記フカンの平均分子量が約90%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<35>
前記フカンの平均分子量が約95%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<36>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも5%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<37>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも10%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<38>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも20%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<39>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも30%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<40>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも40%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<41>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも50%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<42>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも60%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<43>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも70%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<44>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも80%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<45>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも90%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<46>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも95%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<47>
原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物中のフカンの酵素加水分解によって得るための方法であって、
前記原料フカン組成物及びPsychromonasフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Psychromonasフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含む方法。
<48>
前記フカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つの遺伝子配列によってコードされる、<47>に記載の方法。
<49>
前記フカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、<47>に記載の方法。
<50>
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たものである、<47>に記載の方法。
<51>
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たものである、<47>に記載の方法。
<52>
前記フカンの平均分子量が少なくとも5%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<53>
前記フカンの平均分子量が約10%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<54>
前記フカンの平均分子量が約20%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<55>
前記フカンの平均分子量が約30%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<56>
前記フカンの平均分子量が約40%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<57>
前記フカンの平均分子量が約50%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<58>
前記フカンの平均分子量が約60%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<59>
前記フカンの平均分子量が約70%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<60>
前記フカンの平均分子量が約80%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<61>
前記フカンの平均分子量が約90%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<62>
前記フカンの平均分子量が約95%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<63>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも5%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<64>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも10%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<65>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも20%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<66>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも30%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<67>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも40%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<68>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも50%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<69>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも60%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<70>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも70%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<71>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも80%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<72>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも90%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<73>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも95%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<74>
発現可能なP5AFcnAフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
<75>
発現可能なP19DFcnAフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
<76>
発現可能なPsychromonasフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
<77>
発現可能な、配列番号1及び配列番号3のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
<78>
発現可能な、配列番号2及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
<79>
プラスミドである、<74>〜<78>のいずれか一項に記載の発現ベクター。
<80>
原核発現プラスミド(prokaryotic-expression plasmid)である、<74>〜<78>のいずれか一項に記載の発現ベクター。
<81>
前記原核発現プラスミドが大腸菌における発現のために構成されている、<80>に記載の発現ベクター。
<82>
真核発現プラスミド(eukaryotic-expression plasmid)である、<74>〜<78>のいずれか一項に記載の発現ベクター。
<83>
<74>〜<82>のいずれか一項に記載の遺伝子を発現すること、及び前記遺伝子により発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
<84>
<71>〜<82>のいずれか一項に記載の遺伝子配列を発現すること、及びかかる遺伝子から発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
<85>
前記酵素がフカナーゼである、<83>又は<84>に記載の方法。
<86>
<74>〜<82>のいずれか一項に記載の発現ベクターから得られたフカナーゼを提供すること、及び発現されたフカナーゼがフカンを加水分解するよう選択された条件下で前記フカナーゼを前記フカンと組み合わせることを含む、発現されたフカナーゼを使用する方法。
<87>
前記フカンが原料フカン組成物中で提供される、<86>に記載の方法。
<88>
前記発現されたフカナーゼが前記フカン内のグリコシド結合を加水分解する、<86>又は<87>に記載の方法。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
<1>
水溶液中のP5AFcnAフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
<2>
水溶液中のP19DFcnAフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
<3>
前記添加されたフカンは原料フカン組成物である、<1>又は<2>に記載の組成物。
<4>
pHが約6.5〜9.0である、<1>〜<3>のいずれか一項に記載の組成物。
<5>
温度が約15℃〜40℃である、<1>〜<4>のいずれか一項に記載の組成物。
<6>
フカン中のグリコシド結合を前記フカナーゼが加水分解できる条件にある、<1>〜<5>のいずれか一項に記載の組成物。
<7>
真核生物(eukaryotic entity)によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<8>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1及び配列番号3のいずれか1つにおいて1個以上且つ5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<9>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号2及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<10>
Psychromonas属菌以外の原核生物(prokaryotic entity)によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
<11>
真核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<12>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5及び配列番号7のいずれか1つにおいて1個以上且つ5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<13>
Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号6及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<14>
Psychromonas属菌以外の原核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
<15>
前記原核生物が大腸菌(Escherichia Coli)である、<10>又は<14>に記載のフカナーゼ。
<16>
人工の水溶液中でPsychromonasフカナーゼを使用してフカンを選択的に酵素的に加水分解することを含む方法。
<17>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、<16>に記載の方法。
<18>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて3%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、<16>に記載の方法。
<19>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて1%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、<16>に記載の方法。
<20>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、<16>に記載の方法。
<21>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて3%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、<16>に記載の方法。
<22>
前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて1%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、<16>に記載の方法。
<23>
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、<16>に記載の方法。
<24>
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、<16>に記載の方法。
<25>
前記フカンの平均分子量が少なくとも5%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<26>
前記フカンの平均分子量が約10%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<27>
前記フカンの平均分子量が約20%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<28>
前記フカンの平均分子量が約30%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<29>
前記フカンの平均分子量が約40%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<30>
前記フカンの平均分子量が約50%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<31>
前記フカンの平均分子量が約60%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<32>
前記フカンの平均分子量が約70%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<33>
前記フカンの平均分子量が約80%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<34>
前記フカンの平均分子量が約90%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<35>
前記フカンの平均分子量が約95%低下する、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<36>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも5%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<37>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも10%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<38>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも20%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<39>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも30%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<40>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも40%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<41>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも50%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<42>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも60%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<43>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも70%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<44>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも80%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<45>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも90%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<46>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも95%が加水分解される、<16>〜<24>のいずれか一項に記載の方法。
<47>
原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物中のフカンの酵素加水分解によって得るための方法であって、
前記原料フカン組成物及びPsychromonasフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Psychromonasフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含む方法。
<48>
前記フカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つの遺伝子配列によってコードされる、<47>に記載の方法。
<49>
前記フカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、<47>に記載の方法。
<50>
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たものである、<47>に記載の方法。
<51>
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たものである、<47>に記載の方法。
<52>
前記フカンの平均分子量が少なくとも5%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<53>
前記フカンの平均分子量が約10%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<54>
前記フカンの平均分子量が約20%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<55>
前記フカンの平均分子量が約30%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<56>
前記フカンの平均分子量が約40%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<57>
前記フカンの平均分子量が約50%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<58>
前記フカンの平均分子量が約60%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<59>
前記フカンの平均分子量が約70%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<60>
前記フカンの平均分子量が約80%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<61>
前記フカンの平均分子量が約90%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<62>
前記フカンの平均分子量が約95%低下する、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<63>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも5%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<64>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも10%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<65>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも20%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<66>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも30%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<67>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも40%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<68>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも50%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<69>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも60%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<70>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも70%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<71>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも80%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<72>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも90%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<73>
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも95%が加水分解される、<47>〜<51>のいずれか一項に記載の方法。
<74>
発現可能なP5AFcnAフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
<75>
発現可能なP19DFcnAフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
<76>
発現可能なPsychromonasフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
<77>
発現可能な、配列番号1及び配列番号3のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
<78>
発現可能な、配列番号2及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
<79>
プラスミドである、<74>〜<78>のいずれか一項に記載の発現ベクター。
<80>
原核発現プラスミド(prokaryotic-expression plasmid)である、<74>〜<78>のいずれか一項に記載の発現ベクター。
<81>
前記原核発現プラスミドが大腸菌における発現のために構成されている、<80>に記載の発現ベクター。
<82>
真核発現プラスミド(eukaryotic-expression plasmid)である、<74>〜<78>のいずれか一項に記載の発現ベクター。
<83>
<74>〜<82>のいずれか一項に記載の遺伝子を発現すること、及び前記遺伝子により発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
<84>
<71>〜<82>のいずれか一項に記載の遺伝子配列を発現すること、及びかかる遺伝子から発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
<85>
前記酵素がフカナーゼである、<83>又は<84>に記載の方法。
<86>
<74>〜<82>のいずれか一項に記載の発現ベクターから得られたフカナーゼを提供すること、及び発現されたフカナーゼがフカンを加水分解するよう選択された条件下で前記フカナーゼを前記フカンと組み合わせることを含む、発現されたフカナーゼを使用する方法。
<87>
前記フカンが原料フカン組成物中で提供される、<86>に記載の方法。
<88>
前記発現されたフカナーゼが前記フカン内のグリコシド結合を加水分解する、<86>又は<87>に記載の方法。
Claims (88)
- 水溶液中のP5AFcnAフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
- 水溶液中のP19DFcnAフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
- 前記添加されたフカンは原料フカン組成物である、請求項1又は請求項2に記載の組成物。
- pHが約6.5〜9.0である、請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載の組成物。
- 温度が約15℃〜40℃である、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の組成物。
- フカン中のグリコシド結合を前記フカナーゼが加水分解できる条件にある、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の組成物。
- 真核生物(eukaryotic entity)によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
- Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1及び配列番号3のいずれか1つにおいて1個以上且つ5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
- Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号2及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
- Psychromonas属菌以外の原核生物(prokaryotic entity)によって産生されるフカナーゼであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
- 真核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
- Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5及び配列番号7のいずれか1つにおいて1個以上且つ5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
- Psychromonas属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号6及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
- Psychromonas属菌以外の原核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
- 前記原核生物が大腸菌(Escherichia Coli)である、請求項10又は請求項14に記載のフカナーゼ。
- 人工の水溶液中でPsychromonasフカナーゼを使用してフカンを選択的に酵素的に加水分解することを含む方法。
- 前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、請求項16に記載の方法。
- 前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて3%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、請求項16に記載の方法。
- 前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つにおいて1%未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、請求項16に記載の方法。
- 前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて5%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて3%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記Psychromonasフカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つにおいて1%未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、請求項16に記載の方法。
- 前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、請求項16に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が少なくとも5%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約10%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約20%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約30%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約40%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約50%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約60%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約70%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約80%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約90%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約95%低下する、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも5%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも10%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも20%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも30%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも40%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも50%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも60%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも70%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも80%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも90%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも95%が加水分解される、請求項16〜請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物中のフカンの酵素加水分解によって得るための方法であって、
前記原料フカン組成物及びPsychromonasフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Psychromonasフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含む方法。 - 前記フカナーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のいずれか1つの遺伝子配列によってコードされる、請求項47に記載の方法。
- 前記フカナーゼが、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たものである、請求項47に記載の方法。
- 前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たものである、請求項47に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が少なくとも5%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約10%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約20%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約30%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約40%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約50%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約60%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約70%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約80%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約90%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカンの平均分子量が約95%低下する、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも5%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも10%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも20%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも30%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも40%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも50%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも60%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも70%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも80%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも90%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも95%が加水分解される、請求項47〜請求項51のいずれか一項に記載の方法。
- 発現可能なP5AFcnAフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
- 発現可能なP19DFcnAフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
- 発現可能なPsychromonasフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
- 発現可能な、配列番号1及び配列番号3のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
- 発現可能な、配列番号2及び配列番号4のいずれか1つにおいて5%未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
- プラスミドである、請求項74〜請求項78に記載の発現ベクター。
- 原核発現プラスミド(prokaryotic-expression plasmid)である、請求項74〜請求項78に記載の発現ベクター。
- 前記原核発現プラスミドが大腸菌における発現のために構成されている、請求項80に記載の発現ベクター。
- 真核発現プラスミド(eukaryotic-expression plasmid)である、請求項74〜請求項78に記載の発現ベクター。
- 請求項74〜請求項82のいずれか一項に記載の遺伝子を発現すること、及び前記遺伝子により発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
- 請求項71〜請求項82に記載の遺伝子配列を発現すること、及びかかる遺伝子から発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
- 前記酵素がフカナーゼである、請求項83又は請求項84に記載の方法。
- 請求項74〜請求項82のいずれか一項に記載の発現ベクターから得られたフカナーゼを提供すること、及び発現されたフカナーゼがフカンを加水分解するよう選択された条件下で前記フカナーゼを前記フカンと組み合わせることを含む、発現されたフカナーゼを使用する方法。
- 前記フカンが原料フカン組成物中で提供される、請求項86に記載の方法。
- 前記発現されたフカナーゼが前記フカン内のグリコシド結合を加水分解する、請求項86又は請求項87に記載の方法。
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