JP2013146225A - β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】 キチンを分解することでＮ−アセチルグルコサミンを得る際に有用な、食品由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを提供すること。
【解決手段】 本発明によれば、シイタケ由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが提供される。本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、３糖以上のキチンオリゴ糖に対しても優れた分解活性を有するものであり、また、シイタケ由来であることから安全かつ安心なものであるので、医薬品、食品、化粧品などの分野において利用されるＮ−アセチルグルコサミンのキチンからの製造に適したものである。
【選択図】 図１

Description

本発明は、キチンを分解することでＮ−アセチルグルコサミンを得る際に有用な、シイタケ由来の新規なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼに関する。

キチン（β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）は、エビやカニのような甲殻類をはじめとして、昆虫、貝、キノコにいたるまで、極めて多くの生物に含まれている生物資源であり、地球上における産生量は年間１０００億トンにも及ぶと推測されている。しかしながら、キチンは、一般的な溶媒に溶けない高分子多糖であるため、その利用が困難とされているが、キチンの構成単糖であるＮ−アセチルグルコサミンは、変形性関節症の予防や治療に有効である他、美肌効果などの機能性を有していることから、医薬品、食品、化粧品などの分野において有用であることは周知の通りであり、キチンを分解することでＮ−アセチルグルコサミンを得る方法が各種提案されている。例えば特許文献１には、塩酸を用いてキチンを部分加水分解することでキチンオリゴ糖を得た後、キチンオリゴ糖に対して加水分解能を有する酵素を作用させてＮ−アセチルグルコサミンを製造する方法が記載されている。また、自然界からの新規なキチナーゼ（キチン分解酵素）の探索や遺伝子工学的手法による酵素の改変方法などの研究も行われており、例えば特許文献２には、超好熱菌由来のキチナーゼ遺伝子を改変することで得られる高活性で耐熱性のキチナーゼが記載されている。しかしながら、特許文献１に記載の方法のような塩酸を用いる方法は、環境負荷が大きいのでその対策を講じる必要があるといった問題がある。また、Ｎ−アセチルグルコサミンの利用分野を考えると、製造されたＮ−アセチルグルコサミン自体はもちろんのこと、その製造方法も人体にとって安全かつ安心なものであるべき点に鑑みれば、酵素を利用してＮ−アセチルグルコサミンを製造する場合、利用する酵素は、非食品由来の酵素や遺伝子改変酵素などよりも食品由来の酵素が望ましい。けれども、食品由来の酵素の探索については必ずしも十分な研究成果が得られていないのが現状である。

特公平５−３３０３７号公報 特開２００９−１７１８５８号公報

そこで本発明は、キチンを分解することでＮ−アセチルグルコサミンを得る際に有用な、食品由来の酵素を提供することを目的とする。

高分子多糖であるキチンは、エンドキチナーゼによってランダムに分解され、様々な長さのキチンオリゴ糖の生成を経て、キチン２糖であるキトビオースがβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの作用でＮ−アセチルグルコサミンに分解されることが知られている。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、これまでにも様々な生物から見出されているが、その多くは、キチン２糖であるキトビオースに対しては分解活性が高いものの、３糖以上のキチンオリゴ糖に対しては分解活性が低い。本発明者らは、上記の点に鑑みて、キチンを分解することでＮ−アセチルグルコサミンを得る際に有用な、食品由来の酵素の探索を鋭意行った結果、３糖以上のキチンオリゴ糖に対しても優れた分解活性を有するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼがシイタケに含まれていることを見出した。

上記の知見に基づいてなされた本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、請求項１記載の通り、以下の（ａ）〜（ｆ）の性質を有するものである。
（ａ）分子量は７９ｋＤａである（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による測定）
（ｂ）Ｎ末端に配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する
（ｃ）酵素至適ｐＨは３〜６である
（ｄ）ｐＨ５〜８で安定である
（ｅ）酵素至適温度は約５０℃である
（ｆ）６０℃で失活する
また、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、請求項２記載の通り、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなるものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列のタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質
また、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子は、請求項３記載の通り、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列のタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質
また、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子は、請求項４記載の通り、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものである。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
また、本発明の組換えベクターは、請求項５記載の通り、請求項３又は４記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を含むものである。
また、本発明の形質転換体は、請求項６記載の通り、請求項５記載の組換えベクターを含むものである。
また、本発明の請求項１又は２記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの取得方法は、請求項７記載の通り、請求項６記載の形質転換体を培養することで得られる培養物から単離精製することによるものである。
また、本発明の請求項１又は２記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの取得方法は、請求項８記載の通り、担子菌からの単離精製によるものである。
また、本発明のＮ−アセチルグルコサミンの製造方法は、請求項９記載の通り、請求項１又は２記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを単独で用いるかキチナーゼとともに用いてキチンを分解することによるものである。
また、本発明のＮ−アセチルグルコサミンの製造方法は、請求項１０記載の通り、担子菌の水溶性抽出物を単独で用いるかキチナーゼとともに用いてキチンを分解することによるものである。

本発明によれば、キチンを分解することでＮ−アセチルグルコサミンを得る際に有用な、食品由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとして、シイタケ由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを提供することができる。本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、３糖以上のキチンオリゴ糖に対しても優れた分解活性を有するものであり、また、シイタケ由来であることから安全かつ安心なものであるので、医薬品、食品、化粧品などの分野において利用されるＮ−アセチルグルコサミンのキチンからの製造に適したものである。

実施例１における本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である（左レーンが分子量マーカーで右レーンが本発明の酵素）。 実施例３において本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの酵素活性に対するｐＨ及び温度の影響を調べた結果である。 実施例４における本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼのコロイダルキチンに対する分解活性の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果である。 実施例６におけるシイタケの水溶性抽出物のキチン分解活性を示すグラフである。

本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミン系基質（ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ）のみならず、Ｎ−アセチルガラクトサミン系基質（ｐＮＰ−ＧａｌＮＡｃ）も分解する作用を有し、グルコース系基質（ｐＮＰ−Ｇｌｃ）を分解する作用を有しないことから、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであると同定されたものである。

本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、シイタケ（レンチヌラ・エドデス：Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）由来のものである。しかしながら、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、シイタケ由来のものに限定されるわけではなく、他の担子菌由来のものなどであってもよい。なお、担子菌由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとしては、Ｏｈｔａｋａｒａらによって報告されている朱茸（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）由来のもの（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４５：２３９−２４７，１９８１）や、Ｓｏｎｅらによって報告されているシロキクラゲ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）由来のもの（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８３：１１３５−１１４４，１９７８）などがあるが、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの分子量は７９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）であるのに対し、Ｏｈｔａｋａｒａらによって報告されているβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの分子量は６５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）であり、Ｓｏｎｅらによって報告されているβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの分子量は１２５ｋＤａ（サイズ排除クロマトグラフィーによる測定。この分子量が２量体の分子量であると仮定した場合には１分子の分子量は６２．５ｋＤａ）である。従って、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、既に知られているこれらの担子菌由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとは異なるものである。

本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼのシイタケからの単離精製は、担子菌由来の酵素を単離精製するための自体公知の方法に順じ、例えば以下の方法に従って行うことができる。まず、シイタケの子実体を水や緩衝液に懸濁してシイタケ抽出液を得る。シイタケの子実体は、収穫された直後のナマのものであってもよいし、凍結保存されたものや乾燥後に粉砕されたものなどであってもよい。次に、得られたシイタケ抽出液に対して硫安沈殿や遠心分離などを行うことによって不溶物を除去し、上清を粗酵素液として得る。粗酵素液からの酵素の精製は、疎水カラム、限外濾過フィルタ、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどを適宜組み合わせ、酵素活性を指標にして粗酵素液を分画することで行うことができる。こうしてシイタケから単離精製された本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、以下の（ａ）〜（ｆ）の性質を有する。
（ａ）分子量は７９ｋＤａである（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
（ｂ）Ｎ末端に配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する
（ｃ）酵素至適ｐＨは３〜６である
（ｄ）ｐＨ５〜８で安定である
（ｅ）酵素至適温度は約５０℃である
（ｆ）６０℃で失活する

本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、基質特異性が広く、キチン２糖であるキトビオースに対してのみならず、３糖以上のキチンオリゴ糖、さらにはコロイダルキチンや微粉砕キチンに対しても優れた分解活性を有する。但し、甲殻類の殻などを構成する結晶性キチンに対しては分解活性を有しない。興味深い点は、３〜６糖のキチンオリゴ糖に対するＫ_ｍ値がキチン２糖に対するＫ_ｍ値よりも小さい点であり、これは即ち、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、キチン２糖に対するよりも３〜６糖のキチンオリゴ糖に対する方が高い親和性を有する（少なくとも２倍以上である）ことを意味している。前述のＯｈｔａｋａｒａらやＳｏｎｅらによって報告されている担子菌由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼについては、このような３糖以上のキチンオリゴ糖に対する高い親和性は知られていない。従って、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミンをキチンから製造する際、キチンが結晶性キチンである場合にはエンドキチナーゼとともに用いることで、エンドキチナーゼによってキチンが分解されて生成したキチンオリゴ糖を効果的に分解することができる。また、結晶性キチンを予めコロイダルキチンや微粉砕キチンに加工しておけば、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを単独で用いてキチンを分解することができる。

シイタケから単離精製された本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、食品由来の酵素であるので、安全かつ安心なものである。従って、医薬品、食品、化粧品などの分野において利用されるＮ−アセチルグルコサミンのキチンからの製造に適したものである。本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを用いてキチンからＮ−アセチルグルコサミンを製造する際、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは高度に精製されたものを用いてもよいし、粗精製段階のものを用いてもよい。また、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを含むシイタケ抽出物を用いてもよい。本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを含むシイタケ抽出物を用いた場合、Ｎ−アセチルグルコサミンとシイタケ抽出物に含まれるシイタケ由来の有効成分を含んだ組成物を得ることができ、こうした組成物は、例えば機能性食品素材などとして利用することができる。また、シイタケの水溶性抽出物は、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを含んでいるので、シイタケの水溶性抽出物を単独で用いるかエンドキチナーゼとともに用いることで、Ｎ−アセチルグルコサミンをキチンから製造することができる。

また、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、以下の（ａ）のタンパク質や（ｂ）のタンパク質からなる。（ａ）のタンパク質は、上述のＮ末端に配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するシイタケ由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼに相当し、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列の最初の部分が、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対応する。配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸からなる部分は、シグナルペプチドと推定される部分である。（ｂ）のタンパク質において規定される「数個」は、３０個までが望ましく、２０個までがより望ましく、１０個までが最も望ましい。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列のタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質

上記の（ａ）のタンパク質や（ｂ）のタンパク質は、これらのタンパク質をコードするβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子、具体的には、以下の（ａ）のＤＮＡや（ｂ）のＤＮＡを含むβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を利用して、自体公知の遺伝子工学的手法によって産生することができる。配列番号３で表される塩基配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のタンパク質をコードしている（終止コドンを含む）。（ｂ）のＤＮＡにおいて規定されるストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件、例えば、相同性（塩基が一致する割合）が高いＤＮＡ同士（例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士）がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を意味し、具体的には、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ

上記の（ａ）のＤＮＡや（ｂ）のＤＮＡは、配列番号３で表される塩基配列に基づいて、シイタケをはじめとする担子菌などのゲノム遺伝子から、ＰＣＲやＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションなどの自体公知の方法によって調製することができる他、化学合成によっても調製することができる。また、例えば市販の突然変異誘発キットを用いることで、これらのＤＮＡから、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有する人工改変タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。

上記の（ａ）のタンパク質や（ｂ）のタンパク質からなるβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することで得られる培養物から単離精製することによって得ることができる。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を含む組換えベクターは、（ａ）のタンパク質や（ｂ）のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むベクター、具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス由来、ワクシニアウイルス由来、アデノウイルス由来、レトロウイルス由来などのベクターを用いて自体公知の方法によって構築することができる。組換えベクターには発現を調節する制御配列が含まれていてもよい。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を含む組換えベクターを含む形質転換体は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８６）やＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）などの方法により、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を含む組換えベクターを宿主細胞に導入することによって得ることができる。宿主細胞としては、大腸菌などの細菌原核細胞、酵母などの真菌細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞を用いることができる。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を含む組換えベクターを含む形質転換体の培養方法は、宿主細胞に応じた自体公知の方法によって行えばよい。形質転換体を培養することで得られる培養物からの（ａ）のタンパク質や（ｂ）のタンパク質の単離精製は、自体公知の方法によって培養物からタンパク質成分を回収した後、硫安沈殿や遠心分離、疎水カラム、限外濾過フィルタ、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどを適宜組み合わせ、酵素活性を指標にして行うことができる。こうして得られたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミンのキチンからの製造に用いることができる。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの単離精製
（１）粗酵素液の調製
レンチヌラ・エドデス（Ｈ６００）株を用い、菌傘の膜が切れた段階で子実体を収穫し、−８０℃にて保存した。子実体３２０ｇを液体窒素内で粉砕し、３２０ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、３０分間撹拌することでタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質は７０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿化し、遠心分離（３０ｍｉｎ，４，５００ｘｇ）により回収した。回収した沈殿を５０ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、遠心分離（３０ｍｉｎ，１０，０００ｘｇ）後の上清を粗酵素液とした。

（２）酵素の精製
粗酵素液に３０％飽和硫酸アンモニウムを加え、３０％飽和硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｃｏｌｕｍｎ（１．６ｘ１０ｃｍ、東ソー）に流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで供した。キチンオリゴ糖分解活性を示したカラム未吸着画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ，５，０００ ＮＭＷＬ ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外濾過により濃縮及び脱塩処理を行った後、ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ（０．５ｘ５ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで供した。カラム吸着画分を緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））中のＮａＣｌ濃度を直線的に増加（０−０．５Ｍ）させることで溶出させた。キチンオリゴ糖分解活性を示した画分を回収し、上述の限外濾過により濃縮及び脱塩処理を行った後、さらにＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＡＫ ６５０Ｓ（０．８ｘ ７．５ｃｍ、東ソー）に流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで供した。カラム吸着画分を緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））のＮａＣｌ濃度を直線的に増加（０−０．５Ｍ）させることで溶出させた。キチンオリゴ糖分解活性を示した画分を回収し、濃縮後、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３０ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（１．０ｘ３０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相として流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで供することで、目的とする本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを得た。こうして得られた精製酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アトー、パジェル、アクリルアミド濃度１０％）で分離し、単一バンドであることを確認した。この精製酵素の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で７９ｋＤａであった（図１：左レーンが分子量マーカーで右レーンがこの精製酵素）。この精製酵素のＮ末端のアミノ配列をペプチドシークエンスサービス（ニッピ）にて解析したところ、ＬＷＰＬＰＴＤＦＳＴＧＴＡＡＬ（配列番号１）であった。なお、キチンオリゴ糖分解活性は、０．３２ｍＭの４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−ｔｒｉａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄｅ（４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ_３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として用い、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）中、３７℃で１５分間測定し、等量の０．４Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３を加えることで反応を停止させることで行った。遊離したＭＵは分光光度計により測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｔ ３６５ｎｍ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｔ ４４５ｎｍ）。

実施例２：本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの基質特異性
（方法）
ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ（ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ（ｐＮＰ−ＧａｌＮＡｃ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ｐＮＰ−Ｇｌｃ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＧｌｃＮＡｃ_２−６、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｂｉｏｂｕｓｉｎｅｓｓ）、カニ殻由来結晶性キチン（Ｗａｋｏ）、コロイダルキチン（Ｈｓｕ ａｎｄ Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，１９７５）、微粉砕キチン（コンバージミル粉砕物）を基質として用い、実施例１で得た精製酵素の基質特異性を評価した。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．２中、３７℃で１５分間測定し、等量の０．４Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３を加えることで反応を停止させることで行った。ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮＰ−ＧａｌＮＡｃ、ｐＮＰ−Ｇｌｃを基質とした測定においては、遊離したｐＮＰを分光光度計により測定した。ｐＮＰの吸光係数は１７，１００Ｍ^−１ｃｍ^−１とした。ＧｌｃＮＡｃ_２−６及びキチンからのＧｌｃＮＡｃの生成量の測定は、Ｎｅｍａｔら（ＪＢＣ ２７１，１９９６）の手順に沿ったＭｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法により行った。精製酵素の速度パラメータは、０．０５−０．５ｍＭの各基質に対する３．１ｎＭの精製酵素の活性測定値をもとに、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを用いて算出した。

（結果）
この精製酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン系基質（ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ）のみならず、Ｎ−アセチルガラクトサミン系基質（ｐＮＰ−ＧａｌＮＡｃ）も分解する作用を有し、グルコース系基質（ｐＮＰ−Ｇｌｃ）を分解する作用を有しないことから、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであると同定された。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、これまでにも様々な生物から見出されているが、その多くは、キチン２糖であるキトビオースに対しては分解活性が高いものの、３糖以上のキチンオリゴ糖に対しては分解活性が低い。しかしながら、この精製酵素は、基質特異性が広く、キチン２糖であるキトビオースに対してのみならず、３糖以上のキチンオリゴ糖、さらにはコロイダルキチンや微粉砕キチンに対しても優れた分解活性を有することがわかった（コロイダルキチンと微粉砕キチンに対する比活性（タンパク質重量比）はそれぞれ４６．３Ｕ／ｍｇと３９．９Ｕ／ｍｇ）。ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮＰ−ＧａｌＮＡｃ、キチンオリゴ糖（２−６糖）を基質とした場合のこの精製酵素の速度パラメータを算出したところ、この精製酵素は、短鎖の基質（ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びキチン２糖であるキトビース）に対して高いｋ_ｃａｔ値を示すとともに、キチン６糖であるキトヘキサオースに対してもキチン２糖であるキトビオースに対するｋ_ｃａｔ値の約４０％のｋ_ｃａｔ値を示した。一方で、キチン２糖であるキトビオースに対するＫ_ｍ値と比較して、キチン４糖であるキトテトラオースに対するＫ_ｍ値は６．０倍低く、キチン６糖であるキトヘキサオースに対するＫ_ｍ値は４．３倍低いことから、この精製酵素は、キチン２糖に対するよりも３−６糖のキチンオリゴ糖に対する方が高い親和性を有することがわかった（表１）。

実施例３：本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの酵素活性に対するｐＨ及び温度の影響
０．３２ｍＭの４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ_３を基質として用い、実施例１で得た精製酵素の酵素活性に対するｐＨ及び温度の影響を調べた。ｐＨの影響は、５０ｍＭクエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０−５．０）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０−６．０）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）を用いて調べた。各緩衝液中で酵素活性を３７℃において測定した結果、この精製酵素の至適ｐＨは３−６であることがわかった（酵素反応時間２０分間）。各ｐＨで酵素液を４℃で２４時間処理し、残存活性を測定することでｐＨ安定性を評価したところ、この精製酵素はｐＨ５−８で安定であることがわかった。また、至適温度を評価するため、１０−８０℃における酵素活性を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）中で測定した結果、この精製酵素は５０℃で最も高い酵素活性を示した（酵素反応時間２０分間）。さらに、温度安定性を評価するため、各温度で酵素液を３０分間インキュベートし、残存活性を測定したところ、この精製酵素は１０−４０℃までは安定であったが、６０℃における処理で酵素活性はほぼ失活した（図２）。

実施例４：本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼのコロイダルキチンに対する分解活性の高速液体クロマトグラフィーによる分析
コロイダルキチン（２％）と実施例１で得た精製酵素（０．９２ｎＭ）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）中、３０℃で反応させた。反応液の上清をＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｘ２５０ｍｍ、東ソー）を用いたＨＰＬＣシステムに供した。移動相として６５％のアセトニトリルを用い、流速は１．０ｍＬ、カラム温度は８０℃とした。キチン分解物はＵＶ２０５ｎｍにおいて検出した。その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンが唯一の生成物として得られ、その生成量は経時的に増加した。よって、この精製酵素は、非晶性キチンに対してエキソ型のキチナーゼ活性を有することが推定された。反応開始から３時間後における反応液中のＮ−アセチルグルコサミン濃度は０．２ｍＭであった（図３）。

実施例５：本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの遺伝子のクローニング
レンチヌラ・エドデス（Ｈ６００）株の子実体より、Ｙｅａｓｔ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。３’ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡをＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてマニュアルに従って合成した。実施例１で得た精製酵素のＮ末端配列をもとに作製した遺伝子に特異的なプライマー（ｃｈｉ４−３Ｕ：５’−ＡＣＮＧＹＮＧＹＮＡＴＧＧＴＮＴＧＧＡＴ−３’（配列番号４）及びｃｈｉ４−４Ｕ：５’−ＴＧＧＴＧＹＧＡＹＣＣＮＴＴＹＡＡＲＡＣ−３’（配列番号５））と、ＵＰＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号６）及び５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号７））を用い、変性９４℃３０秒間，アニーリング５５℃３０秒間、伸長反応７２℃１分間で、Ｅｘ−Ｔａｑを用いてＰＣＲを行った。５’ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡはＧｅｎｅＲＡＣＥＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてマニュアルに従って合成した。１ｓｔＰＣＲではＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’ｐｒｉｍｅｒ及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒと、遺伝子に特異的なプライマー（ｃｈｉ４−５６−ＲＡＣＥＬ：５’−ＡＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＴ−３’（配列番号８）及びｃｈｉ４−９３−ＲＡＣＥＬ：５’−ＣＴＣＧＧＴＣＣＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号９））を用い、変性９４℃３０秒間、アニーリング５５℃３０秒間、伸長反応７２℃１分間で、Ｅｘ−Ｔａｑを用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片はＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニング後、シークエンス反応を行い、１６５９ｂｐからなるこの精製酵素の遺伝子配列をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ ジェネティックアナライザにより決定した（配列番号３：終止コドンを含むため１６６２ｂｐ）。この塩基配列から、この精製酵素のアミノ酸配列は、配列番号２で表される５５３残基のアミノ酸配列であることが推定されたが、この精製酵素のＮ末端のアミノ酸配列（配列番号１）及びＳｉｇｎａｌＰ ４．０ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）による解析結果から、Ｎ末端から１〜１７番目のアミノ酸からなる部分はシグナルペプチド、成熟タンパク質はＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるものと考えられた。ゲノムデータベースとの照合から、この精製酵素は、糖質加水分解酵素（ＧＨ：Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）ファミリー２０に属するものであり、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（初期設定）にて相同性の高いタンパク質を検索したところ、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（ウシグソヒトヨタケ、ＸＰ ００１８３５６３８）、Ｐｏｓｔｉａ ｐｌａｃｅｎｔａ（ＸＰ ００２４７２４６５）、Ｓｅｒｐｕｌａ ｌａｃｒｙｍａｎｓ（ナミダタケ、ＥＧＮ９７８９３）などの担子菌由来のものが見出された。また、ＤＯＥ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）で公開されている担子菌のゲノムデータベースとの照合から、相同性の高いタンパク質として、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｐｉｎｉｃｏｌａ（ツガサルノコシカケ、ＩＤ ｎｕｍｂｅｒ ｆｒｏｍ ＤＯＥ ＪＧＩ １２９０７５）、Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ ａｎｎｏｓｕｍ（マツノネクチタケ、１５１２６６）、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（マッシュルーム、１２０５９８）などが見出された（相同性はいずれも６０％程度）。前述のＯｈｔａｋａｒａらやＳｏｎｅらによって報告されている担子菌由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの遺伝子クローニングは行われていない。従って、この実験は、担子菌由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの遺伝子クローニングによる同定を行った初めての成功例となった。

実施例６：シイタケの水溶性抽出物のキチン分解活性
実施例１で得た粗酵素液（シイタケ子実体抽出液、タンパク質含量：１．６μｇ）、市販キチナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来、ＳＩＧＭＡ、タンパク質含量：２．４μｇ）、これらの２つの混合酵素液のそれぞれに対し、カニ殻由来の結晶性キチン（Ｗａｋｏ、１ｍｇ）を混合し、０．１ｍＬの５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．２）中、３７℃で反応させた。その結果、実施例１で得た粗酵素液のみを作用させた場合には結晶性キチンからＮ−アセチルグルコサミンはほとんど生成しなかったが、市販キチナーゼとともに作用させると、市販キチナーゼのみを作用させた場合よりも生成量が大幅に増大し、反応開始から３時間後における生成量は、市販キチナーゼのみを作用させた場合の生成量の１４．４倍に達した（図４）。以上の結果から、シイタケの水溶性抽出物をキチナーゼとともに用いることで、結晶性キチンを効率的に分解してＮ−アセチルグルコサミンを製造できることがわかった。

本発明は、キチンを分解することでＮ−アセチルグルコサミンを得る際に有用な、食品由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとして、シイタケ由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (10)

1. 以下の（ａ）〜（ｆ）の性質を有するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ。
   （ａ）分子量は７９ｋＤａである（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定）
   （ｂ）Ｎ末端に配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する
   （ｃ）酵素至適ｐＨは３〜６である
   （ｄ）ｐＨ５〜８で安定である
   （ｅ）酵素至適温度は約５０℃である
   （ｆ）６０℃で失活する
2. 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなるβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ。
   （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列のタンパク質
   （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質
3. 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子。
   （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列のタンパク質
   （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１８番目のアミノ酸からはじまる５３６残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質
4. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子。
   （ａ）配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡ
   （ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
5. 請求項３又は４記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
6. 請求項５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
7. 請求項６記載の形質転換体を培養することで得られる培養物から単離精製することによる請求項１又は２記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの取得方法。
8. 担子菌からの単離精製による請求項１又は２記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの取得方法。
9. 請求項１又は２記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを単独で用いるかキチナーゼとともに用いてキチンを分解することによるＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
10. 担子菌の水溶性抽出物を単独で用いるかキチナーゼとともに用いてキチンを分解することによるＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。