CN110387364B - 一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用 - Google Patents

一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用。该重组几丁质酶为将β‑N‑乙酰己糖胺酶和几丁质酶融合在一起得到的几丁质酶活性高于所述β‑N‑乙酰己糖胺酶和所述几丁质酶的蛋白质，所述几丁质酶为D1)或D2)的蛋白质：D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第51‑791位氨基酸残基的蛋白质；D2)在D1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。本发明的重组几丁质酶具有完全水解几丁质，产生Glc NAc的能力，可广泛用于生物医药、生物农业(如食品)、生物农业(如饲料添加剂)、化妆品、能源工业等。

Description

一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及生物领域中的一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用。
背景技术
几丁质(chitin)又称壳聚糖，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAC)为单体，通过β-1，4-糖苷键连接而成的高分子多聚物。几丁质以三种形态存在于自然界中，即α、β、γ晶型。几丁质广泛存在于自然界中，是储量仅次于纤维素的一种天然的生物多聚物，也是仅次于蛋白质的第二大含氮天然有机化合物。真菌的细胞壁、鱿鱼软骨，尤其是水生甲壳类动物的外壳中，几丁质的含量非常丰富。
几丁质酶是水解几丁质的一类糖苷水解酶，根据几丁质的水解过程，可将几丁质酶分为内切型和外切型，内切几丁质酶是随机作用于几丁质内部的β-1,4键，生成可溶性低分子壳寡糖；外切几丁质酶分两类：一类是从几丁质非还原性末端释放二乙酰壳二糖，另一类是水解低分子壳寡糖为N-乙酰葡萄糖胺，即β-N-乙酰己糖胺酶。因此在几丁质水解过程中，β-N-乙酰己糖胺酶发挥重要作用。
β-N-乙酰己糖胺酶，广泛存在于微生物(细菌、古细菌、真菌等)、植物真核动物(节肢动物和哺乳动物内均有发现)中，其中微生物来源的β-N-乙酰己糖胺酶获得最早的研究。几丁质可被内切几丁质酶水解生成壳寡糖，β-N-乙酰己糖胺酶可进一步水解壳寡糖生成GlcNAc。GlcNAc可应用于制药、功能性食品及化妆品等领域。
微生物来源的几丁质酶的开发是目前研究的一个热点。微生物来源的几丁质酶具有多样性，即使是同一种微生物有时也会产生出几种不同的几丁质酶。在同一种微生物中存在的几丁质酶也很可能性质不同。即使是来自同一家族的几丁质酶，其催化机制也有所不同。微生物中的几丁质酶多为酸性酶，且多为18家族的酶。大多微生物几丁质酶为内切几丁质酶，链霉菌可同时产生内切和外切几丁质酶。
几丁质被几丁质酶降解后所得到的寡糖片段-氨基寡糖素，可作为植物功能的调节剂，控制植物基因的开放与关闭，诱导植物自身产生抗性酶，调节植物的生长并增强植物对病原真菌的抗性；几丁质酶可用做食品添加剂，在食品生产中，可与传统的防腐措施(如山梨酸盐)或与其它的抗微生物酶(如葡萄糖氧化酶)一起使用可以提高食品微生物的安全性；环境治理方面，人们日常生活产生的如蟹壳虾壳等生活废物会造成水体的污染，因而会带来很大的环境问题，目前人们正在研究用微生物几丁质酶来处理这一问题。为饲农业、食品和环境治理提供经济有效、环境友好的候补酶，是几丁质酶应用于工业化生产所必需的。
几丁质水解产物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)广泛地用于治疗发炎性肠道病变，多发性坏死症和皮肤萎缩；其衍生物氨基葡萄糖可用于关节软骨的再生和治疗慢性肠炎；N-乙酰氨基葡萄糖具有甜味，由于其抗氧化性和激发机体免疫活性，可以代替葡萄糖等糖类用于食品和保健品的生产；同时，几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖还可以用于饲料、化妆品、生物燃料和土壤肥料，具有很高的经济价值(Cardozo et al.World J MicrobiolBiotechnol,2017.33(11):p.201.)。目前，几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖主要是用强酸水解的高污染低效的化学方法生产，而微生物酶法水解几丁质具有环境友好，低成本和高重复性的特点，因此，以几丁质为底物的生物转化技术是产业发展的方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何获得高效降解几丁质的重组几丁质酶(融合几丁质酶)。
为了解决以上技术问题，本发明提供了融合蛋白质。
本发明所提供的融合蛋白质是为将β-N-乙酰己糖胺酶和几丁质酶融合在一起得到的几丁质酶活性高于所述β-N-乙酰己糖胺酶和所述几丁质酶的蛋白质，所述几丁质酶为D1)或D2)的蛋白质：
D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第51-791位氨基酸残基的蛋白质；
D2)在D1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
上述融合蛋白质中，所述β-N-乙酰己糖胺酶可来源于链霉菌，如苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)。
上述融合蛋白质中，所述β-N-乙酰己糖胺酶可为A1)或A2)的蛋白质：
为A1)或A2)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第792-1302位氨基酸残基的蛋白质；
A2)在A1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
上述融合蛋白质中，所述融合蛋白质可为F1)-F3)中的任一蛋白质：
F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
F2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第51-1302位的蛋白质；
F3)将F1)或F2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
其中，SEQ ID No.2由1315个氨基酸残基组成。F1)的融合蛋白质名称为His-SaChi18E-HEX-His；F2)的融合蛋白质名称为SaChi18E-HEX。
上述融合蛋白质中，所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白和/或SUMO标签蛋白等。
与上述融合蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
与上述融合蛋白质相关的生物材料可为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码所述融合蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下B11)或B12)：
B11)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
B12)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第151-3906位的DNA分子。
上述生物材料中，SEQ ID No.1由3948个核苷酸组成，其编码序列是1-3948位核苷酸。B11)是His-SaChi18E-HEX-His基因；B12)是SaChi 18E-HEX基因。
上述生物材料中，B3)所述的重组载体具体可为pET30a(+)-SaChi18E-HEX，pET30a(+)-SaChi18E-HEX是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第145-3912位的DNA替换pET30a(+)的BamH I和HindⅢ识别位点间的片段(包括BamH I识别位点和HindⅢ识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到His-SaChi18E-HEX-His基因重组表达载体。
上述生物材料中，B4)的重组微生物可为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)肠杆菌科细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌，如大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
上述生物材料中，B4)的重组微生物具体可为将所述pET30a(+)-SaChi18E-HEX导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的重组蛋白质(名称为His-SaChi18E-HEX-His)的重组大肠杆菌。
上述生物材料中，B5)至B7)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。
本发明还提供了制备上述融合蛋白质的方法。
本发明所提供的上述融合蛋白质的方法，包括：使所述融合蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到所述融合蛋白质；所述生物为微生物、植物或非人动物。
上述方法中，所述微生物可为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)肠杆菌科细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌，如大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
上述融合蛋白质在作为几丁质酶中的应用也属于本发明的保护范围。该应用可为非疾病诊断目的、非疾病预防目的和/或非疾病治疗目的。
上述融合蛋白质、上述生物材料、上述方法在制备几丁质酶制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明将来源于链霉菌(Streptomyces alfalfae)的几丁质酶SaChi18E和来源于链霉菌(Streptomyces alfalfae)的β-N-乙酰己糖胺酶SaHEX融合在一起得到了几丁质酶活性高于单独的几丁质酶His-SaChi18E-His和单独的β-N-乙酰己糖胺酶His-SaHEX-His的重组蛋白质His-SaChi18E-HEX-His。实验证明本发明的融合几丁质酶最适pH为5.0，在40℃pH4.0-8.0都有较高的酶活性(具有70％以上的酶活力)；pH稳定性好，在pH 5.0-9.0之间均很稳定，具有80％以上的酶活力；最适温度为40℃。His-SaChi18E-HEX-His、His-SaChi18E-His和His-SaHEX-His的几丁质酶比活力(U/mol酶蛋白)分别为6032.86±228.8U/μmol酶蛋白、2955±72.6U/μmol酶蛋白和264.71±0.5U/μmol酶蛋白。His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系在反应4小时GlcNAc产率达到最大为98.5％，His-SaChi18E-His+His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系在反应8小时GlcNAc产率达到最大为98.5％，融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率(水解胶体几丁质的效率)是His-SaChi18E-His和His-SaHEX-His组合的2倍((98.5％÷4)÷(98.5％÷8)＝2))。His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系在反应24小时GlcNAc产率达到最大为85％，融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率(水解胶体几丁质的效率)是His-SaChi18E-His的7.0倍((98.5％÷4)÷(85％÷24)＝7.0))。His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系在反应24小时GlcNAc达到最大产率25％，融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率(水解胶体几丁质的效率)是His-SaHEX-His的23.6倍((98.5％÷4)÷(25％÷24)＝23.6))(图2)。
本发明的融合几丁质酶在室温条件下具有极好的催化效率，可降低几丁质酶在工业生产上的能源成本。其广泛的pH适应范围可大大拓宽其应用领域：本发明的融合几丁质酶可应用于环境治理，处理人们日常生活产生的如蟹壳虾壳等生活废物减少水体的污染。本发明的融合几丁质酶具有完全水解几丁质，产生Glc NAc的能力，本发明的融合几丁质酶可广泛用于生物医药、生物农业(如食品)、生物农业(如饲料添加剂)、化妆品、能源工业等。
附图说明
图1为目的蛋白的SDS-PAGE分析。M为蛋白质分子量标准；1为从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E-HEX菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品；2为从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品；3为从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaHEX菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品。
图2为His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系、His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系、His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系和His-SaChi18E-His+His-SaHEXhex-His水解胶体几丁质体系反应不同时间的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的产率。
图3为His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系反应4小时的HPLC图谱。图中，上图为由DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6按照1:1的摩尔比混合得到的标准品的HPLC图谱，DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6分别为标准品GlcNAc、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3、(GlcNAc)4、(GlcNAc)5和(GlcNAc)6；下图为His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系反应4小时的HPLC图谱。
图4为His-SaChi18E-His+His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系反应8小时的HPLC图谱。图中，上图为由DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6按照1:1的摩尔比混合得到的标准品的HPLC图谱，DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6分别为标准品GlcNAc、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3、(GlcNAc)4、(GlcNAc)5和(GlcNAc)6；下图为His-SaChi18E-His+His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系反应8小时的HPLC图谱。
图5为His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系反应24小时的HPLC图谱。图中，上图为由DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6按照1:1的摩尔比混合得到的标准品的HPLC图谱，DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6分别为标准品GlcNAc、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3、(GlcNAc)4、(GlcNAc)5和(GlcNAc)6；下图为His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系反应24小时的HPLC图谱。
图6为His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系反应24小时的HPLC图谱。图中，上图为由DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6按照1:1的摩尔比混合得到的标准品的HPLC图谱，DP1、DP2、DP3、DP4、DP5和DP6分别为标准品GlcNAc、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3、(GlcNAc)4、(GlcNAc)5和(GlcNAc)6；下图为His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系反应24小时的HPLC图谱。
图7为融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的性质。图中，a为融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的最适温度测定结果；b为融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的温度稳定性测定结果；c为融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的最适pH测定结果；d为融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的pH稳定性测定结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，表达载体pET30a(+)为invitrogen公司(美国)的产品，感受态细胞E.coli BL21(DE3)为TransGen Biotech Co.(中国北京)产品。
下述实施例中的标准品N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为BBI Life Sciences公司产品，货号为A602245-0025。
下述实施例中的胶体几丁质均按照如下方法制备：将10g几丁质溶解于200mL浓盐酸中，之后加入500mL 50％乙醇水溶液并搅拌5min，4℃放置24h。离心收集沉淀，用蒸馏水调节pH为7。最后用蒸馏水定容，4℃保存，得到胶体几丁质。其中，几丁质购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A500659-0100。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
实施例1、制备融合几丁质酶SaChi18E-HEX和His-SaChi18E-HEX-His及其对胶体几丁质的酶催化效率的测定
删除GenBank Acession Number WP_076687152(12-APR-2018)的链霉菌(Streptomyces alfalfae)几丁质酶的信号肽(第1-33位氨基酸残基)得到成熟几丁质酶(氨基酸序列是GenBank Acession Number WP_076687152(12-APR-2018)的第34-774位氨基酸残基，将其命名为SaChi18E)；删除GenBank Acession Number AYR18867.1(12-NOV-2018)的链霉菌(Streptomyces alfalfae)β-N-乙酰己糖胺酶的信号肽(氨基酸序列是第1-25位氨基酸残基)得到成熟β-N-乙酰己糖胺酶(氨基酸序列是GenBank Acession NumberAYR18867.1(12-NOV-2018)的第26-536位氨基酸残基，将其命名为SaHEX)。
将上述成熟几丁质酶SaChi18E和上述成熟β-N-乙酰己糖胺酶SaHEX融合在一起得到融合蛋白，将其命名为SaChi18E-HEX。SaChi18E-HEX的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第51-1302位的蛋白质。
采用pET30a(+)作为表达载体，在E.coli BL21(DE3)中原核表达SaChi18E-HEX，得到含有SaChi18E-HEX的融合蛋白质His-SaChi18E-HEX-His(氨基酸序列是SEQ ID No.2)。
采用pET30a(+)作为表达载体，在E.coli BL21(DE3)中原核表达SaChi18E(氨基酸序列是GenBank Acession Number WP_076687152(12-APR-2018)的第34-774位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第51-791位氨基酸残基)得到含有SaChi18E的融合蛋白质His-SaChi18E-His(是将SEQ ID No.2的第792-1302位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质)。其中，His-SaChi18E-His是His-SaChi18E-HEX-His的对照蛋白质，区别仅在于His-SaChi18E-His是将His-SaChi18E-HEX-His中的SaHEX缺失得到的蛋白质；SaChi18E是SaChi18E-HEX的对照蛋白质，区别仅在于SaChi18E是将SaChi18E-HEX中的SaHEX缺失得到的蛋白质。
采用pET30a(+)作为表达载体，在E.coli BL21(DE3)中原核表达SaHEX(氨基酸序列是GenBank Acession Number AYR18867.1(12-NOV-2018)的第26-536位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第792-1302位氨基酸残基)，得到含有SaHEX的融合蛋白质His-Sahex-His(是将SEQ ID No.2的第51-791位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质)作为对照。其中，His-SaHEX-His是His-SaChi18E-HEX-His的对照蛋白质，区别仅在于His-SaHEX-His是将His-SaChi18E-HEX-His中的SaChi18E缺失得到的蛋白质；SaHEX是SaChi18E-HEX的对照蛋白质，区别仅在于SaHEX是将SaChi18E-HEX中SaChi18E的缺失得到的蛋白质。
下面具体阐明SaChi18E-HEX和His-SaChi18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率优于SaChi18E、His-SaChi18E-His、SaHEX和His-SaHEX-His。具体实验方法和实验结果如下：
1、制备重组菌
1.1本步骤制备了三种融合基因，分别为His-SaChi18E-HEX-His基因，His-SaChi18E-His基因和His-SaHEX-His基因。
His-SaChi18E-HEX-His基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1由3948个核苷酸组成。His-SaChi18E-HEX-His基因含有SaChi18E-HEX基因，SaChi18E-HEX基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第151-3906位核苷酸。SEQ ID No.1所示的His-SaChi18E-HEX-His基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白质His-SaChi18E-HEX-His。
His-SaChi18E-His基因是His-Sachi18e-hex-His基因的对照基因，His-SaChi18E-His基因是将SEQ ID No.1的第2374-3906位核苷酸(Sahex基因)缺失得到的DNA分子。His-SaChi18E-His基因含有SaChi18E基因，SaChi18E基因的核苷酸序列是SEQ IDNo.1的第151-2373位核苷酸。His-SaChi18E-His基因编码蛋白质His-SaChi18E-His，His-SaChi18E-His是将SEQ ID No.2的第792-1302位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。SaChi18E基因编码蛋白质SaChi18E，SaChi18E的氨基酸序列是GenBank Acession Number WP_076687152(12-APR-2018)的第34-774位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第51-791位氨基酸残基。
His-SaHEX-His基因是His-SaChi18E-HEX-His基因的对照基因，His-SaHEX-His基因是将SEQ ID No.1的第151-2373位核苷酸(SaChi18E基因)缺失得到的DNA分子。His-SaHEX-His基因含有Sahex基因，Sahex基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第2374-3906位核苷酸。His-SaHEX-His基因编码蛋白质His-SaHEX-His，His-SaHEX-His是将SEQ ID No.2的第51-791位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。SaHEX基因编码蛋白质SaHEX，SaHEX的氨基酸序列是GenBank Acession NumberAYR18867.1(12-NOV-2018)的第26-536位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第792-1302位氨基酸残基。
1.2用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第145-3912位的DNA替换pET30a(+)的BamH I和HindⅢ识别位点间的片段(包括BamH I识别位点和HindⅢ识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到His-SaChi18E-HEX-His基因重组表达载体pET30a(+)-SaChi18E-HEX。pET30a(+)-SaChi18E-HEX含有SEQ ID No.1所示的His-SaChi18E-HEX-His基因。
pET30a(+)-SaChi18E-HEX在E.coli BL21(DE3)中可表达氨基酸序列是SEQ IDNo.2的蛋白质His-SaChi18E-HEX-His。
将重组表达载体pET30a(+)-SaChi18E-HEX中的His-SaChi18E-HEX-His基因替换为上述His-SaChi18E-His基因，得到His-SaChi18E-His基因重组表达载体pET30a(+)-SaChi18E。pET30a(+)-SaChi18E在E.coli BL21(DE3)中可表达上述蛋白质His-SaChi18E-His。
将重组表达载体pET30a(+)-SaChi18E-HEX中的His-SaChi18E-HEX-His基因替换为上述His-SaHEX-His基因，得到His-SaHEX-His基因重组表达载体pET30a(+)-SaHEX。pET30a(+)-SaHEX在E.coli BL21(DE3)中可表达上述蛋白质His-SaHEX-His。
1.3将步骤1.2中的pET30a(+)-SaChi18E-HEX、pET30a(+)-SaChi18E、pET30a(+)-Sa HEX和pET30a(+)这4种表达载体分别单独转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pET30a(+)-SaChi18E-HEX的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E-HEX，将测序结果表明含有pET30a(+)-SaChi18E的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E，将测序结果表明含有pET30a(+)-SaHEX的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)-SaHEX，将测序结果表明含有pET30a(+)的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)(空载体对照)。
2、制备融合蛋白SaChi18E-HEX和His-SaChi18E-HEX-His
将BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E-HEX、BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E、BL21(DE3)/pET30a(+)-SaHEX和BL21(DE3)/pET30a(+)这四种菌株分别按0.5％的接种量单独接种于30mL的LB小瓶液体培养基(含有50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中培养活化12-16小时。然后取适量活化好的菌液按1％的接种量，接种到300mL的大瓶LB培养液(含50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中，连续培养2.5-3小时(利用紫外分光光度计确定培养菌液OD600值为0.8，以含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)，加入IPTG(经过0.22μm滤膜过滤灭菌)至IPTG的含量为0.6mM，在30℃、220rpm的振荡摇床中诱导培养6小时。将上述诱导培养菌液转移至离心杯，于4000rpm转速，离心10分钟，弃上清液，用5mL缓冲液重悬菌体，并回收菌体，将重悬菌体收集至10mL离心管内。在冰水浴条件下，用超声波细胞破碎仪对重悬混浊液进行超声波细胞破碎。设置破碎仪器功率为200W，超声波工作时间4秒，间隔时间3秒，破碎时间为30分钟。破碎完成后，立即于转速12,000rpm、4℃离心菌液10分钟，收集上清液，将该上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：300mmol/L NaCl，50mmol/L NaH2PO4，10mmol/L咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：300mmol/L NaCl，50mmol/L NaH2PO4，50mmol/L咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：300mmol/L NaCl，50mmol/L NaH2PO4，350mmol/L咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋白样品。将镍柱纯化目的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，结果表明从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E-HEX菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品含有大小为142.2kDa的目的蛋白His-SaChi18E-HEX-His，从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChi18E菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品含有大小为86.6kDa的目的蛋白His-SaChi18E-His，从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaHEX菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品含有大小为62.5kDa的目的蛋白His-SaHEX-His，从BL21(DE3)/pET30a(+)菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品中没有外源目的蛋白(图1)。
将镍柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品(分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His、分子筛纯化的His-SaChi18E-His和分子筛纯化的His-SaHEX-His)。将分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明His-SaChi18E-HEX-His的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3、SaChi18E-HEX和His-SaChi 18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率(水解胶体几丁质的效率)优于SaChi18E、His-SaChi18E-His、SaHEX和His-SaHEX-His
用步骤2得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His、分子筛纯化的His-SaChi18E-His和分子筛纯化的His-SaHEX-His配制如下4个水解胶体几丁质体系：His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系、His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系、His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系和His-SaChi18E-His+His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系。
His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系由His-SaChi18E-HEX-His、胶体几丁质和pH5.0的10mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(溶剂)组成。His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系中，His-SaChi18E-HEX-His的含量为0.001μmol/L，胶体几丁质的体积含量为1％。
His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系由His-SaChi18E-His、胶体几丁质和pH5.0的10mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(溶剂)组成。His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系中，His-SaChi18E-His的含量为0.002μmol/L，胶体几丁质的体积含量为1％。
His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系由His-SaHEX-His、胶体几丁质和pH5.0的10mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(溶剂)组成。His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系中，His-SaHEX-His的含量为0.002μmol/L，胶体几丁质的体积含量为1％。
His-SaChi18E-His+His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系由His-SaChi 18E-His、His-SaHEX-His、胶体几丁质和pH5.0的10mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(溶剂)组成。His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系中，His-SaChi18E-His的含量为0.001μmol/L，His-SaHEX-His的含量为0.001μmol/L，胶体几丁质的体积含量为1％。
将上述4个水解胶体几丁质体系分别进行如下操作：将水解胶体几丁质体系在40℃条件下进行反应，在不同的反应时间下取出部分样品，加入等量70％乙腈水溶液终止反应，保存在-20℃冰箱内，所得样品上机前，用0.22μm水系滤膜进行过滤，用SHODEX Amino-P50 4E column(Showa Denko),蒸发光散射HPLC进行产物分析。以70％乙腈水溶液(乙腈和水的体积比为70：30的液体)作为流动相,流速：1.0mL/min,进样量5μl。以GlcNAc为标准品采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。实验重复三次，每次重复实验每个水解胶体几丁质体系每个反应时间设置3个重复。
以N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-乙酰氨基葡萄糖)(GlcNAc)的产率为纵坐标，以反应时间为横坐标，绘制酶催化效率曲线。其中，N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的产率(％)＝GlcNAc产量(mg)/[初始几丁质的质量(mg)*1.08]*100。
结果表明His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系在反应4小时GlcNAc产率达到最大为98.5％，His-SaChi18E-His+His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系在反应8小时GlcNAc产率达到最大为98.5％，融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率(水解胶体几丁质的效率)是His-SaChi18E-His和His-SaHEX-His组合的2倍((98.5％÷4)÷(98.5％÷8)＝2))。His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系在反应24小时GlcNAc产率达到最大为85％，融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率(水解胶体几丁质的效率)是His-SaChi18E-His的7.0倍((98.5％÷4)÷(85％÷24)＝7.0))。His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系在反应24小时GlcNAc达到最大产率25％，融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His对胶体几丁质的酶催化效率(水解胶体几丁质的效率)是His-SaHEX-His的23.6倍((98.5％÷4)÷(25％÷24)＝23.6))(图2)。
His-SaChi18E-HEX-His水解胶体几丁质体系在反应4小时的HPLC检测结果表明，水解产物为GlcNAc(产物纯度为98.5％)，胶体几丁质被完全水解为了GlcNAc(图3)。
His-SaChi18E-His+His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系在反应8小时的HPLC检测结果表明水解产物为GlcNAc(产物纯度为98.5％),胶体几丁质被完全水解为了GlcNAc(图4)。
His-SaChi18E-His水解胶体几丁质体系在反应24小时的HPLC检测结果表明，水解产物为GlcNAc和GlcNAc2(产物纯度为85％)(图5)。
His-SaHEX-His水解胶体几丁质体系在反应24小时的HPLC检测结果表明，水解产物为GlcNAc(产物纯度为25％)(图6)。
实施例2、融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的几丁质酶活性分析
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定几丁质酶活力：向1mL pH5.0的200mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入0.1mL酶液(溶剂是pH5.0的200mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)和0.2mL胶体几丁质得到酶促反应体系，40℃反应5min，反应完成后加入0.4mLDNS，煮沸10min，离心后测定OD540nm。1个酶活单位(U)定义为在上述条件下，每分钟分解胶体几丁质释放1μmol N-乙酰氨基-D-葡萄糖(GlcNAc)所需的酶量。实验重复三次。
结果表明实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His、分子筛纯化的His-SaChi18E-His和分子筛纯化的His-Sahex-His的几丁质酶比活力分别为6032.86±228.8U/μmol酶蛋白、2955±72.6U/μmol酶蛋白和264.71±0.5U/μmol酶蛋白。
实施例3、融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的性质测定
按照如下方法测定实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His的性质。
1、融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的最适pH和pH稳定性的测定
1.1融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的最适pH测定
将实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His在不同pH的缓冲液下进行酶促反应以测定其最适pH。使用的缓冲液分别为0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0-6.0)、0.2mol/L磷酸氢二钠0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)、0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0-12.0)。采用实施例2中的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定His-SaChi 18E-HEX-His在上述缓冲液中的几丁质酶活力，只是将实施例2中的pH5.0的200mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液替换为相应的上述缓冲液，将酶液溶剂替换为相应的上述缓冲液，其它操作相同。以His-SaChi18E-HEX-His在pH5.0的几丁质酶活性为100％。实验重复三次。
结果表明，His-SaChi 18E-HEX-His的最适pH为5.0，在pH4.0-8.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的70％以上(图7中c)。
1.2融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的pH稳定性测定
将实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His在下述不同pH的缓冲液中37℃处理60min：0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 3.0-6.0)、0.2mol/L磷酸氢二钠0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)、0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0-12.0)。然后采用实施例2中的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定经过上述处理的His-SaChi18E-HEX-His的几丁质酶活力。以His-SaChi18E-HEX-His在pH5.0的几丁质酶活性为100％。实验重复三次。
融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.0缓冲液体系中40℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果表明融合几丁质酶在pH 5.0-9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性(图7中d)。
2、融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的最适温度及热稳定性测定
2.1融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的最适温度测定
采用实施例2中的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His的几丁质酶活力，只是将反应温度40℃分别替换为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃，其它操作相同。以His-SaChi18E-HEX-His在40℃的几丁质酶活性为100％。实验重复三次。
结果表明His-SaChi18E-HEX-His的最适温度为40℃(图7中a)。
2.2融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的热稳定性测定
将实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His分别在如下温度30℃、35℃和40℃下放置0分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟后，然后采用实施例2中的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定经过上述处理的His-SaChi18E-HEX-His的几丁质酶活力。以His-SaChi18E-HEX-His在30℃处理0分钟的几丁质酶活性为100％。实验重复三次。
结果表明His-SaChi18E-HEX-His在30-35℃时稳定性较好(图7中b)。
3、融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的酶动力参数
用不同浓度的胶体几丁质或pNP-GlcNAc为底物，按照实施例2中的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法在pH5.0的200mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，60℃下测定酶活性，计算出Km、Vmax、kcat和kcat/Km值。经测定，实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His在40℃下以胶体几丁质为底物的km值为0.14mg/mL，最大反应速度Vmax为48.3μmol/min·mg，kcat值为110.5/s和kcat/Km值为789ml/mg·s。实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChi18E-HEX-His在60℃下以pNP-GlcNAc为底物的km值为2.13mM，最大反应速度Vmax为277.8μmol/min·mg，kcat值为635.6/s和kcat/Km值为297.1ml/mg·s。
4、不同金属离子化学试剂对融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His的酶活性的影响
按照实施例2中的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法在其酶促反应体系中加入表1的试剂，各种试剂的终浓度为1mmol/L，研究其对酶活性的影响，其它操作同实施例2。以实施例2中的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定的几丁质酶活性为100％。实验重复三次。
结果(表1)表明，Co2+能使重组酶His-SaChi18E-HEX-His的几丁质酶活力增加到原来的2.1倍。
表1.各种金属离子及化学试剂对融合几丁质酶His-SaChi18E-HEX-His活力的影响
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60
accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120
gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gccgacgacg cgtcctgccg ccccgacggg 180
ctctacaaga ccccgggcgt cgacgtcccg tactgctccg tctacgacgg cgagggacgg 240
gagaagatgg gcgccgacca ccagcggcgc gtcatcggct acttcaccgg ctggcgcacg 300
ggcaagaacg gcgagcccgc ctacctcgcc ccggacatcc cgtgggacaa ggtcacccac 360
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ctgatgtacg acaagttcaa gaccgccaag ccctacggcg cgaaggtctc gaacaaggag 1740
ctgcccacca aggcggtgga catcggcgtc gagttcggcg acttcaagct cggtgactcc 1800
aactacccga tcaccccgaa ggtgaagatc accaacaaca cgaagacgac gctgcccggc 1860
ggcacggagt tccagttcga ctactccacc tcggcccccg gcaacgcctc cgaccagtcg 1920
ggattcggca cgaaggtgat cagcagcgac cacaccggcg gcaacgtcgg cgggctgaag 1980
ggcgacttcc accgcgtctc gctgaagctg ccggcctggc agtcgctcgc gcccggggcc 2040
tcggtggacc tctccttcaa ctactacctg ccggtgtcga cgccgtggaa ctggaccgtc 2100
gagatcagcg gcacgaagta cacgctcgcc ggcgacctgg cgcgcggcac cacgctggtc 2160
gagcccggca cgggtccggg gccgaccgac ccgccgggac cgacggaccc gcccggcacg 2220
tgcacggccc cggcgtggag cgcgtcggcc gagtacggct ccggcaagac ggtctcccac 2280
aagtcccaca cctggaaggc caagtggtgg acgaagggcg acgagcccgg cgccggcggc 2340
gagtggggcg tctggcagga cctcggcgcc tgcgccgccc ccgcccccga ggcgacccgg 2400
ccctccgtca ccccgctcgg tgaggtggtg cccgctcccc tgaaggcgga ggcgggcggc 2460
gccgggtacc agatcaccgc caagacgcgc atccgcgtcg gcgacggcaa ccccgacgag 2520
cgccgcgtcg gcgagtacct cgcccgggtg ctgcggccct ccaccggcta caagctgccc 2580
gtcaccagcg gagaggggag cgacggcatc cggctgcgca tcagcgccga accggcgaac 2640
aaggtcctcg gcaacgaggg gtaccgcgtc atctccgagc gcggctccct caccatcacc 2700
tcctggtccg gcgccggcct cttccacggc gtccagacgg tccgccagca actgcccgcc 2760
gctgtggaga agaagtcgaa gcagcgcgga ccctggcgga tcgcgggcgg caccatcaag 2820
gacatgccgc gctatggcta ccgctccacg atgctcgacg tctcacggca cttcttcacc 2880
gtcgaccagg tcaagcgcta catcgaccag gcgtccctgt acaagatgaa caagctgcac 2940
ctgcacctca gcgacgacca gggctggcgc atcgccatcg actcctggcc gcgcctcgcg 3000
acccacggcg gctccaccca ggtcggcggc ggcgagggcg gctactacac gaaggcccag 3060
tacaaggaga tcgtggccta cgccgcctcg cggtacatgg aggtcgtgcc cgagatcgac 3120
atgccggggc acaccaacgc cgcgctcgcc tcgtacgccg agctgaactg cgacggcgtg 3180
gccccgccgc tctacaccgg caccgcggtc ggcttcagct cgctgtgcgt gaagaaggac 3240
gtcacgtacg acttcgtgga cgacgtgatc cgtgagctgg ccgccatgac gccgggcgag 3300
tacctgcaca tcggcggcga cgaggcgcac tccaccagcc acgaggactt cgtcgcgttc 3360
atggacaagg tgcagccggt ggtcgccaag tacggcaaga aggtgatggg ctggcaccag 3420
ctggccggcg cccggcccgc gaagggcgcc gtcgcccagt actggggtta cgacaggacg 3480
ggtgccgccg agcgcgagca ggtcgtgaac gccgcgaaga acggcaccaa gctggtcctc 3540
tcgccggccg accgctccta cctcgaccac aagtacacca aggacacccc gctcggcctg 3600
tcctgggccg gtctcgtcga ggtgcggcgg tcctacgact gggacccggg cgcctacctc 3660
cagggcgcgc ccgcggacgc ggtcatgggt gtcgaggcgc cgctgtggac ggagaccctg 3720
tcgacctccg cgcacctgga ccacatggcg ttcccgcggc ttcccgggat cgccgagctc 3780
ggctggtcgc ccgcggccac gcacgactgg gacgcgtaca agacgcggct cgccgcgcag 3840
gcgccccgct gggacgccct gggcatcggc tactacgagt cgccgcaggt gccctggccc 3900
gccaagaagc ttgcggccgc actcgagcac caccaccacc accactga 3948
<210> 2
<211> 1315
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile
35 40 45
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Ser Cys Arg Pro Asp Gly Leu Tyr Lys Thr
50 55 60
Pro Gly Val Asp Val Pro Tyr Cys Ser Val Tyr Asp Gly Glu Gly Arg
65 70 75 80
Glu Lys Met Gly Ala Asp His Gln Arg Arg Val Ile Gly Tyr Phe Thr
85 90 95
Gly Trp Arg Thr Gly Lys Asn Gly Glu Pro Ala Tyr Leu Ala Pro Asp
100 105 110
Ile Pro Trp Asp Lys Val Thr His Val Asn Tyr Ala Phe Gly His Ile
115 120 125
Asp Lys Asp Asn Lys Leu Ser Val Gly Gly Asp Gly Glu Lys Asn Ala
130 135 140
Ala Thr Gly Met Thr Trp Pro Gly Val Ala Gly Ala Glu Met Asp Pro
145 150 155 160
Ser Leu Pro Tyr Lys Gly His Phe Asn Leu Leu Asn Lys Phe Lys Lys
165 170 175
Lys His Pro Asp Val Lys Thr Leu Ile Ser Val Gly Gly Trp Ala Glu
180 185 190
Thr Gly Gly Tyr Phe Gly Asp Asp Gly Lys Arg Val Asn Ser Gly Gly
195 200 205
Phe Tyr Ser Met Ala Thr Asn Ala Asp Gly Ser Val Asn His Ala Gly
210 215 220
Ile Asp Thr Phe Ala Asp Ser Ala Val Ala Phe Ile Lys Lys Tyr Gly
225 230 235 240
Phe Asn Gly Val Asp Ile Asp Tyr Glu Tyr Pro Thr Ser Met Lys Asp
245 250 255
Ala Gly His Pro Ala Asp Phe Pro Leu Ser Asn Ala Arg Arg Gly Gly
260 265 270
Leu Val Lys Gly Tyr Ala Ala Leu Met Lys Ser Leu Arg Glu Lys Leu
275 280 285
Asp Lys Ala Gly Ala Ala Asp Gly Arg His Tyr Met Leu Thr Val Ala
290 295 300
Ala Pro Ser Ser Gly Tyr Leu Leu Arg Gly Met Glu Thr Phe Gln Val
305 310 315 320
Gln Lys Tyr Leu Asp Tyr Val Asn Ile Met Ser Tyr Asp Leu His Gly
325 330 335
Ala Trp Asn Glu Tyr Val Gly Pro Asn Ala Ser Leu Phe Asp Asp Gly
340 345 350
Lys Asp Ala Glu Leu Ala Ala Ala Asn Val Tyr Gly Ser Gln Gln Tyr
355 360 365
Gly Gly Ile Gly Tyr Leu Asn Thr Asp Trp Ala Tyr His Tyr Phe Arg
370 375 380
Gly Ser Met Pro Ala Gly Arg Ile Asn Ile Gly Leu Pro Tyr Tyr Thr
385 390 395 400
Arg Gly His Lys Asn Val Gln Gly Gly Val Asp Gly Leu Trp Gly Lys
405 410 415
Ala Ala Ala Ser Thr Cys Pro Ala Gly Ser Gly Leu Thr Lys Cys Gly
420 425 430
Asp Gly Ala Val Gly Ile Asp Asn Leu Trp His Asp Lys Asp Asp Asn
435 440 445
Gly Lys Glu Ser Pro Ala Gly Ser Asn Pro Met Trp His Ala Lys Asn
450 455 460
Leu Glu Lys Gly Ile Val Gly Asp Tyr Val Thr Lys Tyr Gly Phe Pro
465 470 475 480
Ala Asp Thr Lys Leu Thr Gly Thr Tyr Ala Arg Lys Tyr Asp Ala Lys
485 490 495
Leu Val Ala Pro Trp Leu Trp Asn Ala Glu Lys Lys Val Phe Leu Ser
500 505 510
Thr Glu Asp Glu Thr Ser Val Ala Glu Lys Ala Asp Tyr Val Val Asp
515 520 525
Arg Gly Ile Gly Gly Thr Met Val Trp Glu Met Ala Gly Asp Tyr Arg
530 535 540
Trp Asn Ala Ala Lys Gly Gln Tyr Glu Ile Gly Asp Thr Leu Thr Ser
545 550 555 560
Leu Met Tyr Asp Lys Phe Lys Thr Ala Lys Pro Tyr Gly Ala Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Glu Leu Pro Thr Lys Ala Val Asp Ile Gly Val Glu Phe
580 585 590
Gly Asp Phe Lys Leu Gly Asp Ser Asn Tyr Pro Ile Thr Pro Lys Val
595 600 605
Lys Ile Thr Asn Asn Thr Lys Thr Thr Leu Pro Gly Gly Thr Glu Phe
610 615 620
Gln Phe Asp Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Gly Asn Ala Ser Asp Gln Ser
625 630 635 640
Gly Phe Gly Thr Lys Val Ile Ser Ser Asp His Thr Gly Gly Asn Val
645 650 655
Gly Gly Leu Lys Gly Asp Phe His Arg Val Ser Leu Lys Leu Pro Ala
660 665 670
Trp Gln Ser Leu Ala Pro Gly Ala Ser Val Asp Leu Ser Phe Asn Tyr
675 680 685
Tyr Leu Pro Val Ser Thr Pro Trp Asn Trp Thr Val Glu Ile Ser Gly
690 695 700
Thr Lys Tyr Thr Leu Ala Gly Asp Leu Ala Arg Gly Thr Thr Leu Val
705 710 715 720
Glu Pro Gly Thr Gly Pro Gly Pro Thr Asp Pro Pro Gly Pro Thr Asp
725 730 735
Pro Pro Gly Thr Cys Thr Ala Pro Ala Trp Ser Ala Ser Ala Glu Tyr
740 745 750
Gly Ser Gly Lys Thr Val Ser His Lys Ser His Thr Trp Lys Ala Lys
755 760 765
Trp Trp Thr Lys Gly Asp Glu Pro Gly Ala Gly Gly Glu Trp Gly Val
770 775 780
Trp Gln Asp Leu Gly Ala Cys Ala Ala Pro Ala Pro Glu Ala Thr Arg
785 790 795 800
Pro Ser Val Thr Pro Leu Gly Glu Val Val Pro Ala Pro Leu Lys Ala
805 810 815
Glu Ala Gly Gly Ala Gly Tyr Gln Ile Thr Ala Lys Thr Arg Ile Arg
820 825 830
Val Gly Asp Gly Asn Pro Asp Glu Arg Arg Val Gly Glu Tyr Leu Ala
835 840 845
Arg Val Leu Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Lys Leu Pro Val Thr Ser Gly
850 855 860
Glu Gly Ser Asp Gly Ile Arg Leu Arg Ile Ser Ala Glu Pro Ala Asn
865 870 875 880
Lys Val Leu Gly Asn Glu Gly Tyr Arg Val Ile Ser Glu Arg Gly Ser
885 890 895
Leu Thr Ile Thr Ser Trp Ser Gly Ala Gly Leu Phe His Gly Val Gln
900 905 910
Thr Val Arg Gln Gln Leu Pro Ala Ala Val Glu Lys Lys Ser Lys Gln
915 920 925
Arg Gly Pro Trp Arg Ile Ala Gly Gly Thr Ile Lys Asp Met Pro Arg
930 935 940
Tyr Gly Tyr Arg Ser Thr Met Leu Asp Val Ser Arg His Phe Phe Thr
945 950 955 960
Val Asp Gln Val Lys Arg Tyr Ile Asp Gln Ala Ser Leu Tyr Lys Met
965 970 975
Asn Lys Leu His Leu His Leu Ser Asp Asp Gln Gly Trp Arg Ile Ala
980 985 990
Ile Asp Ser Trp Pro Arg Leu Ala Thr His Gly Gly Ser Thr Gln Val
995 1000 1005
Gly Gly Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Thr Lys Ala Gln Tyr Lys Glu
1010 1015 1020
Ile Val Ala Tyr Ala Ala Ser Arg Tyr Met Glu Val Val Pro Glu
1025 1030 1035
Ile Asp Met Pro Gly His Thr Asn Ala Ala Leu Ala Ser Tyr Ala
1040 1045 1050
Glu Leu Asn Cys Asp Gly Val Ala Pro Pro Leu Tyr Thr Gly Thr
1055 1060 1065
Ala Val Gly Phe Ser Ser Leu Cys Val Lys Lys Asp Val Thr Tyr
1070 1075 1080
Asp Phe Val Asp Asp Val Ile Arg Glu Leu Ala Ala Met Thr Pro
1085 1090 1095
Gly Glu Tyr Leu His Ile Gly Gly Asp Glu Ala His Ser Thr Ser
1100 1105 1110
His Glu Asp Phe Val Ala Phe Met Asp Lys Val Gln Pro Val Val
1115 1120 1125
Ala Lys Tyr Gly Lys Lys Val Met Gly Trp His Gln Leu Ala Gly
1130 1135 1140
Ala Arg Pro Ala Lys Gly Ala Val Ala Gln Tyr Trp Gly Tyr Asp
1145 1150 1155
Arg Thr Gly Ala Ala Glu Arg Glu Gln Val Val Asn Ala Ala Lys
1160 1165 1170
Asn Gly Thr Lys Leu Val Leu Ser Pro Ala Asp Arg Ser Tyr Leu
1175 1180 1185
Asp His Lys Tyr Thr Lys Asp Thr Pro Leu Gly Leu Ser Trp Ala
1190 1195 1200
Gly Leu Val Glu Val Arg Arg Ser Tyr Asp Trp Asp Pro Gly Ala
1205 1210 1215
Tyr Leu Gln Gly Ala Pro Ala Asp Ala Val Met Gly Val Glu Ala
1220 1225 1230
Pro Leu Trp Thr Glu Thr Leu Ser Thr Ser Ala His Leu Asp His
1235 1240 1245
Met Ala Phe Pro Arg Leu Pro Gly Ile Ala Glu Leu Gly Trp Ser
1250 1255 1260
Pro Ala Ala Thr His Asp Trp Asp Ala Tyr Lys Thr Arg Leu Ala
1265 1270 1275
Ala Gln Ala Pro Arg Trp Asp Ala Leu Gly Ile Gly Tyr Tyr Glu
1280 1285 1290
Ser Pro Gln Val Pro Trp Pro Ala Lys Lys Leu Ala Ala Ala Leu
1295 1300 1305
Glu His His His His His His
1310 1315

Claims (5)

1.融合蛋白质，其特征在于：所述融合蛋白质为将β-N-乙酰己糖胺酶和几丁质酶融合在一起得到的几丁质酶活性高于所述β-N-乙酰己糖胺酶和所述几丁质酶的蛋白质，所述融合蛋白质为F1）或F2）：
F1）氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
F2）氨基酸序列是SEQ ID No.2的第51-1302位的蛋白质。
2.与权利要求1所述融合蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1）-B4）中至少一种：
B1）编码权利要求1所述融合蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；所述微生物为大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下B11）或B12）：
B11）编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
B12）核苷酸序列是SEQ ID No.1的第151-3906位的DNA分子。
4.一种制备融合蛋白质的方法，包括：使权利要求1所述融合蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到所述融合蛋白质；所述生物为大肠杆菌。
5.权利要求1所述融合蛋白质、权利要求2或3所述的生物材料、权利要求4所述的方法在制备几丁质酶制剂中的应用。
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