CN108864303A - 抗真菌的融合蛋白及其相关生物材料与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗真菌的融合蛋白及其相关生物材料与应用。该融合蛋白质为将壳聚糖酶和几丁质酶融合在一起得到的抗真菌活性高于所述壳聚糖酶和所述几丁质酶的蛋白质。本发明将来源于链霉菌(Streptomyces alfalfae)的几丁质酶SaChiB和来源于链霉菌(Streptomyces alfalfae)的壳聚糖酶SaCsn融合在一起得到了抗真菌活性高于单独的几丁质酶和单独的壳聚糖酶的重组蛋白质。本发明将几丁质酶和壳聚糖酶融合在一起得到的融合蛋白质，在长枝木霉和短密木霉方面均起到了协同作用。本发明的融合蛋白质可用于制备生防制剂。

Description

抗真菌的融合蛋白及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及生物领域中抗真菌的融合蛋白及其相关生物材料与应用。
背景技术
植物病原真菌是造成植物病害的主要因素，约占植物病害的70％～80％，从而导致大规模的农作物死亡以致农作物产量下降。目前对真菌的防治主要是化学方法，这存在严重的环境污染，开发更高效、更安全的抗真菌制剂迫在眉睫。
几丁质酶是一种能够催化几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖单体或低分子量几丁寡糖的水解酶。据报道，几丁质酶可作为潜在的生防制剂，可以有效的抑制多种病原真菌，尤其是GH19家族的几丁质酶，经研究仅在链霉菌中发现，链霉菌属(或放线菌属)通过获得19家族几丁质酶基因在与真菌的相互作用中获得了一些优势，例如来源于S.griseus的GH19家族的chitinase C能够有效抑制T.reesei,而来源于Serratia marcescens的chitinaseA和来源于B.circulans的chitinase A1均没有作用。壳聚糖酶是一种对壳聚糖的β-1,4-糖苷键进行断裂以释放壳寡糖的水解酶，经研究，其主要对以壳聚糖为主要成分的真菌有作用，如：接合菌，其他方面的抗真菌作用尚没有深入研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高壳聚糖酶和/或几丁质酶的抗病原真菌活性。
为了解决上述技术问题，本发明提供了融合蛋白质。
本发明所提供的融合蛋白质将壳聚糖酶和几丁质酶融合在一起得到的抗真菌活性高于所述壳聚糖酶和所述几丁质酶的蛋白质。
上述融合蛋白质中，所述真菌可为长枝木霉、短密木霉、灰葡病菌、立枯丝核菌、核盘菌和禾谷镰孢菌这6种真菌的全部、任5种、任4种、任3种、任2种或任1种。
上述融合蛋白质中，所述壳聚糖酶和所述几丁质酶均可来源于链霉菌，如苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)。
上述融合蛋白质中，所述壳聚糖酶可为A1)-A3)中的任一蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第323-570位氨基酸残基的蛋白质；
A2)将A1)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到与A1)具有90％以上的同一性且具有壳聚糖酶活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
所述几丁质酶可为D1)-D3)中的任一蛋白质：
D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-322位氨基酸残基的蛋白质；
D2)将D1)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到与B1)具有90％以上的同一性且具有几丁质酶活性的蛋白质；
D3)在D1)或D2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
上述融合蛋白质中，所述融合蛋白质可为F1)-F4)中的任一蛋白质：
F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
F2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-570位的蛋白质；
F3)将F1)或F2)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)或F2)具有90％以上的同一性且抗所述真菌活性高于所述壳聚糖酶和所述几丁质酶的蛋白质；
F4)在F1)或F2)或F3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
其中，SEQ ID No.2由583个氨基酸残基组成。F1)的融合蛋白质名称为His-SaChiB-SaCsn-His；F2)的融合蛋白质名称为SaChiB-SaCsn。
上述融合蛋白质中，所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白和/或SUMO标签蛋白等。
上述融合蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算。然后即可获得同一性的值(％)。
上述融合蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性。
与上述融合蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
与上述融合蛋白质相关的生物材料可为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码所述融合蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下B11)或B12)：
B11)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
B12)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第157-1710位的DNA分子。
上述生物材料中，SEQ ID No.1由1752个核苷酸组成。B11)是His-SaChiB-SaCsn-His基因；B12)是SaChiB-SaCsn基因。
本发明还提供了制备上述融合蛋白质的方法。
本发明所提供的上述融合蛋白质的方法，包括：使所述融合蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到所述融合蛋白质；所述生物为微生物、植物或非人动物。
上述方法中，所述微生物可为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)肠杆菌科细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌，如大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
含有所述融合蛋白质的真菌抑制剂也属于本发明的保护范围。
上述融合蛋白质、上述生物材料、上述方法在制备真菌抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中，所述真菌可为长枝木霉、短密木霉、灰葡病菌、立枯丝核菌、核盘菌和禾谷镰孢菌这6种真菌的全部、任5种、任4种、任3种、任2种或任1种。
上文中，所述长枝木霉可为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，所述短密木霉可为短密木霉(Trichoderma brevicompactum)，所述灰葡病菌可为灰葡萄(Botrytiscinerea)，所述立枯丝核菌可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，所述核盘菌可为核盘菌(Sclerotinia sclerrotiorum)，所述禾谷镰孢菌可为禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)。
上述真菌抑制剂的活性成分可为上述融合蛋白质，上述真菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述真菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对所述真菌的抑制效果确定。
上述真菌抑制剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
本发明将来源于链霉菌(Streptomyces alfalfae)的几丁质酶SaChiB和来源于链霉菌(Streptomyces alfalfae)的壳聚糖酶SaCsn融合在一起得到了抗真菌活性高于单独的几丁质酶和单独的壳聚糖酶的重组蛋白质His-SaChiB-SaCsn-His。实验证明His-SaChiB-SaCsn-His处理对长枝木霉、短密木霉、灰葡病菌、立枯丝核菌、核盘菌和禾谷镰孢菌对这6种病原真菌的抑菌率均大于His-SaChiB-His处理和His-SaCsn-His处理，并且His-SaChiB-SaCsn-His处理对长枝木霉和短密木霉这2种病原真菌的抑菌率均大于His-SaChiB-His处理和His-SaCsn-His处理之和，说明本发明将SaChiB和SaCsn融合在一起得到的融合蛋白His-SaChiB-SaCsn-His和SaChiB-SaCsn，在长枝木霉和短密木霉方面均起到了协同作用(图2和表1)。本发明的融合蛋白质可用于制备生防制剂。
附图说明
图1为目的蛋白的SDS-PAGE分析。M为蛋白质分子量标准；1为从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品；2为从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaCsn菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品；3为从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB-SaCsn菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品。
图2为各处理对灰霉病菌、立枯丝核菌、核盘菌、禾谷镰孢菌、长枝木霉、短密木霉的抑菌照片。图中，A为灰霉病菌；B为立枯丝核菌；C为禾谷镰孢菌；D为核盘菌；E为长枝木霉；F为短密木霉。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的灰霉病菌为灰葡萄(灰霉病菌)(Botrytis cinerea)ACCC 36027，已于2006年8月31日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的立枯丝核菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)ACCC36076，已于2006年8月31日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的核盘菌为核盘菌(Sclerotinia sclerrotiorum)ACCC 36081，已于2006年8月31日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的禾谷镰孢菌为禾谷镰孢(Fusarium graminearum)ACCC 37681，已于2009年04月30日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的长枝木霉为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC31615，已于2001年01月01日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的短密木霉(Trichoderma brevicompactum)ACCC 31689，已于2007年02月07日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中，表达载体pET30a(+)为invitrogen公司(美国)的产品，感受态细胞E.coli BL21(DE3)为TransGen Biotech Co.(中国北京)产品。
实施例1、制备抗真菌相关融合蛋白SaChiB-SaCsn和His-SaChiB-SaCsn-His及其抗真菌活性的测定
删除GenBank Acession Number WP_076682988(12-APR-2018)的链霉菌(Streptomyces alfalfae)几丁质酶的信号肽(氨基酸序列是第1-26位氨基酸残基)得到成熟几丁质酶(氨基酸序列是第27-296位氨基酸残基，将其命名为SaChiB)；删除GenBankAcession Number WP_076688729(12-APR-2018)的链霉菌(Streptomyces alfalfae)壳聚糖酶的信号肽(氨基酸序列是第1-45位氨基酸残基)得到成熟壳聚糖酶(氨基酸序列是第46-293位氨基酸残基，将其命名为SaCsn)。
将上述成熟几丁质酶SaChiB和上述成熟壳聚糖酶SaCsn融合在一起得到融合蛋白，将其命名为SaChiB-SaCsn。SaChiB-SaCsn氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-570位的蛋白质。
采用pET30a(+)作为表达载体，在E.coli BL21(DE3)中原核表达SaChiB-SaCsn，得到含有SaChiB-SaCsn的融合蛋白质His-SaChiB-SaCsn-His(氨基酸序列是SEQ ID No.2)。
采用pET30a(+)作为表达载体，在E.coli BL21(DE3)中原核表达SaChiB(氨基酸序列是GenBank Acession Number WP_076682988(12-APR-2018)的第27-296位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第53-322位氨基酸残基)得到含有SaChiB的融合蛋白质His-SaChiB-His(是将SEQ ID No.2的第323-570位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质)。其中，His-SaChiB-His是His-SaChiB-SaCsn-His的对照蛋白质，区别仅在于His-SaChiB-His是将His-SaChiB-SaCsn-His中的SaCsn缺失得到的蛋白质；SaChiB是SaChiB-SaCsn的对照蛋白质，区别仅在于SaChiB是将SaChiB-SaCsn中的SaCsn缺失得到的蛋白质。
采用pET30a(+)作为表达载体，在E.coli BL21(DE3)中原核表达SaCsn(氨基酸序列是GenBank Acession Number WP_076688729(12-APR-2018)的第46-293位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第323-570位氨基酸残基)，得到含有SaCsn的融合蛋白质His-SaCsn-His(是将SEQ ID No.2的第53-322位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质)作为对照。其中，His-SaCsn-His是His-SaChiB-SaCsn-His的对照蛋白质，区别仅在于His-SaCsn-His是将His-SaChiB-SaCsn-His中的SaChiB缺失得到的蛋白质；SaCsn是SaChiB-SaCsn的对照蛋白质，区别仅在于SaCsn是将SaChiB-SaCsn中SaChiB的缺失得到的蛋白质。
下面具体阐明SaChiB-SaCsn和His-SaChiB-SaCsn-His的抗真菌活性优于SaChiB、His-SaChiB-His、SaCsn和His-SaCsn-His。具体实验方法和实验结果如下：
1、制备重组菌
1.1本步骤制备了三种融合基因，分别为His-SaChiB-SaCsn-His基因，His-SaChiB-His基因和His-SaCsn-His基因。
His-SaChiB-SaCsn-His基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1由1752个核苷酸组成。His-SaChiB-SaCsn-His基因含有SaChiB-SaCsn基因，SaChiB-SaCsn基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第157-1710位核苷酸。SEQ ID No.1所示的His-SaChiB-SaCsn-His基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白质His-SaChiB-SaCsn-His。
His-SaChiB-His基因是His-SaChiB-SaCsn-His基因的对照基因，His-SaChiB-His基因是将SEQ ID No.1的第967-1710位核苷酸(SaCsn基因)缺失得到的DNA分子。His-SaChiB-His基因含有SaChiB基因，SaChiB基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第157-966位核苷酸。His-SaChiB-His基因编码蛋白质His-SaChiB-His，His-SaChiB-His是将SEQ IDNo.2的第323-570位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。SaChiB基因编码蛋白质SaChiB，SaChiB的氨基酸序列是GenBank Acession Number WP_076682988(12-APR-2018)的第27-296位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第53-322位氨基酸残基。
His-SaCsn-His基因是His-SaChiB-SaCsn-His基因的对照基因，His-SaCsn-His基因是将SEQ ID No.1的第157-966位核苷酸(SaChiB基因)缺失得到的DNA分子。His-SaCsn-His基因含有SaCsn基因，SaCsn基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第967-1710位核苷酸。His-SaCsn-His基因编码蛋白质His-SaCsn-His，His-SaCsn-His是将SEQ ID No.2的第53-322位氨基酸残基缺失保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。SaCsn基因编码蛋白质SaCsn，SaCsn的氨基酸序列是GenBankAcession Number WP_076688729(12-APR-2018)的第46-293位氨基酸残基，即SEQ ID No.2的第323-570位氨基酸残基。
1.2用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第151-1716位的DNA替换pET30a(+)的EcoRI和HindⅢ识别位点间的片段(包括EcoRI识别位点和HindⅢ识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到His-SaChiB-SaCsn-His基因重组表达载体pET30a(+)-SaChiB-SaCsn。pET30a(+)-SaChiB-SaCsn含有SEQ ID No.1所示的His-SaChiB-SaCsn-His基因。
pET30a(+)-SaChiB-SaCsn在E.coli BL21(DE3)中可表达氨基酸序列是SEQ IDNo.2的蛋白质His-SaChiB-SaCsn-His。
将重组表达载体pET30a(+)-SaChiB-SaCsn中的His-SaChiB-SaCsn-His基因替换为上述His-SaChiB-His基因，得到His-SaChiB-His基因重组表达载体pET30a(+)-SaChiB。pET30a(+)-SaChiB在E.coli BL21(DE3)中可表达上述蛋白质His-SaChiB–His。
将重组表达载体pET30a(+)-SaChiB-SaCsn中的His-SaChiB-SaCsn-His基因替换为上述His-SaCsn-His基因，得到His-SaCsn-His基因重组表达载体pET30a(+)-SaCsn。pET30a(+)-SaCsn在E.coli BL21(DE3)中可表达上述蛋白质His-SaCsn-His。
1.3将步骤1.2中的pET30a(+)-SaChiB-SaCsn、pET30a(+)-SaChiB、pET30a(+)-SaCsn和pET30a(+)这4种表达载体分别单独转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pET30a(+)-SaChiB-SaCsn的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB-SaCsn，将测序结果表明含有pET30a(+)-SaChiB的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB，将测序结果表明含有pET30a(+)-SaCsn的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)-SaCsn，将测序结果表明含有pET30a(+)的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a(+)(空载体对照)。
2、制备抗真菌相关融合蛋白SaChiB-SaCsn和His-SaChiB-SaCsn-His
将BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB-SaCsn、BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB、BL21(DE3)/pET30a(+)-SaCsn和BL21(DE3)/pET30a(+)这四种菌株分别按0.5％的接种量单独接种于30mL的LB小瓶液体培养基(含有50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中培养活化12-16小时。然后取适量活化好的菌液按1％的接种量，接种到300mL的大瓶LB培养液(含50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中，连续培养2.5-3小时(利用紫外分光光度计确定培养菌液OD600值为0.8，以含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)，加入IPTG(经过0.22μm滤膜过滤灭菌)至IPTG的含量为0.6mM，在30℃、220rpm的振荡摇床中诱导培养6小时。将上述诱导培养菌液转移至离心杯，于4000rpm转速，离心10分钟，弃上清液，用5mL缓冲液重悬菌体，并回收菌体，将重悬菌体收集至10mL离心管内。在冰水浴条件下，用超声波细胞破碎仪对重悬混浊液进行超声波细胞破碎。设置破碎仪器功率为200W，超声波工作时间4秒，间隔时间3秒，破碎时间为30分钟。破碎完成后，立即于转速12,000rpm、4℃离心菌液10分钟，收集上清液，将该上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mMNaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋白样品。将镍柱纯化目的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，结果表明从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB-SaCsn菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品含有大小为63.8kDa的目的蛋白His-SaChiB-SaCsn-His，从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaChiB菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品含有大小为36.3kDa的目的蛋白His-SaChiB-His，从BL21(DE3)/pET30a(+)-SaCsn菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品含有大小为34.7kDa的目的蛋白His-SaCsn-His，从BL21(DE3)/pET30a(+)菌体中得到的镍柱纯化目的蛋白样品中没有外源目的蛋白(图1)。
将镍柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品(分子筛纯化的His-SaChiB-SaCsn-His、分子筛纯化的His-SaChiB-His和分子筛纯化的His-SaCsn-His)。将分子筛纯化的His-SaChiB-SaCsn-His蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明His-SaChiB-SaCsn-His的氨基酸序列如SEQID No.2所示。
3、抗真菌相关融合蛋白抗真菌活性测定
将步骤2获得的分子筛纯化的His-SaChiB-SaCsn-His、分子筛纯化的His-SaChiB-His和分子筛纯化的His-SaCsn-His分别溶于pH为8、10mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(溶剂)中，用0.22μm无菌滤膜过滤后得到His-SaChiB-SaCsn-His浓度为0.55mM的His-SaChiB-SaCsn-His无菌溶液、His-SaChiB-His浓度为0.55mM的His-SaChiB-His无菌溶液，His-SaCsn-His浓度为0.55mM的His-SaCsn-His无菌溶液)。用0.22μm无菌滤膜过滤上述溶剂，得到无菌溶剂。
选取灰霉病菌、立枯丝核菌、核盘菌、禾谷镰孢菌、长枝木霉和短密木霉作为病原真菌进行抗真菌实验。将上述6种病原真菌分别转接在PDA培养基上活化，25℃培养48h后，用直径0.6mm打孔器打取菌饼，将6种病原真菌的菌饼分别接种在装有PDA培养基的培养皿的中央，25℃培养2天，用直径0.6mm打孔器在菌落边缘外打四个孔(孔Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，孔Ⅰ中加入20μL的上述无菌溶剂(对照，CK)、孔Ⅱ中加入20μL的上述His-SaChiB-SaCsn-His无菌溶液(His-SaChiB-SaCsn-His处理，处理Ⅱ)、孔Ⅲ中加入20μL的上述His-SaChiB-His无菌溶液(His-SaChiB-His处理，处理Ⅲ)、孔Ⅳ中加入20μL的上述His-SaCsn-His无菌溶液(His-SaCsn-His处理，处理Ⅳ)，用游标卡尺测量病原真菌菌落朝四个孔的中心方向的半径(r1)。25℃培养3天，用游标卡尺测量病原真菌菌落朝四个孔的中心方向的半径(r2)，计算病原真菌菌落朝四个孔的中心方向的菌落长度增加量(Δr＝r2-r1)。按照如下公式计算抑菌率。抑菌率％＝(对照菌落长度增加量-处理菌落长度增加量)/对照菌落长度增加量×100％。实验重复三次，每次每种病原真菌5个平皿。
结果表明His-SaChiB-SaCsn-His处理对长枝木霉、短密木霉、灰葡病菌、立枯丝核菌、核盘菌和禾谷镰孢菌这6种病原真菌的抑菌率均大于His-SaChiB-His处理和His-SaCsn-His处理，并且His-SaChiB-SaCsn-His处理对长枝木霉和短密木霉这2种病原真菌的抑菌率均大于His-SaChiB-His处理和His-SaCsn-His处理之和，说明本发明将SaChiB和SaCsn融合在一起得到的融合蛋白His-SaChiB-SaCsn-His和SaChiB-SaCsn，在长枝木霉和短密木霉方面起到了协同作用(图2和表1)。
表1.各处理的抑菌情况
实施例2、His-SaChiB-SaCsn-His、His-SaChiB-His和His-SaCsn-His的酶活性分析
1、壳聚糖酶活力测定
采用DNS法测定壳聚糖酶活力，具体方法如下：取0.1mL酶液(溶剂为pH＝5.0、浓度为20mM的醋酸盐缓冲液)，加入0.2mL浓度为2％的壳聚糖溶液(溶剂为pH＝5.0、浓度为20mM的醋酸盐缓冲液)和0.3mL pH＝5.0、浓度为20mM的醋酸盐缓冲液，60℃反应30min，加入0.4mL DNS终止反应，沸水煮10min。冷却后540nm测定OD值。煮沸灭活的酶液同法处理作为对照，根据氨基葡萄糖标准曲线求出反应液中的还原糖含量。1个酶活单位(U)定义为在上述条件下，每分钟分解壳聚糖释放1μmol氨基-D-葡萄糖(GlcN)所需的酶量。
结果表明实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChiB-SaCsn-His、分子筛纯化的His-SaChiB-His和分子筛纯化的His-SaCsn-His的壳聚糖酶比活力(U/mol酶蛋白)分别为2575.61±1.61U/μmol酶蛋白、0U/μmol酶蛋白和12410.11±3.12U/μmol酶蛋白。
2、几丁质酶活力
采用DNS法测定几丁质酶活力，具体方法如下：取0.1mL酶液(溶剂为pH＝8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液)，加入0.2mL浓度为2％的胶体几丁质溶液(溶剂为pH＝8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液)和0.3mL pH＝8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，30℃反应1h，加入0.4mL DNS终止反应，沸水煮10min。冷却后540nm测定OD值。煮沸灭活的酶液同法处理作为对照，根据N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线求出反应液中的还原糖含量。1个酶活单位(U)定义为在上述条件下，每分钟分解胶体几丁质释放1μmol N-乙酰氨基-D-葡萄糖(GlcNAc)所需的酶量。
结果表明实施例1得到的分子筛纯化的His-SaChiB-SaCsn-His、分子筛纯化的His-SaChiB-His和分子筛纯化的His-SaCsn-His的几丁质酶比活力(U/mol酶蛋白)分别为1052.60±12.9U/μmol酶蛋白、1029.66±18.22U/μmol酶蛋白和0U/μmol酶蛋白。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 河北农业大学 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 抗真菌的融合蛋白及其相关生物材料与应用
<130> GNCFH181435
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60
accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120
gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gaattcacgg cgtccgcggc cgcgtgcgcc 180
gcgccatgga gctcgtcctc cgtctacacg ggcggcaaga ccgcctcgca caacgggcac 240
aactggaccg ccaagtggtg gacccagaac gagacgccgg gccgctccga cgtctgggcg 300
gacgcgggcg cctgcggcgg cggcacggat ccgggcaacc ccgacccgtc cggattcgtg 360
gtcagcgagg cccagttcaa ccagatgttc ccgagccgga actcgttcta cacgtacaag 420
ggcctgacgg acgcgctgaa ggcgtacccg gccttcgcca acaccggcag cgacaccgtc 480
aagcgccagg aggcggcggc gttcctcgcc aacgtccacc acgagaccgg cgggctgaag 540
tacatcgtcg agcagaacca ggccaactac ccgcactact gcgacgcgaa ccagccctac 600
ggctgccccg ccgggcaggc cgcgtactac ggccgcggcc cgatccagct cagctggaac 660
ttcaactaca aggccgcggg cgacgcgctc ggcatcgacc tgctgcgcaa cccctacctg 720
gtggagcggg acccggccgt cgcctggaag accggcctct ggtactggaa cacccagtcg 780
ggccccggca ccatgacgcc gcacaacgcc atggtcaacg gcaagggctt cggtgagacc 840
atccgcgcca tcaacggcac cctggagtgc aacggcggca accccgccca ggtgcagagc 900
cgcatcgacc gctacaagca gttcacccag ctcctcggca ccacgccggg ctccaacctg 960
agctgcgggc agacagcgtc cgccggacag acggcggcga gggccggcgg gctcgacgac 1020
ccggcgaaga aggagatcgc catgaagctc gtgtgcagcg cggagaactc cagcctcgac 1080
tggaagaact actaccgcta catcgaggac atcgacgacg gccgcggcta caccgccggc 1140
atcatcggct tctgctccgg caccggcgac atgctcgacc tcgtcgagct gtacacgcgg 1200
cgcaagcccg gcaacgtcct cgcgaagtac ctgcccgcgc tgcgcagggt cgacggcacc 1260
gactcgcacg acgggctcga cccgaactac ccgcgcgact gggcgcgggc cgccgcggac 1320
caggccttcc agcaggcgca gaacgacgag cgcgaccgcg tctacttcaa cccggccgtc 1380
aagcagggca aggcggacgg catcggcgtg ctcggccagt tctgctacta cgacgccatc 1440
gtgatgcacg gcgacggcgg cgactccacc agcttccgca acatccgcaa gcgcgcgctg 1500
cgttcggcca caccaccggc gcagggcggt gacgaggtgg cgtacctgca cgccttcctc 1560
gacgcgcgcg tctgggcgat gaagcaggag gaggcgcacg aggacaccac ccgcgtcgac 1620
accgcccagc gggtcttcct gaacaagcgg aacctcagcc tcaacactcc cctcgaatgg 1680
aaggtctacg gggactcgta ccgcatcggc aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac 1740
caccaccact ga 1752
<210> 2
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile
35 40 45
Gly Ser Glu Phe Thr Ala Ser Ala Ala Ala Cys Ala Ala Pro Trp Ser
50 55 60
Ser Ser Ser Val Tyr Thr Gly Gly Lys Thr Ala Ser His Asn Gly His
65 70 75 80
Asn Trp Thr Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Glu Thr Pro Gly Arg Ser
85 90 95
Asp Val Trp Ala Asp Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Asp Pro Gly
100 105 110
Asn Pro Asp Pro Ser Gly Phe Val Val Ser Glu Ala Gln Phe Asn Gln
115 120 125
Met Phe Pro Ser Arg Asn Ser Phe Tyr Thr Tyr Lys Gly Leu Thr Asp
130 135 140
Ala Leu Lys Ala Tyr Pro Ala Phe Ala Asn Thr Gly Ser Asp Thr Val
145 150 155 160
Lys Arg Gln Glu Ala Ala Ala Phe Leu Ala Asn Val His His Glu Thr
165 170 175
Gly Gly Leu Lys Tyr Ile Val Glu Gln Asn Gln Ala Asn Tyr Pro His
180 185 190
Tyr Cys Asp Ala Asn Gln Pro Tyr Gly Cys Pro Ala Gly Gln Ala Ala
195 200 205
Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile Gln Leu Ser Trp Asn Phe Asn Tyr Lys
210 215 220
Ala Ala Gly Asp Ala Leu Gly Ile Asp Leu Leu Arg Asn Pro Tyr Leu
225 230 235 240
Val Glu Arg Asp Pro Ala Val Ala Trp Lys Thr Gly Leu Trp Tyr Trp
245 250 255
Asn Thr Gln Ser Gly Pro Gly Thr Met Thr Pro His Asn Ala Met Val
260 265 270
Asn Gly Lys Gly Phe Gly Glu Thr Ile Arg Ala Ile Asn Gly Thr Leu
275 280 285
Glu Cys Asn Gly Gly Asn Pro Ala Gln Val Gln Ser Arg Ile Asp Arg
290 295 300
Tyr Lys Gln Phe Thr Gln Leu Leu Gly Thr Thr Pro Gly Ser Asn Leu
305 310 315 320
Ser Cys Gly Gln Thr Ala Ser Ala Gly Gln Thr Ala Ala Arg Ala Gly
325 330 335
Gly Leu Asp Asp Pro Ala Lys Lys Glu Ile Ala Met Lys Leu Val Cys
340 345 350
Ser Ala Glu Asn Ser Ser Leu Asp Trp Lys Asn Tyr Tyr Arg Tyr Ile
355 360 365
Glu Asp Ile Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Ala Gly Ile Ile Gly Phe
370 375 380
Cys Ser Gly Thr Gly Asp Met Leu Asp Leu Val Glu Leu Tyr Thr Arg
385 390 395 400
Arg Lys Pro Gly Asn Val Leu Ala Lys Tyr Leu Pro Ala Leu Arg Arg
405 410 415
Val Asp Gly Thr Asp Ser His Asp Gly Leu Asp Pro Asn Tyr Pro Arg
420 425 430
Asp Trp Ala Arg Ala Ala Ala Asp Gln Ala Phe Gln Gln Ala Gln Asn
435 440 445
Asp Glu Arg Asp Arg Val Tyr Phe Asn Pro Ala Val Lys Gln Gly Lys
450 455 460
Ala Asp Gly Ile Gly Val Leu Gly Gln Phe Cys Tyr Tyr Asp Ala Ile
465 470 475 480
Val Met His Gly Asp Gly Gly Asp Ser Thr Ser Phe Arg Asn Ile Arg
485 490 495
Lys Arg Ala Leu Arg Ser Ala Thr Pro Pro Ala Gln Gly Gly Asp Glu
500 505 510
Val Ala Tyr Leu His Ala Phe Leu Asp Ala Arg Val Trp Ala Met Lys
515 520 525
Gln Glu Glu Ala His Glu Asp Thr Thr Arg Val Asp Thr Ala Gln Arg
530 535 540
Val Phe Leu Asn Lys Arg Asn Leu Ser Leu Asn Thr Pro Leu Glu Trp
545 550 555 560
Lys Val Tyr Gly Asp Ser Tyr Arg Ile Gly Lys Leu Ala Ala Ala Leu
565 570 575
Glu His His His His His His
580

Claims (10)

1.融合蛋白质，其特征在于：所述融合蛋白质为将壳聚糖酶和几丁质酶融合在一起得到的抗真菌活性高于所述壳聚糖酶和所述几丁质酶的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白质，其特征在于：所述真菌为长枝木霉、短密木霉、灰葡病菌、立枯丝核菌、核盘菌和禾谷镰孢菌这6种真菌的全部、任5种、任4种、任3种、任2种或任1种。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白质，其特征在于：所述壳聚糖酶和所述几丁质酶均来源于链霉菌。
4.根据权利要求1或2或3所述的融合蛋白质，其特征在于：所述壳聚糖酶为A1)-A3)中的任一蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第323-570位氨基酸残基的蛋白质；
A2)将A1)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到与A1)具有90％以上的同一性且具有壳聚糖酶活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
所述几丁质酶为D1)-D3)中的任一蛋白质：
D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-322位氨基酸残基的蛋白质；
D2)将D1)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到与B1)具有90％以上的同一性且具有几丁质酶活性的蛋白质；
D3)在D1)或D2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
5.根据权利要求1至4种任一所述的融合蛋白质，其特征在于：所述融合蛋白质为F1)-F4)中的任一蛋白质：
F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
F2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-570位的蛋白质；
F3)将F1)或F2)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)或F2)具有90％以上的同一性且抗所述真菌活性高于所述壳聚糖酶和所述几丁质酶的蛋白质；
F4)在F1)或F2)或F3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
6.与权利要求1-5中任一所述融合蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码权利要求1-5中任一所述融合蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下B11)或B12)：
B11)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
B12)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第157-1710位的DNA分子。
8.一种制备融合蛋白质的方法，包括：使权利要求1-5中任一所述融合蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到所述融合蛋白质；所述生物为微生物、植物或非人动物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述微生物为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)肠杆菌科细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌。
10.下述任一种:
1)含有权利要求1-5中任一所述融合蛋白质的真菌抑制剂；
2)权利要求1-5中任一所述融合蛋白质、权利要求6或7所述的生物材料、权利要求8或9所述的方法在制备真菌抑制剂中的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110387364A (zh) * 2019-08-05 2019-10-29 河北农业大学 一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用
CN111154788A (zh) * 2020-02-24 2020-05-15 中国科学院过程工程研究所 一种海洋雪白链霉菌壳聚糖酶基因及其应用
CN113151226A (zh) * 2021-04-27 2021-07-23 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 高效降解α-几丁质的融合几丁质酶及其相关生物材料与应用
CN114645036A (zh) * 2018-07-11 2022-06-21 河北农业大学 由壳聚糖酶和几丁质酶融合而成的抗真菌融合蛋白及其相关生物材料与应用
CN114807190A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 中国科学院过程工程研究所 一种南极地衣链霉菌壳聚糖酶基因及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921792A (zh) * 2010-05-13 2010-12-22 复旦大学 一种提高抗真菌蛋白质抗菌活性的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3964701B2 (ja) * 2002-03-04 2007-08-22 独立行政法人農業生物資源研究所 病害抵抗性イネ科植物
CN114645036B (zh) * 2018-07-11 2023-08-01 河北农业大学 由壳聚糖酶和几丁质酶融合而成的抗真菌融合蛋白及其相关生物材料与应用
CN113151226A (zh) * 2021-04-27 2021-07-23 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 高效降解α-几丁质的融合几丁质酶及其相关生物材料与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921792A (zh) * 2010-05-13 2010-12-22 复旦大学 一种提高抗真菌蛋白质抗菌活性的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIDEO KUSAOKE等: "Biochemical and biotechnological trends in chitin, chitosan, and related enzymes produced by Paenibacillus IK-5 Strain", 《INT J BIOL MACROMOL》 *
谷天燕: "来源于苜蓿链霉菌的糖苷水解酶19家族几丁质酶的性质研究与应用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114645036A (zh) * 2018-07-11 2022-06-21 河北农业大学 由壳聚糖酶和几丁质酶融合而成的抗真菌融合蛋白及其相关生物材料与应用
CN114645036B (zh) * 2018-07-11 2023-08-01 河北农业大学 由壳聚糖酶和几丁质酶融合而成的抗真菌融合蛋白及其相关生物材料与应用
CN110387364A (zh) * 2019-08-05 2019-10-29 河北农业大学 一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用
CN110387364B (zh) * 2019-08-05 2023-09-01 河北农业大学 一种重组几丁质酶及其相关生物材料与应用
CN111154788A (zh) * 2020-02-24 2020-05-15 中国科学院过程工程研究所 一种海洋雪白链霉菌壳聚糖酶基因及其应用
CN111154788B (zh) * 2020-02-24 2022-03-08 中国科学院过程工程研究所 一种海洋雪白链霉菌壳聚糖酶基因及其应用
CN114807190A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 中国科学院过程工程研究所 一种南极地衣链霉菌壳聚糖酶基因及其应用
CN114807190B (zh) * 2021-01-27 2024-06-04 中国科学院过程工程研究所 一种南极地衣链霉菌壳聚糖酶基因及其应用
CN113151226A (zh) * 2021-04-27 2021-07-23 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 高效降解α-几丁质的融合几丁质酶及其相关生物材料与应用

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