KR20210011909A - 항-gucy2c 키메라 항원 수용체 조성물 및 방법 - Google Patents

항-gucy2c 키메라 항원 수용체 조성물 및 방법 Download PDF

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애덤 스눅
트레버 베이버트
마이클 매기
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토마스 제퍼슨 유니버시티
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Abstract

항-GUCY2C scFv 및 항-GUCY2C scFv를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 단백질이 개시된다. 힌지, 막관통 및 신호 도메인 서열에 연결된 항-GUCY2C scFv에 연결된 신호 서열을 포함하는 단백질이 개시된다. 힌지, 막관통 및 신호 도메인 서열에 연결된 항-GUCY2C scFv에 연결된 신호 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 개시된다. 상기 단백질 및 상기 핵산 분자를 포함하는 T 세포가 개시된다. 상기 T 세포의 제조 방법 및 상기 T 세포를 사용하여 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암을 치료 또는 예방하는 방법이 개시된다.

Description

항-GUCY2C 키메라 항원 수용체 조성물 및 방법
본 발명은 구아닐릴 사이클라제(guanylyl cyclase) C에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포, 상기 키메라 항원 수용체 및 세포의 제조 방법 및 상기 세포를 사용하여 구아닐릴 사이클라제 C를 발현하는 암 세포를 갖는 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법 및 구아닐릴 사이클라제 C를 발현하는 암 세포를 갖는 암에 대해서 개체를 보호하는 방법에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)를 발현하는 T 세포에 기초한 면역요법이 암을 치료하기 위한 새로운 양상이 되었다. CAR은 세포 표면 표적 분자의 HLA-독립적인 결합을 제공하는 기능을 하는 도메인 및 세포독성 림프구, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte: CTL), 자연 살해 T 세포(Natural Killer T cell: NKT) 및 자연 살해 세포(Natural Killer cell: NK) 또는 헬퍼 T 세포라고 지칭되는 세포의 집단을 포함할 수 있는, 다양한 유형의 숙주 면역 세포, 전형적으로 말초 혈액 T 세포를 활성화시킬 수 있는 신호전달 도메인을 포함하는 융합 수용체이다. 즉, 전형적으로 T 세포 내에 도입되는 동안, CAR을 암호화하는 유전 물질이 T 세포가 아닌 면역 세포, 예컨대, NK 세포에 첨가될 수 있다.
구아닐릴 사이클라제 C(GCC 또는 GUCY2C라고도 상호 교환 가능하게 지칭됨)는 장내 항상성, 종양형성 및 비만을 조절하는, 호르몬 리간드 구아닐린 또는 유로구아닐린(uroguanylin)에 의한 활성화 후 제2 메신저 cGMP를 생산하는 막-결합된 수용체이다. GUCY2C 세포 표면 발현은 장내 상피의 내강 표면 및 시상하부 뉴런(hypothalamic neuron)의 하위세트에 국한된다. 이의 발현은 결장직장암 전이의 95% 초과에서 유지되고, 이것은 식도암, 위암, 구강암, 침샘암 및 췌장암을 비롯한, 장내 화생(metaplasia)으로부터 발달하는 종양에서 이소성으로(ectopically) 발현된다.
GUCY2C의 세포하 제약으로 인해서 편극된(polarized) 상피 조직의 선단막(apical membrane)에서 GUCY2C의 접근 어려움은 수반되는 장내 독성 없이 선단-기저측 편극을 잃어버린 결장직장 기원의 전이 병변을 표적으로 하는 치료 기회를 생성시킨다.
동계(syngeneic), 면역적격 마우스 모델은, 뮤린 GUCY2C를 표적으로 하는 CAR-T 세포가 장내 독성의 부재 하에서 폐로 전이되는 결장직장암에 대해서 효과적이었다는 것을 입증하였다. 유사하게, 항체-약물 접합체 및 백신을 포함하는, 다른 GUCY2C-표적화 치료제는 전임상 동물 모델에서 안전하고, 이들 플랫폼을 사용하는 치료 요법은 전이성 식도암, 위암, 췌장암 및 결장직장암을 위해서 임상 시험 중에 있다(NCT02202759, NCT02202785, NCT01972737).
장의 문측-미측 축(rostral-caudal axis)에 걸친 GUCY2C 발현의 맥락에서, 이들 치료 요법의 안전성은 선단에 풍부하지만, 기저측, 상피 세포의 막에 제한된 GUCY2C의 구획화된 발현을 반영한다. GUCY2C 리간드에 접합된 전신 방사성 동위원소 표지된 영상화제는 장에 국지화되지 않고 GUCY2C-발현 전이를 표적으로 하는데, 이는 수용체의 점막 국지화를 확인해준다.
종양은 잠재적으로 정량적 치료창을 생성시키는 정상 상피 세포에 비해서 최대 10배 더 많은 양의 GUCY2C를 발현하여 기저측 막에서 저/무 GUCY2C를 갖는 장내 상피로부터 수용체 과발현 종양을 구별한다.
각각 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 공개 제20120251509 A1호 및 미국 특허 출원 공개 제US 2014-0294784 A1호에는, 구아닐릴 사이클라제 C에 결합하는 CAR을 비롯한 CAR, GUCY2C에 결합하는 CAR을 포함하는 T 세포를 비롯한 CAR을 포함하는 T 세포 및 GUCY2C를 포함하는 표적 세포, 키메라 항원 수용체 및 T 세포의 제조 방법, GUCY2C에 결합하는 CAR을 포함하는 T 세포 및 GUCY2C를 포함하는 표적 세포를 사용하여 GUCY2C를 발현하는 암 세포에 대해서 개체를 보호하는 방법 및 암 세포가 GUCY2C를 발현하는 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법이 개시되어 있다.
GUCY2C를 발현하는 암 세포에 대해서 개체를 보호하고, 암 세포가 GUCY2C를 발현하는 암을 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법이 필요하다.
항-GUCY2C scFV 서열을 포함하는 단백질이 제공된다. 항-GUCY2C scFV 서열은 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
5F9 항-GUCY2C scFV 서열을 포함하고, 신호 서열, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 더 포함하는 단백질이 제공된다.
이러한 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 핵산 분자는 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 단백질을 발현하도록 기능할 수 있는 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산 분자는 핵산 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 단백질을 발현하는 인간 세포 내에서 인간 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터에 혼입될 수 있다.
핵산 분자를 포함하고, 단백질을 발현하는 인간 세포가 제공된다.
이러한 세포의 제조 방법이 제공된다.
GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암을 가진 환자의 치료 방법 및 증가된 위험을 갖는 것으로 식별된 환자에서 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암을 예방하는 방법이 제공된다.
도 1 패널 A 내지 E. 인간 GUCY2C-특이적 CAR-T 세포의 생성. 도 1 패널 A: 재조합 5F9 항체를 1㎍/㎖로 플레이팅된 hGUCY2CECD 또는 BSA(음성 대조군)에 대한 특이적 결합에 대해서 ELISA로 평가하였다. 이원 ANOVA; ****p<0.0001. 도 1 패널 B: 모체 CT26 마우스 결장직장암 세포 또는 hGUCY2C(CT26.hGUCY2C)를 발현하도록 조작되고 5F9 항체로 염색된 CT26 세포에 대해서 유세포 분석법을 수행하였다. 도 1 패널 C: BiP 신호 서열, 5F9 scFv, CD8α 힌지 영역, CD28의 막관통 및 세포내 도메인, 4-1BB(CD137)의 세포내 도메인 및 CD3ζ(5F9.m28BBz)의 세포내 도메인의 뮤린 서열을 함유하는 제3 생성 뮤린 CAR 작제물의 개략도. CAR 작제물을 IRES-GFP 마커의 상류에 MSCV 레트로바이러스 플라스미드 pMIG 내에 삽입하였다. 도 1 패널 D: 대조군(1D3.m28BBz) CAR 또는 5F9 항체로부터 유래된 CAR(5F9.m28BBz)을 함유하는 레트로바이러스가 형질도입된 뮤린 CD8+ T 세포를 정제된 6xHis-hGUCY2CECD(10㎍/㎖)로 표지하고, 항-5xHis-Alexa Fluor 647 접합체로 검출하였다. 유동 플롯을 살아있는 CD8+ 세포에 대해서 게이팅하였다. 도 1 패널 E: 살아있는 CD8+GFP+ 세포에 대해서 게이팅된 5F9-유래된 또는 대조군(1D3) CAR에 대한 6xHis-hGUCY2CECD 결합 곡선(도 5의 데이터 참조). 3회의 독립적인 실험으로부터 조합하였다.
도 2 패널 A 내지 E. hGUCY2C-특이적 CAR은 항원-의존적 T-세포 활성화 및 효과기 기능을 매개한다. 도 2 패널 A 내지 E에서, 뮤린 CD8+ T 세포는 비-형질도입되었거나(없음) 또는 제시된 바와 같은 대조군 1D3.m28BBz 또는 5F9.m28BBz CAR 작제물이 형질도입되었다. 도 2 패널 A: 도 2 패널 B 내지 D에서 모든 분석에 대한 게이팅 전략. 도 2 패널 B: CD45RA 및 CD62L에 기초한 대표적인 CAR-T 세포 표현형분석(phenotyping) 플롯. 이원 ANOVA; NS: 유의하지 않음; 막대: 2 내지 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD; Tn/scm: 미경험 또는 T 기억 줄기 세포; Tcm: 중심 기억 T 세포; Tem: 효과기 기억 T 세포; Temra: CD45RA를 발현하는 효과기 기억 T 세포. (C 내지 D) 106개의 CAR-T 세포를 6시간 동안 플레이트-코팅된 항원(BSA 또는 hGUCY2C) 또는 PMA 및 이오노마이신(ionomycin)(PMA/IONO)으로 자극시켰다. 이어서, T-세포 활성화 마커(CD25, CD69 또는 CD44) 및 세포내 사이토카인 생산(IFNγ, TNFα, IL2 및 MIP1α)을 유세포 분석법에 의해서 정량하였다. 그래프를 평균 ± SD로 나타낸다. 도 2 패널 C는 활성화 마커 상향조절(MFI)을 나타내고, 도 2 패널 D는 3회의 독립적인 실험으로부터의 다기능성 사이토카인 생산(CAR+ 세포의 %)을 나타낸다. 도 2 패널 E: E-플레이트에서 모체 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 마우스 결장직장암 세포를 CAR-T 세포(5:1 E:T 비), 배지 또는 10% Triton-X 100(Triton)으로 처리하고, 10시간 동안 15분마다 상대적인 전기 임피던스를 정량하여 암 세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다. 이원 ANOVA, B-E; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 3 패널 A 내지 E. hGUCY2C CAR-T 세포는 동계 폐 전이 모델에서 장기간 보호를 제공한다. 도 3 패널 A 내지 E에서, BALB/c 마우스에게 꼬리 정맥을 통해서 5×105개의 CT26.hGUCY2C 세포를 주사하여 폐 전이를 확립하였다. 대조군(4D5.m28BBz) 또는 5F9.m28BBz CAR 작제물을 뮤린 CD8+ T 세포에 형질도입하였다. 도 3 패널 A: 마우스를 3일 후 5Gy 전신 방사선 조사(total body irradiation: TBI)로 처리한 후 106 내지 107개의 5F9.m28BBz(N=7 내지 8/군) 또는 107개의 대조군(N=6) CART 세포로 처리하였다. 도 3 패널 B: 마우스를 제3일(D3) 또는 제7일(D7)에 5Gy TBI로 처리한 후 107개의 대조군(N=10/군) 또는 5F9.m28BBz(N=9 내지 10/군) CAR-T 세포로 처리하였다. 도 3 패널 C: 마우스를 제7일에 5Gy TBI로 처리한 후 제7일 및 제14일에 107개의 대조군(N=10) 또는 5F9.m28BBz(N=12) CAR-T 세포로 처리하였다. 도 3 패널 D: 마우스를 제7일에 5Gy TBI 및 PBS 또는 107개의 대조군 또는 5F9.m28BBz CAR-T 세포로 처리하고, 제18일에 희생시키고, 폐를 인디아 잉크(India ink)로 염색하고, 종양/폐를 나열하였다. 일원 ANOVA; *p<0.05. 도 3 패널 E: 5F9.m28BBz CAR-T 세포로 처리된 B 및 C로부터의 살아남은 마우스 또는 미경험 마우스를 5×105개의 CT26(N=4 내지 7/군) 또는 CT26.hGUCY2C(N=7/군) 세포로 시험감염시켰다(초기 시험감염 후 16 내지 40주에 재시험감염이 일어남). 로그-랭크 만텔-콕스 시험(Log-rank Mantel-Cox test), 도 3 패널 A 내지 C 및 E; **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 위 화살표는 CAR-T 세포 처리일을 나타낸다. 각각의 패널은 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4 패널 A 내지 E. hGUCY2C CAR-T 세포는 인간 결장직장 종양 이종이식을 제거한다. 도 4 패널 A: T84 인간 결장직장암 세포에 대한 hGUCY2C 발현을 재조합 5F9 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 정량하였다. 도 4 패널 B 내지 E에서, 대조군(1D3.m28BBz) 또는 5F9.m28BBz CAR 작제물을 뮤린 CD8+ T 세포에 형질도입하였다. 도 4 패널 B: E-플레이트에서 T84 결장직장암 세포를 5F9-m28BBz 또는 대조군 CAR-T 세포(5:1 E:T 비), 배지 또는 10% Triton-X 100(Triton)으로 반복하여 처리하고, 20시간 동안 15분마다 상대적인 전기 임피던스를 측정하여 암 세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다. 이원 ANOVA; **p<0.01; 2회의 독립적인 실험에 대표적임. 도 4 패널 C 내지 E에서, 면역결핍 NSG 마우스에게 복강내 주사를 통해서 2.5×106개의 루시퍼라제-발현 T84 결장직장암 세포를 주사하고, 제14일에 복강내 주사에 의해서 107개의 대조군(N=5) 또는 5F9-m28BBz(N=4) CAR-T 세포로 처리하였다. 도 4 패널 C 내지 D에서, 총 종양 루미네선스(total tumor luminescence)(광자/초)를 T-세포 주사 직전 및 그 후에 주 단위로 정량하였다. 이원 ANOVA; *p<0.05. 도 4 패널 E: 마우스를 생존에 대해서 추적하였다. 로그-랭크 만텔 콕스 시험; *p<0.05.
도 5. 5F9.m28BBz CAR 표면 발현의 검출. 대조군 m28BBz CAR 또는 IRES-GFP 마커의 상류에 5F9 항체(5F9.m28BBz)로부터 유래된 CAR을 함유하는 레트로바이러스가 형질도입된 뮤린 CD8+ T 세포를 정제된 6xHishGUCY2CECD(0 내지 1430nM)로 표지하고, α5xHis-Alexa-647 접합체로 검출하였다. 유동 플롯을 살아있는 CD8+ 세포에 대해서 게이팅하였다.
도 6. hGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포는 5F9.m28BBz CAR-T 세포를 활성화시킨다. 106개의 CAR-T 세포를 6시간 동안 106개의 모체 CT26, CT26.hGUCY2C 결장직장암 세포 또는 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)으로 자극시켰다. T-세포 활성화 마커(CD25, CD69 또는 CD44)를 유세포 분석법에 의해서 정량하였다.
도 7, 패널 A 및 B. hGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포는 5F9.m28BBz CAR-T 세포 사이토카인 생산을 유도한다. 106개의 CAR-T 세포를 6시간 동안 플레이트-코팅된 항원으로 자극시켰다. 도 7, 패널 A는 BSA, hGUCY2C 및 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)에 대한 데이터를 도시한다. 도 7, 패널 B는 106개의 모체 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 결장직장암 세포 또는 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)에 대한 데이터를 도시한다. 세포내 사이토카인 생산(IFNγ, TNFα, IL-2 또는 MIP1α)을 유세포 분석법으로 정량하였다.
도 8 패널 A 및 B. 5F9.m28BBz CAR-T 세포는 hGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포를 사멸시킨다. β-갈락토시다제-발현 CT26(도 8 패널 A의 데이터) 또는 CT26.hGUCY2C(도 8 패널 B의 데이터) 마우스 결장직장암 세포를 4시간 동안 다양한 효과기 CAR-T 세포:표적 암 세포 비(E:T 비)로 배양하였다. 특이적 용해를 발광 기질에 의해서 검출되는 상청액 내로의 β-갈락토시다제 방출에 의해서 결정하였다. ****, p<0.0001 (이원 ANOVA).
도 9 패널 A 및 B. 5F9.m28BBz CAR-T 세포는 hGUCY2C-결핍 인간 결장직장 종양을 사멸시키지 않는다. 도 9 패널 A: SW480 인간 결장직장암 세포에 대한 hGUCY2C 발현을 재조합 5F9 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 정량하였다. 도 9, 패널 B: E-플레이트에서 SW480 세포를 5F9.m28BBz 또는 대조군 1D3.m28BBz CAR T 세포, 배지, 또는 2.5% Triton-X 100(Triton)으로 처리하고, 20시간 동안 15분마다 상대적인 전기 임피던스를 정량하여 암 세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다.
도 10 패널 A-C. 5F9.h28BBz CAR을 발현하는 인간 T 세포는 GUCY2C-발현 결장직장암 세포를 인식하고, 이를 사멸시킨다. 도 10 패널 A: 인간 5F9 CAR 작제물(5F9.h28BBz)을 발현하는 CAR-T 세포를 6시간 동안 플레이트-코팅된 항원(BSA 또는 hGUCY2C) 또는 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)으로 자극시켰다. 이어서, T-세포 활성화 마커 CD69 및 세포내 사이토카인(IFNγ TNFα 및 IL-2)□을 유세포 분석법으로 정량하였다. 도 10 패널 B 내지 C에서의 데이터를 참고하여, E-플레이트에서 배양된 모체(CT26), 인간 GUCY2C 발현 CT26(CT26.hGUCY2C) 마우스 결장직장암 세포(도 10 패널 B에 도시된 데이터), 또는 T84 인간 결장직장암 세포(도 10 패널 C에 도시된 데이터)를 대조군 또는 5F9.h28BBz CAR-T 세포(10:1의 E:T 비), 배지, 또는 2.5% Triton-X 100으로 처리하고, 상대적인 전기 임피던스를 15분마다 정량하여 암세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다. ***, p<0.001(이원 ANOVA).
도 11 패널 A 및 B. 5F9.m28BBz CAR-T 세포는 mGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포를 사멸시키지 않는다. β-갈락토시다제 및 뮤린 GUCY2C(도 11 패널 A; CT26.mGUCY2C) 또는 인간 GUCY2C(도 11 패널 B; CT26.hGUCY2C)를 발현하는 CT26 세포를 4시간 동안 다양한 효과기 CAR-T 세포:표적 암 세포 비(E:T 비)로 배양하였다. 특이적 용해를 발광 기질에 의해서 검출되는 상청액 내로의 β-갈락토시다제 방출에 의해서 결정하였다. ****, p<0.0001 (이원 ANOVA).
인간 GUCY2C의 세포외 도메인에 결합하는 항-GUCY2C 항체의 가변 경쇄의 단편 및 가변 중쇄의 단편을 사용하여 인간 GUCY2C의 세포외 도메인에 결합하는 단일 쇄 단백질 서열을 생성시켰다. 링커 서열은 인간 GUCY2C의 세포외 도메인에 결합하는 단일 쇄 항체 가변 단편 융합 단백질 서열(scFv) 내의 가변 중쇄 단편에 가변 경쇄 단편을 연결한다.
scFv는 더 큰 융합 단백질인 CAR의 구성성분이다. CAR 기능성 구성성분은 면역글로불린-유래 항원 결합 도메인, 항체 서열, 즉, 인간 GUCY2C에 결합하는 svFv, 내부에 발현되는 세포의 세포막 내의 단백질을 고정시키는 막관통 도메인에 scFv를 연결하는 힌지 도메인 및 인간 GUCY2C에 대한 scFv 결합 시 세포를 활성화시키는 신호 전달 세포내 서열(세포질 서열이라고도 지칭됨)로서 기능하는 신호전달 도메인을 포함한다. CAR을 암호화하는 핵산 서열은 번역된 CAR의 세포막으로의 수송을 용이하게 하는 세포 단백질로부터의 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다. CAR은 이들이 발현되는 재조합 세포가, 재조합 세포독성 림프구, 재조합 세포 T 림프구(CTL), 재조합 자연 살해 T 세포(NKT) 및 재조합 자연 살해 세포(NK)의 경우 항체-특이적 표적, 즉, GUCY2C를 디스플레이하는 세포에 결합하여 이를 사멸시키도록 지시한다. CAR이 발현되는 경우, 그것은 세포 표면으로 이송되고, 신호 펩타이드가 전형적으로 제거된다. 성숙 CAR은 세포 수용체로 기능한다. scFv 및 힌지 도메인은 세포 표면 상에 디스플레이되는데, 여기서 scFv 서열은 다른 세포 상의 단백질에 노출되고, 이러한 세포 상의 GUCY2C에 결합할 수 있다. 막관통 영역은 세포 막에서 CAR을 고정시키고, 세포내 서열은 신호 도메인으로서 기능하여 세포에서 신호를 전달하는데, 이것은 CAR-발현 세포가 결합된 GUCY2C-발현 세포의 사멸을 초래한다.
일부 실시형태에서, CAR은 신호 서열, 예컨대, 예를 들어, 포유동물 또는 합성 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 막-결합된 단백질 예컨대, 예를 들어, 포유동물 막-결합된 단백질로부터의 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 막-결합된 단백질, 예컨대, CD8 알파, CD8 베타, CD4, TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD28 및 BiP로부터의 신호 서열을 포함한다. 신호 서열의 예는 또한 막 결합된 임의의 포유동물 신호 서열에서 발견될 수 있다<http://www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia>. 일부 실시형태에서, CAR은 과립구-대식구 집락-자극 인자(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor: GM-CSF) 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22를 갖는 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22를 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66을 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66을 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66으로 이루어진다.
항-GUCY2C 결합 도메인은 MHC-독립적인 단일 쇄 키메라 수용체로서 제공된다. 항원-결합 도메인은 항체로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 5F9로부터의 항-구아닐릴 사이클라제 C(GCC 또는 GUCY2C라고도 지칭됨) 단일 쇄 가변 단편(scFv)(바람직하게는 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4 LINKER-가변 중쇄 단편)을 포함한다. 5F9는 인간 GUCY2C의 세포외 도메인을 인식하는 완전 인간화된 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마이다. 항체 중쇄 및 경쇄의 DNA 암호 서열을 사용하여 항-GCC CAR, 예컨대, 예를 들어, 5F9-28BBz CAR에 생성에 사용되고, GUCY2C 분자에 대해 지향되는 항원 특이성을 부여하는 CAR 구현을 위한 신규 scFv를 생성하였다.
일부 실시형태, 예컨대, 5F9-28BBz CAR에서, 항-GCC scFv는 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)(가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4 LINKER-가변 중쇄 단편)일 수 있다. 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 포함하는 CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다. 서열번호 2의 아미노산 25 내지 133은 5F9 가변 경쇄 단편에 상응한다. 서열번호 2의 아미노산 154 내지 274는 5F9 가변 중쇄 단편에 상응한다. 일부 실시형태에서, CAR은 (글리신4세린)n LINKER(여기서 (글리신4세린) = GGGGS(서열번호 3)이고, n = 2 내지 5임)를 사용하여 서로에 부착된 5F9 가변 경쇄 단편 및 5F9 가변 중쇄 단편에 상응하는 항-GCC 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 2개의 (글리신4세린) 단위((글리신4세린)2)를 함유하고, LINKER G4S-2(서열번호 4)라고 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 3개의 (글리신4세린) 단위((글리신4세린)3)를 함유하고, LINKER G4S-3(서열번호 5)이라고 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 4개의 (글리신4세린) 단위(글리신4세린)4)를 함유하고, LINKER G4S-4(서열번호 6)라고 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 5개의 (글리신4세린) 단위((글리신4세린)5)를 함유하고, LINKER G4S-5(서열번호 7)라고 지칭될 수 있다.
5F9 가변 단편은 N-말단에서부터 C-말단으로 순서대로 가변 경쇄 단편-LINKER-가변 중쇄 단편 또는 가변 중쇄 단편-LINKER-가변 경쇄 단편으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)2-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 8), [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)3-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 9), [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 10), 또는 [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)5-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 11)으로 구성된 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)2-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 12), [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)3-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 13), [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)4-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 14), 또는 [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)5-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 15)으로 구성된 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274를 갖는 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD8α, IgG1-Fc, IgG4-Fc 또는 CD28 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD8α 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336을 갖는 CD8α 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 829 내지 1008을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 829 내지 1008로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 829 내지 1008로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM 막관통 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM 세포내 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM으로부터의 막관통 및 세포내(세포질) 서열 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 갖는 CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ), B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄, 또는 특정 Fc 수용체로부터의 세포내(세포질) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 b) CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ), B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄, 또는 특정 Fc 수용체로부터의 세포내(세포질) 서열과 조합하여 a) CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM 세포내 영역 중 하나 이상으로부터의 세포내(세포질) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 세포내 서열과 조합하여 4-1BB 세포내 서열과 함께 CD28 막관통 및 세포내 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 갖는 CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 4-1BB 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444를 갖는 4-1BB 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444를 포함하는 4-1BB 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1216 내지 1332를 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1216 내지 1332로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1216 내지 1332로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 면역수용체 타이로신 활성화 모티프 (ITAM)를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 ITAM을 포함하는 세포 신호전달 분자로부터의 서열을 포함한다. 전형적으로 3 ITAMS는 이러한 서열에 존재한다. ITAM을 포함하는 세포 신호전달 분자의 예는 CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ), B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄 및 특정 Fc 수용체로부터의 세포내(세포질) 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, CAR은 세포 신호전달 분자, 예컨대, CD3ζ, B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄 및 ITAM을 포함하는 특정 Fc 수용체로부터의 서열을 포함한다. CAR에 포함된 서열은 하나 이상의 ITAM을 포함하는 이러한 분자로부터의 세포내 서열이다. ITAM은 면역계의 특정 세포 표면 단백질의 세포질 꼬리에 2회 반복된 4개의 아미노산의 보존된 서열이다. ITAM의 4개의 아미노 서열의 보존된 서열은 임의의 2개의 다른 아미노산에 의해서 류신 또는 아이소류신으로부터 분리된 타이로신을 함유한다(X가 독립적으로 임의의 아미노산 서열인 YXXL 또는 YXXI). ITAM은 전형적으로 약 6 내지 8개의 아미노산에 의해서 분리된 2 내지 4개의 아미노산의 보존된 서열을 갖는 14 내지 16개의 아미노산인 서열을 함유한다. CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ)는 3개의 ITAM을 함유한다. 서열번호 2의 아미노산 445 내지 557은 CD3ζ 세포내 서열이다. ITAM은 아미노산 465 내지 479, 504 내지 519 및 535 내지 549에 위치된다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 445 내지 557를 갖는 CD3ζ 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열은 서열번호 2의 445 내지 557을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열은 서열번호 2의 445 내지 557로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열은 서열번호 2의 445 내지 557로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1333 내지 1671을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1333 내지 1671로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1333 내지 1671로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 면역글로불린-유래된 항원 결합 도메인, T 세포 신호전달 도메인, 예컨대, T 세포 수용체의 CD3제타 신호전달 쇄 또는 T-세포 쇄, 예컨대, CD3제타 쇄에 연결된 T-세포 공자극성 신호전달(예를 들어, CD28) 도메인에 융합된 GUCY2C에 결합하는 항체 서열 또는 Ig Fc 수용체 복합체의 감마-신호-전달 소단위를 포함할 수 있다.
CAR의 신호전달 도메인은 TCR로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 막관통 및 세포질 신호전달 도메인, 예컨대, CD3제타 쇄에 융합된 항원 결합 기능을 제공하는 항체 가변 영역의 세포외 단일 쇄 단편 또는 CD3제타 쇄에 연결된 또는 CD28 신호 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서 신호전달 도메인은 스페이서 또는 힌지에 의해서 항원 결합 도메인에 연결된다. 항체 가변 영역의 단편이 GUCY2C에 결합하는 경우, 신호전달 도메인은 면역 세포 활성화를 개시한다. 막 결합된 키메라 수용체를 발현하는 이들 재조합 T 세포는 세포외 항-GUCY2C 결합 도메인 및 림프구를 자극하도록 신호전달 기능을 수행하는 TCR로부터 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-GUCY2C 결합 도메인은 항-GUCY2C 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 항-GUCY2C 결합 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 신호전달 도메인은 T-세포 공자극성 신호전달(예를 들어, CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40, SLAM) 도메인 및 T-세포 트리거링(triggering) 쇄(예를 들어, CD3제타)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 친화성 태그를 포함한다. 이러한 친화성 태그의 예는 Strep-태그; Strep-태그II; Poly(His); HA; V5; 및 FLAG-태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 scFv 전에 또는 scFv와 힌지 영역 사이에 또는 힌지 영역 이후에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 Strep-태그, Strep-태그II, Poly(His), HA; V5 및 FLAG-태그로부터 선택되고, scFv 전에 또는 scFv와 힌지 영역 사이에 또는 힌지 영역 이후에 위치될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 N 말단에서부터 C 말단으로, 신호 서열, 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv, 힌지 영역, 막관통 영역 및 1종 이상의 단백질로부터의 세포내 서열 및 세포내 서열 및 면역수용체 타이로신 활성화 모티프 및 선택적으로 친화성 태그를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 N 말단에서부터 C 말단으로, Strep-태그, Strep-태그II, Poly(His), HA; V5 및 FLAG-태그로부터 선택된 친화성 태그에 선택적으로 연결된, 하나 이상의 ITAM을 포함하는 CD3ζ, CD79-알파, CD79-베타 및 Fc 수용체 세포내 서열로부터 선택된 서열을 함유하는 면역수용체 타이로신 활성화 모티프에 연결된, CD284-1BB(CD137), CD2, CD27, CD28, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40, SLAM 세포내 서열로부터 선택된 세포내 서열에 연결된, CD8α, IgG1-Fc, IgG4-Fc 및 CD28 막관통 영역으로부터 선택된 막관통 영역에 연결된, CD8α, IgG1-Fc, IgG4-Fc 및 CD28 힌지 영역으로부터 선택된 힌지 영역에 연결된, (가변 경쇄 단편-(글리신4세린)2-5 LINKER-가변 중쇄 단편) 및 (가변 중쇄 단편-(글리신4세린)2-5 LINKER - 가변 경쇄 단편)으로부터 선택된, 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv에 연결된, GM-CSF, CD8 알파, CD8 베타, CD4, TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD28, BiP로부터 선택된 신호 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 N 말단에서부터 C 말단으로, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열, [가변 경쇄 단편-(글리신4세린)2-5 LINKER -가변 중쇄 단편] 또는 [가변 중쇄 단편- (글리신4세린)2-5 LINKER - 가변 경쇄 단편])으로부터 선택된 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv, CD8α, CD28, IgG1-Fc 또는 IgG4-Fc 힌지 영역, CD8α 또는 CD28 막관통 및 세포내 서열, 4-1BB 세포내 서열 및 CD3ζ 세포내 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열, 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv(가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4 LINKER - 가변 중쇄 단편), CD8α 힌지 영역, CD28 막관통 및 세포내 서열, 4-1BB 세포내 서열 및 CD3ζ 세포내 서열로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22, 25 내지 274, 277 내지 336, 337 내지 405, 406 내지 444 및 445 내지 557을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22, 25 내지 274, 277 내지 336, 337 내지 405, 406 내지 444 및 445 내지 557로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22, 25 내지 274, 277 내지 336, 337 내지 405, 406 내지 444 및 445 내지 557로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 66, 73 내지 822, 829 내지 1008, 1009 내지 1215, 1216 내지 1332 및 1333 내지 1671을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 66, 73 내지 822, 829 내지 1008, 1009 내지 1215, 1216 내지 1332 및 1333 내지 1671로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 66, 73 내지 822, 829 내지 1008, 1009 내지 1215, 1216 내지 1332 및 1333 내지 1671로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 이들 서열은 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된다. 일부 실시형태에서, 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포는 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된 서열로 형질전환된다.
일부 실시형태에서, CAR은 GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop(5F9-28BBz - 서열번호 1), 신규 DNA 서열, T 림프구에 의해서 발현되고, 인간 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C)-발현 악성종양의 치료적 치료를 위해서 주입될 수 있는 합성 수용체에 의해서 암호화된다. GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop은 서열번호 2를 암호화한다. 5F9-28BBz는 연결된 인간 DNA 암호 서열, 따라서: (1) 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열, (2) 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)(가변 경쇄 단편- (글리신4세린)4 LINKER - 가변 중쇄 단편), (3) CD8α 힌지 영역, (4) CD28 막관통 도메인, (5) CD28 세포내 도메인, (6) 4-1BB 세포내 도메인 및 (7) CD3ζ 세포내 도메인을 포함한다. CAR은 5F9-28BBz라고 지칭된다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1로 본질적으로 이루어진 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1로 이루어진 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 이들 서열은 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된다. 일부 실시형태에서, 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포는 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된 서열로 형질전환된다.
일부 실시형태에서, 5F9-28BBz - 서열번호 1은 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된다. 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암소 서열의 발현에 필요한 조절 요소는 5' 및 3' 미번역 영역에 프로모터, 폴리아데닐화 부위 및 다른 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1은 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드, 예컨대, pVAX, 또는 레트로바이러스 발현 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터, 또는 재조합 DNA 바이러스 벡터, 예컨대, 재조합 아데노바이러스, 재조합 AAV, 또는 재조합 백시니아 바이러스, 또는 CRISPR/Cas9, TALEN 또는 다른 트랜스포존 기술과 함께 사용될 이중 가닥 DNA 또는 메신저 RNA에 삽입된다.
일부 실시형태에서, CAR 암호 서열은 일상적인 시험관내 유전자 전달 기술 및 물질, 예컨대, 레트로바이러스 벡터를 사용하여 생체외에서 세포, 예컨대, T 세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+, 불변 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 자연 살해 세포 및 골수 세포, 예컨대, 말초 림프구로부터의 CD34+ 조혈 줄기 세포에 도입된다. 유전자 전달 이후에, 재조합 세포는 환자에게 투여되는 재조합 세포의 수를 확장시키기 위해서 배양된다. 재조합 세포는 세포외 항체-유래된 항원 결합 도메인에 의해서 인식되는 항원을 디스플레이하는 세포를 인식하고, 이에 결합할 것이다.　변형 후에, 세포는 기술된 환자에게 투여되는 다수의 이러한 세포를 얻기 위해서 확장된다. 상기와 같이, 자가유래는 동일한 사람인 세포의 공여자 및 수용자를 지칭한다. 동종이계는 상이한 사람인 세포의 공여자 및 수용자를 지칭한다.　생체외에서의 배양에 의해서 항원-특이적 T 세포의 집단을 단리 및 확장시키는 것에 더하여, T 세포는 단백질, 예컨대, 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15를 암호화하는 것에 유전 물질을 첨가함으로써 집단을 단리시킨 후에 그리고 확장시키기 전에 변형될 수 있다.
GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 복수의 T 세포는 세포 공여자로부터 T 세포를 단리시키고, 그것을 항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자로 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 배양하여 형질전환된 T 세포의 수를 기하급수적으로 확장시켜 복수의 이러한 세포를 생산함으로써 획득될 수 있다.
세포 공여자는 확장된 세포 집단이 투여될 개체, 즉, 자가유래 세포 공여자일 수 있다. 대안적으로, T 세포는 T 세포가 투여될 개체와 상이한 개체인 세포 공여자, 즉, 동종이계 T 세포로부터 획득될 수 있다. 동종이계 T 세포가 사용되는 경우, 세포 공여자는 수용자와 동일하거나 거의 동일한 백혈구 항원의 세트를 발현하는 것으로 식별된, 매칭된 유형인 것이 바람직하다.
T 세포는 예를 들어, 혈액 분획, 특히 말초 혈액 단핵구 세포 구성성분으로부터 또는 골수 샘플로부터의 단리를 비롯한, 일상적인 방법에 의해서 세포 공여자로부터 획득될 수 있다.
T 세포가 세포 공여자로부터 획득된 후, 하나 이상의 T 세포는 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프에 결합하는 항체의 기능성 결합 단편 및 단백질, 세포, 예컨대, T 세포에서 발현되는 경우, 막 결합된 단백질이 되게 하는 부분을 포함하는 항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산으로 형질전환될 수 있다.
항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자는 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 이러한 B 세포를 갖는 "항체 유전자 공여자"로부터의 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 B 세포를 단리시킴으로써 획득될 수 있다. 이러한 항체 유전자 공여자는 백신접종에 의한 것 이외의 면역원에 대한 노출로부터 일어나는 면역 반응으로 인해서 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 B 세포를 가질 수 있거나, 또는 이러한 항체 유전자 공여자는 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 B 세포의 생산을 유도하는 백신을 제공받은 공여자, 즉, 백신접종된 항체 유전자 공여자로서 식별될 수 있다. 백신접종된 항체 유전자 공여자는 이전에 백신접종되었을 수 있거나, 또는 항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자로 T 세포를 형질전환시키고, 세포 수를 확장시키고, 개체에게 형질전환된 T 세포의 확장된 집단을 투여하는 것을 포함하는 방법에 사용하기 위해서 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 이러한 B 세포를 생성시키기 위한 노력의 일부로서 특별하게 백신이 투여될 수 있다.
항체 유전자 공여자는 형질전환된 T 세포의 수용자일 개체 또는 형질전환된 T 세포의 공여자일 개체와 상이한 개체일 수 있다. 항체 유전자 공여자는 세포 공여자와 동일한 개체일 수 있거나 또는 항체 유전자 공여자는 세포 공여자와 상이한 개체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 공여자는 형질전환된 T 세포의 수용자이고, 항체 유전자 공여자는 상이한 개체이다. 일부 실시형태에서, 세포 공여자는 항체 유전자 공여자와 동일한 개체이고, 형질전환된 T 세포의 수용자와 상이한 개체이다. 일부 실시형태에서, 세포 공여자는 항체 유전자 공여자와 동일한 개체이고, 형질전환된 T 세포의 수용자와 동일한한 개체이다.
항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자는 막 결합된 단백질일 발현된 단백질을 제공하는 단백질 서열에 연결된 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체의 기능성 결합 단편을 암호화하는 암호 서열을 포함한다. 암호 서열은 그것이 발현되는 단일 생성물을 암호화하도록 연결된다.
GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체의 기능성 결합 단편을 암호화하는 암호 서열은 항체 유전자 공여자로부터의 B 세포로부터 단리될 수 있다. 이러한 B 세포가 획득되고, 유전 정보가 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, B 세포를 사용하여 항체를 발현하고, 따라서 항체 암호 서열을 보유하는 혼성 세포를 생성시킨다. 항체 암호 서열을 결정하고, 클로닝하고, 이를 사용하여 항-GUCY2C CAR을 제조할 수 있다. GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체의 기능성 결합 단편은 형질전환된 T 세포에서 발현되는 경우 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프에 대한 결합 활성을 보유하는 항체 단백질의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
막 결합된 단백질일 발현된 단백질을 제공하는 단백질 서열에 대한 암호 서열은 막 결합된 세포 단백질로부터 유래될 수 있고, 막관통 도메인 및 선택적으로 세포질 도메인의 적어도 일부 및/또는 세포외 도메인의 일부 및 발현된 단백질을 세포막으로 전위(translocating)시키기 위한 신호 서열을 포함한다.
항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자, 즉, 항-GUCY2C CAR 암호 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 발명은 구아닐릴 사이클라제(guanylyl cyclase) C에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포, 상기 키메라 항원 수용체 및 세포의 제조 방법 및 상기 세포를 사용하여 구아닐릴 사이클라제 C를 발현하는 암 세포를 갖는 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법 및 구아닐릴 사이클라제 C를 발현하는 암 세포를 갖는 암에 대해서 개체를 보호하는 방법에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포에 기초한 면역요법이 암을 치료하기 위한 새로운 양상이 되었다. CAR은 세포 표면 표적 분자의 HLA-독립적인 결합을 제공하는 기능을 하는 도메인 및 세포독성 림프구, 세포독성 T 림프구(CTL), 자연 살해 T 세포(NKT) 및 자연 살해 세포(NK) 또는 헬퍼 T 세포라고 지칭되는 세포의 집단을 포함할 수 있는, 다양한 유형의 숙주 면역 세포, 전형적으로 말초 혈액 T 세포를 활성화시킬 수 있는 신호전달 도메인을 포함하는 융합 수용체이다. 즉, 전형적으로 T 세포 내에 도입되는 동안, CAR을 암호화하는 유전 물질이 T 세포가 아닌 면역 세포, 예컨대, NK 세포에 첨가될 수 있다.
구아닐릴 사이클라제 C(GCC 또는 GUCY2C라고도 상호 교환 가능하게 지칭됨)는 장내 항상성, 종양형성 및 비만을 조절하는, 호르몬 리간드 구아닐린 또는 유로구아닐린(uroguanylin)에 의한 활성화 후 제2 메신저 cGMP를 생산하는 막-결합된 수용체이다 GUCY2C 세포 표면 발현은 장내 상피의 내강 표면 및 시상하부 뉴런(hypothalamic neuron)의 하위세트에 국한된다. 이의 발현은 결장직장암 전이의 95% 초과에서 유지되고, 이것은 식도암, 위암, 구강암, 침샘암 및 췌장암을 비롯한, 장내 화생(metaplasia)으로부터 발달하는 종양에서 이소성으로(ectopically) 발현된다.
GUCY2C의 세포하 제약으로 인해서 편극된(polarized) 상피 조직의 선단막(apical membrane)에서 GUCY2C의 접근 어려움은 수반되는 장내 독성 없이 선단-기저측 편극을 잃어버린 결장직장 기원의 전이 병변을 표적으로 하는 치료 기회를 생성시킨다.
동계(syngeneic), 면역적격 마우스 모델은, 뮤린 GUCY2C를 표적으로 하는 CAR-T 세포가 장내 독성의 부재 하에서 폐로 전이되는 결장직장암에 대해서 효과적이었다는 것을 입증하였다. 유사하게, 항체-약물 접합체 및 백신을 포함하는, 다른 GUCY2C-표적화 치료제는 전임상 동물 모델에서 안전하고, 이들 플랫폼을 사용하는 치료 요법은 전이성 식도암, 위암, 췌장암 및 결장직장암을 위해서 임상 시험 중에 있다(NCT02202759, NCT02202785, NCT01972737).
장의 문측-미측 축(rostral-caudal axis)에 걸친 GUCY2C 발현의 맥락에서, 이들 치료 요법의 안전성은 선단에 풍부하지만, 기저측, 상피 세포의 막에 제한된 GUCY2C의 구획화된 발현을 반영한다. GUCY2C 리간드에 접합된 전신 방사성 동위원소 표지된 영상화제는 장에 국지화되지 않고 GUCY2C-발현 전이를 표적으로 하는데, 이는 수용체의 점막 국지화를 확인해준다.
종양은 잠재적으로 정량적 치료창을 생성시키는 정상 상피 세포에 비해서 최대 10배 더 많은 양의 GUCY2C를 발현하여 기저측 막에서 저/무 GUCY2C를 갖는 장내 상피로부터 수용체 과발현 종양을 구별한다.
각각 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 공개 제20120251509 A1호 및 미국 특허 출원 공개 제US 2014-0294784 A1호에는, 구아닐릴 사이클라제 C에 결합하는 CAR을 비롯한 CAR, GUCY2C에 결합하는 CAR을 포함하는 T 세포를 비롯한 CAR을 포함하는 T 세포 및 GUCY2C를 포함하는 표적 세포, 키메라 항원 수용체 및 T 세포의 제조 방법, GUCY2C에 결합하는 CAR을 포함하는 T 세포 및 GUCY2C를 포함하는 표적 세포를 사용하여 GUCY2C를 발현하는 암 세포에 대해서 개체를 보호하는 방법 및 암 세포가 GUCY2C를 발현하는 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법이 개시되어 있다.
GUCY2C를 발현하는 암 세포에 대해서 개체를 보호하고, 암 세포가 GUCY2C를 발현하는 암을 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법이 필요한다.
항-GUCY2C scFV 서열을 포함하는 단백질이 제공된다. 항-GUCY2C scFV 서열은 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
5F9 항-GUCY2C scFV 서열을 포함하고, 신호 서열, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 더 포함하는 단백질이 제공된다.
이러한 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 핵산 분자는 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 단백질을 발현하도록 기능할 수 있는 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산 분자는 핵산 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 단백질을 발현하는 인간 세포 내에서 인간 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터에 혼입될 수 있다.
핵산 분자를 포함하고, 단백질을 발현하는 인간 세포가 제공된다.
이러한 세포의 제조 방법이 제공된다.
GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암을 가진 환자의 치료 방법 및 증가된 위험을 갖는 것으로 식별된 환자에서 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암을 예방하는 방법이 제공된다.
도 1 패널 A 내지 E. 인간 GUCY2C-특이적 CAR-T 세포의 생성. (도 1 패널 A) 재조합 5F9 항체를 1㎍/㎖로 플레이팅된 hGUCY2CECD 또는 BSA(음성 대조군)에 대한 특이적 결합에 대해서 ELISA로 평가하였다. 이원 ANOVA; ****p<0.0001. (도 1 패널 B) 모체 CT26 마우스 결장직장암 세포 또는 hGUCY2C(CT26.hGUCY2C)를 발현하도록 조작되고 5F9 항체로 염색된 CT26 세포에 대해서 유세포 분석법을 수행하였다. (도 1 패널 C) BiP 신호 서열, 5F9 scFv, CD8α 힌지 영역, CD28의 막관통 및 세포내 도메인, 4-1BB(CD137)의 세포내 도메인 및 CD3ζ(5F9.m28BBz)의 세포내 도메인의 뮤린 서열을 함유하는 제3 생성 뮤린 CAR 작제물의 개략도. CAR 작제물을 IRES-GFP 마커의 상류에 MSCV 레트로바이러스 플라스미드 pMIG 내에 삽입하였다. (도 1 패널 D) 대조군(1D3.m28BBz) CAR 또는 5F9 항체로부터 유래된 CAR(5F9.m28BBz)을 함유하는 레트로바이러스가 형질도입된 뮤린 CD8+ T 세포를 정제된 6xHis-hGUCY2CECD(10㎍/㎖)로 표지하고, 항-5xHis-Alexa Fluor 647 접합체로 검출하였다. 유동 플롯을 살아있는 CD8+ 세포에 대해서 게이팅하였다. (도 1 패널 E) 살아있는 CD8+GFP+ 세포에 대해서 게이팅된 5F9-유래된 또는 대조군(1D3) CAR에 대한 6xHis-hGUCY2CECD 결합 곡선(도 5의 데이터 참조). 3회의 독립적인 실험으로부터 조합하였다.
도 2 패널 A 내지 E. hGUCY2C-특이적 CAR은 항원-의존적 T-세포 활성화 및 효과기 기능을 매개한다. (도 2 패널 A-E) 뮤린 CD8+ T 세포는 비-형질도입되었거나(없음) 또는 제시된 바와 같은 대조군 1D3.m28BBz 또는 5F9.m28BBz CAR 작제물이 형질도입되었다. (도 2 패널 A) 도 2 패널 B 내지 D에서 모든 분석에 대한 게이팅 전략. (도 2 패널 B) CD45RA 및 CD62L에 기초한 대표적인 CAR-T 세포 표현형분석 플롯. 이원 ANOVA; NS: 유의하지 않음; 막대: 2 내지 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD; Tn/scm: 미경험 또는 T 기억 줄기 세포; Tcm: 중심 기억 T 세포; Tem: 효과기 기억 T 세포; Temra: CD45RA를 발현하는 효과기 기억 T 세포. (C 내지 D) 106개의 CAR-T 세포를 6시간 동안 플레이트-코팅된 항원(BSA 또는 hGUCY2C) 또는 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)으로 자극시켰다. 이어서, T-세포 활성화 마커(CD25, CD69 또는 CD44) 및 세포내 사이토카인 생산(IFNγ, TNFα, IL2 및 MIP1α)을 유세포 분석법에 의해서 정량하였다. 그래프는 평균 ± SD(도 2 패널 C) 활성화 마커 상향조절(MFI) 및 (도 2 패널 D) 3회의 독립적인 실험으로부터의 다기능성 사이토카인 생산(CAR+ 세포의 %)을 나타낸다. (도 2 패널 E) E-플레이트에서 모체 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 마우스 결장직장암 세포를 CAR-T 세포(5:1 E:T 비), 배지 또는 10% Triton-X 100(Triton)으로 처리하고, 10시간 동안 15분마다 상대적인 전기 임피던스를 정량하여 암 세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다. 이원 ANOVA, B-E; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 3 패널 A 내지 E. hGUCY2C CAR-T 세포는 동계 폐 전이 모델에서 장기간 보호를 제공한다. (도 3 패널 A 내지 E), BALB/c 마우스에게 꼬리 정맥을 통해서 5×105개의 CT26.hGUCY2C 세포를 주사하여 폐 전이를 확립하였다. 대조군(4D5.m28BBz) 또는 5F9.m28BBz CAR 작제물을 뮤린 CD8+ T 세포에 형질도입하였다. (도 3 패널 A) 마우스를 3일 후 5Gy 전신 방사선 조사(TBI)로 처리한 후 106 내지 107개의 5F9.m28BBz(N=7 내지 8/군) 또는 107개의 대조군(N=6) CART 세포로 처리하였다. (도 3 패널 B) 마우스를 제3일(D3) 또는 제7일(D7)에 5Gy TBI로 처리한 후 107개의 대조군(N=10/군) 또는 5F9.m28BBz(N=9 내지 10/군) CAR-T 세포로 처리하였다. (도 3 패널 C) 마우스를 제7일에 5Gy TBI로 처리한 후 제7일 및 제14일에 107개의 대조군(N=10) 또는 5F9.m28BBz(N=12) CAR-T 세포로 처리하였다. (도 3 패널 D) 마우스를 제7일에 5Gy TBI 및 PBS 또는 107개의 대조군 또는 5F9.m28BBz CAR-T 세포로 처리하고, 제18일에 희생시키고, 폐를 인디아 잉크로 염색하고, 종양/폐를 나열하였다. 일원 ANOVA; *p<0.05. (도 3 패널 E) 5F9.m28BBz CAR-T 세포로 처리된 B 및 C로부터의 살아남은 마우스 또는 미경험 마우스를 5×105개의 CT26(N=4 내지 7/군) 또는 CT26.hGUCY2C(N=7/군) 세포로 시험감염시켰다(초기 시험감염 후 16 내지 40주에 재시험감염이 일어남). 로그-랭크 만텔-콕스 시험, 도 3 패널 A 내지 C 및 E; **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 위 화살표는 CAR-T 세포 처리일을 나타낸다. 각각의 패널은 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4 패널 A 내지 E. hGUCY2C CAR-T 세포는 인간 결장직장 종양 이종이식을 제거한다. (도 4 패널 A) T84 인간 결장직장암 세포에 대한 hGUCY2C 발현을 재조합 5F9 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 정량하였다. (도 4 패널 B-E) 대조군 (1D3.m28BBz) 또는 5F9.m28BBz CAR 작제물을 뮤린 CD8+ T 세포에 형질도입하였다. (도 4 패널 B) E-플레이트에서 T84 결장직장암 세포를 5F9-m28BBz 또는 대조군 CAR-T 세포(5:1 E:T 비), 배지 또는 10% Triton-X 100(Triton)으로 반복하여 처리하고, 20시간 동안 15분마다 상대적인 전기 임피던스를 측정하여 암 세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다. 이원 ANOVA; **p<0.01; 2회의 독립적인 실험에 대표적임. (도 4 패널 C 내지 E) 면역결핍 NSG 마우스에게 복강내 주사를 통해서 2.5×106개의 루시퍼라제-발현 T84 결장직장암 세포를 주사하고, 제14일에 복강내 주사에 의해서 107개의 대조군(N=5) 또는 5F9-m28BBz(N=4) CAR-T 세포로 처리하였다. (도 4 패널 C-D) 총 종양 루미네선스(광자/초)를 T-세포 주사 직전 및 그 후에 주 단위로 정량하였다. 이원 ANOVA; *p<0.05. (도 4 패널 E) 마우스를 생존에 대해서 추적하였다. 로그-랭크 만텔 콕스 시험; *p<0.05.
도 5. 5F9.m28BBz CAR 표면 발현의 검출. 대조군 m28BBz CAR 또는 IRES-GFP 마커의 상류에 5F9 항체(5F9.m28BBz)로부터 유래된 CAR을 함유하는 레트로바이러스가 형질도입된 뮤린 CD8+ T 세포를 정제된 6xHishGUCY2CECD(0 내지 1430nM)로 표지하고, α5xHis-Alexa-647 접합체로 검출하였다. 유동 플롯을 살아있는 CD8+ 세포에 대해서 게이팅하였다.
도 6. hGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포는 5F9.m28BBz CAR-T 세포를 활성화시킨다. 106개의 CAR-T 세포를 6시간 동안 106개의 모체 CT26, CT26.hGUCY2C 결장직장암 세포 또는 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)으로 자극시켰다. T-세포 활성화 마커(CD25, CD69 또는 CD44)를 유세포 분석법에 의해서 정량하였다.
도 7, 패널 A 및 B. hGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포는 5F9.m28BBz CAR-T 세포 사이토카인 생산을 유도한다. 106개의 CAR-T 세포를 6시간 동안 플레이트-코팅된 항원(도 7, 패널 A; BSA 또는 hGUCY2C) 또는 106개의 모체 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 결장직장암 세포(도 7, 패널 B), 또는 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)으로 자극시켰다. 세포내 사이토카인 생산(IFNγ, TNFα, IL-2 또는 MIP1α)을 유세포 분석법으로 정량하였다.
도 8 패널 A 및 B. 5F9.m28BBz CAR-T 세포는 hGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포를 사멸시킨다. β-갈락토시다제-발현 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 마우스 결장직장암 세포를 4시간 동안 다양한 효과기 CAR-T 세포:표적 암 세포 비(E:T 비)로 배양하였다. 특이적 용해를 발광 기질에 의해서 검출되는 상청액 내로의 β-갈락토시다제 방출에 의해서 결정하였다. ****, p<0.0001 (이원 ANOVA).
도 9 패널 A 및 B. 5F9.m28BBz CAR-T 세포는 hGUCY2C-결핍 인간 결장직장 종양을 사멸시키지 않는다. (도 9 패널 A) SW480 인간 결장직장암 세포에 대한 hGUCY2C 발현을 재조합 5F9 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 정량하였다. (도 9, 패널 B) E-플레이트에서 SW480 세포를 5F9.m28BBz 또는 대조군 1D3.m28BBz CAR T 세포, 배지, 또는 2.5% Triton-X 100(Triton)으로 처리하고, 20시간 동안 15분마다 상대적인 전기 임피던스를 정량하여 암 세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다.
도 10 패널 A-C. 5F9.h28BBz CAR을 발현하는 인간 T 세포는 GUCY2C-발현 결장직장암 세포를 인식하고, 이를 사멸시킨다. (도 10 패널 A) 인간 5F9 CAR 작제물(5F9.h28BBz)을 발현하는 CAR-T 세포를 6시간 동안 플레이트-코팅된 항원(BSA 또는 hGUCY2C) 또는 PMA 및 이오노마이신(PMA/IONO)으로 자극시켰다. 이어서, T-세포 활성화 마커 CD69 및 세포내 사이토카인(IFNγ TNFα 및 IL-2)□을 유세포 분석법으로 정량하였다. (도 10 패널 B 내지 C), E-플레이트에서 배양된 모체(CT26), 인간 GUCY2C 발현 CT26(CT26.hGUCY2C) 마우스 결장직장암 세포(도 10 패널 B), 또는 T84 인간 결장직장암 세포(도 10 패널 C)를 대조군 또는 5F9.h28BBz CAR-T 세포(10:1의 E:T 비), 배지, 또는 2.5% Triton-X 100으로 처리하고, 상대적인 전기 임피던스를 15분마다 정량하여 암세포 사멸을 정량하였다(시간=0에 정규화). 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton을 첨가한 후에 특이적 용해 값 백분율을 임피던스 값을 사용하여 계산하였다. ***, p<0.001(이원 ANOVA).
도 11 패널 A 및 B. 5F9.m28BBz CAR-T 세포는 mGUCY2C-발현 마우스 결장직장암 세포를 사멸시키지 않는다. β-갈락토시다제 및 뮤린 GUCY2C(A; CT26.mGUCY2C) 또는 인간 GUCY2C(B; CT26.hGUCY2C)를 발현하는 CT26 세포를 4시간 동안 다양한 효과기 CAR-T 세포:표적 암 세포 비(E:T 비)로 배양하였다. 특이적 용해를 발광 기질에 의해서 검출되는 상청액 내로의 β-갈락토시다제 방출에 의해서 결정하였다. ****, p<0.0001(이원 ANOVA).
인간 GUCY2C의 세포외 도메인에 결합하는 항-GUCY2C 항체의 가변 경쇄의 단편 및 가변 중쇄의 단편을 사용하여 인간 GUCY2C의 세포외 도메인에 결합하는 단일 쇄 단백질 서열을 생성시켰다. 링커 서열은 인간 GUCY2C의 세포외 도메인에 결합하는 단일 쇄 항체 가변 단편 융합 단백질 서열(scFv) 내의 가변 중쇄 단편에 가변 경쇄 단편을 연결한다.
scFv는 더 큰 융합 단백질인 CAR의 구성성분이다. CAR 기능성 구성성분은 면역글로불린-유래 항원 결합 도메인, 항체 서열, 즉, 인간 GUCY2C에 결합하는 svFv, 내부에 발현되는 세포의 세포막 내의 단백질을 고정시키는 막관통 도메인에 scFv를 연결하는 힌지 도메인 및 인간 GUCY2C에 대한 scFv 결합 시 세포를 활성화시키는 신호 전달 세포내 서열(세포질 서열이라고도 지칭됨)로서 기능하는 신호전달 도메인을 포함한다. CAR을 암호화하는 핵산 서열은 번역된 CAR의 세포막으로의 수송을 용이하게 하는 세포 단백질로부터의 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다. CAR은 이들이 발현되는 재조합 세포가, 재조합 세포독성 림프구, 재조합 세포 T 림프구(CTL), 재조합 자연 살해 T 세포(NKT) 및 재조합 자연 살해 세포(NK)의 경우 항체-특이적 표적, 즉, GUCY2C를 디스플레이하는 세포에 결합하여 이를 사멸시키도록 지시한다. CAR이 발현되는 경우, 그것은 세포 표면으로 이송되고, 신호 펩타이드가 전형적으로 제거된다. 성숙 CAR은 세포 수용체로 기능한다. scFv 및 힌지 도메인은 세포 표면 상에 디스플레이되는데, 여기서 scFv 서열은 다른 세포 상의 단백질에 노출되고, 이러한 세포 상의 GUCY2C에 결합할 수 있다. 막관통 영역은 세포 막에서 CAR을 고정시키고, 세포내 서열은 신호 도메인으로서 기능하여 세포에서 신호를 전달하는데, 이것은 CAR-발현 세포가 결합된 GUCY2C-발현 세포의 사멸을 초래한다.
일부 실시형태에서, CAR은 신호 서열, 예컨대, 예를 들어, 포유동물 또는 합성 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 막-결합된 단백질 예컨대, 예를 들어 포유동물 막-결합된 단백질로부터의 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 막-결합된 단백질, 예컨대, CD8 알파, CD8 베타, CD4, TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD28 및 BiP로부터의 신호 서열을 포함한다. 신호 서열의 예는 또한 막 결합된 임의의 포유동물 신호 서열에서 발견될 수 있다<http://www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia>. 일부 실시형태에서, CAR은 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22를 갖는 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22를 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66을 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66을 포함한다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 1 내지 66으로 이루어진다.
항-GUCY2C 결합 도메인은 MHC-독립적인 단일 쇄 키메라 수용체로서 제공된다. 항원-결합 도메인은 항체로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 5F9로부터의 항-구아닐릴 사이클라제 C(GCC 또는 GUCY2C라고도 지칭됨) 단일 쇄 가변 단편(scFv)(바람직하게는 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4 LINKER-가변 중쇄 단편)를 포함한다. 5F9는 인간 GUCY2C의 세포외 도메인을 인식하는 완전 인간화된 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마이다. 항체 중쇄 및 경쇄의 DNA 암호 서열을 사용하여 항-GCC CAR, 예컨대, 예를 들어, 5F9-28BBz CAR에 생성에 사용되고, GUCY2C 분자에 대해 지향되는 항원 특이성을 부여하는 CAR 구현을 위한 신규 scFv를 생성하였다.
일부 실시형태, 예컨대, 5F9-28BBz CAR에서, 항-GCC scFv는 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)(가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4 LINKER-가변 중쇄 단편)일 수 있다. 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 포함하는 CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다. 서열번호 2의 아미노산 25 내지 133은 5F9 가변 경쇄 단편에 상응한다. 서열번호 2의 아미노산 154 내지 274는 5F9 가변 중쇄 단편에 상응한다. 일부 실시형태에서, CAR은 (글리신4세린)n LINKER(여기서 (글리신4세린) = GGGGS(서열번호 3)이고, n = 2 내지 5임)를 사용하여 서로에 부착된 5F9 가변 경쇄 단편 및 5F9 가변 중쇄 단편에 상응하는 항-GCC 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 2개의 (글리신4세린) 단위((글리신4세린)2)를 함유하고, LINKER G4S-2(서열번호 4)라고 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 3개의 (글리신4세린) 단위((글리신4세린)3)를 함유하고, LINKER G4S-3(서열번호 5)이라고 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 4개의 (글리신4세린) 단위(글리신4세린)4)를 함유하고, LINKER G4S-4(서열번호 6)라고 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 5개의 (글리신4세린) 단위((글리신4세린)5)를 함유하고, LINKER G4S-5(서열번호 7)라고 지칭될 수 있다.
5F9 가변 단편은 N-말단에서부터 C-말단으로 순서대로 가변 경쇄 단편-LINKER-가변 중쇄 단편 또는 가변 중쇄 단편-LINKER-가변 경쇄 단편으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)2-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 8), [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)3-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 9), [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 10), 또는 [5F9 가변 경쇄 단편-(글리신4세린)5-5F9 가변 중쇄 단편](서열번호 11)으로 구성된 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)2-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 12), [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)3-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 13), [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)4-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 14), 또는 [5F9 가변 중쇄 단편-(글리신4세린)5-5F9 가변 경쇄 단편](서열번호 15)으로 구성된 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274를 갖는 항-GCC 5F9 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 274로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5F9 scFv를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73 내지 822로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD8α, IgG1-Fc, IgG4-Fc 또는 CD28 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD8α 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336을 갖는 CD8α 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역은 서열번호 2의 아미노산 277 내지 336으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 829 내지 1008을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 829 내지 1008로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 829 내지 1008로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM 막관통 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM 세포내 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM으로부터의 막관통 및 세포내(세포질) 서열 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 갖는 CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ), B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄, 또는 특정 Fc 수용체로부터의 세포내(세포질) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 b) CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ), B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄, 또는 특정 Fc 수용체로부터의 세포내(세포질) 서열과 조합하여 a) CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40 또는 SLAM 세포내 영역 중 하나 이상으로부터의 세포내(세포질) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 세포내 서열과 조합하여 4-1BB 세포내 서열과 함께 CD28 막관통 및 세포내 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 갖는 CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 337 내지 405로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 서열 및 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1009 내지 1215로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 4-1BB 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444를 갖는 4-1BB 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444를 포함하는 4-1BB 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열은 서열번호 2의 아미노산 406 내지 444로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1216 내지 1332를 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1216 내지 1332로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1216 내지 1332로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 면역수용체 타이로신 활성화 모티프 (ITAM)를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 ITAM을 포함하는 세포 신호전달 분자로부터의 서열을 포함한다. 전형적으로 3 ITAMS는 이러한 서열에 존재한다. ITAM을 포함하는 세포 신호전달 분자의 예는 CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ), B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄 및 특정 Fc 수용체로부터의 세포내(세포질) 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, CAR은 세포 신호전달 분자, 예컨대, CD3ζ, B 세포 수용체 복합체의 CD79-알파 및 -베타 쇄 및 ITAM을 포함하는 특정 Fc 수용체로부터의 서열을 포함한다. CAR에 포함된 서열은 하나 이상의 ITAM을 포함하는 이러한 분자로부터의 세포내 서열이다. ITAM은 면역계의 특정 세포 표면 단백질의 세포질 꼬리에 2회 반복된 4개의 아미노산의 보존된 서열이다. ITAM의 4개의 아미노 서열의 보존된 서열은 임의의 2개의 다른 아미노산에 의해서 류신 또는 아이소류신으로부터 분리된 타이로신을 함유한다(X가 독립적으로 임의의 아미노산 서열인 YXXL 또는 YXXI). ITAM은 전형적으로 약 6 내지 8개의 아미노산에 의해서 분리된 2 내지 4개의 아미노산의 보존된 서열을 갖는 14 내지 16개의 아미노산인 서열을 함유한다. CD3과 연관된 ζ-쇄(CD3ζ)는 3개의 ITAM을 함유한다. 서열번호 2의 아미노산 445 내지 557은 CD3ζ 세포내 서열이다. ITAM은 아미노산 465 내지 479, 504 내지 519 및 535 내지 549에 위치된다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 445 내지 557를 갖는 CD3ζ 세포내 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열은 서열번호 2의 445 내지 557을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열은 서열번호 2의 445 내지 557로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열은 서열번호 2의 445 내지 557로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1333 내지 1671을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1333 내지 1671로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 세포내 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1333 내지 1671로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 면역글로불린-유래된 항원 결합 도메인, T 세포 신호전달 도메인, 예컨대, T 세포 수용체의 CD3제타 신호전달 쇄 또는 T-세포 쇄, 예컨대, CD3제타 쇄에 연결된 T-세포 공자극성 신호전달(예를 들어, CD28) 도메인에 융합된 GUCY2C에 결합하는 항체 서열 또는 Ig Fc 수용체 복합체의 감마-신호-전달 소단위를 포함할 수 있다.
CAR의 신호전달 도메인은 TCR로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 막관통 및 세포질 신호전달 도메인, 예컨대, CD3제타 쇄에 융합된 항원 결합 기능을 제공하는 항체 가변 영역의 세포외 단일 쇄 단편 또는 CD3제타 쇄에 연결된 또는 CD28 신호 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서 신호전달 도메인은 스페이서 또는 힌지에 의해서 항원 결합 도메인에 연결된다. 항체 가변 영역의 단편이 GUCY2C에 결합하는 경우, 신호전달 도메인은 면역 세포 활성화를 개시한다. 막 결합된 키메라 수용체를 발현하는 이들 재조합 T 세포는 세포외 항-GUCY2C 결합 도메인 및 림프구를 자극하도록 신호전달 기능을 수행하는 TCR로부터 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-GUCY2C 결합 도메인은 항-GUCY2C 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 항-GUCY2C 결합 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 신호전달 도메인은 T-세포 공자극성 신호전달(예를 들어, CD28, 4-1BB(CD137), CD2, CD27, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40, SLAM) 도메인 및 T-세포 트리거링(triggering) 쇄(예를 들어, CD3제타)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 친화성 태그를 포함한다. 이러한 친화성 태그의 예는 Strep-태그; Strep-태그II; Poly(His); HA; V5; 및 FLAG-태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 scFv 전에 또는 scFv와 힌지 영역 사이에 또는 힌지 영역 이후에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 Strep-태그, Strep-태그II, Poly(His), HA; V5 및 FLAG-태그로부터 선택되고, scFv 전에 또는 scFv와 힌지 영역 사이에 또는 힌지 영역 이후에 위치될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 N 말단에서부터 C 말단으로, 신호 서열, 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv, 힌지 영역, 막관통 영역 및 1종 이상의 단백질로부터의 세포내 서열 및 세포내 서열 및 면역수용체 타이로신 활성화 모티프 및 선택적으로 친화성 태그를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 N 말단에서부터 C 말단으로, Strep-태그, Strep-태그II, Poly(His), HA; V5 및 FLAG-태그로부터 선택된 친화성 태그에 선택적으로 연결된, 하나 이상의 ITAM을 포함하는 CD3ζ, CD79-알파, CD79-베타 및 Fc 수용체 세포내 서열로부터 선택된 서열을 함유하는 면역수용체 타이로신 활성화 모티프에 연결된, CD284-1BB(CD137), CD2, CD27, CD28, CD30, CD40L, CD79A, CD79B, CD226, DR3, GITR, HVEM, ICOS, LIGHT, OX40, SLAM 세포내 서열로부터 선택된 세포내 서열에 연결된, CD8α, IgG1-Fc, IgG4-Fc 및 CD28 막관통 영역으로부터 선택된 막관통 영역에 연결된, CD8α, IgG1-Fc, IgG4-Fc 및 CD28 힌지 영역으로부터 선택된 힌지 영역에 연결된, (가변 경쇄 단편-(글리신4세린)2-5 LINKER - 가변 중쇄 단편) 및 (가변 중쇄 단편-(글리신4세린)2-5 LINKER - 가변 경쇄 단편)으로부터 선택된, 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv에 연결된, GM-CSF, CD8 알파, CD8 베타, CD4, TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD28, BiP로부터 선택된 신호 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 N 말단에서부터 C 말단으로, 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열, [가변 경쇄 단편-(글리신4세린)2-5 LINKER-가변 중쇄 단편] 또는 [가변 중쇄 단편-(글리신4세린)2-5 LINKER-가변 경쇄 단편]으로부터 선택된 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv, CD8α, CD28, IgG1-Fc 또는 IgG4-Fc 힌지 영역, CD8α 또는 CD28 막관통 및 세포내 서열, 4-1BB 세포내 서열 및 CD3ζ 세포내 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열, 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 항-GCC scFv(가변 경쇄 단편-(글리신4세린)4 LINKER-가변 중쇄 단편), CD8α 힌지 영역, CD28 막관통 및 세포내 서열, 4-1BB 세포내 서열 및 CD3ζ 세포내 서열로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22, 25 내지 274, 277 내지 336, 337 내지 405, 406 내지 444 및 445 내지 557을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22, 25 내지 274, 277 내지 336, 337 내지 405, 406 내지 444 및 445 내지 557로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2의 아미노산 1 내지 22, 25 내지 274, 277 내지 336, 337 내지 405, 406 내지 444 및 445 내지 557로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 66, 73 내지 822, 829 내지 1008, 1009 내지 1215, 1216 내지 1332 및 1333 내지 1671을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 66, 73 내지 822, 829 내지 1008, 1009 내지 1215, 1216 내지 1332 및 1333 내지 1671로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 66, 73 내지 822, 829 내지 1008, 1009 내지 1215, 1216 내지 1332 및 1333 내지 1671로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 이들 서열은 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된다. 일부 실시형태에서, 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포는 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된 서열로 형질전환된다.
일부 실시형태에서, CAR은 GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop(5F9-28BBz-서열번호 1), 신규 DNA 서열, T 림프구에 의해서 발현되고, 인간 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C)-발현 악성종양의 치료적 치료를 위해서 주입될 수 있는 합성 수용체에 의해서 암호화된다. GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop은 서열번호 2를 암호화한다. 5F9-28BBz는 연결된 인간 DNA 암호 서열, 따라서: (1) 과립구-대식구 집락-자극 인자(GM-CSF) 신호 서열, (2) 5F9 단일 쇄 가변 단편(scFv)(가변 경쇄 단편- (글리신4세린)4 LINKER - 가변 중쇄 단편), (3) CD8α 힌지 영역, (4) CD28 막관통 도메인, (5) CD28 세포내 도메인, (6) 4-1BB 세포내 도메인 및 (7) CD3ζ 세포내 도메인을 포함한다. CAR은 5F9-28BBz라고 지칭된다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 2로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1로 본질적으로 이루어진 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 작제물의 핵산 서열은 서열번호 1로 이루어진 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 이들 서열은 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된다. 일부 실시형태에서, 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포는 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된 서열로 형질전환된다.
일부 실시형태에서, 5F9-28BBz - 서열번호 1은 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 연결된다. 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포에서 암소 서열의 발현에 필요한 조절 요소는 5' 및 3' 미번역 영역에 프로모터, 폴리아데닐화 부위 및 다른 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1은 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드, 예컨대, pVAX, 또는 레트로바이러스 발현 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터, 또는 재조합 DNA 바이러스 벡터, 예컨대, 재조합 아데노바이러스, 재조합 AAV, 또는 재조합 백시니아 바이러스, 또는 CRISPR/Cas9, TALEN 또는 다른 트랜스포존 기술과 함께 사용될 이중 가닥 DNA 또는 메신저 RNA에 삽입된다.
일부 실시형태에서, CAR 암호 서열은 일상적인 시험관내 유전자 전달 기술 및 물질, 예컨대, 레트로바이러스 벡터를 사용하여 생체외에서 세포, 예컨대, T 세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+, 불변 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 자연 살해 세포 및 골수 세포, 예컨대, 말초 림프구로부터의 CD34+ 조혈 줄기 세포에 도입된다. 유전자 전달 이후에, 재조합 세포는 환자에게 투여되는 재조합 세포의 수를 확장시키기 위해서 배양된다. 재조합 세포는 세포외 항체-유래된 항원 결합 도메인에 의해서 인식되는 항원을 디스플레이하는 세포를 인식하고, 이에 결합할 것이다.　변형 후에, 세포는 기술된 환자에게 투여되는 다수의 이러한 세포를 얻기 위해서 확장된다. 상기와 같이, 자가유래는 동일한 사람인 세포의 공여자 및 수용자를 지칭한다. 동종이계는 상이한 사람인 세포의 공여자 및 수용자를 지칭한다.　생체외에서의 배양에 의해서 항원-특이적 T 세포의 집단을 단리 및 확장시키는 것에 더하여, T 세포는 단백질, 예컨대, 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15를 암호화하는 것에 유전 물질을 첨가함으로써 집단을 단리시킨 후에 그리고 확장시키기 전에 변형될 수 있다.
GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 복수의 T 세포는 세포 공여자로부터 T 세포를 단리시키고, 그것을 항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자로 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 배양하여 형질전환된 T 세포의 수를 기하급수적으로 확장시켜 복수의 이러한 세포를 생산함으로써 획득될 수 있다.
세포 공여자는 확장된 세포 집단이 투여될 개체, 즉, 자가유래 세포 공여자일 수 있다. 대안적으로, T 세포는 T 세포가 투여될 개체와 상이한 개체인 세포 공여자, 즉, 동종이계 T 세포로부터 획득될 수 있다. 동종이계 T 세포가 사용되는 경우, 세포 공여자는 수용자와 동일하거나 거의 동일한 백혈구 항원의 세트를 발현하는 것으로 식별된, 매칭된 유형인 것이 바람직하다.
T 세포는 예를 들어, 혈액 분획, 특히 말초 혈액 단핵구 세포 구성성분으로부터 또는 골수 샘플로부터의 단리를 비롯한, 일상적인 방법에 의해서 세포 공여자로부터 획득될 수 있다.
T 세포가 세포 공여자로부터 획득된 후, 하나 이상의 T 세포는 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프에 결합하는 항체의 기능성 결합 단편 및 단백질, 세포, 예컨대, T 세포에서 발현되는 경우, 막 결합된 단백질이 되게 하는 부분을 포함하는 항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산으로 형질전환될 수 있다.
항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자는 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 이러한 B 세포를 갖는 "항체 유전자 공여자"로부터의 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 B 세포를 단리시킴으로써 획득될 수 있다. 이러한 항체 유전자 공여자는 백신접종에 의한 것 이외의 면역원에 대한 노출로부터 일어나는 면역 반응으로 인해서 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 B 세포를 가질 수 있거나, 또는 이러한 항체 유전자 공여자는 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 B 세포의 생산을 유도하는 백신을 제공받은 공여자, 즉, 백신접종된 항체 유전자 공여자로서 식별될 수 있다. 백신접종된 항체 유전자 공여자는 이전에 백신접종되었을 수 있거나, 또는 항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자로 T 세포를 형질전환시키고, 세포 수를 확장시키고, 개체에게 형질전환된 T 세포의 확장된 집단을 투여하는 것을 포함하는 방법에 사용하기 위해서 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 이러한 B 세포를 생성시키기 위한 노력의 일부로서 특별하게 백신이 투여될 수 있다.
항체 유전자 공여자는 형질전환된 T 세포의 수용자일 개체 또는 형질전환된 T 세포의 공여자일 개체와 상이한 개체일 수 있다. 항체 유전자 공여자는 세포 공여자와 동일한 개체일 수 있거나 또는 항체 유전자 공여자는 세포 공여자와 상이한 개체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 공여자는 형질전환된 T 세포의 수용자이고, 항체 유전자 공여자는 상이한 개체이다. 일부 실시형태에서, 세포 공여자는 항체 유전자 공여자와 동일한 개체이고, 형질전환된 T 세포의 수용자와 상이한 개체이다. 일부 실시형태에서, 세포 공여자는 항체 유전자 공여자와 동일한 개체이고, 형질전환된 T 세포의 수용자와 동일한한 개체이다.
항-GUCY2C CAR을 암호화하는 핵산 분자는 막 결합된 단백질일 발현된 단백질을 제공하는 단백질 서열에 연결된 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체의 기능성 결합 단편을 암호화하는 암호 서열을 포함한다. 암호 서열은 그것이 발현되는 단일 생성물을 암호화하도록 연결된다.
GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체의 기능성 결합 단편을 암호화하는 암호 서열은 항체 유전자 공여자로부터의 B 세포로부터 단리될 수 있다. 이러한 B 세포가 획득되고, 유전 정보가 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, B 세포를 사용하여 항체를 발현하고, 따라서 항체 암호 서열을 보유하는 혼성 세포를 생성시킨다. 항체 암호 서열을 결정하고, 클로닝시키고, 이를 사용하여 항-GUCY2C CAR을 제조할 수 있다. GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 항체의 기능성 결합 단편은 형질전환된 T 세포에서 발현되는 경우 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프에 대한 결합 활성을 보유하는 항체 단백질의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
막 결합된 단백질일 발현된 단백질을 제공하는 단백질 서열에 대한 암호 서열은 막 결합된 세포 단백질로부터 유래될 수 있고, 막관통 도메인 및 선택적으로 세포질 도메인의 적어도 일부 및/또는 세포외 도메인의 일부 및 발현된 단백질을 세포막으로 전위시키기 위한 신호 서열을 포함한다.
분자. 핵산 분자는 공여자 T 세포에서 암호 서열의 발현에 필요한 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C CAR 암호 서열을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드 DNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C CAR 암호 서열을 포함하는 핵산 분자는 발현 벡터인 플라스미드 DNA 분자이고, 여기서 암호 서열은 공여자 T 세포에서 항-GUCY2C CAR 암호 서열의 발현에 필요한 플라스미드에서 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C CAR 암호 서열을 포함하는 핵산 분자는 공여자 T 세포를 감염시키는 데 사용되는 바이러스 입자에 혼입될 수 있다. 이러한 입자를 제조하기 위한 패키징 기술이 공지되어 있다. 입자에 혼입되는 암호 서열은 공여자 T 세포에서 항-GUCY2C CAR 암호 서열의 발현에 필요한 플라스미드에서 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C CAR 암호 서열을 포함하는 핵산 분자가 바이러스 게놈 내에 혼입된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 공여자 T 세포를 감염시키는 데 사용되는 바이러스 입자에 혼입된다. 핵산 분자를 세포에 전달하기 위한 바이러스 벡터는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 백신 바이러스(vaccine virus), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 폭스 바이러스(pox virus)뿐만 아니라 다양한 레트로바이러스에 기초한 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 게놈에 혼입되는 항-GUCY2C CAR 암호 서열 암호 서열은 공여자 T 세포에서 항-GUCY2C CAR 암호 서열의 발현에 필요한 플라스미드에서 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
형질전환된 T 세포에서 핵산의 발현 시, 형질전환된 세포를 시험하여 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 T 세포를 식별할 수 있다. 이러한 형질전환된 T 세포를 식별하고, 표준 기술을 사용하여 샘플로부터 단리시킬 수 있다. GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 단백질을 고체 지지체에 부착시키고, 샘플과 접촉시킬 수 있다. 이어서, 세척 후에 표면에 남아있는 T 세포를 추가로 시험하여 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 T 세포를 식별한다. 친화도 단리 방법, 예컨대, 칼럼, 세포에 결합하는 표지된 단백질, 세포 분류기 기술을 또한 다양하게 사용할 수 있다. GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 갖는 단백질의 존재 하에서의 반응성에 의해서 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 T 세포를 또한 식별할 수 있다.
T 세포가 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 T 세포로서 식별된 후, 그것은 세포 성장 및 분화를 촉진시키고 유지하는 조건과 함께 조직 배양 기술을 사용하여 클론적으로 확장되어 기하급수적인 수의 동일한 세포를 생산할 수 있다. T 세포의 확장된 집단은 환자에게 투여하기 위해서 수집될 수 있다.
일부 실시형태에 따른 GUCY2C의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 복수의 T 세포는 세포와 조합하여 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 세포를 포함하는 약제학적 제형은 널리 공지되어 있고, 당업자에 의해서 일상적으로 제형화될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 본 명세서에 참조에 의해 포함된 관련 기술 분야에서 표준 참고 문헌인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]에 기재되어 있다. 본 발명은 주입을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 복수의 세포는 약제학적으로 허용 가능한 비히클과 회합된 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로즈 용액 및 5% 인간 혈청 알부민이다. 비히클은 등장성을 유지시키는 첨가제(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지시키는 첨가제(예를 들어, 완충제 및 보존제)를 포함할 수 있다. 비히클은 일반적으로 사용되는 기술에 의해서 세포의 첨가 이전에 멸균된다.
복수의 세포는 그것이 암 세포와 접촉하는 것을 가능하게 하는 임의의 수단에 의해서 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 예를 들어, 정맥내로 투여될 수 있다.
투여량은 복수의 세포의 본성, 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 본성 및 정도, 병행 치료의 유형, 치료의 빈도 및 목적하는 효과에 따라서 달라진다. 일반적으로, 1×1010 내지 1×1012개의 T 세포가 투여되지만, 더 많거나 더 적게, 예컨대, 1×109 내지 1×1013개가 투여될 수도 있다. 전형적으로, 1×1011개의 T 세포가 투여된다. 전달되는 세포의 수는 예방 또는 치료 반응을 유도하기에 충분한 양이다. 당업자는 일상적인 방법에 의해서 범위 및 최적의 투여량을 쉽게 결정할 수 있다.
항-GUCY2C CAR로 치료될 환자는 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 환자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 암은 전이성 결장직장암, 전이성 또는 원발성 위암, 전이성 또는 원발성 식도암, 전이성 또는 원발성 구강암 또는 전이성 또는 원발성 침샘암 또는 전이성 또는 원발성 췌장암 또는 GUCY2C 발현을 갖는 것으로 식별된 임의의 다른 암일 수 있다. 일부 실시형태에서, GUCY2C를 발현하는 암 세포를 포함하는 암을 갖는 것으로 의심되는 환자를 항-GUCY2C CAR로 치료한다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C CAR로의 치료 전에, 환자는 전이성 결장직장암, 전이성 또는 원발성 위암, 전이성 또는 원발성 식도암, 전이성 또는 원발성 구강암 또는 전이성 또는 원발성 침샘암 또는 전이성 또는 원발성 췌장암 환자로서 식별된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C CAR로의 치료 전에, 환자로부터의 암의 샘플을 GUCY2C 발현에 대해서 시험하고, GUCY2C 발현에 대해서 양성으로 시험된 암을 갖는 환자를 항-GUCY2C CAR로 치료한다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C CAR로의 치료 전에, 환자는 종양 제거를 위한 수술을 받고, 환자로부터 제거된 종양의 샘플을 GUCY2C 발현에 대해서 시험하고, GUCY2C 발현에 대해서 양성으로 시험된 암을 갖는 환자를 항-GUCY2C CAR로 치료한다.
항-GUCY2C CAR은 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암, 예컨대, 전이성 결장직장암, 전이성 또는 원발성 위암, 전이성 또는 원발성 식도암, 전이성 또는 원발성 구강암 또는 전이성 또는 원발성 침샘암 또는 전이성 또는 원발성 췌장암의 위험이 증가된 것으로 식별된 개체에서 암을 예방하는 데 유용할 수 있다. 개체는 가족 의학력, 유전적 배경에 기초하여 또는 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암, 예컨대, 전이성 결장직장암, 전이성 또는 원발성 위암, 전이성 또는 원발성 식도암, 전이성 또는 원발성 구강암 또는 전이성 또는 원발성 침샘암 또는 전이성 또는 원발성 췌장암의 진단 전에 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암의 위험이 증가된 것으로 식별될 수 있고, 치료는 암을 제거하거나 치료는 명확한 관해(remission) 또는 무암(cancer free) 상태를 야기한다.
실시예
실시예 1
GUCY2C-발현 악성종양, 예컨대, GUCY2C를 발현하는 전이성 결장직장암, 전이성 또는 원발성 위함, 식도암, 구강암, 침샘암 또는 췌장암 또는 다른 암을 갖는 환자에서 사용될 수 있는 인간 GUCY2C-표적화 CAR을 식별하였다. 이러한 항-GUCY2C CAR은 항원-의존적 T-세포 활성화, 사이토카인 생산 및 세포용해 활성을 유도하였다. 인간 GUCY2C-표적화 CAR-T 세포는 면역적격, 동계 마우스 모델뿐만 아니라 인간 결장직장암의 이식 모델에서 전이성 종양에 대해서 효과적이었다.
물질 및 방법
세포주 및 시약. CT26 및 β-갈락토시다제-발현 CT26.CL25 마우스 결장직장암 세포주 및 인간 결장직장암 세포주 T84 및 SW480을 ATCC로부터 입수하고, 저-계대 세포의 대량 스톡을 냉동보존하였다. 세포를 본래 공급원으로부터 인증받고, 모폴로지, 성장, 항생제 내성(여기서 적절한 GUCY2C 및 β-갈락토시다제 발현) 및 생체내 전이 패턴에 의해서 일상적으로 인증받고, 범용 마이코플라즈마 검출 키트(Universal Mycoplasma Detection Kit)(ATCC, 카탈로그 번호 30-1012K)를 사용하여 마이코플라즈마에 대해서 일상적으로 스크리닝하였다. 마우스에게 주사하기 전에, 세포를 2주 미만 동안 일상적으로 배양하였다. 인간 GUCY2C를 암호화하는 유전자를 코돈 최적화하고, 합성하고(젠 아트사(Gene Art), 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)), 레트로바이러스 작제물 pMSCVpuro(클론테크사(Clontech)) 내에 클로닝하였다. CT26 및 CT26.CL25 세포에 hGUCY2C를 암호화하는 레트로바일스 상청액을 형질도입하고, 그 다음 퓨로마이신으로 선택함으로써 CT26.hGUCY2C 및 CT26.CL25.hGUCY2C를 생성시켰다. Phoenix-Eco 레트로바이러스 패키징 세포주(Gary Nolan, 스탠포드 대학교(Stanford University))에 pMSCV-Puro(클론테크사) 또는 hGUCY2C-pMSCV Puro 및 pCL-Eco(임제넥스사(Imgenex)) 레트로바이러스 패키징 벡터(12)를 형질주입함으로써 레트로바이러스 상청액을 생성시켰다. 제조사 지침에 따라서 293FT 세포(인비트로젠사(Invitrogen))에 pLenti4-V5-GW-루시퍼라제.puro(토마스 제퍼슨 대학교(Thomas Jefferson University) Andrew Aplin이 제공함) 및 비라파워 렌티바이러스 패키징 믹스(ViraPower Lentiviral Packaging Mix)(인비트로젠사)를 형질주입함으로써 생성된 렌티바이러스 상청액을 형질도입하고, 그 다음 퓨로마이신으로의 선택에 의해서 루시퍼라제 함유 T84.fLuc 세포를 생성시켰다. 인간 GUCY2C-특이적 항체 5F9로부터의 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 pFUSE-rIgG-Fc2(IL2ss) 플라스미드(인비보젠사(Invivogen)) 내에 클로닝하여, 토끼 Fc를 갖는 5F9 scFv 융합 단백질(5F9-rFc)을 생성시켰다. 5F9-rFc를 형질주입된 293F 세포(라이프 테크놀로지즈사)의 상청액에 수집하고, BSA 또는 젠스크립트사(GenScript)에 의해서 HEK293-6E 세포로부터 계약 하에서 정제된 재조합 6xHis-태그된 hGUCY2C 세포외 도메인(6xHis-hGUCY2CECD) 단백질로 코팅된 ELISA 플레이트(Nunc-Immuno PolySorp)에서 적정하고, HRP-접합된 염소 항-토끼(잭슨 이뮤노리서치사(Jackson ImmunoResearch))로 검출하였다. 유세포 분석법을 위해서, 세포를 FACS 완충제(PBS 중의 1% 열-불활성화된 FBS) 중에 희석된 5F9-rFc 또는 비형질주입된 293F 세포로부터의 대조군 상청액으로 염색하고, 그 다음 FACS 완충제 중의 이차 Alexa Fluor 488-접합된 항-토끼(라이프 테크놀로지즈사)로 염색하였다. 세포를 2% 파라폼알데하이드(PFA; 어피메트릭스사(Affymetrix))로 고정시키고, BD LSR II 유세포 분석기 및 FlowJo v10 소프트웨어(트리 스타사(Tree Star))를 사용하여 분석하였다.
뮤린 CAR-T 세포 생성. 뮤린 CAR 구성성분을 사용하여 이미 기재된 바와 같은 3세대 코돈 최적화된 레트로바이러스 CAR 작제물을 생산하였다. 5F9 인간 GUCY2C-특이적 항체로부터 유래된 코돈 최적화된 scFv 서열을 BiP 신호 펩타이드, CD8α 힌지 영역, CD28 막관통 및 세포내 도메인 및 4-1BB(CD137) 및 CD3ζ 세포내 도메인의 뮤린 서열을 함유하는 CAR 작제물 내에 클로닝하여, 5F9.m28BBz CAR 작제물을 생산하였다. 인간 ERBB2(Her2)-특이적 항체 4D5 또는 마우스 CD19-특이적 항체 1D3으로부터 유래된 CAR을 제시된 바와 같은 대조군(대조군 m28BBz)으로 사용하였다. CAR을 pMSCV-IRES-GFP(pMIG) 레트로바이러스 벡터(애드젠사(Addgene) # 27490) 내에 서브클로닝하였다. Calcium Phosphate ProfectionR 포유동물 형질주입 시스템(프로메가사)(Promega)을 사용하여 Phoenix-Eco 레트로바이러스 패키징 세포주(Gary Nolan, 스탠포드 대학교)에 CAR-pMIG 벡터 및 pCL-Eco 레트로바이러스 패키징 벡터(임제넥스사)를 형질주입하였다. 레트로바이러스-함유 상청액을 48시간 후에 수집하고, 0.45μM 필터로 여과시키고, 분취물을 -80℃에서 냉동시켰다. CD8α+ T 세포 단리 키트 II 및 LS 자성 칼럼(밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec))을 사용하여 BALB/c 비장세포로부터 뮤린 CD8+ T 세포를 음성적으로 선택하였다. 그 후에 CD8+ T 세포를 100U/㎖ 재조합 인간 IL2(NCI 레포지토리사(NCI Repository))를 함유한 cRPMI 중에서 1×106개 세포/㎖에서 1:1 비드:세포 비로 항-CD3/항-CD28-코팅된 비드(T 세포 활성화/확장 키트, 밀테니이 바이오테크사)로 자극시켰다. 자극 다음 날, 배양 배지의 ½을 8㎍/㎖ 폴리브렌(polybrene)(밀리포어사(Millipore))의 존재 하에서 동일 부피의 해동된 레트로바이러스 상청액으로 조심스럽게 교체하였다. 실온에서 90분 동안 2500rpm에서 스피노컬레이션(spinoculation)을 수행하고, 그 다음 37℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션시켰는데, 이 때 세포는 펠릿화되었고, 이것을 100U/㎖ IL2를 함유하는 새로운 배지에 재현탁시켰다. 새로운 cRPMI 및 IL2를 사용하여 매일 1×106개 세포/㎖로 희석시킴으로써 T 세포를 7 내지 10일 동안 확장시켰고, 이 때 이것을 기능성 검정에 사용하였다.
인간 CAR-T 세포 생성. 인간 T 세포를 사용한 연구를 위해서, 규제 및 제도적 요구사항에 따라서 동의한 지원자로부터 PBMC를 수집하였다. MACS(스템셀 테크놀로지즈사(Stemcell Technologies)) 정제된 CD8+ T 세포를 90% 초과의 순도에서 개별 정상 건강한 공여자 전혈로부터 음성적으로 선택하였다. 인간 서열을 사용한 CAR 도메인을 사용하여 5F9 인간 GUCY2C-특이적 scFv 및 GM-CSF 신호 펩타이드, CD8α 힌지 영역, CD28 막관통 및 세포내 도메인 및 4-1BB(CD137) 및 CD3ζ 세포내 도메인의 인간 서열을 함유하는 3세대 코돈 최적화된 레트로바이러스 CAR 작제물을 생산하여, 5F9.h28BBz(서열번호 1)를 생산하였다. CAR-암호화 암포트로픽(amphotropic) γ-166 레트로바이러스 생산은 pCL-Eco를 pCL-Ampho 패키징 플라스미드(임제넥스사)로 대체한 것을 제외하고는 뮤린 T 세포와 유사하였다. 레트로바이러스 형질도입은 ImmunoCult CD3/CD28 Activator(스템 셀 테크놀로지즈사(Stem Cell Technologies))로의 제3일 또는 제4일-활성화 후에 일어났다. 제7일에 GFP-농축을 위해서 세포를 유동 분류에 적용하고, 그 다음 제10일에 실험적 사용에 적용하였다. 배양 기간 전체에서, 인간 CD8+ T 세포를 100U/㎖ 재조합, 인간 IL2(NCI 레포지토리사)가 보충된 ImmunoCult-XF 배지(스템셀 테크놀로지즈사)에 유지시켰다.
CAR 표면 검출. CAR-형질도입된 T 세포를 PBS 중의 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 키트(인비트로젠사)로 염색하고, 다양한 농도의 6xHis-hGUCY2CECD로 1시간 동안 PBS 0.5% BSA 중에서 표지하고, 항-5xHis-Alexa Fluor 647 접합체(퀴아젠사(Qiagen)) 및 항-CD8b-PE(클론 H35.17.2, 비디 바이오사이언시스사(BD Biosciences))로 1시간 동안 PBS 0.5% BSA 중에서 염색하고, 2% PFA로 고정시키고, BD LSR II 유세포 분석기 및 FlowJo 소프트웨어 v10(트리 스타사)를 사용하여 분석하였다. hGUCY2C 결합을 CD8+ CAR+(GFP+) 세포 상에서 Alexa Fluor 647의 평균 형광 강도에 의해서 결정하였다. 비선형 회귀 분석(GraphPad Prism v6)을 사용하여 GUCY2C-CAR 결합의 Kav 및 Bmax를 결정하였다.
마우스 T-세포 표현형분석, 활성화 마커 및 세포내 사이토카인 염색. 표현형분석을 위해서, 1×106개의 비형질도입된 또는 CAR-형질도입된 마우스 T 세포를 PBS 중의 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 키트(인비트로젠사)로 염색하고, 그 다음 항-CD8α-BV570(클론 RPA-T8; 바이오레전드사(Biolegend)), 항-CD45RA-PerCP-Cy5.5(클론 14.8; 비디 바이오사이언시스사) 및 항-CD62L-PE-Cy7(클론 MEL-14; 비디 바이오사이언시스사)을 사용하여 30분 동안 PBS 0.5% BSA 중에서 표면 마커에 대해서 염색하였다. 그 다음, 세포를 고정시키고, Cytofix/Cytoperm 완충제로 20분 동안 4℃에서 투과시키고(BD Cytofix/Cytoperm 키트; 비디 바이오사이언시스사), 45분 동안 Perm/Wash 완충제 중에서 세포내 GFP(항-GFP-Alexa Fluor 488; 인비트로젠사)에 대해서 염색하여 CAR-형질도입된 세포를 식별하였다. 이어서, 하기 하위세트를 CD45RA 및 CD62L 염색에 기초하여 정량하였다: Tn/scm(미경험 또는 T 기억 줄기세포; CD62L+CD45RA+), Tcm(중심 기억 T 세포; CD62L+CD45RA-), Tem(효과기 기억 T 세포; CD62L CD45RA-) 및 Temra(CD45RA; CD62L CD45RA+를 발현하는 효과기 기억 T 세포). 활성화 마커 및 사이토카인 분석을 위해서, 1×106개의 CAR-형질도입된 마우스 T 세포를 밤새 4℃에서 PBS 중의 1㎍/㎖ GUCY2C로 미리 코팅된 조직 배양 플레이트에서 또는 1×106개의 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 세포를 함유하는 조직 배양 플레이트에서 6시간 동안 자극시켰다. 양성 대조군으로서, CAR-T 세포를 6시간 동안 1X 세포 자극 칵테일(PMA/이오노마이신, 이바이오사이언스사)과 함께 인큐베이션시켰다. 세포내 사이토카인을 평가하는 경우 인큐베이션은 1X 단백질 수송 저해제 칵테일(Protein Transport Inhibitor Cocktail)((이바이오사이언스사)을 포함하였다. 세포를 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 키트(인비트로젠사)로 염색하고, 그 다음 항-CD8α-PerCP-Cy5.5(클론 53.6-7; 비디 바이오사이언시스사), 항-CD69-PE(클론 H1.2F3; 비디 바이오사이언시스사), 항-CD25-PE(클론 PC61.5, 이바이오사이언스사) 및 항-CD44-APC(클론 IM7; 바이오레전드사)를 사용하여 표면 마커에 대해서 염색하였다. BD Cytofix/Cytoperm Kit(비디 바이오사이언시스사)를 사용하여 세포내 사이토카인 염색을 수행하였고, 항-GFP-Alexa488(인비트로젠사), 항-IFNγ-APC-Cy7(클론 XMG1.2; 비디 바이오사이언시스사), 항-TNFα-PE-Cy7(클론 MP6-XT22; 비디 바이오사이언시스사), 항-IL2-APC(클론 JES6-5H4; 비디 바이오사이언시스사) 및 αMIP1α-PE(클론 39624; 알앤디 시스템즈사(R&D Systems))로 염색하였다. 세포를 2% PFA 중에서 고정시키고, BD LSR II 유세포 분석기로 분석하였다. FlowJo v10 소프트웨어(트리 스타사)를 사용하여 분석을 수행하였다.
인간 T-세포 활성화 마커 및 세포내 사이토카인 염색. 활성화 마커 및 사이토카인 분석을 위해서, 1×106개의 인간 GUCY2C-지향된 CAR 형질도입된 인간 T 세포를 PBS 중의 10㎍/㎖ 인간 GUCY2C 또는 BSA 대조군 항원으로 4℃에서 밤새 코팅된 조직 배양 플레이트에서 6시간 동안 자극시키거나 또는 1X 세포 자극 칵테일(PMA/이오노마이신, 이바이오사이언스사(eBioscience))를 CAR-T 세포의 플레이팅 시에 첨가하였다. 모든 조건은 인큐베이션 기간의 시작 시에 1X 단백질 수송 저해제 칵테일(이바이오사이언스사)을 포함하였다. 세포를 PBS 중의 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 키트(인비트로젠사)로 10분 동안 염색하고, 그 다음 PBS 0.5% BSA 중의 항-CD8-Qdot 800(클론 3B5, 인비트로젠사) 및 항-CD69-APC(클론 L78, 비디 바이오사이언시스사)을 사용하여 25분 동안 표면 마커에 대해서 염색하였다. Cytofix/Cytoperm 완충제를 사용한 20분 동안의 고정 및 BD perm 세척 완충제 중에서 45분 동안의 항-GFP-Alexa Fluor 488(인비트로젠사), 항-IFNγ-BV605(클론 4S.B3; 바이오레전드사), 항-TNFα-PerCP-Cy5.5(클론 Mab11; 비디 바이오사이언시스사) 및 항-IL2-PE(클론 MQ1-17H12; 비디 바이오사이언시스사)로의 염색으로 이루어진 BD Cytofix/Cytoperm 키트(비디 바이오사이언시스사)를 사용하여 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다. 세포를 2% PFA 중에서 고정시키고, BD LSR II 유세포 분석기로 분석하였다. FlowJo v10 소프트웨어(트리 스타사)를 사용하여 분석을 수행하였다.
T-세포 세포독성 검정. xCELLigence 실시간, 세포-매개된 세포독성 시스템(아세아 바이오사이언시스사(Acea Biosciences))을 이미 기재된 바와 같이(12) CAR T 세포-매개된 세포독성의 평가를 위해서 사용하였다. 간략하면, 1×104개의 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 또는 2.5×104개의 T84 또는 SW480 암 세포 표적을 E-플레이트 16(아세아 바이오사이언시스사)의 각각의 웰에서 150㎕의 성장 배지 중에 플레이팅하고, 37℃ 인큐베이터에서 밤새 성장시키고, RTCA DP 분석기 시스템 및 RTCA 소프트웨어 버전 2.0(아세아 바이오사이언시스사)을 사용하여 15분마다 전기 임피던스를 정량하였다. 마우스의 경우 대략 24시간 및 인간 T 세포 실험의 경우 6시간 후에, 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 50㎕의 CAR-T 세포를 첨가하거나(마우스 T 세포의 경우 5:1 E:T 비 또는 인간 T 세포의 경우 10:1 E:T 비), 또는 50㎕의 배지 또는 10% Triton-X 100(피셔사(Fisher))을 2.5% Triton-X 100의 최종(v/v)를 위해서 첨가하였다 세포-매개된 사멸을 다음 10 내지 20시간에 걸쳐서 정량하고, 15분마다 전기 임피던스를 판독하였다. 정규화(각각 0% 및 100% 특이적 용해)를 위해서 배지 및 Triton-X 100을 첨가한 후에 임피던스 값을 사용하여, 각각의 시간 지점에서 각각의 반복물에 대해서 GraphPad Prism Software v6을 사용하여 특이적 용해 값 백분율을 계산하였다. 대안적으로, β-gal 방출 T-세포 세포독성 검정은 β-갈락토시다제를 발현하는 CT26 암 세포 표적(CT26.CL25)을 사용하였다. 암 세포 표적을 2×105개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 4시간 동안 37℃에서 증가하는 효과기 CAR T 세포 대 암 세포 표적 비로 인큐베이션시켰다. 방출된 β-갈락토시다제를 Galacto-Light Plus System(어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 배지 중에서 측정하였다. 최대 방출을 공급된 용해 완충제로 용해된 세포의 상청액으로부터 결정하였다. 258 % 특이적 용해 = [(실험 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출)]×100.
전이성 종양 모델. BALB/c 마우스 및 NSG(NOD-scid IL2Rγ널(null)) 마우스를 각각 NCI 애니멀 프로덕션 프로그램(NCI Animal Production Program)(미국 메릴랜드주 프레드릭 소재) 및 잭슨 랩스(Jackson Labs)(미국 메인주 바 하버 소재)로부터 입수하였다. 동물 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(homas Jefferson University Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 동계 마우스 모델에서, BALB/c 마우스에게 꼬리 정맥 주사에 의해서 100㎕의 PBS 중의 5×105개의 CT26.hGUCY2C 세포를 주사하였다. 제시된 날에, 마우스에게 PanTak, 310kVe x-선 기계에서 5Gy 전신 방사선 조사의 비골수 절제 용량을 제공하였다. 마우스에게 제시된 시간 지점에 꼬리 정맥에 의해서 100㎕의 PBS 중의 CD8+ BALB/c T 세포로부터 생산된 제시된 용량의 CAR-T 세포를 제공하였다. 암세포 주사 후 제18일에 마우스를 생존에 대해서 추적하거나 또는 희생시키고, 폐를 인디아 잉크로 염색하고, 종양 계수를 위해 페케트 용액(Fekete's solution) 중에서 고정시켰다. 재시험감염 실험을 위해서, 미경험 마우스 또는 CAR-T 세포에 의해서 확립된 종양이 제거된 마우스("살아남은 마우스"라고 지칭)에게 1회 용량의 5×105개의 CT26 또는 CT26.hGUCY2C를 꼬리 정맥 주사를 통해서 제공하였다. 살아남은 마우스를 먼저 재시험감염 실험 전 16 내지 40주에 먼저 시험감염시켰다. 인간 종양 이종이식 모델에서, NSG(23) 마우스(JAX 스톡 번호005557)에게 복강내 주사를 통해서 100㎕ PBS 중의 2.5×106개의 T84.fLuc 세포를 주사하였다. 마우스에게 암 세포 접종 후 제14일에 복강내 주사를 통해서 100㎕ PBS 중의 CD8+ BALB/c T 세포로부터 생산된 107개의 총(CAR+에 대해서 분류되지 않음) T 세포를 제공하였다. PBS 중의 15mg/㎖ D-루시페린 칼륨염(골드 바이오테크놀로지즈사(Gold Biotechnologies))의 250㎕ 용액의 피하 주사에 의해서 그리고 Caliper IVIS Lumina-XR 영상화 스테이션(퍼킨 엘머사)을 사용한 8분 노출 후 영상화에 의해서 종양 성장을 281회 주 단위로 모니터링하였다. Living Image In Vivo Imaging Software(퍼킨 엘머사)를 사용하여 총 라디언스(total radiance)(광자/초)를 정량하였다.
결과 및 논의
hGUCY2C CAR-T 세포
인간 GUCY2C(hGUCY2C)에 특이적인 재조합 항체(클론 5F9)는 hGUCY2C를 발현하도록 조작된 정제된 hGUCY2C 세포외 도메인(도 1 패널 A) 및 뮤린 CT26 결장직장암 세포에 결합하였지만, hGUCY2C 결핍 CT26 암 세포에는 결합하지 않았다(도 1 패널 B). 5F9 scFv를 사용하여 BiP 신호 서열, CD8α 힌지 영역 및 세포내 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 신호전달 모이어티를 함유하는 3세대 뮤린 CAR 작제물(5F9.m28BBz)을 생성시키고, 레트로바이러스 작제물에 삽입하였다(도 1 패널 C). 대조군 m28BBz 또는 5F9.m28BBz CAR을 암호화하는 레트로바이러스를 사용하여 뮤린 T 세포에 약 35 내지 45% 형질도입 효율로 형질도입하였고, GFP 형질도입 마커에 의해서 정량하였다(도 1 패널 D). CAR-T 세포를 증가하는 농도의 정제된 6xHis-태그된 hGUCY2CECD와 인큐베이션시키고, 그 다음 표지된 α5xHis 항체로 검출하고, 유세포 분석법으로 평가함으로써 정량한 hGUCY2C-결합 결합활성(avidity)(Kav = 11.2nM) 및 CAR 발현(Bmax = 957.8 MFI)은 마우스 GUCY2C(12)에 기능성 반응성을 나타낸 CAR과 대등하였다(도 1 패널 D 및 E 및 서열번호 1).
hGUCY2C CAR은 T-세포 활성화 및 효과기 기능을 매개한다
정제된 마우스 CD8+ T 세포에 대조군 m28BBz 또는 hGUCY2C 특이적 5F9.m28BBz CAR 작제물을 형질도입시킨 것은 비-형질도입된 세포에 비해서 T-세포 표현형에 영향을 미치지 않았고(도 2 패널 B), IL2의 존재 하에서 생산된 CAR-T 세포에서의 다른 CAR 작제물과 유사한 기억 및 효과기 표현형의 혼합물[Tn/scm (CD62L+CD45RA+), Tcm(CD62L+CD45RA-), Tem(CD62L-CD45RA-) 및 Temra(CD62L-CD45RA+)]을 생산한다. 대조군이 아닌 hGUCY2C-특이적, CAR-T 세포는 고정된 hGUCY2CECD 단백질 또는 CT26.hGUCY2C 세포로 자극되는 경우(도 6 및 도 7 패널 A 및 B) 활성화 마커 CD25, CD69 및 CD44를 상향조절하였고(도 2 패널 C), 효과기 사이토카인 IFNγ, TNFα, IL2 및 MIP1α를 생산하였다(도 2 패널 D). 활성화 마커 및 사이토카인 반응은 5F9.m28BBz CAR-T 세포가 BSA 또는 hGUCY2C-결핍 CT26 세포로 자극된 경우에는 존재하지 않았는데, 이는 5F9.m28BBz CAR에 의한 T-세포 활성화가 항원-의존적임을 확인해준다(도 2 패널 C 및 D, 도 6 및 도 7 패널 A 및 B). 5F9.m28BBz CAR-T 세포가 시험관내에서 hGUCY2C 결핍 CT26 세포에 대해서 불활성이었지만(도 2 패널 E), 이것은 CT26.hGUCY2C 세포의 시간-의존적 사멸을 나타내었고, 이는 전기 임피던스 검정에 의해서 정량되었으며(도 2 패널 E), β-갈락토시다제 방출 T-세포 세포독성 검정에서 확인되었다(도 8 패널 A 및 B).
hGUCY2C CAR-T 세포는 전이성 결장직장암에 대항한다.
내인성 면역계는 종양 미세환경에서 면역억제를 유도하고, 장기간 지속에 필요한 자원을 위해서 입양 전달된 T 세포와 경쟁할 수 있다. 이러한 맥락에서, 림포-고갈 컨디셔닝 요법(lympho-depletive conditioning regimen), 예컨대, 저-용량 전신 방사선 조사(TBI) 또는 화학요법은 면역억제 세포를 제거하고, IL7 및 IL15를 비롯한 항상성 사이토카인에 대한 경쟁을 제거함으로써 입양 전달된 T 세포의 효능을 향상시킨다. 면역적격 마우스 모델 및 골수 비파괴성 용량(non-myeloablative dose)의 5Gy 전신 방사선 조사(TBI)를 사용하여 임상 치료 요법을 모방하였다. 면역적격 BALB/c 마우스에게 꼬리 정맥에 의해서 CT26.hGUCY2C 세포를 제공하여 폐 전이를 생성시키고, 3일 후에 TBI로 추적하고, 마우스 CAR-T 세포의 용량을 증가시킨다(도 3 패널 A). 대조군이 아닌, hGUCY2C 표적화된 5F9.m28BBz, CAR-T 세포는 107개의 T 세포의 용량에서 마우스의 생존을 개선시켰다(도 3 패널 A). 이러한 용량은 또한 암 세포 접종 7일 후에 투여될 때 효과적이었고(도 3 패널 B), 제14일에 투여된 제2 용량은 제7일의 단일 용량에 비해서 중위 생존을 추가로 증가시켰다(>150 대 93.5일, p<0.05; 도 3 패널 C). 암 세포 접종 18일 후(처리 11일 후)에 수집된 폐는 종양 결절을 함유하였는데, 이는 대조군 마우스가 폐 전이되었지만, 5F9.m28BBz CAR-T 세포 치료는 거시적 종양을 제거하였음을 확인해주었다(도 3 패널 D). 살아남은 마우스가 hGUCY2C-발현 종양에 대해서 지속적인 보호를 나타내었는지를 결정하기 위해서, 장기 생존자(초기 암 세포 접종 후 161 내지 282일)를 꼬리 정맥 주사에 의해서 모체 CT26 또는 CT26.hGUCY2C 세포로 시험감염시켜 hGUCY2C-특이적 보호를 조사하였다(도 3 패널 E). CT26 종양은 일부 백신접종 요법에서 보호적 gp70-특이적 CD8+ T-세포 반응을 생성시키는 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 gp70 엔벨로프(envelope) 단백질을 보유한다고 공지되어 있다. 모체 CT26 암 세포로 시험감염된 미경험 마우스 및 장기간 살아남은 마우스는 동일한 사망률을 나타내었는데, 이는 장기간 생존자가 CT26 세포에서 발현된 gp70 또는 다른 항원에 대해서 보호성 면역 반응을 생성시키지 않았음을 나타낸다(도 3 패널 E). 이에 반해서, 장기 생존자는 미경험 대조군 마우스에 비해서 CT26.hGUCY2C 암 세포에 대해서 보호되었는데, 이는 5F9.m28BBz CAR-T 세포가 hGUCY2C-발현 종양에 대한 지속된 보호를 생성시킴을 나타낸다(도 3 패널 E).
hGUCY2C CAR-T 세포는 인간 결장직장 종양을 인식한다
다음으로, hGUCY2C CAR-T 세포가 인간 결장직장 종양에서 네이티브 hGUCY2C를 인식하는지의 여부를 결정하였다. 재조합 hGUCY2C-특이적 항체 5F9는 GUCY2C-발현 T84의 표면 상의 hGUCY2C를 염색하였지만(도 4 패널 A), GUCY2C-결핍 SW480(도 9 패널 A), 인간 결장직장암 세포는 염색하지 않았다. 상응하게, 5F9.m28BBz CAR-T 세포는 시험관내에서 시간 의존적인 방식으로 T84를 용해시켰지만(도 4 패널 B), SW480(도 9 패널 B), 암 세포는 용해시키지 않았다. 대조군 CAR-T 세포는 인간 암 세포 유형을 사멸시키지 않았는데, 이는 사멸이 항원-의존적이었음을 나타낸다(도 4 패널 A 및 도 9 패널 A). 인간 5F9 CAR 작제물(5F9.h28BBz)을 발현하는 인간 T 세포는 GUCY2C 자극 후에 효과기 사이토카인을 생산하였고, hGUCY2C를 내인적으로 발현하는 인간 결장직장암 세포를 사멸시켰다(도 10 패널 A 내지 C). hGUCY2C-특이적(5F9.m28BBz)(대조군은 그렇지 않음) CAR을 발현하는 마우스 T 세포는 복막 전이 모델에서 T84 인간 결장직장 종양 이종이식을 효과적으로 치료하였다(도 4 패널 C 내지 E). 종합하면, 이러한 데이터는 5F9 scFv를 사용하여 생산된 hGUCY2C 특이적 CAR 작제물이 hGUCY2C를 내인적으로 발현하는 인간 결장직장 종양의 T 세포 매개된 사멸을 재지시할 수 있음을 나타내었다.
결장직장 종양 항원을 표적으로 하는 입양 T-세포 요법은 항원 "표적 내, 종양 외(on-target, off-tumor)" 독성에 의해서 제한되었다. GUCY2C는 완전 동계 마우스 모델에서 CAR-T 세포 치료를 위한 잠재적인 표적으로서 이미 검증되었는데, 여기서 CAR 표적화 마우스 GUCY2C는 정상 GUCY2C-발현 장내 상피에 대한 독성의 부재 하에서 항종양 효능을 촉진시켰다. 여기서, 인간 GUCY2C-특이적 CAR을 GUCY2C-발현 악성종양에 대한 임상 시험에서 항체-약물 접합체로서 현재 사용되는 항체(NCT02202759, NCT02202785)로부터 생산하였고, 뮤린 T 세포를 사용하는 동계 및 인간 결장직장 종양 이종이식 마우스 모델 둘 다에서 T-세포 활성화, 효과기 기능 및 항종양 효능을 유도하는 능력을 입증하였다. 5F9 scFv로부터 생산된 CAR은 뮤린 GUCY2C와 교차 반응하지 않아서(도 11 패널 A 및 B), 마우스 모델에서 장내 독성의 정량을 방지한다. 본 명세서에 기재된 CAR과 이미 기재된 뮤린 CAR의 항원-인식 도메인의 차이뿐만 아니라 마우스와 인간 간의 내재하는 차이는, 뮤린 GUCY2C CAR-T 세포 안전성 데이터에도 불구하고, 인간에 대한 GUCY2C CAR-T 세포 투여의 위험을 시사한다. 따라서, GUCY2C CAR-T 세포의 사용을 임상으로 전환할 때, mRNA 전기 천공 또는 자살 유전자의 혼입에 의한 일시적 CAR 발현을 포함하여 적절한 안전 조치를 고려해야 한다. 그럼에도 불구하고, GUCY2C-표적화 CAR-T 세포는 적합한 항원 표적의 부족으로 제한되는 패러다임인 T-세포 요법 전체 설비를 위한 매력적인 도구이다. 인간 T-세포 시스템의 추가 개발 및 인간 임상 시험으로의 번역에 따라서, GUCY2C CAR-T 세포 요법은 잠재적으로 미국에서 연간 14만 명 초과의 사망을 생성시키는 제한된 치료 선택을 가진 질환 설정인 전이성 위장관 악성종양의 치료를 잠재적으로 전환시킬 수 있다.
실시예 2　
전달은 다른 잠재적인 보조 치료 중에서, 사이토카인 투여(주로 IL-2), CMA-지향 백신 및/또는 항체 요법, 화학요법, 사이클로포스파마이드 및 플루다라빈 전신 방사선 조사(TBI)를 사용한 숙주 예비 림프결실을 포함한 다양한 치료와 조합될 수 있다.
참고 문헌
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Figure pct00002
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Figure pct00004
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Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 11 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct scFv VL-L5-VH <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(109) <223> 5F9 Variable Light Chain fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(134) <223> Linker G4S-5 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (135)..(255) <223> 5F9 Variable Heavy Chain fragment <400> 11 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly 130 135 140 Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val 145 150 155 160 Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro 165 170 175 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn 180 185 190 Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 195 200 205 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 210 215 220 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly 225 230 235 240 Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 12 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct scFv VH-L2-VL <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(121) <223> 5F9 Variable Heavy Chain fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (122)..(131) <223> Linker G4S-2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (132)..(240) <223> 5F9 Variable Light Chain fragment <400> 12 Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro 1 5 10 15 Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val 130 135 140 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 145 150 155 160 Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 165 170 175 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser 195 200 205 Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser 145 150 155 160 Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser 165 170 175 Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 180 185 190 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu 210 215 220 Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp 225 230 235 240 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser 245 250 255

Claims (39)

  1. 단백질로서,
    서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 5F9 항-GCC scFV 서열을 포함하는, 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 신호 서열, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 더 포함하는, 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 신호 서열, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 더 포함하는, 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 신호 서열은 GM-CSF 신호 서열, CD8 알파 신호 서열, CD8 베타 신호 서열, CD4 신호 서열, TCR 알파 신호 서열, TCR 베타 신호 서열, CD3 델타 신호 서열, CD3 엡실론 신호 서열, CD3 감마 신호 서열, CD28 신호 서열 및 BiP 신호 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8α 힌지 영역, IgG1-Fc 힌지 영역, IgG4-Fc 힌지 영역 및 CD28 힌지 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 영역은 CD8α 막관통 영역, IgG1-Fc 막관통 영역, IgG4-Fc 막관통 영역 및 CD28 막관통 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 도메인은 CD28 신호전달 도메인, 4-1BB(CD137) 신호전달 도메인, CD2 신호전달 도메인, CD27 신호전달 도메인, CD30 신호전달 도메인, CD40L 신호전달 도메인, CD79A 신호전달 도메인, CD79B 신호전달 도메인, CD226 신호전달 도메인, DR3 신호전달 도메인, GITR 신호전달 도메인, HVEM 신호전달 도메인, ICOS 신호전달 도메인, LIGHT 신호전달 도메인, OX40 신호전달 도메인 및 SLAM 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 면역수용체 타이로신 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine activation motif: ITAM)를 더 포함하는, 단백질.
  9. 제8항에 있어서, CD3ζ, CD79-알파, CD79-베타 또는 Fc 수용체로부터의 ITAM을 포함하는 세포내 서열을 포함하는, 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 태그(affinity tag)를 더 포함하는, 단백질.
  11. 제1항에 있어서, CD8α 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인 및 4-1BB 세포내 서열 및 CD3ζ 세포내 서열을 포함하는 신호전달 도메인을 더 포함하는, 단백질.
  12. 제11항에 있어서, GM-CSF 신호 서열을 더 포함하는, 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 서열번호 2를 갖는, 단백질.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  15. 제12항의 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 인간 T 세포에서의 발현을 위해서 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  17. 제16항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 세포.
  18. 제16항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 T 세포.
  19. 서열번호 1을 포함하는 제13항의 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, 서열번호 1은 인간 T 세포에서의 발현을 위해서 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  21. 제20항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 세포.
  22. 제20항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 T 세포.
  23. 제15항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 세포.
  24. 제15항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 T 세포.
  25. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는, 재조합 세포.
  26. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는, 재조합 T 세포.
  27. 제11항의 단백질을 포함하는, 재조합 세포.
  28. 제11항의 단백질을 포함하는, 재조합 T 세포.
  29. 제13항의 단백질을 포함하는, 재조합 세포.
  30. 제13항의 단백질을 포함하는, 재조합 T 세포.
  31. GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 환자의 치료 방법으로서,
    상기 환자에게 복수의 제17항, 제18항 및 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암 세포를 갖는 환자의 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 복수의 재조합 세포는 복수의 재조합 T 세포인, 암 세포를 갖는 환자의 치료 방법.
  33. GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 환자의 치료 방법으로서,
    상기 환자로부터 T 세포를 단리시키는 단계; 상기 T 세포를 제20항의 핵산 분자로 형질전환시켜서 막 결합된 단백질로서 서열번호 1을 발현하고, 서열번호 2를 포함하는 형질전환된 T 세포의 집단을 생산하는 단계, 상기 형질전환된 T 세포의 집단을 확장시켜 복수의 형질전환된 T 세포를 생산하는 단계 및 상기 환자에게 상기 복수의 재조합 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암 세포를 갖는 환자의 치료 방법.
  34. 제31항 또는 제33항에 있어서, 상기 환자로부터 세포를 단리시키기 전에, 암 세포의 샘플을 상기 환자로부터 단리시키고, GUCY2C를 상기 암 세포 상에서 검출하는, 암 세포를 갖는 환자의 치료 방법.
  35. 증가된 위험을 갖는 것으로 식별된 환자에서 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암의 예방 방법으로서,
    상기 환자에게 복수의 제17항, 제18항 및 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 복수의 재조합 세포는 복수의 재조합 T 세포인, 암의 예방 방법.
  37. 증가된 위험을 갖는 것으로 식별된 환자에서 GUCY2C를 발현하는 암 세포를 갖는 암의 예방 방법으로서,
    상기 환자로부터 T 세포를 단리시키는 단계; 상기 T 세포를 제20항의 핵산 분자로 형질전환시켜서 막 결합된 단백질로서 서열번호 1을 발현하고, 서열번호 2를 포함하는 형질전환된 T 세포의 집단을 생산하는 단계, 상기 형질전환된 T 세포의 집단을 확장시켜 복수의 형질전환된 T 세포를 생산하는 단계 및 상기 환자에게 상기 복수의 형질전환된 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 방법.
  38. 복수의 제21항의 재조합 세포의 제조 방법으로서,
    개체로부터 세포를 단리시키는 단계; 세포에서 기능성인 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 서열번호 2를 암호화하는 핵산 분자로 상기 세포를 형질전환시켜 막 결합된 단백질로서 서열번호 2를 포함하는 형질전환된 세포의 집단을 생산하는 단계 및 상기 형질전환된 세포의 집단을 확장시켜 복수의 재조합 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 복수의 재조합 세포의 제조 방법.
  39. 복수의 제22항의 재조합 T 세포의 제조 방법으로서,
    개체로부터 T 세포를 단리시키는 단계; T 세포에서 기능성인 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 서열번호 2를 암호화하는 핵산 분자로 상기 T 세포를 형질전환시켜 막 결합된 단백질로서 서열번호 2를 포함하는 형질전환된 T 세포의 집단을 생산하는 단계 및 상기 형질전환된 T 세포의 집단을 확장시켜 복수의 재조합 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 복수의 재조합 T 세포의 제조 방법.
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