CN112004552A - 抗gucy2c嵌合抗原受体组合物和方法 - Google Patents

抗gucy2c嵌合抗原受体组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112004552A
CN112004552A CN201980026298.4A CN201980026298A CN112004552A CN 112004552 A CN112004552 A CN 112004552A CN 201980026298 A CN201980026298 A CN 201980026298A CN 112004552 A CN112004552 A CN 112004552A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
gly
car
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980026298.4A
Other languages
English (en)
Inventor
S·沃尔德曼
A·斯努克
T·贝巴特
M·马吉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Thomas Jefferson University
Original Assignee
Thomas Jefferson University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Thomas Jefferson University filed Critical Thomas Jefferson University
Publication of CN112004552A publication Critical patent/CN112004552A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464454—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70507—CD2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

公开了包含抗GUCY2C scFv的蛋白质和编码抗GUCY2C scFv的核酸分子。公开了包含与连接至铰链、跨膜和信号结构域序列的抗GUCY2C scFv连接的信号序列的蛋白质。公开了编码包含与连接至铰链、跨膜和信号结构域序列的抗GUCY2C scFv连接的信号序列的蛋白质的核酸分子。公开了包含所述蛋白质和所述核酸分子的T细胞。公开了制备所述T细胞的方法和使用所述T细胞治疗或预防具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的方法。

Description

抗GUCY2C嵌合抗原受体组合物和方法
技术领域
本发明涉及与鸟苷酰环化酶C结合的嵌合抗原受体和编码所述嵌合抗原受体的核酸分子。本发明还涉及包含所述嵌合抗原受体的细胞，制备所述嵌合抗原受体和细胞的方法，以及使用所述细胞治疗患有具有表达鸟苷酰环化酶C的癌细胞的癌症的个体以及保护个体免于具有表达鸟苷酰环化酶C的癌细胞的癌症侵害的方法。
发明背景
基于表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的免疫疗法已成为一种新兴的治疗癌症的方法。CAR是融合受体，其包含用于提供不依赖HLA的细胞表面靶分子结合的结构域和可激活各种类型的宿主免疫细胞的信号传导结构域，所述宿主免疫细胞通常是外周血T细胞，其可包括称为细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤T细胞(NKT)和自然杀伤细胞(NK)或辅助T细胞的细胞群体。也就是说，虽然通常被引入T细胞中，但是可将编码CAR的遗传物质添加至并非T细胞的免疫细胞，例如NK细胞。
鸟苷酰环化酶C(也可互换称为GCC或GUCY2C)是一种膜结合受体，在通过其激素配体鸟苷蛋白或尿鸟苷蛋白激活后产生第二信使cGMP，从而调节肠内稳态、肿瘤发生和肥胖。GUCY2C细胞表面表达局限于肠上皮的腔表面和下丘脑神经元子集。其表达在>95％的结直肠癌转移中得以维持，并且其在肠上皮化生引起的肿瘤(包括食道癌、胃癌、口腔癌、唾液腺癌和胰腺癌)中异位表达。
由于GUCY2C的亚细胞限制，GUCY2C无法到达极化上皮组织的顶膜中，为靶向已失去顶-基底外侧极化的结直肠来源的转移性病变创造了治疗机会，同时没有伴随肠毒性。
一种同源的具有免疫能力的小鼠模型表明，靶向鼠类GUCY2C的CAR-T细胞可在不存在肠毒性的情况下有效针对转移至肺部的结直肠癌。类似地，其它靶向GUCY2C的治疗剂(包括抗体-药物缀合物和疫苗)在临床前动物模型中是安全的，并且利用这些平台的治疗方案在针对转移性食道癌、胃癌、胰腺癌和结直肠癌的临床试验中(NCT02202759、NCT02202785、NCT01972737)。
这些治疗方案的安全性，在跨小肠的头尾轴的GUCY2C表达的情况下，反映了GUCY2C的区室表达，其富集于上皮细胞的顶膜，但局限于上皮细胞的基底外侧膜。与GUCY2C配体缀合的全身放射性标记显像剂靶向了表达GUCY2C的转移，而不会局限在肠道内，从而证实了受体的粘膜区室化。
与正常上皮细胞相比，肿瘤表达的GUCY2C量高达10倍，从而可能产生定量治疗窗口，以区分基底外侧膜中具有低/不存在GUCY2C的肠上皮中过表达受体的肿瘤。
各自通过引用并入本文的美国专利申请公开20120251509A1和美国专利申请公开US 2014-0294784A1公开了包括结合至鸟苷酰环化酶C的CAR的CAR，包含CAR的T细胞(包括包含与GUCY2C和包含GUCY2C的靶细胞结合的CAR的T细胞)，制备嵌合抗原受体和T细胞的方法，以及使用包含与GUCY2C和包含GUCY2C的靶细胞结合的CAR的T细胞来保护个体免受表达GUCY2C的癌细胞的侵害和治疗患有其中癌细胞表达GUCY2C的癌症的个体的方法。
仍然需要改进的组合物和方法来保护个体免受表达GUCY2C的癌细胞的侵害和治疗患有其中癌细胞表达GUCY2C的癌症的个体。
发明内容
提供了包含抗GUCY2C scFV序列的蛋白质。所述抗GUCY2C scFV序列可选自由SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14和SEQ ID NO:15组成的组。
提供了包含5F9抗GUCY2C scFV序列并且还包含信号序列、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域的蛋白质。
提供了编码所述蛋白质的核酸分子。所述核酸分子可以可操作地连接至调节元件，所述调节元件可起到在人类细胞例如人类T细胞中表达蛋白质的作用。可将核酸分子并入核酸载体，例如质粒或重组病毒载体，所述核酸载体可用于将人类细胞转化为表达蛋白质的人类细胞。
提供了包含核酸分子并表达蛋白质的人类细胞。
提供了制备所述细胞的方法。
提供了治疗患有具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的患者的方法和在被鉴定为具有增加风险的患者中预防具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的方法。
附图说明
图1的图A-E。人类GUCY2C特异性CAR-T细胞的生成。图1的图A：通过ELISA评估重组5F9抗体与以1μg/mL接种的hGUCY2CECD或BSA(阴性对照)的特异性结合。双因素ANOVA；****p<0.0001。图1的图B：对亲本CT26小鼠结直肠癌细胞或经工程化以表达hGUCY2C并用5F9抗体染色的CT26细胞(CT26.hGUCY2C)进行流式细胞术分析。图1的图C：第三代鼠类CAR构建体的示意图，所述构建体包含BiP信号序列、5F9 scFv、CD8α铰链区、CD28的跨膜和细胞内结构域、4-1BB(CD137)的细胞内结构域和CD3ζ(5F9.m28BBz)的细胞内结构域的鼠类序列。将CAR构建体插入IRES-GFP标志物上游的MSCV逆转录病毒质粒pMIG中。图1的图D：用含有对照(1D3.m28BBz)CAR或源自5F9抗体(5F9.m28BBz)的CAR的逆转录病毒转导的鼠类CD8+T细胞用纯化的6xHis-hGUCY2CECD(10μg/mL)标记，用抗5xHis-Alexa Fluor 647缀合物检测。在活CD8+细胞上对流式曲线(flow plot)进行门控。图1的图E：在活CD8+GFP+细胞上门控的5F9衍生或对照(1D3)CAR的6xHis-hGUCY2CECD结合曲线(参见图5中的数据)。来自3个独立实验的组合。
图2的图A-E。hGUCY2C特异性CAR介导抗原依赖性T细胞活化和效应子功能。在图2的图A-E中，鼠类CD8+T细胞保持未转导(无)或用对照1D3.m28BBz或5F9.m28BBz CAR构建体转导，如所示。图2的图A：图2的图B-D中所有分析的门控策略。图2的图B：基于CD45RA和CD62L的代表性CAR-T细胞表型分析图。双因素ANOVA；NS：不显著；条柱：2-3次独立实验的平均值±SD；Tn/scm：初始或T记忆干细胞；Tcm：中央记忆T细胞；Tem：效应记忆T细胞；Temra：表达CD45RA的效应记忆T细胞。(C-D)用板包被的抗原(BSA或hGUCY2C)或PMA和离子霉素(PMA/IONO)刺激106个CAR-T细胞持续6小时。然后通过流式细胞术对T细胞活化标志物(CD25、CD69或CD44)和细胞内细胞因子产生(IFNγ、TNFα、IL2和MIP1α)进行定量。图表指示平均值±SD。图2的图C涉及活化标志物上调(MFI)并且图2的图D涉及来自3个独立实验的多功能细胞因子产生(CAR+细胞的百分比)。图2的图E：E-板中的亲本CT26或CT26.hGUCY2C小鼠结直肠癌细胞用CAR-T细胞(E:T比率为5:1)、培养基或10％Triton-X 100(Triton)处理，并且每15分钟定量相对电阻抗，持续10小时，以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。双因素ANOVA，B-E；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图3的图A-E。hGUCY2C CAR-T细胞在同源肺转移模型中提供长期保护。在图3的图A-E中，经由尾静脉向BALB/c小鼠注射5×105个CT26.hGUCY2C细胞以建立肺转移。将对照(4D5.m28BBz)或5F9.m28BBz CAR构建体转导至鼠类CD8+T细胞中。图3的图A：小鼠在3天后用5Gy全身辐射(TBI)处理，然后用106-107个5F9.m28BBz(N＝7-8个/组)或107个对照(N＝6)CART细胞处理。图3的图B：小鼠在第3天(D3)或第7天(D7)用5Gy TBI处理，然后用107个对照(N＝10个/组)或5F9.m28BBz(N＝9-10个/组)CAR-T细胞处理。图3的图C：小鼠在第7天用5GyTBI处理，然后在第7天和第14天用107个对照(N＝10)或5F9.m28BBz(N＝12)CAR-T细胞处理。图3的图D：在第7天用5Gy TBI和PBS或107个对照或5F9.m28BBz CAR-T细胞处理的小鼠在第18天被处死，肺部用印度墨水染色，并对肿瘤/肺计数。单因素ANOVA；*p<0.05。图3的图E：用5F9.m28BBz CAR-T细胞处理的B和C存活小鼠或初始小鼠用5×105个CT26(N＝4-7个/组)或CT26.hGUCY2C(N＝7个/组)细胞攻击(再次攻击发生在最初攻击后的16-40周)。对数秩Mantel-Cox检验，图3的图A-C和E；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。向上箭头指示CAR-T细胞治疗天数。每个图指示一个独立的实验。
图4的图A-E。hGUCY2C CAR-T细胞消除了人类结直肠肿瘤异种移植物。图4的图A：使用重组5F9抗体通过流式细胞术定量T84人类结直肠癌细胞上的hGUCY2C表达。在图4的图B-E中，将对照(1D3.m28BBz)或5F9.m28BBz CAR构建体转导到鼠类CD8+T细胞中。图4的图B：用5F9-m28BBz或对照CAR-T细胞(E:T比率为5:1)、培养基或10％Triton-X 100(Triton)一式两份地处理E-板中的T84结直肠癌细胞，并且每15分钟测量相对电阻抗，持续20小时，以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。双因素ANOVA；**p<0.01；两个独立实验的代表。在图4的图C-E中，免疫缺陷型NSG小鼠经由腹膜内注射的方式注射2.5×106个表达荧光素酶的T84结直肠癌细胞，并在第14天通过腹膜内注射用107个对照(N＝5)或5F9-m28BBz(N＝4)CAR-T细胞进行处理。在图4的图C-D中，在即将T细胞注射之前和之后每周定量总肿瘤发光(光子/秒)。双因素ANOVA；*p<0.05。图4的图E：追踪小鼠的存活率。对数轶Mantel Cox检验；*p<0.05。
图5。检测5F9.m28BBz CAR表面表达。用逆转录病毒转导的鼠类CD8+T细胞用纯化的6xHishGUCY2CECD(0-1430nM)标记，所述逆转录病毒含有对照m28BBz CAR或源自5F9抗体(5F9.m28BBz)的IRES-GFP标志物上游的CAR，并用α5xHis-Alexa-647缀合物检测。在活CD8+细胞上对流式曲线进行门控。
图6。表达hGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞激活5F9.m28BBz CAR-T细胞。用106个亲本CT26、CT26.hGUCY2C结直肠癌细胞或PMA和离子霉素(PMA/IONO)刺激106个CAR-T细胞持续6小时。通过流式细胞术定量T细胞活化标志物(CD25、CD69或CD44)。
图7的图A和图B。表达hGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞诱导5F9.m28BBz CAR-T细胞的细胞因子产生。用板包被的抗原刺激106个CAR-T细胞持续6小时。图7的图A示出BSA、hGUCY2C以及PMA和离子霉素(PMA/IONO)的数据。图7的图B示出106个亲本CT26或CT26.hGUCY2C结直肠癌细胞或PMA和离子霉素(PMA/IONO)的数据。通过流式细胞术定量细胞内细胞因子产生(IFNγ、TNFα、IL-2或MIP1α)。
图8的图A和图B。5F9.m28BBz CAR-T细胞杀伤表达hGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞。将表达β-半乳糖苷酶的CT26(图8的图A中的数据)或CT26.hGUCY2C(图8的图B中的数据)小鼠结直肠癌细胞以一系列效应子CAR-T细胞:靶癌细胞比率(E:T比率)培养4小时。通过由发光底物检测到的β-半乳糖苷酶释放到上清液中来确定特异性裂解。****，p<0.0001(双因素ANOVA)。
图9的图A和图B。5F9.m28BBz CAR-T细胞不能杀伤hGUCY2C缺陷型人类结直肠肿瘤。图9的图A：使用重组5F9抗体通过流式细胞术定量在SW480人类结直肠癌细胞上的hGUCY2C表达。图9的图B：用5F9.m28BBz或对照1D3.m28BBz CAR T细胞、培养基或2.5％Triton-X 100(Triton)处理E-板中的SW480细胞，并且每15分钟定量相对电阻抗，持续20小时，以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。
图10的图A-C。表达5F9.h28BBz CAR的人类T细胞识别并杀伤表达GUCY2C的结直肠癌细胞。图10的图A：用板包被的抗原(BSA或hGUCY2C)或PMA和离子霉素(PMA/IONO)刺激表达人类5F9 CAR构建体(5F9.h28BBz)的CAR-T细胞持续6小时。然后通过流式细胞术对T细胞活化标志物CD69和细胞内细胞因子(IFNγ、TNFα和IL-2)□进行定量。参考图10的图B-C中的数据，用对照或5F9.h28BBz CAR-T细胞(E:T比率为10:1)、培养基或2.5％Triton-X 100处理在E-板中培养的亲本(CT26)、表达人类GUCY2C的CT26(CT26.hGUCY2C)小鼠结直肠癌细胞(数据显示在图10的图B中)或T84人类结直肠癌细胞(数据显示在图10的图C中)，并且每15分钟定量相对电阻抗以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。***，p<0.001(双因素ANOVA)。
图11的图A和图B。5F9.m28BBz CAR-T细胞不杀伤表达mGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞。将表达β-半乳糖苷酶和鼠类GUCY2C的CT26细胞(图11的图A；CT26.mGUCY2C)或表达人类GUCY2C的CT26细胞(图11的图B；CT26.hGUCY2C)以一系列效应子CAR-T细胞:靶癌细胞比率(E:T比率)培养4小时。通过由发光底物检测到的β-半乳糖苷酶释放到上清液中来确定特异性裂解。****，p<0.0001(双因素ANOVA)。
具体实施方式
使用与人类GUCY2C的细胞外结构域结合的抗GUCY2C抗体的可变轻链和可变重链的片段，产生与人类GUCY2C的细胞外结构域结合的单链蛋白序列。接头序列将可变轻链片段与可变重链片段连接成与人类GUCY2C的细胞外结构域结合的单链抗体可变片段融合蛋白序列(scFv)。
scFv是CAR中的成分，CAR是一种较大的融合蛋白。CAR功能组件包括源自免疫球蛋白的抗原结合结构域，与人类GUCY2C结合的抗体序列即svFv，将scFV连接至跨膜结构域的铰链结构域，所述跨膜结构域将蛋白质锚定在其所表达的细胞的细胞膜中，和信号结构域，所述信号结构域充当在scFv与人类GUCY2C结合后激活细胞的信号传导细胞内序列(也称为细胞质序列)。编码CAR的核酸序列包括编码来自细胞蛋白的信号肽的序列，所述序列促进所翻译的CAR向细胞膜的转运。CAR指导表达它们的重组细胞结合于并且在重组细胞毒性淋巴细胞、重组细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、重组自然杀伤T细胞(NKT)和重组自然杀伤细胞(NK)的情况下杀伤显示抗体指定靶标即GUCY2C的细胞。当表达CAR时，CAR被转运至细胞表面并且通常去除信号肽。成熟的CAR充当细胞受体。scFv和铰链结构域显示在细胞表面上，其中scFv序列可暴露于其它细胞上的蛋白质并与所述细胞上的GUCY2C结合。跨膜区将CAR锚定在细胞膜中，并且细胞内序列起到信号结构域的作用以在细胞内转导信号，这导致与表达CAR的细胞结合的表达GUCY2C的细胞死亡。
在一些实施方案中，CAR包含信号序列，例如哺乳动物或合成信号序列。在一些实施方案中，CAR包含来自膜结合蛋白例如哺乳动物膜结合蛋白的信号序列。在一些实施方案中，CAR包含来自膜结合蛋白的信号序列，所述蛋白例如CD8α、CD8β、CD4、TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD28和BiP。信号序列的实例也可见于膜结合的任何哺乳动物信号序列<http://www.signalpeptide.de/index.php？m＝listspdb_mammalia>。在一些实施方案中，CAR包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-22的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列。在一些实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-22。在一些实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列基本上由SEQID NO:2的氨基酸1-22组成。在一些实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列由SEQ ID NO:2的氨基酸1-22组成。在一些实施方案中，编码包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的CAR的构建体的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸1-66。在一些实施方案中，编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸1-66。在一些实施方案中，编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核酸1-66组成。在一些实施方案中，编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的核酸序列由SEQ ID NO:1的核酸1-66组成。
抗GUCY2C结合结构域作为独立于MHC的单链嵌合受体提供。抗原结合结构域源自抗体。在一些实施方案中，CAR包含来自5F9的抗鸟苷酰环化酶C(也称为GCC或GUCY2C)单链可变片段(scFv)(优选可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)。5F9是表达识别人类GUCY2C的细胞外结构域的完全人源化的单克隆抗体的杂交瘤。抗体重链和轻链的DNA编码序列用于产生用于CAR实施的新型scFv，其用于产生抗GCC CAR(例如5F9-28BBz CAR)，并赋予针对GUCY2C分子的抗原特异性。
在例如5F9-28BBz CAR的一些实施方案中，抗GCC scFv可以是5F9单链可变片段(scFv)(可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)。5F9 scFv可包含SEQ ID NO:2的氨基酸25-274。在一些实施方案中，编码包含5F9 scFv的CAR的构建体的核酸序列包含SEQID NO:1的核苷酸73-822。在一些实施方案中，CAR包含抗GCC 5F9 scFv。SEQ ID NO:2的氨基酸25-133对应于5F9可变轻链片段。SEQ ID NO:2的氨基酸154-274对应于5F9可变重链片段。在一些实施方案中，CAR包含抗GCC 5F9单链可变片段(scFv)，其对应于用(甘氨酸4丝氨酸)n接头彼此连接的5F9可变轻片段和5F9可变重片段，其中(甘氨酸4丝氨酸)＝GGGGS(SEQID NO:3)并且n＝2-5。
在一些实施方案中，接头含有两个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)2)，并且可被称为接头G4S-2(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，接头含有三个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)3)，并且可被称为接头G4S-3(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，接头含有四个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)4)，并且可被称为接头G4S-4(SEQ IDNO:6)。在一些实施方案中，接头含有五个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)5)，并且可被称为接头G4S-5(SEQ ID NO:7)。
5F9可变片段可从N末端至C末端以可变轻链片段-接头-可变重链片段或可变重链片段-接头-可变轻链片段的顺序进行配置。在一些实施方案中，CAR包含配置为[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:8)、[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)3-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:9)、[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)4-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:10)或[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)5-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:11)的抗GCC 5F9scFv。在一些实施方案中，CAR包含配置为[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5F9可变轻链片段](SEQ ID NO:12)、[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)3-5F9可变轻链片段](SEQ ID NO:13)、[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)4-5F9可变轻链片段](SEQ ID NO:14)或[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)5-5F9可变轻链片段(SEQ ID NO:15)的抗GCC 5F9 scFv。
在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸25-274的抗GCC5F9 scFv。在一些实施方案中，5F9 scFv包含SEQ ID NO:2的氨基酸25-274。在一些实施方案中，5F9scFv基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸25-274组成。在一些实施方案中，5F9 scFv由SEQ IDNO:2的氨基酸25-274组成。在一些实施方案中，编码5F9 scFv的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸73-822。在一些实施方案中，编码5F9 scFv的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸73-822组成。在一些实施方案中，编码5F9 scFv的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸73-822组成。
在一些实施方案中，CAR包含CD8α、IgG1-Fc、IgG4-Fc或CD28铰链区。在一些实施方案中，CAR包含CD8α铰链区。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸277-336的CD8α铰链区。在一些实施方案中，CD8α铰链区包含SEQ ID NO:2的氨基酸277-336。在一些实施方案中，CD8α铰链区基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸277-336组成。在一些实施方案中，CD8α铰链区由SEQ ID NO:2的氨基酸277-336组成。在一些实施方案中，编码CD8α铰链区的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸829-1008。在一些实施方案中，编码CD8α铰链区的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸829-1008组成。在一些实施方案中，编码CD8α铰链区的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸829-1008组成。
在一些实施方案中，CAR包含CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM跨膜区。
在一些实施方案中，CAR包含CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM细胞内区。
在一些实施方案中，CAR包含来自CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM的跨膜和细胞内(细胞质)序列。在一些实施方案中，CAR包含CD28跨膜和细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸337-405的CD28跨膜和细胞内序列。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸337-405。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215组成。
在一些实施方案中，CAR包含来自与CD3相关的ζ链(CD3ζ)、B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链或某些Fc受体的细胞内(细胞质)序列。
在一些实施方案中，CAR包含a)来自CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM细胞内区中的一者或多者的细胞内(细胞质)序列，以及b)来自与CD3相关的ζ链(CD3ζ)、B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链或某些Fc受体的细胞内(细胞质)序列。
在一些实施方案中，CAR包含CD28跨膜和细胞内序列以及4-1BB细胞内序列与CD3ζ细胞内序列的组合。
在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸337-405的CD28跨膜和细胞内序列。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸337-405。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列由SEQID NO:1的核苷酸1009-1215组成。
在一些实施方案中，CAR包含4-1BB细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸406-444的4-1BB细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含4-1BB细胞内序列，所述4-1BB细胞内序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸406-444。在一些实施方案中，4-1BB细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸406-444组成。在一些实施方案中，4-1BB细胞内序列由SEQ ID NO:2的氨基酸406-444组成。在一些实施方案中，编码4-1BB细胞内的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1216-1332。在一些实施方案中，编码4-1BB细胞内的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1216-1332组成。在一些实施方案中，编码4-1BB细胞内的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1216-1332组成。
在一些实施方案中，CAR包含编码至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的序列。在一些实施方案中，CAR包含来自包含ITAM的细胞信号分子的序列。通常在这样的序列中存在3个ITAM。包含ITAM的细胞信号分子的实例包括与CD3相关的ζ链(CD3ζ)，B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链，以及某些Fc受体。因此，在一些实施方案中，CAR包含来自包含ITAM的细胞信号分子如CD3ζ、B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链以及某些Fc受体的序列。CAR中包括的序列是来自包含一个或多个ITAM的此类分子的细胞内序列。ITAM是四个氨基酸的保守序列，其在免疫系统的某些细胞表面蛋白的细胞质尾部重复两次。ITAM的四个氨基序列的保守序列含有酪氨酸，其被任何两个其它氨基酸(YXXL或YXXI，其中X独立地是任何氨基酸序列)与亮氨酸或异亮氨酸隔开。ITAM含有通常为14-16个氨基酸的序列，其具有通过约6至8个氨基酸隔开的两个四个氨基酸保守序列。与CD3相关的ζ链(CD3ζ)含有3个ITAM。SEQ ID NO:2的氨基酸445-557是CD3ζ细胞内序列。ITAM位于氨基酸465-479、504-519和535-549。在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸445-557的CD3ζ细胞内序列。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内序列包含SEQ ID NO:2的445-557。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的445-557组成。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内序列由SEQ ID NO:2的445-557组成。在一些实施方案中，编码CD3ζ细胞内的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1333-1671。在一些实施方案中，编码CD3ζ细胞内的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1333-1671组成。在一些实施方案中，编码CD3ζ细胞内的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1333-1671组成。
在一些实施方案中，CAR可包含源自免疫球蛋白的抗原结合结构域，与GUCY2C结合的抗体序列，其与T细胞信号传导结构域如T细胞受体的CD3ζ信号链或与T细胞链如CD3ζ链或Ig Fc受体复合物的γ-信号传导亚基连接的T细胞共刺激信号传导(例如CD28)结构域融合。
CAR的信号传导结构域包含源自TCR的序列。在一些实施方案中，CAR包含提供抗原结合功能的抗体可变区的细胞外单链片段，其与跨膜和细胞质信号传导结构域如CD3ζ链或与CD3ζ链连接的CD28信号结构域融合。在一些实施方案中，信号传导结构域通过间隔子或铰链连接至抗原结合结构域。当抗体可变区的片段与GUCY2C结合时，信号传导结构域启动免疫细胞激活。这些重组T细胞表达膜结合嵌合受体，所述嵌合受体包含细胞外抗GUCY2C结合结构域和衍生自TCR的细胞内结构域，所述TCR执行信号传导功能以刺激淋巴细胞。一些实施方案提供了抗GUCY2C结合结构域是单链可变片段(scFv)，其包括抗GUCY2C抗体的重链和轻链可变区的抗GUCY2C结合区。信号传导结构域可包括T细胞共刺激信号传导(例如CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40、SLAM)结构域和T细胞触发链(例如CD3ζ)。
在一些实施方案中，CAR包括亲和标签。这样的亲和标签的实例包括：Strep-Tag；Strep-TagII；Poly(His)；HA；V5；和FLAG-tag。在一些实施方案中，亲和标签可位于scFv之前或者scFv与铰链区之间或者铰链区之后。在一些实施方案中，亲和标签选自Strep-Tag、Strep-TagII、Poly(His)、HA；V5，和FLAG-tag，并且位于scFv之前或者scFv与铰链区之间或者铰链区之后。
在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含信号序列，抗GCC scFv是5F9单链可变片段(scFv)，铰链区，跨膜区和来自一种或多种蛋白和细胞内序列的细胞内序列和免疫受体酪氨酸激活基序，以及任选地亲和标签。
在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含信号序列，信号序列选自GM-CSF、CD8α、CD8β、CD4、TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD28、BiP，连接至抗GCC scFv，抗GCC scFv是选自(可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头-可变重链片段)和(可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头)-可变轻链片段)的5F9单链可变片段(scFv)，连接至选自CD8α、IgG1-Fc、IgG4-Fc和CD28铰链区的铰链区，连接至选自CD8α、IgG1-Fc、IgG4-Fc和CD28跨膜区的跨膜区，连接至选自CD284-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40、SLAM细胞内序列的细胞内序列，连接至含有选自CD3ζ、CD79-α、CD79-β和包含一个或多个ITAM的Fc受体细胞内序列的免疫受体酪氨酸激活基序，任选地连接至选自Strep-Tag、Strep-TagII、Poly(His)、HA；V5和FLAG-tag的亲和标签。
在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列，抗GCC scFv是选自[可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头-可变重链片段]或[可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头-可变轻链片段])、CD8α、CD28、IgG1-Fc或IgG4-Fc铰链区、CD8α或CD28跨膜和细胞内序列、4-1BB细胞内序列和CD3ζ细胞内序列的5F9单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，CAR基本上由粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列组成，抗GCC scFv是5F9单链可变片段(scFv)(可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)，CD8α铰链区，CD28跨膜和细胞内序列，4-1BB细胞内序列和CD3ζ细胞内序列。
在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-22、25-274、277-336、337-405、406-444和445-557。在一些实施方案中，CAR基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸1-22、25-274、277-336、337-405、406-444和445-557组成。在一些实施方案中，CAR由SEQ ID NO:2的氨基酸1-22、25-274、277-336、337-405、406-444和445-557组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1-66、73-822、829-1008、1009-1215、1216-1332和1333-1671。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列基本上由SEQ IDNO:1的核苷酸1-66、73-822、829-1008、1009-1215、1216-1332和1333-1671组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1-66、73-822、829-1008、1009-1215、1216-1332和1333-1671组成。在一些实施方案中，这些序列与在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件连接。在一些实施方案中，用连接至表达编码序列所必需的调节元件的序列转化人类细胞，例如人类T细胞。
在一些实施方案中，CAR由GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop(5F9-28BBz-SEQ ID NO:1)编码，它是一种新型DNA序列，一种合成受体，可由T淋巴细胞表达并输注用于治疗性治疗表达人类鸟苷酰环化酶C(GUCY2C)的恶性肿瘤。GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop编码SEQ ID NO:2。5F9-28BBz包含如此连接的人类DNA编码序列：(1)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列，(2)5F9单链可变片段(scFv)(可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)，(3)CD8α铰链区，(4)CD28跨膜结构域，(5)CD28细胞内结构域，(6)4-1BB细胞内结构域和(7)CD3ζ细胞内结构域。CAR被称为5F9-28BBz。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，CAR基本上由SEQ ID NO:2组成。在一些实施方案中，CAR由SEQ ID NO:2组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由包含SEQ ID NO:1的核苷酸组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由基本上由SEQ ID NO:1组成的核苷酸组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由SEQ ID NO:1组成的核苷酸组成。在一些实施方案中，这些序列与在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件连接。在一些实施方案中，用连接至表达编码序列所必需的调节元件的序列转化人类细胞，例如人类T细胞。
在一些实施方案中，5F9-28BBz-SEQ ID NO:1与在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件连接。在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件可包括启动子、聚腺苷酸化位点以及5'和3'非翻译区中的其它序列。在一些实施方案中，将SEQ ID NO:1插入表达载体，例如质粒如pVAX，或逆转录病毒表达载体如慢病毒载体，或重组DNA病毒载体如重组腺病毒、重组AAV或重组牛痘病毒，或与CRISPR/Cas9、TALEN或其它转座子技术一起使用的双链DNA，或作为信使RNA。
在一些实施方案中，使用常规的体外基因转移技术和例如逆转录病毒载体的材料将CAR编码序列离体引入细胞，例如T细胞，包括CD4+和CD8+，恒定自然杀伤T细胞，γ-δT细胞，自然杀伤细胞，和髓样细胞，包括来自外周淋巴细胞的CD34+造血干细胞。基因转移后，培养重组细胞以扩增施用于患者的重组细胞的数量。重组细胞将识别并结合于呈现由源自细胞外抗体的抗原结合结构域所识别的抗原的细胞。修饰后，将细胞离体扩增以获得已经描述的施用于患者的大量此类细胞。如上所述，自体是指细胞的供者和受者是同一个人。同种异体是指细胞的供者和受者是不同的人。除了通过离体培养分离和扩增抗原特异性T细胞群体外，还可以在分离群体之后和扩增群体之前，通过向群体中添加编码例如细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)的蛋白质的遗传物质，对T细胞进行修饰。
通过从细胞供者中分离T细胞，用编码抗GUCY2C CAR的核酸分子转化T细胞，以及培养转化的细胞以指数方式扩增转化T细胞的数量以产生多个这样的细胞，可获得多个识别GUCY2C的至少一个表位的T细胞。
细胞供者可以是将向其施用扩增的细胞群体的个体，即自体细胞供者。或者，可从与将要施用T细胞的个体不同的个体的细胞供者获得T细胞，即同种异体T细胞。如果使用同种异体T细胞，则优选将细胞供者进行类型匹配，即被鉴定为与受者表达相同或几乎相同的白细胞抗原组。
可通过常规方法从细胞供者获得T细胞，所述常规方法包括例如从血液级分，特别是外周血单核细胞组分，或从骨髓样品中分离。
一旦从细胞供者获得T细胞，就可用编码抗GUCY2C CAR的核酸转化一个或多个T细胞，所述核酸包括与GUCY2C的至少一个表位结合的抗体的功能性结合片段，和当在细胞如T细胞中表达时使得蛋白质为膜结合蛋白的部分。
可通过从“抗体基因供者”中分离产生识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的B细胞来获得编码抗GUCY2C CAR的核酸分子，所述抗体基因供者具有产生识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的这些B细胞。这样的抗体基因供者可能具有B细胞，所述B细胞产生的抗体识别GUCY2C的至少一个表位，这是由于因暴露于接种疫苗以外的免疫原引起的免疫反应，或者这样的抗体基因供者可被鉴定为已接受疫苗的那些，所述疫苗诱导B细胞的产生，所述B细胞产生的抗体识别GUCY2C的至少一个表位，即疫苗接种的抗体遗传供者。疫苗接种的抗体遗传供者可能先前已经接种过疫苗，或者可能专门施用疫苗，作为产生这种B细胞的工作的一部分，所述B细胞产生可识别GUCY2C的至少一个表位的抗体，用于包括以下的方法中：用编码抗GUCY2C CAR的核酸分子转化T细胞，扩增细胞数量，以及将扩增的转化T细胞群体施用于个体。
抗体基因供者可以是将成为转化T细胞的受者的个体，或者是与将成为转化T细胞的受者的个体不同的个体。抗体基因供者可以是与细胞供者相同的个体，或者抗体基因供者可以是与细胞供者不同的个体。在一些实施方案中，细胞供者是转化T细胞的受者，并且抗体基因供者是不同的个体。在一些实施方案中，细胞供者是与抗体基因供者相同的个体，并且是与转化T细胞的受者不同的个体。在一些实施方案中，细胞供者是与抗体基因供者相同的个体，并且是与转化T细胞的受者相同的个体。
编码抗GUCY2C CAR的核酸分子包含编码抗体的功能性结合片段的编码序列，所述抗体识别GUCY2C的至少一个表位，所述编码序列与提供所表达的蛋白质为膜结合蛋白的蛋白质序列连接。编码序列被连接以使得它们编码所表达的单个产物。
可从抗体基因供者的B细胞中分离出编码识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的功能性结合片段的编码序列。可获得这样的B细胞并且分离出遗传信息。在一些实施方案中，B细胞用于产生表达抗体并因此携带抗体编码序列的杂交细胞。抗体编码序列可被确定、克隆并用于制备抗GUCY2C CAR。识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的功能结合片段可包括一些或全部的抗体蛋白，当在转化T细胞中表达时，它保留其对GUCY2C的至少一个表位的结合活性。
提供所表达的蛋白质为膜结合蛋白的蛋白质序列的编码序列可源自膜结合细胞蛋白，并且包括跨膜结构域和任选地细胞质结构域的至少一部分，和/或细胞外结构域的一部分，以及将所表达的蛋白质易位至细胞膜的信号序列。
编码抗GUCY2C CAR的核酸分子，即抗GUCY2C CAR编码序列，可以是DNA或RNA。本发明涉及与鸟苷酰环化酶C结合的嵌合抗原受体和编码所述嵌合抗原受体的核酸分子。本发明还涉及包含所述嵌合抗原受体的细胞，制备所述嵌合抗原受体和细胞的方法，以及使用所述细胞治疗患有具有表达鸟苷酰环化酶C的癌细胞的癌症的个体和保护个体免受具有表达鸟苷酰环化酶C的癌细胞的癌症侵害的方法。
基于表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的免疫疗法已成为一种新兴的治疗癌症的方法。CAR是融合受体，其包含用于提供不依赖HLA的细胞表面靶分子结合的结构域和可激活各种类型的宿主免疫细胞的信号传导结构域，所述宿主免疫细胞通常是外周血T细胞，其可包括称为细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤T细胞(NKT)和自然杀伤细胞(NK)或辅助T细胞的细胞群体。也就是说，虽然通常被引入T细胞中，但是可将编码CAR的遗传物质添加至并非T细胞的免疫细胞，例如NK细胞。
鸟苷酰环化酶C(也可互换称为GCC或GUCY2C)是一种膜结合受体，在通过其激素配体鸟苷蛋白或尿鸟苷蛋白激活后产生第二信使cGMP，从而调节肠内稳态、肿瘤发生和肥胖。GUCY2C细胞表面表达局限于肠上皮的腔表面和下丘脑神经元子集。其表达在>95％的结直肠癌转移中得以维持，并且其在肠上皮化生引起的肿瘤(包括食道癌、胃癌、口腔癌、唾液腺癌和胰腺癌)中异位表达。
由于GUCY2C的亚细胞限制，GUCY2C无法到达极化上皮组织的顶膜中，为靶向已失去顶-基底外侧极化的结直肠来源的转移性病变创造了治疗机会，同时没有伴随肠毒性。
一种同源的具有免疫能力的小鼠模型表明，靶向鼠类GUCY2C的CAR-T细胞可在不存在肠毒性的情况下有效针对转移至肺部的结直肠癌。类似地，其它靶向GUCY2C的治疗剂(包括抗体-药物缀合物和疫苗)在临床前动物模型中是安全的，并且利用这些平台的治疗方案正在针对转移性食道癌、胃癌、胰腺癌和结直肠癌进行临床试验(NCT02202759、NCT02202785、NCT01972737)。
这些治疗方案的安全性，在跨小肠的头尾轴的GUCY2C表达的情况下，反映了GUCY2C的区室表达，其富集于上皮细胞的顶膜，但局限于上皮细胞的基底外侧膜。与GUCY2C配体缀合的全身放射性标记显像剂可靶向表达GUCY2C的转移，而不会局限在肠道内，从而证实了受体的粘膜区室化。
与正常上皮细胞相比，肿瘤表达的GUCY2C量高达10倍，从而可能产生定量治疗窗口，以区分基底外侧膜中具有低/不存在GUCY2C的肠上皮中过表达受体的肿瘤。
各自通过引用并入本文的美国专利申请公开20120251509A1和美国专利申请公开US 2014-0294784A1公开了包括结合至鸟苷酰环化酶C的CAR的CAR，包含CAR的T细胞(包括包含与GUCY2C结合的CAR的T细胞和包含GUCY2C的靶细胞)，制备嵌合抗原受体和T细胞的方法，以及使用包含与GUCY2C和包含GUCY2C的靶细胞结合的CAR的T细胞来保护个体免受表达GUCY2C的癌细胞的侵害和治疗患有其中癌细胞表达GUCY2C的癌症的个体的方法。
仍然需要改进的组合物和方法来保护个体免受表达GUCY2C的癌细胞的侵害和治疗患有其中癌细胞表达GUCY2C的癌症的个体。
提供了包含抗GUCY2C scFV序列的蛋白质。所述抗GUCY2C scFV序列可选自由SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14和SEQ ID NO:15组成的组。
提供了包含5F9抗GUCY2C scFV序列并且还包含信号序列、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域的蛋白质。
提供了编码所述蛋白质的核酸分子。所述核酸分子可以可操作地连接至调节元件，所述调节元件可起到在人类细胞例如人类T细胞中表达蛋白质的作用。可将核酸分子并入核酸载体，例如质粒或重组病毒载体，所述核酸载体可用于将人类细胞转化为表达蛋白质的人类细胞。
提供了包含核酸分子并表达蛋白质的人类细胞。
提供了制备所述细胞的方法。
提供了治疗患有具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的患者的方法和在被鉴定为具有增加风险的患者中预防具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的方法。
图1的图A-E。人类GUCY2C特异性CAR-T细胞的生成。(图1的图A)通过ELISA评估重组5F9抗体与以1μg/mL接种的hGUCY2CECD或BSA(阴性对照)的特异性结合。双因素ANOVA；****p<0.0001。(图1的图B)对亲本CT26小鼠结直肠癌细胞或经工程化以表达hGUCY2C并用5F9抗体染色的CT26细胞(CT26.hGUCY2C)进行流式细胞术分析。(图1的图C)第三代鼠类CAR构建体的示意图，所述构建体包含BiP信号序列、5F9 scFv、CD8α铰链区、CD28的跨膜和细胞内结构域、4-1BB(CD137)的细胞内结构域和CD3ζ(5F9.m28BBz)的细胞内结构域的鼠类序列。将CAR构建体插入IRES-GFP标志物上游的MSCV逆转录病毒质粒pMIG中。(图1的图D)用含有对照(1D3.m28BBz)CAR或源自5F9抗体(5F9.m28BBz)的CAR的逆转录病毒转导的鼠类CD8+T细胞用纯化的6xHis-hGUCY2CECD(10μg/mL)标记，用抗5xHis-Alexa Fluor647缀合物检测。在活CD8+细胞上对流式曲线进行门控。(图1的图E)在活CD8+GFP+细胞上门控的5F9衍生或对照(1D3)CAR的6xHis-hGUCY2CECD结合曲线(参见图5中的数据)。来自3个独立实验的组合。
图2的图A-E。hGUCY2C特异性CAR介导抗原依赖性T细胞活化和效应子功能。(图2的图A-E)鼠类CD8+T细胞保持未转导(无)或用对照1D3.m28BBz或5F9.m28BBz CAR构建体转导，如所示。(图2的图A)图2的图B-D中所有分析的门控策略。(图2的图B)基于CD45RA和CD62L的代表性CAR-T细胞表型分析图。双因素ANOVA；NS：不显著；条柱：2-3次独立实验的平均值±SD；Tn/scm：初始或T记忆干细胞；Tcm：中央记忆T细胞；Tem：效应记忆T细胞；Temra：表达CD45RA的效应记忆T细胞。(C-D)用板包被的抗原(BSA或hGUCY2C)或PMA和离子霉素(PMA/IONO)刺激106个CAR-T细胞持续6小时。然后通过流式细胞术对T细胞活化标志物(CD25、CD69或CD44)和细胞内细胞因子产生(IFNγ、TNFα、IL2和MIP1α)进行定量。图表指示平均值±SD。(图2的图C)活化标志物上调(MFI)和(图2的图D)来自3个独立实验的多功能细胞因子的产生(CAR+细胞的百分比)。(图2的图E)E-板中的亲本CT26或CT26.hGUCY2C小鼠结直肠癌细胞用CAR-T细胞(E:T比率为5:1)、培养基或10％Triton-X 100(Triton)处理，并且每15分钟定量相对电阻抗，持续10小时，以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。双因素ANOVA，B-E；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图3的图A-E。hGUCY2C CAR-T细胞在同源肺转移模型中提供长期保护。(图3的图A-E)经由尾静脉向BALB/c小鼠注射5×105个CT26.hGUCY2C细胞以建立肺转移。将对照(4D5.m28BBz)或5F9.m28BBz CAR构建体转导至鼠类CD8+T细胞中。(图3的图A)小鼠在3天后用5Gy全身辐射(TBI)处理，然后用106-107个5F9.m28BBz(N＝7-8个/组)或107个对照(N＝6)CART细胞处理。(图3的图B)小鼠在第3天(D3)或第7天(D7)用5Gy TBI处理，然后用107个对照(N＝10个/组)或5F9.m28BBz(N＝9-10个/组)CAR-T细胞处理。(图3的图C)小鼠在第7天用5Gy TBI处理，然后在第7天和第14天用107个对照(N＝10)或5F9.m28BBz(N＝12)CAR-T细胞处理。(图3的图D)在第7天用5Gy TBI和PBS或107个对照或5F9.m28BBz CAR-T细胞处理的小鼠在第18天被处死，肺部用印度墨水染色，并对肿瘤/肺计数。单因素ANOVA；*p<0.05。(图3的图E)用5F9.m28BBz CAR-T细胞处理的B和C存活小鼠或初始小鼠用5×105个CT26(N＝4-7个/组)或CT26.hGUCY2C(N＝7个/组)细胞攻击(再次攻击发生在最初攻击后的16-40周)。对数秩Mantel-Cox检验，图3的图A-C和E；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。向上箭头指示CAR-T细胞治疗天数。每个图指示一个独立的实验。
图4的图A-E。hGUCY2C CAR-T细胞消除了人类结直肠肿瘤异种移植物。(图4的图A)使用重组5F9抗体通过流式细胞术定量T84人类结直肠癌细胞上的hGUCY2C表达。(图4的图B-E)将对照(1D3.m28BBz)或5F9.m28BBz CAR构建体转导到鼠类CD8+T细胞中。(图4的图B)用5F9-m28BBz或对照CAR-T细胞(E:T比率为5:1)、培养基或10％Triton-X 100(Triton)一式两份地处理E-板中的T84结直肠癌细胞，并且每15分钟测量相对电阻抗，持续20小时，以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。双因素ANOVA；**p<0.01；两个独立实验的代表。(图4的图C-E)免疫缺陷型NSG小鼠经由腹膜内注射的方式注射2.5×106个表达荧光素酶的T84结直肠癌细胞，并在第14天通过腹膜内注射用107个对照(N＝5)或5F9-m28BBz(N＝4)CAR-T细胞进行处理。(图4的图C-D)在即将T细胞注射之前和之后每周定量总肿瘤发光(光子/秒)。双因素ANOVA；*p<0.05。(图4的图E)追踪小鼠的存活率。对数轶MantelCox检验；*p<0.05。
图5。检测5F9.m28BBz CAR表面表达。用逆转录病毒转导的鼠类CD8+T细胞用纯化的6xHishGUCY2CECD(0-1430nM)标记，所述逆转录病毒含有对照m28BBz CAR或源自5F9抗体(5F9.m28BBz)的IRES-GFP标志物上游的CAR，并用α5xHis-Alexa-647缀合物检测。在活CD8+细胞上对流式曲线进行门控。
图6。表达hGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞激活5F9.m28BBz CAR-T细胞。用106个亲本CT26、CT26.hGUCY2C结直肠癌细胞或PMA和离子霉素(PMA/IONO)刺激106个CAR-T细胞持续6小时。通过流式细胞术定量T细胞活化标志物(CD25、CD69或CD44)。
图7的图A和图B。表达hGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞诱导5F9.m28BBz CAR-T细胞的细胞因子产生。用板包被的抗原(图7的图A；BSA或hGUCY2C)或106个亲本CT26或CT26.hGUCY2C结直肠癌细胞(图7的图B)，或PMA和离子霉素(PMA/IONO)刺激106个CAR-T细胞持续6小时。通过流式细胞术定量细胞内细胞因子产生(IFNγ、TNFα、IL-2或MIP1α)。
图8的图A和图B。5F9.m28BBz CAR-T细胞杀伤表达hGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞。将表达β-半乳糖苷酶的CT26或CT26.hGUCY2C小鼠结直肠癌细胞以一系列效应子CAR-T细胞:靶癌细胞比率(E:T比率)培养4小时。通过由发光底物检测到的β-半乳糖苷酶释放到上清液中来确定特异性裂解。****，p<0.0001(双因素ANOVA)。
图9的图A和图B。5F9.m28BBz CAR-T细胞不能杀伤hGUCY2C缺陷型人类结直肠肿瘤。(图9的图A)使用重组5F9抗体通过流式细胞术定量在SW480人类结直肠癌细胞上的hGUCY2C表达。(图9的图B)用5F9.m28BBz或对照1D3.m28BBz CAR T细胞、培养基或2.5％Triton-X 100(Triton)处理E-板中的SW480细胞，并且每15分钟定量相对电阻抗，持续20小时，以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。
图10的图A-C。表达5F9.h28BBz CAR的人类T细胞识别并杀伤表达GUCY2C的结直肠癌细胞。(图10的图A)用板包被的抗原(BSA或hGUCY2C)或PMA和离子霉素(PMA/IONO)刺激表达人类5F9 CAR构建体(5F9.h28BBz)的CAR-T细胞持续6小时。然后通过流式细胞术对T细胞活化标志物CD69和细胞内细胞因子(IFNγ、TNFα和IL-2)□进行定量。(图10的图B-C)用对照或5F9.h28BBz CAR-T细胞(E:T比率为10:1)、培养基或2.5％Triton-X 100处理在E-板中培养的亲本(CT26)、表达人类GUCY2C的CT26(CT26.hGUCY2C)小鼠结直肠癌细胞(图10的图B)或T84人类结直肠癌细胞(图10的图C)，并且每15分钟定量相对电阻抗以量化癌细胞死亡(归一化为时间＝0)。在添加培养基和Triton进行归一化后，使用阻抗值计算特异性裂解百分比值(分别为0％和100％特异性裂解)。***，p<0.001(双因素ANOVA)。
图11的图A和图B。5F9.m28BBz CAR-T细胞不会杀伤表达mGUCY2C的小鼠结直肠癌细胞。将表达β-半乳糖苷酶和鼠类GUCY2C的CT26细胞(A；CT26.mGUCY2C)或表达人类GUCY2C的CT26细胞(B；CT26.hGUCY2C)以一系列效应子CAR-T细胞:靶癌细胞比率(E:T比率)培养4小时。通过由发光底物检测到的β-半乳糖苷酶释放到上清液中来确定特异性裂解。****，p<0.0001(双因素ANOVA)。
使用与人类GUCY2C的细胞外结构域结合的抗GUCY2C抗体的可变轻链和可变重链的片段，产生与人类GUCY2C的细胞外结构域结合的单链蛋白序列。接头序列将可变轻链片段与可变重链片段连接成与人类GUCY2C的细胞外结构域结合的单链抗体可变片段融合蛋白序列(scFv)。
scFv是CAR中的成分，CAR是一种较大的融合蛋白。CAR功能组件包括源自免疫球蛋白的抗原结合结构域，与人类GUCY2C结合的抗体序列即svFv，将scFV连接至跨膜结构域的铰链结构域，所述跨膜结构域将蛋白质锚定在其所表达的细胞的细胞膜中，和信号结构域，所述信号结构域充当在scFv与人类GUCY2C结合后激活细胞的信号传导细胞内序列(也称为细胞质序列)。编码CAR的核酸序列包括编码来自细胞蛋白的信号肽的序列，所述序列促进所翻译的CAR向细胞膜的转运。CAR指导表达它们的重组细胞结合于并且在重组细胞毒性淋巴细胞、重组细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、重组自然杀伤T细胞(NKT)和重组自然杀伤细胞(NK)的情况下杀伤显示抗体指定靶标即GUCY2C的细胞。当表达CAR时，CAR被转运至细胞表面并且通常去除信号肽。成熟的CAR充当细胞受体。scFv和铰链结构域显示在细胞表面上，其中scFv序列可暴露于其它细胞上的蛋白质并与所述细胞上的GUCY2C结合。跨膜区将CAR锚定在细胞膜中，并且细胞内序列起到信号结构域的作用以在细胞内转导信号，这导致与表达CAR的细胞结合的表达GUCY2C的细胞死亡。
在一些实施方案中，CAR包含信号序列，例如哺乳动物或合成信号序列。在一些实施方案中，CAR包含来自膜结合蛋白例如哺乳动物膜结合蛋白的信号序列。在一些实施方案中，CAR包含来自膜结合蛋白的信号序列，所述蛋白例如CD8α、CD8β、CD4、TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD28和BiP。信号序列的实例也可见于膜结合的任何哺乳动物信号序列<http://www.signalpeptide.de/index.php？m＝listspdb_mammalia>。在一些实施方案中，CAR包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-22的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列。在一些实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-22。在一些实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列基本上由SEQID NO:2的氨基酸1-22组成。在一些实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列由SEQ ID NO:2的氨基酸1-22组成。在一些实施方案中，编码包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的CAR的构建体的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸1-66。在一些实施方案中，编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸1-66。在一些实施方案中，编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核酸1-66组成。在一些实施方案中，编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的核酸序列由SEQ ID NO:1的核酸1-66组成。
抗GUCY2C结合结构域作为独立于MHC的单链嵌合受体提供。抗原结合结构域源自抗体。在一些实施方案中，CAR包含来自5F9的抗鸟苷酰环化酶C(也称为GCC或GUCY2C)单链可变片段(scFv)(优选可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)。5F9是表达识别人类GUCY2C的细胞外结构域的完全人源化的单克隆抗体的杂交瘤。抗体重链和轻链的DNA编码序列用于产生用于CAR实施的新型scFv，其用于产生抗GCC CAR(例如5F9-28BBz CAR)，并赋予针对GUCY2C分子的抗原特异性。
在例如5F9-28BBz CAR的一些实施方案中，抗GCC scFv可以是5F9单链可变片段(scFv)(可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)。5F9 scFv可包含SEQ ID NO:2的氨基酸25-274。在一些实施方案中，编码包含5F9 scFv的CAR的构建体的核酸序列包含SEQID NO:1的核苷酸73-822。在一些实施方案中，CAR包含抗GCC 5F9 scFv。SEQ ID NO:2的氨基酸25-133对应于5F9可变轻链片段。SEQ ID NO:2的氨基酸154-274对应于5F9可变重链片段。在一些实施方案中，CAR包含抗GCC 5F9单链可变片段(scFv)，其对应于用(甘氨酸4丝氨酸)n接头彼此连接的5F9可变轻片段和5F9可变重片段，其中(甘氨酸4丝氨酸)＝GGGGS(SEQID NO:3)并且n＝2-5。
在一些实施方案中，接头含有两个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)2)，并且可被称为接头G4S-2(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，接头含有三个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)3)，并且可被称为接头G4S-3(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，接头含有四个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)4)，并且可被称为接头G4S-4(SEQ IDNO:6)。在一些实施方案中，接头含有五个(甘氨酸4丝氨酸)单元((甘氨酸4丝氨酸)5)，并且可被称为接头G4S-5(SEQ ID NO:7)。
5F9可变片段可从N末端至C末端以可变轻链片段-接头-可变重链片段或可变重链片段-接头-可变轻链片段的顺序进行配置。在一些实施方案中，CAR包含配置为[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:8)、[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)3-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:9)、[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)4-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:10)或[5F9可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)5-5F9可变重链片段](SEQ ID NO:11)的抗GCC 5F9scFv。在一些实施方案中，CAR包含配置为[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5F9可变轻链片段](SEQ ID NO:12)、[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)3-5F9可变轻链片段](SEQ ID NO:13)、[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)4-5F9可变轻链片段](SEQ ID NO:14)或[5F9可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)5-5F9可变轻链片段(SEQ ID NO:15)的抗GCC 5F9 scFv。
在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸25-274的抗GCC5F9 scFv。在一些实施方案中，5F9 scFv包含SEQ ID NO:2的氨基酸25-274。在一些实施方案中，5F9scFv基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸25-274组成。在一些实施方案中，5F9 scFv由SEQ IDNO:2的氨基酸25-274组成。在一些实施方案中，编码5F9 scFv的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸73-822。在一些实施方案中，编码5F9 scFv的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸73-822组成。在一些实施方案中，编码5F9 scFv的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸73-822组成。
在一些实施方案中，CAR包含CD8α、IgG1-Fc、IgG4-Fc或CD28铰链区。在一些实施方案中，CAR包含CD8α铰链区。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸277-336的CD8α铰链区。在一些实施方案中，CD8α铰链区包含SEQ ID NO:2的氨基酸277-336。在一些实施方案中，CD8α铰链区基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸277-336组成。在一些实施方案中，CD8α铰链区由SEQ ID NO:2的氨基酸277-336组成。在一些实施方案中，编码CD8α铰链区的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸829-1008。在一些实施方案中，编码CD8α铰链区的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸829-1008组成。在一些实施方案中，编码CD8α铰链区的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸829-1008组成。
在一些实施方案中，CAR包含CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM跨膜区。
在一些实施方案中，CAR包含CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM细胞内区。
在一些实施方案中，CAR包含来自CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM的跨膜和细胞内(细胞质)序列。在一些实施方案中，CAR包含CD28跨膜和细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸337-405的CD28跨膜和细胞内序列。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸337-405。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215组成。
在一些实施方案中，CAR包含来自与CD3相关的ζ链(CD3ζ)、B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链或某些Fc受体的细胞内(细胞质)序列。
在一些实施方案中，CAR包含a)来自CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40或SLAM细胞内区中的一者或多者的细胞内(细胞质)序列，以及b)来自与CD3相关的ζ链(CD3ζ)、B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链或某些Fc受体的细胞内(细胞质)序列。
在一些实施方案中，CAR包含CD28跨膜和细胞内序列以及4-1BB细胞内序列与CD3ζ细胞内序列的组合。
在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸337-405的CD28跨膜和细胞内序列。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸337-405。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，CD28跨膜和细胞内序列由SEQ ID NO:2的氨基酸337-405组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1009-1215组成。在一些实施方案中，编码CD28跨膜和细胞内序列的核酸序列由SEQID NO:1的核苷酸1009-1215组成。
在一些实施方案中，CAR包含4-1BB细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸406-444的4-1BB细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含4-1BB细胞内序列，所述4-1BB细胞内序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸406-444。在一些实施方案中，4-1BB细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸406-444组成。在一些实施方案中，4-1BB细胞内序列由SEQ ID NO:2的氨基酸406-444组成。在一些实施方案中，编码4-1BB细胞内的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1216-1332。在一些实施方案中，编码4-1BB细胞内的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1216-1332组成。在一些实施方案中，编码4-1BB细胞内的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1216-1332组成。
在一些实施方案中，CAR包含编码至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的序列。在一些实施方案中，CAR包含来自包含ITAM的细胞信号分子的序列。通常在这样的序列中存在3个ITAM。包含ITAM的细胞信号分子的实例包括与CD3相关的ζ链(CD3ζ)，B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链，以及某些Fc受体。因此，在一些实施方案中，CAR包含来自包含ITAM的细胞信号分子如CD3ζ、B细胞受体复合物的CD79-α和CD79-β链以及某些Fc受体的序列。CAR中包括的序列是来自包含一个或多个ITAM的此类分子的细胞内序列。ITAM是四个氨基酸的保守序列，其在免疫系统的某些细胞表面蛋白的细胞质尾部重复两次。ITAM的四个氨基序列的保守序列含有酪氨酸，其被任何两个其它氨基酸(YXXL或YXXI，其中X独立地是任何氨基酸序列)与亮氨酸或异亮氨酸隔开。ITAM含有通常为14-16个氨基酸的序列，其具有通过约6至8个氨基酸隔开的两个四个氨基酸保守序列。与CD3相关的ζ链(CD3ζ)含有3个ITAM。SEQ ID NO:2的氨基酸445-557是CD3ζ细胞内序列。ITAM位于氨基酸465-479、504-519和535-549。在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ细胞内序列。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸445-557的CD3ζ细胞内序列。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内序列包含SEQ ID NO:2的445-557。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内序列基本上由SEQ ID NO:2的445-557组成。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内序列由SEQ ID NO:2的445-557组成。在一些实施方案中，编码CD3ζ细胞内的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1333-1671。在一些实施方案中，编码CD3ζ细胞内的核酸序列基本上由SEQ ID NO:1的核苷酸1333-1671组成。在一些实施方案中，编码CD3ζ细胞内的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1333-1671组成。
在一些实施方案中，CAR可包含源自免疫球蛋白的抗原结合结构域，与GUCY2C结合的抗体序列，其与T细胞信号传导结构域如T细胞受体的CD3ζ信号链或与T细胞链如CD3ζ链或Ig Fc受体复合物的γ-信号传导亚基连接的T细胞共刺激信号传导(例如CD28)结构域融合。
CAR的信号传导结构域包含源自TCR的序列。在一些实施方案中，CAR包含提供抗原结合功能的抗体可变区的细胞外单链片段，其与跨膜和细胞质信号传导结构域如CD3ζ链或与CD3ζ链连接的CD28信号结构域融合。在一些实施方案中，信号传导结构域通过间隔子或铰链连接至抗原结合结构域。当抗体可变区的片段与GUCY2C结合时，信号传导结构域启动免疫细胞激活。这些重组T细胞表达膜结合嵌合受体，所述嵌合受体包含细胞外抗GUCY2C结合结构域和衍生自TCR的细胞内结构域，所述TCR执行信号传导功能以刺激淋巴细胞。一些实施方案提供了抗GUCY2C结合结构域是单链可变片段(scFv)，其包括抗GUCY2C抗体的重链和轻链可变区的抗GUCY2C结合区。信号传导结构域可包括T细胞共刺激信号传导(例如CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40、SLAM)结构域和T细胞触发链(例如CD3ζ)。
在一些实施方案中，CAR包括亲和标签。这样的亲和标签的实例包括：Strep-Tag；Strep-TagII；Poly(His)；HA；V5；和FLAG-tag。在一些实施方案中，亲和标签可位于scFv之前或者scFv与铰链区之间或者铰链区之后。在一些实施方案中，亲和标签选自Strep-Tag、Strep-TagII、Poly(His)、HA；V5，和FLAG-tag，并且位于scFv之前或者scFv与铰链区之间或者铰链区之后。
在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含信号序列，抗GCC scFv是5F9单链可变片段(scFv)，铰链区，跨膜区和来自一种或多种蛋白和细胞内序列的细胞内序列和免疫受体酪氨酸激活基序，以及任选地亲和标签。
在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含信号序列，信号序列选自GM-CSF、CD8α、CD8β、CD4、TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD28、BiP，连接至抗GCC scFv，抗GCC scFv是选自(可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头-可变重链片段)和(可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头)-可变轻链片段)的5F9单链可变片段(scFv)，连接至选自CD8α、IgG1-Fc、IgG4-Fc和CD28铰链区的铰链区，连接至选自CD8α、IgG1-Fc、IgG4-Fc和CD28跨膜区的跨膜区，连接至选自CD284-1BB(CD137)、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40L、CD79A、CD79B、CD226、DR3、GITR、HVEM、ICOS、LIGHT、OX40、SLAM细胞内序列的细胞内序列，连接至含有选自CD3ζ、CD79-α、CD79-β和包含一个或多个ITAM的Fc受体细胞内序列的免疫受体酪氨酸激活基序，任选地连接至选自Strep-Tag、Strep-TagII、Poly(His)、HA；V5和FLAG-tag的亲和标签。
在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列，抗GCC scFv是选自[可变轻链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头-可变重链片段]或[可变重链片段-(甘氨酸4丝氨酸)2-5接头-可变轻链片段])、CD8α、CD28、IgG1-Fc或IgG4-Fc铰链区、CD8α或CD28跨膜和细胞内序列、4-1BB细胞内序列和CD3ζ细胞内序列的5F9单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，CAR基本上由粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列组成，抗GCC scFv是5F9单链可变片段(scFv)(可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)，CD8α铰链区，CD28跨膜和细胞内序列，4-1BB细胞内序列和CD3ζ细胞内序列。
在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-22、25-274、277-336、337-405、406-444和445-557。在一些实施方案中，CAR基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸1-22、25-274、277-336、337-405、406-444和445-557组成。在一些实施方案中，CAR由SEQ ID NO:2的氨基酸1-22、25-274、277-336、337-405、406-444和445-557组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1-66、73-822、829-1008、1009-1215、1216-1332和1333-1671。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列基本上由SEQ IDNO:1的核苷酸1-66、73-822、829-1008、1009-1215、1216-1332和1333-1671组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸1-66、73-822、829-1008、1009-1215、1216-1332和1333-1671组成。在一些实施方案中，这些序列与在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件连接。在一些实施方案中，用连接至表达编码序列所必需的调节元件的序列转化人类细胞，例如人类T细胞。
在一些实施方案中，CAR由GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop(5F9-28BBz-SEQ ID NO:1)编码，它是一种新型DNA序列，一种合成受体，可由T淋巴细胞表达并输注用于治疗性治疗表达人类鸟苷酰环化酶C(GUCY2C)的恶性肿瘤。GM.5F9(VL-(G4S)4-VH)-CD8a-CD28tm.ICD-4-1BB-CD3z.stop编码SEQ ID NO:2。5F9-28BBz包含如此连接的人类DNA编码序列：(1)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列，(2)5F9单链可变片段(scFv)(可变轻片段-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-可变重片段)，(3)CD8α铰链区，(4)CD28跨膜结构域，(5)CD28细胞内结构域，(6)4-1BB细胞内结构域和(7)CD3ζ细胞内结构域。CAR被称为5F9-28BBz。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，CAR基本上由SEQ ID NO:2组成。在一些实施方案中，CAR由SEQ ID NO:2组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由包含SEQ ID NO:1的核苷酸组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由基本上由SEQ ID NO:1组成的核苷酸组成。在一些实施方案中，编码CAR的构建体的核酸序列由SEQ ID NO:1组成的核苷酸组成。在一些实施方案中，这些序列与在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件连接。在一些实施方案中，用连接至表达编码序列所必需的调节元件的序列转化人类细胞，例如人类T细胞。
在一些实施方案中，5F9-28BBz-SEQ ID NO:1与在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件连接。在人类细胞例如人类T细胞中表达编码序列所必需的调节元件可包括启动子、聚腺苷酸化位点以及5'和3'非翻译区中的其它序列。在一些实施方案中，将SEQ ID NO:1插入表达载体，例如质粒如pVAX，或逆转录病毒表达载体如慢病毒载体，或重组DNA病毒载体如重组腺病毒、重组AAV或重组牛痘病毒，或与CRISPR/Cas9、TALEN或其它转座子技术一起使用的双链DNA，或作为信使RNA。
在一些实施方案中，使用常规的体外基因转移技术和例如逆转录病毒载体的材料将CAR编码序列离体引入细胞，例如T细胞，包括CD4+和CD8+，恒定自然杀伤T细胞，γ-δT细胞，自然杀伤细胞，和髓样细胞，包括来自外周淋巴细胞的CD34+造血干细胞。基因转移后，培养重组细胞以扩增施用于患者的重组细胞的数量。重组细胞将识别并结合于呈现由源自细胞外抗体的抗原结合结构域所识别的抗原的细胞。修饰后，将细胞离体扩增以获得已经描述的施用于患者的大量此类细胞。如上所述，自体是指细胞的供者和受者是同一个人。同种异体是指细胞的供者和受者是不同的人。除了通过离体培养分离和扩增抗原特异性T细胞群体外，还可以在分离群体之后和扩增群体之前，通过向群体中添加编码例如细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)的蛋白质的遗传物质，对T细胞进行修饰。
通过从细胞供者中分离T细胞，用编码抗GUCY2C CAR的核酸分子转化T细胞，以及培养转化的细胞以指数方式扩增转化T细胞的数量以产生多个这样的细胞，可获得多个识别GUCY2C的至少一个表位的T细胞。
细胞供者可以是将向其施用扩增的细胞群体的个体，即自体细胞供者。或者，可从与将要施用T细胞的个体不同的个体的细胞供者获得T细胞，即同种异体T细胞。如果使用同种异体T细胞，则优选将细胞供者进行类型匹配，即被鉴定为与受者表达相同或几乎相同的白细胞抗原组。
可通过常规方法从细胞供者获得T细胞，所述常规方法包括例如从血液级分，特别是外周血单核细胞组分，或从骨髓样品中分离。
一旦从细胞供者获得T细胞，就可用编码抗GUCY2C CAR的核酸转化一个或多个T细胞，所述核酸包括与GUCY2C的至少一个表位结合的抗体的功能性结合片段，和当在细胞如T细胞中表达时使得蛋白质为膜结合蛋白的部分。
可通过从“抗体基因供者”中分离产生识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的B细胞来获得编码抗GUCY2C CAR的核酸分子，所述抗体基因供者具有产生识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的这些B细胞。这样的抗体基因供者可能具有B细胞，所述B细胞产生的抗体识别GUCY2C的至少一个表位，这是由于因暴露于接种疫苗以外的免疫原引起的免疫反应，或者这样的抗体基因供者可被鉴定为已接受疫苗的那些，所述疫苗诱导B细胞的产生，所述B细胞产生的抗体识别GUCY2C的至少一个表位，即疫苗接种的抗体遗传供者。疫苗接种的抗体遗传供者可能先前已经接种过疫苗，或者可能专门施用疫苗，作为产生这种B细胞的工作的一部分，所述B细胞产生可识别GUCY2C的至少一个表位的抗体，用于包括以下的方法中：用编码抗GUCY2C CAR的核酸分子转化T细胞，扩增细胞数量，以及将扩增的转化T细胞群体施用于个体。
抗体基因供者可以是将成为转化T细胞的受者的个体，或者是与将成为转化T细胞的受者的个体不同的个体。抗体基因供者可以是与细胞供者相同的个体，或者抗体基因供者可以是与细胞供者不同的个体。在一些实施方案中，细胞供者是转化T细胞的受者，并且抗体基因供者是不同的个体。在一些实施方案中，细胞供者是与抗体基因供者相同的个体，并且是与转化T细胞的受者不同的个体。在一些实施方案中，细胞供者是与抗体基因供者相同的个体，并且是与转化T细胞的受者相同的个体。
编码抗GUCY2C CAR的核酸分子包含编码抗体的功能性结合片段的编码序列，所述抗体识别GUCY2C的至少一个表位，所述编码序列与提供所表达的蛋白质为膜结合蛋白的蛋白质序列连接。编码序列被连接以使得它们编码所表达的单个产物。
可从抗体基因供者的B细胞中分离出编码识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的功能性结合片段的编码序列。可获得这样的B细胞并且分离出遗传信息。在一些实施方案中，B细胞用于产生表达抗体并因此携带抗体编码序列的杂交细胞。抗体编码序列可被确定、克隆并用于制备抗GUCY2C CAR。识别GUCY2C的至少一个表位的抗体的功能结合片段可包括一些或全部的抗体蛋白，当在转化T细胞中表达时，它保留其对GUCY2C的至少一个表位的结合活性。
提供所表达的蛋白质为膜结合蛋白的蛋白质序列的编码序列可源自膜结合细胞蛋白，并且包括跨膜结构域和任选地细胞质结构域的至少一部分，和/或细胞外结构域的一部分，以及将所表达的蛋白质易位至细胞膜的信号序列。
分子。核酸分子可以可操作地连接至供者T细胞中表达编码序列所必需的调节元件。在一些实施方案中，包含抗GUCY2C CAR编码序列的核酸分子是质粒DNA分子。在一些实施方案中，包含抗GUCY2C CAR编码序列的核酸分子是质粒DNA分子，其为表达载体，其中所述编码序列可操作地连接至质粒中表达供者T细胞中的抗GUCY2C CAR编码序列所必需的调节元件。在一些实施方案中，可将包含抗GUCY2C CAR编码序列的核酸分子并入用于感染供者T细胞的病毒颗粒中。用于制备这种颗粒的包装技术是已知的。并入颗粒中的编码序列可以可操作地连接至质粒中为表达供者T细胞中的抗GUCY2C CAR编码序列所必需的调节元件。在一些实施方案中，将包含抗GUCY2C CAR编码序列的核酸分子并入病毒基因组中。在一些实施方案中，将病毒基因组并入用于感染供者T细胞的病毒颗粒中。用于将核酸分子递送至细胞的病毒载体是众所周知的，并且包括例如基于疫苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒以及各种逆转录病毒的病毒载体。并入病毒基因组中的抗GUCY2C CAR编码序列可以可操作地连接至质粒中为表达供者T细胞中的抗GUCY2C CAR编码序列所必需的调节元件。
在转化的T细胞中表达核酸后，可测试转化的细胞以鉴定识别GUCY2C的至少一个表位的T细胞。可使用标准技术从样品中鉴定并分离出这种转化的T细胞。包含GUCY2C的至少一个表位的蛋白质可粘附到固体支撑物上并与样品接触。然后进一步测试洗涤后保留在表面上的T细胞，以鉴定识别GUCY2C的至少一个表位的T细胞。也可不同地使用亲和力分离方法，例如柱、与细胞结合的标记蛋白、细胞分选技术。识别GUCY2C的至少一个表位的T细胞也可通过它们在蛋白质的存在下与GUCY2C的至少一个表位的反应性来鉴定。
一旦T细胞被鉴定为可识别至少一个表位GUCY2C的T细胞，就可使用组织培养技术在促进和维持细胞生长和分裂的条件下对其进行克隆扩增，以产生指数数量的相同细胞。可收集扩增的T细胞群体以施用于患者。
根据一些实施方案，识别GUCY2C的至少一个表位的多个T细胞包含与细胞组合的药学上可接受的载体。包含细胞的药物制剂是众所周知的，并且可由本领域普通技术人员常规地配制。合适的药物载体描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,A.Osol，其为本领域的标准参考书，其通过引用并入本文。本发明涉及用于输注的药物组合物。
在一些实施方案中，例如，可将多个细胞配制成与药学上可接受的媒介物缔合的悬浮液。这样的媒介物的实例是水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人类血清白蛋白。媒介物可含有维持等渗性的添加剂(例如，氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(例如，缓冲剂和防腐剂)。在添加细胞之前，通过常用技术对媒介物进行灭菌。
多个细胞可通过任何使它们与癌细胞接触的方式来施用。药物组合物可例如经静脉内施用。
剂量根据以下因素而改变：多个细胞的性质，受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度，并行治疗的种类，治疗的频率以及所需的效果。通常，施用1×1010至1×1012个T细胞，但是也可以施用更多或更少，例如1×109至1×1013。通常，施用1×1011个T细胞。所递送的细胞数是足以诱导保护性或治疗性反应的量。本领域普通技术人员可通过常规方法容易地确定范围和最佳剂量。
用抗GUCY2C CAR治疗的患者包括患有表达GUCY2C的癌细胞的患者。在一些实施方案中，这样的癌症可以是转移性结直肠癌，转移性或原发性胃癌，转移性或原发性食道癌，转移性或原发性口腔癌，转移性或原发性唾液腺癌或转移性或原发性胰腺癌或被鉴定为具有GUCY2C表达的任何其它癌症。在一些实施方案中，用抗GUCY2C CAR治疗疑似患有包括表达GUCY2C的癌细胞的癌症的患者。在一些实施方案中，在用抗GUCY2C CAR治疗之前，将患者鉴定为转移性结直肠癌、转移性或原发性胃癌、转移性或原发性食道癌、转移性或原发性口腔癌、转移性或原发性唾液腺癌或转移性或原发性胰腺癌患者。在一些实施方案中，在用抗GUCY2C CAR治疗之前，测试来自患者的癌症样品的GUCY2C表达，并用抗GUCY2C CAR治疗那些测试为GUCY2C表达阳性的癌症患者。在一些实施方案中，在用抗GUCY2C CAR治疗之前，对患者进行手术以移除肿瘤，并测试从所述患者中移除的肿瘤样品的GUCY2C表达，并用抗GUCY2C CAR治疗那些测试为GUCY2C表达阳性的癌症患者。
抗GUCY2C CAR可用于预防鉴定为癌症风险升高的个体中的癌症，所述癌症具有表达GUCY2C的癌细胞，例如转移性结直肠癌、转移性或原发性胃癌、转移性或原发性食道癌、转移性或原发性口腔癌、转移性或原发性唾液腺癌或转移性或原发性胰腺癌。基于家族病史，遗传背景或先前诊断出具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症，例如转移性结直肠癌、转移性或原发性胃癌、转移性或原发性食道癌、转移性或原发性口腔癌、转移性或原发性唾液腺癌或转移性或原发性胰腺癌，以及移除癌症的治疗或导致明显的缓解或无癌状态的治疗，个体可鉴定为具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症风险升高。
实施例
实施例1
已经鉴定了靶向人类GUCY2C的CAR，其可用于具有表达GUCY2C的恶性肿瘤(例如转移性结直肠癌、转移性或原发性胃癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌或胰腺癌或其它表达GUCY2C的癌症)的患者中。这种抗GUCY2C CAR诱导了抗原依赖性T细胞活化、细胞因子产生和细胞裂解活性。靶向人类GUCY2C的CAR-T细胞在具有免疫能力的同源小鼠模型以及人类结直肠癌的同种异体移植物模型中均有效对抗转移性肿瘤。
材料和方法
细胞系和试剂。从ATCC获得表达CT26和β-半乳糖苷酶的CT26.CL25小鼠结直肠癌细胞系和人类结直肠癌细胞系T84和SW480，并冷冻保存大量的低传代细胞。细胞由原始供应商认证，并通过形态、生长、抗生素抗性(在适当时，GUCY2C和β-半乳糖苷酶表达以及体内转移模式)进行常规认证，并使用通用支原体检测试剂盒(ATCC，目录号30-1012K)常规筛查支原体。在注入小鼠中之前，将细胞常规培养<2周。对编码人类GUCY2C的基因进行密码子优化和合成(Gene Art,Life Technologies)，并克隆到逆转录病毒构建体pMSCVpuro(Clontech)中。通过用编码hGUCY2C的逆转录病毒上清液转导CT26和CT26.CL25细胞，然后用嘌呤霉素进行选择来产生CT26.hGUCY2C和CT26.CL25.hGUCY2C。逆转录病毒上清液是通过用pMSCV-Puro(Clontech)或hGUCY2C-pMSCV Puro和pCL-Eco(Imgenex)逆转录病毒包装载体(12)转染Phoenix-Eco逆转录病毒包装细胞系(Gary Nolan,Stanford University)而产生的。通过按照制造商的说明用pLenti4-V5-GW-luciferase.puro(由Thomas JeffersonUniversity的Andrew Aplin友情提供)和ViraPower慢病毒包装混合物(Invitrogen)转染293FT细胞(Invitrogen)产生的慢病毒上清液进行转导，然后在嘌呤霉素中选择来产生含有荧光素酶的T84.fLuc细胞。将来自人类GUCY2C特异性抗体5F9的单链可变片段(scFv)克隆到pFUSE-rIgG-Fc2(IL2ss)质粒(Invivogen)中，产生与兔Fc(5F9-rFc)的5F9 scFv融合蛋白。将5F9-rFc在转染的293F细胞(Life Technologies)的上清液中收集，在用BSA包被的ELISA板(Nunc-Immuno PolySorp)或重组6xHis标记的hGUCY2C细胞外结构域(6xHis-hGUCY2CECD)蛋白中进行滴定，根据合同从HEK293-6E细胞通过GenScript纯化，并用HRP缀合的山羊抗兔(Jackson ImmunoResearch)检测。对于流式细胞术，将细胞用FACS缓冲液(PBS中1％热灭活的FBS)中稀释的5F9-rFc或来自未转染的293F细胞的对照上清液染色，然后用FACS缓冲液中的二次Alexa Fluor 488缀合的抗兔(Life Technologies)染色。细胞用2％多聚甲醛(PFA；Affymetrix)固定，并使用BD LSR II流式细胞仪和FlowJo v10软件(Tree Star)进行分析。
鼠类CAR-T细胞的产生。如先前所述，将鼠类CAR组分用于产生第三代的密码子优化的逆转录病毒CAR构建体。将源自5F9人类GUCY2C特异性抗体的密码子优化的scFv序列克隆到CAR构建体中，所述CAR构建体含有BiP信号肽、CD8α铰链区、CD28跨膜和细胞内结构域以及4-1BB(CD137)和CD3ζ细胞内结构域的鼠类序列，从而产生5F9.m28BBz CAR构建体。如所示，使用源自人类ERBB2(Her2)特异性抗体4D5或小鼠CD19特异性抗体1D3的CAR作为对照(对照m28BBz)。将CAR亚克隆到pMSCV-IRES-GFP(pMIG)逆转录病毒载体(Addgene#27490)中。使用Calcium Phosphate ProfectionR哺乳动物转染系统(Promega)用CAR-pMIG载体和pCL-Eco逆转录病毒包装载体(Imgenex)转染Phoenix-Eco逆转录病毒包装细胞系(GaryNolan,Stanford University)。48小时后收集含逆转录病毒的上清液，通过0.45μM过滤器过滤，并且将等分试样冷冻于-80℃。使用CD8α+T细胞分离试剂盒II和LS磁柱(MiltenyiBiotec)从BALB/c脾细胞中阴性选择鼠类CD8+T细胞。随后，用抗CD3/抗CD28包被的珠粒(T细胞活化/扩增试剂盒，Miltenyi Biotec)在1:1珠粒:细胞比率下以1x106个细胞/ml在cRPMI中用100U/mL重组人类IL2(NCI Repository)刺激CD8+T细胞。刺激后第二天，在存在8μg/ml聚凝胺(polybrene)(Millipore)的情况下，小心地用等体积的解冻逆转录病毒上清液替换1/2的培养基。在室温下以2500rpm进行旋转接种持续90分钟，然后在37℃温育2.5小时，此时将细胞沉淀并重悬于含有100U/mL IL2的新鲜培养基中。用新鲜的cRPMI和IL2将T细胞每日稀释至1×106个细胞/ml来扩增7-10天，此时将其用于功能测定。
人类CAR-T细胞的产生。对于人类T细胞的研究，根据监管和机构要求从同意的志愿者中收集PBMC。从单个正常健康供者全血中以大于90％的纯度阴性选择MACS(StemcellTechnologies)纯化的CD8+T细胞。使用人类序列的CAR结构域被用于产生第三代的密码子优化的逆转录病毒CAR构建体，所述构建体含有5F9人类GUCY2C特异性scFv和以下的人类序列：GM-CSF信号肽，CD8α铰链区，CD28跨膜和细胞内结构域，以及4-1BB(CD137)和CD3ζ细胞内结构域，从而产生5F9.h28BBz(SEQ ID NO:1)。编码CAR的两亲性γ-166逆转录病毒的产生与鼠类T细胞相似，但用pCL-Ampho包装质粒(Imgenex)代替pCL-Eco。逆转录病毒转导发生在用ImmunoCult CD3/CD28激活剂(Stem Cell Technologies)激活后第3天或第4天。在第7天对细胞进行流式分选，以进行GFP富集，然后在第10天进行实验使用。在整个培养的持续时间内，将人类CD8+T细胞维持在补充有100U/mL重组人类IL2(NCI Repository)的ImmunoCult-XF培养基(Stemcell Technologies)中。
CAR表面检测。使用LIVE/DEAD Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(Invitrogen)在PBS中对CAR转导的T细胞进行染色，在PBS 0.5％BSA中用不同浓度的6xHis-hGUCY2CECD标记1小时，用抗5xHis-Alexa Fluor 647缀合物(Qiagen)和抗CD8b-PE(克隆H35.17.2，BDBiosciences)在PBS 0.5％BSA中染色1小时，用2％PFA固定并使用BD LSR II流式细胞仪和FlowJo软件v10(Tree Star)进行分析。hGUCY2C结合是通过Alexa Fluor 647在活CD8+CAR+(GFP+)细胞上的平均荧光强度确定的。使用非线性回归分析(GraphPad Prism v6)来确定GUCY2C-CAR结合的Kav和Bmax。
小鼠T细胞表型分析、活化标志物和细胞内细胞因子染色。对于表型分析，将1×106个非转导或经CAR转导的小鼠T细胞在PBS中用LIVE/DEAD Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(Invitrogen)染色，随后在PBS 0.5％BSA中使用抗CD8α-BV570(克隆RPA-T8；Biolegend)、抗CD45RA-PerCP-Cy5.5(克隆14.8；BD Biosciences)和抗CD62L-PE-Cy7(克隆MEL-14；BD Biosciences)对表面标志物染色30分钟。随后在4℃下将细胞用Cytofix/Cytoperm缓冲液固定并透化(BD Cytofix/Cytoperm试剂盒；BD Biosciences)持续20分钟，并在Perm/洗涤缓冲液中对细胞内GFP(抗GFP-Alexa Fluor 488；Invitrogen)染色45分钟，以鉴定CAR转导的细胞。然后基于CD45RA和CD62L染色对以下亚组进行定量：Tn/scm(初始或T记忆干细胞；CD62L+CD45RA+)，Tcm(中央记忆T细胞；CD62L+CD45RA-)，Tem(效应记忆T细胞；CD62L CD45RA-)和Temra(表达CD45RA的效应记忆T细胞；CD62L CD45RA+)。对于活化标志物和细胞因子分析，在先前涂有PBS中1μg/mL GUCY2C过夜的组织培养板中于4℃或含有1×106个CT26或CT26.hGUCY2C细胞的组织培养板中，将1×106个CAR转导的小鼠T细胞刺激6小时。作为阳性对照，将CAR-T细胞与1X细胞刺激混合液(PMA/Ionomycin,eBioscience)温育6小时。当评估细胞内细胞因子时，温育包括1X蛋白质转运抑制剂混合液(eBioscience)。用LIVE/DEAD Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(Invitrogen)染色细胞，随后使用抗CD8α-PerCP-Cy5.5(克隆53.6-7；BD Biosciences)、抗CD69-PE(克隆H1.2F3；BD Biosciences)、抗CD25-PE(克隆PC61.5，eBioscience)和抗CD44-APC(克隆IM7；Biolegend)对表面标志物进行染色。使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)进行细胞内细胞因子染色，并使用抗GFP-Alexa488(Invitrogen)、抗IFNγ-APC-Cy7(克隆XMG1.2；BD Biosciences)、抗TNFα-PE-Cy7(克隆MP6-XT22；BD Biosciences)、抗IL2-APC(克隆JES6-5H4；BDBiosciences)和αMIP1α-PE(克隆39624；R&D Systems)染色。将细胞固定在2％PFA中，并在BD LSR II流式细胞仪上进行分析。使用FlowJo v10软件(Tree Star)进行分析。
人类T细胞活化标志物和细胞内细胞因子染色。对于活化标志物和细胞因子分析，将1×106个人类GUCY2C定向的CAR转导的人类T细胞在组织培养板中刺激6小时，所述组织培养板在4℃下用PBS中的10μg/mL人类GUCY2C或BSA对照抗原或用接种CAR-T细胞时添加的1X细胞刺激混合液(PMA/Ionomycin,eBioscience)包被过夜。在温育期开始时，所有条件均包括1X蛋白质转运抑制剂混合液(eBioscience)。细胞在PBS中用LIVE/DEAD Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(Invitrogen)染色10分钟，随后使用抗CD8-Qdot 800(克隆3B5，Invitrogen)和抗CD69-APC(克隆L78，BD Biosciences)在PBS 0.5％BSA中对表面标志物染色25分钟。使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)进行细胞内细胞因子染色，包括用Cytofix/Cytoperm缓冲液固定20分钟，并用抗GFP-Alexa Fluor 488(Invitrogen)、抗IFNγ-BV605(克隆4S.B3；BioLegend)、抗TNFα-PerCP-Cy5.5(克隆Mab11；BDBiosciences)和抗IL2-PE(克隆MQ1-17H12；BD Biosciences)在BD perm洗涤缓冲液中染色45分钟。将细胞在2％PFA中固定，并在BD LSR II流式细胞仪上进行分析。使用FlowJo v10软件(Tree Star)进行分析。
T细胞的细胞毒性测定。如前所述，利用xCELLigence实时细胞介导的细胞毒性系统(Acea Biosciences Inc.)来评估CAR T细胞介导的细胞毒性(12)。简言之，将1x104个CT26或CT26.hGUCY2C或2.5x104个T84或SW480癌细胞靶标涂铺在E-Plate 16(AceaBiosciences)的每个孔中的150μL生长培养基中，并在37℃温育器中生长过夜，每15分钟使用RTCA DP分析仪系统和RTCA软件2.0版(Acea Biosciences Inc.)定量电阻抗。约24小时后(对于小鼠T细胞实验)以及约6小时后(对于人类T细胞实验)，分别添加50μL CAR-T细胞(5:1E:T比率(对于小鼠T细胞)或10:1E:T比率(对于人类T细胞))或者50μL培养基或10％Triton-X100(Fisher)，使最终(v/v)为2.5％Triton-X 100，作为阴性对照和阳性对照。在接下来的10-20小时内，对细胞介导的杀伤进行定量，每15分钟读取电阻抗。使用GraphPadPrism软件v6在每个时间点针对每个重复样品，使用添加培养基和Triton-X 100进行归一化后的阻抗值(分别为0％和100％特异性裂解)，计算特异性裂解百分比值。或者，β-gal释放T细胞的细胞毒性测定法利用表达β-半乳糖苷酶(CT26.CL25)的CT26癌细胞靶标。将癌细胞靶标以2x105个细胞/孔涂铺在96孔板中，并在增加的效应子CAR T细胞/癌细胞靶标比率下在37℃下温育4小时。使用Galacto-Light Plus系统(Applied Biosystems，Carlsbad，California)在培养基中测量释放的β-半乳糖苷酶。从用所提供的裂解缓冲液裂解的细胞上清液中确定最大释放。258％特异性裂解＝[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]x 100。
转移性肿瘤模型。BALB/c小鼠和NSG(NOD-scid IL2Rγnull)小鼠分别从NCIAnimal Production Program(Frederick,MD)和Jackson Labs(Bar Harbor,ME)获得。动物方案得到了托马斯·杰斐逊大学机构动物护理和使用委员会(Thomas JeffersonUniversity Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。在同源小鼠模型中，通过尾静脉注射向BALB/c小鼠注射100μL PBS中的5x105个CT26.hGUCY2C细胞，以建立肺转移。在指定日，小鼠在PanTak 310kVe x射线机中接受非清髓性剂量的5Gy全身照射。小鼠在指定的时间点通过尾静脉接受在100μL PBS中从CD8+BALB/c T细胞产生的指定剂量的CAR-T细胞。追踪小鼠的存活或在癌细胞注射后第18天将其处死，并用印度墨水对肺进行染色并固定在Fekete溶液中进行肿瘤计数。对于再次攻击实验，初始小鼠或通过CAR-T细胞清除已建立肿瘤的小鼠(称为“存活小鼠”)经由尾静脉注射接受一剂5x105个CT26或CT26.hGUCY2C。在再次攻击实验之前，最初对存活的小鼠攻击16-40周。在人类肿瘤异种移植物模型中，经由腹膜内注射向NSG(23)小鼠(JAX库存#005557)注入100μL PBS中的2.5x106个T84.fLuc细胞。在癌细胞接种后第14天，小鼠经由腹膜内注射接受100μL PBS中由CD8+BALB/c T细胞产生的剂量107个(未在CAR+上分选)T细胞。通过皮下注射250μL的15mg/ml D-荧光素钾盐(Gold Biotechnologies)于PBS中的溶液每周281次监测肿瘤生长，并在暴露8分钟后使用Caliper IVIS Lumina-XR成像平台(Perkin Elmer)进行成像。使用活体成像体内成像软件(Perkin Elmer)对总辐射度(光子/秒)进行定量。
结果和讨论
hGUCY2C CAR-T细胞
对人类GUCY2C(hGUCY2C)具特异性的重组抗体(克隆5F9)结合于纯化的hGUCY2C细胞外结构域(图1的图A)和经工程化以表达hGUCY2C的鼠类CT26结直肠癌细胞，而非hGUCY2C缺陷型CT26癌细胞(图1的图B)。使用5F9 scFv生成含有BiP信号序列、CD8α铰链区和细胞内CD28、4-1BB和CD3ζ信号传导部分的第三代鼠类CAR构建体(5F9.m28BBz)，并将其插入逆转录病毒构建体中(图1的图C)。编码对照m28BBz或5F9.m28BBz CAR的逆转录病毒用于转导鼠类T细胞，转导效率为约35-45％(由GFP转导标志物定量)(图1的图D)。通过将CAR-T细胞与递增浓度的纯化6xHis标记的hGUCY2CECD温育，然后用标记的α5xHis抗体进行检测并通过流式细胞术进行评估来定量的hGUCY2C结合亲合力(Kav＝11.2nM)和CAR表达(Bmax＝957.8MFI)与显示对小鼠GUCY2C(12)具有功能反应性的CAR相当(图1的图D-E和SEQ ID NO:1)。
hGUCY2C CAR介导T细胞活化和效应子功能
与非转导细胞相比，用对照m28BBz或hGUCY2C特异性5F9.m28BBz CAR构建体转导纯化的小鼠CD8+T细胞对T细胞表型没有影响(图2的图B)，产生了记忆和效应子表型的混合物[Tn/scm(CD62L+CD45RA+)、Tcm(CD62L+CD45RA-)、Tem(CD62L-CD45RA-)和Temra(CD62L-CD45RA+)]，类似于在IL2存在下产生的CAR-T细胞中的其它CAR构建体。hGUCY2C特异性而非对照的CAR-T细胞在用固定的hGUCY2CECD蛋白或CT26.hGUCY2C细胞(图6和图7的图A和图B)刺激时上调了活化标志物CD25、CD69和CD44(图2的图C)并产生了效应细胞因子IFNγ、TNFα、IL2和MIP1α(图2的图D)。当用BSA或hGUCY2C缺陷型CT26细胞刺激5F9.m28BBz CAR-T细胞时，不存在活化标志物和细胞因子应答，从而证实5F9.m28BBz CAR的T细胞激活具抗原依赖性((图2的图C-D，图6和图7的图A和图B)。尽管5F9.m28BBz CAR-T细胞在体外对hGUCY2C缺陷型CT26细胞没有活性(图2的图E)，但它们表现出时间依赖性的CT26.hGUCY2C细胞杀伤，通过使用电阻抗测定定量(图2的图E)，并在β-半乳糖苷酶释放T细胞的细胞毒性测定中证实(图8的图A和图B)。
hGUCY2C CAR-T细胞对抗转移性结直肠癌
内源性免疫系统可在肿瘤微环境中诱导免疫抑制，并与过继转移的T细胞竞争长期持久性所必需的资源。在这种情况下，例如低剂量全身照射(TBI)或化学疗法的淋巴消耗性调节方案可通过消除免疫抑制细胞并减少对包括IL7和IL15在内的稳态细胞因子的竞争来增强过继转移T细胞的功效。使用具有免疫能力的小鼠模型和非清髓剂量的5Gy全身照射(TBI)来模拟临床治疗方案。具有免疫能力的BALB/c小鼠通过尾静脉接受CT26.hGUCY2C细胞来产生肺转移，随后3天后接受TBI和增加剂量的小鼠CAR-T细胞(图3的图A)。靶向hGUCY2C的5F9.m28BBz而非对照的CAR-T细胞在107个T细胞的剂量下改善了小鼠的存活率(图3的图A)。当癌细胞接种后7天施用时，该剂量也有效(图3的图B)，并且与第7天单剂量相比，第14天施用的第二剂进一步提高了中位存活期(>150天对93.5天，p<0.05；图3的图C)。癌细胞接种后18天(治疗后11天)收集的肺中含有肿瘤结节，证实对照小鼠死于肺转移，而5F9.m28BBz CAR-T细胞治疗消除了肉眼可见的肿瘤(图3的图D)。为了确定存活的小鼠是否对表达hGUCY2C的肿瘤表现出持续的保护作用，通过尾静脉注射用亲本CT26或CT26.hGUCY2C细胞攻击长期存活者(最初癌细胞接种后161-282天)以检查hGUCY2C特异性保护(图3的图E)。已知CT26肿瘤带有源自鼠类白血病病毒的gp70包膜蛋白，所述蛋白在一些疫苗接种方案中产生保护性gp70特异性CD8+ T细胞应答。用亲本CT26癌细胞攻击的长期存活和初始小鼠表现出相同的死亡率，这表明长期存活者并未对gp70或CT26细胞中表达的其它抗原产生保护性免疫应答(图3的图E)。相反，与初始对照小鼠相比，长期存活者被保护免受CT26.hGUCY2C癌细胞的侵害，表明5F9.m28BBz CAR-T细胞对表达hGUCY2C的肿瘤产生持久的保护作用(图3的图E)。
hGUCY2C CAR-T细胞识别人类结直肠肿瘤
接下来，确定hGUCY2C CAR-T细胞是否识别人类结直肠肿瘤上的天然hGUCY2C。重组hGUCY2C特异性抗体5F9在表达GUCY2C的T84(图4的图A)、而非GUCY2C缺陷型SW480(图9的图A)的人类结直肠癌细胞上对hGUCY2C染色。相应地，5F9.m28BBz CAR-T细胞以时间依赖性方式在体外裂解了T84(图4的图B)而非SW480(图9的图B)癌细胞。对照CAR-T细胞不杀伤任何人类癌细胞类型，表明杀伤具抗原依赖性(图4的图A和图9的图A)。表达人类5F9 CAR构建体(5F9.h28BBz)的人类T细胞在GUCY2C刺激后产生效应细胞因子，并杀伤内源性表达hGUCY2C的人类结直肠癌细胞(图10的图A-C)。表达hGUCY2C特异性(5F9.m28BBz)而非对照CAR的小鼠T细胞在腹膜转移模型中有效治疗T84人类结直肠肿瘤异种移植物(图4的图C-E)。总之，这些数据表明用5F9 scFv产生的hGUCY2C特异性CAR构建体可重定向T细胞介导的内源性表达hGUCY2C的人类结直肠肿瘤的杀伤。
靶向结直肠肿瘤抗原的过继性T细胞疗法已受到抗原“中靶、非肿瘤”毒性的限制。GUCY2C先前已被验证为在完全同源小鼠模型中CAR-T细胞治疗的潜在靶标，其中靶向小鼠GUCY2C的CAR在对正常表达GUCY2C的肠上皮没有毒性的情况下增强了抗肿瘤功效。在此，人类GUCY2C特异性CAR由抗体产生，所述抗体目前在表达GUCY2C的恶性肿瘤(NCT02202759、NCT02202785)的临床试验中用作抗体-药物缀合物，并证明了其诱导T细胞活化、效应子功能以及使用鼠类T细胞在同源和人类结直肠肿瘤异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效的能力。由5F9 scFv产生的CAR不会与鼠类GUCY2C发生交叉反应(图11的图A和图B)，从而无法量化小鼠模型中的肠毒性。尽管有鼠类GUCY2C CAR-T细胞安全性数据，但此处描述的CAR的抗原识别结构域与先前描述的鼠类CAR的差异以及小鼠与人类之间的固有差异提示在对人类施用GUCY2C CAR-T细胞时要谨慎。因此，在将GUCY2C CAR-T细胞转化用于临床时应考虑采取适当的安全措施，包括通过mRNA电穿孔或并入自杀基因来瞬时表达CAR。然而，靶向GUCY2C的CAR-T细胞是T细胞疗法武器库的有吸引力的工具，是由于缺乏合适的抗原靶标而受到限制的范例。随着人类T细胞系统的进一步发展和人类临床试验的转化，GUCY2C CAR-T细胞疗法可能会改变转移性胃肠道恶性肿瘤的治疗，这种疾病的治疗选择有限，在美国每年产生＞140,000例死亡。
实施例2
转移可与多种治疗方法结合，包括细胞因子施用(主要是IL-2)，CMA指导的疫苗接种和/或抗体疗法，化学疗法，用环磷酰胺和氟达拉滨全身照射(TBI)进行的宿主制备性淋巴衰竭以及其它潜在的辅助治疗。
参考文献
Maude SL，Frey N，Shaw PA，Aplenc R，Barrert DM，Bunin NJ，et al.Chimericantigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia，N Engl J Med2014；371(16)：1507-17 doi 10.1056/NEJMoa1407222.
Lee DW，Kochenderfer JN，Stetler-Stevenson M，Cui YK，Delbrook C，FeldmanSA，et al.T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acutelymphoblastic leukaemia ia children and young adults：a phase 1 dose-escalation trial.Lancet 2015：385(9967)：517-28 doi 10，1016/S0140-6736(14)61403-3.
Louis CU，Savoldo B，Dotti G，Pule M，Yvon E，Myers GD，et al.Antitumoractivity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells inpatienis with neuroblastoma.Blood 2011；118(23)：6050-6 doi 10.1182/blood-2011-05-354449.
Parkhurst MR，Yang JC，Langan RC，Dudley ME，Nathan DA，Feldman SA，et al.Tcells targeting carcinoembryonic antigen can mediate regression of metastaticcolorectal cancer but induce severe transient colitis.Mol Ther 2011；19(3)：620-6 doi 10.1038/mt.2010.272.
Morgan RA，Yang JC，Kitano M，Dudley ME，Laurencot CM，Rosenberg SA.Casereport of a serious adverse event following the administration of T cellstransduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2.Mol Ther 2010；18(4)：843-51 doi mt201024[pii]10.1038/mt.2010.24.
Aka AA，Rappaport JA，Pattison AM，Sato T，Snook AE，Waldman SA.Guanylatecyclase C as a target for prevention，detection，and therapy in colorectalcancer.Expert review of clinical pharmacology 2017；10(5)：549-57 doi 10.1080/17512433，2017，1292124.
Valentino MA，Lin JE，Snook AE，Li P，Kim GW，Marszalowicz G，et al，Auroguanylin-GUCY2C endocrine axis regulates feeding in mice，J Clin Invest2011；121(9)：3578-88 doi 10.1172/JCI57925.
Carrithers SL，Barber MT，Biswas S，Parkinson SJ，Park PK，Goldstein SD，etal.Guanylyl cyclase C is a selective marker for metastatic colorectal tumorsin human extraintestinal tissnes.Proc Natl Acad Sci U S A 1996；93(25)：14827-32.
Birbe R，Palazzo JP，Walters R，Weinberg D，Schulz S，Waldman SA.Guanylylcyclase C is a marker of intestinal metaplasia，dysplasia，and adenocarcinomaof the gastrointestinal traci.Hum Pathol 2005；36(2)：170-9 doi 10.1016/j.humpath.2004.12.002.
Wolfe HR，Mendizabal M，Lleong E，Cuthbertson A，Desai V，Pullan S，etal.In vivo imaging of human colon cancer xenografts in immunodeficient miceusing a guanylyl cyclase C--specific ligand.J Nucl Med 2002；43(3)：392-9.
CoradiniD，Casarsa C，Oriana S.Epithelial cell polarity andtumorigenesis：new perspectives for cancer detection and treatment.ActaPharmacol Sin 2011；32(5)：552-64 doi 10.1038/aps.2011.20.
Magee MS，Kraft CL，Abraham TS，Baybutt TR，Marszalowicz GP，Li P，etal.GUCY2C-direcied CAR-T cells oppose colorectal cancer metastases withoutautoimmunity.Oncoimmunology 2016；5(10)：e1227897 doi 10.1080/2162402x.2016.1227897.
Marszalowicz GP，Snook AE，Magee MS，Merlino D，Berman-Booty LD，WaldmanSA.GUCY2C lysosomotropic endocytosis delivers immunotoxin therapy tometastatic colorectal cancer.Oncotarget 2014；5(19)：9460-71doi 10，18632/oncotarget.2455.
Snook AE，Li P，Stafford BJ，Faul EJ，Huang L，Birbe RC，et al.Lineagespecific T-cell responses to cancer mucosa antigen oppose systemic metastaseswithout mucosal inflammaiory disease，Cancer Res 2009；69(8)：3537-44 doi 10，1158/0008-5472.CAN-08-3386.
Snook AE，Magee MS，Schulz S，Waldman SA.Selective antigen-specific CD4(+)T-cell，but not CD8(+)T-or B-cell，tolerance corrupts cancerimmunotberapy.Eur J Immunol 2014；44(7)：1956-66 doi 10.1002/eji，201 444539.
Hodson CA，Ambrogi IG，Scou RO，Mohler PJ，Milgram SL，Polarized apicalsorting of guanylyl cyclase C is specified by a cytosolicsignal.Traffic 2006；7(4)：456-64 doi TRA398[pii]10.1111/j.1600-0854.2006.00398.x.
Charney AN，Egnor RW，Alexander-Chacko JT，Zaharia V，Mann EA，GiannellaRA.Effect of E，coli heat-stable enterotoxin on colonic transport in guanylyIcyclase C recepior-deficient mice.Am J Physiol Gasirointest Liver Physiol2001；280(2)：G216-21.
Kuhn M，Adermann K，Jahne J，Forssmann WG，RechkemmerG，Segmentaldifferences in the effects ofguanylin and Escherichia coli heat stableenterotoxin on Cl-secretion in human gut，The Journal of Physiology 1994；479(Pi 3)：433-40.
Guarino A，Cohen MB，Overmann G，Thompson MR，Giannella RA.Binding ofE.coli heat-stable enterotoxin to rat intestinal brush borders and tobasolateral membranes，Dig Dis Sci 1987；32(9)：1017-26.
Witek ME，NielsenK，Walters R，Hyslop T，Palazzo J，Schulz S，et al.Theputative tumor suppressor Cdx2 is overexpressed by human colorectaladenocarcinomas.Clin Cancer Res 2005；11(24 Pt 1)：8549-56 doi 10.1158/1078-0432.CCR-05-1624.
Liu X，Jiang S，Fang C，Yang S，Olalere D，Pequignot EC，et al.Affinity-TunedErbB2 or EGFR Chimeric Antigen Receptor T Cells Exhibit an IncreasedTherapeuticIndex against Tumors in Mice，Cancer Res 2015；75(17)：3596-607 doi10.1158/0008-5472.CAN-15-0159.
Mule JJ，Shu.S，Schwarz SL，Rosenberg SA.Adoptive immunotherapy ofestablished pulmonary metasiases with LAK cells and recombinant interleukin-2.Science 1984；225(4669)：1487-9.
Shultz LD，Lyons BL，Burzenski LM，Gott B，Chen X，Chaleff S，et al.Humanlymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null miceengrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.J Immunol 2005；174(10)：6477-89
Xu XJ，Song DG，Poussin M，Ye Q，Sharma P，Rodriguez-Garcia A，etal.Maltiparameter comparaive analysis reveals differential impacts of variouscyiokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.Oncotarget2016 doi 10.18632/oncotarget.10510.
Muranski P，Boni A，Wrzesinski C，Citrin DE，Rosenberg SA，Childs R，etal.Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far canwe go？Nat Clin Pracl Oncol 2006；3(12)：668-81 doi 10，1038/ncponc0666.
Gattinoni L，Finkelstein SE，Klebanoff CA，Antony PA，Palmer DC，SpiessPJ；et al，Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhancesthe efficacy of adoptively transferred iumor-specific CD8+ T cells.J Exp Med2005；202(7)：907-12 doi 10.1084/jem 20050732.
Huang AY，Gulden PH，Woods AS，Thomas MC，Tong CD，Wang W，et al.Theimmanodorninant major histocompatibility complex class l-restricied antigenof a murine colon tumor derives from an endogenous retroviral gene productProc Natl Acad Sci U S A 1996；93(18)：9730-5.
BeattyGL，Haas AR，Maus MV，Torigian DA，Soulen MC，Plesa G，etal.Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mRNA-engineered T cellsinduce anti-tumor activity in solid malignancies.Cancer Immunol Res 2014；2(2)：112-20 doi 10，1158/2326-6066.CIR-13-0170.
Casucci M，Bondauza A.Suicide gene therapy to increase the safety ofchimeric antigen receptor-redirected T lymphocytes.J Cancer 2011；2：378-82.
Rosenberg SA，Decade in review-cancer immunotherapy：Entering themainstream of cancer treaument.Nature reviews Clinical oncology 2014 doi10.1038/nrclinonc.2014.174.
序列表
<110> 托马斯杰斐逊大学(Thomas Jefferson University)
<120> 抗GUCY2C嵌合抗原受体组合物和方法
<130> 100051.19302
<150> 62/643,850
<151> 2018-03-16
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有人源序列的合成CAR-T
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1671)
<223> 用于人类CAR-T细胞表达的5F9.28BBz CAR构建体
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(66)
<223> hGMCSFRa信号肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(822)
<223> 5F9抗GUYC2C scFv
<220>
<221> misc_feature
<222> (829)..(1008)
<223> CD8铰链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1009)..(1215)
<223> CD28 TM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1216)..(1332)
<223> 4-1BB细胞内-信号转导结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1333)..(1671)
<223> CD3ζ细胞内-信号转导结构域ITAM
<400> 1
atg ctg ctg ctc gtg aca tct ctg ctg ctg tgc gag ctg ccc cac ccc 48
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
gcc ttt ctg ctg atc ccc gat atc gag atc gtg atg acc cag agc ccc 96
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
20 25 30
gcc acc ctg agt gtg tct cca ggc gaa aga gcc acc ctg tcc tgc aga 144
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
35 40 45
gcc agc cag agc gtg tcc aga aac ctg gcc tgg tat cag cag aag ccc 192
Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag gct ccc cgg ctg ctg atc tat ggc gcc agc aca aga gcc aca 240
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
65 70 75 80
ggc atc ccc gcc aga ttt tcc ggc tct ggc agc ggc acc gag ttc acc 288
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
85 90 95
ctg aca atc ggc agc ctg cag tcc gag gac ttc gcc gtg tac tac tgc 336
Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
cag cag tac aag acc tgg ccc cgg acc ttt ggc cag ggc acc aac gtg 384
Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val
115 120 125
gaa atc aag gcc tct ggc ggc gga gga tct ggg gga ggc gga agc gga 432
Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
ggc gga gga agt ggc gga ggg gga tct gaa ctg cag gtg cag ctg cag 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln
145 150 155 160
cag tgg gga gcc gga ctg ctg aag cct agc gag aca ctg agc ctg acc 528
Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr
165 170 175
tgc gcc gtg ttc ggc ggc agc ttc agc ggc tac tac tgg tcc tgg atc 576
Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile
180 185 190
aga cag ccc cct ggc aag ggc ctg gaa tgg atc ggc gag atc aac cac 624
Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His
195 200 205
cgg ggc aac acc aac gac aac ccc agc ctg aag tcc aga gtg acc atc 672
Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile
210 215 220
agc gtg gac acc agc aag aac cag ttc gcc ctg aag ctg agc agc gtg 720
Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val
225 230 235 240
aca gcc gcc gat acc gcc gtg tat tat tgc gcc aga gag cgg ggc tac 768
Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr
245 250 255
acc tac ggc aac ttc gac cac tgg ggc cag gga acc ctc gtg acc gtg 816
Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
tct agc gag ctc ctg agc aac agc atc atg tac ttc agc cac ttc gtg 864
Ser Ser Glu Leu Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val
275 280 285
ccc gtg ttt ctg ccc gcc aag cct acc aca acc cct gcc cct aga cct 912
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
290 295 300
cct acc cca gcc cct aca atc gcc tcc cag cct ctg tct ctg agg ccc 960
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
305 310 315 320
gag gct tgt aga cct gct gct ggc gga gcc gtg cac acc aga gga ctg 1008
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
325 330 335
ttt tgg gtg ctg gtg gtc gtg ggc gga gtg ctg gcc tgt tac agc ctg 1056
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
340 345 350
ctc gtg act gtg gcc ttc atc atc ttt tgg gtg cgc agc aag cgg agc 1104
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
355 360 365
aga ctg ctg cac agc gac tac atg aac atg acc ccc aga cgg cca ggc 1152
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
370 375 380
ccc acc aga aag cac tac cag cct tac gcc cct ccc cgg gat ttc gcc 1200
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
385 390 395 400
gcc tac aga agc ggc aga aag aag ctg ctg tac atc ttc aag cag ccc 1248
Ala Tyr Arg Ser Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
405 410 415
ttc atg cgg ccc gtg cag acc acc cag gaa gag gac ggc tgc tcc tgc 1296
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
420 425 430
aga ttc ccc gag gaa gaa gaa ggc ggc tgc gag ctg aga gtg aag ttc 1344
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
435 440 445
agc aga tcc gcc gac gcc cct gcc tat cag cag ggc cag aac cag ctg 1392
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
450 455 460
tac aac gag ctg aac ctg ggc aga cgg gaa gag tac gac gtg ctg gac 1440
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
465 470 475 480
aag cgg aga ggc agg gac cct gag atg ggc gga aag ccc cag aga aga 1488
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
485 490 495
aag aac ccc cag gaa ggc ctg tat aac gaa ctg cag aaa gac aag atg 1536
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
500 505 510
gcc gag gcc tac agc gag atc gga atg aag ggc gag cgg aga aga ggc 1584
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
515 520 525
aag gga cac gac ggc ctg tac cag gga ctg agc acc gcc acc aag gac 1632
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
530 535 540
acc tac gac gcc ctg cac atg cag gcc ctg ccc ccc aga 1671
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550 555
<210> 2
<211> 557
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
35 40 45
Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val
115 120 125
Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln
145 150 155 160
Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr
165 170 175
Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile
180 185 190
Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His
195 200 205
Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile
210 215 220
Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val
225 230 235 240
Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr
245 250 255
Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Glu Leu Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val
275 280 285
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
290 295 300
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
305 310 315 320
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
325 330 335
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
340 345 350
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
355 360 365
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
370 375 380
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
385 390 395 400
Ala Tyr Arg Ser Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
405 410 415
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
420 425 430
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
435 440 445
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
450 455 460
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
465 470 475 480
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
485 490 495
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
500 505 510
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
515 520 525
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
530 535 540
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550 555
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFV的合成接头序列
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFV的合成接头序列
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFV的合成接头序列
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFV的合成接头序列
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFV的合成接头序列
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 8
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VL-L2-VH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(109)
<223> 5F9可变轻链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(119)
<223> 接头G4S-2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (120)..(240)
<223> 5F9可变重链片段
<400> 8
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp
115 120 125
Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala
130 135 140
Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln
145 150 155 160
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly
165 170 175
Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val
180 185 190
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
195 200 205
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr
210 215 220
Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
<210> 9
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VL-L3-VH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(109)
<223> 5F9可变轻链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(124)
<223> 接头G4S-3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (125)..(245)
<223> 5F9可变重链片段
<400> 9
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp
145 150 155 160
Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
165 170 175
Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
180 185 190
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
210 215 220
Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 10
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VL-L4-VH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(109)
<223> 5F9可变轻链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(129)
<223> 接头G4S-4
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (130)..(250)
<223> 5F9可变重链片段
<400> 10
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
130 135 140
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe
145 150 155 160
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro
180 185 190
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
195 200 205
Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 11
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VL-L5-VH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(109)
<223> 5F9可变轻链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(134)
<223> 接头G4S-5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (135)..(255)
<223> 5F9可变重链片段
<400> 11
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly
130 135 140
Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val
145 150 155 160
Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro
165 170 175
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn
180 185 190
Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
195 200 205
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
210 215 220
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly
225 230 235 240
Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
<210> 12
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VH-L2-VL
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> 5F9可变重链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (122)..(131)
<223> 接头G4S-2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (132)..(240)
<223> 5F9可变轻链片段
<400> 12
Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val
130 135 140
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
145 150 155 160
Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser
195 200 205
Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr
210 215 220
Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser
225 230 235 240
<210> 13
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VH-L3-VL
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> 5F9可变重链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (122)..(136)
<223> 接头G4S-3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (137)..(245)
<223> 5F9可变轻链片段
<400> 13
Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Ala Ser
245
<210> 14
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VH-L4-VL
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> 5F9可变重链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (122)..(141)
<223> 接头G4S-4
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (142)..(250)
<223> 5F9可变轻链片段
<400> 14
Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Leu Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala
180 185 190
Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser
245 250
<210> 15
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体scFv VH-L5-VL
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> 5F9可变重链片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (122)..(146)
<223> 接头G4S-5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (147)..(255)
<223> 5F9可变轻链片段
<400> 15
Glu Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
145 150 155 160
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
165 170 175
Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
180 185 190
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu
210 215 220
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp
225 230 235 240
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Ala Ser
245 250 255

Claims (39)

1.一种蛋白质，所述蛋白质包含选自由以下组成的组的5F9抗GCC scFV序列：SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15。
2.如权利要求1所述的蛋白质，所述蛋白质还包含信号序列、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。
3.如权利要求2所述的蛋白质，所述蛋白质还包含信号序列、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。
4.如权利要求3所述的蛋白质，其中所述信号序列选自由以下组成的组：GM-CSF信号序列、CD8α信号序列、CD8β信号序列、CD4信号序列、TCRα信号序列、TCRβ信号序列、CD3δ信号序列、CD3ε信号序列、CD3γ信号序列、CD28信号序列和BiP信号序列。
5.如权利要求2至4中任一项所述的蛋白质，其中所述铰链区选自由以下组成的组：CD8α铰链区、IgG1-Fc铰链区、IgG4-Fc铰链区和CD28铰链区。
6.如权利要求2至5中任一项所述的蛋白质，其中所述跨膜区选自由以下组成的组：CD8α跨膜区、IgG1-Fc跨膜区、IgG4-Fc跨膜区和CD28跨膜区。
7.如权利要求2至6中任一项所述的蛋白质，其中所述信号传导结构域选自由以下组成的组：CD28信号传导结构域、4-1BB(CD137)信号传导结构域、CD2信号传导结构域、CD27信号传导结构域、CD30信号传导结构域、CD40L信号传导结构域、CD79A信号传导结构域、CD79B信号传导结构域、CD226信号传导结构域、DR3信号传导结构域、GITR信号传导结构域、HVEM信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、LIGHT信号传导结构域、OX40信号传导结构域和SLAM信号传导结构域。
8.如权利要求2至7中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质还包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
9.如权利要求8所述的蛋白质，所述蛋白质包含细胞内序列，所述细胞内序列包括来自CD3ζ、CD79-α、CD79-β或Fc受体的ITAM。
10.如权利要求1-9中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质还包含亲和标签。
11.如权利要求1所述的蛋白质，所述蛋白质还包含CD8α铰链结构域、CD28跨膜结构域和包含4-1BB细胞内序列和CD3ζ细胞内序列的信号传导结构域。
12.如权利要求11所述的蛋白质，所述蛋白质还包含GM-CSF信号序列。
13.如权利要求12所述的蛋白质，所述蛋白质具有SEQ ID NO:2。
14.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求1-12中任一项所述的蛋白质的核酸序列。
15.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求12所述的蛋白质的核酸序列。
16.如权利要求15所述的核酸分子，其中编码所述蛋白质的核酸序列可操作地连接至调节元件以在人类T细胞中表达。
17.一种重组细胞，所述重组细胞包含如权利要求16所述的核酸分子。
18.一种重组T细胞，所述重组T细胞包含如权利要求16所述的核酸分子。
19.如权利要求13所述的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1。
20.如权利要求19所述的核酸分子，其中SEQ ID NO:1可操作地连接至调节元件以在人类T细胞中表达。
21.一种重组细胞，所述重组细胞包含如权利要求20所述的核酸分子。
22.一种重组T细胞，所述重组T细胞包含如权利要求20所述的核酸分子。
23.一种重组细胞，所述重组细胞包含如权利要求15所述的核酸分子。
24.一种重组T细胞，所述重组T细胞包含如权利要求15所述的核酸分子。
25.一种重组细胞，所述重组细胞包含如权利要求1-15中任一项所述的蛋白质。
26.一种重组T细胞，所述重组T细胞包含如权利要求1-15中任一项所述的蛋白质。
27.一种重组细胞，所述重组细胞包含如权利要求11所述的蛋白质。
28.一种重组T细胞，所述重组T细胞包含如权利要求11所述的蛋白质。
29.一种重组细胞，所述重组细胞包含如权利要求13所述的蛋白质。
30.一种重组T细胞，所述重组T细胞包含如权利要求13所述的蛋白质。
31.一种治疗患有具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用多个如权利要求17、18和21至30中任一项所述的重组细胞的步骤。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述多个重组细胞是多个重组T细胞。
33.一种治疗患有具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的患者的方法，所述方法包括以下步骤：从所述患者中分离T细胞；用如权利要求20所述的核酸分子转化所述T细胞，以产生表达SEQ ID NO:1并包含SEQ ID NO:2作为膜结合蛋白的转化T细胞群体，扩增所述转化T细胞群体以产生多个转化T细胞，以及向所述患者施用多个重组T细胞。
34.如权利要求31或33中任一项所述的方法，其中在从所述患者中分离细胞之前，从所述患者中分离癌细胞样品，以及在所述癌细胞上检测GUCY2C。
35.一种在被鉴定为风险增加的患者中预防具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用多个如权利要求17、18和21至30中任一项所述的重组细胞的步骤。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述多个重组细胞是多个重组T细胞。
37.一种在被鉴定为风险增加的患者中预防具有表达GUCY2C的癌细胞的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：从所述患者中分离T细胞；用如权利要求20所述的核酸分子转化所述T细胞，以产生表达SEQ ID NO:1并包含SEQ ID NO:2作为膜结合蛋白的转化T细胞群体，扩增所述转化T细胞群体以产生多个转化T细胞，以及向所述患者施用多个重组T细胞。
38.一种制备多个如权利要求21所述的重组细胞的方法，所述方法包括以下步骤：从个体中分离细胞；用编码SEQ ID NO:2的核酸分子转化所述细胞，所述核酸分子可操作地连接至在细胞中起作用的调节元件，以产生包含SEQ ID NO:2作为膜结合蛋白的转化细胞群体，以及扩增所述转化细胞群体以产生多个重组细胞。
39.一种制备多个如权利要求22所述的重组T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：从个体中分离T细胞；用编码SEQ ID NO:2的核酸分子转化所述T细胞，所述核酸分子可操作地连接至在T细胞中起作用的调节元件，以产生包含SEQ ID NO:2作为膜结合蛋白的转化T细胞群体，以及扩增所述转化T细胞群体以产生多个重组T细胞。
CN201980026298.4A 2018-03-16 2019-03-16 抗gucy2c嵌合抗原受体组合物和方法 Pending CN112004552A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862643850P 2018-03-16 2018-03-16
US62/643,850 2018-03-16
PCT/US2019/022645 WO2019178580A1 (en) 2018-03-16 2019-03-16 Anti-gucy2c chimeric antigen receptor compositions and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112004552A true CN112004552A (zh) 2020-11-27

Family

ID=67908473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980026298.4A Pending CN112004552A (zh) 2018-03-16 2019-03-16 抗gucy2c嵌合抗原受体组合物和方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210038648A1 (zh)
EP (1) EP3765078A4 (zh)
JP (2) JP2021520229A (zh)
KR (1) KR20210011909A (zh)
CN (1) CN112004552A (zh)
AU (1) AU2019236307A1 (zh)
CA (1) CA3093705A1 (zh)
WO (1) WO2019178580A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116751303A (zh) * 2022-12-09 2023-09-15 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体及其应用
WO2024061170A1 (zh) * 2022-09-19 2024-03-28 广东菲鹏制药股份有限公司 抗人鸟苷酸环化酶c抗体及其试剂盒和应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021205325A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-14 Pfizer Inc. Anti-gucy2c antibodies and uses thereof
TW202237638A (zh) * 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
AU2022253202A1 (en) * 2021-04-07 2023-09-28 Lg Chem, Ltd. Gucy2c binding polypeptide and uses thereof
US11970548B2 (en) 2021-08-27 2024-04-30 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Nanobody target GCC and uses in chimeric antigen receptor cell therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017167217A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
CN107236762A (zh) * 2017-06-19 2017-10-10 河北浓孚雨生物科技有限公司 一种微环dna转染t细胞制备临床级car‑t细胞制剂的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120251509A1 (en) * 2009-10-22 2012-10-04 Waldman Scott A Cell-based anti-cancer compositions and methods of making and using the same
NZ623607A (en) * 2009-10-23 2016-07-29 Millennium Pharm Inc Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017167217A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
CN107236762A (zh) * 2017-06-19 2017-10-10 河北浓孚雨生物科技有限公司 一种微环dna转染t细胞制备临床级car‑t细胞制剂的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL S MAGEE 等: "UCY2C-directed CAR-T cells oppose colorectal cancer metastases without autoimmunity", 《ONCOIMMUNOLOGY》, vol. 5, no. 10, pages 2 *
姚镇东 等: "鸟苷酸环化酶C在结直肠癌诊治中的研究进展", 《胃肠病学》, vol. 21, no. 10, pages 626 - 628 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024061170A1 (zh) * 2022-09-19 2024-03-28 广东菲鹏制药股份有限公司 抗人鸟苷酸环化酶c抗体及其试剂盒和应用
CN116751303A (zh) * 2022-12-09 2023-09-15 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体及其应用
CN116751303B (zh) * 2022-12-09 2023-12-26 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210011909A (ko) 2021-02-02
JP2024041780A (ja) 2024-03-27
AU2019236307A1 (en) 2020-10-22
JP2021520229A (ja) 2021-08-19
WO2019178580A1 (en) 2019-09-19
US20210038648A1 (en) 2021-02-11
EP3765078A1 (en) 2021-01-20
CA3093705A1 (en) 2019-09-19
EP3765078A4 (en) 2021-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7004470B2 (ja) Ｃｄ－１９を標的とするキメラ抗原受容体
ES2928296T3 (es) Receptores de antígenos quiméricos anti-antígenos de maduración de linfocitos B con dominios humanos
AU2017366739B2 (en) Synthetic immune receptors and methods of use thereof
CN112004552A (zh) 抗gucy2c嵌合抗原受体组合物和方法
US11976117B2 (en) T cell-antigen coupler with various construct optimizations
JP7198670B2 (ja) 免疫調整性ｉｌ２ｒ融合タンパク質およびその使用
Ma et al. Anti‐prostate specific membrane antigen designer T cells for prostate cancer therapy
US11878035B2 (en) T cell-antigen coupler with various construct optimizations
JP7404279B2 (ja) 様々な構築物最適化を備えたｔ細胞抗原カプラ
TW202108620A (zh) 靶向ｂｃｍａ的工程化免疫細胞及其用途
US20180230219A1 (en) Vegfr-2 car immune cells to treat cancers
JP2021501567A (ja) Ｙ１８２ｔ突然変異を有するｔ細胞−抗原カプラおよびその方法ならびに使用
US11707486B2 (en) Natural killer cell expressing anti-cotinine chimeric antigen receptor
US20210260125A1 (en) Anti-slamf7 chimeric antigen receptors
WO2023125975A1 (zh) 一种新型靶向人flt3的嵌合抗原受体修饰的t细胞的构建及应用
CN116348483A (zh) 嵌合t细胞受体，核酸及其制造和使用方法
EA045368B1 (ru) Связывающий t-клетку с антигеном агент с различной оптимизацией конструкций
CN117794951A (zh) Claudin 18.2 T细胞抗原偶联物及其用途
CN111714618A (zh) T细胞和高亲和力pd-1融合蛋白的组合

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination