KR20200103679A - 양이온성 지질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 활성 성분, 특히 핵산을 우수한 효율로 세포에 도입하는 것을 가능하게 하는 기술 및 이에 사용되는 양이온성 지질 등을 제공한다. 본 발명에 따른 화합물 또는 그 염은 하기 식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그 염이고, 식 중 n은 2 내지 5의 정수를, R은 직쇄상 C1-5 알킬기, 직쇄상 C7-11 알케닐기 또는 직쇄상 C11 알카디에닐기를, 파선은 각각 독립적으로 시스형 또는 트랜스형의 결합을 나타낸다.

Description

양이온성 지질
본 발명은 활성 성분으로서의 핵산을 다종류의 세포, 조직 또는 장기에 도입하는 것을 가능하게 하는 양이온성 지질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자 및 그 지질 입자와 핵산을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
최근 활성 성분으로서 핵산을 함유하는 핵산 의약의 연구개발이 활발히 이루어지고 있다. 예를 들어 siRNA, miRNA, miRNA mimic 또는 안티센스 핵산 등의 핵산을 포함하는 표적 mRNA의 분해 작용이나 기능 억제 작용을 갖는 핵산 의약의 연구가 다수 이루어지고 있다. 또한 목적 단백질을 코드하는 mRNA 등을 포함하는 목적 단백질을 세포 내에서 발현시키기 위한 핵산 의약 연구도 이루어지고 있다. 이러한 연구 개발과 관련하여 핵산을 고효율로 세포, 조직 또는 장기에 도입하기 위한 기술이 약물 송달계(DDS) 기술로서 개발되고 있다.
상기 DDS 기술로서는, 핵산과 지질을 혼합하여 복합체를 형성한 후, 상기 복합체를 통해 핵산을 세포에 흡수시키는 기술이 종래부터 알려져 있다. 상기 복합체 형성에 사용되는 지질로서는 양이온성 지질, 친수성 폴리머 지질, 헬퍼 지질 등이 종래부터 알려져 있다. 상기 양이온성 지질로서는, 예를 들어 다음과 같은 선행 기술 문헌에 기재된 화합물이 알려져 있다.
특허 문헌 1에는 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 그 염 등이 기재되어 있다.
Figure pct00001
식 중 R1은 각각 독립적으로 치환되어 있어도 되는 C8 내지 C24 알킬 및 치환되어 있어도 좋은 C8 내지 C24 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 치환되어 있어도 좋은 C1 내지 C8 알킬, 치환되어 있어도 좋은 아릴알킬 등으로 이루어진 군으로부터 선택되고; Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 수소, 치환되어 있어도 좋은 C1 내지 C6 알킬, 치환되어 있어도 좋은 알킬알킬 등으로 이루어진 군 중에서 선택되고, Y3은 존재하는 경우는 각각 독립적으로 수소, 치환되어 있어도 좋은 C1 내지 C8 알킬, 치환되어 있어도 좋은 아릴알킬 등으로 이루어진 군으로부터 선택되고; m은 1 내지 4 중 어느 정수이고, n은 0 내지 3 중 어느 정수이고, p는 0 또는 1이며, m, n 및 p의 합계는 4이고; k는 1 내지 5 중 어느 정수이고; q는 0 또는 1인 것 등이 규정되어 있다.
특허 문헌 2에는 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 그 염 등이 기재되어 있다.
Figure pct00002
식 중, W는 식 -NR1R2 또는 식 -N+R3R4R5(Z-)를 나타내고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-4알킬기 또는 수소 원자를 나타내고, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 C1-4알킬기를 나타내며, Z-는 음이온을 나타내고, X는 치환되어 있어도 좋은 C1-6알킬렌기를 나타내고, YA, YB 및 YC는 각각 독립적으로 치환되어 있어도 좋은 메틴기를 나타내고, LA, LB 및 LC 는 각각 독립적으로 치환되어 있어도 좋은 메틸렌기 또는 결합수를 나타내고, RA1 , RA2 , RB1 , RB2 , RC1 및 RC2 는 각각 독립적으로 치환되어 있어도 좋은 C4-10 알킬기를 나타낸다.
WO 2003/102150호 팸플릿 WO 2016/021683호 팸플릿
핵산을 높은 효율로 세포에 도입하는 것을 가능하게 하는 양이온성 지질은 약효 발현, 안전성(저독성) 등의 측면에서 우수한, 치료상 우수한 효과를 갖는 핵산 의약의 창출에 기여할 것으로 기대된다. 또한 핵산을 다양한 세포에 도입하는 것을 가능하게 하는 양이온성 지질은 다양한 조직에서 발생하는 각종 질환에 대한 핵산 의약의 창출을 가능하게 할 것으로 기대된다. 그러나, 현재 상태로서는, 이것들을 충분히 만족할 수 있는 것은 발견되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 핵산을 우수한 효율로 세포에 도입하는 것을 가능하게 하는 기술 및 이것에 사용되는 양이온성 지질 등을 제공하는 것이다. 또 다른 관점에서는 본 발명의 목적은 핵산을 여러 세포에 도입하는 것을 가능하게 하는 기술 및 여기에 사용되는 화합물 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들이 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 그 염을 이용함으로써 상기 과제를 해결 가능하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 적어도 이하의 발명에 관한 것이다.
[1]
식（I）：
Figure pct00003
[식 (I) 중,
n은 2 내지 5의 정수를,
R은 직쇄상 C1-5 알킬기, 직쇄상 C7-11 알케닐기 또는 직쇄상 C11 알카디에닐기를,
파선은 각각 독립적으로 시스형 또는 트랜스형의 결합을 나타낸다.］
[2]
3-((4-(디메틸아미노)부타노일(옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트 또는 그 염.
[3]
3-((5-(디메틸아미노)펜타노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트 또는 그 염.
[4]
3-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트 또는 그 염.
[5]
항 1에 기재된 화합물 또는 그 염을 함유하는 지질 입자.
[6]
핵산 및 항 5에 기재된 지질 입자를 함유하는 핵산 도입용 조성물.
[7]
핵산이 RNA인 항 6에 기재된 조성물.
[7a]
핵산이 DNA인 항 6에 기재된 조성물.
[8]
RNA가 mRNA 또는 siRNA인 항 7에 기재된 조성물.
또한, 본 명세서에서 "식 (I)로 표시되는 화합물"을 "화합물 (I)"이라고 기재하는 수가 있다. 또, "식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그 염"을 "본 발명의 화합물"이라고 하기도 한다. "식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그 염(본 발명의 화합물)을 함유하는 지질 입자"를 "본 발명의 지질 입자"라고 하는 경우가 있다. "핵산 및 본 발명의 지질 입자를 함유하는 핵산 도입용 조성물"을 "본 발명의 조성물"이라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 의해 핵산을 세포, 조직 또는 장기에 대해 우수한 효율로 도입하는 것이 가능해진다. 또한 본 발명에 의해 핵산을 다종류의 세포, 조직 또는 장기(예를 들어 암세포)에 도입하는 것이 가능해진다. 본 발명에 의해 핵산을 다종류의 세포, 조직 또는 장기에 도입하는 의약 또는 연구용 시약을 얻는 것이 가능해진다. 또한 본 발명에 따라 핵산을 세포, 조직 또는 장기에 도입할 경우, 그 핵산이 갖는 활성(예를 들어 약효)의 발현 효율이 높다.
이하, 본 명세서 중에서 이용되는 각 치환기의 정의에 대해 상술한다. 특기하지 않는 한 각 치환기는 이하의 정의를 갖는다.
본 명세서 중, "직쇄상 C1-5 알킬기"로서는, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸을 들 수 있다.
본 명세서 중 "직쇄상 C7-11 알케닐기"로서는, 예를 들어 1-헵테닐, 2-헵테닐, 3-헵테닐, 4-헵테닐, 5-헵테닐, 6-헵테닐, 1-옥테닐, 2-옥테닐, 3-옥테닐, 4-옥테닐, 5-옥테닐, 6-옥테닐, 7-옥테닐, 1-노네닐, 2-노네닐, 3-노네닐, 4-노네닐, 5-노네닐, 6-노네닐, 7-노네닐, 8-노네닐, 1-데세닐, 2-데세닐, 3-데세닐, 4-데세닐, 5-데세닐, 6-데세닐, 7-데세닐, 8-데세닐, 9-데세닐, 1-운데세닐, 2-운데세닐, 3-운데세닐, 4-운데세닐, 5-운데세닐, 6-운데세닐, 7-운데세닐, 8-운데세닐, 9-운데세닐, 10-운데세닐을 들 수있다. 이러한 직쇄상 C7-11 알케닐기는 탄소-탄소 이중 결합을 1개 포함하기 때문에 시스형 및 트랜스형의 구조를 취할 수 있지만, 어느 쪽 구조이어도 좋다.
본 명세서 중 "직쇄상 C11 알카디에닐기"로서는, 예를 들어 1,3-운데카디에닐, 1,4-운데카디에닐, 1,5-운데카디에닐, 1,6-운데카디에닐, 1,7-운데카디에닐, 1,8-운데카디에닐, 1,9-운데카디에닐, 1,10-운데카디에닐, 2,4-운데카디에닐, 2,5-운데카디에닐, 2,6-운데카디에닐, 2,7-운데카디에닐, 2,8-운데카디에닐, 2,9-운데카디에닐, 2,10-운데카디에닐, 3,5-운데카디에닐, 3,6-운데카디에닐, 3,7-운데카디에닐, 3,8-운데카디에닐, 3,9-운데카디에닐, 3,10-운데카디에닐, 4,6-운데카디에닐, 4,7-운데카디에닐, 4,8-운데카디에닐, 4,9-운데카디에닐, 4,10-운데카디에닐, 5,7-운데카디에닐, 5,8-운데카디에닐, 5,9-운데카디에닐, 5,10-운데카디에닐, 6,8-운데카디에닐, 6,9-운데카디에닐, 6,10-운데카디에닐, 7,9-운데카디에닐, 7,10-운데카디에닐, 8,10-운데카디에닐을 들 수있다. 이러한 직쇄상 C11 알카디에닐기는 탄소-탄소 이중 결합을 2개 포함하기 때문에 각각에서 서로 독립적으로 시스형 및 트랜스형의 구조를 취할 수 있지만, 각각 어느 쪽 구조이어도 좋다.
식 (I)에서의 n 및 파선의 바람직한 예는 다음과 같다.
n은 바람직하게는 3 내지 5의 정수이며, 보다 바람직하게는 3이다.
파선은, 바람직하게는 양쪽 모두 시스형의 결합이다.
화합물 (I)의 적합한 구체예는 다음과 같다.
화합물 (A): n이 3 내지 5의 정수이며, R이 시스형의 직쇄상 C7-11 알케닐기이며, 파선이 양쪽 모두 시스형이 되는 결합인 화합물.
화합물 (B): n이 4이며, R이 2개의 탄소-탄소 이중 결합 양쪽에서 시스형의 직쇄상 C11 알카디에닐기이며, 파선이 양쪽 모두 시스형의 결합인 화합물.
화합물 (C): n이 2 또는 3이고, R이 직쇄상 C1-5 알킬기이며, 파선이 양쪽 모두 시스형의 결합인 화합물.
화합물 (I)의 보다 적합한 구체예는 다음과 같다.
화합물 (A1) : n은 3-5의 정수이고, R이 시스형의 5-헵테닐, 7-노네닐 또는 9-운데세닐이며, 파선이 양쪽 모두 시스형이 되는 결합인 화합물.
화합물 (B1) : n이 4이고, R이 2개의 탄소-탄소 이중 결합의 양쪽에서 시스형의 2,5-운데카디에닐이며, 파선이 양쪽 모두 시스형의 결합인 화합물.
화합물 (C1) : n은 2 또는 3이고, R이 메틸, 프로필, 또는 펜틸이며, 파선이 양쪽 모두 시스형의 결합인 화합물.
화합물 (I)의 염으로서는 약리학적으로 허용되는 염이 바람직하며, 예를 들어 무기염기와의 염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염을 들 수 있다.
무기염기와의 염의 적합한 예로서는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염; 알루미늄염, 암모늄염을 들 수 있다. 바람직하게는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염이며 보다 바람직하게는 나트륨염, 칼륨염이다.
유기염기와의 염의 적합한 예로서는 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민[트리스(히드록시메틸)메틸아민], tert-부틸아민, 시클로헥실아민, 벤질아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민과의 염을 들 수 있다.
무기산과의 염의 적합한 예로서는 불화 수소산, 염산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산, 질산, 황산, 인산과의 염을 들 수 있다. 바람직하게는 염산과의 염, 인산과의 염이다.
유기산과의 염의 적합한 예로서는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸말산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산과의 염을 들 수 있다.
염기성 아미노산과의 염의 적합한 예로서는 아르기닌, 리신, 오르니틴과의 염을 들 수 있다.
산성 아미노산과의 염의 적합한 예로서는 아스파르트산, 글루탐산과의 염을 들 수 있다.
본 발명에서 본 발명의 화합물은 양이온성 지질로서 사용할 수 있다. 양이온성 지질은 용매 또는 분산매 중에서 복수의 분자와 함께 복합체를 형성할 수 있다. 상기 복합체에는 본 발명의 화합물에 더하여 다른 성분이 포함되어 있어도 좋다. 상기 다른 성분의 예로서는 다른 지질 성분 및 핵산을 들 수 있다.
상기 다른 지질 성분으로서는 지질 입자를 구성할 수 있는 구조 지질을 들 수 있다. 이러한 구조 지질로서는, 예를 들어 스테롤류(예를 들어 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르, 콜레스테롤헤미숙신산 등);
인지질(예를 들어 포스파티딜콜린(예를 들어 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테알로일포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 팔미토일올레오일포스파티딜콜린, 디리놀레노일포스파티딜콜린, MC-1010(NOF CORPORATION), MC-2020(NOF CORPORATION), MC-4040(NOF CORPORATION) 등), 포스파티딜세린(예를 들어 디팔미토일포스파티딜세린, 디스테아로일포스파티딜세린, 디올레오일포스파티딜세린, 팔미토일올레오일포스파티딜세린 등), 포스파티딜에탄올아민(예를 들어 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민 등) , 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산 등) ;
폴리에틸렌글리콜 지질(PEG 지질) (예를 들어 PEG-DAA, PEG-DAG, PEG-phospholipid cunjugate, PEG-Cer, PEG-cholesterol, PEG-C-DOMG, 2KPEG-CMG, GM-020 (NOF CORPORATION), GS-020 (NOF CORPORATION), GS-050 (NOF CORPORATION) 등) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 구조 지질로서 스테롤류(특히 콜레스테롤), 인지질(특히 포스파티딜콜린) 및 폴리에틸렌글리콜 지질의 3 종 모두를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 지질 입자를 형성하는 혼합 지질 성분에서의 본 발명의 화합물과 구조 지질의 비율은 목적이나 용도에 따라 적절히 조절할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 화합물 1몰에 대하여, 구조 지질은 통상 0.008 내지 4몰의 비율이며, 바람직하게는 0.4 내지 1.5몰의 비율이다. 또 다른 규정의 방법을 사용하면, 혼합 지질 성분 중, 본 발명의 화합물은 통상 1 내지 4몰, 스테롤류는 통상 0 내지 3몰, 인지질은 통상 0 내지 2몰, 폴리에틸렌글리콜 지질은 통상 0 내지 1몰의 비율이다. 본 발명의 화합물과 다른 지질 성분을 혼합하여 사용하는 경우의 보다 바람직한 태양은 본 발명의 화합물 1 내지 1.5몰, 스테롤류 0 내지 1.25몰, 인지질 0 내지 0.5몰 및 폴리에틸렌글리콜 지질 0 내지 0.125몰의 비율이다.
본 발명의 화합물은, 본 발명의 지질 입자를 제조하기 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 지질 입자는 상기 복합체 중 핵산을 포함하지 않는 복합체를 의미한다. 본 발명의 지질 입자 형상은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 본 발명의 화합물 등이 구형을 구성하도록 집합한 복합체, 특정 형상을 구성하지 않고 집합한 복합체, 용매에 용해된 복합체, 분산매 중에 균일하거나 불균일하게 분산된 복합체 등을 포함한다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어 본 발명의 화합물 및 그 이외의 구조 지질에 의해 구성되는 지질 입자)는 예를 들어 당해 지질 입자와 핵산(특히 의약적 용도 또는 연구 목적 용도에 유용한 물질인 핵산)을 함유하는 본 발명의 조성물을 제조하기 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 의약 또는 시약으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물에서는 가능한 한 많은 비율의 핵산이 지질 입자에 내봉되어 있는(즉 내봉율이 높은) 것이 바람직하다.
"핵산"이란 뉴클레오티드 및 그 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합된 분자라면 어떤 것이든 좋으며, 예를 들어 리보뉴클레오티드의 중합체인 RNA, 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체인 DNA, 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드가 혼합된 중합체 및 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 뉴클레오티드 중합체를 들 수 있으며, 또한, 핵산 유도체를 포함하는 뉴클레오티드 중합체이어도 좋다. 또, 핵산은 단일쇄 핵산 또는 이중쇄 핵산이어도 좋다. 또한 이중쇄 핵산에는 한쪽 쇄에 대하여 다른 쪽 쇄가 엄격한 조건에서 하이브리다이즈하는 이중쇄 핵산도 포함된다.
뉴클레오티드 유사체로서는 RNA 또는 DNA와 비교하여 뉴클레아제 내성 향상 또는 안정화시키기 위해, 상보쇄 핵산과의 어피니티를 올리기 위해, 또는 세포 투과성을 높이기 위해, 또는 가시화시키기 위해, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, RNA 또는 DNA에 수식을 실시한 분자라면 어떤 분자라도 좋다. 뉴클레오티드 유사체로서는 천연에 존재하는 분자이어도 비천연분자이어도 좋으며, 예를 들어 당부 수식 뉴클레오티드 유사체나 인산 디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드 유사체 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드 유사체로서는 뉴클레오티드의 당의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대해 임의의 화학 구조 물질을 부가 또는 치환한 것이라면 어떤 것이어도 좋으며, 그 구체예로서는 2'-O-메틸리보스로 치환된 뉴클레오티드 유사체, 2'-O-프로필리보스로 치환된 뉴클레오티드 유사체, 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 뉴클레오티드 유사체, 2'-O-메톡시에틸리보오스로 치환된 뉴클레오티드 유사체, 2'-O-[2-(구아니디움)에틸]리보오스로 치환된 뉴클레오티드 유사체, 2'-O-플루오로리보오스로 치환된 뉴클레오티드 유사체, 당부에 가교 구조를 도입함으로써 2개의 환상 구조를 갖는 가교 구조형 인공 핵산(Bridged Nucleic Acid) (BNA), 보다 구체적으로는 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 가교한 잠금 인공 핵산(Locked Nucleic Acid) (LNA) 및 에틸렌 가교 구조형 인공 핵산(Ethylene bridged nucleic acid) (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]을 들 수 있고, 또한 펩티드 핵산 (PNA) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)], 옥시 펩티드 핵산 (OPNA) [J. Am . Chem. Soc., 123, 4653 (2001)] 및 펩티드 리보 핵산 (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)] 등을 들 수 있다.
인산 디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드 유사체로서는 뉴클레오티드의 인산 디에스테르 결합의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대해 임의의 화학 물질을 부가 또는 치환한 것이라면 어떤 것이든 좋으며, 그 구체예로서는 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드 유사체, N3'-P5'포스포아미데이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드 유사체 등을 들 수 있다[세포 공학, 16, 1463-1473(1997) [RNAi법과 안티센스법, 고단사(2005)].
핵산 유도체로서는 핵산에 비해 뉴클레아제 내성을 향상시키기 위해, 안정화시키기 위해, 상보쇄 핵산과의 어피니티를 올리기 위해, 세포 투과성을 높이기 위해, 또는 가시화시키기 위해, 그 핵산에 다른 화학 물질을 부가한 분자라면 어떤 분자이어도 좋으며, 그 구체예로서는 5'-폴리아민 부가 유도체, 콜레스테롤 부가 유도체, 스테로이드 부가 유도체, 담즙산 부가 유도체, 비타민 부가 유도체, Cy5 부가 유도체, Cy3 부가 유도체, 6-FAM 부가 유도체 및 비오틴 부가 유도체 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 핵산으로서는 특별히 한정되지 않으며 예를 들어 질환, 증상, 장애 또는 병적 상태의 개선 및 질환, 증상, 장애 또는 병태의 경감 또는 발증의 예방 등(본 명세서에서 "질환의 치료 등"이라 칭하는 경우가 있다)을 목적으로 한 핵산이어도 좋고, 질환의 치료 등에는 기여하지 않으나 연구용으로 유용한 목적으로 하는 단백질 발현을 조절하기 위한 핵산이어도 좋다.
질환과 관련된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드(본 명세서 중 "질환 관련 유전자"라고 칭하는 경우가 있다)는 예를 들어 McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) 및 National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.) 등으로부터 입수 가능하다.
본 발명에서의 핵산의 구체예로서는, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA, miRNA mimic, 안티센스 핵산, 리보자임, mRNA, 데코이 핵산, 앱타마, 플라스미드 DNA, Cosmid DNA, BAC DNA를 들 수 있다. 핵산으로는 siRNA, mRNA 등의 RNA 또는 이들에 인공적인 수식이 실시된 유사체 혹은 유도체가 바람직하다.
본 발명에서 "siRNA"란, 10 내지 30염기, 또는 15 내지 25염기의 이중쇄 RNA 또는 그 유연체로서, 상보적 서열을 포함하는 것을 의미한다. siRNA는 바람직하게는 3' 말단에 1 내지 3 염기, 보다 바람직하게는 2 염기의 돌출 염기를 갖는다. 상보적 서열 부분은 완전히 상보적이어도 좋고, 또는 상보적이지 않은 염기를 포함하고 있어도 좋지만, 바람직하게는 완전히 상보적이다.
본 발명에서의 siRNA는 특별히 한정되지 않으며 예를 들어 질환 관련 유전자에 대해 유전자 발현을 녹다운하기 위한 siRNA를 이용할 수 있다. 질환 관련 유전자는 비질환 대조의 조직 또는 세포와 비교하여 환부 조직에서 유래하는 세포 중에서 비정상적인 수준에서 또는 비정상적인 형태로 전사 또는 번역 산물을 발생시키고 있는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 또한 본 발명에서의 siRNA으로서는 연구용으로 유용한 목적으로 하는 단백질의 발현을 조절하기 위한 siRNA를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 "mRNA"란 단백질로 번역 가능한 염기 서열을 포함하는 RNA를 의미한다. 본 발명에서의 mRNA로서는 세포 내에서 목적으로 하는 단백질을 발현시킬 수 있는 mRNA라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 mRNA로서는 의약적 용도(예를 들어 질환 치료 용도) 및/또는 연구 목적 용도에 유용한 mRNA가 바람직하며, 이러한 mRNA로서는 예를 들어 루시페라제와 같은 마커 단백질을 세포 내에서 발현시키기 위한 mRNA를 들 수 있다.
상기의 질환으로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 이하에 기재된 질환을 들 수 있다. "( )" 안은 구체적인 질환예를 기재하는 경우를 제외하고 질환 관련 유전자의 예를 나타낸다. 본 발명에서의 핵산으로서는 이들 질환 관련 유전자(또는 이들이 코드하는 단백질)의 발현량을 조절하는 핵산도 들 수 있다.
(1) 혈액계 질환 [빈혈 (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG, RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT), 부전 림프구 증후군(TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA, RFX5), 출혈성 질환(TBXA2R, P2RX1, P2X1), H인자 및 H인자양 1인자 결핍증(HF1, CFH, HUS), V인자 및 VIII인자 결핍증(MCFD2), VII인자 결핍증(F7), X인자 결핍증(F10), XI인자 결핍증(F11), XII인자 결핍증(F12, HAF), XIIIA인자 결핍증(F13A1, F13A), XIIIB 인자 결핍증(F13B), 판코니 빈혈(FANCA, FACA, FA1, FA, FAA, FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FACE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596), 혈구 탐식성 림프 조직구증(PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3) 혈우병 A(F8, F8C, HEMA), 혈우병 B(F9, HEMB), 출혈성 장애(PI, ATT, F5), 백혈구 결손(ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4), 겸상 적혈구 빈혈 (HBB), 사라세미아(HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1) 등];
(2) 염증성·면역성 질환[AIDS (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1), 자가 면역 림프구 증식성 증후군(TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A), 복합형 면역 부전증(IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4), HIV 감염증(CCL5, SCYA5, D17S135E, TCP228, IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, DMKBR5, CCCKR5, CCR5), 면역 부전증 (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI), 염증(IL10, IL-1, IL-13, IL-17, IL-23, CTLA4), 중증 복합병 면역 부전증(JAK3, JAKL, DCLRE1C, ATREMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4), 관절 류마티스, 건선, 염증성 장질환(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염 등), 쇼그렌 증후군, 베체트병, 다발성 경화증, 전신성 에리테마토수스, 루푸스 신장염, 원판상 홍반성 낭창, 캐슬만병, 강직성 척추염, 다발성 근염, 피부 근염, 결절성 다발성 동맥염, 혼합성 결합성 조직증, 강피증, 심재성 홍반성 낭창, 만성 갑상선염, 그레이브스병, 자가 면역성 위염, I형 및 II형 당뇨병, 자가 면역성 용혈성 빈혈, 자가 면역성 호중구 감소증, 혈소판 감소증, 아토피성 피부염, 만성 활동성 간염, 중증 근무력증, 이식편대 숙주 질환, 애디슨 병, 이상 면역 반응, 관절염, 피부염, 방사선 피부염, 원발성 담즙성 간경변 등];
(3) 대사·간·신장 질환 [아밀로이드 뉴로파시 (TTR, PALB), 아밀로이드증 (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB), 비알코올성 지방간염 및 간섬유증(COL1A1), 간경변(KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988), 낭포성 섬유증(CFTR, ABCC7, CF, MRP7), 글리코겐 축적증(SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM), 간세포 선종(TCF1, HFN1A, MODY3,), 간 부전(SCOD1, SCO1), 간성 리파아제 결핍증(LIPC), 간모세포종(CTNNB1, PDFGRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5), 수질 낭포 신장 질환(UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2), 페닐케톤 뇨증(PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS), 다낭성 신장 및 간 질환(FCYT, PKHD1, APRKD, PDK1, PDK2, PDK4, PDKTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63) 등];
(4) 신경계 질환 [ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF), 알츠하이머병 (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU , URK, ACE, DCP1, ACE1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3), 자폐증(BZRAP1, MDGA2, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2), 취약성 X 증후군 (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR5), 헌팅톤병(HD, IT15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17), 파킨슨병(NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, DBH, NDUFV2), 레트 증후군(MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9), 조현병(GSK3, 5-HTT, COMT, DRD, SLC6A3, DAOA, DTNBP1), 세크래타제 관련 장애(APH-1) 등];
(5) 안과 질환 [노인성 황반 변성증(Abcr, Ccl2, cp, Timp3, 카텝신 D, Vldlr, Ccr2), 백내장 (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BSFP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1), 각막 혼탁 (APOA1, TGFB1, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TASTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD), 선천성 유전성 편평 각막(KERA, CNA2), 녹내장 (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A), 레베르씨 선천성 흑암시(CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3), 황반 이영양증(ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2) 등];
(6) 종양성 질환 [악성 종양, 혈관 신생 녹내장, 유아성 혈관종, 다발성 골수종, 만성 육종, 전이 흑색종, 카포지 육종, 혈관 증식, 악액질, 유방암의 전이 등, 암(예를 들어 대장암(예를 들어 가족성 대장암, 유전성 비폴리포시스 대장암, 소화관 간질 종양 등), 폐암(예를 들어 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피부종 등), 중피종, 췌장암(예를 들어 췌관암 등), 위암(예를 들어 유두선암, 점액성 선암, 선편평 상피암 등), 유방암(예를 들어 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암 등), 난소암(예를 들어 상피성 난소암, 성선외 배아 세포 종양, 난소성 배아 세포 종양, 난소 저악성 종양 등), 전립선암 (예를 들어 호르몬 의존성 전립선암, 호르몬 비의존성 전립선암 등), 간암(예를 들어 원발성 간암, 간외담관암 등), 갑상선암 (예를 들어 갑상선 골수암 등), 신장암(예를 들어 신장 세포암, 신우와 요관의 이행 상피암 등), 자궁암, 뇌종양(예를 들어 송과체성세포 종양, 모양세포성 성상세포종 , 미만성 성상 세포종, 역형성 성상세포종 등), 흑색종, 육종, 방광암, 다발성 골수종을 포함하는 혈액암 등, 뇌하수체 선종, 신경 교종, 청신경 초종, 망막 육종, 인두암, 후두암, 설암, 흉선종, 식도암, 십이지장암, 결장암, 직장암, 간세포암, 췌장 내분비 종양, 담관암, 담낭암, 음경암, 요관암, 정소종양, 외음암, 자궁경부암, 자궁체부암, 자궁육종, 융모성 질환, 질암, 피부암, 균상식육증, 기저세포종, 연부 육종, 악성 림프종, 호지킨병, 골수 이형성 증후군, 성인 T세포 백혈병, 만성 골수 증식성 질환, 췌장 내분비 종양, 섬유성 조직구종, 평활 근육종, 횡문 근육종, 원발 불명암 등), 백혈병(예를 들어 급성 백혈병(예를 들어 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 등), 만성 백혈병(예를 들어 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 등), 골수 형성 증후군 등), 자궁 육종(예를 들면 자궁 중배엽성 혼합 종양, 자궁 평활 근육종, 자궁 내막 간질 종양 등), 골수 섬유증 등).
의약으로서의 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 의약의 제형으로서, 예를 들어 완충제 및/또는 안정제 등의 관용 조제를 배합한 비경구 투여용 제제(예를 들어 주사제 등의 액제), 관용의 의약용 담체가 배합된 연고, 크림, 액제 또는 고약 등의 국소용 제제를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 다수 종류의 세포, 조직 또는 장기에 활성 성분을 도입하기 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물을 적용할 수 있는 세포로서는 예를 들어 간엽계 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 비장 세포, 신경 세포, 글리아 세포, 췌장 B 세포, 골수 세포, 혈관간 세포, 랑게르한스 세포, 표피 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아 세포, 섬유 세포, 근 세포(예, 골격근 세포, 심근 세포, 근아 세포, 근위성 세포, 평활근 세포), 지방 세포, 혈구 세포(예, 마크로파지, T 세포, B 세포, 내추럴 킬러 세포, 비만 세포, 백혈구, 호중구, 호염기구, 호산구, 단구, 거핵구, 조혈 줄기 세포), 활막 세포, 연골 세포, 골 세포, 골아 세포, 파골 세포, 유선 세포, 간 세포 또는 간질 세포, 난세포, 정세포, 또는 이들 세포로 분화 유도 가능한 전구 세포, 줄기 세포(예를 들어 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배아 줄기 세포(ES 세포) 포함), 시원 생식 세포, 난모 세포, 수정란을 들 수 있다. 또한 본 발명의 조성물을 적용할 수 있는 조직 또는 장기로서는 상기 세포가 존재하는 모든 조직 또는 장기, 예를 들어 뇌, 뇌의 각 부위(예, 후구, 편두핵, 대뇌 기저구, 해마, 시상, 시상하부, 시상하핵, 대뇌피질, 연수, 소뇌, 후두엽, 전두엽, 측두엽, 피각, 미상핵, 뇌염, 흑질), 척수, 뇌하수체, 위, 췌장, 신장, 간, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 폐, 위장관(예, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 악하선, 말초혈, 말초혈구, 전립선, 태반, 자궁, 뼈, 관절 및 근육(예, 골격근, 평활근, 심근) 등을 들 수 있다. 이들 세포, 조직 또는 장기는 암화된 암 세포나 암조직 등이어도 좋다.
본 발명의 조성물은 특히 암세포에 핵산을 도입하는 효율이 우수하다.
본 발명의 화합물, 지질 입자 및 조성물은 안정적이고 저독성적으로 안전하게 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물을 in vivo에서 이용하는 경우, 내지 의약으로서 이용하는 경우, 투여 대상(예를 들어 인간 또는 비인간 포유 동물(바람직하게는 인간))에 대해 핵산의 유효량이 표적으로 하는 세포에 송달되도록 해당 조성물을 투여하면 된다.
본 발명물의 조성물을 in vivo에서 사용하는 경우, 내지 의약으로서 이용하는 경우, 예를 들어 정제(당의정, 필름 코팅정, 설하정, 구강내 붕괴정 포함), 산제, 과립제, 캡슐제(소프트 캡슐, 마이크로 캡슐 포함), 액제, 트로키제, 시럽제, 유제, 현탁제, 주사제(예, 피하 주사제, 정맥내 주사제, 근육내 주사제, 복강내 주사제 등), 외용제 (예, 경비 투여 제제, 경피 제제, 연고제) 좌제(예, 직장 좌제, 질 좌제), 펠렛, 경비제, 경폐제(흡입제), 점적제 등의 의약 제제로 함으로써 경구적 또는 비경구적(예, 국소, 직장, 정맥 투여 등)으로 안전하게 투여할 수 있다. 이들 제제는 속방성 제제 또는 서방성 제제 등의 방출 제어 제제(예, 서방성 마이크로 캡슐)이어도 좋다.
이하, 본 발명의 화합물의 제조 방법에 대하여 설명한다.
이하의 제조 방법에서의 각 공정에서 사용된 원료나 시약 및 얻어진 화합물은 각각 염을 형성하고 있어도 좋다. 이러한 염으로서는 예를 들어 앞에서 서술한 본 발명의 화합물에서의 염과 동일한 것을 들 수 있다.
각 공정에서 얻어진 화합물이 유리 화합물인 경우에는 공지된 방법에 의해 목적으로 하는 염으로 변환할 수 있다. 반대로 각 공정에서 얻어진 화합물이 염인 경우에는 공지된 방법에 의해 유리체 또는 목적으로 하는 다른 종류의 염으로 변환할 수 있다.
각 공정에서 얻어진 화합물은 반응액 그대로이거나 또는 조생성물로서 얻은 후에 다음 반응에 이용할 수도 있거나, 또는 각 공정에서 얻어진 화합물을 통상법에 따라 반응 혼합물로부터 농축, 정출, 재결정, 증류, 용매 추출, 분류, 크로마토그래피 등의 분리 수단에 의해 단리 및/또는 정제할 수 있다.
각 공정의 원료나 시약의 화합물이 시판되고 있는 경우에는 시판품을 그대로 이용할 수 있다.
각 공정의 반응에서 반응 시간은 이용하는 시약이나 용매에 따라 다를 수 있지만, 특별히 기재가 없는 경우, 통상 1분 내지 48시간, 바람직하게는 10분 내지 8시간이다.
각 공정의 반응에서 반응 온도는 이용하는 시약이나 용매에 따라 다를 수 있지만, 특별히 기재가 없는 경우, 통상 -78℃ 내지 300℃, 바람직하게는 -78℃ 내지 150℃이다.
각 공정의 반응에서 압력은 사용하는 시약이나 용매에 따라 다를 수 있지만, 특별히 기재가 없는 경우, 통상 1기압 내지 20기압, 바람직하게는 1기압 내지 3기압이다.
각 공정의 반응에서, 예를 들어 Biotage사제 Initiator 등의 Microwave 합성 장치를 이용하는 경우가 있다. 반응 온도는 이용하는 시약이나 용매에 따라 다를 수 있지만 특별히 기재가 없는 경우, 통상 실온 내지 300℃, 바람직하게는 실온 내지 250℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 250℃이다. 반응 시간은 이용하는 시약이나 용매에 따라 다를 수 있지만 특별한 기재가 없는 경우, 통상 1분 내지 48시간, 바람직하게는 1분 내지 8시간이다.
각 공정의 반응에서 시약은 특별히 기재가 없는 경우, 기질에 대해 0.5당량 내지 20당량, 바람직하게는 0.8당량 내지 5당량이 이용된다. 시약을 촉매로서 사용할 경우, 시약은 기질에 대해 0.001당량 내지 1당량, 바람직하게는 0.01당량 내지 0.2당량이 이용된다. 시약이 반응 용매를 겸할 경우 시약은 용매량이 이용된다.
각 공정의 반응에서 특별히 기재가 없는 경우, 이들 반응은 무용매 또는 적당한 용매에 용해 또는 현탁하여 이루어진다. 용매의 구체예로서는 실시예에 기재되어 있는 용매 혹은 다음을 들 수 있다.
알코올류: 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올, tert-부틸알코올, 2-메톡시에탄올 등;
에테르류: 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디페닐에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄 등;
방향족 탄화 수소류 : 클로로벤젠, 톨루엔, 자일렌 등;
포화 탄화 수소류 : 시클로헥산, 헥산, 헵탄 등;
아미드류: N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등;
할로겐화 탄화 수소류: 디클로로메탄, 사염화 탄소 등;
니트릴류: 아세토니트릴 등;
술폭시드류: 디메틸술폭시드 등;
방향족 유기 염기류: 피리딘 등;
산무수물류: 무수 아세트산 등;
유기산류: 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산 등;
무기산류: 염산, 황산 등;
에스테르류: 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필에스테르 등;
케톤류: 아세톤, 메틸에틸케톤 등;
물.
상기 용매는 2종 이상을 적당한 비율로 혼합해서 사용해도 좋다.
각 공정의 반응에서 염기를 사용하는 경우, 예를 들어 아래에 나타내는 염기 또는 실시예에 기재되어 있는 염기가 이용된다.
무기 염기류 : 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 마그네슘 등;
염기성 염류: 탄산 나트륨, 탄산 칼슘, 탄산 수소 나트륨 등;
유기 염기류: 트리에틸아민, 디에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N, N-디메틸아닐린, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센, 이미다졸, 피페리딘 등;
금속 알콕시드류: 나트륨에톡시드, 칼륨tert-부톡시드, 나트륨tert-부톡시드 등;
알칼리 금속 수소화물류: 수소화 나트륨 등;
금속 아미드류: 나트륨아미드, 리튬디이소프로필아미드, 리튬헥사메틸디실라지드 등;
유기 리튬류: n-부틸리튬, sec-부틸리튬 등.
각 공정의 반응에서 산 또는 산성 촉매를 이용할 경우, 예를 들어 다음에 나타내는 산이나 산성 촉매 또는 실시예에 기재되어 있는 산이나 산성 촉매가 이용된다.
무기산류: 염산, 황산, 질산, 브롬화 수소산, 인산 등;
유기산류: 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, p-톨루엔술폰산, 10-캄퍼술폰산 등;
루이스산: 삼불화 붕소 디에틸에테르 착체, 요오드화 아연, 무수 염화 알루미늄, 무수 염화 아연, 무수 염화철 등.
각 공정의 반응은 특별한 기재가 없는 한, 공지된 방법, 예를 들어 제5판 실험 화학 강좌, 13권 내지 19권(일본 화학회편); 신실험 화학 강좌, 14권 내지 15권(일본 화학회편); 정밀 유기 화학 개정 제2판(L. F. Tietze, Th. Eicher, 미나미에도); 개정 유기 인명 반응 그 구조와 포인트 (도고 히데오 지음, 코단샤); ORGANIC SYNTHESES Collective Volume I 내지 VII (John Wiley & SonsInc); Modern Organic Synthesis in the Laboratory A Collection of Standard Experimental Procedures (Jie Jack Li 지음, OXFORD UNIVERSITY 출판); Comprehensive Heterocyclic Chemistry III, Vol. 1~Vol. 14 (엘세비어·재팬 주식회사); 인명 반응으로 배우는 유기 합성 전략(도미오카 기요시 역, 화학 동인 발행); 컴프리헨시브 오가닉 트랜스포메이션스(VCH Publishers Inc.) 1989년 간행 등에 기재된 방법, 또는 실시예에 기재된 방법에 준하여 이루어진다.
각 공정에서 관능기의 보호 또는 탈보호 반응은 공지된 방법, 예를 들어 Wiley-Interscience사 2007년 간행 "Protective Groups in Organic Synthesis, 4thEd."(Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts 지음); Thieme사의 2004년 간행 "Protecting Groups 3rdEd."(P.J.Kocienski 지음) 등에 기재된 방법 또는 실시예에 기재된 방법에 준하여 이루어진다.
알코올 등의 수산기나 페놀성 수산기의 보호기로서는, 예를 들어 메톡시메틸에테르, 벤질에테르, p-메톡시벤질에테르, t-부틸디메틸실릴에테르, t-부틸디페닐실릴에테르, 테트라히드로피라닐에테르 등의 에스테르형 보호기; 아세트산 에스테르 등의 카르복실산 에스테르형 보호기; 메탄술폰산 에스테르 등의 술폰산 에스테르형 보호기; t-부틸카보네이트 등의 탄산 에스테르형 보호기 등을 들 수 있다.
알데히드의 카르보닐기의 보호기로서는, 예를 들어 디메틸아세탈 등의 아세탈형 보호기; 환상 1,3-디옥산 등의 환상 아세탈형 보호기 등을 들 수 있다.
케톤의 카르보닐기의 보호기로서는, 예를 들어 디메틸케탈 등의 케탈형 보호기; 환상 1,3-디옥산 등의 환상 케탈형 보호기; O-메틸옥심 등의 옥심형 보호기; N, N-디메틸히드라존 등의 히드라존형 보호기 등을 들 수 있다.
카르복실기의 보호기로서는, 예를 들어 메틸에스테르 등의 에스테르형 보호기; N, N-디메틸아미드 등의 아미드형 보호기 등을 들 수 있다.
티올의 보호기로서는, 예를 들어 벤질티오에테르 등의 에테르형 보호기; 티오아세트산 에스테르, 티오카르보네이트, 티오카르바메이트 등의 에스테르형 보호기 등을 들 수 있다.
아미노기나 이미다졸, 피롤, 인돌 등의 방향족 헤테로환의 보호기로서는, 예를 들어 벤질카르바메이트 등의 카르바메이트형 보호기; 아세트아미드 등의 아미드형 보호기; N-트리페닐메틸아민 등의 알킬아민형 보호기, 메탄술폰아미드 등의 술폰아미드형 보호기 등을 들 수 있다.
보호기의 제거는 공지된 방법, 예를 들어 산, 염기, 자외광, 히드라진, 페닐히드라진, N-메틸디티오카르바민산 나트륨, 테트라부틸암모늄플루오리드, 아세트산 팔라듐, 트리알킬실릴할라이드(예를 들어 트리메틸실릴요오드화물, 트리메틸실릴브로미드)를 사용하는 방법이나 환원법 등을 이용해 실시할 수 있다.
각 공정에서 환원 반응을 행하는 경우, 사용되는 환원제로서는 수소화 알루미늄리튬, 수소화 트리아세톡시 붕소 나트륨, 수소화 시아노 붕소 나트륨, 수소화 디이소부틸알루미늄(DIBAL-H), 수소화 붕소 나트륨, 수소화 트리아세톡시 붕소 테트라메틸암모늄 등의 금속 수소화물류; 보란테트라히드로푸란 착체 등의 보란류; 라네 니켈; 라네 코발트; 수소; 포름산 등을 들 수 있다. 예를 들어 수소 또는 포름산 존재 하에서 라네 니켈 또는 라네 코발트를 사용할 수 있다. 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 환원하는 경우는, 팔라듐-카본이나 Lindlar 촉매 등의 촉매를 사용하는 방법이 있다.
각 공정에서 산화 반응을 행하는 경우, 사용되는 산화제로서는 m-클로로벤조산 (MCPBA), 과산화 수소, t-부틸히드로퍼옥시 등의 과산류; 과염소산 테트라부틸암모늄 등의 과염소산염류; 염소산 나트륨 등의 염소산염류; 아염소산 나트륨 등의 아염소산염류; 과요오드산 나트륨 등의 과요오드산류; 요오드실벤젠 등의 고원자가 요오드 시약; 이산화 망간, 과망간산 칼륨 등의 망간 등의 망간을 갖는 시약; 4아세트산납 등 납류; 클로로크롬산 피리디늄(PCC), 2크롬산 피리디늄(PDC), 존스 시약 등의 크롬을 갖는 시약; N-브로모숙신이미드(NBS) 등의 할로겐 화합물류; 산소; 오존; 삼산화황·피리딘 착체; 사산화 오스뮴; 이산화 셀레늄; 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ) 등을 들 수 있다.
각 공정에서 라디칼 환화 반응을 행하는 경우, 사용되는 라디칼 개시제로서는 아조비스이소부티로니트릴(AIBN) 등의 아조 화합물; 4-4'-아조비스-4-시아노펜탄산(ACPA) 등의 수용성 라디칼 개시제; 공기 또는 산소 존재 하에서의 트리에틸 붕소; 과산화 벤조일 등을 들 수 있다. 또한 사용되는 라디칼 반응 시제로서는 트리부틸스타난, 트리스트리메틸실릴실란, 1,1,2,2-테트라페닐디실란, 디페닐실란, 요오드화 사마륨 등을 들 수 있다.
각 공정에서 Wittig 반응을 행하는 경우, 사용되는 Wittig 시약으로서는 알킬리덴포스포란류 등을 들 수 있다. 알킬리덴포스포란류는 공지된 방법, 예를 들어 포스포늄염과 강염기를 반응시킴으로써 조제할 수 있다.
각 공정에서 Horner-Emmons 반응을 행하는 경우, 사용되는 시약으로서는 디메틸포스포노아세트산 메틸, 디에틸포스포노아세트산 에틸 등의 포스포노아세트산 에스테르류; 알칼리 금속 수소화물류, 유기 리튬류 등의 염기를 들 수 있다.
각 공정에서 Friedel-Crafts 반응을 행하는 경우, 사용되는 시약으로서는 루이스산과 산클로리드 혹은 알킬화제(예, 할로겐화 알킬류, 알코올, 올레핀류 등)를 들 수 있다. 또는 루이스산 대신 유기산이나 무기산을 사용할 수도 있고, 산클로리드 대신 무수 아세트산 등 산무수물을 사용할 수도 있다.
각 공정에서 방향족 구핵 치환 반응을 행하는 경우, 시약으로서는 구핵제(예, 아민류, 이미다졸 등)와 염기(예, 염기성 염류, 유기 염기류 등)를 사용할 수 있다.
각 공정에서 카르보 음이온에 의한 구핵 부가 반응, 카르보 음이온에 의한 구핵 1,4-부가 반응(Michael 부가 반응), 또는 카르보 음이온에 의한 구핵 치환 반응을 행하는 경우, 카르보 음이온을 발생하기 위해 이용하는 염기로서는 유기 리튬류, 금속 알콕시드류, 무기 염기류, 유기 염기류 등을 들 수 있다.
각 공정에서 Grignard 반응을 행하는 경우, Grignard 시약으로서는 페닐마그네슘브로미드 등의 아릴마그네슘할라이드류; 메틸마그네슘브로미드, 이소프로필마그네슘브로미드 등의 알킬마그네슘할라이드류를 들 수 있다. Grignard 시약은 공지된 방법, 예를 들어 에테르 또는 테트라히드로푸란을 용매로 하여 할로겐화 알킬 또는 할로겐화 아릴과 금속 마그네슘을 반응시킴으로써 조제할 수 있다.
각 공정에서 Knoevenagel 축합 반응을 행하는 경우, 시약으로서는 두 개의 전자 구인기에 협지된 활성 메틸렌 화합물(예, 말론산, 말론산 디에틸, 말로노니트릴 등) 및 염기(예, 유기 염기류, 금속 알콕시드류, 무기 염기류)를 사용할 수 있다.
각 공정에서 Vilsmeier-Haack 반응을 행하는 경우, 시약으로서는 염화 포스포릴과 아미드 유도체(예, N, N-디메틸포름아미드 등)를 사용할 수 있다.
각 공정에서 알코올류, 알킬할라이드류, 술폰산 에스테르류의 아지드화 반응을 행하는 경우, 사용되는 아지드화제로서는 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 트리메틸실릴아지드, 아지화 나트륨 등을 들 수 있다. 예를 들어 알코올류를 아지드화하는 경우, 디페닐포스포릴아지드와 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데카-7-엔(DBU)을 이용하는 방법이나 트리메틸실릴아지드와 루이스산을 이용하는 방법 등이 있다.
각 공정에서 환원적 아미노화 반응을 행하는 경우, 사용되는 환원제로서는 수소화 트리아세톡시 붕소 나트륨, 수소화 시아노 붕소 나트륨, 수소, 포름산 등을 들 수 있다. 기질이 아민 화합물인 경우는, 사용되는 카르보닐 화합물로서는 파라포름알데히드 외에 아세트알데히드 등의 알데히드류, 시클로헥사논 등의 케톤류를 들 수 있다. 기질이 카르보닐 화합물인 경우는 사용되는 아민류로서는 암모니아, 메틸아민 등의 1급 아민; 디메틸아민 등의 2급 아민 등을 들 수 있다.
각 공정에서 광연 반응을 행하는 경우, 시약으로서는 아조디카르복실산 에스테르류(예, 아조디카르복실산 에틸(DEAD), 아조디카르복실산 디이소프로필(DIAD) 등) 및 트리페닐포스핀을 사용할 수 있다.
각 공정에서 에스테르화 반응, 아미드화 반응, 또는 우레아화 반응을 행하는 경우, 사용되는 시약으로서는 산크롤리드, 산브로미드 등의 할로겐화 아실체; 산무수물, 활성 에스테르체, 황산 에스테르체 등 활성화된 카르복실산류를 들 수 있다. 카르복실산의 활성화제로서는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(WSCD) 등의 카르보디이미드계 축합제; 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드-n-하이드레이트(DMT-MM) 등의 트리아진계 축합제; 1,1-카르보닐디이미다졸(CDI) 등의 탄산 에스테르계 축합제; 디페닐인산 아지드(DPPA); 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스디메틸아미노포스포늄염(BOP 시약); 요오드화2-클로로-1-메틸-피리디늄(무코야마 시약); 염화 티오닐; 클로로포름산 에틸 등의 할로포름산 저급 알킬; O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로 인산염(HATU); 황산; 또는 이들의 조합 등을 들 수 있다. 카르보디이미드계 축합제를 사용하는 경우, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), N-히드록시숙신산 이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘(DMAP) 등의 첨가제를 추가로 반응에 첨가하여도 좋다.
각 공정에서 커플링 반응을 행하는 경우, 사용되는 금속 촉매로서는 아세트산 팔라듐(II), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0), 디클로로비스(트리페닐포스핀) 팔라듐(II), 디클로로비스(트리에틸포스핀)팔라듐(II), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), 염화1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센팔라듐(II), 아세트산 팔라듐(II) 등의 팔라듐 화합물; 테트라키스(트리페닐포스핀)니켈(0) 등의 니켈 화합물; 염화 트리스(트리페닐포스핀)로듐(III) 등의 로듐 화합물; 코발트 화합물; 산화 동, 요오드화 동(I) 등의 동 화합물; 백금 화합물 등을 들 수 있다. 추가로 반응에 염기를 첨가하여도 좋고, 이러한 염기로서는 무기 염기류, 염기성 염류 등을 들 수 있다.
각 공정에서 티오카르보닐화 반응을 행하는 경우, 티오카르보닐화제로서는 대표적으로는 오황화 2인을 이용할 수 있는데, 오황화 2인 외에 2,4-비스(4-메톡시페닐)-1,3,2,4-디티아디포스페탄-2,4-디술피드(Lowesson 시약) 등의 1,3,2,4-디티아디포스페탄-2,4-디술피드 구조를 갖는 시약을 이용해도 좋다.
각 공정에서 Wohl-Ziegler 반응을 행하는 경우, 사용되는 할로겐화제로서는 N-요오드 숙신산 이미드, N-브로모 숙신산 이미드(NBS), N-클로로 숙신산 이미드(NCS), 브롬, 염화 술프릴 등을 들 수 있다. 추가로 열, 빛, 과산화 벤조일, 아조비스이소부티로니트릴 등의 라디칼 개시제를 반응에 첨가함으로써 반응을 가속시킬 수 있다.
각 공정에서 히드록시기의 할로겐화 반응을 행하는 경우, 사용되는 할로겐화제로서는 할로겐화 수소산과 무기산의 산할로겐화물, 구체적으로는 염소화에서는 염산, 염화 티오닐, 옥시 염화인 등, 브롬화에서는 48% 브롬화 수소산 등을 들 수 있다. 또한 트리페닐포스핀과 사염화 탄소 또는 사브롬화 탄소 등과의 작용에 의해 알코올로부터 할로겐화 알킬체를 얻는 방법을 이용해도 좋다. 혹은 알코올을 술폰산 에스테르로 변환한 후, 브롬화 리튬, 염화 리튬 또는 요오드화 나트륨과 반응시키는 2단계 반응을 거쳐 할로겐화 알킬체를 합성하는 방법을 이용해도 좋다.
각 공정에서 Arbuzov 반응을 행하는 경우, 사용되는 시약으로서는 브로모아세트산 에틸 등의 할로겐화 알킬류; 트리에틸포스파이트나 트리(이소프로필)포스파이트 등의 포스파이트류를 들 수 있다.
각 공정에서 술폰에스테르화 반응을 행하는 경우, 사용되는 술폰화제로는 메탄술포닐클로리드, p-톨루엔술포닐클로리드, 메탄술폰산 무수물, p-톨루엔술폰산 무수물, 트리플루오로메탄술폰산 무수물 등을 들 수 있다.
각 공정에서 가수 분해 반응을 행하는 경우, 시약으로서는 산 또는 염기가 이용된다. 또한 t-부틸에스테르산의 가수 분해 반응을 행하는 경우, 부생하는 t-부틸 양이온을 환원적으로 트랩하기 위해 포름산이나 트리에틸실란 등을 첨가하는 수가 있다.
각 공정에서 탈수 반응을 행하는 경우, 사용되는 탈수제로서는 황산, 오산화 2인, 옥시 염화인, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, 알루미나, 폴리인산 등을 들 수 있다.
화합물 (I)은, 예를 들어 이하의 제법에 따라 제조할 수 있다. 화합물 (I) 중, 파선의 양쪽이 시스형이 되는 결합인 화합물 및 파선의 한쪽 또는 양쪽이 트랜스형이 되는 결합인 화합물 중 어느 것도 이하에 나타내는 제법과 동일한 제법으로 제조할 수 있다. 본 발명에서는, 특히 에스테르화 시에, 목적으로 하는 화합물 (I)의 구조에 따른 적절한 원료를 이용함으로써, 목적으로 하는 구조의 화합물 (I)을 합성하는 것이 가능하다. 또한 화합물 (I)의 염은 무기 염기, 유기 염기, 유기산, 염기성 또는 산성 아미노산과의 적절한 혼합에 의해 얻을 수 있다.
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이하, 본 발명의 화합물을 함유하는 지질 입자 및 당해 지질 입자와 핵산을 함유하는 핵산 도입용 조성물의 제조 방법에 대하여 기재한다.
본 발명의 지질 입자는 본 발명의 화합물 (양이온성 지질)을 필요에 따라 그 밖의 지질 성분과 혼합한 후, 지질 성분으로부터 지질 입자를 조제하기 위한 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어 상기의 (혼합)지질 성분을 유기 용매에 용해하고, 얻어진 유기 용매 용액을 물 또는 완충액과 혼합함(예를 들어 유화법)으로써 지질 입자 분산액으로서 제조할 수 있다. 상기 혼합은, 미소 유체 혼합 시스템(예를 들어 Nano Assemblr 장치(Precision Nano Systems사))를 이용하여 실시할 수 있다. 얻어진 지질 입자는 탈염 또는 투석 및 멸균 여과에 부쳐도 좋다. 또한 필요에 따라 pH 조정, 삼투압 조정을 행하여도 좋다.
화합물 (I)은 식 (I)의 n, R 및 파선의 정의의 조합에 의해 복수의 구조를 취할 수 있다. 지질 입자의 제조에는 화합물 (I)로서 특정 구조를 갖는 1종류의 화합물을 단독으로 사용해도 좋고, 구조가 다른 여러 종류의 화합물의 혼합물로서 사용해도 좋다.
"다른 지질 성분"으로서는 앞서 설명한 것과 같은 구조 지질, 예를 들어 스테롤류, 인지질, 폴리에틸렌글리콜 지질을 들 수 있다. "다른 지질 성분"은 예를 들어 본 발명의 화합물 1몰에 대해 0.008 내지 4몰이 이용된다. 본 발명의 화합물은 다른 지질 성분(특히 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 및 폴리에틸렌글리콜 지질)과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물과 다른 지질 성분을 혼합하여 사용하는 경우의 바람직한 양태는 본 발명의 화합물 1 내지 4몰, 스테롤류 0 내지 3몰, 인지질 0 내지 2몰 및 폴리에틸렌글리콜 지질 0 내지 1몰의 혼합물이다. 본 발명의 화합물과 다른 지질 성분을 혼합하여 사용하는 경우의 보다 바람직한 양태는 본 발명의 화합물 1 내지 1.5몰, 스테롤류 0 내지 1.25몰, 인지질 0 내지 0.5몰 및 폴리에틸렌글리콜 지질 0 내지 0.125몰의 혼합물이다.
전술한 유기 용매 용액 중의 본 발명 화합물 또는 본 발명의 화합물과 다른 지질 성분과의 혼합물의 농도는 바람직하게는 0.5 내지 100mg/mL이다.
유기 용매로서는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, tert-부탄올, 아세톤, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 또는 이들 혼합물을 들 수 있다. 유기 용매는 0 내지 20%의 물 또는 완충액을 함유해도 좋다.
완충액으로서는 산성 완충액(예를 들어 아세트산 완충액, 시트르산 완충액, 2-모르폴리노에탄술폰산(MES) 완충액, 인산 완충액)이나 중성 완충액(예를 들어 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충액, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris) 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수(PBS))를 들 수 있다.
미소 유체 혼합 시스템을 이용하여 혼합을 행하는 경우, 유기 용매 용액 1용적부에 대하여 물 또는 완충액 1 내지 5용적부를 혼합하는 것이 바람직하다. 또한 해당 시스템에서 혼합액(유기 용매 용액과 물 또는 완충액과의 혼합액) 유속은 바람직하게는 0.1 내지 10mL/min이며, 온도는 바람직하게는 15 내지 45℃이다.
본 발명의 조성물은 지질 입자 또는 지질 입자 분산액을 제조할 때, 물 또는 완충액에 활성 성분으로서의 핵산을 첨가해 둠으로써 활성 성분을 포함하는 지질 입자 분산액으로서 제조할 수 있다. 활성 성분은 물 또는 완충액에서의 활성 성분의 농도가 0.05 내지 2.0mg/mL가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 조성물은 지질 입자 또는 지질 입자 분산액과 활성 성분 또는 그 수용액을 공지된 방법으로 혼화함으로써도 활성 성분을 포함하는 지질 입자 분산액으로서 제조할 수 있다. 지질 입자 분산액은 지질 입자를 적당한 분산매에 분산시킴으로써 조제할 수 있다. 또, 활성 성분의 수용액은 활성 성분을 적당한 용매에 용해시킴으로써 조제할 수 있다.
분산매 및 용매를 제외한 본 발명의 조성물에서의 본 발명의 화합물의 함량은 바람직하게는 40 내지 70 중량%이다.
분산매 및 용매를 제외한 본 발명의 조성물에서의 활성 성분의 함량은 바람직하게는 1 내지 20 중량%이다.
지질 입자 분산액 또는 조성물을 포함하는 분산액의 분산매는, 투석함으로써 물 또는 완충액으로 치환할 수 있다. 투석에는 분획 분자량 10 내지 20K의 한외 여과막을 이용해 4℃ 내지 실온에서 실시한다. 반복 투석을 해도 좋다. 분산매의 치환에는, 탄젠셜 플로우·필트레이션(TFF)을 사용해도 좋다. 또, 분산매의 치환 후 필요에 따라 pH 조정, 삼투압 조정을 해도 좋다.
이하, 본 발명의 화합물을 함유하는 지질 입자 및 당해 지질 입자와 활성 성분으로서의 핵산을 함유하는 조성물의 분석 방법에 관하여 기재한다.
(조성물 중의) 지질 입자의 입경은 공지된 수단에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어 NIBS(비접촉 후방 산란) 기술에 기초한 입자 직경 측정 장치, Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 이용하고, 자기 상관 함수의 큐물런트 해석에 의해 Z평균 입자 직경으로서 산출할 수 있다. (조성물 중의) 지질 입자의 입자 직경(평균입자 직경)은, 바람직하게는 10 내지 200 nm이다.
본 발명의 조성물에서의 활성 성분으로서의 핵산(예를 들어 siRNA, mRNA)의 농도 및 내봉률은 공지된 수단에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어 Quant-iTTM RiboGreen(등록상표)(Invitrogen)을 이용해 핵산을 형광 표지하고, 그 형광 강도를 측정함으로써 농도 및 내봉률을 구할 수 있다. 조성물 중의 핵산 농도는 농도가 기지의 핵산 수용액으로부터 작성되는 표준 곡선을 이용하여 산출할 수 있으며 내봉률은 Triton-X100(지질 입자를 붕괴시키기 위한 계면 활성제)의 첨가 유무에 따른 형광 강도의 차이를 기초로 산출할 수 있다. 또한, 조성물 중의 핵산 농도는 지질 입자에 내봉되어 있는 핵산 및 내봉되지 않은 핵산의 합계 농도를 가리키며, 내봉율은 조성물 중의 핵산 전체 중, 지질 입자에 내봉되어 있는 것의 비율을 가리킨다.
실시예
본 발명은 다시 이하의 실시예, 시험예 및 제제예에 따라 자세하게 설명되지만, 이것들은 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 또한 본 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위에서 변화시켜도 좋다.
이하의 실시예 중의 "실온"은 통상 약 10℃ 내지 약 35℃를 나타낸다. 혼합 용매에서 나타낸 비는 특별히 언급이 없는 한 용량비를 나타낸다. %는 특별히 언급이 없는 한 중량%를 나타낸다.
실시예의 컬럼 크로마토그래피에서의 용출은 특별히 언급하지 않는 한 TLC(Thin Layer Chromatography, 박층 크로마토그래피)에 의한 관찰 하에 실시하였다. TLC 관찰에서는 TLC 플레이트로서 메르크(Merck)사제의 60 F254를 이용하고, 전개 용매로서 컬럼 크로마토그래피에서 용출 용매로서 이용한 용매를 이용하였다. 또, 검출에는 UV 검출기를 채용하고, 필요에 따라 TLC 발색 시약을 이용해 관찰하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에서 NH라고 기재한 경우는 아미노프로필실란 결합 실리카겔을, Diol라고 기재한 경우는 3-(2,3-디히드록시프로폭시)프로필실란 결합 실리카겔을 이용하였다. 분취 HPLC(고속 액체 크로마토그래피)에서 C18이라고 기재했을 경우는 옥타데실 결합 실리카겔을 이용하였다. 용출 용매에서 나타낸 비는 특별히 언급이 없는 한 용량비를 나타낸다.
1H NMR은 푸리에 변환형 NMR로 측정하였다. 1H NMR의 해석에는 ACD/SpecManager(상품명) 소프트웨어 등을 이용하였다. 수산기나 아미노기 등의 프로톤 피크가 매우 완만한 피크에 대해서는 기재하지 않는 수가 있다.
MS는, LC/MS 및 MALDI/TOFMS에 의해 측정하였다. 이온화법으로서는 ESI법, APCI법 또는 MALDI법을 이용하였다. 매트릭스로서는 CHCA를 사용하였다. 데이터는 실측값(found)을 기재하였다. 통상, 분자 이온 피크가 관측되지만 프라그먼트 이온으로서 관측되는 경우가 있다. 염의 경우는, 통상, 프리체의 분자 이온 피크, 양이온종, 음이온종 혹은 프라그먼트 이온 피크가 관측된다.
이하의 실시예에서는 아래의 약호를 사용한다.
MS: 매스 스펙트럼
M: 몰 농도
N: 규정도
CDCl3: 중클로로포름
DMSO-d6: 중디메틸술폭시드
1H NMR: 프로톤 핵자기 공명
LC/MS: 액체 크로마토그래프 질량 분석계
ESI: electrospray ionization, 일렉트로스프레이 이온화
APCI: atmospheric pressure chemical ionization, 대기압 화학 이온화
MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ionization, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화
TOFMS: Time-of-flight mass spectrometry, 비행 시간형 질량 분석
CHCA: α-시아노-4-히드록시 신남산
DMF: N,N-디메틸포름아미드
THF: 테트라히드로푸란
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
TBAF: 테트라부틸암모늄플루오리드
[실시예 1] 3-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트
A) 2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올
2,2-비스(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(5.45 g), 1H-이미다졸(2.72 g) 및 DMF(190 mL)의 혼합물에 tert-부틸클로로디메틸실란(3.01 g)의 DMF(10 mL) 용액을 실온에서 첨가하였다. 24 시간 교반 후, 반응 혼합물을 감압 하 농축하였다. 잔사를 아세트산 에틸로 희석하고, 물로 3회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(2.25 g)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.08 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.53 (3H, t, J = 5.5 Hz), 3.66 (2H, s), 3.73 (6H, d, J = 5.5 Hz)
B) 3-((tert-부틸(디메틸)실릴)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트
2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(258 mg), (9Z)-테트라데카-9-엔산(769 mg) 및 DMAP(126 mg)의 DMF(3 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(790 mg)을 실온에서 첨가하였다. 18 시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세트산 에틸로 희석하고, 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH, 아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(860 mg)를 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.03 (6H, s), 0.81-0.96 (18H, m), 1.18-1.41 (36H, m), 1.53-1.67 (6H,m), 1.91-2.10 (12H, m), 2.29 (6H, t, J = 7.6 Hz), 3.58 (2H, s), 4.08 (6H, s), 5.27-5.43 (6H, m)
C) 3-히드록시-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트
3-((tert-부틸(디메틸)실릴)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트(5.91 g)의 THF(120 mL) 용액에 TBAF의 THF 용액(1 M, 14.85 mL)과 아세트산(4.91 mL)의 혼합물을 실온에서 첨가하였다. 3 일간 교반 후, 반응 혼합물을 감압 하 농축하였다. 잔사를 아세트산 에틸로 희석하고, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액으로 1회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(4.96 g)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.82-0.97 (9H, m), 1.16-1.42 (36H, m), 1.52-1.68 (6H, m), 1.90-2.12 (12H, m), 2.32 (6H, t, J = 7.6 Hz), 2.52 (1H, t, J = 7.0 Hz), 3.49 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.11 (6H, s), 5.26-5.42 (6H, m)
D) 3-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트
3-히드록시-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트(4.96 g), DMAP(796 mg) 및 4-(디메틸아미노)부탄산 염산염(2.19 g)의 DMF(20 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(2.50 g)을 실온에서 첨가하였다. 18 시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세트산 에틸로 희석하여 포화 탄산 수소 나트륨 수용액으로 1회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH, 아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(5.31 g)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.82-0.94 (9H, m), 1.20-1.42 (36H, m), 1.50-1.66 (6H, m), 1.69-1.83 (2H, m), 1.90-2.10 (12H, m), 2.20 (6H, s), 2.23-2.41 (10H, m), 4.11 (8H, s), 5.23-5.44 (6H, m)
[실시예 4] 3-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-헥사데카-9-에노에이트
A) 2-(((tert-부틸(디페닐)실릴)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올
2,2-비스(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(5.0 g), 1H-이미다졸(2.5 g) 및 DMF(200 mL)의 혼합물에 tert-부틸클로로디페닐실란(5.1 g)의 DMF(10 mL) 용액을 실온에서 첨가하였다. 18 시간 교반 후, 반응 혼합물을 감압 하 농축하였다. 잔사를 아세트산 에틸로 희석하고, 물로 3회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(6.4 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δppm 1.07 (9H, s), 2.34 (3H, t, J = 5.5 Hz), 3.67 (2H, s), 3.74 (6H, d, J = 5.5 Hz), 7.39-7.48 (6 H, m), 7.63-7.67 (4H, m)
B) (5-(((tert-부틸(디페닐)실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메탄올
2-(((tert-부틸(디페닐)실릴)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(3.5 g), 2,2-디메톡시프로판(1.5 g)의 아세톤(35 mL) 용액에 p-톨루엔술폰산 1수화물(88.9 mg)을 실온에서 첨가하였다. 2 시간 교반 후, 반응 혼합물에 묽은 암모니아수를 첨가하여 중화한 후, 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(2.7 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δppm 1.07 (9H, s), 1.27 (3H, s), 1.41 (3H, s), 2.12-2.18 (1 H, m), 3.69-3.78 (8H, m), 7.38-7.47 (6H, m), 7.65-7.69 (4H, m)
C) (5-(((tert-부틸(디페닐)실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸(9Z)-헥사데카-9-에노에이트
(5-(((tert-부틸(디페닐)실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메탄올(910 mg), DMAP(215 mg) 및 (9Z)-헥사데카-9-엔산(838 mg)의 DMF(10 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(757 mg)을 실온에서 첨가하였다. 6 시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(1.43 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δppm 0.84 - 0.91 (3 H, m), 1.03 - 1.07 (9 H, m), 1.22 - 1.35 (16 H, m), 1.40 (6 H, d, J = 17.0 Hz), 1.49 - 1.63 (2 H, m), 2.01 (4 H, q, J=6.5 Hz), 2.24 (2 H, t, J=7.6 Hz), 3.65 (2 H, s), 3.73 (2 H, d, J=11.7 Hz), 3.80 (2 H, d, J=12.0 Hz), 4.17 (2 H, s), 5.29 - 5.39 (2 H, m), 7.35 - 7.46 (6 H, m), 7.65 (4 H, d, J=6.9 Hz)
D) (5-(히드록시메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸(9Z)-헥사데카-9-에노에이트
(5-(((tert-부틸(디페닐)실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸(9Z)-헥사데카-9-에노에이트(1.43 g)의 THF(4 mL) 용액에 TBAF의 THF 용액(1M, 2.64 mL)을 실온에서 첨가하였다. 3시간 교반 후, 반응 혼합물을 감압 하 농축하였다. 잔사를 아세트산 에틸로 희석하고, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액으로 1회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(0.82 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δppm 0.85 - 0.91 (3 H, m), 1.24 - 1.36 (16 H, m), 1.42 (6 H, s), 1.58 - 1.66 (2 H, m), 2.01 (4 H, q, J=6.5 Hz), 2.30 (1 H, t, J=6.6 Hz), 2.35 (2 H, t, J=7.6 Hz), 3.48 (2 H, d, J=6.6 Hz), 3.69 - 3.75 (4 H, m), 4.25 (2 H, s), 5.31 - 5.38 (2 H, m)
E) (5-(((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸(9Z)-헥사데카-9-에노에이트
(5-(히드록시메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸(9Z)-헥사데카-9-에노에이트(410 mg), DMAP(97 mg) 및 4-(디메틸아미노)부티르산 염산염(250 mg)의 DMF(4 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(343 mg)을 50 ℃에서 첨가하였다. 4시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH, 아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(430 mg)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δppm 0.86 - 0.91 (3 H, m), 1.24 - 1.36 (16 H, m), 1.42 (6 H, s), 1.53 - 1.69 (2 H, m), 1.78 (2 H, m), 1.98 - 2.04 (4 H, m), 2.21 (6 H, s), 2.29 (4 H, m), 2.37 (2 H, t, J=7.6 Hz), 3.74 (4 H, s), 4.11 (4 H, d, J=5.7 Hz), 5.31 - 5.38 (2 H, m)
F) 3-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-헥사데카-9-에노에이트
(5-(((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸(9Z)-헥사데카-9-에노에이트(430 mg)에 아세트산(2 mL), 물(1 mL)을 첨가하여 75 ℃에서 2 시간 교반 후, 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사에 아세트산 에틸, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액을 첨가하여 2 시간 동안 교반하였다. 물로 2회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 얻어진 잔사에 DMAP(201 mg) 및 (9Z)-테트라데카-9-엔산(466 mg)의 DMF(4 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(458 mg)을 50 ℃에서 첨가하였다. 4 시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH, 아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(604 mg)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δppm 0.85 - 0.92 (9 H, m), 1.24 - 1.36 (40 H, m), 1.55 - 1.64 (6 H, m), 1.73 - 1.80 (2 H, m), 1.98 - 2.05 (12 H, m), 2.20 (6 H, s), 2.24 - 2.33 (8 H, m), 2.36 (2 H, t, J=7.6 Hz), 4.09 - 4.13 (8 H, m), 5.31 - 5.38 (6 H, m)
[실시예 8] 2-(((N,N-디메틸-β-알라닐)옥시)메틸)-2-((옥타노일옥시)메틸)프로판-1,3-디일(9Z, 9'Z)비스-테트라데카-9-에노에이트
A) (2-(4-메톡시페닐)-1,3-디옥산-5,5-디일)디메탄올
2,2-비스(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(506 g)의 수(2.0 L)용액을 50 ℃에서 교반하였다. 농염산(18 mL)을 첨가하고 p-메톡시벤즈알데히드(474 mL)를 30 ℃ 부근에서 3시간에 걸쳐 적하하였다. 그 후, 반응액을 25 ℃로 하여 5시간 동안 교반하였다. 2N 수산화 나트륨 수용액(120 mL)을 넣고 1시간 동안 교반하였다. 결정을 여과하고 물로 세정한 후, 아세트산 에틸/헥산으로 재결정하여 표제 화합물(769 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm 3.24 (2H, d, J = 5.0 Hz), 3.67 (2H, d, J = 5.4 Hz), 3.74 (3H, s), 3.77 (2H, d, J = 11.3 Hz), 3.88 (2H, t, J = 11.3 Hz), 4.53 (1H, t, J = 5.4 Hz), 4.62 (1H, t, J = 5.0 Hz), 5.34 (1H, s), 6.90 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.33 (2H, d, J = 8.9 Hz)
B-1) 2-(히드록시메틸)-2-(((4-메톡시벤질)옥시)메틸)프로판-1,3-디올　
(2-(4-메톡시페닐)-1,3-디옥산-5,5-디일)디메탄올(10.0 g)의 톨루엔(100 mL) 현탁 용액에 1.5M DIBAL-H 용액(105 mL)을 실온에서 적하하여 5시간 동안 교반하였다. 메탄올(30 mL)을 첨가한 후, 2N 염산(20 mL)과 4N 수산화 나트륨 수용액(240 mL)을 첨가하여 2 시간 동안 교반한 후, 톨루엔층을 제거하였다. 수층을 염산으로 중화한 후, 아세트산 에틸로 추출하고, 포화 식염수로 2회 세정 후 셀 라이트 여과하였다. 용매를 감압 증류하고 잔사를 아세트산 에틸/헥산으로 재결정하여 표제 화합물(6.6 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm 3.32 (2H, s), 3.39 (6H, d, J = 5.4 Hz), 3.74 (3H, s), 4.21 (3H, t, J = 5.4 Hz), 4.36 (2H, s), 6.90 (2H, d like, J = 7.8 Hz), 7.23 (2H, d like, J = 7.8 Hz)
C-1) (5-(((4-메톡시벤질)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메탄올
2-(히드록시메틸)-2-(((4-메톡시벤질)옥시)메틸)프로판-1,3-디올(1.00g), 2,2-디메톡시프로판(1.22 g)의 DMF(5 mL) 용액에 피리디늄 p-톨루엔술포네이트(10 mg)를 실온에서 첨가하였다. 2시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 포화 탄산 수소 나트륨 수용액으로 1회, 5 % 식염수로 2회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(426 mg)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm 1.29 (3H, s), 1.29 (3H, s), 3.35 (2H, s), 3.39 (2H, d, J = 5.1 Hz), 3.61 (4H, s), 3.74 (3H, s), 4.38 (2H, s), 4.59 (1H, t, J = 5.1 Hz), 6.90 (2H, d like, J = 7.5 Hz), 7.24 (2H, d like, J = 7.5 Hz)
B-2) 9-(4-메톡시페닐)-3,3-디메틸-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸
(2-(4-메톡시페닐)-1,3-디옥산-5,5-디일)디메탄올(2.00 g), 2,2-디메톡시프로판(2.46 g)의 DMF(8 mL) 용액에 피리디늄 p-톨루엔술포네이트(20 mg)를 실온에서 첨가하였다. 4시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세트산 에틸로 희석하여 포화 탄산 수소 나트륨 수용액으로 2회, 포화 식염수로 2회 세정한 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 아세트산 에틸/헥산으로 재결정하여 표제 화합물(1.62 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm 1.34 (6H, s), 3.33 (2H, s), 3.63 (2H, d, J = 11.7 Hz), 3.74 (3H, s), 3.99 (2H, s), 4.12 (2H, d, J = 11.7 Hz), 5.37 (1H, s), 6.90 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.34 (2H, d, J = 8.8 Hz)
C-2) (5-(((4-메톡시벤질)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메탄올
9-(4-메톡시페닐)-3,3-디메틸-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸(22.0 g)의 톨루엔(200 mL) 현탁 용액에 1.5M DIBAL-H 용액(60 mL)을 5 내지 20 ℃에서 적하하고 15 ℃에서 3시간 동안 교반하였다. 메탄올(22 mL)을 첨가한 후, 2N 수산화 나트륨 수용액(100 mL), 4N 수산화 나트륨 수용액(200 mL)을 순서대로 적하하였다. 1.5시간 동안 교반한 후, 톨루엔층을 분취하고 5 % 식염수로 세척하였다. 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(14.7 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm 1.29 (3H, s), 1.29 (3H, s), 3.35 (2H, s), 3.39 (2H, d, J = 5.1 Hz), 3.61 (4H, s), 3.74 (3H, s), 4.38 (2H, s), 4.59 (1H, t, J = 5.1 Hz), 6.90 (2H, d like, J = 7.5 Hz), 7.24 (2H, d like, J = 7.5 Hz)
D) (5-(((4-메톡시벤질)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸옥타노에이트
(5-(((4-메톡시벤질)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메탄올(2.00 g), DMAP(412 mg) 및 옥탄산(1.27 g)의 DMF(20 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(1.94 g)을 50 ℃에서 첨가하였다. 4 시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(2.78 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ0.84 - 0.91 (3 H, m), 1.22 - 1.33 (8 H, m), 1.40 (6 H, s), 1.53 - 1.61 (2 H, m), 2.26 (2 H, t, J = 7.6 Hz), 3.39 (2 H, s), 3.68 - 3.74 (2 H, m), 3.76 - 3.80 (2 H, m), 3.80 (3 H, s), 4.15 (2 H, s), 4.42 (2 H, s), 6.87 (2 H, d, J = 7.8 Hz), 7.20 - 7.24 (2 H, m)
E) (5-(히드록시메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸옥타노에이트
(5-(((4-메톡시벤질)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸옥타노에이트(2.78 g)의 에탄올(30 mL) 용액에 Pd 탄소(840 mg)를 실온에서 첨가하고, 수소 분위기 하에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 후, Pd 탄소를 여과 제거한 후, 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(1.35 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ0.85 - 0.91 (3 H, m), 1.23 - 1.34 (8 H, m), 1.38 - 1.44 (6 H, m), 1.63 (2 H, m), 2.30 - 2.38 (3 H, m), 3.48 (2 H, d, J = 6.6 Hz), 3.68 - 3.75 (4 H, m), 4.25 (2 H, s)
F) (5-(((N,N-디메틸-β-알라닐)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸옥타노에이트　
(5-(히드록시메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸옥타노에이트(400 mg), DMAP(129 mg) 및 3-(디메틸아미노)프로판산 염산염(305 mg)의 DMF(4 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(456 mg)을 실온에서 첨가하였다. 4시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH, 아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(320 mg)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ0.84 - 0.92 (3 H, m), 1.21 - 1.33 (8 H, m), 1.42 (6 H, s), 1.61 (2 H, br), 2.23 (6 H, s), 2.32 (2 H, t, J = 7.6 Hz), 2.47 - 2.51 (2 H, m), 2.57 - 2.61 (2 H, m), 3.75 (4 H, s), 4.13 (4 H, d, J = 11.7 Hz)
G) 2-(((N,N-디메틸-β-알라닐)옥시)메틸)-2-((옥타노일옥시)메틸)프로판-1,3-디일(9Z,9'Z)비스-테트라데카-9-에노에이트
(5-(((N,N-디메틸-β-알라닐)옥시)메틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-일)메틸옥타노에이트(320 mg)에 아세트산(1.6 mL), 물(0.8 m L)를 첨가하여 65 ℃에서 3.5시간 동안 교반한 후, 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사에 아세트산 에틸, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액을 첨가하여 2 시간 동안 교반하였다. 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 얻어진 잔사(150 mg), DMAP(101 mg) 및 (9Z)-테트라데카-9-엔산(235 mg)의 DMF(4.5 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(231 mg)을 50 ℃에서 첨가하였다. 8 시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH, 아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(230 mg)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ0.84 - 0.93 (9 H, m), 1.24 - 1.36 (30 H, m), 1.53 - 1.65 (8 H, m), 1.98 - 2.05 (8 H, m), 2.22 (6 H, s), 2.30 (6 H, t, J = 7.6 Hz), 2.48 (2 H, t, J = 6.9 Hz), 2.58 (2 H, t, J = 6.8 Hz), 4.06 - 4.22 (8 H, m), 5.31 - 5.38 (4 H, m)
[실시예 11] 2-(((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)메틸)-2-((도데카노일옥시)메틸)프로판-1,3-디일(9Z, 9'Z)비스-테트라데카-9-에노에이트
A) 3-히드록시-2,2-비스(히드록시메틸)프로필도데카노에이트
2,2-비스(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(5.00 g), DMAP(2.24 g) 및 라우린산(3.68 g)의 DMF(150 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(7.04 g)을 실온에서 첨가하였다. 20 시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(1.79 g)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ0.85 - 0.91 (3 H, m), 1.22 - 1.33 (16 H, m), 1.59 - 1.66 (3 H, m), 2.36 (2 H, t, J = 7.6 Hz), 2.51 (2 H, t, J = 5.8 Hz), 3.65 (6 H, d, J = 5.7 Hz), 4.23 (2 H, s)
B) 2-((도데카노일옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디일(9Z,9'Z)비스-테트라데카-9-에노에이트
3-히드록시-2,2-비스(히드록시메틸)프로필도데카노에이트(400 mg), DMAP(153 mg) 및 (9Z)-테트라데카-9-엔산(569 mg)의 DMF(4 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(602 mg)을 실온에서 첨가하였다. 8시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(230 mg)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ0.85 - 0.93 (9 H, m), 1.22 - 1.36 (40 H, m), 1.58 - 1.65 (6 H, m), 1.99 - 2.05 (8 H, m), 2.32 (6 H, t, J = 7.6 Hz), 2.52 (1 H, t, J = 7.1 Hz), 3.48 (2 H, d, J = 6.9 Hz), 4.09 - 4.14 (6 H, m), 5.31 - 5.38 (4 H, m)
C) 2-(((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)메틸)-2-((도데카노일옥시)메틸)프로판-1,3-디일(9Z, 9'Z)비스-테트라데카-9-에노에이트
2-((도데카노일옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디일(9Z,9'Z)비스-테트라데카-9-에노에이트(230 mg), DMAP(38 mg) 및 4-(디메틸아미노)부티르산 염산염(105 mg)의 DMF(4 mL) 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(150 mg)을 실온에서 첨가하였다. 3시간 교반 후, 반응 혼합물에 아세트산 에틸을 첨가하고 물로 2회, 포화 식염수로 1회 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 용매를 감압 하 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH, 아세트산 에틸/헥산)로 정제하여 표제 화합물(100 mg)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ0.85 - 0.93 (9 H, m), 1.23 - 1.35 (40 H, m), 1.55 - 1.67 (6 H, m), 1.77 (2 H, m), 1.98 - 2.05 (8 H, m), 2.20 (6 H, s), 2.24 - 2.33 (8 H, m), 2.36 (2 H, t, J = 7.6 Hz), 4.09 - 4.13 (8 H, m), 5.31 - 5.38 (4 H, m)
상기의 각 실시예에 나타낸 방법 또는 이에 준하는 방법 중 어느 것에 따라 이하의 표 중의 실시예 2 내지 3, 5 내지 7 및 9 내지 10이 제조되었다. 이들 실시예에 대해 실시예 1, 4, 8 및 11과 함께 화합물의 명칭, 구조식 및 제조 시에 실시된 질량수(표 중 MS로 나타낸다)를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00005
[본 발명의 지질 입자 및 핵산을 함유하는 핵산 도입용 조성물의 제조예 및 시험예]
[제조예 1]
지질 혼합물(실시예에서 제조한 양이온성 지질 : DPPC : 콜레스테롤 : GM-020 = 60 : 10.6 : 28 : 1.4, 몰비)을 90 % EtOH, 10 % RNase 프리 워터에 용해하여 8.5 mg/mL 지질 용액을 얻었다. Luciferase mRNA(TriLink BioTechnologies)을 10mM 2-모르폴리노에탄술폰산(MES) 완충액 pH 4.0에 용해하여 0.22 mg/mL의 핵산 용액을 얻었다. 얻어진 지질 용액 및 핵산 용액을 실온에서 NanoAssemblr 장치(Precision Nanosystems)에 의해 유속비 3 mL/min : 6 mL/min로 혼합하여 핵산을 내봉하는 지질 입자를 포함하는 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액은 Slyde-A-Lyzer(20k 분획 분자량, Thermo scientific)를 이용하여 물에 대하여 실온에서 1시간, PBS에 대하여 4℃에서 48시간 투석을 실시하였다. 이어서 0.2 μm의 syringe filter(Iwaki)를 이용하여 여과하고, 핵산 도입용 조성물로서 조제한 후, 4℃에 보존하였다. 지질 입자의 입자 직경은 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 이용하여 측정하였다. 또한 지질 입자에서의 mRNA 농도 및 내봉률은 Quant-iTTM RiboGreen(등록상표)(Invitrogen)을 이용해 측정하였다. 분석 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00006
[시험예 1] 배양 세포로의 mRNA 트랜스펙션 시험
인간 대장암 유래 세포주 HCT116을 6000 cells/well의 세포 밀도로 96-Well 플레이트에 배양하고, 24시간 후에 10ng의 luciferase mRNA를 함유하는 핵산 도입용 조성물(제조예 1에서 제조한 것을 mRNA로서 10ng/10μL이 되도록 희석한 액) 10μL을 배지에 첨가하였다. mRNA의 첨가로부터 24시간 후, HCT116에 발현한 luciferase 양은 Picagene LT2.0 키트(도요보)를 이용하여 측정하였다. 측정 결과를 표 3 및 표 4에 나타낸다.
Figure pct00007
Figure pct00008
[본 발명의 지질 입자 및 핵산을 함유하는 핵산 도입용 조성물의 제조예 및 시험예]
[제조예 2]
지질 혼합물(실시예에서 제조한 양이온성 지질 : DPPC : 콜레스테롤 : GM-020 = 60 : 10.6 : 28 : 1.4 몰비)을 90 % EtOH, 10 % RNase 프리 워터에 용해하여 약 7 mg/ml의 지질 용액을 얻었다. Col1a1에 대한 siRNA와 Factor VII(FVII)에 대한 siRNA는 동량씩 혼합하여 25mM 아세트산 완충액 pH 4.0에 용해하여 0.2 mg/ml의 핵산 용액을 얻었다. 또한 각 siRNA의 서열 정보는 아래 표에 나타낸다. 얻어진 지질 용액 및 핵산 용액을 실온에서 NanoAssemblr 장치(Precision Nanosystems)에 의해 유속비 3 ml/min : 9 ml/min로 혼합하여 핵산을 내봉하는 지질 입자를 포함하는 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액은 Slyde-A-Lyzer(20k 분획 분자량, Thermo scientific)를 사용하여 물에 대하여 실온에서 1 시간, PBS에 대하여 4℃에서 48 시간 투석을 실시하였다. 이어서 0.2 μm의 syringe filter(Iwaki)를 이용하여 여과를 하여 핵산 도입용 조성물로서 제조한 후, 4℃에 보존하였다. 지질 입자의 입자 직경은 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 이용하여 측정하였다. 또한 지질 입자에서의 mRNA 농도 및 내봉률은 Quant-iTTM RiboGreen(등록 상표)(Invitrogen)를 이용하여 측정하였다. 분석 결과를 표 6 에 나타낸다.
Figure pct00009
Figure pct00010
[시험예 2] 사염화 탄소 간 장해 모델 마우스에서의 간성 세포로의 siRNA 딜리버리 시험
Col1a1 siRNA 및 FVII siRNA를 내봉한 지질 입자의 PBS 분산액은 siRNA 농도가 40 μg/ml 및 120 μg/ml가 되도록 PBS로 희석하여 Balb/c 마우스에 대한 siRNA 투여량이 0.2 mg/kg 및 0.6 mg/kg이 되도록 안와 정맥총 내에 투여하였다. siRNA의 투여 3시간 후 사염화 탄소를 0.1 ml/kg이 되도록 경구 투여를 실시하였다. 사염화 탄소의 투여로부터 4 일 후, 마우스는 이소플루란 마취 하에서의 방혈에 의해 안락사시켜 간을 회수하였다. 얻어진 간으로부터는 RNeasy Mini Kit(QIAGEN사)에 의해 total RNA를 추출하고, 정량적 PCR법에 따라 Col1a1 mRNA, FVII mRNA 및 GAPDH mRNA 양의 측정을 행하였다. GAPDH mRNA 양에 대해 표준화를 실시한 Col1a1 mRNA 및 FVII mRNA의 발현 저하율을 siRNA 비투여 마우스를 기준으로 산출하여 아래 표에 나타냈다.
Figure pct00011
본 발명의 화합물, 지질 입자 또는 조성물은 다양한 세포, 조직 또는 장기에 대해 효율적으로 핵산을 도입하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 화합물, 지질 입자 또는 조성물은, 핵산 의약에서의 DDS 기술로서 이용 가능하다. 또한 본 발명의 화합물, 지질 입자 또는 조성물은 연구용 핵산 도입 시약으로서도 이용 가능하다.
<110> TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED <120> Cationic Compounds <130> PT38-9027WO <150> JP 2017-254667 <151> 2017-12-28 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 siRNA (Sense) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> The sequence comprises both RNA and DNA bases, some of which are modified bases. <220> <221> modified_base <222> (2) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (3) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (4) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (8) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (10) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (12) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (12) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (13) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (14) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (17) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (18) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> The nucleosides (t and t) are bound with phosphorothioate. <400> 1 gucuagacau guucagcuut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 siRNA (Antisense) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> The sequence comprises both RNA and DNA bases, some of which are modified bases. <220> <221> modified_base <222> (9) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (15) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> The nucleosides (t and t) are bound with phosphorothioate. <400> 2 aagcugaaca ugucuagact t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor VII siRNA (Sense) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> The sequence comprises both RNA and DNA bases, some of which are modified bases. <220> <221> modified_base <222> (1) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (2) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (4) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (10) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (12) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (13) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (14) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (15) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (16) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> modified_base <222> (17) <223> The "c" stands for 2'-O-methylcytidine (cm) <220> <221> modified_base <222> (19) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> The nucleosides (t and t) are bound with phosphorothioate. <400> 3 cuacgaaagc auccuucaut t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor VII siRNA (Antisense) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> The sequence comprises both RNA and DNA bases, some of which are modified bases. <220> <221> modified_base <222> (17) <223> The "u" stands for 2'-O-methyluridine (um) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> The nucleosides (t and t) are bound with phosphorothioate. <400> 4 augaaggaug cuuucguagt t 21

Claims (8)

  1. 식 (I）：
    Figure pct00012

    [식 (I) 중,
    n은 2 내지 5의 정수를,
    R은 직쇄상 C1-5 알킬기, 직쇄상 C7-11 알케닐기 또는 직쇄상 C11 알카디에닐기를,
    파선은 각각 독립적으로 시스형 또는 트랜스형의 결합을 나타낸다.］
    로 표시되는 화합물 또는 그 염.
  2. 3-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트 또는 그 염.
  3. 3-((5-(디메틸아미노)펜타노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트 또는 그 염.
  4. 3-((6-(디메틸아미노)헥사노일)옥시)-2,2-비스(((9Z)-테트라데카-9-에노일옥시)메틸)프로필(9Z)-테트라데카-9-에노에이트 또는 그 염.
  5. 제1항에 기재된 화합물 또는 그 염을 함유하는 지질 입자.
  6. 핵산 및 제5항에 기재된 지질 입자를 함유하는 핵산 도입용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 핵산이 RNA인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, RNA가 mRNA 또는 siRNA인 조성물.
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