BR112020012424A2 - composto, partícula lipídica, e, composição para introdução de ácido nucleico. - Google Patents

composto, partícula lipídica, e, composição para introdução de ácido nucleico. Download PDF

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Abstract

A presente invenção provê: uma técnica que torna possível a introdução de componentes ativos, em particular de ácidos nucleicos, para dentro de células com excelente eficácia; e lipídios catiônicos, etc., usados na técnica. Este composto ou um sal do mesmo é representado pela fórmula (I). Na fórmula, n é um número inteiro de 2 a 5, R é um grupo alquila C1-5 de cadeia linear, um grupo alquenila C7-11 de cadeia linear, ou um grupo alcadienila C11 de cadeia linear, e as linhas onduladas representam, cada uma, independentemente, uma ligação-cis ou uma ligação-trans.

Description

1 / 66 COMPOSTO, PARTÍCULA LIPÍDICA, E, COMPOSIÇÃO PARA
INTRODUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se a um lipídio catiônico que permite a introdução de ácidos nucleicos, como um ingrediente ativo, para dentro de muitos tipos de células, tecidos, ou órgãos. A presente invenção refere-se, adicionalmente, a uma partícula lipídica contendo o lipídio catiônico, e a uma composição contendo a partícula lipídica e um ácido nucleico.
Fundamentos da Invenção
[002] Pesquisa e desenvolvimento intensivos de fármacos de ácido nucleico, que contêm um ácido nucleico como um ingrediente ativo, têm sido realizados em anos recentes. Por exemplo, numerosos estudos têm sido conduzidos para fármacos de ácido nucleico tendo efeito de decomposição ou efeito inibitório de função sobre mRNAs alvo incluindo ácidos nucleicos como siRNAs, miRNAs, miméticos de miRNA, ácidos nucleicos antissenso.
Além disso, estudos têm sido realizados para fármacos de ácido nucleico contendo um mRNA ou semelhantes que codifica uma proteína de interesse em células. Em relação a tais pesquisa e desenvolvimento, técnicas para introduzir ácidos nucleicos em células, tecidos, ou órgãos, com alta eficiência têm sido desenvolvidas com técnicas de sistema de distribuição de fármaco.
[003] Convencionalmente conhecida como tal uma técnica DDS é uma tal técnica que um ácido nucleico e um lipídio são misturados para formar um complexo e as células são permitidas incorporar o ácido nucleico via o complexo. Convencionalmente conhecidos como lipídios para uso na
2 / 66 formação do complexo são os lipídios catiônicos, lipídios poliméricos hidrofílicos, lipídios auxiliares, e assim por diante. Como tais lipídios catiônicos, por exemplo, são conhecidos os compostos descritos nos documentos da técnica anterior, como mostrados abaixo.
[004] Literatura de Patente 1 descreve um composto representado pela seguinte fórmula ou um sal do mesmo, e assim por diante.
[Fórmula 1]
[005] É especificado para a fórmula que R1 é independentemente selecionado do grupo consistindo em alquila C8-C24 opcionalmente substituída e alquenila C8-C24 opcionalmente substituída; cada R2 e R3 é independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, alquila C1-C8 opcionalmente substituída, arilalquila opcionalmente substituída, e assim por diante; cada Y1 e Y2 é independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, alquila C1-C6 opcionalmente substituída, arilalquila opcionalmente substituída, e assim por diante; cada Y3, se presente, é independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, alquila C1-C8 opcionalmente substituída, arilalquila opcionalmente substituída, e assim por diante; m é um número inteiro de 1 a 4; n é um número inteiro de 0 a 3; p é 0 ou 1; a soma de m, n, e p é 4; k é um número inteiro de 1 a 5; e q é 0 ou 1.
[006] Literatura de Patente 2 descreve um composto representado
3 / 66 pela seguinte fórmula ou um sal do mesmo, e assim por diante.
[Fórmula 2]
[007] Na fórmula, W denota a fórmula -NR1R2 ou a fórmula - N+R3R4R5(Z-); R1 e R2 denotam, cada um, independentemente, um grupo alquila C1-4 ou átomo de hidrogênio; R3, R4, e R5 denotam, cada um, independentemente, um grupo alquila C1-4; Z- denota um íon negativo; X denota um grupo alquileno C1-6 que pode estar substituído; YA, YB, e YC denotam, cada um, independentemente, um grupo metino que pode estar substituído; LA, LB, e LC denotam, cada um, independentemente, um grupo metileno que pode estar substituído ou uma ligação; RA1, RA2, RB1, RB2, RC1, e RC2 denotam, cada um, independentemente, um grupo alquila C4-10 que pode estar substituído.
Lista de Citações Literatura de Patente
[008] Literatura de Patente 1: Publicação Internacional nº WO 2003/102150.
[009] Literatura de Patente 2: Publicação Internacional nº WO 2016/021683.
4 / 66
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema Técnico
[0010] Supõe-se que os lipídios catiônicos que permitem a introdução de ácidos nucleicos para dentro de células com alta eficiência contribuem para a criação de fármacos de ácido nucleico que são superiores em termos de manifestação de ação do fármaco, segurança do fármaco (toxicidade baixa), e assim por diante e apresentam efeito farmaceuticamente superior. Supõe-se que os lipídios catiônicos que permitem a introdução de ácidos nucleicos para dentro de várias células permitem a criação de fármacos de ácido nucleico para doenças que ocorrem em vários tecidos. Atualmente, entretanto, não tem sido verificado lipídio catiônico que satisfaça suficientemente aqueles requisitos.
[0011] Um objetivo da presente invenção é prover uma técnica que permite a introdução de ácidos nucleicos para dentro de células com eficiência superior; e lipídios catiônicos, etc., para uso na técnica. Um objetivo da presente invenção, a partir de um outro ponto de vista, é prover uma técnica que permite a introdução de ácidos nucleicos para dentro de várias células; e compostos, etc., para uso na técnica.
Solução do Problema
[0012] Os presentes inventores têm diligentemente examinado para solucionar o problema e verificaram que o problema é bem solucionado com sucesso pelo uso de um composto representado pela fórmula abaixo ou um sal do mesmo, completando, assim, a presente invenção.
[0013] Especificamente, a presente invenção refere-se a pelo menos os seguintes.
5 / 66
[0014] [1] Um composto representado pela fórmula (I): [Fórmula 3] em que n representa um número inteiro de 2 a 5, R representa um grupo alquila C1-5 linear, um grupo alquenila C7-11 linear, ou um grupo alcadienila C11 linear, e as linhas onduladas representam, cada uma, independentemente, uma ligação-cis ou uma ligação-trans, ou um sal do mesmo.
[0015] [2] (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((4- (dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9-enoiloxi)metil)propila ou um sal do mesmo.
[0016] [3] (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((5- (dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9-enoiloxi)metil)propila ou um sal do mesmo.
[0017] [4] (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((6- (dimetilamino)hexanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9-enoiloxi)metil)propila ou um sal do mesmo.
[0018] [5] Uma partícula lipídica contendo o composto ou um sal do mesmo de acordo com o item 1.
6 / 66
[0019] [6] Uma composição para introdução de ácido nucleico contendo um ácido nucleico e a partícula lipídica de acordo com o item 5.
[0020] [7] A composição de acordo com o item 6, em que o ácido nucleico é um RNA.
[0021] [7a] A composição de acordo com o item 6, em que o ácido nucleico é um DNA.
[0022] [8] A composição de acordo com o item 7, em que o RNA é um mRNA ou um siRNA.
[0023] Aqui, “o composto representado pela fórmula (I)” é ocasionalmente chamado de o “composto (I)”. “O composto representado pela fórmula (I) ou um sal do mesmo” é ocasionalmente chamado de “o composto da presente invenção”. Uma “partícula lipídica contendo o composto representado pela fórmula (I) ou um sal do mesmo (o composto da presente invenção)” é ocasionalmente chamada de “a partícula lipídica da presente invenção”. Uma “composição para introdução de ácido nucleico contendo um ácido nucleico e a partícula lipídica da presente invenção” é ocasionalmente chamada de “a composição da presente invenção”.
Efeitos Vantajosos da Invenção
[0024] A presente invenção permite a introdução de ácidos nucleicos para dentro de células, tecidos, ou órgãos com eficiência superior. A presente invenção permite a introdução de ácidos nucleicos para dentro de vários tipos de células, tecidos, ou órgãos (por exemplo, células cancerosas). A presente invenção permite a aquisição de fármacos ou reagentes para pesquisa para introduzir um ácido nucleico em vários tipos de células, tecidos, ou órgãos.
Além disso, se um ácido nucleico é introduzido em células, um tecido, ou um
7 / 66 órgão mediante a presente invenção, a eficiência de manifestação da atividade (por exemplo, ação do fármaco) possuída pelo ácido nucleico é alta.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0025] Agora, definições de substituintes aqui usadas serão descritas em detalhe. Os substituintes têm as seguintes definições, salvo especificação em contrário.
[0026] Exemplos, aqui, do “grupo alquila C1-5 linear”, incluem metila, etila, propila, butila, e pentila.
[0027] Exemplos, aqui, do “grupo alquenila C7-11 linear” incluem 1- heptenila, 2-heptenila, 3-heptenila, 4-heptenila, 5-heptenila, 6-heptenila, 1- octenila, 2-octenila, 3-octenila, 4-octenila, 5-octenila, 6-octenila, 7-octenila, 1-nonenila, 2-nonenila, 3-nonenila, 4-nonenila, 5-nonenila, 6-nonenila, 7- nonenila, 8-nonenila, 1-decenila, 2-decenila, 3-decenila, 4-decenila, 5- decenila, 6-decenila, 7-decenila, 8-decenila, 9-decenila, 1-undecenila, 2- undecenila, 3-undecenila, 4-undecenila, 5-undecenila, 6-undecenila, 7- undecenila, 8-undecenila, 9-undecenila, e 10-undecenila. Embora cada um destes grupos alquenila C7-11 linear tenha uma ligação dupla de carbono- carbono, e consequentemente a ligação dupla de carbono-carbono possa formar uma estrutura-cis e uma estrutura-trans, a ligação dupla de carbono- carbono pode formar qualquer uma das estruturas.
[0028] Exemplos, aqui, do “grupo alcadienila C11 linear” incluem 1,3- undecadienila, 1,4-undecadienila, 1,5-undecadienila, 1,6-undecadienila, 1,7- undecadienila, 1,8-undecadienila, 1,9-undecadienila, 1,10-undecadienila, 2,4- undecadienila, 2,5-undecadienila, 2,6-undecadienila, 2,7-undecadienila, 2,8- undecadienila, 2,9-undecadienila, 2,10-undecadienila, 3,5-undecadienila, 3,6-
8 / 66 undecadienila, 3,7-undecadienila, 3,8-undecadienila, 3,9-undecadienila, 3,10- undecadienila, 4,6-undecadienila, 4,7-undecadienila, 4,8-undecadienila, 4,9- undecadienila, 4,10-undecadienila, 5,7-undecadienila, 5,8-undecadienila, 5,9- undecadienila, 5,10-undecadienila, 6,8-undecadienila, 6,9-undecadienila, 6,10-undecadienila, 7,9-undecadienila, 7,10-undecadienila, e 8,10- undecadienila. Embora cada um destes grupos alcadienila C11 linear tenha duas ligações duplas de carbono-carbono, e consequentemente as ligações duplas de carbono-carbono possam, cada uma, independentemente formar uma estrutura-cis e uma estrutura-trans, cada ligação dupla de carbono- carbono pode formar qualquer uma das estruturas.
[0029] Os exemplos preferidos de n e t e das linhas onduladas na fórmula (I) são como segue.
[0030] n é preferivelmente um número inteiro de 3 a 5, e mais preferivelmente 3.
[0031] As linhas onduladas são, cada uma, preferivelmente uma ligação-cis.
[0032] Exemplos preferidos específicos de composto (I) são como segue.
[0033] Composto (A): um tal composto que n é um número inteiro de 3 a 5, R é um grupo alquenila C7-11 linear em uma estrutura-cis, e as linhas onduladas são, cada uma, uma ligação-cis.
[0034] Composto (B): um tal composto que n é 4, R é um grupo alcadienila C11 linear em que duas ligações duplas de carbono-carbono formam, cada uma, uma estrutura-cis, e as linhas onduladas são, cada uma, uma ligação-cis.
9 / 66
[0035] Composto (C): um tal composto que n é 2 ou 3, R é um grupo alquila C1-5 linear, e as linhas onduladas são, cada uma, uma ligação-cis.
[0036] Exemplos específicos, mais preferidos, de composto (I) são como segue.
[0037] Composto (A1): um tal composto que n é um número inteiro de 3 a 5, R é 5-heptenila, 7-nonenila, ou 9-undecenila na estrutura-cis, e as linhas onduladas são, cada uma, uma ligação-cis.
[0038] Composto (B1): um tal composto que n é 4, R é 2,5- undecadienila em que duas ligações duplas de carbono-carbono formam, cada uma, uma estrutura-cis, e as linhas onduladas são, cada uma, uma ligação-cis.
[0039] Composto (C1): um tal composto que n é 2 ou 3, R é metila, propila, ou pentila, e as linhas onduladas são, cada uma, uma ligação-cis.
[0040] O sal de composto (I) é preferivelmente um sal farmacologicamente aceitável, e exemplos do mesmo incluem sais com uma base inorgânica, sais com uma base orgânica, sais com um ácido inorgânico, sais com um ácido orgânico, e sais com um aminoácido básico ou ácido.
[0041] Exemplos preferidos de sais com uma base inorgânica incluem sais de metais alcalinos como sais de sódio e sais de potássio; sais de metais alcalinoterrosos como sais de cálcio e sais de magnésio; sais de alumínio; e sais de amônio. Preferidos são sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio, e sais de magnésio, e mais preferidos são sais de sódio e sais de potássio.
[0042] Exemplos preferidos de sais com uma base orgânica incluem sais com trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina[tris(hidroximetil)metilamina], terc-butilamina, ciclo-hexilamina, benzilamina, diciclo-hexilamina, e N,N-
10 / 66 dibenziletilenodiamina.
[0043] Exemplos preferidos de sais com um ácido inorgânico incluem sais com ácido fluorídrico, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, e ácido fosfórico. Os sais com ácido clorídrico e sais com ácido fosfórico são preferidos.
[0044] Exemplos preferidos de sais com um ácido orgânico incluem sais com ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido ftálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico, e ácido p-toluenossulfônico.
[0045] Exemplos preferidos de sais com um aminoácido básico incluem sais com arginina, lisina, e ornitina.
[0046] Exemplos preferidos de sais com um aminoácido ácido incluem sais com ácido aspártico e ácido glutâmico.
[0047] Na presente invenção, o composto da presente invenção pode ser usado como um lipídio catiônico. O lipídio catiônico pode formar um complexo com uma pluralidade de moléculas em um solvente ou meio de dispersão. O complexo pode conter um componente adicional além do composto da presente invenção. Exemplos do componente adicional incluem componente lipídico adicional e um ácido nucleico.
[0048] Exemplos do componente lipídico adicional incluem lipídios estruturais capazes de constituir uma partícula lipídica. Para um tal lipídio estrutural, pode ser usado, por exemplo, pelo menos um selecionado dos seguintes: esteróis (por exemplo, colesterol, éster colesterílico,
11 / 66 hemissuccinato de colesterila); fosfolipídios (por exemplo, fosfatidilcolina (por exemplo, dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, palmitoiloleoilfosfatidilcolina, dilinolenoilfosfatidilcolina, MC-1010 (NOF CORPORATION), MC-2020 (NOF CORPORATION), MC-4040 (NOF CORPORATION)), fosfatidilserina (por exemplo, dipalmitoilfosfatidilserina, diestearoilfosfatidilserina, dioleoilfosfatidilserina, palmitoiloleoilfosfatidilserina), fosfatidiletanolamina (por exemplo, dipalmitoilfosfatidiletanolamina, diestearoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina, lisofosfatidiletanolamina), fosfatidilinositol, ácido fosfatídico); e poli(glicol etilênico)-lipídios (PEG-lipídios) (por exemplo, PEG-DAA, PEG-DAG, conjugado de PEG-fosfolipídio, PEG-Cer, PEG- colesterol, PEG-C-DOMG, 2KPEG-CMG, GM-020 (NOF CORPORATION), GS-020 (NOF CORPORATION), GS-050 (NOF CORPORATION)). Na presente invenção, é preferido usar todos os três, a saber, um esterol (em particular, colesterol), um fosfolipídio (em particular, fosfatidilcolina), e um poli(glicol etilênico)-lipídio, como o lipídio estrutural.
[0049] A relação entre o composto da presente invenção e o lipídio estrutural no componente lipídico misto constituindo a partícula lipídica da presente invenção pode ser apropriadamente controlada de acordo com o propósito ou o uso. Por exemplo, a relação do lipídio estrutural é tipicamente de 0,008 a 4 mol e preferivelmente de 0,4 a 1,5 mol por mol do composto da presente invenção. Em outra definição das razões no componente lipídico
12 / 66 misto, a quantidade composto da presente invenção é tipicamente de 1 a 4 mol, aquela do esterol é tipicamente de 0 a 3 mol, aquela do fosfolipídio é tipicamente de 0 a 2 mol, e aquela do glicol propilênico-lipídio é tipicamente 0 a 1 mol. Em uma modalidade preferida que usa uma mistura do composto da presente invenção e os componentes lipídicos adicionais, com respeito às razões, a quantidade do composto da presente invenção é de 1 a 1,5 mol, aquela do esterol é de 0 a 1,25 mol, aquela do fosfolipídio é de 0 a 0,5 mol, e aquela do poli(glicol etilênico)-lipídio é 0 a 0,125 mol.
[0050] O composto da presente invenção pode ser usado para produzir a partícula lipídica da presente invenção. A partícula lipídica da presente invenção refere-se ao complexo descrito acima, mas não contendo ácido nucleico. O formato da partícula lipídica da presente invenção não é limitado a um formato específico, e o escopo inclui um complexo em que o composto da presente invenção e assim por diante monta-se para formar uma esfera; um complexo em que o composto da presente invenção e assim por diante monta- se sem formar um formato específico; um complexo em que o composto da presente invenção e assim por diante dissolve-se em um solvente; e um complexo em que o composto da presente invenção e assim por diante homogênea ou heterogeneamente se dispersa em um meio dispersante.
[0051] A partícula lipídica da presente invenção (por exemplo, uma partícula lipídica composta do composto da presente invenção e lipídios estruturais diferentes do composto) pode ser usada, por exemplo, para produzir a composição da presente invenção contendo a partícula lipídica e um ácido nucleico (em particular, um ácido nucleico como uma substância útil para aplicações farmacêuticas ou aplicações para pesquisa). A
13 / 66 composição da presente invenção pode ser usada como um fármaco ou um reagente. É preferido para a composição da presente invenção que a partícula lipídica encapsule um ácido nucleico em uma relação tão alta quanto possível (isto é, em um alta relação de encapsulamento).
[0052] O “ácido nucleico” pode ser qualquer molécula na qual as moléculas de nucleotídeo ou as moléculas tendo funções equivalentes àquelas do nucleotídeo são polimerizadas, e exemplos das mesmas incluem RNA, que é um polímero de ribonucleotídeos; DNA, que é um polímero de desoxirribonucleotídeos; um polímero de uma mistura de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos; e um polímero de nucleotídeos incluindo um análogo de nucleotídeo. Ademais, o ácido nucleico pode ser um polímero de nucleotídeos incluindo um derivado de ácido nucleico. O ácido nucleico pode ser um ácido nucleico de fita simples ou um ácido nucleico de fita dupla. O conceito de ácido nucleico de fita dupla abrange um ácido nucleico de fita dupla de modo que uma fita hibridiza com a outra fita sob condições estringentes.
[0053] O análogo de nucleotídeo pode ser qualquer molécula obtida pela modificação de ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, RNA, ou DNA, para aprimorar a resistência às nucleases, para estabilizar, para intensificar a afinidade com um ácido nucleico de fita complementar ou para intensificar a permeabilidade celular em comparação com o RNA ou DNA, ou para visualização. O análogo de nucleotídeo pode ser uma molécula de ocorrência natural ou uma molécula não natural, e exemplos do mesmo incluem um análogo de nucleotídeo modificado com açúcar e um análogo de nucleotídeo modificado com ligação fosfodiéster.
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[0054] O análogo de nucleotídeo modificado com açúcar pode ser qualquer um obtido pela adição de ou substituição com uma substância tendo uma estrutura química arbitrária para uma parte ou o todo da estrutura química do açúcar de um nucleotídeo. Exemplos específicos do mesmo incluem um análogo de nucleotídeo substituído com 2'-O-metilribose, um análogo de nucleotídeo substituído com 2'-O-propilribose, um análogo de nucleotídeo substituído com 2'-metoxietoxirribose, um análogo de nucleotídeo substituído com 2'-O-metoxietilribose, um análogo de nucleotídeo substituído com 2'-O-[2-(guanidínio)etil]ribose, um análogo de nucleotídeo substituído com 2'-O-fluororribose, um ácido nucleico artificial reticulado provido com duas estruturas cíclicas pela introdução de uma estrutura reticulante à porção açúcar (Ácido Nucleico em Ponte) (BNA), mais especificamente, um ácido nucleico artificial bloqueado no qual o átomo de oxigênio na posição 2' e o átomo de carbono na posição 4' estão reticulados via metileno (Ácido Nucleico Bloqueado) (LNA) e um ácido nucleico artificial reticulado via etileno (ácido nucleico em ponte de Etileno) (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)], adicionalmente, um ácido peptídeo-nucleico (PNA) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)], um ácido oxipeptídeo-nucleico (OPNA) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)], e um ácido peptídeo-ribonucleico (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)].
[0055] O análogo de nucleotídeo modificado com ligação fosfodiéster pode ser qualquer um obtido pela adição de ou substituição com uma estrutura química arbitrária para uma parte ou o todo da estrutura química da ligação fosfodiéster de um nucleotídeo. Exemplos específicos do mesmo incluem um análogo de nucleotídeo substituído com uma ligação fosforotioato e um
15 / 66 análogo de nucleotídeo substituído com uma ligação N3'-P5' fosforamidato [Saibo Kogaku (em japonês, título traduzido: Cell Engineering), 16, 1463- 1473 (1997)] [“RNAi and Antisense Strategies”, KODANSHA LTD. (2005)].
[0056] O derivado de ácido nucleico pode ser qualquer molécula obtida pela adição a uma outra substância química de ácido nucleico para aprimorar a resistência às nucleases, para estabilizar, para intensificar a afinidade com um ácido nucleico de fita complementar, ou para intensificar a permeabilidade celular em comparação com o ácido nucleico, ou para visualização. Exemplos específicos do mesmo incluem um derivado com uma 5'-poliamina adicionada, um derivado com um colesterol adicionado, um derivado com um esteroide adicionado, um derivado com ácido biliar adicionado, um derivado com vitamina adicionada, um derivado com Cy5 adicionado, um derivado com Cy3 adicionado, um derivado com 6-FAM adicionada, e um derivado com biotina adicionada.
[0057] O ácido nucleico na presente invenção não é limitado a um ácido nucleico específico, e pode ser um ácido nucleico, por exemplo, para o propósito de minorar uma doença, um sintoma, um distúrbio, ou uma enfermidade, e mitigar uma doença, um sintoma, um distúrbio, ou uma condição patológica ou prevenir o início da(o) mesma(o) (aqui, ocasionalmente chamado de “tratamento ou semelhantes de uma doença”), ou um ácido nucleico para regular a expressão de uma proteína desejada que é útil para pesquisa, mesmo que a proteína não contribua para o tratamento ou semelhantes de uma doença.
[0058] Genes ou polinucleotídeos relacionados às doenças (aqui, ocasionalmente chamados de “genes relacionados às doenças”) estão
16 / 66 disponíveis, por exemplo, junto ao “McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine”, Johns Hopkins University (Baltimore, Md., EUA) e junto ao “National Center for Biotechnology Information”, “National Library of Medicine” (Bethesda, Md., EUA).
[0059] Exemplos específicos do ácido nucleico na presente invenção incluem siRNAs, shRNAs, miRNAs, miméticos de miRNA, ácidos nucleicos antissenso, ribozimas, mRNAs, ácidos nucleicos decoy (isca), aptâmeros, DNAs plasmidiais, DNAs Cosmidiais, e BAC DNAs. O ácido nucleico é preferivelmente um RNA como um siRNA e um mRNA ou um análogo ou derivado obtido pela modificação artificial de um RNA.
[0060] Na presente invenção, o “siRNA” refere-se a um RNA de fita dupla ou parente do mesmo consistindo em 10 a 30 nucleotídeos, preferivelmente de 15 a 25 nucleotídeos, e incluindo sequências complementares. O siRNA inclui nucleotídeos protuberantes preferivelmente de um a três nucleotídeos, mais preferivelmente de dois nucleotídeos, na extremidade-3'. A porção de sequências complementares pode ser completamente complementar ou incluir nucleotídeos não complementares, mas preferivelmente são completamente complementares.
[0061] O siRNA na presente invenção não é limitado a um siRNA específico, e, por exemplo, pode ser usado um siRNA para atenuação de expressão gênica contra um gene relacionado à doença. Um gene relacionado à doença refere-se a qualquer gene ou polinucleotídeo que gera um produto de transcrição ou de tradução em um nível anormal o em uma forma anormal em células derivadas de um tecido de um paciente, em comparação com o tecido ou as células de um controle isento de doença. Para o siRNA na presente
17 / 66 invenção, pode ser usado siRNA para regular a expressão de uma proteína desejada útil para pesquisa.
[0062] Na presente invenção, o “mRNA” refere-se a um RNA incluindo uma sequência de nucleotídeos que pode ser traduzida em uma proteína. O mRNA na presente invenção não é limitado a um mRNA específico e pode ser qualquer mRNA capaz de expressar uma proteína desejada em células. O mRNA é preferivelmente um mRNA útil para aplicações farmacêuticas (por exemplo, aplicações de tratamento de doença) e/ou aplicações para pesquisa, e exemplos de tais mRNAs incluem um mRNA para expressar uma proteína marcadora, como luciferase, em células.
[0063] A doença não é limitada a uma doença específica, e exemplos da doença incluem as doenças listadas abaixo. Os teores em cada “()” são exemplos do correspondente gene relacionado à doença, exceto o caso no qual são listados exemplos de doenças específicas. Outro exemplo do ácido nucleico na presente invenção é um ácido nucleico que regula o nível de expressão de qualquer um dos genes relacionados à doença (ou uma proteína codificada pelo gene relacionado à doença).
[0064] (1) Doenças do sistema sanguíneo [anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG, RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT), síndrome do linfócito nu (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA, RFX5), doenças hemorrágicas (TBXA2R, P2RX1, P2X1), deficiências de fator H e fator H-like 1 (HF1, CFH, HUS), deficiências de fator V e fator VIII (MCFD2), deficiência de fator VII (F7), deficiência de fator X (F10), deficiência de fator XI (F11), deficiência de fator XII (F12,
18 / 66
HAF), deficiência de fator XIIIA (F13A1, F13A), deficiência de fator XIIIB
(F13B), anemia de Fanconi (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA, FAAP95,
FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1,
FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FACE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG,
BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596), linfo-
histiocitose hematofagocítica (PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4,
HPLH3, HLH3, FHL3), hemofilia A (F8, F8C, HEMA), hemofilia B (F9,
HEMB), distúrbios hemorrágicos (PI, ATT, F5), deficiência leucocitária
(ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3,
EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4), anemia das células falciformes
(HBB), talassemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1), e assim por diante];
(2) doenças inflamatórias/imunológicas [AIDS (KIR3DL1,
NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1), síndrome linfoproliferativa autoimune (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A),
imunodeficiência combinada (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4), infecção por
HIV (CCL5, SCYA5, D17S135E, TCP228, IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2,
DMKBR5, CCCKR5, CCR5), imunodeficiência (CD3E, CD3G, AICDA,
AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG,
HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI),
inflamação (IL10, IL-1, IL-13, IL-17, IL-23, CTLA4), imunodeficiência combinada grave (JAK3, JAKL, DCLRE1C, ATREMIS, SCIDA, RAG1,
RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1,
SCIDX, IMD4), artrite reumatoide, psoríase, doenças inflamatórias intestinais
(por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa), síndrome de Sjögren,
doença de Behçet, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite
19 / 66 lúpica, lúpus eritematoso discoide, doença de Castleman, espondilite anquilosante, polimiosite, dermatomiosite, poliarterite nodosa, doença mista do tecido conjuntivo, dermatoesclerose, lúpus profundo, tireoidite crônica,
doença de Graves, gastrite autoimune, diabetes melito tipo I e tipo II, anemia hemolítica autoimune, neutropenia autoimune, trombocitopenia, dermatite atópica, hepatite ativa crônica, miastenia grave, doença do enxerto-contra-
hospedeiro, doença de Addison, resposta imune anormal, artrite, dermatite,
radiodermatite, cirrose biliar primária, e assim por diante];
(3) doenças metabólicas/hepáticas/renais [neuropatia amiloide
(TTR, PALB), amiloidose (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA,
LYZ, TTR, PALB), esteato-hepatite não alcoólica e fibrose hepática
(COL1A1), cirrose (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988),
fibrose cística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7), doença do armazenamento de glicogênio (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2,
LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM), adenoma hepatocelular
(TCF1, HFN1A, MODY3), insuficiência hepática (SCOD1, SCO1),
deficiência de lipase hepática (LIPC), hepatoblastoma (CTNNB1, PDFGRL,
PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET,
CASP8, MCH5), doença renal medular cística (UMOD, HNFJ, FJHN,
MCKD2, ADMCKD2), fenilcetonúria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS),
doença renal multicística e doença hepática multicística (FCYT, PKHD1,
APRKD, PDK1, PDK2, PDK4, PDKTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63),
e assim por diante];
(4) doenças do sistema nervoso [ALS (SOD1, ALS2, STEX,
FUS, TARDBP, VEGF), doença de Alzheimer (APP, AAA, CVAP, AD1,
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APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK,
ACE, DCP1, ACE1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH,
PSEN1, AD3), autismo (BZRAP1, MDGA2, GLO1, MECP2, RTT, PPMX,
MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2), síndrome do X frágil (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR5), doença de Huntington (HD, IT15,
PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17), doença de Parkinson
(NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP,
PARK1, PARK4, DJ1, DBH, NDUFV2), síndrome de Rett (MECP2, RTT,
PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9), esquizofrenia (GSK3, 5-HTT,
COMT, DRD, SLC6A3, DAOA, DTNBP1), distúrbio relacionado às secretases (APH-1), e assim por diante];
(5) doenças do olho [degeneração macular relacionada à idade
(Abcr, Ccl2, cp, Timp3, catepsina D, Vldlr, Ccr2), catarata (CRYAA,
CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, PAX6, AN2,
MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19,
CRYGD, CRYG4, BSFP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB,
CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYA1, GJA8, CX50,
CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1), opacidade corneana (APOA1, TGFB1, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TASTD2,
TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD,
PPCD2, PIP5K3, CFD), córnea plana congênita hereditária (KERA, CNA2),
glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2,
HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A),
amaurose congênita de Leber (CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1,
LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1,
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CORD6, RDH12, LCA3), distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2,
STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2), e assim por diante]; e
(6) doenças neoplásicas [tumor maligno, glaucoma neovascular, hemangioma infantil, mieloma múltiplo, sarcoma crônico,
melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, angioproliferação, caquexia,
metástase ou semelhantes de câncer de mama, câncer (por exemplo, câncer colorretal (por exemplo, câncer colorretal familiar, câncer colorretal hereditário não ligado à polipose, tumor estromal gastrointestinal), câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, mesotelioma maligno), mesotelioma, câncer pancreático (por exemplo, carcinoma ductal pancreático), câncer gástrico (por exemplo, adenocarcinoma papilar, adenocarcinoma mucinoso,
adenocarcinoma de célula escamosa), câncer de mama (por exemplo,
carcinoma de mama ductal invasivo, carcinoma de mama ductal não invasivo,
carcinoma de mama inflamatório), câncer ovariano (por exemplo, câncer ovariano epitelial, tumor extragonadal de células germinativas, tumor ovariano de células germinativas, tumor ovariano de baixo grau), câncer de próstata (por exemplo, câncer de próstata dependente de hormônio, câncer de próstata independente de hormônio), câncer hepático (por exemplo, câncer hepático primário, câncer de ducto biliar extra-hepático), câncer de tireoide
(por exemplo, câncer medular de tireoide), câncer renal (por exemplo,
carcinoma de célula renal, carcinoma celular transicional da pelve renal e da uretra), câncer uterino, tumor cerebral (por exemplo, astrocitoma pineal,
astrocitoma pilocítico, astrocitoma difuso, astrocitoma anaplásico),
22 / 66 melanoma, sarcoma, câncer de bexiga, câncer hematológico ou semelhantes incluindo mieloma múltiplo, adenoma da pituitária, glioma, neurinoma acústico, sarcoma retinal, câncer faríngeo, câncer laríngeo, câncer de língua, timoma, carcinoma esofágico, câncer duodenal, câncer de cólon, câncer retal, carcinoma hepatocelular, tumor endócrino pancreático, câncer de ducto biliar, câncer de vesícula biliar, câncer peniano, câncer uretérico, tumor testicular, carcinoma vulvar, câncer de colo uterino, carcinoma do corpo uterino, sarcoma uterino, doença tromboblástica, câncer vaginal, câncer de pele, micose fungoide, basalioma, sarcoma de partes moles, linfoma maligno, doença de Hodgkin, síndrome mielodisplásica, leucemia de células-T de adulto, doença mieloproliferativa crônica, tumor endócrino pancreático, histiocitoma fibroso, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma primário desconhecido), leucemia (por exemplo, leucemia aguda (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda), leucemia crônica (por exemplo, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica), síndrome mielodisplásica), sarcoma uterino (por exemplo, tumor mesodérmico misto uterino, leiomiossarcoma uterino, tumor estromal endometrial), mielofibrose, e assim por diante].
[0065] A composição da presente invenção como um fármaco pode ser produzida pelo uso de um método conhecido na técnica de formulação de fármaco com um carreador farmaceuticamente aceitável. Exemplos da forma de dosagem do fármaco incluem formulações para administração parenteral (por exemplo, um líquido como uma injeção) mesclado com um agente auxiliar convencional como um agente tamponante e/ou estabilizante, e formulações para administração tópica, como uma pomada, um creme, um
23 / 66 líquido, e um emplastro, mesclado com um carreador farmacêutico convencional.
[0066] A composição da presente invenção pode ser usada para introdução de um ingrediente ativo para dentro de vários tipos de células, tecidos, ou órgãos. Exemplos de células nas quais a composição da presente invenção pode ser aplicada incluem células-tronco mesenquimais, células- tronco neurais, células-tronco da pele, esplenócitos, células nervosas, células gliais, células B pancreáticas, células da medula óssea, células mesangiais, células de Langerhans, células epidérmicas, células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos, células fibrosas, células fibrilares, células musculares (por exemplo, células de músculo esquelético, células de músculo cardíaco, mioblastos, células satélites musculares, células de músculo liso), células adiposas, células sanguíneas (por exemplo, macrófagos, células-T, células-B, células assassinas naturais, mastócitos, leucócitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monócitos, megacariócitos, células-tronco hematopoiéticas), sinoviócitos, condrócitos, osteócitos, osteoblastos, osteoclastos, células mamárias, hepatócitos ou células estromais, ovos, espermátides, ou células precursoras capazes de induzir diferenciação para estas células, células-tronco (por exemplo, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS), células-tronco embrionárias (células ES)), células germinativas primordiais, oócitos, e ovos fertilizados. Exemplos de tecidos ou órgãos nos quais a composição da presente invenção pode ser aplicada incluem todos os tecidos ou órgãos nos quais as células acima estão presentes, por exemplo, cérebro, sítios do cérebro (por exemplo, bulbo olfativo, amígdala, gânglio basal, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo
24 / 66 subtalâmico, córtex cerebral, medula oblonga, cerebelo, lobo occipital, lobo frontal, lobo temporal, putame, núcleo caudado, corpo caloso, substância negra), medula espinhal, glândula pituitária, estômago, pâncreas, rim, fígado, gônada, tireoide, vesícula biliar, medula óssea, glândula adrenal, pele, pulmão, trato digestivo (por exemplo, intestino grosso, intestino delgado), vaso sanguíneo, coração, timo, baço, glândula submandibular, sangue periférico, células do sangue periférico, próstata, placenta, útero, ossos, articulações, e músculos (por exemplo, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco). Aquelas células, tecidos, ou órgãos podem ser células cancerosas, tecidos cancerosos, ou semelhantes que têm sofrido canceração.
[0067] A composição da presente invenção é particularmente superior em eficácia para introduzir um ácido nucleico em células cancerosas.
[0068] O composto, a partícula lipídica, e a composição da presente invenção são estáveis e têm toxicidade baixa e podem ser seguramente usados. Com o uso da composição da presente invenção in vivo, ou com o uso da composição como um fármaco, a composição é adequadamente administrada a um indivíduo (por exemplo, um humano ou um mamífero não humano (preferivelmente, um humano)) de modo que uma quantidade efetiva do ácido nucleico seja distribuída para as células alvo.
[0069] Com o uso da composição da presente invenção in vivo, ou com o uso da composição como um fármaco, a composição pode ser oralmente ou parenteralmente (por exemplo, administração local, retal, ou intravenosa) administrada em uma maneira segura na forma de uma formulação farmacêutica como comprimidos (incluindo comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos revestidos com filme, comprimidos
25 / 66 sublinguais, comprimidos oralmente desintegráveis), pós, grânulos, cápsulas (incluindo cápsulas moles, microcápsulas), líquidos, trociscos, xaropes, emulsões, suspensões, injeções (por exemplo, injeções subcutâneas, injeções intravenosas, injeções intramusculares, injeções intraperitoneais), formulações tópicas (por exemplo, formulações para administração nasal, formulações transdérmicas, pomadas), supositórios (por exemplo, supositórios retais, supositórios vaginais), péletes, formulações nasais, formulações pulmonares (inalações), e infusões. Cada formulação pode ser uma formulação de liberação controlada como uma formulação de liberação rápida e uma formulação de liberação prolongada (por exemplo, uma microcápsula de liberação prolongada).
[0070] Agora, será descrito um método para produzir o composto da presente invenção.
[0071] As matérias-primas e os reagentes usados em cada etapa do método de produção, abaixo, e o composto resultante, podem, cada, formar um sal. Exemplos de tais sais são os mesmos sais supracitados para o composto da presente invenção.
[0072] Quando um composto obtido em cada etapa é um composto livre, o composto pode ser convertido em um sal pretendido pelo uso de um método conhecido. Inversamente, quando um composto obtido em cada etapa é um sal, o composto pode ser convertido em uma forma livre ou em outro sal pretendido pelo uso de um método conhecido.
[0073] Um composto obtido em cada etapa pode ser usado diretamente na reação subsequente como uma solução de reação, ou um produto bruto pode ser obtido da mesma e usado para a reação subsequente.
26 / 66 Alternativamente, um composto obtido em cada etapa pode ser isolado e/ou purificado a partir de uma mistura reacional de acordo com um método convencional usando um meio de separação como concentração, cristalização, recristalização, destilação, extração com solvente, destilação fracionada, e cromatografia.
[0074] Se um composto como uma matéria-prima ou um reagente em cada etapa estiver comercialmente disponível, o produto comercialmente disponível pode ser diretamente usado.
[0075] O tempo de reação para a reação em cada etapa, que pode variar dependendo dos reagentes e solventes a serem usados, é tipicamente de 1 minuto a 48 horas, e preferivelmente de 10 minutos a 8 horas, salvo especificação em contrário.
[0076] A temperatura de reação para a reação em cada etapa, que pode variar dependendo dos reagentes e solventes a serem usados, é tipicamente de -78°C a 300°C, e preferivelmente de -78°C a 150°C, salvo especificação em contrário.
[0077] A pressão para a reação em cada etapa, que pode variar dependendo dos reagentes e solventes a serem usados, é tipicamente de 1 atm (101 kPa) a 20 atm (2.027 kPa), e preferivelmente de 1 atm (101 kPa) a 3 atm (304 kPa), salvo especificação em contrário.
[0078] Um aparelho de síntese de micro-ondas como um Initiator produzido pela Biotage é ocasionalmente usado em reação em uma etapa. A temperatura de reação, que pode variar dependendo dos reagentes e solventes a serem usados, é tipicamente temperatura ambiente a 300°C, preferivelmente temperatura ambiente a 250°C, e mais preferivelmente 50°C a 250°C, salvo
27 / 66 especificação em contrário. O tempo de reação, que pode variar dependendo dos reagentes e solventes a serem usados, é tipicamente de 1 minuto a 48 horas, e preferivelmente de 1 minuto a 8 horas, salvo especificação em contrário.
[0079] Na reação em cada etapa, um reagente é usado em uma quantidade de 0,5 equivalente a 20 equivalentes, preferivelmente em uma quantidade de 0,8 equivalente a 5 equivalentes, em relação à quantidade de um substrato, salvo especificação em contrário. Quando um reagente é usado como um catalisador, o reagente é usado em uma quantidade de 0,001 equivalente a 1 equivalente, preferivelmente em uma quantidade de 0,01 equivalente a 0,2 equivalente, em relação à quantidade de um substrato, salvo especificação em contrário. Se um reagente serve como um solvente de reação em combinação com sua própria função, o reagente é usado em uma quantidade como solvente.
[0080] Na reação em cada etapa, a reação é realizada sem solvente, ou em um solvente apropriado que dissolve ou suspende os reagentes no mesmo, salvo especificação em contrário. Exemplos do solvente incluem os solventes descritos nos Exemplos e os seguintes solventes.
[0081] Álcoois: metanol, etanol, isopropanol, isobutanol, álcool terc- butílico, 2-metoxietanol, e assim por diante; éteres: éter dietílico, éter di-isopropílico, éter difenílico, tetra- hidrofurano, 1,2-dimetoxietano, e assim por diante; hidrocarbonetos aromáticos: clorobenzeno, tolueno, xileno, e assim por diante; hidrocarbonetos saturados: ciclo-hexano, hexano, heptano, e
28 / 66 assim por diante; amidas: n,n-dimetilformamida, n-metilpirrolidona, e assim por diante; hidrocarbonetos halogenados: diclorometano, tetracloreto de carbono, e assim por diante; nitrilas: acetonitrila e assim por diante; sulfóxidos: sulfóxido dimetílico e assim por diante; bases orgânicas aromáticas: piridina e assim por diante; anidrido de ácido: anidrido acético e assim por diante; ácidos orgânicos: ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, e assim por diante; ácidos inorgânicos: ácido clorídrico, ácido sulfúrico, e assim por diante; ésteres: acetato de etila, acetato de isopropila, e assim por diante; cetonas: acetona, cetona etílica e metílica, e assim por diante; e água.
[0082] Dois ou mais destes solventes podem ser misturados para uso com uma relação apropriada.
[0083] Quando uma base é usada na reação em cada etapa, por exemplo, qualquer uma das bases listadas abaixo é usada ou as bases descritas nos Exemplos são usadas.
[0084] Bases inorgânicas: hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de magnésio, e assim por diante; sais básicos: carbonato de sódio, carbonato de cálcio,
29 / 66 hidrogenocarbonato de sódio, e assim por diante; bases orgânicas: trietilamina, dietilamina, piridina, 4- dimetilaminopiridina, N,N-dimetilanilina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, 1,8- diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno, imidazol, piperidina, e assim por diante; alcóxidos de metal: etóxido de sódio, terc-butóxido de potássio, terc-butóxido de sódio, e assim por diante; hidretos de metal alcalino: hidreto de sódio e assim por diante; amidas de metal: amida de sódio, di-isopropilamida de lítio, hexametildissilazida de lítio, e assim por diante; e organolítios: n-butil-lítio, sec-butil-lítio, e assim por diante.
[0085] Quando um ácido ou um catalisador ácido é usado na reação em cada etapa, por exemplo, qualquer um dos ácidos e catalisadores ácidos listados abaixo é usado e ácidos e catalisadores ácidos descritos nos Exemplos são usados.
[0086] Ácidos inorgânicos: ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, e assim por diante; ácidos orgânicos: ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido cítrico, ácido p-toluenossulfônico, ácido 10-canforossulfônico, e assim por diante; e ácidos de Lewis: complexo de trifluoreto de boro - éter dietílico, iodeto de zinco, cloreto de alumínio anidro, cloreto de zinco anidro, cloreto de ferro anidro, e assim por diante.
[0087] Salvo especificação em contrário, a reação em cada etapa é realizada de acordo com um método conhecido como um método descrito em “The Fifth Series of Experimental Chemistry, Vol. 13 a 19 (The Chemical
30 / 66 Society of Japan (ed.)); “Shin Jikken Kagaku Koza” (em japonês, título traduzido: “New Experimental Chemistry”), Vol. 14 e 15 (The Chemical Society of Japan (ed.)); “Seimitsu Yuki Kagaku” (em japonês, título traduzido: “Precise Organic Chemistry”, título original: “Reaktionen und Synthesen im organisch-chemischen Praktikum und Forschungslaboratorium”) 2ª Edição Revisada (L. F. Tietze, Th. Eicher, Nankodo Co., Ltd.); “Organic Name Reaction”; “The Reaction Mechanism and Essence Revised Edition” (TOGO, Hideo, KODANSHA LTD.); “ORGANIC SYNTHESES Collective Volume I a VII” (John Wiley & Sons Inc.); “Modern Organic Synthesis in the Laboratory - A Collection of Standard Experimental Procedures” (Jie Jack Li, Oxford University Pres); “Comprehensive Heterocyclic Chemistry III, Vol. 1 a Vol. 14” (Elsevier Japan K.K.); “Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis” (supervisor da tradução: TOMIOKA, Kiyoshi, publicado por: Kagaku-Dojin Publishing Company, INC.); “Comprehensive Organic Transformations”(VCH Publishers Inc.) (1989); ou semelhantes, ou de acordo com um método descrito nos Exemplos.
[0088] A reação de proteção ou de desproteção para um grupo funcional em cada etapa é realizada de acordo com um método conhecido como um método descrito em “Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed.” (Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts) publicado por Wiley- Interscience Publication, 2007; “Protecting Groups 3rd Ed.” (P. J. Kocienski) publicado por Thieme Medical Publishers, 2004; ou semelhantes, ou de acordo com um método descrito nos Exemplos.
[0089] Exemplos de grupos protetores para um grupo hidroxila de
31 / 66 álcoois ou semelhantes e de grupos hidroxila fenólica incluem grupos protetores do tipo éter como éter metoximetílico, éter benzílico, éter p- metoxibenzílico, éter t-butildimetilsilílico, éter t-butildifenilsilílico, e éter tetra-hidropiranílico; grupos protetores do tipo carboxilato como acetato; ésteres do tipo sulfonato como metanossulfonato; e grupos protetores do tipo carbonato como t-butilcarbonato.
[0090] Exemplos de grupos protetores para um grupo carbonila de aldeídos incluem grupos protetores do tipo acetal como dimetilacetal; e grupos protetores do tipo acetal cíclico como 1,3-dioxano cíclico.
[0091] Exemplos de grupos protetores para um grupo carbonila de cetonas incluem grupos protetores do tipo cetal como cetal dimetílico; grupos protetores do tipo cetal cíclico como 1,3-dioxano cíclico, grupos protetores do tipo oxima como O-metiloxima; e grupos protetores do tipo hidrazona como N,N-dimetil-hidrazona.
[0092] Exemplos de grupos protetores para um grupo carboxila incluem grupos protetores do tipo éster como éster metílico, e grupos protetores do tipo amida como N,N-dimetilamida.
[0093] Exemplos de grupos protetores para tiol incluem grupos protetores do tipo éter como tioéter benzílico; e grupos protetores do tipo éster como tioacetato, tiocarbonato e tiocarbamato.
[0094] Exemplos de grupos protetores para um grupo amino e heterociclos aromáticos como imidazol, pirrol, e indol, incluem grupos protetores do tipo carbamato como benzilcarbamato; grupos protetores do tipo amida como acetamida; grupos protetores do tipo alquilamina como N- trifenilmetilamina; e grupos protetores do tipo sulfonamida como
32 / 66 metanossulfonamida.
[0095] A remoção de um grupo protetor pode ser realizada pelo uso de um método conhecido como um método que usa um ácido, uma base, luz ultravioleta, hidrazina, fenil-hidrazina, N-metilditiocarbamato de sódio, fluoreto de tetrabutilamônio, acetato de paládio, ou haleto de trialquilsilila (por exemplo, iodeto de trimetilsilila, brometo de trimetilsilila), ou pelo uso de um método de redução.
[0096] Exemplos de agentes redutores a serem usados quando reação de redução é realizada em cada etapa incluem hidretos de metal como hidreto de alumínio e lítio, triacetoxiboro-hidreto de sódio, cianoboro-hidreto de sódio, hidreto de di-isobutilalumínio (DIBAL-H), boro-hidreto de sódio, e triacetoxiboro-hidreto de tetrametilamônio; boranos como um complexo de borano-tetra-hidrofurano; níquel de Raney; cobalto de Raney; hidrogênio; e ácido fórmico. Por exemplo, níquel de Raney ou cobalto de Raney podem ser usados na presença de hidrogênio ou ácido fórmico. Quando uma ligação dupla de carbono-carbono ou uma ligação tripla de carbono-carbono é reduzida, pode ser usado um método que usa um catalisador como paládio- carbono e catalisador de Lindlar.
[0097] Exemplos de agentes oxidantes a serem usados quando reação de oxidação é realizada em cada etapa incluem perácidos como ácido m- cloroperbenzoico (MCPBA), peróxido de hidrogênio, e hidroperóxido de t- butila; percloratos como perclorato de tetrabutilamônio; cloratos como clorato de sódio; cloritos como clorito de sódio; periodatos como periodato de sódio; reagentes de iodo hipervalente iodosilbenzeno; reagentes contendo manganês como dióxido de manganês e permanganato de potássio; chumbos como tetra-
33 / 66 acetato de chumbo; reagentes contendo cromo como clorocromato de piridínio (PCC), dicromato de piridínio (PDC), e o reagente de Jones; compostos halogenados como N-bromossuccinimida (NBS); oxigênio; ozônio; um complexo de trióxido de enxofre-piridina; tetróxido de ósmio; dióxido de selênio; e 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ).
[0098] Exemplos de iniciadores radicalares a serem usados quando reação de ciclização radicalar é realizada em cada etapa incluem compostos azoicos como azobisisobutironitrila (AIBN); iniciadores radicalares solúveis em água como ácido 4-4'-azobis-4-cianopentanoico (ACPA); trietilboro na presença de ar ou oxigênio; e peróxido de benzoíla. Exemplos de reagentes de reação radicalar a serem usados incluem tributilestanano, tristrimetilsililsilano, 1,1,2,2-tetrafenildissilano, difenilsilano, e iodeto de samário.
[0099] Exemplos de reagentes de Wittig a serem usados quando a reação de Wittig é realizada em cada etapa incluem alquilidenofosforanos. Os alquilidenofosforanos podem ser preparados pelo uso de um método conhecido como a reação de um sal de fosfônio e uma base forte.
[00100] Exemplos de reagentes a serem usados quando a reação de Horner-Emmons é realizada em cada etapa incluem fosfonoacetatos como dimetilfosfonoacetato de metila e dietilfosfonoacetato de etila; e bases como hidretos de metal alcalino e organolítios.
[00101] Exemplos de reagentes a serem usados quando a reação de Friedel-Crafts é realizada em cada etapa incluem um ácido de Lewis com um cloreto de ácido ou um agente alquilante (por exemplo, uma alquila halogenada, um álcool, uma olefina). Alternativamente, um ácido orgânico ou
34 / 66 um ácido inorgânico pode ser usado ao invés de um ácido de Lewis, e um anidrido de ácido como anidrido acético pode ser usado ao invés de um cloreto de ácido.
[00102] Quando uma reação de substituição nucleofílica aromática é realizada em cada etapa, um nucleófilo (por exemplo, uma amina, um imidazol) e uma base (por exemplo, um sal básico, uma base orgânica) são usados como reagentes.
[00103] Exemplos de bases usadas para gerar um carbânio quando reação de adição nucleofílica com um carbânio, reação de adição-1,4 nucleofílica com um carbânio (reação de adição de Michael), ou reação de substituição nucleofílica com um carbânio é realizada em cada etapa incluem organolítios, alcóxidos de metal, bases inorgânicas, e bases orgânicas.
[00104] Exemplos de reagentes de Grignard a serem usados quando a reação de Grignard é realizada em cada etapa incluem haletos de arilmagnésio como brometo de fenilmagnésio; e haletos de alquilmagnésio como brometo de metilmagnésio e brometo de isopropilmagnésio. Os reagentes de Grignard podem ser preparados pelo uso de um método conhecido como a reação de uma alquila halogenada ou uma arila halogenada e magnésio metálico em um solvente como um éter ou tetra-hidrofurano.
[00105] Quando a reação de condensação de Knoevenagel é realizada em cada etapa, um composto de metileno ativo sanduichado entre dois grupos aceptores de elétrons (por exemplo, ácido malônico, malonato de dietila, malononitrila) e uma base (por exemplo, uma base orgânica, um alcóxido de metal, uma base inorgânica) são usados como reagentes.
[00106] Quando a reação de Vilsmeier-Haack é realizada em cada
35 / 66 etapa, cloreto de fosforila e um derivado de amida (por exemplo, N,N- dimetilformamida) são usados como reagentes.
[00107] Exemplos de agentes de azidação a serem usados quando reação de azidação é realizada para um álcool, um haleto de alquila, ou um sulfonato em cada etapa incluem difenilfosforilazida (DPPA), trimetilsililazida, e azida de sódio. Quando um álcool é azidado, por exemplo, um método que usa difenilfosforilazida e 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) ou um método que usa trimetilsililazida e um ácido de Lewis pode ser usado.
[00108] Exemplos de agentes redutores a serem usados quando uma reação de aminação redutiva é realizada em cada etapa incluem triacetoxiboro-hidreto de sódios, cianoboro-hidreto de sódio, hidrogênio, e ácido fórmico. Exemplos de compostos carbonilados a serem usados quando o substrato é um composto aminado incluem aldeídos como paraformaldeído e também acetaldeído, e cetonas como ciclo-hexanona. Exemplos de aminas a serem usadas quando o substrato é um composto carbonilado incluem amônia; aminas primárias como metilamina; e aminas secundárias como dimetilamina.
[00109] Quando a reação de Mitsunobu é realizada em cada etapa, um azodicardicarboxilato (por exemplo, azodicarboxilato de dietila (DEAD), azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD)) e trifenilfosfina são usados como reagentes.
[00110] Exemplos de reagentes a serem usados quando reação de esterificação, reação de amidação, ou reação de formação de ureia é realizada em cada etapa incluem formas aciladas halogenadas como cloretos de ácido e brometos de ácido; e ácidos carboxílicos ativados como anidridos de ácido,
36 / 66 formas de éster ativadas, e formas de sulfato. Exemplos de ativadores de ácidos carboxílicos incluem agentes de condensação à base de carbodi-imida como cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (WSCD); agentes de condensação à base de triazina como cloreto de 4-(4,6-dimetoxi- 1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio n-hidrato (DMT-MM); agentes de condensação à base de carbonato como 1,1-carbonildi-imidazol (CDI); difenilfosforilazida (DPPA); sal de benzotriazol-1-iloxi- trisdimetilaminofosfônio (reagente BOP); iodeto de 2-cloro-1-metil-piridínio (reagente de Mukaiyama); cloreto de tionila; haloformiatos de alquila inferior como cloroformiato de etila; hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU); ácido sulfúrico; e qualquer combinação deles. Quando um agente de condensação à base de carbodi-imida é usado, um aditivo como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-hidroxissuccinimida (HOSu), e dimetilaminopiridina (DMAP) pode ser, adicionalmente, adicionado à reação.
[00111] Exemplos de catalisadores de metal a serem usados quando reação de acoplamento é realizada em cada etapa incluem compostos de paládio como acetato de paládio(II), tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0), diclorobis(trifenilfosfina)paládio(II), diclorobis(trietilfosfina)paládio(II), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0), cloreto de 1,1'- bis(difenilfosfino)ferrocenopaládio(II), e acetato de paládio(II); compostos de níquel como tetraquis(trifenilfosfina)níquel(0); compostos de ródio como cloreto de tris(trifenilfosfina)ródio(III); compostos de cobalto; compostos de cobre como óxido de cobre e iodeto de cobre(I); e compostos de platina. Uma base pode ser adicionalmente adicionada à reação, e exemplos da base
37 / 66 incluem bases inorgânicas e sais básicos.
[00112] Quando reação de tiocarbonilação é realizada em cada etapa, pentassulfeto de difósforo é tipicamente usado como o agente de tiocarbonilação; entretanto, não apenas pentassulfeto de difósforo, mas também um reagente tendo estrutura de 2,4-dissulfeto de 1,3,2,4- ditiadifosfetano como 2,4-dissulfeto de 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3,2,4- ditiadifosfetano (reagente de Lowesson) pode ser usado.
[00113] Exemplos de agentes de halogenação a serem usados quando a reação de Wohl-Ziegler é realizada em cada etapa incluem N- iodossuccinimida, N-bromossuccinimida (NBS), N-clorossuccinimida (NCS), bromo, e cloreto de sulfurila. Adicionalmente, a reação pode ser acelerada pela adição de calor, luz, ou um iniciador radicalar como peróxido de benzoíla, e azobisisobutironitrila.
[00114] Exemplos de agentes de halogenação a serem usados quando reação de halogenação é realizada para um grupo hidroxila em cada etapa incluem ácidos hidro-hálicos e haletos de ácido de ácidos inorgânicos, especialmente, ácido clorídrico, cloreto de tionila, oxicloreto de fósforo para cloração, e ácido bromídrico 48% para bromação. Pode ser usado um método no qual uma forma alquila halogenada é obtida a partir de um álcool pela ação de trifenilfosfina e tetracloreto de carbono, tetrabrometo de carbono, ou semelhantes. Alternativamente, pode ser usado um método no qual uma forma alquila halogenada é sintetizada mediante uma reação de duas etapas de modo que um álcool seja convertido em um sulfato e então reagido com brometo de lítio, cloreto de lítio, ou iodeto de sódio.
[00115] Exemplos de reagentes a serem usados quando a reação de
38 / 66 Arbuzov é realizada em cada etapa incluem alquilas halogenadas como acetato de bromoetilo; e fosfitos como fosfito de trietila e fosfito de tri(isopropila).
[00116] Exemplos de agentes de sulfonação a serem usados quando reação de sulfonação é realizada em cada etapa incluem cloreto de metanossulfonila, cloreto de p-toluenossulfonila, anidrido metanossulfônico, anidrido p-toluenossulfônico, e anidrido trifluorometanossulfônico.
[00117] Quando reação de hidrólise é realizada em cada etapa, um ácido ou uma base é usado como um reagente. Quando reação de hidrólise ácida é realizada para um éster t-butílico, ácido fórmico ou trietilsilano é adicionado em alguns casos para redutivamente sequestrar cátions t-butílicos produzidos como subprodutos.
[00118] Exemplos de agentes desidratantes a serem usados quando reação de desidratação é realizada em cada etapa incluem ácido sulfúrico, pentóxido de difósforo, oxicloreto de fósforo, N,N'-diciclo-hexilcarbodi- imida, alumina, e ácido polifosfórico.
[00119] O Composto (I) pode ser produzido, por exemplo, pelo uso de um método de produção mostrado abaixo. Dentre os compostos (I), um composto no qual cada uma das linhas onduladas forma uma estrutura-cis e um composto no qual uma das ou ambas as linhas onduladas forma(m) uma estrutura-trans podem ser ambos produzidos pelo uso do mesmo método de produção que o método de produção mostrado abaixo. Na presente invenção, o composto (I) com uma estrutura desejada pode ser sintetizado pelo uso de uma matéria-prima apropriada para a estrutura pretendida de composto (I) particularmente em esterificação. Um sal de composto (I) pode ser obtido
39 / 66 mediante mistura apropriada com uma base inorgânica, uma base orgânica, um ácido orgânico, um aminoácido básico ou um aminoácido ácido.
[Fórmula 4]
[00120] Agora, serão descritos um método para produzir uma partícula
40 / 66 lipídica contendo o composto da presente invenção e um método para produzir uma composição contendo a partícula lipídica e um ácido nucleico para introdução ácido nucleico.
[00121] A partícula lipídica da presente invenção pode ser produzida por mistura do composto da presente invenção (lipídio catiônico) e, conforme a necessidade, um componente lipídico adicional, e então aplicação de um método conhecido para preparar uma partícula lipídica a partir de um componente lipídico. Por exemplo, a partícula lipídica pode ser produzida como uma dispersão de partícula lipídica pela dissolução do componente lipídico (misturado) em um solvente orgânico e mistura da solução de solvente orgânico resultante com água ou um tampão (por exemplo, mediante um método de emulsificação). A mistura pode ser realizada pelo uso de um sistema de mistura microfluídica (por exemplo, o aparelho NanoAssembler (Precision NanoSystems)). A partícula lipídica obtida pode ser submetida à dessalinização ou diálise e filtração estéril. Conforme a necessidade, um ajuste de pH ou ajuste de pressão osmótica pode ser realizado.
[00122] O composto (I) pode formar estruturas diferentes dependendo da combinação das definições de n, R, e linhas onduladas da fórmula (I). Para introduzir a partícula lipídica, um composto tendo uma estrutura específica pode ser usado sozinho como o composto (I), e uma mistura de uma pluralidade de compostos de estruturas diferentes pode ser usada como o composto (I).
[00123] Exemplos do “componente lipídico adicional” incluem os lipídios estruturais supracitados como esteróis, fosfolipídios, e poli(glicol etilênico)-lipídios. O “componente lipídico adicional” é usado, por exemplo,
41 / 66 em uma quantidade de 0,008 a 4 mol por mol do composto da presente invenção. O composto da presente invenção é preferivelmente usado como uma mistura com o componente lipídico adicional (em particular, colesterol, fosfatidilcolina, e um poli(glicol etilênico)-lipídio). Em uma modalidade preferida que usa uma mistura do composto da presente invenção e o componente lipídico adicional, a mistura é uma mistura de 1 a 4 mol do composto da presente invenção, de 0 a 3 mol de um esterol, de 0 a 2 mol de um fosfolipídio, e de 0 a 1 mol de um poli(glicol etilênico)-lipídio. Em uma modalidade mais preferida que usa uma mistura do composto da presente invenção e o componente lipídico adicional, a mistura é uma mistura de 1 a 1,5 mol do composto da presente invenção, 0 a 1,25 mol de um esterol, 0 a 0,5 mol de um fosfolipídio, e 0 a 0,125 mol de um poli(glicol etilênico)- lipídio.
[00124] A concentração do composto da presente invenção ou da mistura do composto da presente invenção e o componente lipídico adicional na solução de solvente orgânico é preferivelmente de 0,5 a 100 mg/mL.
[00125] Exemplos do solvente orgânico incluem metanol, etanol, 1- propanol, 2-propanol, 1-butanol, terc-butanol, acetona, acetonitrila, N,N- dimetilformamida, sulfóxido dimetílico, e misturas deles. O solvente orgânico pode conter de 0 a 20% de água ou um tampão.
[00126] Exemplos do tampão incluem tampões ácidos (por exemplo, tampão acetato, tampão citrato, tampão 2-morfolinoetanossulfonato (MES), tampão fosfato), e tampões neutros (por exemplo, tampão 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanossulfonato (HEPES), tampão tris(hidroximetil)aminometano (Tris), tampão fosfato, tampão fosfato-salino (PBS)).
42 / 66
[00127] Se a mistura é realizada pelo uso de um sistema de mistura microfluídica, é preferido misturar 1 a 5 partes em volume de água ou do tampão por parte em volume da solução de solvente orgânico. A taxa de fluxo da solução misturada (solução misturada da solução de solvente orgânico e água ou tampão) no sistema é preferivelmente de 0,1 a 10 mL/min, e a temperatura é preferivelmente de 15 a 45°C.
[00128] A composição da presente invenção pode ser produzida como uma dispersão de partícula lipídica contendo um ingrediente ativo pela adição antecipada de um ácido nucleico como um ingrediente ativo à água ou ao tampão na produção da partícula lipídica ou uma dispersão de partícula lipídica. O ingrediente ativo é preferivelmente adicionado de modo que a concentração de ingrediente ativo em água ou no tampão alcance de 0,05 a 2,0 mg/mL.
[00129] Além disso, a composição da presente invenção pode ser produzida como uma dispersão de partícula lipídica contendo um ingrediente ativo pela mistura da partícula lipídica ou de uma dispersão de partícula lipídica e um ingrediente ativo ou uma solução aquosa do ingrediente ativo através um método conhecido. A dispersão de partícula lipídica pode ser preparada pela dispersão da partícula lipídica em um meio dispersante apropriado. A solução aquosa do ingrediente ativo pode ser preparada dissolvendo o ingrediente ativo em um solvente apropriado.
[00130] O teor do composto da presente invenção na composição da presente invenção com o meio dispersante e o solvente excluídos é preferivelmente de 40 a 70% em peso.
[00131] O teor do ingrediente na composição da presente invenção om
43 / 66 o meio dispersante e o solvente excluídos é preferivelmente de 1 a 20% em peso.
[00132] O meio dispersante da dispersão de partícula lipídica ou da dispersão contendo a composição pode ser substituído por água ou um tampão mediante diálise. A diálise é realizada com uma membrana de ultrafiltração tendo um corte de peso molecular de 10 a 20K de 4°C a temperatura ambiente. A diálise pode ser realizada repetidamente. Para a substituição do meio dispersante, filtração de fluxo tangencial (TFF) pode ser usada. Após a substituição do meio dispersante, o ajuste de pH ou o ajuste da pressão osmótica pode ser realizado, conforme a necessidade.
[00133] Agora, serão descritos os métodos para analisar uma partícula lipídica contendo o composto da presente invenção, e uma composição contendo a partícula lipídica e um ácido nucleico como um ingrediente ativo.
[00134] O tamanho de partícula da partícula lipídica (na composição) pode ser medido pelo uso de um meio conhecido. Por exemplo, um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited), um analisador de tamanho de partícula baseado em uma técnica de retrodispersão não invasiva (NIBS), pode ser usado para calcular o tamanho de partícula como um tamanho de partícula médio-z mediante análise cumulativa da função de autocorrelação. O tamanho de partícula (tamanho médio de partícula) da partícula lipídica (na composição) é preferivelmente de 10 a 200 nm.
[00135] A concentração e a relação de encapsulamento de um ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um mRNA) como um ingrediente ativo na composição da presente invenção podem ser medidas pelo uso de um meio conhecido. Por exemplo, após o ácido nucleico ser marcado com
44 / 66 fluorescência com Quant-iT (TM) RiboGreen (R) (Invitrogen), a concentração e a relação de encapsulamento podem ser determinadas pela medição da intensidade da fluorescência. A concentração do ácido nucleico na composição pode ser calculada pelo uso de uma curva padrão preparada a partir de soluções aquosas do ácido nucleico com concentrações conhecidas, e a relação de encapsulamento pode ser calculada com base na diferença em intensidade de fluorescência dependendo da presença ou ausência de adição de Triton-X100 (um tensoativo para desintegrar a partícula lipídica). A concentração do ácido nucleico na composição refere-se à concentração total de moléculas do ácido nucleico encapsuladas na partícula lipídica e de moléculas do ácido nucleico não encapsuladas na partícula lipídica, e a relação de encapsulamento refere-se à fração de moléculas do ácido nucleico encapsuladas na partícula lipídica em relação a todas as moléculas do ácido nucleico na composição.
Exemplos
[00136] A presente invenção será adicionalmente descrita em detalhes com referência aos Exemplos, Exemplos de Teste, e Exemplos de Formulação; entretanto, estes não limitam a presente invenção, e modificação pode ser realizada sem se desviar do escopo da presente invenção.
[00137] “Temperatura ambiente” nos Exemplos, abaixo, tipicamente indica aproximadamente de 10°C a aproximadamente 35°C. Cada relação mostrada para solvente misto indica uma relação em volume, salvo declaração em contrário. % Indica % em peso, salvo declaração em contrário.
[00138] Eluição em cromatografia em coluna foi realizada sob observação com CCF (cromatografia em camada fina), salvo descrição em
45 / 66 contrário. Na observação com CCF, uma 60 F254 produzida por Merck KGaA foi usada como uma placa de CCF, e o solvente usado como um solvente de eluição em cromatografia em coluna foi usado como um eluente. Um detector de UV foi utilizado para detecção, e a observação foi realizada com um reagente de coloração para CCF, conforme a necessidade. Na descrição de cromatografia em coluna de gel de sílica, NH indica que foi usado gel de sílica ligada com aminopropilsilano, e Diol indica que foi usado gel de sílica ligada com 3-(2,3-di-hidroxipropoxi)propilsilano. Na descrição de CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) preparativa, C18 indica que foi usado gel de sílica ligada com octadecila. Cada relação mostrada para solvente de eluição indica uma relação em volume, salvo declaração em contrário.
[00139] RMN-1H foi medida pelo uso de RMN com transformada de Fourier. O programa de computador ACD/SpecManager (nome de produto) e assim por diante foi usado para análise de RMN-1H. Descrição é ocasionalmente omitida para os picos para um grupo hidroxila, um grupo amino, e assim por diante, com um pico de próton muito largo.
[00140] EM foi medido mediante CL/EM e um MALDI/TOFMS. Para o método de ionização, foi usado um método IES, um método IQPA, ou um método MALDI. ACHC foi usado para a matriz. Os valores medidos (verificados) foram relatados como dados. Em casos típicos, alguns picos de íon molecular são observados como íons de fragmento. No caso de um sal, o pico de íon molecular para a forma livre, picos de íon catiônico, aniônico, ou de fragmento são tipicamente observados.
[00141] Nos Exemplos abaixo, as seguintes abreviações são usadas.
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[00142] EM: Espectro de massas M: Concentração molar N: Normalidade CDCl3: Clorofórmio deuterado DMSO-d6: Sulfóxido dimetílico deuterado RMN-1H: Ressonância magnética nuclear de próton LC/EM: Cromatógrafo líquido/Espectrômetro de massas IES: Ionização por eletrospray IQPA: Ionização química à pressão atmosférica MALDI: Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz TOFMS: Espectrometria de Massas por Tempo-de-Voo ACHC: Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico DMF: N,N-dimetilformamida THF: Tetra-hidrofurano DMAP: 4-Dimetilaminopiridina FTBA: Fluoreto de tetrabutilamônio [Exemplo 1] (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)- tetradec-9-enoiloxi)metil)propila A) 2-(((terc-Butildimetilsilil)oxi)metil)-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol
[00143] A uma mistura de 2,2-bis(hidroximetil)propano-1,3-diol (5,45 g), 1H-imidazol (2,72 g) e DMF (190 mL), uma solução de terc- butilclorodimetilsilano (3,01 g) em DMF (10 mL) foi adicionada à temperatura ambiente. Após agitação durante 24 horas, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com acetato de
47 / 66 etila, a solução foi lavada três vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (2,25 g).
[00144] RMN-1H (300 MHz, CDCl3) δ ppm 0,08 (6H, s), 0,90 (9H, s), 2,53 (3H, t, J = 5,5 Hz), 3,66 (2H, s), 3,73 (6H, d, J = 5,5 Hz) B) (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((terc-butil(dimetil)silil)oxi)-2,2-bis(((9Z)- tetradec-9-enoiloxi)metil)propila
[00145] A uma solução de 2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-2- (hidroximetil)propano-1,3-diol (258 mg), ácido (9Z)-tetradec-9-enoico (769 mg) e DMAP (126 mg) em DMF (3 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida (790 mg) foi adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 18 horas, a mistura de reação foi diluída com acetato de etila, lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (NH, acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (860 mg).
[00146] RMN-1H (300 MHz, CDCl3) δ ppm 0,03 (6H, s), 0,81-0,96 (18H, m), 1,18-1,41 (36H, m), 1,53-1,67 (6H,m), 1,91-2,10 (12H, m), 2,29 (6H, t, J = 7,6 Hz), 3,58 (2H, s), 4,08 (6H, s), 5,27-5,43 (6H, m) C) (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-hidroxi-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila
[00147] A uma solução de (9Z)-tetradec-9-enoato de 3-((terc-
48 / 66 butil(dimetil)silil)oxi)-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9-enoiloxi)metil)propila (5,91 g) em THF (120 mL), uma mistura de uma solução de FTBA em THF (1 M, 14,85 mL) e ácido acético (4,91 mL) foi adicionada à temperatura ambiente.
Após agitação durante 3 dias, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com acetato de etila, a solução foi lavada uma vez com solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (4,96 g).
[00148] RMN-1H (300 MHz, CDCl3) δ ppm 0,82-0,97 (9H, m), 1,16- 1,42 (36H, m), 1,52-1,68 (6H, m), 1,90-2,12 (12H, m), 2,32 (6H, t, J = 7,6 Hz), 2,52 (1H, t, J = 7,0 Hz), 3,49 (2H, d, J = 7,0 Hz), 4,11 (6H, s), 5,26-5,42 (6H, m) D) (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2- bis(((9Z)-tetradec-9-enoiloxi)metil)propila
[00149] A uma solução de (9Z)-tetradec-9-enoato de 3-hidroxi-2,2- bis(((9Z)-tetradec-9-enoiloxi)metil)propila (4,96 g), DMAP (796 mg) e cloridrato de ácido 4-(dimetilamino)butanoico (2,19 g) em DMF (20 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (2,50 g) foi adicionada à temperatura ambiente. Após agitação durante 18 horas, a mistura de reação foi diluída com acetato de etila, lavada uma vez com solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna
49 / 66 de gel de sílica (NH, acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (5,31 g).
[00150] RMN-1H (300 MHz, CDCl3) δ ppm 0,82-0,94 (9H, m), 1,20- 1,42 (36H, m), 1,50-1,66 (6H, m), 1,69-1,83 (2H, m), 1,90-2,10 (12H, m), 2,20 (6H, s), 2,23-2,41 (10H, m), 4,11 (8H, s), 5,23-5,44 (6H, m) [Exemplo 4] (9Z)-Hexadec-9-enoato de 3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)- tetradec-9-enoiloxi)metil)propila A) 2-(((terc-Butil(difenil)silil)oxi)metil)-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol
[00151] A uma mistura de 2,2-bis(hidroximetil)propano-1,3-diol (5,0 g), 1H-imidazol (2,5 g) e DMF (200 mL), uma solução de terc- butilclorodifenilsilano (5,1 g) em DMF (10 mL) foi adicionada à temperatura ambiente. Após agitação durante 18 horas, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com acetato de etila, a solução foi lavada três vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (6,4 g).
[00152] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 1,07 (9H, s), 2,34 (3H, t, J = 5,5 Hz), 3,67 (2H, s), 3,74 (6H, d, J = 5,5 Hz), 7,39-7,48 (6 H, m), 7,63- 7,67 (4H, m) B) (5-(((terc-Butil(difenil)silil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metanol
[00153] A uma solução de 2-(((terc-butil(difenil)silil)oxi)metil)-2- (hidroximetil)propano-1,3-diol (3,5 g) e 2,2-dimetoxipropano (1,5 g) em acetona (35 mL), ácido p-toluenossulfônico mono-hidrato (88,9 mg) foi
50 / 66 adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 2 horas, amônia aquosa diluída foi adicionada à mistura de reação para neutralizar a mistura de reação, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (2,7 g).
RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 1,07 (9H, s), 1,27 (3H, s), 1,41 (3H, s), 2,12-2,18 (1 H, m), 3,69-3,78 (8H, m), 7,38-7,47 (6H, m), 7,65-7,69 (4H, m) C) (9Z)-Hexadec-9-enoato de (5-(((terc-butil(difenil)silil)oxi)metil)-2,2- dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila
[00154] A uma solução de (5-(((terc-butil(difenil)silil)oxi)metil)-2,2- dimetil-1,3-dioxan-5-il)metanol (910 mg), DMAP (215 mg) e ácido (9Z)- hexadec-9-enoico (838 mg) em DMF (10 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida (757 mg) foi adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 6 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (1,43 g).
[00155] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 0,84 - 0,91 (3 H, m), 1,03 - 1,07 (9 H, m), 1,22 - 1,35 (16 H, m), 1,40 (6 H, d, J = 17,0 Hz), 1,49 - 1,63 (2 H, m), 2,01 (4 H, q, J=6,5 Hz), 2,24 (2 H, t, J=7,6 Hz), 3,65 (2 H, s), 3,73 (2 H, d, J=11,7 Hz), 3,80 (2 H, d, J=12,0 Hz), 4,17 (2 H, s), 5,29 - 5,39 (2 H, m), 7,35 - 7,46 (6 H, m), 7,65 (4 H, d, J=6,9 Hz) D) (9Z)-Hexadec-9-enoato de (5-(hidroximetil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-
51 / 66 il)metila
[00156] A uma solução de (9Z)-hexadec-9-enoato de (5-(((terc- butil(difenil)silil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila (1,43 g) em THF (4 mL), uma solução de FTBA em THF (1 M, 2,64 mL) foi adicionada à temperatura ambiente. Após agitação durante 3 horas, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com acetato de etila, a solução foi lavada uma vez com solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida.
O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (0,82 g).
[00157] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 0,85 - 0,91 (3 H, m), 1,24 - 1,36 (16 H, m), 1,42 (6 H, s), 1,58 - 1,66 (2 H, m), 2,01 (4 H, q, J=6,5 Hz), 2,30 (1 H, t, J=6,6 Hz), 2,35 (2 H, t, J=7,6 Hz), 3,48 (2 H, d, J=6,6 Hz), 3,69 - 3,75 (4 H, m), 4,25 (2 H, s), 5,31 - 5,38 (2 H, m) E) (9Z)-Hexadec-9-enoato de (5-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-2,2- dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila
[00158] A uma solução de (9Z)-hexadec-9-enoato de (5-(hidroximetil)- 2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila (410 mg), DMAP (97 mg) e cloridrato de ácido 4-(dimetilamino)butírico (250 mg) em DMF (4 mL), cloridrato de 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (343 mg) foi adicionado a 50°C. Após agitação durante 4 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por
52 / 66 cromatografia em coluna de gel de sílica (NH, acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (430 mg).
[00159] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 0,86 - 0,91 (3 H, m), 1,24 - 1,36 (16 H, m), 1,42 (6 H, s), 1,53 - 1,69 (2 H, m), 1,78 (2 H, m), 1,98 - 2,04 (4 H, m), 2,21 (6 H, s), 2,29 (4 H, m), 2,37 (2 H, t, J=7,6 Hz), 3,74 (4 H, s), 4,11 (4 H, d, J=5,7 Hz), 5,31 - 5,38 (2 H, m) F) (9Z)-Hexadec-9-enoato de 3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2- bis(((9Z)-tetradec-9-enoiloxi)metil)propila
[00160] Ao (9Z)-hexadec-9-enoato de (5-(((4- (dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila (430 mg), ácido acético (2 mL) e água (1 mL) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada a 75°C durante 2 horas, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. Acetato de etila e solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foram adicionados ao resíduo, e a mistura resultante foi agitada durante 2 horas. Depois, lavagem com água foi realizada duas vezes, a mistura resultante foi seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. A uma solução do resíduo resultante, DMAP (201 mg) e ácido (9Z)-tetradec-9-enoico (466 mg) em DMF (4 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (458 mg) foi adicionado a 50°C. Após agitação durante 4 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (NH, acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (604 mg).
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[00161] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 0,85 - 0,92 (9 H, m), 1,24 - 1,36 (40 H, m), 1,55 - 1,64 (6 H, m), 1,73 - 1,80 (2 H, m), 1,98 - 2,05 (12 H, m), 2,20 (6 H, s), 2,24 - 2,33 (8 H, m), 2,36 (2 H, t, J=7,6 Hz), 4,09 - 4,13 (8 H, m), 5,31 - 5,38 (6 H, m) [Exemplo 8] (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-(((N,N-dimetil-β-alanil)oxi)metil)-2- ((octanoiloxi)metil)propano-1,3-di-ila A) (2-(4-Metoxifenil)-1,3-dioxano-5,5-di-il)dimetanol
[00162] Uma solução de 2,2-bis(hidroximetil)propano-1,3-diol (506 g) em água (2,0 L) foi agitada a 50°C. Ácido clorídrico concentrado (18 mL) foi adicionado à mesma, à qual p-metoxibenzaldeído (474 mL) foi adicionado por gotejamento a cerca de 30°C durante 3 horas. Depois, a temperatura da solução de reação foi ajustada para 25°C, e a solução de reação foi agitada durante 5 horas. À mesma, solução aquosa de hidróxido de sódio 2 N (120 mL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada durante 1 hora. Cristais foram coletados através de filtração e lavados com água, e então recristalização foi realizada com acetato de etila/hexano para produzir o composto do título (769 g).
[00163] RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm3,24 (2H, d, J = 5,0 Hz), 3,67 (2H, d, J = 5,4 Hz), 3,74 (3H, s), 3,77 (2H, d, J = 11,3 Hz), 3,88 (2H, t, J = 11,3 Hz), 4,53 (1H, t, J = 5,4 Hz), 4,62 (1H, t, J = 5,0 Hz), 5,34 (1H, s), 6,90 (2H, d, J = 8,9 Hz), 7,33 (2H, d, J = 8,9 Hz) B-1) 2-(Hidroximetil)-2-(((4-metoxibenzil)oxi)metil)propano-1,3-diol
[00164] A uma solução de suspensão de (2-(4-metoxifenil)-1,3- dioxano-5,5-di-il)dimetanol (10,0 g) em tolueno (100 mL), solução de
54 / 66 DIBAL-H 1,5 M (105 mL) foi adicionada por gotejamento à temperatura ambiente, e a mistura resultante foi agitada durante 5 horas. Metanol (30 mL) foi adicionado à mesma, e ácido clorídrico 2 N (20 mL) e solução aquosa de hidróxido de sódio 4 N (240 mL) foram então adicionados à mesma e a mistura resultante foi agitada durante 2 horas, e depois a camada de tolueno foi removida. Depois, a camada aquosa foi neutralizada com ácido clorídrico, extração foi realizada com acetato de etila, e o extrato foi lavado duas vezes com salmoura saturada e filtrado através de Celite. O solvente foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo foi recristalizado com acetato de etila/hexano para produzir o composto do título (6,6 g).
[00165] RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,32 (2H, s), 3,39 (6H, d, J = 5,4 Hz), 3,74 (3H, s), 4,21 (3H, t, J = 5,4 Hz), 4,36 (2H, s), 6,90 (2H, d like, J = 7,8 Hz), 7,23 (2H, d like, J = 7,8 Hz) C-1) (5-(((4-Metoxibenzil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metanol
[00166] A uma solução de 2-(hidroximetil)-2-(((4- metoxibenzil)oxi)metil)propano-1,3-diol (1,00 g) e 2,2-dimetoxipropano (1,22 g) em DMF (5 mL), p-toluenossulfonato de piridínio (10 mg) foi adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 2 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada uma vez com solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e duas vezes com solução salina 5%, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (426 mg).
[00167] RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,29 (3H, s), 1,29 (3H,
55 / 66 s), 3,35 (2H, s), 3,39 (2H, d, J = 5,1 Hz), 3,61 (4H, s), 3,74 (3H, s), 4,38 (2H, s), 4,59 (1H, t, J = 5,1 Hz), 6,90 (2H, d like, J = 7,5 Hz), 7,24 (2H, d like, J = 7,5 Hz) B-2) 9-(4-Metoxifenil)-3,3-dimetil-2,4,8,10-tetraoxaespiro[5.5]undecano
[00168] A uma solução de (2-(4-metoxifenil)-1,3-dioxano-5,5-di- il)dimetanol (2,00 g) e 2,2-dimetoxipropano (2,46 g) em DMF (8 mL), p- toluenossulfonato de piridínio (20 mg) foi adicionado à temperatura ambiente.
Após agitação durante 4 horas, a mistura de reação foi diluída com acetato de etila, lavada duas vezes com solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e duas vezes com salmoura saturada, e então seca com sulfato de magnésio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi recristalizado com acetato de etila/hexano para produzir o composto do título (1,62 g).
[00169] RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,34 (6H, s), 3,33 (2H, s), 3,63 (2H, d, J = 11,7 Hz), 3,74 (3H, s), 3,99 (2H, s), 4,12 (2H, d, J = 11,7 Hz), 5,37 (1H, s), 6,90 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,34 (2H, d, J = 8,8 Hz) C-2) (5-(((4-Metoxibenzil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metanol
[00170] A uma solução-suspensão de 9-(4-metoxifenil)-3,3-dimetil- 2,4,8,10-tetraoxaespiro[5.5]undecano (22,0 g) em tolueno (200 mL), solução de DIBAL-H 1,5 M (60 mL) foi adicionada por gotejamento de 5 a 20°C, e a mistura resultante foi agitada a 15°C durante 3 horas. Metanol (22 mL) foi adicionado à mesma, e solução aquosa de hidróxido de sódio 2 N (100 mL) e solução aquosa de hidróxido de sódio 4 N (200 mL) foram então adicionadas por gotejamento à mesma na ordem apresentada. Após agitação durante 1,5 horas, a camada de tolueno foi separada e lavada com solução salina 5%. O
56 / 66 solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (14,7 g).
[00171] RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,29 (3H, s), 1,29 (3H, s), 3,35 (2H, s), 3,39 (2H, d, J = 5,1 Hz), 3,61 (4H, s), 3,74 (3H, s), 4,38 (2H, s), 4,59 (1H, t, J = 5,1 Hz), 6,90 (2H, d like, J = 7,5 Hz), 7,24 (2H, d like, J = 7,5 Hz) D) Octanoato de (5-(((4-metoxibenzil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5- il)metila
[00172] A uma solução de (5-(((4-metoxibenzil)oxi)metil)-2,2-dimetil- 1,3-dioxan-5-il)metanol (2,00 g), DMAP (412 mg) e ácido octanoico (1,27 g) em DMF (20 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (1,94 g) foi adicionado a 50°C. Após agitação durante 4 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (2,78 g).
[00173] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ 0,84 - 0,91 (3 H, m), 1,22 - 1,33 (8 H, m), 1,40 (6 H, s), 1,53 - 1,61 (2 H, m), 2,26 (2 H, t, J = 7,6 Hz), 3,39 (2 H, s), 3,68 - 3,74 (2 H, m), 3,76 - 3,80 (2 H, m), 3,80 (3 H, s), 4,15 (2 H, s), 4,42 (2 H, s), 6,87 (2 H, d, J = 7,8 Hz), 7,20 - 7,24 (2 H, m) E) Octanoato de (5-(hidroximetil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila
[00174] A uma solução de octanoato de (5-(((4- metoxibenzil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila (2,78 g) em etanol
57 / 66 (30 mL), Pd-carbono (840 mg) foi adicionado à temperatura ambiente, e a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio durante 5 horas. Após a reação, Pd-carbono foi removido através de filtração, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (1,35 g).
[00175] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ 0,85 - 0,91 (3 H, m), 1,23 - 1,34 (8 H, m), 1,38 - 1,44 (6 H, m), 1,63 (2 H, m), 2,30 - 2,38 (3 H, m), 3,48 (2 H, d, J = 6,6 Hz), 3,68 - 3,75 (4 H, m), 4,25 (2 H, s) F) Octanoato de (5-(((N,N-dimetil-β-alanil)oxi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioxan- 5-il)metila
[00176] A uma solução de octanoato de (5-(hidroximetil)-2,2-dimetil- 1,3-dioxan-5-il)metila (400 mg), DMAP (129 mg) e cloridrato de ácido 3- (dimetilamino)propanoico (305 mg) em DMF (4 mL), cloridrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (456 mg) foi adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 4 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (NH, acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (320 mg).
[00177] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ 0,84 - 0,92 (3 H, m), 1,21 - 1,33 (8 H, m), 1,42 (6 H, s), 1,61 (2 H, br), 2,23 (6 H, s), 2,32 (2 H, t, J = 7,6 Hz), 2,47 - 2,51 (2 H, m), 2,57 - 2,61 (2 H, m), 3,75 (4 H, s), 4,13 (4 H, d, J = 11,7 Hz)
58 / 66 G) (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-(((N,N-dimetil-β-alanil)oxi)metil)-2- ((octanoiloxi)metil)propano-1,3-di-ila
[00178] Ao octanoato de (5-(((N,N-dimetil-β-alanil)oxi)metil)-2,2- dimetil-1,3-dioxan-5-il)metila (320 mg), ácido acético (1,6 mL) e água (0,8 mL) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada a 65°C durante 3,5 horas, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. Acetato de etila e solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foram adicionados ao resíduo, e a mistura resultante foi agitada durante 2 horas. Depois, lavagem foi realizada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, a mistura resultante foi seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. A uma solução do resíduo resultante (150 mg), DMAP (101 mg), e ácido (9Z)-tetradec-9-enoico (235 mg) em DMF (4,5 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (231 mg) foi adicionado a 50°C. Após agitação durante 8 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (NH, acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (230 mg).
[00179] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ 0,84 - 0,93 (9 H, m), 1,24 - 1,36 (30 H, m), 1,53 - 1,65 (8 H, m), 1,98 - 2,05 (8 H, m), 2,22 (6 H, s), 2,30 (6 H, t, J = 7,6 Hz), 2,48 (2 H, t, J = 6,9 Hz), 2,58 (2 H, t, J = 6,8 Hz), 4,06 - 4,22 (8 H, m), 5,31 - 5,38 (4 H, m) [Exemplo 11] (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-2-
59 / 66 ((dodecanoiloxi)metil)propano-1,3-di-ila A) Dodecanoato de 3-hidroxi-2,2-bis(hidroximetil)propila
[00180] A uma solução de 2,2-bis(hidroximetil)propano-1,3-diol (5,00 g), DMAP (2,24 g) e ácido láurico (3,68 g) em DMF (150 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (7,04 g) foi adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 20 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (1,79 g).
[00181] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ 0,85 - 0,91 (3 H, m), 1,22 - 1,33 (16 H, m), 1,59 - 1,66 (3 H, m), 2,36 (2 H, t, J = 7,6 Hz), 2,51 (2 H, t, J = 5,8 Hz), 3,65 (6 H, d, J = 5,7 Hz), 4,23 (2 H, s) B) (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-((dodecanoiloxi)metil)-2- (hidroximetil)propano-1,3-di-ila
[00182] A uma solução de dodecanoato de 3-hidroxi-2,2- bis(hidroximetil)propila (400 mg), DMAP (153 mg) e ácido (9Z)-tetradec-9- enoico (569 mg) em DMF (4 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida (602 mg) foi adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 8 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila/hexano) para
60 / 66 produzir o composto do título (230 mg).
[00183] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ 0,85 - 0,93 (9 H, m), 1,22 - 1,36 (40 H, m), 1,58 - 1,65 (6 H, m), 1,99 - 2,05 (8 H, m), 2,32 (6 H, t, J = 7,6 Hz), 2,52 (1 H, t, J = 7,1 Hz), 3,48 (2 H, d, J = 6,9 Hz), 4,09 - 4,14 (6 H, m), 5,31 - 5,38 (4 H, m) C) (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)- 2-((dodecanoiloxi)metil)propano-1,3-di-ila
[00184] A uma solução de (9Z,9'Z)bis-tetradec-9-enoato de 2- ((dodecanoiloxi)metil)-2-(hidroximetil)propano-1,3-di-ila ( (230 mg), DMAP (38 mg) e cloridrato de ácido 4-(dimetilamino)butírico (105 mg) em DMF (4 mL), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (150 mg) foi adicionado à temperatura ambiente. Após agitação durante 3 horas, acetato de etila foi adicionado à mistura de reação, a mistura resultante foi lavada duas vezes com água e uma vez com salmoura saturada, e então seca com sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (NH, acetato de etila/hexano) para produzir o composto do título (100 mg).
[00185] RMN-1H (500 MHz, CDCl3) δ 0,85 - 0,93 (9 H, m), 1,23 - 1,35 (40 H, m), 1,55 - 1,67 (6 H, m), 1,77 (2 H, m), 1,98 - 2,05 (8 H, m), 2,20 (6 H, s), 2,24 - 2,33 (8 H, m), 2,36 (2 H, t, J = 7,6 Hz), 4,09 - 4,13 (8 H, m), 5,31 - 5,38 (4 H, m)
[00186] Os Exemplos 2 e 3, 5 a 7, e 9 e 10 na tabela, abaixo, foram produzidos de acordo com qualquer um dos métodos mostrados nos Exemplos acima e os métodos de confirmação dos mesmos. A Tabela 1 mostra os nomes, as estruturas, e os números de massa dos compostos
61 / 66 observados na produção (indicados como EM na tabela) para aqueles Exemplos juntos com os Exemplos 1, 4, 8, e 11.
[Tabela 1] Exemplo de EM:m/z Nome IUPAC Fórmula Estrutural número (M+H) (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((4- (dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2- 1 874,75 bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((5- (dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2- 2 888,73 bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila (9Z)-Tetradec-9-enoato de 3-((6- (dimetilamino)hexanoil)oxi)-2,2- 3 902,74 bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila (9Z)-Hexadec-9-enoato de 3-((4- (dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2- 4 902,74 bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila (9Z)-Hexadec-9-enoato de 3-((5- (dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2- 5 916,76 bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila (9Z)-Octadec-9-enoato de 3-((5- (dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2- 6 944,79 bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila (9Z,12Z)-Octadec-9,12-dienoato de 3-((5- 7 (dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2- 942,77 bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-(((N,N-dimetil-β- 8 alanil)oxi]metil}-2- 778,62 [(octanoiloxi)metil)propano-1,3- di-ila (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-(((4- 9 (dimetilamino)butanoil)oxi)metil)- 792,63 2-((octanoiloxi)metil)propano-1,3- di-ila (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-((decanoiloxi)metil)-2-(((4- 10 820,67 (dimetilamino)butanoil)oxi)metil) propano-1,3-di-ila
62 / 66 (9Z,9'Z)Bis-tetradec-9-enoato de 2-(((4- 11 (dimetilamino)butanoil)oxi)metil)- 848,70 2-((dodecanoiloxi)metil)propano- 1,3-di-ila [Exemplo de Produção e Exemplo de Teste para Composição Contendo Partícula Lipídica da Presente Invenção e Ácido Nucleico para Introdução de Ácido Nucleico] [Exemplo de Produção 1]
[00187] Uma mistura lipídica (produto de lipídio catiônico em Exemplos:DPPC:colesterol:GM-020 = 60:10,6:28:1,4, em relação molar) foi dissolvida em 90% de ETOH/10% de água isenta de RNase para produzir uma solução de lipídio a 8,5 mg/mL. mRNA que codifica Luciferase (TriLink BioTechnologies) foi dissolvido em tampão 2-morfolinoetanossulfonato (MES) 10 mM em pH 4,0 para produzir uma solução de ácido nucleico a 0,22 mg/mL. A solução de lipídio e a solução de ácido nucleico obtidas foram misturadas pelo uso do aparelho NanoAssembler (Precision Nanosystems) à temperatura ambiente com uma relação de taxa de fluxo de 3 mL/min:6 mL/min para produzir uma dispersão contendo uma partícula lipídica encapsulando o ácido nucleico. Pelo uso de um Slyde-A-Lyzer (corte de peso molecular: 20k, Thermo Fisher Scientific), a dispersão obtida foi dialisada com água à temperatura ambiente durante 1 hora e com PBS a 4°C durante 8 horas. Subsequentemente, filtração foi realizada com um filtro de seringa de 0,2 µm (IWAKI CO., LTD.) para preparar uma composição para introdução de ácido nucleico, e depois a composição foi armazenada a 4°C. O tamanho de partícula da partícula lipídica foi medido pelo uso de um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited). A concentração de mRNA e a relação de encapsulamento da partícula lipídica foram medidas pelo uso de um Quant-
63 / 66 iT™ RiboGreen® (Invitrogen). A Tabela 2 mostra os resultados de análise.
[Tabela 2] Tamanho de Relação de Lipídio catiônico Concentração de mRNA (µg/mL) partícula (nm) Encapsulamento (%) Exemplo 1 71 136 96 Exemplo 2 90 73 96 Exemplo 3 93 87 96 Exemplo 4 76 113 97 Exemplo 5 91 96 98 Exemplo 8 67 84 94 Exemplo 9 108 129 62 Exemplo 10 92 86 84 Exemplo 11 83 85 92 [Exemplo de Teste 1] Teste de Transfecção de mRNA para dentro de Células Cultivadas
[00188] Células HCT116A da linhagem celular derivada de câncer colorretal humano foram cultivadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de células de 6.000 células/poço, e 24 horas depois, 10 µL da composição contendo 10 ng de mRNA que codifica luciferase para introdução de ácido nucleico (uma solução obtida pela diluição do produto do Exemplo de Produção 1 para uma concentração de mRNA de 10 ng/10 µL) foram adicionados ao meio. O nível de luciferase expressada em HCT116 24 horas após a adição de mRNA foi medido pelo uso de um kit Picagene LT2.0 (TOYOBO CO., LTD.). As Tabelas 3 e 4 mostram os resultados de medição.
[Tabela 3] Lipídio catiônico Valor médio de luminescência (cps) para 3 poços Controle PBS 560 Exemplo 1 227720 Exemplo 2 570027 Exemplo 3 412187 Exemplo 4 407547 Exemplo 5 545507 Exemplo 8 3853 Exemplo 10 1203467 Exemplo 11 953520 [Tabela 4] Lipídio catiônico Valor médio de luminescência (cps) para 3 poços Controle PBS 627 Exemplo 9 549893
64 / 66 [Exemplo de Produção e Exemplo de Teste para Composição Contendo Partícula Lipídica da Presente Invenção e Ácido Nucleico para Introdução de Ácido Nucleico] [Exemplo de Produção 2]
[00189] Uma mistura lipídica (produto de lipídio catiônico em Exemplos:DPPC:colesterol:GM-020 = 60:10,6:28:1,4, em relação molar) foi dissolvida em 90% de ETOH/10% de água isenta de RNase para produzir uma solução de lipídio de aproximadamente 7 mg/mL. Quantidades iguais de um siRNA que codifica Col1a1 e de um siRNA que codifica Fator VII (FVII) foram misturadas juntas, e a mistura foi dissolvida em tampão acetato de 25 mM em pH 4,0 para produzir uma solução de ácido nucleico a 0,2 mg/mL.
Informações de sequências sobre os siRNAs são mostrados na tabela abaixo.
A solução de lipídio e a solução de ácido nucleico obtidas foram misturadas pelo uso do aparelho NanoAssembler (Precision Nanosystems) à temperatura ambiente com uma relação de taxa de fluxo de 3 mL/min:9 mL/min para produzir uma dispersão contendo uma partícula lipídica incluindo os ácidos nucleicos. Pelo uso de um Slyde-A-Lyzer (corte de peso molecular: 20k, Thermo Fisher Scientific), a dispersão obtida foi dialisada com água à temperatura ambiente durante 1 hora e com PBS a 4°C durante 48 horas. Subsequentemente, filtração foi realizada com um filtro de seringa de 0,2 µm (IWAKI CO., LTD.) para preparar uma composição para introdução de ácido nucleico, e depois a composição foi armazenada a 4°C. O tamanho de partícula da partícula lipídica foi medido pelo uso de um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited). A concentração de mRNA e a relação de encapsulamento da partícula lipídica foram medidas pelo uso de um Quant-
65 / 66 iT™ RiboGreen® (Invitrogen). A Tabela 6 mostra os resultados de análise.
[Tabela 5] siRNA que codifica Col1a1 (citado de Calvente et al. Hepatology 2015, 62:4) Senso 5' - G[mU][mC][mU]AGA[mC]A[mU]G[mU][mU][mC]AG[mC][mU][mU][ts]t - 3' Antissenso 5' - AAGCUGAA[mC]AUGUC[mU]AGAC[ts]t - 3' siRNA que codifica Fator VII (citado de Landesman et al. Silence 2010, 1:16) Senso 5' - [mC][mU]A[mC]GAAAG[mC]A[mU][mC][mC][mU][mU][mC]A[mU][ts]t - 3' Antissenso 5' - AUGAAGGAUGCUUUCG[mU]AG[ts]t - 3' N: RNA n: DNA [mN]: 2'-OMe RNA [ns]: fosforotioato [Tabela 6] Tamanho de Relação de Composto Concentração de siRNA (µg/mL) partícula (nm) encapsulamento (%) Exemplo 2 104 251 98 Exemplo 3 117 196 95 Exemplo 10 88 307 90 Exemplo 11 85 402 91 Exemplo 4 90 355 89 Exemplo 5 103 367 94 Exemplo 6 87 333 98 Exemplo 7 102 320 96 [Exemplo de Teste 2] Teste de Distribuição de siRNA para Células Hepáticas Stellate em Camundongo Modelo com Distúrbio Hepático Causado por Tetracloreto de Carbono
[00190] A dispersão em PBS da partícula lipídica incluindo o siRNA que codifica Col1a1 e o siRNA que codifica FVII foi diluída com PBS para as concentrações de respectivos siRNAs de 40 µg/mL e 120 µg/mL, e administrada ao sino orbital de cada camundongo para alcançar doses de respectivos siRNA de 0,2 mg/kg e de 0,6 mg/kg. Três horas após a administração dos siRNAs, tetracloreto de carbono foi oralmente administrado para alcançar uma dose de 0,1 mL/kg. Quatro dias após a administração de tetracloreto de carbono, cada camundongo foi eutanasiado
66 / 66 por sangramento sob anestesia com isoflurano, e o fígado foi removido. A partir do fígado obtido, o RNA total foi extraído com um RNeasy Mini Kit (QIAGEN), e os níveis de mRNA que codifica Col1a1, de mRNA que codifica FVII, e de mRNA que codifica GAPDH foram medidos através de um método de PCR quantitativa. As taxas de redução de expressão de mRNA que codifica Col1a1 e de mRNA que codifica FVII normalizadas contra o nível de mRNA que codifica GAPDH foram calculadas com referência àquelas para camundongos sem administração de siRNA, e a seguinte tabela mostra os resultados de cálculo.
[Tabela 7] Composto Eficiência de atenuação de COL1A1 (%) Eficiência de atenuação de FVII (%) Exemplo 2 73 0 Exemplo 3 81 0 Exemplo 10 31 0 Exemplo 11 60 0 Exemplo 4 67 19 Exemplo 5 83 14 Exemplo 6 86 27 Exemplo 7 85 24
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[00191] O composto, a partícula lipídica, ou a composição da presente invenção permite a introdução de ácidos nucleicos para dentro de vários tipos de células, tecidos, ou órgãos. Consequentemente, o composto, a partícula lipídica, ou a composição da presente invenção está disponível como uma técnica de DDS para fármacos de ácido nucleico. Além disso, o composto, a partícula lipídica, ou a composição da presente invenção está disponível como um reagente para introdução de ácido nucleico para pesquisa.

Claims (8)

1 /2 REIVINDICAÇÕES
1. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela fórmula (I): em que n representa um número inteiro de 2 a 5, R representa um grupo alquila C1-5 linear, um grupo alquenila C7-11 linear, ou um grupo alcadienila C11 linear, e as linhas onduladas representam, cada uma, independentemente, uma ligação-cis ou uma ligação-trans, ou um sal do mesmo.
2. Composto, caracterizado pelo fato de ser (9Z)-tetradec-9- enoato de 3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila ou um sal do mesmo.
3. Composto, caracterizado pelo fato de ser (9Z)-tetradec-9- enoato de 3-((5-(dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila ou um sal do mesmo.
4. Composto, caracterizado pelo fato de ser (9Z)-tetradec-9- enoato de 3-((6-(dimetilamino)hexanoil)oxi)-2,2-bis(((9Z)-tetradec-9- enoiloxi)metil)propila ou um sal do mesmo.
5. Partícula lipídica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto ou um sal do mesmo como definido na reivindicação
2 /2
1.
6. Composição para introdução de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico e a partícula lipídica como definida na reivindicação 5.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico é um RNA.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o RNA é um mRNA ou um siRNA.
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